Los tres desafíos principales en las Auditorías Externas para Acreditación

Número 1

Una publicación de Romer Labs®

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Creando Calibradores Líquidos para Micotoxinas: Una mirada detrás de escena

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Los tres desafíos principales en las Auditorías Externas para Acreditación

Contenidos

4-6 Los tres desafíos principales en las Auditorías Externas para Acreditación Sortear con éxito los principales desafíos para la mayoría de los laboratorios: trazabilidad, incertidumbre de las mediciones y efecto matriz.

Por Elisabeth PICHLER, PhD, Jefe de Gestión de Calidad, Romer Labs®

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Trazabilidad y Materiales de Referencia Certificados La trazabilidad completa es un factor clave durante las auditorías. Una forma de cumplir con esto, es contar con Materiales de Referencia Certificados acompañados con la documentación clara y completa.

Por Lilian KUSTER, PhD, Gerente de Producto, Romer Labs®

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Superar los efectos matriz en LC-MS/MS para lograr la máxima confiabilidad

Spot On es una publicación cuatrimestral de Romer Labs Division Holding GmbH, de distribución libre.

La validación de los métodos usados como rutina puede eliminar efectos severos de las matrices más comunes, pero aun dejan un amplio margen de falta de confiabilidad.

Por Lilian KUSTER, PhD, Gerente de Producto, Romer Labs®

ISSN: 2414-2042

Editores: Cristian Ilea, Simone Schreiter

Contribuciones: Elisabeth Pichler, Lilian Kuster, Anna Lilek Gráfica: Reinhold Gallbrunner Investigación: Kurt Brunner

Publicación a cargo de : Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com ©Copyright 2024, Romer Labs®

Todos los derechos reservados.

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Todas las fotografías son propiedad de Romer Labs o utilizadas bajo licencia.

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8-11 Creando Calibradores Líquidos para Micotoxinas: Una mirada detrás de escena Una revisión paso a paso a través de la secuencia de producción de materiales de referencia claves para las industrias de alimentos.

Por Anna LILEK, Gestión de Calidad, Romer Labs®

Spot On Número 1

Editorial Enhebrando la aguja Los laboratorios de servicios analíticos trabajan bajo una gran presión. Ser capaces de entregar resultados de la más alta calidad para varias matrices, es un prerrequisito importante para los clientes potenciales. Sin embargo, es frecuente que los clientes no tengan la capacidad para evaluar la calidad de los resultados, y la única manera de que tienen para evaluar la competencia de un laboratorio es confiar en la acreditación externa de acuerdo a la norma ISO 17025. Los criterios que consideran más importantes al momento de seleccionar un laboratorio tienden a ser precio y tiempo de respuesta. En contraste a estas presiones de mercado, los organismos de acreditación tienen requerimientos como ser la documentación, validaciones para todas las matrices, muestras control, trazabilidad total, participación en rondas interlaboratoriales internacionales y capacitación permanente para todos los empleados del laboratorio – todos factores que agregan costos y reducen la velociodad de respuesta en el laboratorio. En este ambiente altamente competitivo, es crucial encontrar formas de cumplir con requerimientos que contradicen la eficiencia.

En este número inaugural de Spot On, nuestra publicación para los profesionales de la industria analítica, nos enfocamos en los tres grandes desafíos que pueden presentarse durante el proceso de auditoría externa: trazabilidad, incertidumbre de las mediciones y efecto matriz.

Los materiales de referencia certificados que cuenten con un certificado de análisis, acompañan el largo camino para cumplir con el primer punto. Para la determinación del segundo punto, hay disponibilidad de varios métodos diferentes. Con respecto al tercer punto, los estándares marcados con 13C pueden corregir completamente los efectos matriz en el análisis por LC-MS/MS. Finalmente, para explorar a fondo la trazabilidad, recorreremos el proceso completo de producción desde el cultivo de inicial de hongos hasta la entrega a los clientes de calibradores líquidos de micotoxinas.

Esperamos que disfrute la lectura de este primer número de la publicación cuatrimestral Spot On. ¡Feliz lectura!

Elisabeth Pichler Jefe de Gestión de Calidad, Romer Labs®

Una Publicación de Romer Labs®

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Los tres desafíos principales durante las Auditarías Externas para Acreditación

La función de un gerente de laboratorio es hacer frente tanto de las necesidades de los clientes así como las de las autoridades de los organismos externos de acreditación. Los tres puntos descriptos en este artículo explican la clave para obtener resultados confiables.

Por Elisabeth PICHLER, PhD, Jefe de Gestión de Calidad, Romer Labs®

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as auditorías externas para la acreditación ISO 17025, pueden ser un verdadero examen para el conocimiento. Normalmente, los auditores trabajan en el mismo campo que auditan, y son verdaderos expertos.

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Ellos evalúan la competencia técnica en profundidad.

Para la mayoría de los laboratorios, la incertidumbre de las mediciones y los efectos matriz, son los principales desafíos que se presentan durante una auditoría externa para la acreditación.

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Trazabilidad Este es uno de los problemas con los que se enfrenta el laboratorio. Para un laboratorio acreditado es necesario demostrar que los resultados que se presentan en los reportes analíticos tienen trazabilidad hasta las unidades de medidas de los estándares internacionales (IS). En el caso de que un resultado se presente en µg/kg (microgramos por kilogramo) obtenido mediante análisis con HPLC (Cromatografía Líquida de Alto Desempeño) o LC-MS (Cromatografía Líquida con detección mediante espectrometría de masas) se requiere una documentación muy clara.

En ambos casos, tanto utilizar un estándar líquido para la curva de calibración, como para dejar asentada una trazabilidad total hasta el kg base del SI, los auditores requerirán un reporte certificado de los proveedores de la preparación del material, así como todas las mediciones hechas. (Para más información, leer el texto en el recuadro “Trazabiliad y Materiales de Referencia Certificados”)

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Incertidumbre de las mediciones Bajo los requerimientos de la ISO 17025, la incertidumbre de las mediciones (mu) para cada método acreditado, debe ser calculada e incluida en los reportes de los análisis. Existen varias formas de calcular o estimar la incertidumbre de las mediciones, y la forma aceptada en cada caso depende mucho de los cuerpos de acreditación nacionales. Una manera simple y práctica de estimar la incertidumbre de las mediciones para los laboratorios pequeños, es empleando una carta de control. Es una Buena Práctica de Laboratorio utilizar una muestra para el control, idealmente naturalmente contaminada o fortificada con el analito de interés.

Esta muestra control debe correrse con cada secuencia de análisis a llevarse a cabo en el Laboratorio.

Los resultados de las muestras control se incorporan a una carta de control que se utiliza para establecer la tendencia a largo termino. La incertidumbre de la medición se deriva a partir de 2 desvíos estándar de todos los resultados. En Europa, un enfoque válido es el de “Aptitud para el uso” publicado en el Reglamento de la Comisión (EC) No 401/2006, donde se detallan los métodos de toma de muestras y de análisis para el control de micotoxinas en alimentos.

Una Publicación de Romer Labs®

Trazabilidad y Materiales de Referencia Certificados La trazabilidad completa es un factor clave durante las auditorías.

Una forma de cumplir con ésto, es contar con Materiales de Referencia Certificados acompañados con la documentación clara y completa.

Por Lilian KUSTER, PhD, Gerente de Producto, Romer Labs®

Diferentes términos pueden usarse para describir un estándar de referencia en un método analítico, como ser material de referencia, material de referencia certificado, calibrador, estándar, etc.

Los materiales de referencia certificados, se definen como materiales de referencia caracterizados por una trazabilidad metrológica, un valor certificado y una incertidumbre asociada.

Esto cumple con todos los requerimientos de ISO 17025, GLP, etc. y cuenta con la documentación completa de: • estado de pureza del material original • trazabilidad retrospectiva hasta estándares nacionales • medición de la incertidumbre y su cálculo • estudio de homogeneidad • estudio de estabilidad a corto y largo plazo • descripción de la intención de uso Los materiales de referencia certificados se utilizan para la verificación de los estándares preparados en el laboratorio y que se emplean como materiales de referencia en las rutinas

analíticas. Son empleados para la calibración de instrumentos, especialmente en aquellos laboratorios acreditados bajo ISO 17025 donde la trazabilidad y calidad de los resultados son muy importantes.

La tabla 1 ilustra las diferencias entre un material de referencia y un material de referencia certificado para los calibradores BiopureTM. Un material de referencia certificado cuenta con una comprobación completa de la trazabilidad, la cual es importante durante el proceso de auditoría. Además, cuenta con una incertidumbre declarada y una total transparencia del proceso de preparación y certificación. Únicamente una institución acreditada que se apega estrictamente a la Guía ISO 34 está habilitada para extender certificados de referencia. La Guía ISO 34 define los “Requerimientos generales para la competencia de los productores de materiales de referencia” y están elaborados bajo la ISO 17025, incluyendo los requisitos técnicos adicionales para los materiales de referencia certificados.

Tabla 1. Diferencias entre materiales de referencia y materiales de referencia certificados BiopureTM Material de referencia Material de referencia certificado BiopureTM BiopureTM Pureza de la Establecida por método qNMR acredEstablecida por HPLC-UV materia prima itado Certificado de Análisis y reporte comDocumentación Certificado de Análisis pleto de certificación Datos de estabilidad a corto y Datos de Disponible, pero no con largo plazo están disponibles y estabilidad un enfoque sistemático estadísticamente evaluados de acuerdo a la Guía ISO 35 Conjunto completo de datos de No disponibles (las Datos de homogeneidad de acuerdo a la Guía soluciones líquidas se homogeneidad ISO 35 están disponibles y analizados consideran homogéneas) estadísticamente Competencia del Sin pruebas formales Aprobado por un cuerpo nacional de productor de competencia acreditación Procesos y Completamente trazeables y descriptos No 100% transparentes cálculos en el reporte de certificación Uso de instrumentos con certificados Usos de instrumentos con Instrumentos externos de calibración y bajos valores calibración estándar de incertidumbre Vial de vidrio ámbar con Vial con bucle de vidrio inerte Empaque/Llenado tapa a rosca de la más alta calidad

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Tabla 2. Los 8 pasos del método GUM

Con estas herramientas a mano, los laboratorios estarán mejor posicionados para recorrer de manera exitosa el proceso de auditoría.

La siguiente formula presenta una forma de calcular la incertidumbre estándar máxima:

!" =

(

!"# ! ) + (! ×!)!

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donde: • Uf es la incertidumbre estándar máxima (μg/kg) • LOD es el límite de detección del método (μg/kg) • α es una constante, factor numérico que depende del valor de C. • C es la concentración de interés (μg/kg).

Tabla 1. Valores para la constante (α) Concentración (μg/kg)

α

≤ 50

0,2

51-500

0,18

1 001-10 000

0,12

501-1 000

0,15

> 10 000

0,1

Otro enfoque es seguir los pasos descriptos en JCGM 100:2008 Guía para la Expresión de la Incertidumbre de las Mediciones (GUM) en la Tabla 2. De acuerdo con ello, la incertidumbre de una medición, es el resultado de nuestro conocimiento incompleto del valor de la magnitud medida en combinación con los factores que influyen en ella. La Tabla 3 enumera muchas de las posibles fuentes de incertidumbre en las mediciones.

➌

Efectos de la matriz Los laboratorios de servicios acreditados, todos los días se encuentran con diversas matrices para ser analizadas. Estos laboratorios tienen sus métodos validados para las matrices más comunes. Sin embargo, incluso el análisis de las matrices más simples, como ser el maíz, pueden verse influenciadas con, por ej., las variedades

Certificación ≠ Acreditación Algunas veces los términos certificación y acreditación pueden resultar confusos. Cualquiera que quiera certificar algo, ya sea un sistema de gestión, un producto o una persona, necesita estar acreditado para esta tarea por parte de un organismo nacional de acreditación. La acreditación bajo la norma ISO 17025 permite emitir certificaciones válidas en muchas jurisdicciones.

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Spot On Número 1

1. Describir el valor medido en términos de su proceso de medición (modelo de la medición) 2. Enumerar las magnitudes de entrada 3. Determinar la incertidumbre para cada magnitud de entrada 4. Evaluar cualquier covarianza/correlación en las magnitudes de entrada 5. Calcular el valor medido para reportar 6. Combinar correctamente los componentes de la incertidumbre 7. Multiplicar la incertidumbre combinada por un factor de cobertura 8. Reportar el resultado en el formato adecuado Tabla 3. Posibles fuentes de incertidumbre en las mediciones

1. Definición incompleta de la magnitud a ser medida 2. Realización imperfecta de la definición de la magnitud a ser medida 3. Toma de muestras no representativa 4. Conocimiento inadecuado de los efectos de las condiciones ambientales o medición inadecuada de las condiciones ambientales 5. Desvíos personales en la lectura con instrumentos analógicos, incluyendo los pareamientos.

6. Resolución finita o umbral de discriminación 7. Valores inexactos de los estándares de medición o de los materiales de referencia 8. valores inexactos de constantes y otros parámetros obtenidos de fuentes externas y utilizados en el algoritmo de reducción de datos 9. Aproximaciones y suposiciones incorporadas en el método de medición y el procedimiento 10. Las variaciones en observaciones repetidas de la medida y en condiciones aparentemente idénticas

de maíz. Las muestras más compuestas como ser los alimentos balanceados o productos alimenticios muy procesados, pueden alterar los resultados de los análisis. Hoy en día, el enfoque más usado es emplear estándares internos marcados con 13C para cada analito, y un cálculo con base en la calibración interna, para obtener resultados más exactos.

(Para más detalles, leer el recuadro con el texto 'Superando los efectos de las matrices para obtener resultados más confiables con LC-MS/MS', página 7)

Conclusiones La trazabilidad, la incertidumbre de las mediciones y los efectos matriz, son los principales desafíos para los laboratorios durante los procesos de auditorías para acreditar.

Un reporte certificado de un proveedor acreditado es el inicio del camino de la trazabilidad. Para el cálculo de la incertidumbre existen muchos métodos. Pero para corregir por completo el efecto de las matrices, la única manera es utilizar estándares internos marcados con 13 C. Estas son las herramientas para recorrer con seguridad el proceso de una auditoria externa.

Superar los efectos matriz en LC-MS/MS para lograr la máxima confiabilidad Como en cualquier técnica analítica, los resultados obtenidos mediante cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas en tándem, (LC-MS/MS) se ven influidos por la matriz analizada.

Estos efectos de la matriz – causada por la supresión o realce de los iones – puede ser la causa de sobre o subestimación en los valores medidos del analito buscado.

La validación de los métodos de rutina puede eliminar los efectos más severos en las matrices comunes.

Sin embargo, incluso en las matrices más simples como ser el maíz, las diferentes variedades pueden influir en la ionización, dejando así una amplia brecha para la falta de fiabilidad.

Por Lilian KUSTER, Gerente de Producto Romer Labs®

Los enfoques que se emplean para contrarrestar el efecto de las matrices, incluyen la calibración con matriz pareada, adición de estándar a cada muestra y la aplicación de patrones internos. Las dos primeras estrategias, incluyen pasos adicionales de preparación de muestras o más corridas, lo que conlleva más costos. Es importante tener en cuenta que la calibración con matriz pareada y el agregado de patrón interno no compensan por complete los efectos de las matrices. La efectividad del uso de estándares internos para compensar el efecto de las matrices depende de la elección de los calibrantes.

natural. El empleo de Deuterio (²H) para reemplazar el 1H que está presente en forma natural, duplica la masa, razón por la cual, los estándares deuterados pueden presentar tiempos de retención desplazados, lo que causa resultados poco precisos con LC-MS/MS. El uso de un isótopo de nitrógeno es poco práctico, ya que el mismo no está presente en todas las sustancias.

Por otro lado, el Carbono, está presente en forma natural en la mayoría de los compuestos y las micotoxinas. Reemplazar el 12C presente en forma natural por 13C, cambia la masa total del átomo de manera ligera, a diferencia de los estándares deuterados. El agregado de estándares marcados con 13C, por ejemplo, las micotoxinas marcadas con 13C, mantienen las mismas características de sus análogos de 12 C, eluyendo de la columna con el mismo tiempo de retención. La diferencia de masas entre las micotoxinas con 12C y 13 C, como se muestra para el deoxinivalenol en la Figura 1, permite la separación y la identificación de ambos eluatos cuando la detección se lleva a cabo por la espectrometría de masas. El pico de 13C representa la cantidad conocida del estándar agregado. Este pico puede ser utilizado para calcular la cantidad desconocida del analito y de esa manera compensar la eficiencia en la ionización. Esto explica como los estándares marcados con 13C, pueden eliminar los efectos de las matrices.

La importancia de la elección del estándar Los patrones internos pueden ser compuestos químicos relacionados como ser sus derivados (por ej. zearalanona para zearalenona) o compuestos similares con comportamiento idéntico durante el proceso de la ionización, que solamente son diferentes en términos de masa atómica (isótopos estables). Los análisis con LC-MS/MS se fundamentan en ensayos de dilución de isótopos estables para superar los efectos de las matrices mediante la adición de estándares marcados con isótopos estables a la muestra a ser analizada. La marcación con isótopos estables involucre el uso de isótopos no radiactivos como ser ²H, 13C o 15N para reemplazar los átomos que están presentes en forma

Natural DON 296 amu → +15 amu → 13C DON

Figura 1. Barrido del espectro completo del (13C15)-Deoxinivalenol (BiopureTM) x 10 4

DON presente en forma natural �M-H�- m/z = 295 amu

13

13

295.12

2.5

Intensidad

2.0 1.0

0.5

0.0

13

296.12

295

C14-DON 15.8%

309.17 308.17 307.16

300

15 amu

305

Línea roja: DON forma natural. Línea azul: Estándar interno 13C BiopureTM.

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310.17

C13-DON 2.8%

297.12 298.12

290

C15-DON 81.4% 13

1.5

C-DON isótopo marcado de deoxinivalenol �M-H�- m/z = 310 amu

310

315

m/z

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Spot On Número 1

Creando Calibradores Líquidos para Micotoxinas: Una mirada detrás de escena Muchos laboratorios acreditados utilizan materiales de referencia para demostrar la trazabilidad y la fiabilidad de sus resultados analíticos. Lo que no se conoce mucho, es cómo se fabrican estos materiales de referencia.

By Anna LILEK, Gestión de Calidad, Romer Labs®

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a descripción de materiales de referencias o calibrantes, se refiere a sustancias u objetos con una o más características definidas que se usa como punto de referencia para una medición. Debido a la importancia de la inocuidad de los alimentos y raciones para los consumidores, el análisis de micotoxinas involucran materiales de referencia para obtener resultados más confiables.

Peligros omnipresentes

Algunas toxinas tienen estructuras moleculares favorables, y pueden ser cristalizadas a partir de una solución sobresaturada de un solvente orgánico polar o apolar.

Las micotoxinas son metabolitos fúngicos secundarios, tóxicos para humanos y animales. Los hongos pueden desarrollarse tanto en el campo como durante el almacenamiento. Se encuentran en la mayoría de los cultivos en todo el mundo, y se han identificado más de 380 micotoxinas, y la toxicidad de las mismas varía mucho entre ellas. Las concentraciones máximas admitidas para varias micotoxinas en materias primas como ser trigo y maíz – para mencionar algunas – ha hecho que los productores deban examinar sus muestras con mucho cuidado en los laboratorios analíticos, para estar seguros de la calidad del producto.

Preparación por gravimetría Frecuentemente, un hongo que se desarrolla bajo condiciones óptimas – temperaturas suficientemente cálidas, humedad alta y un sustrato adecuado – puede elaborar micotoxinas. En el laboratorio, la historia del material de referencia comienza con el ajuste artificial de las condiciones de crecimiento, para obtener un óptimo rendimiento en micotoxinas. Esto incluye utilizar un género adecuado de hongo – como cada hongo produce su propio patrón característico de metabolitos, que pueden llegar a ser cientos. El mantenimiento de la cepa fúngica para producción, es crucial. Su

vitalidad y funcionalidad están siendo constantemente monitoreadas, dado que es la base para el proceso de producción de materiales de referencia. Los hongos son organismos vivos que pueden sufrir mutaciones con el tiempo, o pueden degenerarse y reducir la cantidad de micotoxinas producidas. Pueden formarse nuevos metabolitos luego de cierto período de almacenamiento, que pueden influir en el proceso de aislamiento. Las cepas deben renovarse regularmente de manera tal de prevenir las mutaciones, impurezas u otras características no deseadas.

El primer paso, la fermentación, depende completa-

Tabla 1. Desafíos claves en la producción de materiales de referencia Desafío

Solución

Mutaciones de la cepa fúngica (formación de otros metabolitos, disminución/aumento de la producción, formación de impurezas)

Revisión regular de las cepas.

Chequeo de vitalidad y productividad.

Renovación de la cepa si es necesario.

Estandarización del proceso de fermentación y de aislamiento Impurezas no detectables por solapamiento

Encontrar materiales de referencias certificados (externos) para los controles de proceso y calidad

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Empleo de técnicas, materiales y equipos innovadores y adecuados.

Asegurar una estrategia robusta para la limpieza.

Buscar otra solucuón para la identificación de la sustancia aislada – por ej, mediante análisis de otros laboratorios de servicios acreditados que pueden lograr una identificación y trazabilidad de la determinación de la pureza (NMR cuantitativo, LC-MS / MS, análisis elemental, etc.)

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Figura 1. Patrón de producción de un estándar líquido

Preparación gravimétrica

• Adecuar la micotoxina sólida a la temperatura ambiente • Pesada • Disolución • Homogeneización

Control de Calidad • HPLC • Fotometría UV • HPLC-MS

Envasado y CoA • Llenado de los viales • Certificado de Análisis (CoA) • Despacho al cliente

mente del entorno del laboratorio, y de cuan favorable es para la promoción del desarrollo de los hongos. El medio óptimo para el crecimiento, puede variar entre cepas, se provee de componentes como sales y minerales como fuente de nutrientes. Se deja desarrollar el hongo durante un cierto tiempo – que puede ser pocos días o hasta un par de semanas – durante el cual el hongo metaboliza el medio.

Luego de completar la fermentación, y con un cuidadoso control del proceso, se extraen las micotoxinas del medio de cultivo utilizando solventes orgánicos adecuados. Dependiendo de la estructura molecular, estos solventes pueden ser polares o no polares. Durante la fermentación, los hongos pueden elaborar otros componentes además de la toxina de interés, como ser metabolitos, cromógenos, aceites, etc.

El extracto resultante, contiene muchas impurezas, durante los pasos de aislamiento o purificación, se busca alcanzar una pureza >98% a través de varias cromatografías y aplicaciones preparativas con diferente selectividad.

Algunas toxinas tienen estructuras moleculares favorables, lo que permite su cristalización a partir de soluciones sobresaturadas de solventes orgánicos polares o no polares. Esto puede ocurrir, por ejemplo, enfriando la solución, por evaporación, o por mezcla de solventes de diferentes polaridades. Otras toxinas pueden cristalizarse por congelamiento. La cristalización permite el incremento de la pureza hasta el valor deseado.

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Control de Calidad HPLC, fotometría UV y HPLC-MS se utilizan para determinar/confirmar la pureza del material producido.

Dependiendo de la toxina, esto puede hacerse por HPLC en combinación con una detección por Arreglo de Diodos (DAD) o por fluorescencia (FLD), con Fotometría UV P (análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto) o HPLC don detección por espectrometría de masas. La MS, es necesaria en particular, para determinar la pureza isotópica (> 98% átomos de 13C) de las micotoxinas marcadas con isótopos de 13C. Los materiales de referencia para micotoxinas, tienen una posición de nicho en el mercado. Por lo tanto, algunas veces es difícil encontrar, a nivel comercial, sustancias para hacer las comparaciones y que puedan emplearse durante el control del proceso y control de calidad.

La Tabla 1 indica un número de desafíos que pueden presentarse durante la producción y las etapas de QC, junto con las soluciones implementadas por Romer Labs.

Entrega Luego de pasar el control de Calidad final, la micotoxina sólida se lleva a solución para utilizarla como un material de referencia líquido. La solución calibrante líquida, es envasada y se genera un certificado de análisis, donde se establece la magnitud y la incertidumbre que acompañan a cada calibrador.

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Making the World’s Food Safer Por más de 40 años, los kits de prueba, los materiales de referencia, las columnas de limpieza y los servicios analíticos de Romer Labs han sido un testimonio de nuestro compromiso en hacer que los alimentos del mundo sean más seguros.

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