Non i soliti sospetti: 5 lacune nel vostro programma di test ambientali

Non i soliti sospetti: 5 lacune nel vostro programma di test ambientali

Rivoluzione o mera evoluzione? Citometria a flusso e verifica della pulizia e della disinfezione nelle strutture di produzione alimentare

La citometria a flusso di impedenza e il suo utilizzo nel monitoraggio degli ambienti di lavorazione alimentare

Spot On è una pubblicazione della Romer Labs Division Holding GmbH, distribuita gratuitamente.

ISSN: 2414-2042

Redattore:

Joshua Davis

Co-autori:

Cristian Ilea, Florin Soptica, Stefan Widmann

Grafica:

GraphX DSM Austria

Ricerca: Kurt Brunner

Editore:

Romer Labs Division Holding GmbH

Erber Campus 1

3131 Getzersdorf, Austria

Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

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Indice

Non i soliti sospetti: 5 lacune nel vostro programma di monitoraggio dei test ambientali

Persino i migliori programmi di monitoraggio di pulizia e disinfezione hanno le loro pecche. Stefan Widmann approfondisce cinque delle più probabili – e più pericolose –lacune nel vostro programma di monitoraggio dei test ambientali.

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Rivoluzione o mera evoluzione?

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Citometria a flusso e verifica della pulizia e della disinfezione nelle strutture di produzione alimentare

I produttori di alimenti devono essere diligenti nel mantenere il loro ambiente di lavorazione pulito e privo di microorganismi patogeni. Ma come avviene tutto questo, e qual è il potenziale della citometria a flusso nella verifica dei programmi di pulizia e disinfezione?

Di Cristian Ilea, Head of Marketing and Product Management, Romer Labs

Cos´e´la citometria, come funziona e quali applicazioni potrebbe avere nel monitoraggio degli ambienti di lavorazione degli alimenti? Florin Soptica e Stefan Widmann risponderanno a queste domende e a molte di piú.

Di Florin Soptica, Product Manager, Romer Labs; e Stefan Widmann, R&D Team Lead, Romer Labs

La citometria a flusso di impedenza e il suo utilizzo nel monitoraggio degli ambienti di lavorazione alimentare

Di Stefan Widmann, R&D Team Lead, Romer Labs

Colmare le lacune nel vostro programma di test ambientali con la citometria a flusso

La presenza di batteri nelle strutture di produzione di alimenti e bevande può incidere sulla durata e sulla qualità del prodotto; i patogeni possono portare addirittura a malattie di origine alimentare. Pulizia e disinfezione sono dunque fondamentali per garantire la sicurezza alimentare e per proteggere la vostra reputazione e il vostro business.

Però, lottare con successo contro un nemico invisibile non è sempre facile e immediato. L’ispezione visiva è pur sempre un buon primo passo, ma non basta. I tradizionali metodi microbiologici spesso non consentono il controllo preventivo e azioni pre-operative, come gli esiti di laboratorio, richiedono giorni. I test ATP, pur essendo semplici e veloci, quantificano i residui biologici, che non sono un indicatore significativo dell’efficacia della disinfezione. Tuttavia, nonostante questi limiti, voi siete tenuti a prendere decisioni informate, rapidamente.

In questo numero di Spot On parleremo della citometria a flusso di impedenza e di come essa possa fornire ai produttori alimentari una verifica immediata, sul posto, dei loro programmi di test ambientali. Partendo dalle 5 lacune più ostinate in qualsiasi programma di test ambientale, spiegherò in dettaglio perché ai metodi di test tradizionali possano sfuggire, per esempio, batteri vitali ma non colturabili o psicrotrofi, e perché questo sia un problema.

Il mio collega Cristian Ilea prosegue con una discussione sulla citometria a flusso di impedenza e sul nuovo citometro a flusso CytoQuant®. Con CytoQuant®, i produttori alimentari possono ottenere un’istantanea delle concentrazioni di batteri e particelle residue nel loro ambiente di produzione. Una rapida occhiata al funzionamento interno di CytoQuant® e di come esso sia in grado di quantificare all’istante batteri e residui completa questo numero.

A fine giornata, la posta in gioco è troppo alta — in termini di sicurezza del consumatore e di reputazione aziendale — perché i produttori alimentari debbano attendere giorni prima di avere informazioni vitali sul loro programma di pulizia e disinfezione. Ecco che cosa ci ha spinto a esplorare la citometria a flusso e, in definitiva, a sviluppare CytoQuant®.

Vi auguro una piacevole lettura di questo numero di Spot On

Stefan Widmann R&D Team Lead, Romer Labs

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Non i soliti sospetti: 5 lacune nel vostro programma di monitoraggio dei test ambientali

4.0 µm

Persino i programmi migliori di monitoraggio di pulizia e disinfezione hanno le loro pecche. Stefan Widmann approfondisce cinque delle più probabili – e più pericolose – lacune nel vostro programma di monitoraggio e spiega quali sono, perché dovreste preoccuparvene e che cosa potete fare al riguardo.

Di Stefan Widmann, R&D Team Lead, Romer Labs

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Pur non conoscendo ancora tutte le specie di batteri che possono diventare VBNC, ne conosciamo però alcune; tra queste troviamo organismi indicatori, adulteranti e patogeni.

#1

Microorganismi vitali ma non colturabili (VBNC)

Per molto tempo, i microbiologi sono partiti dall’assunto che qualsiasi batterio che non riuscisse a proliferare su mezzi di coltura normali fosse morto. La ricerca successiva ha rivelato che esiste un terzo stato, oltre a quello colturabile e morto: vitale ma non colturabile (VBNC). In generale, i batteri in stato VBNC non si moltiplicano ma sono ancora vivi, come dimostra la loro attività metabolica. Il fatto più rilevante per noi è che essi possano diventare colturabili dopo essere resuscitati e possano pertanto proliferare negli alimenti. Inoltre, alcuni batteri patogeni non proliferano in assenza di un ospite e hanno solo bisogno di sopravvivere nell´alimento fino alla sua ingestione per provocare intossicazione.

Sono molte le ragioni per le quali dei batteri possono passare allo stato VBNC; malnutrizione, incubazione al di fuori dell’intervallo di temperatura ottimale per la crescita, elevate concentrazioni osmotiche, livelli di concentrazione di ossigeno o esposizione alla luce bianca sono solo alcune delle cause. I tratti specifi ci del ceppo di batteri in questione determina che cosa induce esattamente i batteri a entrare in questo stato.

Perché dovreste preoccuparvene?

Alcuni batteri in grado di entrare in stato VBNC sono preoccupanti per la produzione alimentare. Pur non conoscendo ancora tutte le specie di batteri che possono diventare VBNC, ne conosciamo tuttavia alcune; tra queste ci sono organismi indicatori (come Klebsiella aerogenes e Klebsiella pneumoniae), adulteranti (come Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis) e patogeni (come Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli o Listeria monocytogenes).

Una volta identificati, dobbiamo domandarci se questi batteri possano ritornare a uno stato piena-

mente colturabile e potenzialmente patogeno. Per lungo tempo i microbiologi sono stati ignari della questione, poiché è difficile separare nettamente i batteri VBNC da quelli colturabili. I ricercatori hanno risolto questo problema, in parte, ricorrendo a un approccio statistico: diluendo un alto numero di batteri VBNC fino al punto che sia quasi impossibile che rimangano batteri colturabili. I batteri vengono quindi conteggiati dopo un determinato periodo di tempo. Se si osservano gradi elevati di crescita, l’unica conclusione possibile è che i batteri abbiano lasciato lo stato VBNC e siano diventati colturabili. Un ulteriore corollario è che se essi possono tornare allo stato colturabile, allora possono anche tornare a essere patogeni. Ci sono esempi di questo preciso fenomeno che ha portato a epidemie. Per esempio, si sospetta che VBNC E. coli O157 sia stato responsabile di un’epidemia scoppiata in Giappone nel 1997, poiché i numeri totali di E. coli erano insignificanti e ceppi produttori di tossina shiga come O157 potrebbero causare intossicazioni a concentrazioni molto basse.

#2

Batteri anaerobi e microaerofili

I batteri anaerobi o, più in generale, i microorganismi anaerobi, si possono distinguere in tre gruppi: obbligati, aero-tolleranti e facoltativi. Come indicato dal nome, ogni gruppo ha speciali requisiti per quanto concerne l’aria, o meglio l’ossigeno che lo circonda. Anaerobi obbligati come Clostridioides difficile sono danneggiati dall’ossigeno e muoiono poco dopo l’esposizione a esso. I batteri aero-tolleranti come Clostridium botulinum non possono utilizzare ossigeno

e, in presenza di esso, non muoiono né proliferano. Gli anaerobi facoltativi possono usare l’ossigeno ma non ne hanno bisogno per crescere, come accade per E. coli. C’è anche il gruppo dei batteri microaerofili come Campylobacter che ha bisogno di un po’ di ossigeno per crescere, anche se in quantità molto minori (1-2%) che nell’aria normale, ma che possono essere inibiti in condizioni aerobiche.

Perché dovreste preoccuparvene?

Numerosi batteri patogeni hanno questi specifici requisiti di crescita. Attualmente, le specie termotolleranti Campylobacter sono fonte di preoccupazione tra i professionisti della salute pubblica. In media, un pollo su due è infetto da Campylobacter, una media che rende il pollame una delle cause più comuni di intossicazione alimentare. Nell’UE, le intossicazioni provocate dalle specie Campylobacter sono due volte più frequenti di quelle provocate da Salmonella. Nel gruppo anaerobico, una specie di Clostridia come il C. botulinum è responsabile dell’intossicazione alimentare conosciuta come botulismo, spesso trasmessa attraverso alimenti in scatola (ossia poveri di ossigeno), nei quali C. botulinum può proliferare e produrre la tossina botulinica complessa, che è tossica per l’uomo. Un’altra specie di Clostridia, C. perfringens, è la causa più comune di intossicazione alimentare negli USA e in Canada e provoca sintomi come crampi addominali e diarrea. Il rischio di infezione da C. perfringens è legato in maniera particolarmente forte ai cibi conservati in condizioni di calore per periodi prolungati, condizione che favorisce la crescita fino a numeri infettivi (104 cfu/g).

La grande anomalia della conta su piastra Alcune stime indicano che solo l’1% dei batteri può essere coltivato con le conoscenze e le tecniche di cui attualmente disponiamo. La “grande anomalia della conta su piastra” è l’espressione che usiamo per descrivere l’osservazione secondo cui le conte di cellule al microscopio sono significativamente più alte delle corrispondenti conte di “unità formanti colonia” su piastre agarizzate. Un paio di esempi può illustrare al meglio questo fenomeno: mentre il 50% dei microorganismi della flora orale possono essere coltivati con piastre agarizzate, quasi tutta la flora gastrointestinale non può essere coltivata affatto. Le cause di ciò sono numerose, ma la comunità di organismi che circonda le specie in questione, inclusi altri batteri, come pure piante e animali, può giocare un ruolo importante.

I metodi di conta su piastra aerobica si basano su mezzi molto generici, che non supportano la crescita della maggior parte di gruppi di batteri. Tecnicamente, questo non rientra in realtà nella grande anomalia della conta su piastra, poiché alcuni batteri sono in grado di crescere su speciali piastre agarizzate in specifiche condizioni (come condizioni anaerobiche o microaerofile).

Perché dovreste preoccuparvene?

La grande anomalia della conta su piastra non pone problemi significativi nei giri di verifica quotidiani, poiché le conte su piastra aerobica di microorganismi indicatori sono specifiche di un dato ambiente di produzione e, come tali, sono sempre relative a una base di riferimento stabilita, determinata per quell’ambiente di produzione.

Tuttavia, i metodi su piastra hanno tempi molto lunghi, perché richiedono un periodo di incubazione fino a dieci giorni, a seconda del protocollo in atto. Ci sono metodi diretti che non richiedono una fase di coltivazione per la conta batterica; i microscopi

I metodi su piastra hanno tempi molto lunghi, perché richiedono un periodo di incubazione fino a dieci giorni, a seconda del protocollo in atto.

forniscono una panoramica completa ma hanno anch’essi tempi molto lunghi. I metodi diretti come la citometria a flusso sono consueti negli impianti di trattamento delle acque, ma non lo sono altrettanto nell’industria alimentare.

Batteri psicrotrofi

Le specie psicrotrofe Pseudomonas sono i microorganismi responsabili con maggiore frequenza del deperimento della carne refrigerata conservata in ambiente aerobico. #4 #5

I batteri psicrotrofi possono proliferare a temperature basse come 0 °C, con temperature ottimali e massime sopra i 15 °C. Questo rende tali microbi problematici specialmente per cibi e bevande come carne cruda e latte conservati a basse temperature per periodi prolungati. I gruppi psicrotrofi di batteri che si trovano più comunemente negli alimenti sono i generi Gram-negativi Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium e Flavobacterium come pure i generi Gram-positivi come Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Microbacteria. Anche per Listeria monocytogenes e alcuni ceppi di Clostridium botulinum si sa che sono in grado di proliferare a temperature di refrigerazione.

Perché dovreste preoccuparvene?

I batteri psicrotrofi sono adulteranti e possono diminuire in misura significativa la qualità e la durata del cibo. Le strutture di produzione fresca e i serbatoi di stoccaggio offrono un ambiente favorevole per la moltiplicazione di queste specie di batteri. Nel latte fresco, ad esempio, Pseudomonas fluorescens può produrre sia proteasi, sia lipasi. Pertanto, le specie appartenenti al genere Pseudomonas genus sono

considerate tipicamente responsabili di diffi coltà tecniche, poiché le proteasi e lipasi che producono possono provocare il degrado del grasso e delle proteine del latte, dando al latte un colore grigiastro e un sapore amaro. Le specie Pseudomonas sono i microorganismi responsabili con maggiore frequenza del deperimento della carne refrigerata conservata in ambiente aerobico. È ben noto che le specie Pseudomonas sono molto robuste e in grado di resistere a condizioni ambientali di stress che inibirebbero la crescita di altri microorganismi alteranti. Nella carne cruda refrigerata confezionata sottovuoto, la microflora è dominata nella maggior parte dei casi da batteri psicrotrofi dell’acido lattico. Inoltre, la crescita di patogeni durante la conservazione refrigerata potrebbe provocare gravi intossicazioni.

Biofilm

I microorganismi sono in grado di colonizzare le superfici formando una matrice polimerica nella quale possono essere presenti specie microbiche multiple; questa presenza è nota come biofilm. L’evidenza mostra che l’abilità di formare biofilm e di sopravvivervi non è limitata a gruppi specifici di microorganismi. Infatti, la stragrande maggioranza dei batteri è in grado di formare biofilm. I biofilm possono pertanto essere composti da monocolture o da parecchie specie diverse di microorganismi. Alcuni ricercatori hanno suggerito che la struttura complessa dei biofilm misti li renda più stabili e più resistenti ai detergenti chimici. La popolazione iniziale che si lega alla superficie può modificare le caratteristiche di quella superficie,

consentendo a quelli che arriveranno dopo di aderire mediante associazione cellula a cellula; in alcuni casi, attaccarsi a una seconda specie può aumentare la stabilità della popolazione del biofilm. Ad esempio, studi dimostrano che L. monocytogenes ha maggiori probabilità di aderire all’acciaio in presenza di Pseudomonas

Perché dovreste preoccuparvene?

I biofilm che si formano sulle attrezzature di lavorazione alimentare e su altre superfici a contatto con alimenti agiscono come una fonte persistente di contaminazione, mettendo a rischio la qualità in generale e la sicurezza dei prodotti alimentari, con possibili esiti di intossicazione alimentare e di perdite economiche. I microorganismi alteranti sono noti per essere responsabili di quasi un terzo delle perdite nelle catene di rifornimento alimentari. Per questo il controllo e la prevenzione del biofilm sono una priorità nell’industria alimentare.

I microorganismi che formano biofi lm o proliferano in esso sono più resistenti alla disinfezione, una resistenza che li rende problematici in un ampio spettro di industrie alimentari. Altri effetti dei biofi lm come la corrosione delle superfi ci metalliche sono una criticità ulteriore nelle industrie alimentari. In ogni caso, la presenza di biofi lm in uno stabilimento di produzione alimentare mette a rischio la salute umana. Il grado di rischio dipende dalle specie batteriche che formano questa struttura tridimensionale vivente.

Come colmare queste lacune? Il potenziale della citometria a flusso

In genere i produttori di alimenti non hanno a disposizione molte opzioni. Quelle che offrono un po’ di precisione, come la colorazione vitale in combinazione con microscopi, riescono a quantifi -

care i batteri VBNC ma richiedono molto tempo e attrezzature speciali. Tutti i gruppi di batteri anaerobi e microaerofili – con la notevole eccezione degli anaerobi facoltativi – possono crescere su classiche piastre agarizzate, ma solo a livelli di ossigeno attentamente controllati.

Le piastre agarizzate non sono però la soluzione a tutto. Le piastre agarizzate sono in grado di contare solo approssimativamente l’1% delle specie di batteri conosciute e richiedono giorni prima di avere i risultati: fino a 10 giorni nel caso di batteri psicrotrofi. I metodi ATP, per quanto rapidi, non quantifi cano i batteri e sono utili soltanto in misura limitata per la rilevazione dei batteri di biofilm; i dati cinetici di cellule planctoniche liberamente in sospensione non si dovrebbero usare come riferimento poiché il rilascio di ATP è molto minore nei biofilm. Inoltre, tracce di ATP da residui di alimenti o funghi possono facilmente oscurare l’ATP rilasciata da batteri, poiché le cellule eucariote contengono 10 milioni di volte più ATP delle cellule procariote. Di conseguenza, i dispositivi ATP utilizzati per rilevare biofilm tendono ad avere un limite di rilevazione molto superiore, ossia non sono così sensibili come lo sarebbero nel rilevare batteri liberi di muoversi.

Ognuno di questi cinque casi ha mostrato soltanto quanto sia diffi cile rilevare batteri e residui sulle superfici di produzione alimentare; le carenze dei metodi d rilevazione più comuni, come i test su piastra e ATP, sono tanto tenaci quanto sono ben documentate.

Che cosa possono fare i produttori di alimenti per colmare le lacune lasciate dai metodi di coltura e dai test ATP? Nel prossimo articolo, il mio collega Cristian Ilea parla del potenziale della citometria a flusso di impedenza e del citometro a flusso CytoQuant®, una nuova soluzione che quantifica immediatamente batteri e particelle residue sulle superfici.

Tracce di ATP da residui di alimenti o funghi possono facilmente oscurare l’ATP rilasciata da batteri, poiché le cellule eucariote contengono 10 milioni di volte più ATP delle cellule procariote.

Rivoluzione o mera evoluzione?

Citometria a flusso e verifica della pulizia e della disinfezione nelle strutture di produzione alimentare

La sicurezza alimentare dipende in larga misura dalle condizioni igieniche nelle strutture di produzione alimentare. La presenza di alti livelli di batteri alteranti può influire sulla durata e sulla qualità degli alimenti, mentre la presenza di patogeni (come Salmonella e Listeria) può provocare gravi intossicazioni. I produttori di alimenti devono essere diligenti nel mantenere il loro ambiente di lavorazione pulito e privo di microorganismi patogeni, per prevenire la contaminazione incrociata del prodotto finale. Ma come avviene tutto ciò allo stato attuale?

Di Cristian Ilea, Head of Marketing and Product Management

Ai produttori di alimenti serve un metodo rapido che quantifichi direttamente sia i batteri, sia le particelle residue e che non sia influenzato dai disinfettanti e dalla temperatura.

Ispezione visiva

Pur essendo un prerequisito, l’ispezione visiva di per sé non è sufficiente. È un metodo soggettivo e impreciso di verifica della corretta pulizia. Ancor più importante, anche se una superficie non ha apparentemente dei residui, ciò non significa che sia immacolata. L’ispezione visiva non può garantire che tutti i residui di cibo delle produzioni precedenti siano stati eliminati o che un disinfettante abbia effettivamente ridotto il livello microbico sulle superfici.

Conta microbica con metodi basati su coltura

Questi sono metodi tradizionali per monitorare l’igiene dell’ambiente di lavorazione. In genere, ci sono due modi per fare la campionatura: mediante contatto e mediante tampone. Con i metodi basati sul contatto, si mettono a contatto della superficie da analizzare, delle piastre o dei vetrini a immersione (dip-slide) che vengono campionati e quindi incubati. Il campionamento mediante tampone si esegue con stick tampone o spugne che vengono quindi diluiti in una soluzione tampone che poi viene inoculata in terreni sterili e incubata. Il limite principale di questi metodi tradizionali di rilevazione microbica è il tempo necessario per ottenere i risultati. Inoltre, moltissime specie di batteri non si possono coltivare su agar, un fenomeno noto come la grande anomalia della conta su piastra.

Rilevazione ATP

L’adenosina trifosfato (ATP) è un nucleotide che le cellule utilizzano per produrre energia. La si può immaginare come la “moneta corrente" molecolare per trasferire energia all’interno di tutte le cellule viventi. L’energia viene trasferita quando l’ATP si scinde nel suo nucleotide e nei suoi gruppi fosfato. L’idrolisi dei legami covalenti dei fosfati libera energia che viene utilizzata per reazioni. I sistemi di test ATP commerciali sfruttano la reazione luciferina/ luciferasi, che è molto comune in natura, per generare luce visibile con l’energia fornita dall’ATP. Quanto maggiore è la luce emessa, tanto maggiore è l’ATP presente, cosa che potrebbe indirettamente indicare più residui di alimenti o (potenzialmente) più microorganismi. C’è però una limitazione importante: poiché questi sistemi si basano su una reazione enzimatica, potenziali inibitori o condizioni ambientali non ottimali potrebbero invalidare i risultati.

La temperatura ambiente potrebbe aumentare i tempi di reazione, mentre la luce potrebbe rendere difficile ottenere letture corrette. Inoltre, disinfettanti possono interferire con la reazione, vale a dire che potrebbe non esserci una vera correlazione tra i batteri viventi presenti sulla superficie e i risultati della misurazione di ATP. Pertanto, i metodi basati sull’ATP si usano di norma per testare le superfici prima di applicare il disinfettante.

Nei metodi ATP è insito un potenziale svantaggio ulteriore: hanno un’applicabilità variabile a seconda del tipo di alimento in lavorazione. La maggior parte degli alimenti lascia residui che contengono grandi quantità di ATP, quantità che supera di parecchi ordini di grandezza quelle contenute all’interno delle cellule batteriche. In pratica, ciò significa che i sistemi basati sull’ATP non si possono utilizzare per valutare la contaminazione microbica delle superfici nella maggior parte delle strutture di produzione alimentare. Sebbene la conta diretta sia impossibile di qualsiasi batterio, i sistemi basati sull’ATP sono ampiamente utilizzati perché producono risultati nel giro di pochi secondi, un tempo disponibile finora per nessun’altra tecnologia comunemente in commercio.

Ma perché non possiamo avere tutto?

Il sacro graal della verifica della pulizia e della disinfezione

Ciò di cui hanno bisogno i produttori di alimenti è un metodo rapido che quantifichi direttamente sia i batteri, sia le particelle e che non sia influenzato dai disinfettanti e dalla temperatura. Anche se sembra troppo pretenzioso, la tecnologia di base per realizzare questo standard esiste già ed è già applicata oggigiorno.

Che cos’è la citometria a flusso

La citometria a flusso (FCM) si riferisce a un gruppo di tecniche che sfruttano segnali ottici o elettrici per rilevare e misurare determinate proprietà fisiche o chimiche di cellule e particelle sospese in un fluido. Quasi 300 studi condotti tra il 2000 e il 2018 hanno valutato la FCM come uno strumento per caratterizzare la qualità microbica dell’acqua. Questa ricerca è riuscita a illustrare il valore della FCM nel trattamento, nella distribuzione e nel riuso dell’acqua. Ci sono ora lavori di ricerca che documentano applicazioni di successo della FCM, sufficientemente fondati da suggerire che essa potrebbe ragionevolmente e realisticamente trovare ampia applicazione come metodo di routine per l’analisi della qualità dell’acqua.

Che cosa ha a che fare tutto questo con la validazione della pulizia e della disinfezione nelle strutture di produzione alimentare? Metodi finora consueti per determinare la qualità dell’acqua avevano spesso dei limiti quali la bas-

sa sensibilità, l’elevato dispendio di lavoro e di tempo, la suscettibilità all’interferenza con composti inibitori, e difficoltà nel distinguere tra cellule vitali e non vitali. (Sono tutti limiti che suonano familiari, vero?) Però, attenzione: i citofluorimetri a flusso sono dispositivi solitamente ingombranti e costosi, che richiedono personale altamente specializzato per essere usati.

Il potere della citometria di flusso in un dispositivo manuale portatile

Per rendere la FCM una soluzione praticabile per la verifica della pulizia nelle strutture di produzione alimentare, occorre che sia in un formato portatile che sia semplice e intuitivo da usare, ma nonostante questo sufficientemente accurato da fornire conte affidabili di batteri e particelle nei campioni ambientali. Tutto ciò è stato reso possibile sfruttando la citometria di flusso di impedenza. La citometria a flusso di impedenza è un tipo specifico di citometria di flusso: invece di sistemi ottici come la tecnologia a laser, i citometri a flusso di impedenza utilizzano una corrente alternata a frequenze variabili, che consente al dispositivo di rilevare e contare cellule e particelle separatamente. Mentre i citometri a flusso basati su sistemi ottici sono in grado soltanto di contare cellule marcate con tinture, i citometri a flusso di impedenza riescono a eseguire la stessa operazione senza che ci sia bisogno di marcatura. In confronto ad altri dispositivi citometrici a flusso, sono compatti, portatili e funzionano a batteria, consentendo l’uso sul posto dove viene prelevato il campione.

Come fanno i citometri a flusso di impedenza a distinguere le cellule dalle particelle residue?

Le proprietà elettromagnetiche dei batteri consentono ai citometri a flusso di distinguere i batteri da altre particelle. Il citoplasma e la membrana cellulare di un batterio modificano il campo elettrico in modi unici e identificabili. Mentre la corrente elettrica attraverserà particelle metalliche senza incontrare quasi nessuna resistenza, particelle non conduttrici faranno invece resistenza al campo elettrico. I batteri intatti, tuttavia, somigliano contemporaneamente a particelle non conduttrici e conduttrici: la membrana cellulare impedisce alle basse frequenze di penetrarla, facendola somigliare a particelle non conduttrici; ad alte frequenze, però, la corrente elettrica passa attraverso la membrana. I microelettrodi nei citometri a flusso di impedenza generano questi campi elettrici e fanno sì che il dispositivo quantifichi i cambiamenti di conduttività e resistenza in termini di misurazioni separate di cellule intatte e particelle.

Applicazione della citometria a flusso di impedenza alla sicurezza alimentare: vi presentiamo CytoQuant®

Come sopra accennato, un vantaggio dei citometri a flusso di impedenza rispetto ad altri tipi di dispositivi citometrici è la loro portabilità. Leggeri, piccoli e funzionanti a batteria, si possono usare sul campo e in punti di controllo critici dove l’igiene è una questione prioritaria.

Il citometro a flusso di impedenza CytoQuant® è stato progettato per essere usato proprio in tali aree, incluse le strutture di produzione alimentare e le camere bianche. La citometria a flusso di impedenza apporta considerevoli vantaggi ai produttori di alimenti, che devono verificare la loro sicurezza alimentare e i loro programmi di pulizia: la quantificazione rapida e separata di batteri e particelle residue (che può fare da indicatore dell’efficacia della pulizia), la sensibilità del metodo, e la robustezza del kit tampone e del citometro stesso.

Il sistema CytoQuant® é facile da usare perché il dispositivo fa tutto da solo, tranne la tamponatura. Un giro di test inizia tamponando un´area predefinita (20 x 20 cm o 8 x 8 pollici) della superficie da testare. Poi continua mettendo il tampone in una provetta contenente una soluzione conduttrice brevettata ed in seguito, agitando il kit tampone per sospendere i batteri. Quando si analizza acqua di risciacquo, il campione viene dosato direttamente nella provetta vuota e si aggiungono poche goccie di soluzione elettrolitica. Dopo aver mescolato il campione, l´operatore inserisce la provetta nel CytoQuant®. Due aghi penetrano il fondo del tubo, collegando il liquido al sistema di flusso nel dispositivo. Quindi, dopo che la soluzione è introdotta nel sistema di flusso, viene fatta passare attraverso elettrodi nella cella di flusso. Dopo 30 secondi il dispositivo registra risultati separati per batteri e particelle e li mostra sul display.

Rivoluzione o evoluzione?

Il citometro portatile a flusso CytoQuant® consente l’immediata verifica sul posto delle procedure di pulizia e di disinfezione nelle strutture di produzione alimentare o in altre aree dove l’igiene è fondamentale. Quantificando direttamente batteri e particelle residue sulle superfici senza l’influenza di disinfettanti o della temperatura, esso fornisce vantaggi sostanziali rispetto ai dispositivi ATP, mentre i 30 secondi necessari per avere i risultati lo rendono un potenziamento perfetto dei piani di igiene che già usano metodi di coltura. Considerando l’enorme potenziale della citometria a flusso di impedenza, potrebbe a un certo punto arrivare a essere considerato equivalente o addirittura a sostituire i metodi di coltura come standard nella verifica della pulizia. Ciò rappresenterebbe una vera e propria rivoluzione nel settore.

I citometri a flusso di impedenza utilizzano una corrente alternata a frequenze variabili, che consente al dispositivo di rilevare e contare cellule e particelle separatamente.

La citometria a flusso di impedenza è una potente variante della citometria a flusso perché è molto robusta è si può usare per valutare caratteristiche cellulari che sono altrimenti impossibili da misurare senza l’uso di marcatori molecolari, come l’integrità della membrana cellulare.

La citometria a flusso di impedenza e il suo utilizzo nel monitoraggio degli ambienti di lavorazione alimentare

Che cos’è la citometria a flusso, come funziona e quale applicazione potrebbe trovare nel monitoraggio degli ambienti di produzione alimentare? Florin Soptica e Stefan Widmann rispondono a queste domande con ulteriori approfondimenti.

Che cos’è la citometria a flusso?

La citometria a flusso si riferisce a un gruppo di tecniche che utilizzano un laser o un campo elettrico per conteggiare le cellule in sospensione in un fluido e determinare alcune delle loro proprietà fisico-chimiche. Nella situazione ottimale, solo una cellula alla volta attraversa il canale microfluidico del citometro, che rileva le variazioni di lunghezza d’onda della luce o di carica elettrica al passaggio di ogni cellula o altra particella. Poiché un citometro a flusso richiede in genere dispositivi grandi e costosi, oltre a fastidiosi passaggi preliminari, questo metodo è stato tradizionalmente limitato all’uso in laboratori in ambiti di applicazione quali la ricerca o la medicina.

Impiego della citometria a flusso di impedenza per la conta di cellule e particelle residue

La citometria a flusso di impedenza è derivata dalla tecnologia sulla quale si basano i contatori di particelle Coulter, che riescono a misurare e conteggiare particelle sospese in elettroliti sulla base dei cambiamenti di impedenza provocati dallo spostamento di elettroliti causato dalle particelle. Misurando frequenze multiple

Come

nello stesso momento al passaggio di ogni particella, la citometria a flusso di impedenza riesce a operare una distinzione tra particelle, non solo in base alle dimensioni, ma anche in base alle proprietà elettriche. Questa è una potente variante della citometria a flusso, perché è molto robusta e si può usare per valutare caratteristiche cellulari che sono altrimenti impossibili da misurare senza l’uso di marcatori molecolari, come l’integrità della membrana cellulare. Pertanto, invece di un laser, un citometro a flusso di impedenza impiega una corrente alternata, le cui variazioni di frequenza consentono al dispositivo di rilevare, misurare e conteggiare separatamente cellule con membrana intatta e altre particelle. In confronto ad altri dispositivi citometrici a flusso, i citometri a flusso di impedenza sono compatti, portatili e funzionano a batteria, consentendo l’uso sul posto dove viene prelevato il campione. Come fanno i citometri a flusso di impedenza a sapere la differenza tra cellule e altre particelle?

La citometria a flusso di impedenza sfrutta le proprietà elettromagnetiche uniche della membrana cellulare e del citoplasma per distinguere i batteri da altre particelle. La membrana e il citoplasma della cellula influenzano il campo elettrico in una maniera che è differente da altre particelle presenti nel campione. Un esempio con parti-

Di Florin Soptica, Product Manager, Romer Labs; e Stefan Widmann, R&D Team Lead, Romer Labs

i citometri a flusso di impedenza identificano i batteri

Batteri (in rosso) e altre particelle attraversano il canale microfluidico del citometro.

Microelettrodi nella cella di flusso microfluidico generano campi elettrici sia ad alte che a basse frequenze.

celle metalliche (conduttrici), particelle non conduttrici e cellule intatte può illustrare questo principio nel modo più chiaro. Indipendentemente dalla frequenza del campo elettrico, la conduttività delle particelle metalliche permetterà al campo elettrico di passare senza ostacoli. Al contrario, particelle non conduttrici come il polistirene faranno resistenza al campo elettrico; la corrente si muoverà soltanto nel mezzo liquido, il che comporta uno spostamento di volume misurabile correlato alla dimensione delle particelle nel canale di flusso. Le cellule intatte, tuttavia, sono uniche poiché somigliano contemporaneamente a particelle non conduttrici e conduttrici, a seconda della frequenza del campo elettrico. A basse frequenze, la qualità isolante di una membrana cellulare impedisce al campo elettrico di penetrarla, portando allo stesso tipo di spostamento che avviene con particelle non conduttrici. Frequenze più alte, tuttavia, possono penetrare parzialmente la membrana; come tali, le cellule sono simili per conduttività a particelle metalliche. I microelettrodi nei citometri a flusso di impedenza generano campi sia a basse, sia ad alte frequenze, facendo sì che il dispositivo rilevi questi cambiamenti di conduttività e resistenza e li attribuisca in numeri precisi a cellule intatte o a particelle. Il rilevatore identifica l’obiettivo come un batterio basandosi sul grado di variazione di impedenza o conduttività a queste frequenze. L’utente ottiene quindi conte delle cellule intatte e delle particelle.

In che cosa la citometria a flusso di impedenza differisce dai metodi di coltura

I metodi di coltura, e in particolare l’uso delle piastre agarizzate, sono l’approccio tradizionale per monitorare la sanificazione degli ambienti di lavorazione degli alimenti.

Però i metodi di coltura, per quanto ben affermati, presentano numerosi svantaggi per quanto riguarda rapidità e completezza. I metodi di coltura sono lenti, richiedono da uno a dieci giorni perché la crescita dei

batteri formi colonie conteggiabili. Questi metodi misurano soltanto ciò che è colturabile a condizioni specifiche di un dato test; una specie o altri raggruppamenti di batteri potrebbero richiedere un terreno agarizzato o un terreno liquido specifico a un’esatta temperatura, un esatto grado di luce o umidità, per citare solo alcune variabili. I metodi di coltura sono in difetto anche per la misurazione completa di tutti i batteri di un campione. La “grande anomalia della conta su piastra”, un enigma ben noto in microbiologia, osserva che soltanto una piccola frazione di batteri in un habitat può essere rintracciata mediante coltura. I batteri in stato vitale ma non colturabile (VBNC) sono vivi, ma a causa di stress, idiosincrasie o fattori ambientali non ottimali non possono crescere su agar or in mezzi liquidi. In alcuni casi si possono coltivare dopo essere stati resuscitati, un processo che, di nuovo, richiede molto tempo. Alcuni batteri patogeni, come E. coli O157, si sa che sono entrati in stato VBNC per proliferare soltanto in stadi successivi lungo la catena alimentare o in ospiti umani dopo ingestione.

Inoltre, i batteri anaerobi e microaerofili hanno bisogno rispettivamente di assenza di ossigeno o di livelli di ossigeno più bassi di quelli delle normali condizioni atmosferiche. I batteri di questi gruppi che siano colturabili necessitano di speciali condizioni di incubazione, aggiungendo il costo dei test analitici.

I citometri a flusso di impedenza conteggiano tutti i batteri che attraversano il canale di flusso, indipendentemente dal loro stato (colturabile, VBNC, non colturabile, dormiente) o dalle loro condizioni di crescita. Una tale quantificazione diretta, immediata allarga lo spettro di un programma di controllo dell’igiene; con la citometria a flusso di impedenza possono essere oggetto di rilevazione anche i batteri che non si moltiplicano fino a quando non vengano in contatto con cibo o con potenziali ospiti. Essa permette anche di intervenire immediatamente quando pulizia e disinfezione non siano conformi al piano.

I citometri a flusso di impedenza conteggiano tutti i batteri che attraversano il canale di flusso, indipendentemente dal loro stato (colturabile, VBNC, non colturabile, dormiente) o dalle loro condizioni di crescita.

L’impronta unica dei batteri: il campo elettrico riesce a penetrare la membrana cellulare dei batteri soltanto ad alte frequenze. A basse frequenze, la qualità isolante della membrana impedisce che ciò avvenga.

Batteri e altre particelle influenzano il campo elettrico perché passano tra gli elettrodi.

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