Número 15
Una publicación de Romer Labs®
No son las sospechas habituales: 5 deficiencias en su programa de ensayos ambientales 6.0 µm
6.0 µm
5.5 µm
5.5 µm
5.0 µm
5.0 µm
4.5 µm
4.5 µm
4.0 µm
4.0 µm
3.5 µm
3.5 µm
3.0 µm
3.0 µm
2.5 µm
2.5 µm
2.0 µm
2.0 µm ¿Revolución o mera evolución? Citometría de flujo y verificación de la limpieza y la desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos Citometría de flujo por impedancia y su uso en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos
Contenido 6.0 µm
6.0 µm
5.5 µm
5.5 µm
5.0 µm
5.0 µm
4.5 µm
4.5 µm
4.0 µm
4.0 µm
3.5 µm
3.5 µm
3.0 µm
3.0 µm
2.5 µm
2.5 µm
2.0 µm
2.0 µm
4-9 No son las sospechas habituales: 5 deficiencias en su programa de monitorización ambiental Incluso los programas de monitorización de la limpieza y la desinfección mejor planeados tienen sus puntos ciegos. Stefan Widmann estudia más de cerca cinco de las deficiencias más comunes, y más peligrosas, de su programa de monitorización ambiental. Por Stefan Widmann, jefe del equipo de I+D, Romer Labs
Spot On es una publicación de Romer Labs Division Holding GmbH, de distribución gratuita. ISSN: 2414-2042
Jefe de redacción: Joshua Davis
10-13 ¿Revolución o mera evolución? Citometría de flujo y verificación de la limpieza y la desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos Los fabricantes de alimentos deben ser diligentes a la hora de mantener su entorno de procesamiento limpio y libre de microrganismos patógenos. Pero, ¿cómo se hace actualmente y cuál es el potencial de la citometría de flujo para verificar los programas de limpieza y desinfección? Por Cristian Ilea, jefe de Mercadotecnia y Gestión de Productos, Romer Labs
Colaboradores: Cristian Ilea, Florin Soptica, Stefan Widmann Diseño gráfico: GraphX DSM Austria Investigación: Kurt Brunner
Editor: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
©Copyright 2024, Romer Labs® Todos los derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial de esta publicación por cualquier medio con fines comerciales sin la autorización escrita del titular de los derechos de autor. Todas las fotos son propiedad de Romer Labs o se utilizan con licencia.
2
Citometría de flujo por impedancia y su uso en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos
14-15
¿Qué es la citometría de flujo, cómo funciona y qué aplicación tendría en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos? Florin Soptica y Stefan Widmann responden a estas y otras preguntas.
Por Florin Soptica, director de producto, Romer Labs; and Stefan Widmann, jefe del equipo de I+D, Romer Labs
Spot On número 15
Editorial Abordar las deficiencias de su programa de ensayos ambientales con la citometría de flujo La presencia de bacterias en las instalaciones de fabricación de alimentos y bebidas puede afectar a la vida útil y la calidad de los productos. Los microrganismos patógenos pueden incluso provocar enfermedades de origen alimentario. Por ello, la limpieza y la desinfección son fundamentales para garantizar la seguridad alimentaria y proteger tanto su reputación como su negocio. Pero tomar medidas contra algo que no puede ver no siempre es fácil y sencillo. Una inspección visual puede ayudar, pero no es suficiente por sí misma. Los métodos microbiológicos tradicionales no suelen permitir el control preventivo ni las acciones preoperativas, ya que los resultados del laboratorio tardan días. Las pruebas de ATP, aunque son sencillas y rápidas, cuantifican los residuos biológicos, que no son un indicador significativo de la eficacia de la desinfección. Sin embargo, se espera que tome decisiones informadas y rápidas a pesar de estas limitaciones. En este número de Spot On, hablamos de la citometría de flujo por impedancia y cómo puede aportar a los productores de alimentos una verificación inmediata e in situ de sus programas de ensayos ambientales. Comienzo echándole un vistazo a las 5 deficiencias más difíciles de abordar en cualquier programa de ensayos ambientales y detallo por qué los métodos analíticos tradicionales pueden no detectar, p. ej., bacterias viables no cultivables o psicrotróficas, y por qué esto supone un problema. Mi compañero Cristian Ilea continúa con un análisis de la citometría de flujo por impedancia y el nuevo citómetro de flujo CytoQuant®. Con CytoQuant®, los productores de alimentos pueden obtener datos instantáneos sobre las concentraciones de bacterias y de partículas de residuos en sus ambientes de producción. Y una mirada rápida al funcionamiento interno de CytoQuant® y cómo cuantifica las bacterias y los residuos de forma instantánea cierra esta edición. Al fin y al cabo, hay demasiado en juego, en términos de seguridad del consumidor y reputación de la empresa, para que los productores de alimentos tengan que esperar días hasta obtener información vital sobre su programa de limpieza y desinfección. Esta ha sido nuestra motivación para investigar la citometría de flujo y, en definitiva, desarrollar CytoQuant®. Espero que disfrute de este número de Spot On.
Stefan Widmann Jefe del equipo de I+D, Romer Labs
Una publicación de Romer Labs®
3
6.0 µm 5.5 µm 5.0 µm 4.5 µm 4.0 µm 3.5 µm 3.0 µm 2.5 µm 2.0 µm 4
Spot On número 15
6.0 µm 5.5 µm 5.0 µm 4.5 µm 4.0 µm 3.5 µm
No son las sospechas habituales:
5 deficiencias en su programa de monitorización ambiental Incluso los programas de monitorización de la limpieza y la desinfección mejor planeados tienen sus puntos ciegos. Stefan Widmann estudia más de cerca cinco de las deficiencias más comunes, y más peligrosas, de su programa de monitorización ambiental y explica cuáles son, por qué deberían preocuparle y qué puede hacer para afrontarlas. Por Stefan Widmann, jefe del equipo de I+D, Romer Labs
3.0 µm 2.5 µm 2.0 µm Una publicación de Romer Labs®
5
Aunque todavía no conocemos todas las especies de bacterias que pueden convertirse en VNC (viables no cultivables), sabemos de algunas que sí lo hacen; entre ellas se encuentran microrganismos indicadores, microrganismos adulterantes y microrganismos patógenos.
#1 Los microrganismos viables no cultivables (VNC) Durante mucho tiempo, los microbiólogos supusieron que cualquier bacteria que no creciera en un medio de cultivo normal estaba muerta. Mediante investigaciones posteriores se reveló que existe un tercer estado aparte del cultivable y el muerto: el viable no cultivable (VNC). En general, las bacterias en el estado VNC no se multiplican, pero siguen vivas, como lo demuestra su actividad metabólica. Lo más interesante para nosotros es el hecho de que puedan llegar a ser cultivables tras la resucitación y, por tanto, proliferar en los alimentos. Además, algunas bacterias patógenas no crecerán en ausencia de un anfitrión y solo necesitarán sobrevivir en los alimentos hasta su ingestión para causar la enfermedad. Hay muchas razones por las que las bacterias pueden entrar en el estado VNC. La inanición, la incubación fuera del intervalo de temperatura óptimo para el crecimiento, las concentraciones osmóticas elevadas, los niveles de concentración de oxígeno o la exposición a la luz blanca son solo algunas de las causas. Los rasgos específicos de la cepa bacteriana en cuestión determinan qué es lo que hace que las bacterias entren en este estado.
¿Por qué deberían preocuparle? Algunas bacterias capaces de entrar en el estado VNC son motivo de preocupación para los fabricantes de alimentos. Aunque todavía no conocemos todas las especies de bacterias que pueden convertirse en VNC, sabemos de algunas que sí lo hacen; entre ellas se encuentran microorganismos indicadores (como Klebsiella aerogenes y Klebsiella pneumoniae), microrganismos adulterantes (como Lactobacillus plantarum y Lactococcus lactis) y microrganismos patógenos (como Salmonella typhimurium, Campylobacter coli o Listeria monocytogenes).
6
Una vez identificadas, debemos preguntarnos si estas bacterias podrían volver a un estado totalmente cultivable y potencialmente patógeno. Los microbiólogos permanecieron durante mucho tiempo a oscuras con respecto a esta cuestión, ya que es difícil separar completamente las bacterias VNC de las cultivables. Los investigadores han resuelto este problema, en parte, utilizando un enfoque estadístico: diluyen un alto número de bacterias VNC hasta el punto de que es casi imposible que quede alguna bacteria cultivable. Las bacterias se cuentan después de un período de tiempo definido. Si se observan altos grados de crecimiento, la única conclusión posible es que las bacterias han abandonado el estado VNC y se han vuelto cultivables. Otro corolario es que, si pueden volver a un estado cultivable, también pueden volverse patógenas de nuevo. Hay ejemplos de este fenómeno en concreto que han ocasionado brotes epidémicos. Por ejemplo, se sospechaba de E. coli O157 VNC en un brote epidémico en Japón en 1997, ya que las cantidades totales de E. coli eran insignificantes y cepas shigatoxigénicas como O157 podrían causar enfermedades en cifras muy bajas.
#2 Las bacterias anaerobias y microaerófilas Las bacterias anaerobias o, de manera más general, los microrganismos anaerobios, pueden dividirse en tres grupos: estrictos, aerotolerantes y facultativos. Como su nombre indica, cada uno de ellos tiene requisitos especiales con respecto al aire o, más concretamente, el oxígeno que los rodea. Los anaerobios estrictos, como Clostridioides difficile, se Spot On número 15
Los métodos de placas requieren mucho tiempo, ya que necesitan un período de incubación de hasta
#3 ven perjudicados por el oxígeno y mueren poco después de la exposición. Las bacterias aerotolerantes, como Clostridium botulinum, no pueden utilizar el oxígeno, por lo que no morirán ni crecerán en su presencia. Los anaerobios facultativos pueden utilizar el oxígeno, pero no lo necesitan para crecer, como es el caso de E. coli. Asimismo, existe el grupo de bacterias microaerófilas, como Campylobacter, que necesitan oxígeno para crecer, aunque en cantidades mucho más pequeñas (1-2 %) que, en el aire normal, pero pueden inhibirse en condiciones aeróbicas.
¿Por qué deberían preocuparle? Varias bacterias patógenas tienen estos requisitos especiales de crecimiento. Actualmente, las especies de Campylobacter termotolerantes son motivo de preocupación entre los profesionales sanitarios. En promedio, uno de cada dos pollos está infectado con Campylobacter, lo que hace que la carne de aves de corral sea una de las causas más comunes de intoxicación alimentaria. En la UE, las enfermedades causadas por las especies de Campylobacter se producen con el doble de frecuencia que las causadas por Salmonella. Del grupo anaerobio, una especie de Clostridia, como C. botulinum, es responsable de la enfermedad de origen alimentario conocida como botulismo, a menudo transmitida a través de alimentos enlatados (es decir, pobres en oxígeno), en los que C. botulinum puede desarrollarse y producir la toxina botulínica, que es nociva para los seres humanos. Otra especie de Clostridia, C. perfringens, es la fuente más común de intoxicación alimentaria en Estados Unidos y Canadá, y causa síntomas como calambres abdominales y diarrea. El riesgo de infección por C. perfringens se correlaciona especialmente con los alimentos mantenidos o conservados en condiciones de calor durante mayores períodos de tiempo, lo que favorece su crecimiento hasta alcanzar cifras infecciosas (104 UFC/g). Una publicación de Romer Labs®
diez días, dependiendo del protocolo en vigor.
La gran anomalía del recuento en placa Algunas estimaciones indican que solo el 1 % de las bacterias puede cultivarse con el conocimiento y las técnicas de las que disponemos actualmente. La «gran anomalía del recuento en placa» es el término que utilizamos para describir la observación de que los recuentos de células microscópicas son significativamente más altos que los correspondientes recuentos de «unidades formadoras de colonias» en placas de agar. Un par de ejemplos pueden ilustrar mejor este fenómeno: mientras que el 50 % de los microrganismos de la flora bucal puede cultivarse con placas de agar, la mayor parte de la flora gastrointestinal no puede cultivarse en absoluto. Las razones de ello son numerosas, pero la comunidad de microrganismos que rodea a la especie en cuestión, incluidas otras bacterias, así como también plantas y animales, puede desempeñar un papel importante. Los métodos de recuento de aerobios en placa dependen de medios de cultivo muy generales, que no fomentan el crecimiento de la mayor parte de los grupos de bacterias. En teoría, esto no es realmente parte de la gran anomalía del recuento en placa, ya que algunas bacterias son capaces de crecer en placas de agar especiales en condiciones especiales (como las condiciones anaeróbicas o microaerófilas).
¿Por qué deberían preocuparle? La gran anomalía del recuento en placa no plantea problemas significativos en los análisis diarios, puesto que los recuentos de aerobios en placa de microrganismos indicadores son específicos de un ambiente de producción dado y, como tales, siempre están relacionados con un valor de referencia determinado para ese ambiente de producción. Sin embargo, los métodos de placas requieren mucho tiempo, ya que necesitan un período de incubación de hasta tres días, dependiendo del protocolo
7
Las especies psicrotróficas de Pseudomonas son los microrganismos responsables en la mayoría de los casos de la putrefacción de la carne refrigerada conservada en un ambiente aeróbico.
en vigor. Existen métodos directos que no requieren un paso de cultivo para contar las bacterias; los microscopios proporcionan una visión completa de las bacterias, pero también consumen mucho tiempo. Aunque los métodos directos como la citometría de flujo son habituales en las instalaciones de tratamiento de aguas, no lo son en la industria alimentaria.
#4 Las bacterias psicrotróficas Las bacterias psicrotróficas pueden crecer a temperaturas tan bajas como 0 °C, con temperaturas de crecimiento óptimas y máximas por encima de los 15 °C. Esto hace que estos microbios sean especialmente problemáticos para alimentos y bebidas, como la carne cruda y la leche conservadas a bajas temperaturas durante largos períodos de tiempo. Los grupos psicrotróficos de bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en los alimentos son los géneros gramnegativos Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium y Flavobacterium, así como géneros grampositivos, como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus y Microbacterium. También se sabe que Listeria monocytogenes y algunas cepas de Clostridium botulinum pueden proliferar en temperaturas de refrigeración.
¿Por qué deberían preocuparle? Las bacterias psicrotróficas son microrganismos adulterantes y pueden disminuir significativamente la calidad y la vida útil de los alimentos. Las instalaciones de producción refrigeradas y los tanques de almacenamiento ofrecen un ambiente favorable para la multiplicación de estas especies de bacterias. En la leche refrigerada, p ej., Pseudomonas fluorescens
8
puede producir tanto proteasas como lipasas. Por lo tanto, se considera que las especies que pertenecen al género Pseudomonas son típicamente responsables de las dificultades tecnológicas, ya que las proteasas y las lipasas que producen pueden hacer que la grasa y las proteínas de la leche se degraden, lo que otorga a la leche un color grisáceo y un sabor amargo. Las especies de Pseudomonas son los microrganismos responsables en la mayoría de los casos de la putrefacción de la carne refrigerada conservada en un ambiente aeróbico. Es bien sabido que las especies de Pseudomonas son muy resistentes y capaces de soportar condiciones ambientales estresantes que inhibirían el crecimiento de otros microrganismos de putrefacción. En la carne cruda refrigerada y envasada al vacío, la microflora está dominada en su mayor parte por bacterias psicrotróficas del ácido láctico. Además, el crecimiento de microrganismos patógenos durante el almacenamiento en refrigeración puede causar enfermedades graves.
#5 Las biopelículas Los microrganismos pueden colonizar superficies mediante la formación de una matriz polimérica en la que puede haber presentes múltiples especies microbianas; esto es lo que se conoce como biopelícula. Hay pruebas que demuestran que la capacidad de formar biopelículas y sobrevivir en estas no se limita a grupos específicos de microrganismos. De hecho, la gran mayoría de bacterias puede formar biopelículas. Por tanto, las biopelículas pueden estar compuestas de monocultivos o de varias especies diferentes de microrganismos. Algunos investigadores han sugerido que la compleja estructura de las biopelículas mixtas las hace más estables y más resistentes a los Spot On número 15
Las trazas de ATP procedentes de residuos alimentarios u hongos pueden ocultar fácilmente el ATP liberado por productos químicos de limpieza. La población inicial que se une a la superficie puede cambiar las propiedades de dicha superficie, lo que permite a las bacterias que aparezcan posteriormente unirse mediante adhesión intercelular; en algunos casos, la unión de una segunda especie puede aumentar la estabilidad de la población de la biopelícula. Por ejemplo, ciertos estudios demuestran que es más probable que L. monocytogenes se adhiera al acero en presencia de Pseudomonas.
¿Por qué deberían preocuparle? Las biopelículas que se forman en el equipo de procesamiento de alimentos y en otras superficies que entran en contacto con los alimentos son una fuente persistente de contaminación, lo que supone una amenaza para la calidad y la seguridad generales de los productos alimenticios y puede ocasionar enfermedades de origen alimentario, así como pérdidas económicas. Se sabe que los microrganismos de putrefacción son responsables de casi un tercio de las pérdidas en las cadenas de suministro de alimentos, por lo que la prevención y el control de las biopelículas es una prioridad para la industria alimentaria. Los microrganismos que se forman o proliferan en biopelículas son más resistentes a la desinfección, por lo que suponen un problema en un amplio abanico de industrias alimentarias. Otros efectos de las biopelículas, como la corrosión de las superficies metálicas, son otra preocupación crítica para estas industrias. En cualquier caso, la presencia de biopelículas en una fábrica de alimentos pone en riesgo la salud humana. El grado de riesgo depende de las especies de bacterias que formen esta estructura tridimensional viva.
¿Cómo cubrimos estas deficiencias? El potencial de la citometría de flujo Por lo general, los fabricantes de alimentos no disponen de muchas opciones. Las que ofrecen un mínimo de precisión, como la tinción vital en Una publicación de Romer Labs®
combinación con microscopios, pueden cuantificar las bacterias VNC, pero requieren mucho tiempo y un equipo especial. Todos los grupos de bacterias anaerobias y microaerófilas, con la notable excepción de los anaerobios facultativos, pueden crecer en las clásicas placas de agar, pero solo con niveles de oxígeno cuidadosamente controlados. No obstante, las placas de agar no son la panacea. En las placas de agar se puede contar solo aproximadamente el 1 % de las especies de bacterias conocidas y se tarda días en obtener los resultados, hasta 10 días en el caso de las bacterias psicrotróficas. Los métodos de ATP, aunque son rápidos, no cuantifican las bacterias y solo tienen una utilidad limitada a la hora de detectar bacterias de biopelículas; los datos cinéticos de células planctónicas en suspensión libre no deben utilizarse como referencia, ya que la liberación de ATP es mucho menor en las biopelículas. Además, las trazas de ATP procedentes de residuos alimentarios u hongos pueden ocultar fácilmente el ATP liberado por bacterias, puesto que las células eucariotas contienen 10 millones de veces más ATP que las células procariotas. En consecuencia, los dispositivos de ATP utilizados para detectar biopelículas suelen tener un límite de detección mucho más alto, lo que implica que no son tan sensibles como lo serían en la detección de bacterias de libre flotación. Cada uno de estos cinco casos demuestra lo difícil que puede llegar a ser detectar bacterias y residuos en las superficies de producción de alimentos; las carencias de los métodos de detección más habituales, como las pruebas en placa y de ATP, están bien documentadas, pero son difíciles de abordar. ¿Qué pueden hacer los productores de alimentos para cubrir las deficiencias de los métodos de cultivo y los ensayos de ATP? En el siguiente artículo, mi compañero Cristian Ilea habla sobre el potencial de la citometría de flujo por impedancia y el citómetro de flujo CytoQuant®, una nueva solución que cuantifica inmediatamente las bacterias y las partículas de residuos en las superficies.
bacterias, ya que las células eucariotas contienen 10 millones de veces más ATP que las células procariotas.
9
10
Spot On número 15
¿Revolución o mera evolución?
Citometría de flujo y verificación de la limpieza y la desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos La seguridad de los alimentos depende en gran medida de las condiciones higiénicas en las instalaciones de fabricación de alimentos. Altos niveles de bacterias de putrefacción pueden afectar a la vida útil y la calidad de los alimentos, mientras que la presencia de microrganismos patógenos (como Salmonella y Listeria) pueden causar enfermedades graves. Los fabricantes de alimentos deben ser diligentes a la hora de mantener su entorno de procesamiento limpio y libre de microrganismos patógenos para evitar la contaminación cruzada del producto final. ¿Pero cómo se hace esto actualmente? Por Cristian Ilea, jefe de Mercadotecnia y Gestión de Productos
Una publicación de Romer Labs®
11
Los fabricantes de alimentos necesitan un método rápido que cuantifique directamente tanto las bacterias como las partículas de residuos y no se vea afectado por los desinfectantes ni la temperatura.
Inspección visual Aunque la inspección visual es un prerrequisito, no es suficiente por sí misma. Es una forma subjetiva e imprecisa de verificar si una limpieza es adecuada. Lo que es más importante: incluso aunque no haya residuos aparentes en una superficie, no significa que esté inmaculada. Mediante la inspección visual no se puede garantizar que todos los residuos alimentarios de la producción anterior se hayan limpiado o que un desinfectante haya reducido eficazmente la concentración microbiana en la superficie.
La enumeración microbiana con métodos de cultivo Se trata de métodos tradicionales para monitorizar la higiene del entorno de procesamiento. En general, hay dos formas de realizar el muestreo: mediante contacto o mediante hisopado. Con los métodos de contacto, se colocan placas o portaobjetos de inmersión en la superficie que se quiere muestrear y, posteriormente, se incuban. El muestreo por hisopado se lleva a cabo con hisopos o esponjas que se enjuagan en una solución amortiguadora, la cual después se inocula en medios de cultivo estériles y se incuba. La limitación principal de estos métodos tradicionales de determinación microbiana es la cantidad de tiempo que se tarda en obtener resultados. Además, la mayoría de las especies de bacterias no puede cultivarse en agar, un fenómeno conocido como la gran anomalía del recuento en placa.
Detección de ATP El trifosfato de adenosina (ATP) es un nucleótido que utilizan las células para producir energía. Se puede considerar como la «unidad de divisa» molecular de la energía en todas las células vivas. La energía se transfiere cuando el ATP se separa en su nucleósido y su fosfato libre. La hidrolización de los enlaces covalentes de los fosfatos libera una energía que se usa en reacciones. Los sistemas de las pruebas de ATP comerciales aprovechan la reacción de la luciferina o la luciferasa, muy común en la naturaleza, para generar luz con la energía proporcionada por el ATP. Cuanta más luz se emita, más ATP hay presente, lo que indicaría indirectamente que hay más residuos de alimentos o (posiblemente) más microrganismos. No obstante, hay un pero importante: puesto que estos sistemas se basan en una reacción enzimática, posibles inhibidores o unas condiciones ambientales subóptimas podrían llevar a resultados erróneos. La temperatura ambiental podría aumentar el tiempo de reacción, mientras que la luz puede dificultar que se obtengan lecturas correctas. Asimismo, los desinfectantes pueden interferir con la reacción, lo que significa que quizás no exista una correlación real entre las bacterias vivas presentes en la superficie y los
12
resultados de la medición del ATP. Por tanto, los métodos de ATP suelen usarse para analizar superficies antes de aplicar el desinfectante. Los métodos de ATP presentan otra desventaja más: su aplicabilidad depende de la naturaleza de los alimentos que se procesen. La mayoría de los alimentos dejan un residuo que contiene grandes cantidades de ATP, la cuales sobrepasan en varios órdenes de magnitud las cantidades que contienen las células bacterianas. En la práctica, esto significa que los sistemas de ATP no pueden usarse para evaluar la contaminación microbiana en las superficies de la mayoría de instalaciones de procesamiento de alimentos. Aunque ninguna bacteria puede contarse directamente, los sistemas de ATP se utilizan ampliamente porque arrojan resultados en segundos, un tiempo rápido que ninguna otra tecnología comúnmente disponible hasta ahora ofrece.
Entonces, ¿por qué no podemos tenerlo todo? El santo grial de la verificación de la limpieza y la desinfección Lo que los fabricantes de alimentos necesitan es un método rápido que cuantifique directamente tanto las bacterias como las partículas de residuos y no se vea afectado por los desinfectantes ni la temperatura. Aunque esto parece estar fuera de nuestro alcance, la tecnología básica para que sea una realidad ya existe y se está utilizando. Presentación de la citometría de flujo La citometría de flujo (CMF) se refiere a un grupo de técnicas que utilizan señales ópticas o eléctricas para detectar y medir ciertas propiedades físicas o químicas de células y partículas suspendidas en un líquido. Casi 300 estudios realizados entre los años 2000 y 2018 evaluaron la CMF como herramienta para caracterizar la calidad microbiana del agua. Con esta investigación se pudo ilustrar el valor de la CMF en el tratamiento, la distribución y la reutilización del agua. Actualmente existe un conjunto de investigaciones que documenta la aplicación satisfactoria de la CMF lo suficientemente robusto como para sugerir que podría, de manera razonable y realista, adoptarse de forma generalizada como método habitual para evaluar la calidad del agua. ¿Qué tiene que ver todo esto con la evaluación de la eficacia de la limpieza y desinfección en las instalaciones de fabricación de alimentos? Los métodos Spot On número 15
que se utilizaban anteriormente de forma habitual para determinar la calidad del agua a menudo se veían limitados por la sensibilidad baja, los altos requisitos de trabajo y tiempo, la susceptibilidad a las interferencias de compuestos inhibidores y las dificultades para distinguir entre células viables y no viables. (Todo eso le suena, ¿verdad?) Pero, cuidado: los citómetros de flujo por fluorescencia suelen ser dispositivos poco manejables y caros que requieren un personal muy formado para su uso.
Todo el poder de una citometría de flujo en un dispositivo portátil Para que la CMF sea una solución viable en la verificación de la limpieza de las instalaciones de procesamiento de alimentos, tiene que venir en un formato portátil simple y fácil de usar, a la vez que tener la precisión suficiente para suministrar recuentos fiables de bacterias y partículas de residuos en muestras ambientales. Esto se ha hecho realidad gracias al uso de la citometría de flujo por impedancia. La citometría de flujo por impedancia es un tipo específico de citometría de flujo: en lugar de utilizar sistemas ópticos como la tecnología láser, los citómetros de flujo por impedancia usan una corriente alterna en diferentes frecuencias que permite al dispositivo detectar y contar células y partículas de residuos por separado. Mientras que los citómetros de flujo ópticos solo pueden contar células marcadas con colorantes, los citómetros de flujo por impedancia pueden realizar la misma operación sin necesidad de marcado. En comparación con otros dispositivos de citometría de flujo, son compactos, portátiles y tienen batería, lo que permite su uso en el lugar en el que se toma la muestra.
¿Cómo distinguen los citómetros de flujo por impedancia entre células y partículas de residuos? Las propiedades electromagnéticas de las bacterias permiten a los citómetros de flujo diferenciar a estas de otras partículas. El citoplasma y la membrana celular de una bacteria cambian el campo eléctrico de una forma única e identificable. Mientras que la corriente eléctrica pasará a través de partículas metálicas prácticamente sin impedimentos, las partículas no conductoras resisten el campo eléctrico. No obstante, las bacterias intactas se parecen tanto a las partículas no conductoras como a las conductoras: la membrana celular evita que las frecuencias bajas penetren en esta, lo que hace que se parezcan a las partículas no conductoras; sin embargo, a altas frecuencias, la corriente eléctrica penetra en la membrana. Los microelectrodos del citómetro de flujo por impedancia generan estos campos eléctricos y permiten al dispositivo cuantificar los cambios en la conductividad y la resistencia con mediciones separadas de células intactas y partículas. Una publicación de Romer Labs®
Aplicación de la citometría de flujo por impedancia en la seguridad alimentaria: presentación de CytoQuant®
Los citómetros de
Como se menciona anteriormente, una ventaja de los citómetros de flujo por impedancia con respecto a otros tipos de dispositivos citométricos es su portabilidad. Al ser ligeros, pequeños y con batería, pueden utilizarse in situ y en puntos de control críticos en los que la higiene es una preocupación fundamental. El citómetro de flujo por impedancia CytoQuant® está diseñado para su uso en dichas áreas, incluidas las instalaciones de producción de alimentos y las salas asépticas. Los citómetros de flujo por impedancia aportan ventajas considerables a los productores de alimentos que buscan verificar la seguridad de los alimentos y sus programas de limpieza: la cuantificación rápida y por separado de las bacterias y las partículas de residuos (lo que puede servir como indicador de la eficacia de la limpieza), la sensibilidad del método y la robustez del equipo de hisopado y del propio citómetro. El sistema CytoQuant® es fácil de usar, ya que el dispositivo realiza todo el trabajo, a excepción del hisopado. Un análisis comienza mediante el hisopado de un área predefinida (p. ej., 20 × 20 cm u 8 × 8 in) de la superficie que se va a analizar. A continuación se pone el hisopo en un vial que contiene una solución conductora patentada y luego se agita el vial para suspender las bacterias. Cuando se analizan aguas de enjuague, la muestra se coloca directamente en un vial vacío y luego se agregan unas gotas de solución electrolítica. Después de mezclar la muestra, el usuario inserta el vial en el CytoQuant®. Dos agujas atraviesan la base del tubo, conectando el líquido con el sistema de flujo del dispositivo. Después, una vez que la solución se ha introducido en el sistema de flujo, se pasa por los electrodos de la celda de flujo. Tras 30 segundos, el dispositivo registra resultados separados para las bacterias y las partículas y los muestra en la pantalla.
usan una corriente
flujo por impedancia alterna en diferentes frecuencias que permite al dispositivo detectar y contar células y partículas de residuos por separado.
¿Revolución o evolución? El citómetro de flujo móvil CytoQuant® permite la verificación inmediata e in situ de los procedimientos de limpieza y desinfección en las instalaciones de producción de alimentos u otras áreas donde la higiene es crucial. Mediante la cuantificación directa de las bacterias y las partículas de residuos en las superficies sin la influencia negativa de los desinfectantes o la temperatura, proporciona ventajas significativas frente a los dispositivos de ATP, mientras que el tiempo de espera hasta obtener los resultados de 30 segundos lo convierte en un complemento perfecto para mejorar los programas de higiene en los que ya se utilizan métodos de cultivo. Teniendo en cuenta el enorme potencial de la citometría de flujo por impedancia, puede que en algún momento llegue a considerarse equivalente a los métodos de cultivo, o incluso que los sustituya como método habitual para verificar la limpieza. Esto supondría una auténtica revolución en este ámbito.
13
Citometría de flujo por impedancia y su uso en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos ¿Qué es la citometría de flujo, cómo funciona y qué aplicación tendría en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos? Florin Soptica y Stefan Widmann responden a estas y otras preguntas. Por Florin Soptica, director de producto, Romer Labs; y Stefan Widmann, jefe del equipo de I+D, Romer Labs
La citometría de flujo por impedancia es una potente variante de la citometría de flujo, ya que es muy robusta y puede utilizarse para evaluar las características celulares que, de otro modo, no se podrían determinar sin el uso de marcadores moleculares, como la integridad de la membrana celular.
¿Qué es la citometría de flujo? La citometría de flujo se refiere a un grupo de técnicas que usa un láser o un campo eléctrico para contar las células suspendidas en un líquido y para determinar algunas de sus propiedades físicas o químicas. De manera óptima, las células fluyen de una en una a través del canal microfluídico del citómetro, el cual detecta variaciones en la longitud de onda de la luz o en la carga eléctrica mientras las células u otras partículas lo atraviesan. Puesto que, para la citometría de flujo, generalmente se necesitan dispositivos grandes y caros, así como exigentes etapas de preparación, el método se ha limitado tradicionalmente al uso en laboratorios en campos de aplicación como la investigación o la medicina.
Utilizar la citometría de flujo por impedancia para contar tanto células como partículas de residuos La citometría de flujo por impedancia se deriva de la tecnología en la que se basan los contadores de partículas Coulter, que pueden contar las partículas suspendidas en electrolitos y determinar su tamaño mediante los cambios en la impedancia causados por el desplazamiento de los electrolitos por las partículas. Al medir al mismo tiempo frecuencias múltiples de cada partícula que pasa, la citometría de flujo por impedan-
cia puede discriminar entre partículas no solo por su tamaño, sino también por sus propiedades eléctricas. Esto supone una potente variante de la citometría de flujo, ya que es muy robusta y puede utilizarse para evaluar las características celulares que, de otro modo, no se podrían determinar sin el uso de marcadores moleculares, como la integridad de la membrana celular. Por tanto, el lugar de un láser, un citómetro de flujo por impedancia utiliza una corriente alterna, y sus distintas frecuencias permiten al dispositivo detectar células con la membrana intacta y otras partículas, medir su tamaño y contarlas por separado. En comparación con otros dispositivos de citometría de flujo, los citómetros de flujo por impedancia pueden ser ligeros, portátiles y funcionar con batería, lo que permite su uso en el lugar en el que se toma la muestra. ¿Cómo distinguen los citómetros de flujo por impedancia entre las células y otras partículas? La citometría de flujo por impedancia aprovecha las propiedades electromagnéticas únicas de la membrana celular y el citoplasma para distinguir a las bacterias de otras partículas. La membrana y el citoplasma de una célula influyen en el campo eléctrico de una forma diferente a la de otras partículas de la muestra. Un ejemplo con partículas metálicas (conductoras), partículas no conductoras y células intactas puede ilustrar este
Cómo identifican las bacterias los citómetros de flujo por impedancia
Las bacterias (en rojo) y otras partículas fluyen a través del canal de microfluidos del citómetro.
14
Los microelectrodos del canal de flujo microfluídico generan campos eléctricos a altas y bajas frecuencias.
Spot On número 15
principio más claramente. Independientemente de la frecuencia del campo eléctrico, la conductividad de las partículas metálicas permitirá que el campo eléctrico pase sin impedimentos. Por el contrario, las partículas no conductoras, como el poliestireno, resistirán el campo eléctrico; la corriente solo avanzará en el medio líquido, lo que provoca un desplazamiento del volumen medible correlacionado con las partículas del canal de flujo. Sin embargo, las células intactas son únicas porque se asemejan tanto a partículas no conductoras como a partículas metálicas, dependiendo de la frecuencia del campo eléctrico. A bajas frecuencias, la cualidad aislante de la membrana de una célula impide que el campo eléctrico penetre en ella, lo que provoca el mismo tipo de desplazamiento que con las partículas no conductoras. En cambio, las frecuencias más altas pueden penetrar parcialmente la membrana; así, las células tienen una conductividad similar a la de las partículas metálicas. Los microelectrodos de los citómetros de flujo por impedancia generan campos tanto a baja como a alta frecuencia, lo que permite al dispositivo detectar estos cambios en la conductividad y la resistencia y asignarlos con cifras precisas a células intactas o a otras partículas. El detector identifica el objetivo como una bacteria sobre la base del grado variable de impedancia o conductividad en estas frecuencias. El usuario recibe entonces recuentos separados de células intactas y otras partículas.
Comparación de la citometría de flujo por impedancia con los métodos de cultivo Los métodos de cultivo, en concreto el uso de placas de agar, son el método tradicional para monitorizar el saneamiento de los entornos de procesamiento de alimentos. No obstante, los métodos de cultivo, aunque están bien establecidos, presentan ciertas desventajas con respecto al tiempo que requieren y su ámbito de aplicación. Los métodos de cultivo son lentos, ya que necesitan entre uno y diez días para que las bacterias
Las bacterias y las partículas influyen en el campo eléctrico al fluir entre los electrodos.
Una publicación de Romer Labs®
formen bacterias cuantificables. Estos métodos solo miden aquello que es cultivable en las condiciones específicas de un análisis dado; una especie u otros grupos de bacterias pueden requerir un agar específico o un medio líquido a una temperatura, un grado de iluminación o una humedad exactos, entre otras variables. Además, los métodos de cultivo no pueden utilizarse para la medición global de todas las bacterias que haya en una muestra. La «gran anomalía del recuento en placa», un enigma muy conocido en microbiología, señala que, mediante el cultivo, solo puede recuperarse una pequeña fracción de bacterias en un hábitat. Las bacterias en un estado viable no cultivable (VNC) están vivas, pero, debido al estrés, a idiosincrasias o a unos factores ambientales subóptimos, no pueden crecer en agar ni en medios de cultivo líquidos. En algunos casos, pueden cultivarse tras la resucitación, un proceso que, de nuevo, requiere tiempo. Se sabe que algunas bacterias patógenas, como E. coli O157, entran en un estado VNC y proliferan en etapas posteriores de la cadena alimentaria o en los anfitriones humanos tras la ingestión. Además, las bacterias anaerobias y microaerófilas requieren la ausencia de oxígeno o una concentración de este inferior a la de las condiciones atmosféricas normales, respectivamente. Las bacterias de estos grupos que son cultivables requieren unas condiciones de incubación especiales, lo que incrementa el coste de los análisis. Los citómetros de flujo por impedancia cuentan todas las bacterias que pasan a través del canal de flujo, independientemente de su estado (cultivable, VNC, no cultivable o latente) o de sus necesidades para el crecimiento. Estas cuantificaciones directas e inmediatas amplían el alcance de los programas de control de higiene; con la citometría de flujo por impedancia también se pueden identificar las bacterias que no se multiplican hasta que entran en contacto con los alimentos o con posibles anfitriones. Además, permite que se tomen medidas inmediatas cuando la limpieza y la desinfección no funcionan según lo previsto.
Los citómetros de flujo por impedancia cuentan todas las bacterias que pasan a través del canal de flujo, independientemente de su estado (cultivable, VNC, no cultivable o latente) o de sus necesidades para el crecimiento.
La huella única de las bacterias: el campo eléctrico solo puede penetrar la membrana celular de las bacterias a altas frecuencias. A bajas frecuencias, la cualidad aislante de la membrana evita que esto ocurra.
15
VE LO QUE OTROS NO VEN.
VERIFIC
I N M E D IAC I Ó N ATA DE L I M P
IE D ES I N F Z A Y ECC I Ó N
CytoQuant® cuantifica bacterias y residuos en 30 segundos. Obtén recuentos separados y precisos de bacterias y residuos en superficies de producción, todo en un sencillo procedimiento de dos pasos. Más información en cytoquant.com