RevMVZ Córdoba 19(3) by Revista MVZ Córdoba

Rev.MVZ Córdoba 19(3):4195-4198, 2014. ISSN: 0122-0268

EDITORIAL

Ebola… How far away are we? Ébola… ¿Qué tan lejos estamos? Hollywood adores an infectious disease film. One of the most shocking was the 1995 film “Outbreak”, in which Dustin Hoffman and Rene Russo worked to stop a fictional virus similar to Ebola. In the movie the virus is introduced from Africa to the US by a monkey. In another film, “28 Days Later,” a virus from experimental monkeys infects humans in London. Several additional films about the human fear of “killer viruses” have been released. A real-life scare to the US and the western world came when two American Ebola patients were recently transported from West Africa to an Atlanta hospital for treatment. Currently, there is a pervasive public fear of the dissemination of Ebola in the US and the rest of the world. Ebola virus causes a severe, often fatal hemorrhagic fever, with a case fatality rate of up to 90%. Ebola virus is one of the world’s most virulent pathogens. The virus is transmitted by direct contact with the blood, body fluids, and tissues of infected animals or humans. Severely ill patients require intensive supportive care. During an outbreak, those at highest risk of infection are health workers, family members, and others in close contact with sick or deceased patients. The estimated number of cases in the current outbreak in West Africa is 3069 with 1552 deaths (51% mortality)(1,2). In 1976, Ebola virus was first detected during two simultaneous outbreaks in Sudan and the Democratic Republic of the Congo (then Zaire). The village in which the second outbreak occurred is near the Ebola River, which gives its name to the virus. The family Filoviridae contains three genera: Ebolavirus, Marburgvirus, and Cuevavirus. Ebolavirus contains five species: Bundibugyo ebolavirus, Zaire ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudan ebolavirus, and Tai Forest ebolavirus. Bundibugyo ebolavirus, Zaire ebolavirus, and Sudan ebolavirus have been associated with major outbreaks in Africa. Reston ebolavirus,

A Hollywood le gustan las películas de enfermedades infecciosas. Una de las más impactantes fue la película “Brote” en 1995, en donde Dustin Hoffman y Rene Russo se esforzaron para detener un ficticio virus similar al Ébola. En la película el virus es introducido desde África a los Estados Unidos por un mono. En otra película, “28 días después”, un virus de monos experimentales infecta a los humanos en Londres. Otras películas se han realizado sobre el miedo humano a los “virus asesinos”. El miedo se hizo realidad en los Estados Unidos y en el mundo occidental cuando dos pacientes estadounidenses enfermos de Ébola fueron recientemente transportados desde África occidental hasta un hospital en Atlanta con el fin de recibir tratamiento. En la actualidad, en la gente existe un temor generalizado de la difusión del Ébola en los Estados Unidos y en el resto del mundo. El virus del Ébola provoca una fiebre hemorrágica severa, a menudo fatal, con una tasa de letalidad de hasta 90%. El virus de Ébola es uno de los patógenos más virulentos de todo el mundo. El virus se transmite por contacto directo con la sangre, fluidos corporales y tejidos de animales infectados o de seres humanos. Los pacientes gravemente enfermos necesitan servicios de cuidado intensivo. Durante un brote, el mayor riesgo de infección lo tienen los trabajadores de la salud, miembros de la familia y otros que están en estrecho contacto con pacientes enfermos o fallecidos. El número estimado de casos en el brote actual en África occidental es 3069 con 1552 muertes (51% de mortalidad) (1,2). En 1976, el virus del Ébola fue primero detectado durante dos brotes simultáneos en Sudán y la República Democrática del Congo (antes Zaire). La aldea en la que se produjo el segundo brote está cerca del Río Ébola, que da su nombre al virus. La familia Filoviridae contiene tres géneros: Ebolavirus, Marburgvirus y Cuevavirus. Ebolavirus contiene cinco especies: Bundibugyo ebolavirus, Zaire ebolavirus, Reston ebolavirus, Sudán ebolavirus y Tai forest ebolavirus. Bundibugyo ebolavirus, ebolavirus de Zaire y Sudán ebolavirus se han asociado con grandes brotes en África.

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found in the Philippines and China, can infect humans, but is not known to cause human disease (3).

Reston ebolavirus, encontrado en las Filipinas y China, puede infectar a los seres humanos, pero no se sabe si causa enfermedad en humanos (3).

Spillover of Ebola virus from the endemic wildlife cycle to humans may occur through contact with organs, blood, secretions, or body fluids of an infected animal. In Africa human infection has been associated with handling infected chimpanzees, gorillas, monkeys, fruit bats, and porcupines. Once introduced to humans, the virus spreads in the community by human-to-human transmission as described above. In Africa, burial ceremonies in which the members of the funeral procession have direct contact with the corpse can also result in transmission. Men can continue to transmit the virus in semen for seven weeks after clinical recovery (3,4).

El contagio del virus del Ébola del ciclo endémico de vida silvestre a los seres humanos puede ocurrir a través del contacto con los órganos, sangre, secreciones o fluidos corporales de un animal infectado. En África la infección humana se ha asociado con el manejo de los chimpancés infectados, gorilas, monos, murciélagos frugívoros y puercos espines. Una vez introducido a los seres humanos, el virus se propaga en la comunidad por la transmisión de humano a humano como se describió anteriormente. En África, las ceremonias funerales en las cuales, miembros de la comitiva fúnebre tienen contacto directo con el cuerpo también pueden resultar infectados. Los hombres pueden seguir transmitiendo el virus en el semen durante siete semanas después de la recuperación clínica (3,4).

Investigators in Canada showed the deadly virus may spread between species, through the air. A team of researchers from the National Centre for Foreign Animal Disease, the University of Manitoba, and the Public Health Agency of Canada, observed transmission of Ebola virus from pigs to monkeys. They inoculated piglets with the virulent Zaire Ebolavirus. The piglets were placed in a room with macaques, but were separated by wire cages to prevent direct contact between the species. A few days later the inoculated piglets showed clinical signs of infection. In pigs, Ebola generally causes respiratory illness and increased temperature. After eight days of exposure, monkeys showed signs of Ebola infection (5). Ebola hemorrhagic fever is often characterized by sudden onset of fever (40°C), intense weakness and muscle aches, headache and sore throat, followed by vomiting, diarrhea, rash, renal and hepatic dysfunction and, in some cases, internal and external bleeding. Laboratory results show leucopenia, thrombocytopenia, and elevated liver enzymes. Patients are contagious as long as the virus is present in blood and secretions. The incubation period (interval from infection to onset of symptoms) varies between 2 and 21 days (3). There is no vaccine for Ebola virus. Some vaccine candidates are being tested but none are yet available for clinical use. Most cases require treatment in an intensive care unit. Patients tend to be dehydrated and need intravenous or oral rehydration with electrolyte solutions. There is no specific

Investigadores en Canadá demostraron que el virus mortal se puede diseminar entre las especies, a través del aire. Un equipo de investigadores del Centro Nacional para Enfermedades Animales Exóticas, la Universidad de Manitoba y la Agencia de Salud Pública de Canadá, observaron la transmisión del virus del Ébola los cerdos a los monos. Inocularon lechones con la cepa virulenta Ebolavirus de Zaire. Los lechones fueron colocados en una sala con los macacos, pero fueron separados por jaulas metálicas para evitar el contacto directo entre las especies. Unos días más tarde los cerdos inoculados mostraron signos clínicos de infección. En cerdos, el Ébola generalmente causa enfermedad respiratoria e incremento de la temperatura. Después de ocho días de exposición, los monos mostraron signos de infección por el virus del Ébola (5). La fiebre hemorrágica del Ébola se caracteriza por la aparición súbita de fiebre (40°C), debilidad intensa, dolores musculares, dolor de cabeza, dolor de garganta, seguido por vómitos, diarrea, erupción cutánea, disfunción renal y hepática, y en algunos casos, sangrados internos y externos. Los resultados de laboratorio muestran niveles elevados de enzimas hepáticas, trombocitopenia y leucopenia. Los pacientes son contagiosos mientras el virus esté presente en la sangre y en las secreciones. El período de incubación (intervalo de la infección con aparición de síntomas) varía entre 2 y 21 días (3). No hay vacuna para el virus del Ébola. Algunas vacunas candidatas están siendo analizadas, pero todavía ninguna está disponible para uso clínico. La mayoría de los casos requieren de tratamiento en una unidad de cuidados intensivos. Los pacientes tienden a deshidratarse y necesitan

4197 treatment, though new drug treatments are being evaluated. According to a report published online today in Science Translational Medicine, scientists have successfully treated Ebola virus infection in animals following onset of disease. The results show promise for developing therapies. MB-003 is a “cocktail” of monoclonal antibodies that help bind to and inactivate the virus. The antibodies recognize infected cells and trigger the immune system to destroy them. No side effects of the antibodies were seen in the surviving animals. Recently, WHO authorized human treatment with MB-003 (6); two American patients survived and one Spanish priest died. The natural hosts of the Ebola viruses are likely to be fruit bats such as Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti, and Myonycteris torquata, which are common in Africa (7). There are no studies in Latin America on Ebola, but if the evolution of the filovirus is as old as American bats (500 million years), one could speculate that some filoviruses might be present in the Neotropics. The geographic distribution of Ebola viruses could match the distribution of these bats, or other unknown neotropic filoviruses could be adapted to other autochthonous bat species. Although non-human primates have been a source of infection for humans, it is believed that they are not the reservoir of the virus. More likely, they are accidental guests, like humans. Outbreaks of Ebola in chimpanzees and gorillas have been reported. The virus has caused severe outbreaks in crab eating macaques (Macaca fascicularis) in the Philippines, and was detected in monkeys imported from the Philippines to the US and Italy in the 1990s. In 2008, Ebola virus was detected in several outbreaks of deadly disease in pigs in the Philippines and China. Asymptomatic infections in pigs have also been reported (7). In Colombia, we should be alert to illegal immigration of humans from Ebola-endemic countries who use Colombia as a bridge to reach America and the US. Colombian immigration officials must be alert to international passengers who may be sick with high fever. Finally, studies of bat ecology are also important.

Salim Mattar V. Ph.D.

rehidratación intravenosa u oral con soluciones electrolíticas. No hay ningún tratamiento específico, aunque se están evaluando nuevos tratamientos farmacológicos. Según un informe publicado en Science Translational Medicine, los científicos han tratado con éxito la infección del virus del Ébola en animales luego de la aparición de la enfermedad. Los resultados son prometedores para el desarrollo de terapias. El MB-003 es un “cóctel” de anticuerpos monoclonales que ayudan a capturar e inactivar el virus. Los anticuerpos reconocen las células infectadas y activan el sistema inmunitario para destruirlos. No hubo efectos secundarios de los anticuerpos en los animales sobrevivientes. Recientemente, la Organización Mundial de la Salud autorizó el tratamiento humano con MB-003 (6); dos pacientes americanos sobrevivieron y un sacerdote español quien murió. El huésped natural de los virus del Ébola es probable que sean los murciélagos frugívoros como Hypsignathus monstrosus, Franqueti Epomops y Myonycteris torquata, que son comunes en África (7). No existen estudios en América Latina del Ébola, pero, si la evolución de los filovirus es tan antigua como los murciélagos americanos (500 millones de años), se podría especular que algunos filovirus podrían estar presentes en el neotrópico. La distribución geográfica del virus del Ébola podría coincidir con la distribución de estos murciélagos u otros desconocidos filovirus neotropicales podrían adaptarse a otras especies autóctonas. Aunque los primates no humanos han sido una fuente de infección para los seres humanos, se cree que no son el reservorio del virus. Lo más probable es que sean huéspedes accidentales, como los seres humanos. Se han reportado brotes de Ébola en chimpancés y gorilas. El virus ha causado brotes severos en macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) en las Filipinas y fue detectado en monos importados de Filipinas a los Estados Unidos e Italia en la década de 1990. En 2008, el virus del Ébola fue detectado en varios brotes de enfermedad mortal en los cerdos en las Filipinas y China. También se han reportado infecciones asintomáticas en cerdos (7). En Colombia, deberíamos estar alertas a la inmigración ilegal de personas de los países endémicos del Ébola, que utilizan a Colombia como puente para llegar a América y luego a los Estados Unidos. Los funcionarios colombianos de inmigración, deben estar alertas con los pasajeros internacionales que pueden estar enfermos con fiebre alta. Finalmente, los estudios de ecología de murciélagos también son importantes.

Marco González T. M.Sc.

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REFERENCES 1. Centers for Disease Control and Prevention. 2014 Ebola Outbreak in West Africa. [on line]. Atlanta, USA: CDC; 2014. URL Available in: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/ outbreaks/guinea/index.html

5. Jane Huston. From Pigs to Monkeys, Ebola Goes Airborne. [on line]. The Disease Daily 2012. URL Available in: http://healthmap. org/site/diseasedaily/article/pigs-monkeysebola-goes-airborne-112112

2. Centers for Disease Control and Prevention. Ebola Hemorrhagic Fever. [on line]. Atlanta, USA: CDC; 2014. URL Available in: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/index. html?s_cid=cdc_homepage_feature_001

6. Wo r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n . E b o l a : Experimental therapies and rumoured remedies. [on line]. Geneva, Switzerland: WHO; 2014. URL Available in: http:// www.who.int/mediacentre/news/ebola/15august-2014/en/

3. World Health Organization. Global Alert and Response (GAR). [on line]. Geneva, Switzerland: WHO; 2014. URL Available in: http://www.who.int/csr/disease/ebola/en/ 4. Centers for Disease Control and Prevention. Signs and Symptoms. [on line]. Atlanta, USA: CDC; 2014. URL Available in: http://www. cdc.gov/vhf/ebola/symptoms/index.html

7. World Health Organization. Ebola: Media centre. [on line]. Geneva, Switzerland: WHO; 2014. URL Available in: http://www. who.int/mediacentre/factsheets/fs103/en/

Rev.MVZ Córdoba 19(3):4199-4213, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

A new species of Schizopera (Copepoda: Harpacticoida: Miraciidae) from Colombia Una nueva especie de Schizopera (Copepoda: Harpacticoida: Miraciidae) de Colombia Juan M. Fuentes-Reinés,1* M.Sc, Samuel Gómez,2 Ph.D. Universidad del Magdalena, Grupo de investigación en Limnología Neotropical. A.A 731 Santa Marta, Magdalena, Colombia. 2Universidad Nacional Autónoma de México, Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, Unidad Académica Mazatlán, Mazatlán, Sinaloa, México.*Corresponding: juanmanuelfuentesreines@yahoo.com 1

Received: March 2014; Accepted: June 2014.

ABSTRACT Objective. The present contribution aims at the description of a new species of the genus Schizopera. Materials and methods. Water samples were collected in littoral areas with mangrove and macrophytes, and in the limnetic zone. Twenty five liters of water were taken. Water samples were filtered with a zooplankton net (45µm) and preserved in 70% ethanol. The filtered samples were concentrated to 100 ml and examined in a Bogorov camera. Copepods were separated. Observations and drawings of S. evelynae sp. nov. were made at a magnification of 1000X. Results. Schizopera evelynae sp. nov. seems to be closely related to S. giselae Jiménez -Álvarez 1988 and to S. pratensis Noodt 1958 based on the armature formula of P1-P4, but can be separated from these two species based on the relative length of P1ENP, length/width ratio of P1ENP2, relative length of the outer proximal and distal spines on P4EXP3, shape of the exopod and relative length of the exopodal setae of the female P5, shape and length/width ratio of the male P2ENP2, and male P5 baseoendopodal lobe:exopod length ratio. A key to the species of Schizopera from America is given. Conclusion. A new species of the genus Schizopera is described. The Colombian material shares most characters with S. giselae and S. pratensis. Key words: Copepoda, distribution, harpacticoida, taxonomy, lagoon, new species (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Describir una nueva especie del genero Schizopera. Materiales y métodos. Muestras de agua fueron colectadas en áreas del litoral con mangle y macrófitas, y en la zona limnética. Se tomaron 25 L de agua. Las muestras de agua fueron filtradas con una red de zooplancton (45 µm) y preservadas en etanol al 70%. Las muestras filtradas se concentraron a 100 ml y fueron analizadas en una cámara de Bogorov. Los copépodos fueron separados. Se realizaron observaciones y dibujos de S. evelynae sp. nov. a un aumento de 1000X. Resultados. Schizopera evelynae sp. nov. parece estar estrechamente relacionada con S. giselae Jiménez-Álvarez 1988 y con S. pratensis Noodt 1958 basado en la fórmula de la armadura de P1-P4, pero puede ser separado de estas dos especies basado 4199

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en la longitud relativa de P1ENP, relación longitud / anchura de P1ENP2, la longitud relativa de las espinas proximal y distal externas en P4EXP3, forma del exópodo y la longitud relativa de las setas del exópodo de la P5 de la hembra, la forma y la relación longitud / anchura del P2ENP2 del macho, y la relación entre la longitud del lóbulo baseoendopodal de la P5 y la longitud del exópodo en el macho. Se presenta una clave para las especies del género Schizopera en América. Conclusiones. Se describe una nueva especie para la ciencia del género Schizopera. Los especímenes colombianos comparten la mayoría de los caracteres con S. giselae y S. pratensis. Palabras clave: Copepoda, distribución, harpacticoida, taxonomía, laguna, nueva especie (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Harpacticoida is one of the most important groups of meiobenthos. However, the study of this order from Colombian systems, especially those from estuarine environments, has been largely neglected.

Harpacticoida es uno de los grupos más importantes del meiobentos. Sin embargo, el estudio de este orden de copépodos de los sistemas colombianos, especialmente aquéllos de los ambientes estuarios, ha sido muy descuidado.

Within Harpacticoida, Miraciidae is one of the most common and abundant families, being composed of about 364 species. Most of the species of Miraciidae are marine living forms inhabiting the benthic realm (1) and are distributed among 53 valid genera (2). Miraciidae contains two large genera, Schizopera (3) and Stenhelia (4) that account for almost 42 % of the whole family. The genus Schizopera comprises about 92 valid species and subspecies worldwide (5, 6), 18 of which have been described from the Americas (S. tobae tobae (7); S. haitiana(8); S. triacantha (8); S. vicina (9); S. gauldi (10); S. noodti (11); S. knabeni (12); S. californica (12); S. borutzkyi (13); S. anomala (14); S. carolinensis (14); S. tobae cubana (15); S. giselae. (16); S. pori. (16); S. chiloensis (17); S. osana (18); S. hawaiiensis (19); S. costaricana, (20)). Species of genus Schizopera can be found in marine, brackish and freshwater habitats (21, 22)

Dentro de Harpacticoida, Miraciidae es una de las familias más comunes y abundantes, y está compuesta de cerca de 364 especies. La mayoría de las especies de Miraciidae son formas de vida marina que habitan el reino bentónico (1) y están distribuidas en 53 géneros (2). Miraciidae contiene dos grandes géneros: Schizopera (3) y Stenhelia (4) que abarcan cerca del 42 % de toda la familia. El género Schizopera comprende cerca de 92 especies válidas y subespecies en el mundo (5, 6),18 de las cuales han sido descritas en ambientes de América (S. tobae tobae (7); S. haitiana(8); S. triacantha(8); S. vicina (9); S. gauldi (10); S. noodti(11); S. knabeni (12); S. californica(12); S. borutzkyi(13); S. anomala (14); S. carolinensis (14); S. tobae cubana (15); S. giselae. (16); S. pori. (16); S. chiloensis (17); S. osana (18); S. hawaiiensis (19); S. costaricana, (20)). Se pueden encontrar especies del género Schizopera en hábitats marinos, salobres y de agua dulce (21, 22).

Apostolov (23) divided the genus Schizopera into three genera: Schizopera with two subgenera [Schizopera s. str. (23) and Neoschizopera (23)], Eoschizopera (24) with two subgenera [Eoschizopera s. str. (23) and Praeoschizopera (23)], and Schizoperopsis (23) with two subgenera [Schizoperopsis s. str. (23) and Psammoschizoperopsis (23)]. These groupings have been rejected by some authors (17,20,25). Mielke (17) united the genera Eoschizopera and Schizoperopsis into one genus, Schizopera.

Apostolov (23) dividió el género Schizopera en tres géneros: Schizopera con dos subgéneros [Schizopera s. str. (23) y Neoschizopera(23)], Eoschizopera (24) con dos subgéneros [Eoschizopera s. str. (23) y Praeoschizopera(23)], y Schizoperopsis (23) con dos subgéneros [Schizoperopsis s. str. (23) y Psammoschizoperopsis(23)]. Estas agrupaciones han sido rechazadas por algunos autores (17,20,25). Mielke (17) unificó los géneros Eoschizopera y Schizoperopsis en un solo género: Schizopera.

The taxonomic position of the genus Schizopera is complex and controversial, and its ecology and phylogenetical relationships have been subject of discussions (17).

La posición taxonómica del género Schizopera es compleja y controversial y su ecología y relaciones filogenéticas han sido objeto de discusiones (17).

Following Mielke (17, 18), the subgenera created by Apostolov (23) and the genus Eoschizopera

De acuerdo con Mielke (17, 18), el subgénero creado por Apostolov (23) y el género Eoschizopera no deben ser aceptados. Sin embargo, Karanovic

Fuentes-Reinés - A New species Schizopera from Colombia should not be accepted. Nevertheless, Karanovic (20) challenged Mielke’s (17) view. Wells (26) agrees with Karanovic’s (20) opinion but considers Schizoperopsis as synonym of Schizopera. According to Karanovic & Cooper (5) the subdivision of the genus Schizopera must be now abandoned, being the only exception the genus Eoschizopera (22, 24) which includes four species (20). Thus, the generic division proposed by Apostolov (23) has also been abandoned (26). The description of a new species of Schizopera and an identification key to the species of Schizopera from America is herein presented.

MATERIAL AND METHODS Study area. Water samples were collected in Laguna Navío Quebrado (Los Flamencos Fauna and Flora Sanctuary, Camarones, La Guajira Department, Colombia) from April to December 2012 in littoral areas with mangrove and macrophytes, and in the limnetic zone. Field methods. Twenty five liters of water were taken using a bucket of 25 L. The water samples were filtered with a zooplankton net (45 µm) and preserved in 70% ethanol.

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(20) cuestionó la posición de Mielke (17). Wells (26) está de acuerdo con la opinión de Karanovic (20) pero considera a Schizoperopsis como un sinónimo de Schizopera. De acuerdo con Karanovic y Cooper (5) la subdivisión del género Schizopera debe ser abandonada, siendo la única excepción el género Eoschizopera (22, 24) que incluye cuatro especies (20). Así, la división genérica propuesta por Apostolov (23) también debe ser abandonada (26). Se presenta aquí la descripción de una nueva especie y una clave de identificación de las especies de Schizopera de América.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de Estudio. Se recolectaron muestras de agua en la Laguna Navío-Quebrado (Santuario de Fauna y Flora “Los Flamencos”, Camarones, Departamento de la Guajira, Colombia) entre abril y diciembre de 2012 en áreas del litoral con manglares y macrófitas y en la zona limnética. Métodos de campo. Se tomaron veinticinco litros de agua, utilizando un balde de 25 L. Las muestras de agua fueron filtradas con una red de zooplanton (45 µm) y conservadas en etanol al 70%.

Analytical methods. The filtered samples were concentrated to 100 ml and examined using a Bogorov camera. Copepods were separated and kept in 70% ethanol. Observations and drawings of S. evelynae sp. nov. were made at a magnification of 1000X from whole and dissected specimens mounted in lactophenol with a Leica compound microscope equipped with phase contrast and a drawing tube.

Métodos analíticos. Se concentraron las muestras filtradas en un volúmen final de 100 ml y se analizaron utilizando una cámara de Bogorov. Se separaron los copépodos y se conservaron en etanol al 70%. Se hicieron observaciones y dibujos a partir de individuos de S. evelynae sp. nov., completos y disectados montados en lactofenol a un aumento máximo de 1000X con un microscopio compuesto Leica equipado con contraste de fases y tubo de dibujo.

Museums and terminology. The type material was deposited in the Museo de Colecciones Biológicas de la Universidad del Atlántico – Colombia (UARC) and in the Copepoda collection of the Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, Mazatlán Marine Station, Sinaloa state, Mexico (EMUCOP).

Museos y terminología. El material tipo fue depositado en el Museo de Colecciones Biológicas de la Universidad del Atlántico – Colombia (UARC) y en la colección de Copépodos del Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, de la Unidad Académica Mazatlán en Sinaloa, México (EMUCOP).

The terminology proposed by Huys & Boxshall (27) for the general description was adopted.

Se adoptó la terminología propuesta por Huys & Boxshall (27) para la descripción general.

Taxonomical account Family MIRACIIDAE Dana, 1846 Subfamily DIOSACCINAE Sars, 1906 Genus Schizopera Sars, 1905 Schizopera evelynae sp. nov. (Figures. 1- 8)

Registro taxonómico Familia MIRACIIDAE Dana, 1846 Sub-familia DIOSACCINAE Sars, 1906 Género SchizoperaSars, 1905 Schizopera evelynae sp. nov. (Figuras 1- 8)

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Type material.One female holotype (UARC154M), one male allotype (UARC155M), a n d 1 6 f e m a l e a n d 1 4 m a l e p a ra t y p e s (UARC156M) preserved in alcohol, and 29 female and 30 male paratypes preserved in alcohol (EMUCOP 0412-01) and 2 female (EMUCOP 0412-02, EMUCOP 0412-03) and 2 male (EMUCOP 0412-04, EMUCOP 0412-05) dissected paratypes; April to December, 2012. Leg. Juan M. Fuentes Reinés. Type locality. Laguna de Navío Quebrado, Los Flamencos Fauna and Flora Sanctuary, Camarones, La Guajira Department, Colombia (11°25’N, 75°5’ W). Salinity, from 0-28 PSU. Schizopera evelynae sp. nov. was found in the limnetic zone and in vegetated areas (mangroves); salinity, 28 PSU. Etymology. The species is named in honor to Dr Evelyn Zoppy de Roa, for her work on zooplankton from Venezuelan systems and for her legacy and leadership of new generations of planktologists. Description of female. Habitus (not shown) fusiform, tapering from the posterior part of the cephalothorax to the posterior part of the body. Total body length, measured from the tip of rostrum to the posterior margin of caudal rami, ranging from 532 µm to 602 µm (n= 11, mean= 567 µm). First urosomite (P5-bearing somite) without, posterior margin of genital double-somite, fourth and fifth urosomites with posterior finely serrated hyaline frill; dorsal

Material tipo. Un holotipo hembra (UARC154M), un alotipo macho (UARC155M), y 16 paratipos hembra y 14 machos (UARC156M) preservados en alcohol, y 29 paratipos hembra y 30 machos preservados en alcohol (EMUCO 0412-01) y 2 paratipos disectados hembras (EMUCOP 0412-02, EMUCOP 0412-03) y 2 machos (EMUCOP 0412-04, EMUCOP 0412-05); Abril a diciembre de 2012. Leg. Juan M. Fuentes Reinés. Localidad tipo. Laguna de Navío Quebrado, Santuario de Flora y Fauna “Los Flamencos”, Camarones, Departamento de la Guajira, Colombia (11°25’N, 75°5’ W). Salinidad de 0-28 PSU. Schizopera evelynae sp. nov. fue hallada en la zona limnética y en la zona cubierta por vegetación (manglares); salinidad, 28 PSU. Etimología. La especie fue nombrada en honor a la Dra. Evelyn Zoppy de Roa, por su trabajo en el zooplancton de sistemas venezolanos y por su legado y liderazgo de nuevas generaciones de zooplanctólogos. Descripción de la hembra. Habitus fusiforme (no se muestra), estrechándose desde la parte posterior del cefalotórax a la parte posterior del cuerpo. Longitud total del cuerpo, medido desde la punta de rostro hasta el margen posterior de las ramas caudales, desde 532 µm hasta 602 µm (n= 11, media= 567 µm). Primer urosomita (aquel que lleva la P5), sin membrana hialina posterior, margen posterior del somita genital doble, cuarto y quinto urosomitas con membrana hialina posterior finamente aserrada; membrana

C A

Figure 1. Schizopera evelynae sp. nov., female, paratype (EMUCOP 0412-02). A, urosome, dorsal, P5-bearing somite omitted; B, urosome, ventral, showing P6, P5 bearing-somite omitted. C, posterior part of fifth urosomite, anal somite and caudal rami, dorsal; D, anal somite and caudal rami, ventral. Scale bar: A, B, 100 µm; C, D, 140 µm.

Fuentes-Reinés - A New species Schizopera from Colombia

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E D

C B

Figure 2. Schizopera evelynae sp. nov., female. A, antennule and rostrum, dorsal; B, antenna; C, exopod of antenna, another view; D, free endopodal segment of antenna, another view; E, mandible. A, E, paratype EMUCOP 0412-02; B-D, paratype EMUCOP 0412-03. Scale bar: A, 100 µm; B-E, 70 µm.

hyaline frill of fifth urosomite bulging medially (Figures 1A). Genital double-somite fused dorsally and ventrally, with lateral rib indicating former division (Figure 1A, B); ventral surface plain, bearing P6, the latter represented by 1 outer short plumose seta and 1 inner long slender element (Figure 1B). Dorsal and ventral surface of genital double-somite, fourth and fifth urosomite with spinular pattern as figured (Figure 1A, B). Anal somite with semicircular smooth operculum (Figures 1A, C); with ventral spinules as shown (Figure 1D). Caudal rami as long as wide (Figures 1A-D); with 6 elements. Rostrum not fused to cephalothorax, elongate, triangular, reaching tip of the second antennular segment (Figure 2A).

hialina dorsal del quinto urosomita extendido en la parte media (Figuras 1A). El somita genital doble fusionado dorsalmente y ventralmente, con restos de división dorsalmente y lateralmente indicando división previa (Figura 1A, B); superficie ventral sin ornamentación, con P6, esta última representada por una seta externa plumosa y un elemento interno largo y delgado (Figura 1B), superficie dorsal y ventral del somita genital doble, cuarto y quinto urosomita con espínulas según se muestra (Figura 1A, B). Somita anal con opérculo semicircular, sin ornamentación (Figuras 1A, C); con espínulas ventrales como se muestra (Figura 1D), ramas caudales tan largas como anchas (Figuras 1A-D); con 6 elementos. Rostro no fusionado con el cefalotórax, alargado, triangular, alcanzando el margen dista del segundo segmento antenular (Figura 2A).

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Antennule (Figure 2A) 8-segmented; armature formula: 1(1), 2(9), 3(7), 4(2+ (1+ae)), 5(2), 6(3), 7(4), 8(5+acrotek).

Anténula (Figura 2A) con 8 segmentos; fórmula de de la armadura: 1(1), 2(9), 3(7), 4(2+ (1+ae)), 5(2), 6(3), 7(4), 8(5+acrotek).

Antenna (Figure 2B-D). Allobasis with short rows of spinules along inner margin proximally and at base of exopod, with 1 abexopodal seta. Exopod 2-segmented; first segment with 1 slender plumose seta; second segment with 2 setae. Free endopodal segment with inner row of spinules, and armed with 2 lateral inner spines and 2 slender setae, and with seven distal elements (1 spine, 3 geniculate elements, 1 slender seta, and 1 strong spinulose element fused to 1 slender setae basally).

Antena (Figura 2B-D). Alobase con filas cortas de espínulas a lo largo del margen interno proximal y en la base de exópodo, con una seta abexopodal. Exópodo de 2 segmentos; primer segmento con una seta plumosa delgada; segundo segmento con dos setas. Segmento libre del endópodo con una fila interna de espínulas, y armado con dos espinas internas laterales y 2 setas delgadas, y con siete elementos distales (1 espina, 3 elementos geniculados, 1 seta delgada, y 1 elemento fuerte espinulado fusionado basalmente a 1 seta fina). Mandíbula (Figura 2E). Gnatobase con incisivos pareados, tres espínulas y 1 seta pinada. Coxabase con 3 setas plumosas distales. Exópodo pequeño, con dos setas. Endópodo mucho más largo que el exópodo, con 1 segmento, con dos setas internas (una de ellas más corta), y 5 setas distales.

Mandible (Figure 2E). Gnathobasis with bidentate pars incisiva, three spinules and 1 pinnate seta. Coxa-basis with 3 plumose setae distally. Exopod small, with 2 setae. Endopod much larger than exopod, 1-segmented, with 2 inner setae (one of them shorter), and 5 distal setae.

Figure 3. Schizopera evelynae sp. nov., female. A, maxillule; B, maxilla; C, maxilliped. A-C, paratype EMUCOP 0412-02. Scale bar: 50 µm.

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Maxillule (Figure 3A). Praecoxal arthrite with 8 strong spines, 1 pinnate lateral element and 2 surface setae. Coxa with 1 strong and 1 slender seta. Basis with 6 elements. Exopod fused to basis, with 2 setae. Endopod 1- segmented, with 3 slender setae.

Maxílula (Figura 3A). Artrito precoxal con 8 espinas fuertes, 1 elemento lateral pinado y 2 setas superficiales. Coxa con una seta fuerte y 1 seta delgada. Base con 6 elementos. Exópodo fusionado a la base, con 2 setas. Endópodo con 1 segmento, con 3 setas delgadas.

Maxilla (Figure 3B). Syncoxa with three endites; first and second endites with 2 elements each, third endite with 3 elements. Endopod 2-segmented, with 6 setae.

Maxila (Figura 3B). Syncoxa con tres enditos; primer y segundo enditos con 2 elementos cada uno, tercer endito con 3 elementos. Endópodo con 2 segmentos, con 6 setas

Maxilliped (Figure 3C). Basis with spinules as shown and armed with 1 subdistal and 2 apical pinnate setae. Endopod 2-segmented; first segment with row of spinules along inner margin and 2 setae; second segment with strong claw and 2 accompanying setae (1 of them very short).

Maxilípedo (Figura 3C). Base con espínulas como se muestra y armado con 1 seta subdistal y 2 setas apicales pinadas. Endópodo con 2 segmentos; primer segmento con fila de espínulas a lo largo del margen interno y con dos setas; segundo segmento con garra fuerte y dos setas (1 de ellas muy corta).

Figure 4. Schizopera evelynae sp. nov., female. A, P1, anterior; B, P2, anterior. A, paratype EMUCOP 0412-02; B, paratype EMUCOP 0412-03. Scale bar: A, 100 µM; B, 124 µm.

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P1 (Figure 4A). Praecoxa, coxa and basis ornamented as shown. Basis with inner and outer spines. Exopod 3-segmented; exopodal segments without inner armature; EXP 3 with 4 elements. Endopod 2-segmented; first segment longer than exopod, about 4 times as long as wide, with a long inner seta subdistally; second segment about 1.6 times as long as wide, with one strong spine, one geniculate element and one slender seta. P2 (Figure 4B). Praecoxa, coxa and basis ornamented as figured. Basis with outer spiniform element. Rami 3-segmented. Exopod as long as endopod; EXP 1 and 3 without, EXP 2 with inner seta; EXP 3 with 4 elements. First endopodal segment without, second segment with 1 inner and 3 apical elements. P3 (Figure 5). Spinular ornamentation of praecoxa, coxa and basis as shown. Basis with outer seta. Rami 3-segmented. Exopod as long as endopod; EXP 1 and 3 without, EXP 2 with inner seta, EXP 3 with 4 elements in all. ENP 1-2 with inner seta; ENP 3 with 1 strong inner seta and 3 apical elements.

P1 (Figura 4A). Precoxa, coxa y base ornamentadas como se muestra. Base con espina interna y externa. Exópodo con 3 segmentos; segmentos del exópodo sin armadura interna; EXP 3 con 4 elementos. Endópodo con 2 segmentos; primer segmento más largo que el exópodo, cerca de 4 veces más largo que ancho, con una seta interna larga subdistal; el segundo segmento cerca de 1.6 veces más largo que ancho, con una espina fuerte, un elemento geniculado y una seta fina. P2 (Figura 4B).Precoxa, coxa y base ornamentadas como se muestra. Base con elemento externo espinoforme. Ramas con 3 segmentos. Exópodo tan largo como el endópodo; EXP 1 y 3 sin, EXP 2 con seta interna; EXP 3 con 4 elementos. Primer segmento endopodal sin, segundo segmento con 1 elemento interno; tercer segmento con 3 elementos.. P3 (Figura 5).Con espínulas en precoxa, coxa y base como se muestra. Base con seta externa. Ramas con 3 segmentos. Exópodo tan largo como el endópodo; EXP 1 y 3 sin, EXP 2 con seta interna, EXP 3 con 4 elementos en total. ENP 1-2 con seta interna; ENP 3 con una seta interna fuerte y 3 elementos apicales.

Figure 5. Schizopera evelynae sp. nov., female. P3, anterior. A, paratype EMUCOP 0412-02. Scale bar: 100 µm. P4 (Figure 6A). Praecoxa, coxa and basis as in P3. Rami 3-segmented. Exopod noticeably longer than endopod; EXP 1-3 without, EXP 2 with inner seta; EXP 3 with 4 elements in all.

P4 (Figura 6A).Precoxa, coxa y base como en P3. Ramas con 3 segmentos. Exópodo claramente más largo que el endópodo; EXP 1-3 sin, EXP 2 con seta interna; EXP 3 con 4 elementos en total.

P5 (Figure 6B). Baseoendopodal lobe with 2 inner and 2 distal setae plus outer seta of basis. Exopod reaching beyond baseoendopod, with 6 setae.

P5 (Figura 6B). Lóbulo del basoendópodo con dos setas internas y 2 distales, y seta externa de la base. El exópodo alcanza más allá del basoendópodo, con 6 setas.

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Armature formula P1-P4 as follows:

Fórmula de setas y espinas de P1-P4 como sigue:

Exopod Endopod P1 I-0; I-0; I,I1,1 0-1; I11 P2 I-0; I-1;I,I1,1 0-0;0-1;I,2,1 P3 I-0;I-1;I,I1,1 0-1;0-1;I,2,1 P4 I-0;I-1;I,I1,1 0-1;0-1;I,2,0

P1 P2 P3 P4

Exópodito Endópodito I-0; I-0; I,I1,1 0-1; I11 I-0; I-1;I,I1,1 0-0;0-1;I,2,1 I-0;I-1;I,I1,1 0-1;0-1;I,2,1 I-0;I-1;I,I1,1 0-1;0-1;I,2,0

Figure 6. Schizopera evelynae sp. nov., female. A, P4, anterior; B, P5, anterior. A, B, paratype EMUCOP 0412-02. Scale bar: A, 100 µm; B, 70 µm

Description of male. Habitus and rostrum (not shown) as in female. Total body length, measured from tip of rostrum to posterior margin of caudal rami, ranging from 400 to 420 µm (n=11; mean=410). Dorsal and ventral spinular ornamentation of urosomites (Figure 7A, B) as shown. Anal somite and caudal rami as in female.

Descripción del macho. Habitus y rostro (no se muestran) como en la hembra. Longitud total del cuerpo, medido desde la punta de rostro al margen posterior de las ramas caudales, desde 400 µm hasta 420 µm (n=11; media=410). Con espínulas dorsales y ventrales de los urosomitas (Figura 7A, B) como se muestra. Somita anal y ramas caudales como en la hembra.

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A B

Figure 7. Schizopera evelynae sp. nov., male. A, urosome, dorsal; B, urosome, ventral, showing P5 and P6. A, B, paratype EMUCOP 0412-04. Scale bar: 100 µm. Antennule (Figure 8A) 8-segmented, haplocer. First and fifth segment with spinules, second segment wide, third segment narrow, fourth segment swollen. Armature formula difficult to define, but most probably as follows: 1(1)-2(9)-3(6)-4(7+(1+ae))-5(2)-6(1)-7(4)8(4+acrothek).

Anténula (Figura 8A) con 8 segmentos, haplócera. Primer y quinto segmentos con espínulas. Segundo segmento ancho, tercer segmento angosto, cuarto segmento goloboso. Fórmula de setas difícil de definir, pero lo más probable es como sigue: 1(1)-2(9)-3(6)-4(7+(1+ae))-5(2)-6(1)-7(4)8(4+acrothek).

Antenna, mandible, maxillule, maxilla and maxilliped as in female.

Antena, mandíbula, maxílula, maxila y maxilípedo como en la hembra.

P1 as in female except for dimorphic inner process of basis (Figure 8B).

P1 como en la hembra excepto por proceso interno dimórfico en la base (Figura 8B).

P2 EXP (not shown) as in female. Endopod (Figure 8C) 2-segmeted, proximal segment without armature, distal segment modified as in figures 8D, E.

P2 EXP (no se muestra) como en la hembra. Endópodo (Figura 8C) con 2 segmentos, segmento proximal sin armadura, segmento distal modificado como en las Figuras 8D, E.

P3 as in female, except for the presence of a characteristic inner flattened hyaline spine on the third exopodal segment (Figure 8F).

P3 como en la hembra, excepto por la presencia de una espina interna plana hialina característica en el tercer segmento del exópodo (Figura 8F).

P4 (not illustrated) as in female.

P4 (sin ilustrar) como en la hembra.

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Figure 8. Schizopera evelynae sp. nov., male. A, antennule; B, basis of P1, anterior; C, P2ENP, anterior; D, distal armature of P2ENP2; E, distal apophysis and flagellate element on P2ENP2; F, P3EXP3; G. P5, anterior; H, P6, anterior. A-H, paratype EMUCOP 0412-04. Scale bar: 100 µm.

P5 (Figure 8G). Exopod with 5 setae. Baseoendopod with two strong elements ornamented as figured, plus outer seta of basis.

P5 (Figura 8G). Exópodo con 5 setas. Basoendópodo con dos elementos fuertes ornamentados como se ilustra, más seta externa de la base.

P6 (Figure 8H). Each leg represented by one plate armed with 2 minute setae.

P6 (Figura 8H). Cada pata representada por una placa con 2 setas diminutas.

Variability. Female (11 females analyzed). The left P1ENP 2 of one female was observed to possess one instead of two setae; the left P1ENP 1 of one female lacks the lateral seta. The left P5ENP of two females possess five instead of four setae. Male (11 males analyzed). The right P2ENP 1 of one male was observed to possess a big spine instead of spinules.

Variabilidad. Hembra (se analizaron 11 hembras). El P1ENP 2 izquierdo de una hembra, con 1 en vez de 2 setas; el P1ENP 1 izquierdo de una hembra carece de seta lateral. El P5ENP izquierdo de dos hembras posee 5 en lugar de 4 setas. Machos (se analizaron 11 machos). Se observó que el P2ENP 1 derecho de 1 macho posee una espina grande en lugar de espínulas.

Distribution and ecology. Schizopera evelynae sp. nov. is currently known from a single locality

Distribución y ecología. Schizopera evelynae sp. nov. se conoce actualmente de un sitio solamente, el

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only, the protected coastal system Laguna Navío Quebrado, on the Caribbean coast of Colombia. This large (surface area of 10.7 km2) lagoon is a shallow water body (depth 0.3-1.1 m), whose temperature varies over the seasons from 28 to 31ºC; pH values during sampling ranged between 7.8 and 8.3. In the surveyed area S. evelynae sp nov. was recorded in both the limnetic region and the vegetation zones (mangroves), being more frequent in the former habitat where salinity was highest (28 PSU). Fourteen species of Harpacticoida were reported in this water body (28).

DISCUSSION Among the species of the genus Schizopera, S. evelynae sp. nov. seems to be closely related to S. giselae (16) and to S. pratensis (28) given the armature formula of P1-P4. However S. evelynae sp. nov. can be separated from S. giselae and S. pratensis by the relative length of P1Enp 1 (P1ENP 1 being longer that the exopod in S. evelynae, but as long as exopod in S. pratensis and S. giseale); length/width ratio of P1ENP 2 (about 1.4 in S. evelynae sp. nov. and 2.4 and 3 in S. giselae and S. pratensis, respectively). The anal operculum of S. evelynae sp. nov. is similar to that of S. pratensis, but differs from that of S. giselae in the setular ornamentation (with two rows of setules in S. giselae, but smooth in S. evelynae sp. nov. and S. pratensis). Also, the outer proximal and distal spines on the P4EXP 3 are different in length in S. evelynae sp. nov., and S. pratensis, but these outer spines are of the same length in S. giselae. The female P5 of S. evelynae sp. nov. is similar to that of S. giseale, but differs from that of S. pratensis in the shape of the exopod and in the relative length of the exopodal setae (exopod rounded in S. evelynae sp. nov. and S. giselae, but comparatively more elongate in S. pratensis). The male of S. evelynae sp. nov. differs from the male of S pratensis in the length/width ration of P2ENP 2 (about 2.7 times as long as wide in S. evelynae sp. nov., but as long as wide in S. pratensis), in the shape of the apical elements on P2ENP 2 (one straight spine and three slender elements in S. evelynae sp. nov. but two long curved spines and one slender element in S. pratensis), in the length/width ration of the caudal rami (as long as wide in S. evelynae sp. nov., but 1.3 times as long as wide in S. pratensis), in the baseoendopodal lobe:exopod length ratio (longer than the exopod in S. evelynae sp. nov., but both rami of about the same length in S. pratensis) .

sistema costero protegido de Laguna Navío Quebrado, en la Costa Caribe de Colombia. Este gran sistema lagunar (superficie de 10.7 km2) es un cuerpo de agua poco profundo (profundidad entre 0.3-1.1 m), cuya temperatura varia a estacionalmente entre 28–31°C; los valores de pH durante el muestreo estuvieron entre 7.8 y 8.3. En el área explorada se registró a S. evelynae sp. nov., tanto en la región limnética como en las zonas de vegetación (manglares), siendo más frecuentes en el primer hábitat donde la salinidad era mayor (28 PSU). Se reportaron 14 especies de Harpacticoida en este cuerpo de agua (28).

DISCUSIÓN Entre las especies del género Schizopera, S. evelynae sp. nov. parece estar muy relacionada con S. giselae (16) y S. pratensis (28) dada la fórmula de setas y espinas de P1-P4. Sin embargo, S. evelynae sp. nov. se puede separar de S. giselae y S. pratensis por el tamaño relativo del P1Enp 1 (P1ENP 1 más largo que el exópodo en S. evelynae, pero tan largo como el exópodo en S. pratensis y S. giseale); la relación de largo/ancho de P1ENP 2 (cerca de 1.4 en S. evelynae sp. nov. y 2.4 y 3 en S. giselae y S. pratensis, respectivamente). El opérculo anal de S. evelynae sp. nov. es similar al de S. pratensis, pero difiere del de S. giselae en la ornamentación setular (con dos filas de pequeñas sétulas en S. giselae, pero liso en S. evelynae sp. nov. y S. pratensis). Así mismo, las espinas externas proximales y distales en el P4EXP 3 son diferentes en tamaño en S. evelynae sp. nov. y S. pratensis, pero estas espinas externas son del mismo tamaño en S. giselae. La P5 de la hembra de S. evelynae sp. nov. es similar a la de S. giseale, pero difiere de la de S. pratensis en la forma del exópodo y en el tamaño relativo de la setas del exópodo (exópodo redondo en S. evelynae sp. nov. y S. giselae, pero comparativamente más alargado en S. pratensis). El macho de S. evelynae sp. nov. difiere del macho de S. pratensis en la relación largo/ancho del P2ENP 2 (cerca de 2.7 veces más largo que ancho en S. evelynae sp. nov., pero tan largo como ancho en S. pratensis), en la forma de los elementos apicales del P2ENP 2 (1 espina recta y 3 elementos delgados en S. evelynae sp. nov., pero dos espinas curvas y un elementos delgado en S. pratensis), en la relación largo/ancho de las ramas caudales (tan largas como anchas en S. evelynae sp. nov., pero 1.3 veces más largas que anchas en S. pratensis), en la relación de la longitud del lóbulo del basoendópodo:exópodo (más largo que el exópodo en S. evelynae sp. nov., pero ambos de la misma longitud en S. pratensis) .

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Unfortunately, the male of S. giselae remains unknown and cannot be compared with the male of S. evelynae sp. nov.

Desafortunadamente, el macho de S. giselae no se conoce y no puede ser comparado con el macho de S. evelynae sp. nov.

In the following section, an identification key that might prove useful, at least, for preliminary identification of the valid Schizopera species for America, is presented. The key is based on female characters, because the male of S. giselae, S. triacantha, S. californica are unknown.

En la siguiente sección se presenta una clave de identificación de las especies validas de Schizopera de América que puede resultar útil, por lo menos, para una identificación preliminar. La clave está basada en caracteres de la hembra, debido a que los machos de S. giselae, S. triacantha y S. californica no se conocen.

Key to america species of the genus schizopera. 1A. ENP P1 2-segmented

…….………………………………..….…………………..2A

1B. ENP P1 3-segmented

……..…………………………………..…………….….. 4A

2A. P4 ENP 2-segmented

……………………………..… Schizopera gauldi (9)

3A. anal operculum with two rows of setules, outer spines of third exopodal segment of P4 equal in length ………………………….…………….... S. giseale(16) 3B. anal operculum smooth, Outer spines of third exopodal segment of P4 unequal in length 4A. A2 EXP 1-segmented

………………….………………. S. evelynae sp. nov ……..……………….….…………………………………6A

4B. A2 EXP 2 or 3-segmented

………..…………………..……………………………..5A

5A. P2ENP2 with two inner setae, length/width ratio of caudal rami about 2.5

………………………………….…… S. anomala(13)

5B. P2ENP2 with one inner seta, length/width ratio of caudal rami about 1

………………………………… S. carolinensis (13)

6A. A2 EXP 3-segmented

…………..……………….…….…… chiloensis (16)

6B. A2 EXP 2-segmented

…………………….…………….……………………..7A

7A. P3 EXP3 with 5 setae

………….…………….………………………………..8A

7B. P3 EXP3 with 4 setae

……………………………….………………………… 9A

8A. P5 ENP with 3 setae

………………………………….……..S. haitiana (7)

8B. P5 ENP with 5 setae

………………………….…………. S. triacantha (7)

9A. P3 ENP 3 with 3 setae

…………………….……….…………………………. 10A

9B. P3 ENP 3 with 4 setae 10A. P3 and P4 ENP 1 without inner seta

…………………………………………………….…. 11A ……………...…………………………… S. noodti(10)

10B. P3 and P4 ENP1 with one inner seta

……………………………….…….. S. borutzkyi (12)

11A. Caudal rami less than 2 times as long as wide

………………………………………………………………12A

11B. Caudal rami about 2 or 2.5 times as long as wide

………….……………...……..……………….……....17A

12A. P3-P4EXP2 without inner setae

…………………..…………… S. tobae cubana (14)

12B. P3-P4EXP2 with inner setae

…………………………………………………….……….13A

13A. length/width ratio of P1ENP 1 about 2.5

……………………………...…... S. costaricana (19)

13B. length/width ratio of P1ENP 1 more than 2.5

…………………….………………………………………..14A

14A. caudal rami with inner setules; length/width ratio of P1ENP 1 about 4.3

..………………..……………………… S. knabeni (11)

14B. caudal rami without inner setules; length/width ratio of P1ENP 1 less than 4.3

………..….………………..………………………………15A

15A. outer spine of the last endopodal segment of P1 thick; length/width ratio of P1ENP3 about 2

……………………………………S. tobae tobae (6)

15B. outer spine of the last endopodal segment of P1 slender; length/width ratio of P1ENP 3 about 2.5-3 …....................................................16A 16A. inner spine of the basis of P1 short; length/width ratio of P1ENP 3 about 3

…………………………………………..……..S. pori (15)

16B. inner spine of the basis of P1 long; length/width ratio of P1ENP 3 about 2.5

………………………………………………...S. vicina(8)

17A. Caudal rami about 2 times as long as wide; P1ENP1 slightly shorter than EXP

……….......................……….… S. osana (17)

17B. Caudal rami about 2.5 times as long as wide; P1ENP1 slightly longer than EXP

……………………..……….….. S. hawaiiensis (18)

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4214-4225, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Determination of microbiological and sensory parameters of fish fillets with propolis preserved under refrigeration Determinación de parámetros microbiológico y sensorial de filetes de pescado preservados con propóleos bajo refrigeración Héctor Suarez M,1* Ph.D, Álvaro Jiménez T,2 M.Sc, Consuelo Díaz M,1 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. 1Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos-ICTA. 2Postgrado en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Carrera 30 N° 45-03 Edificio 500 C. Cundinamarca, Bogotá. *Correspondencia: hsuarezm@unal.edu.co Received: July 2013; Accepted: November 2013.

ABSTRACT Objective: To determine the ability of propolis preservative cachama fillets during refrigerated storage. Materials and method. Ethanol extracts of propolis (EEP) were used in cachama fillets. The treatments included: i) 96% ethanol alcohol as the control; ii) 0.8% EEP; iii) 1.2% EEP; and iv) liquid smoke. A in vitro analysis was used to determine the inhibitory effect of propolis on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium sp. and on the fish matrix to determine the mesophiles, psychrotrophiles, total coliforms, fecal coliforms, sulphite reducing spores and the presence of Salmonella. Results. The results of the in vitro analysis demonstrated the control that the EEP had over the evaluated microorganisms without presenting significant differences between the different concentrations (p>0.05). The analyses of the fish fillet matrix presented acceptable contents for the evaluated microorganisms in the treatments with EEP. A different situation was seen in the treatment with liquid smoke and the control, which had samples that where rejected after 20 days of storage. The sensory analysis showed acceptance for the samples with EEP until the end of the storage period but low marks for the treatment with liquid smoke and the control. Conclusions. The EEP used in this study could be effective for the control of Gram positive bacteria and some Gram negative bacteria that are present in cachama fillets; and could be an alternative to the use of chemical preservatives. Key words: Cachama, ethanol extracts, microorganisms, preservation, Piaractus braquipomus (Sources: UNESCO, FAO).

RESUMEN Objetivo. Determinar la capacidad conservante de propóleos en filetes de cachama durante el almacenamiento bajo refrigeración. Materiales y método. Se utilizaron extractos etanólicos de propóleos (EEP) en filetes del pez cachama (Piaractus brachypomus). Los tratamientos realizados fueron: i) alcohol etanólico 96% v/v como control; ii) EEP 0.8%; iii) EEP 1.2% y iv) Humo líquido. Fueron realizados análisis in vitro para determinar la actividad inhibitoria de los propóleos frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp., y Clostridium sp., y en la matriz de pescado para determinar la presencia de mesófilos, psicrotrófilos, coliformes totales, coliformes fecales, esporas sulfitoreductoras 4214

Suarez - Determine the ability of propolis preservative cachama fillets

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y de Salmonella spp. Resultados. Los resultados de los análisis in vitro mostraron control de los EEP sobre los microorganismos utilizados sin presentar diferencias significativas (p>0.05). Los análisis en la matriz del filete de pescado presentaron conteos aceptables para los microorganismos evaluados en los tratamientos con EEP. Situación diferente para los tratamientos con el humo líquido y el control, siendo las muestras rechazadas a partir del día 20 de almacenamiento. El análisis sensorial mostró aceptación de las muestras con EEP hasta el final del período de almacenamiento y bajas puntuaciones para los tratamientos con el humo líquido y el control. Conclusiones. Los EEP utilizados podrían ser efectivos en el control de bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas presentes en filetes de cachama y serian una opción para evitar el uso de conservantes químicos. Palabras clave: Cachama, conservación, extractos etanólicos, microorganismos, Piaractus brachypomus (Fuentes: UNESCO, FAO).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The cachama fish (Piaractus brachypomus) hails from different basins of South America. In Colombia is the main native species in aquaculture. On the other hand, propolis is a natural, resinous substance and a strong adhesive, which is collected by Africanized honeybees (Apis mellifera L.) from leaf buds of trees and plants, and mixed with pollen and enzymes that are secreted by the bees (1). The bees use propolis as a sealant for the interior walls of hives and as a protective barrier against intruders (2). In general, propolis is composed of balsam and vegetative resin (50% v/v), wax (30% v/v), essential herb oils (10% v/v), pollen (5% v/v) and other substances (5% v/v), including organic remains (2). In ethanol extraction, the wax and organic residues are removed during the process. The ethanol extract that is obtained has more than 300 bioactive compounds, such as polyphenols, terpenoids, steroids, sugars and amino acids that have been detected in raw propolis.

La cachama (Piaractus brachypomus) viene de diferentes cuencas de Sudamérica. En Colombia es la principal especie nativa en acuacultura. Por otro lado, propóleos es una sustancia natural, resinosa y fuertemente adhesiva, que es recolectada por abejas melíferas africanizadas (Apis mellifera L.) de las yemas y hojas de árboles y plantas, mezclada con polen y enzimas que las abejas secretan (1). Las abejas usan propóleos para sellar las paredes interiores de sus colmenas y como una barrera protectora contra intrusos (2). En general, los propóleos son compuestos de bálsamo y resina vegetal (50% v/v), cera (30% v/v), aceites esenciales de hierbas (10% v/v), polen (5% v/v) y otras sustancias (5% v/v), incluyendo restos orgánicos (2). En la extracción etanólica, los residuos orgánicos y de la cera son removidos durante el proceso. El extracto etanólico que se obtiene contiene más de 300 compuestos bioactivos, tales como polifenoles, terpenoides, esteroides, azucares y aminoácidos que han sido detectados en propóleos crudo.

Propolis is considered responsible for the lower incidence of bacteria and fungi in hives. The action against microorganisms is an essential characteristic of propolis. Furthermore, humans have used propolis for centuries due to the pharmaceutical properties (1). The antimicrobial biological activity is due to the presence of flavonoid and phenol compounds, although the exact action of this mechanism is unknown (3). The antimicrobial effect of propolis depends on the propolis extract concentration and is influenced by the extraction method (4). In addition, studies have shown that allergic reactions are not slightly common and that propolis is relatively no toxic, with effect values not observed (NOEL) in 1400mg/kg of body weight/day in mice (2).

Los propóleos son considerados responsables de la baja incidencia de bacterias y hongos en las colmenas. Esta acción contra los microrganismos es una característica esencial de los propóleos. Además, los humanos han usado propóleos por siglos por sus propiedades farmacéuticas (1). La actividad biológica antimicrobiano es debido a la presencia de compuestos de flavonoides y fenol, aunque la acción exacta de este mecanismo no se conoce (3). El efecto antimicrobiano de los propóleos depende de la concentración del extracto de propóleos y es afectado por el método de extracción (4). Además, estudios han mostrado que las reacciones alérgicas no son comunes y que los propóleos son relativamente no toxico, con valores de efecto no observados (NOEL) en 1400mg/kg de peso corporal/día en ratones (2).

A number of studies have mainly described the antimicrobial action against microorganisms (5, 6). The antibacterial effect of propolis

Numerosos estudios han descrito principalmente la acción antimicrobiana contra los microorganismos (5, 6). El efecto antibacteriano de propóleos

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on pathogens transmitted by food, such as Bacilluscereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis and Perfringenes Clostridium, has shown a potential for preserving food against such pathogens (7,8). In addition, propolis contains actions that not only counteract bacteria and fungi but also viruses. Drago and De Vecchi (5) reported that propolis is capable is inhibiting the growth of influenza viruses, adenoviruses, parainfluenza viruses, and the Herpes simplextype-1 virus. In food applications, propolis has been proposed as a preservative for meat products due to the antimicrobial effect (9) and as a bactericide and insecticide in food packaging (10). Furthermore, it has been reported that the addition of propolis doubles or triples the shelf-life of frozen fish (8). In addition, the liquid smoke has antimicrobial activity, but must be used under certain thermal conditions. In considering safety factors, it has been reported that various propolis compounds are present in nutritional and/or food additives and are considered GRAS (Generally recognize as safe) (2). These characteristics make propolis an attractive candidate for natural preservation in new food applications and able to satisfy the demand for antioxidants and antimicrobials that comes from the growing awareness of consumers for natural food and the omission of processing and chemical preservatives (9, 11). This study aimed to evaluate the antimicrobial and sensory capabilities of ethanol extracts of propolis applied to cachama fillets during a period of refrigerated storage.

MATERIALS AND METHODS Ethanol extract of propolis (EEP). Propolis from the Villa de Leiva, Boyacá (Colombia) was utilized in this study. Twenty five % (v/v) ethanol extract of propolis in 96% (v/v) ethanol was used. Hundrey g of propolis were introduced in a precipitated glass, then 400 ml of ethanol 96% (v/v) were added. The mixture was shaken during two hours, and it was left at rest overnight, and then it was filtered. The residue was subjected to a secondary extraction with the same proportions as the first one. Finally the two extracts were mixed and frozen to precipitate other compounds. The supernatant EEP was used for the tests and its solid concentration of 8% (v/v) was established for the oven-drying method. Preparation of the fillets. Transversal cuts were used on the cachama fillets to cut

en patógenos transmitidos por alimentos, tales como Bacilluscereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis y Perfringenes Clostridium, han mostrado ser un potencial para preservar alimentos contra tales patógenos (7, 8). Adicionalmente, los propóleos contiene actividad que no solo contrarrestan bacteria y hongos pero también los virus. Drago y De Vecchi (5) reportaron que los propóleos son capaces de inhibir el crecimiento de los virus de influenza, adenovirus, para influenza, y el virus Herpes simplex tipo-1. En alimentos los propóleos han sido recomendados como conservantes para productos cárnicos debido a su efecto antimicrobiano (9) y como bactericida e insecticida en empaques de alimentos (10). Además, se ha reportado que añadir propóleos extiende de dos a tres veces la vida útil de pescado congelado (8). Adicionalmente el humo líquido tiene actividad antimicrobiano, pero debe ser usado bajo condiciones térmicas. Al considerar factores de seguridad se ha reportado que varios compuestos de los propóleos están presente en aditivos nutricionales y/o alimentos y son considerados GRAS (generalmente reconocidos como seguros) (2). Estas características hacen de los propóleos un candidato atractivo para la conservación natural en aplicaciones alimenticias nuevas y para poder satisfacer la demanda de antioxidantes y antimicrobianos, que nace de una conciencia creciente de consumidores de alimentos naturales y la omisión de procesamientos y conservantes químicos (9, 11). El objetivo de este estudio fue evaluar las capacidades antimicrobianas y sensoriales de los extractos etanólicos de los propóleos aplicados a filetes de cachama durante un periodo de almacenaje refrigerado.

MATERIALES Y MÉTODOS Extracto de etanólico de propóleos (EEP). Se utilizaron propóleos de Villa de Leiva, Boyacá (Colombia) en este estudio. Veinte cinco % (v/v) de extracto etanólicos de propóleos en 96% v/v) de etanol se usaron. Cien gramos de propóleos se introdujeron en un vidrio precipitado, y después se añadieron 400 ml de etanol 96% (v/v). La mezcla se agitó por dos horas y se dejó reposar durante la noche, y después se filtró. Los residuos fueron sujetos a una extracción secundaria con las mismas proporciones de la primera. Finalmente los dos extractos se mezclaron y se congelaron para precipitar otros compuestos. El sobrenadante de EEP se usó para estos ensayos y su concentración solida de 8% (v/v) fue establecido para el método de secado al horno.

Suarez - Determine the ability of propolis preservative cachama fillets intramuscular bones. The following treatments were used: i) Control, 96% (v/v) ethanol alcohol; ii) propolis at a concentration of 0.8mg/ ml; iii) propolis at a concentration of 1.2 mg/ ml; iv) liquid smoke. The fillets were packed in vacuum sealed bags and stored at 3oC for 24 days. Microbiological Analysis. The following microbiological analyses were carried out: In vitro tests. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium sp., strains were obtained from the Microbiology Laboratory at the Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos - ICTA at the Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. For the activation of Clostridium sp., BHI broth (Oxoid) was used; for Salmonella sp., a nutritive broth (Oxoid) according to ATCC 13076; and for Staphylococcus aureus, Escherichia coli, TSB broth (Merck) according to ATCC 25923 and ATCC 25922, respectively. The strains were incubated overnight after 18 hours of growth. For the analysis of the inhibitory activity of propolis, a diffusion test was carried out in Mueller-Hinton agar. One ml of each strain was grown using 0.5 in the MacFarland scale, corresponding to a concentration of 1.5 x109 cells on the surface. Six mm diameter of filter paper discs were impregnated with three different propolis concentrations (0.8, 1.2 and 1.6 mg/mL) and a control with 96% (v/v) ethanol alcohol was used. They were incubated for 48 hours and the inhibition halos were measured. It was found that the three concentrations inhibited the growth of the utilized pathogens and that there were no significant differences for the inhibitory effect, so the two lower concentrations were selected (0.8 and 1.2 mg/ mL). Cachama fillet tests. The plate mesophile (heterotrophs), psychrotrophile, total coliform, fecal coliform, and sulphite reducing spore counts and the presence of Salmonella spp., were determined according to the standards of the Normas del Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos- INVIMA and Normas Técnicas Colombianas (12). Plate mesophile and psychrotrophile count: 11g of the sample were added to 99 ml of peptonated water (0.1% w/v) and placed in petri dishes with PlateCount Agar and incubated at 35±2°C for 48 hours. For psychrotrophiles, they were incubated at 4±0.5°C for 5-7 days. The results

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Preparación de los filetes. Se hicieron cortes transversales en los filetes de cachama para cortar las espinas intramusculares. Fueron utilizados los siguientes tratamientos: i) Control, 96% (v/v) alcohol etanol; ii) propóleos a una concentración de 0.8mg/ml; iii) propóleos a una concentración de 1.2 mg/ml; iv) humo líquido. Los filetes fueron empacados en bolsas selladas al vacío y almacenadas a 3oC por 24 días. Análisis microbiológico. Los siguientes análisis microbiológicos se llevaron a cabo: Ensayos in vitro. Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella sp. y Clostridium sp., se obtuvieron del laboratorio de microbiología del Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos - ICTA de la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. Para activar Clostridium sp., se usó caldo BHI (Oxoid); para Salmonella sp., un caldo nutritivo (Oxoid) según ATCC 13076; y para Staphylococcus aureus, Escherichia coli, caldo TSB (Merck) según ATCC 25923 y ATCC 25922, respectivamente. Las cepas fueron incubadas durante la noche para obtener 18 horas de crecimiento. Para el análisis de la actividad inhibidora de propóleos, un ensayo de difusión se llevó a cabo en agar MuellerHinton. Un ml de cada cepa se cultivó utilizando 0.5 en la escala MacFarland, correspondiendo a una concentración de 1.5 x109 células en la superficie. Discos de papel de filtro de seis mm de diámetro fueron impregnados con tres diferentes concentraciones de propóleos (0.8, 1.2 y 1.6 mg/mL) y un control con 96% (v/v) alcohol etanol se usó. Fueron incubados por 48 horas y se midieron los halos de inhibición. Se encontró que las tres concentraciones inhibieron el crecimiento de los patógenos utilizados y que no hubieron diferencias significativas en el efecto inhibitorio, así que las dos concentraciones menores fueron seleccionados (0.8 y 1.2 mg/mL). Ensayos en filetes de cachama. Recuento de mesófilos (heterotrofos) en placa, psicrotrofos, coliforme totales, coliforme fecales, cantidad de esporas sulfito reductoras y presencia de Salmonella spp., fueron determinados según los estándares de las Normas del Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos- INVIMA y Normas Técnicas Colombianas (12). Conteo de mesofilos en placa y psicrotrofos: 11g de la muestra se añadieron a 99 ml de agua peptonada (0.1% w/v) y colocados en placas Petri con Agar PlateCount e incubados a 35±2°C por 48 horas. Los psicrotrofilos fueron incubados a 4±0.5°C por 5-7 días. Los resultados fueron expresados como Log de Unidades Formadoras de Colonia/g, (Log CFU/g).

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were expressed as Log of Colony Forming Units/g, (Log CFU/g). Determination of Salmonella. Twenty five g of cachama fillet were homogenized in 225 ml of buffered peptone and incubated at 35±2°C for 18 to 24 hours. 1 ml of the culture was added to one test tube with 10 ml of tetrathionate broth and to another with selenite, to which were added 2 drops of lugol and 2 drops of green coloring at 0.1% (w/v). The tubes were incubated at 35±2°C for 18 to 24 hours. The medium of the utilized selective culture was XLD agar and SS agar for the surface exhaustion method and incubation at 35±2°C for 24 hours. The results were reported as positive or negative. Determination of sulphite reducing spores. 11 g of the sample were added to 99 ml of universal peptone (0.1 w/v) and diluted cultures of 1 ml, with preliminary thermal shock at 90ºC for 5 minutes, in petri dishes with SPS agar with the depth method; and incubated at 35±2°C for 72 hours in anaerobiosis. The results were expressed as CFU/g. Determination of total and fecal coliforms. 11 g of the sample were homogenized in 99 ml of Fluorocult LMX broth using a vortex and incubation at 35±2ºC for 24 to 48 hours. The presence of the gas was determined with a Durham tube and by turbidity of the Brilla broth (Merck). The data were reported as Most Probable Number (MPN). Sensory analysis. The sensory analysis was done with a descriptive test to judge the quality of the fillets by eight semi-trained panelists. The sensory attributes: appearance, color and aroma were evaluated in fresh fillets. The attributes: taste, texture and appearance were evaluated in cooked fillets. The scoring was based on a scale of four points, with 4 being the best and 1 the worst. Experimental design and analysis of the data. A factorial design with two factors (time and preservation) was used to study the effect of the preservation treatments with propolis, liquid smoke and time of storage on the quality attributes of the fish fillets. A control and three levels were employed for the preservation treatments. For the factor of time, four storage periods were used (0, 8, 16 and 24 days). Three repetitions were used for each treatment. ANOVA was utilized on the results to evaluate the effect of preservation (A), time (B) and the A x B interaction on the quality attributes, using the software Statgraphics (StatisticalGraphics Corp.

Determinación de Salmonella. Veinte cinco g de filete de cachama se homogenizaron en 225 ml de peptona tamponada e incubados a 35±2°C por 18 a 24 horas. A 1 ml del cultivo se añadió a un tubo de ensayo con 10 ml de caldo de tetrationate y a otro con selenita, a lo cual se añadieron 2 gotas de lugol y 2 gotas de colorante verde a 0.1% (w/v). Los tubos se incubaron a 35±2°C por 18 a 24 horas. El medio del cultivo selectivo fue agar XLD y agar SS para el método de agotamiento de superficie e incubado a 35±2°C por 24 horas. Los resultados se reportaron como positivo o negativo. Determinación de esporas sulfito reductoras. 11 g de la muestra fueron añadidos a 99 ml de peptona universal (0.1 w/v) y cultivos diluidos a 1 ml, con shock térmico preliminar a 90ºC por 5 minutos, en placas de Petri con agar SPS con el método de profundidad; e incubados a 35±2°C por 72 horas en anaerobiosis. Los resultados se expresaron en CFU/g. Determinación de coliformes totales y fecales. 11 g de la muestra se homogenizaron en 99 ml de caldo Fluorocult LMX utilizando un vortex e incubación a 35±2ºC por 24 a 48 horas. La presencia del gas se determino con un tubo Durham por turbidez del caldo Brilla (Merck). Los datos se reportaron como Número Más Probable (MPN). Análisis sensorial. El análisis sensorial se hizo con un ensayo descriptivo para determinar la calidad de los filetes por ocho panelistas semi entrenados. Los atributos sensoriales: apariencia, color y aroma se evaluaron en filetes frescos. Los atributos: gusto, textura, y apariencia se evaluaron en los filetes cocidos. El puntaje se basó en una escala de cuatro puntos, siendo 4 la mejor y 1 la peor. Diseño experimental y análisis de datos. Un diseño factorial con dos factores (tiempo y conservación) se usaron para estudiar el efecto de los tratamientos de conservación con propóleos, humo líquido y el tiempo de almacenaje sobre los atributos de calidad de los filetes de pescado. Un control y tres niveles fueron usados para los tratamientos de conservación. Para el factor tiempo, cuatro periodos de almacenaje se usaron (0, 8, 16 y 24 días). Cada tratamiento se repitió tres veces. Se utilizó ANOVA en los resultados para evaluar el efecto de conservación (A), tiempo (B) y la interacción A x B en los atributos de calidad, utilizando software Statgraphics (StatisticalGraphics Corp. Rockville, USA). La diferencia entre el promedio de los valores de los diferentes tratamientos y el periodo de almacenaje fue determinado por la prueba de mínima diferencia significativa (LSD) y la diferencia estadística se definió p≤0.05.

Suarez - Determine the ability of propolis preservative cachama fillets Rockville, USA). The difference between the mean of the values of the different treatments and the storage period was determined by the Least Significant Difference test (LSD) and the statistical difference was defined as p≤0.05.

RESULTS In vitro microbiological analysis. Table 1 shows the inhibition halos that were obtained using the concentrations of 0.8, 1.2 and 1.6 mg/ ml of EEP. It was observed that, in all cases, the substances inhibited the growth of the bacterial pathogens as compared to the control. Table 1. Diameter of the halos of inhibition of the in vitro tests for the different concentrations of propolis. Concentration of ethanol extract of propolis

Control

Bacteria

0.8mg/ml

1.2 mg/ ml

1.6 mg/ml

Ethanol alcohol

S. aureus

Salmonella

E. coli

Clostridium sp.

Values reported as halo of inhibition in mm.

No significant differences (p>0.05) were found for the different concentrations (0.8, 1.2 and 1.6 mg/mL) when the diffusion technique was used to test the antagonism between the ethanol extract of propolis and Salmonella, E. coli, S. aureus and Clostridum sp. As a result, only the two lower concentrations were used.

4219

RESULTADOS Análisis microbiológico in vitro. La tabla 1 muestra los halos de inhibición que se obtuvieron usando las concentraciones de 0.8, 1.2 y 1.6 mg/ml de EEP. Se observe que, en todos casos, las sustancias inhibieron el crecimiento de los patógenos bacterianos al ser comparados con el control. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) para las diferentes concentraciones (0.8, 1.2 y 1.6 mg/mL) cuando la técnica de difusión se usó para probar el antagonismo entre el extracto de etanol de propóleos y Salmonella, E. coli, S. aureus y Clostridum sp. Como resultado, solo las dos concentraciones menores se usaron. Análisis microbiológico de los filetes. La figura 1 muestra los resultados del crecimiento microbiano para mesofilos y psicrotrofilos en filetes de cachama para cada tratamiento durante los 24 días del muestreo. Figura 1 y tabla 2 muestran los valores de los conteos microbioanos de las pruebas llevadas a cabo en los filetes de cachama, según NTC 1325 (13). Los resultados demuestran una carga microbiana inicial representado por mesofilos

Microbiological analysis of the fillets. Figure 1 show the results for the microbial growth of the mesophile and psychrotrophile microorganisms in the cachama fillets for each treatment during the 24 days of the sampling. Figure 1 and table 2 show the values of the microbiological counts of the tests carried out on the cachama fillets, in accordance with Table 2. Microbiological count values for cachama fillets, using ethanol extract of propolis and liquid smoke. Total Coliforms Day 0

Day 8

Day 16

Day 24

EEP 0.8

>1100

290

> 1100

EEP 1.2

>1100

> 1100

Liquid Smoke

>1100

> 1100

240

> 1100

Control

>1100

460

> 1100

EEP 0.8

EEP 1.2

3.6

Liquid Smoke

7.3

6.2

9.1

Control

3.6

6.2

9.1

Fecal Coliforms

Figure 1. Microbial growth of mesophile and psychrotrophile microorganisms in cachama fillets treated with EEP and liquid smoke.

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NTC 1325 (13). The results demonstrate an initial microbial load represented by aerobic mesophiles and psychrophiles, and total and fecal coliforms, without the presence of Escherichia coli, Salmonella sp., Clostridium sp. or coagulase-positive Staphylococcus. The mesophile count demonstrated continuous growth over the course of the storage time. The liquid smoke treatment and the control presented counts of 7.4 log CFU/g at 20 days of storage, which is microbiologically unacceptable. While, the propolis treatments still presented acceptable microbiological conditions at this time, with counts of 6.1 log CFU/g and 5.4 log CFU/g, using EEP concentrations of 0.8mg/ml and 1.2 mg/ml, respectively. The psychrotrophile analysis presented a similar condition, showing continuous growth over the time of storage. The highest counts were seen in the liquid smoke treatment and the control with values of 6.7 log CFU/g and 6.1 log CFU/g, respectively, at the end of the storage period. The EEP treatments presented values of 4.2 log CFU/g and 4.5 log CFU/g in the concentrations of 0.8 mg/ml and 1.2 mg/ml, respectively, for the same time period.

aeróbicos y psicrofilos, y coliformes total y fecal, sin la presencia de Escherichia coli, Salmonella sp., Clostridium sp. o Staphylococcus positivocoagulase. El conteo de mesófilos demostró crecimiento continuo durante el tiempo de almacenamiento. El tratamiento con humo líquido y el grupo control presentaron cantidades de 7.4 log CFU/g a los 20 días de almacenamiento, el cual es microbiológicamente inaceptable. Los tratamientos de propóleos todavía presentaron condiciones microbiológicas aceptables en este periodo, con conteos de 6.1 log CFU/g y 5.4 log CFU/g, utilizando concentraciones EEP de 0.8 mg/ml y 1.2 mg/ml, respectivamente. El análisis para psicrotrófilos presentó una condición similar, mostrando crecimiento continuo durante el periodo de almacenamiento. Los mayores conteos de presentaron en el tratamiento de humo líquido y el grupo control, con valores de 6.7 log CFU/g y 6.1 log CFU/g, respectivamente, al final del periodo de almacenamiento. Los tratamientos EEP presentaron valores de 4.2 log CFU/g y 4.5 log CFU/g en concentraciones de 0.8 mg/ml y 1.2 mg/ml, respectivamente, para el mismo periodo de tiempo.

The presence of coliforms from the manipulation was reported in the treatments; however, the fecal coliforms presented a lower quantity with values under 3 NMP/g for the EEP treatments. Values over 3 NMP/g were seen in the liquid smoke treatment and the control. The aerobic mesophiles presented initial values of 3.8 log CFU/g and the psychrophiles had values of 2.4 log CFU/g, increasing over the time of storage. There were significant differences (p<0.05) between the EEP treatments and the liquid smoke treatment, as well as the control, with the best microbiological conditions seen in the 1.2 mg/ mL of EEP treatment. The cachama fillets treated with liquid smoke and the control exceeded the acceptable microbiological limits after 20 days of storage.

La presencia de coliformes por manipulación fue reportado en los tratamientos; sin embargo, los coliformes fecales presentaron una cantidad menor, con valores por debajo de 3 NMP/g por los tratamientos EEP. Valores sobre 3 NMP/g fueron reportados en el tratamiento de humo líquido y el grupo control. Los mesofilos aeróbicos presentaron valores iniciales de 3.8 log CFU/g y los psicrofilos tuvieron valores de 2.4 log CFU/g, aumentando durante el periodo de almacenamiento. Se mostraron diferencias significantes (p<0.05) entre los tratamientos EEP y el tratamiento de humo líquido, además del grupo de control, con las mejores condiciones microbiológicas presente en el 1.2 mg/mL del tratamiento EEP. Los filetes de cachama tratados con humo líquido y el grupo control excedieron los límites aceptables microbiológicos después de 20 días de almacenamiento.

Sensory analysis. Figures 2 and 3 present the results of the sensory analysis for the cachama fillets treated with EEP for fresh fillet and cooked cachama fillets, respectively. The sensory tests were carried out every 8 days during the 24 days. The panelists graded the sensory attributes of color, aroma, and appearance in fresh cachama fillets and the attributes of taste, texture, and appearance in cooked fillets. In the analysis of the fresh cachama fillets the attribute color scored the highest for the 0.8 mg/mL EEP treatment. As for aroma, the scores were similar for all the EEP treatments, without significant differences

Análisis sensorial. Figuras 2 y 3 presentan los resultados del análisis sensorial para los filetes de cachama tratados con EEP para filetes de cachama frescos y cocidos, respectivamente. Las pruebas sensoriales se hicieron cada 8 días durante 24 días. Los panelistas tomaron en cuenta los atributos sensoriales de color, aroma, y apariencia de filetes frescos de cachama y los atributos de sabor, textura y apariencia de los filetes cocidos. En el análisis de los filetes frescos de cachama, el atributo de color presento los mejores valores para el tratamiento EEP 0.8 mg/mL. En cuanto a aroma, las calificaciones fueron similares para todos los tratamientos EEP,

Suarez - Determine the ability of propolis preservative cachama fillets

4221

(p>0.05). The appearance was preferred by the panelists in the 1.2 mg/ml EEP treatment. The lowest values were seen in the liquid smoke treatment and the control, with samples from day 24 being rejected by the panelists in the evaluation of the three attributes.

sin diferencias significativas (p>0.05). La apariencia del tratamiento EEP de 1.2 mg/ml fue preferido por los panelistas. Los valores más bajos se vieron en el tratamiento de humo líquido y el control, con muestras del día 24 siendo rechazadas por los panelistas en la evaluación de los tres atributos.

The results of the sensory evaluation for the cooked cachama fillets that were preserved with EEP are presented in figure 3.

Los resultados de la evaluación sensorial para los filetes cocidos de cachama que se preservaron con EEP son presentados en figura 3.

The sensory analysis for the taste attribute in the cachama fillets of the EEP treatments did not present significant differences (p>0.05). The obtained values decreased during the storage period, with values of 2.20 at the end, which were acceptable to the judges. The liquid smoke treatment and the control were rejected by the evaluators at the end of the storage period. The analyses of texture and appearance produced similar results for the EEP treatments, with no significant difference (p>0.05). However, the liquid smoke treatment and the control presented low values starting at day 16 and values that were rejected by the judges on day 24 of the storage.

El análisis sensorial para el atributo de sabor en los filetes de cachama de los tratamientos EEP no presentaron diferencias significativas (p>0.05). Los valores obtenidos bajaron durante el periodo de almacenamiento, con valores de 2.20 al final, que fueron aceptables a los jueces. El tratamiento con humo líquido y el grupo control fueron rechazados por los evaluadores al final del periodo de almacenamiento. El análisis de textura y apariencia produjeron resultados similares para los tratamientos EEP, sin diferencias significativas (p>0.05). Sin embargo, el tratamiento de humo líquido y el grupo control presentaron valores bajos iniciando el día 16 y con valores rechazados por los jueces a partir del día 24 del almacenamiento. Day 0 4

Color

Day 0 4

Color

Control

1 Day 8

Taste

Day 24

Taste

Propolis 0,8 %

Control

1 Day 24

Day 8

Propolis 1,2 %

Propolis 0,8 % Propolis 1,2 % Liquid smoke

Liquid smoke

Day 16

Day 0 4

Smell Smell

Day 0 4 3

Day 8

Propolis 0,8 %

Control

1 Day 24

Texture

Day 24

Day 8

Propolis 1,2 %

Propolis 0,8 % Propolis 1,2 % Liquid smoke

Liquid smoke

Day 16 Day 0 4

Appearance Appearance

2 Control

1 Day 24

Appearance Appearance

Day 8

Propolis 0,8 %

Control

1 Day 24

Propolis 1,2 %

Day 8

Propolis 0,8 % Propolis 1,2 % Liquid smoke

Liquid smoke

Day 16

Figure 2. Sensory analysis for the cachama fillets treated with ethanol extract of propolis (EEP) analysis of color, aroma and appearance.

Day 16

Figure 3. Sensory analysis of taste, texture and appearance for cooked cachama fillets that were preserved with ethanol extract of propolis.

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DISCUSSION

DISCUSIÓN

In vitro microbiological analysis. Inhibition halos were observed with diameters starting at 8 mm for the evaluated concentrations. The diameter of the halos is considered a inhibition test, in accordance with other authors (14), the diffusion method has been used and the antimicrobial activity of EEP against S. aureus has been reported in different regions of Argentine, presenting inhibition halos with diameters starting at 9mm, which were considered as important antimicrobial activity.

Análisis microbiológico in vitro. Los halos de inhibición se observaron con diámetros comenzando con 8 mm para las concentraciones evaluadas. El diámetro de los halos se considera una prueba de inhibición, en conformidad con otros autores (14), el método de difusión se ha usado y la actividad antimicrobiana de EEP contra S. aureus ha sido reportado en diferentes regiones de Argentina, presentando halos de inhibición con diámetros a partir de 9 mm, que se consideraron como señal de actividad antimicrobiana importante.

It has been reported that EEP concentrations of 1.25 mg/ml have inhibition activity against Gram positive bacteria and 5 mg/ml concentrations have inhibition activity vs. Gram negative bacteria (15), values that surpass those reported in this study.

Se ha reportado que concentraciones EEP de 1.25 mg/ml tienen actividad de inhibición contra bacterias Gram positivas y concentraciones de 5 mg/ml provocan inhibición de actividad contra bacterias Gram negativas (15), valores que sobrepasan los reportados en este estudio.

On the other hand, Palomino et al (16) indicated that bacteria such as E. coli, S. aureus and S. tiphi did not present a reduction in growth in the presence of ethanol extracts of propolis, while the Gram positive bacterium B. subtilis was sensitive to concentrations of 1.0 and 10.0 mg/ml, presenting a bacteriostatic effect at 1.0 mg/ml and a bactericide effect at 10.0 mg/ ml, with 8.0mm inhibition halos. And so, the higher antimicrobial effect of propolis against Gram positive bacteria and the lower effect against Gram negative bacteria are well known. The results obtained for E. coli do not agree with those reported by Brehm-Stecher and Jonson (17), who showed that Gram negative bacteria, such as E coli, possess an additional membrane called the “OM structure” that confers a higher degree of resistance against antimicrobial agents. Equally, Kim and Chung (18) did not report any evidence of inhibition of Salmonella Typhimurium and Escherichia coli when 2.3 mg/mL of ethanol extract of propolis was used. The results of the present study showed considerable inhibition of Salmonella spp., and E. coli, however some constituents, the application dose, the probable presence of non-volatile compounds (3), of course, the botanic origin may contribute to the variation in the antimicrobial effect of propolis on the microorganisms.

Por otro lado, Palomino et al (16) indicaron que bacterias como E. coli, S. aureus y S. tiphi no presentaron una reducción en crecimiento en la presencia de extractos etanólicos de propóleos, mientras que la bacteria Gram positiva B. subtilis se mostró sensible a concentraciones de 1.0 y 10.0 mg/ml, presentando un efecto bacteriostático a los 1.0 mg/ml y un efecto bactericida a 10.0 mg/ml, con halos de inhibición de 8.0mm. Así, el efecto antimicrobiano más alto de propóleos contra bacterias Gram positivas y el menor efecto contra bacterias Gram negativas son bien conocidos. Los resultados obtenidos por E. coli no coinciden con los reportados por Brehm-Stecher y Jonson (17) quienes mostraron que bacterias Gram negativas, tal como E. coli, posee una membrana adicional llamado la “estructura OM” que confiere un grado más alto de resistencia contra agentes antimicrobianos. De la misma manera, Kim y Chung (18) no reportaron evidencia de inhibición de Salmonella Typhimurium y Escherichia coli cuando se usó 2.3 mg/mL de extracto etanólico de propóleos. Los resultados de este estudio mostraron una inhibición considerable de Salmonella spp., y E. Coli; sin embargo algunos constituyentes, la dosis de aplicación, la presencia probable de compuestos no volátiles (3) y claro, el origen botánico pueden contribuir a la variación en el efecto antimicrobiano de propóleos en los microorganismos.

Microbiological analysis of the fillets. According to Bankova (2), a dose of EEP that would be safe for human consumption is 1.4 mg/kg of body weight/day, or approximately 70mg/day in adults. As a reference, benzoic acid and sodium benzoate were used, which are listed as food additives and cataloged as GRAS (generally recognized as safe) by the

Análisis microbiológico de los filetes. Según Bankova (2), una dosis de EEP que sería innocuo para el consumo humano sería de 1.4 mg/kg de peso corporal/día, o aproximadamente 70mg/ día en adultos. Como referencia, se usaron ácido benzoico y sodio benzoato, que son considerados aditivos alimenticios y catalogados como GRAS (generalmente reconocidos como seguro) por el FDA. La ingesta diaria aceptable (ADI) de las

Suarez - Determine the ability of propolis preservative cachama fillets FDA. The acceptable daily intake (ADI) of both substances has values between 0 and 5 mg/kg of body weight. As a result, EEP can successfully inhibit microorganisms such as Salmonella, E. coli, S. aureus and Clostridum sp., at levels that are safe for human consumption and, as a consequence, can be used as a biopreservative or a food preservative with an unspecified antibacterial action (9). Melliou et al (19) reported that EEP from Greece inhibited four different species of Gram negative bacterium (E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae, P. aeruginosa). Equally, EEP from Bulgaria inhibited 90.0% of the tested Gram negative bacteria (20), while Da Silva et al (21) did not find an inhibitory activity in extracts of propolis from Brazil and Bulgaria against a strain of E. coli. Furthermore, extracts of propolis from Brazil and Korea inhibited Gram negative bacteria such as S. Typhimurium, but did not inhibit Pseudomonas aeruginosa (22). In general, it is reported that the antimicrobial spectrum is related to the presence of terpenoid compounds. Although more than 300 compounds have been identified in propolis samples, the biological activity must be principally due to some of the scarcer substances, such as flavonoids, terpenes, phenolic acid and their esters, with antimicrobial properties, and to a synergistic combination (1, 2). This could offer an explanation for the antimicrobial effectiveness for a microorganism, depending on the origin of the propolis, since the components are determinants for some bacterial strains. Sensory analysis. The use of EEP as a preservative could influence the sensory attributes, principally affecting taste due to the presence of ethanol compounds, which, in some cases, could negatively affect the final taste of the fish. The results of the present study demonstrate that the presence of ethanol compounds did not negatively affect the perception of the evaluators, which is in agreement with other authors (23). Furthermore, the thermal shock treatment allowed for the removal of intramuscular bones without negatively affecting the sensorial acceptance, which is also in agreement with other authors (24). In conclusions the EEP used in this study could be effective for the control of Gram positive bacteria and some Gram negative bacteria that are present in cachama fillets; and could be an alternative to the use of chemical preservatives.

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dos sustancias tiene valores entre 0 y 5 mg/kg de peso corporal. Como resultado, EEP puede inhibir de manera exitosa los microrganismos como Salmonella, E. coli, S. aureus y Clostridum sp., a niveles que son seguros para el consumo humano y como consecuencia se pueden usar como bioconservante o conservante de alimentos con una acción antibacteriana no especificada (9). Melliou et al (19) reportaron que EEP de Grecia inhibió cuatro diferentes especias de bacterias Gram negativas (E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae, P. aeruginosa). De modo similar, EEP de Bulgaria inhibió 90.0% de bacterias Gram negativas (20), mientras Da Silva et al (21) no encontraron una actividad inhibitoria en extractos de propóleos de Brasil y Bulgaria contra una cepa de E. coli. Además, extractos de propóleos de Brasil y Corea mostraron que bacterias Gram negativas, tales como S. Typhimurium, pero no inhibieron Pseudomonas aeruginosa (22). En general, se ha reportado que el espectro antimicrobiano se relaciona a la presencia de compuestos terpenoides. Aunque más de 300 compuestos se han identificado en muestras propóleos, la actividad biológica debe ser debido principalmente a algunas de las sustancias menos comunes, como los flavonoides, terpenos, acido fenólico y sus esteres, con propiedades antimicrobianas, y a una combinación sinérgica (1, 2). Esto podría explicar porque existe cierta actividad antimicrobiana por un microorganismo, dependiendo del origen del propóleos, puesto que los componentes son determinantes para algunas cepas de bacteria. Análisis sensorial. El uso de EEP como preservante podría influir en los atributos sensoriales, principalmente afectando el sabor debido a la presencia de compuestos etanólicos, que en algunos casos podría afectar de manera negativa el sabor final del pescado. Los resultados de este estudio demuestran que la presencia de compuestos etanólicos no afecta de manera negativa la percepción de los evaluadores, coincidiendo con otros autores (23). Además, el tratamiento térmico permitió degradar las espinas intramusculares sin afectar de manera negativa la aceptación sensorial, en concordancia con otros autores (24). En conclusión, el EEP usado en este estudio podría ser efectivo para controlar bacterias Gram positivas y algunas bacterias Gram negativas que son presentes en los filetes de cachama, y puede ser una alternativa al uso de conservantes químicos.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4226-4241, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) culture water recirculating system Evaluación de un sistema de recirculación de agua para levante de trucha arcoiris (Oncorhynchus mikyss) Iván Sánchez O,* M.Sc, Wilmer Sanguino O, IPA, Ariel Gómez C, Esp, Roberto García C, IPA. Universidad de Nariño, Faculty of Livestock Sciences, Department of Hydrobiological Resources, Aquaculture Production Engineering Program. Ciudad Universitaria, Barrio Torobajo Carrera 22#18-109. San Juan de Pasto, Nariño, Colombia. *Correspondence: iaso@udenar.edu.co. Received: July 2013; Accepted: February 2014.

ABSTRACT Objective. To evaluate a water recirculation system for rainbow trout fish cultures at the recirculating laboratory of the Aquaculture Engineering Production Program of University of Nariño. Materials and Methods. 324 rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) fries were cultured in 12 plastic tanks with a capacity of 250 L in an aquaculture recirculating system the treatment system of which was made up by a conventional sedimentation tank, a fixed stand upflow biofilter with recycled PVC tube pieces and a natural degassing system; the sedimentation unit effluent was pumped up to a reservoir tank using a 2 HP centrifugal pump after being subject to gravity through the biofilter and to be then distributed to the 12 culture units to which a constant amount of air from a blower was injected. Results. The water treatment system removed 31% of total suspended solids, 9.5% of total ammonia nitrogen, and increased dissolved oxygen to the final effluent in 6.5%. An increase of 305% in biomass was calculated during 75 days, the mortality percentage registered throughout the study period was 4.9%. Conclusions. The water treatment system maintained the physicochemical water quality parameters within the values recommended for the species. The increase in weight and size, food conversion, mortality and biomass production reported normal values for rainbow trout fish culture in recirculating systems. Key words: Aquaculture, cultivation, treatment, trout, water recirculation (Source: CAB, DeCS).

RESUMEN Objetivo. Evaluar un sistema de recirculación de agua para cultivo de trucha arcoiris en el laboratorio de recirculación del Programa Ingeniería en Producción Acuícola de la Universidad de Nariño. Materiales y métodos. Se cultivaron 324 alevinos de trucha arco íris (Oncorhynchus mikyss) en 12 tanques plásticos de 250 L de capacidad en un sistema de recirculación para acuacultura cuyo sistema de tratamiento estuvo constituido por un sedimentador convencional, un biofiltro de flujo ascendente con medio soporte fijo conformado por segmentos reciclados de tubos PVC, y un sistema de desgasificación natural; el efluente del sedimentador fue elevado a un tanque reservorio por medio de una bomba centrífuga de 2 HP para después pasar por gravedad a través del biofiltro y posteriormente ser distribuido a las 12 unidades de cultivo a las que de manera permanente se inyectó aire proveniente de un blówer. 4226

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss)

4227

Resultados. El sistema de tratamiento del agua removió 31% de los sólidos suspendidos totales; 9.5% del nitrógeno amoniacal total, e incrementó el oxígeno disuelto al efluente final en un 6.5%. Se calculó un incremento de la biomasa del 345% en los 75 días, el porcentaje de mortalidad registrado durante todo el periodo de estudio fue del 4.9%. Conclusiones. El sistema de tratamiento mantuvo los parámetros físico-químicos de la calidad de agua dentro de los rangos requeridos por la especie. El incremento de peso y talla, la conversión alimenticia, la mortalidad y la producción de biomasa reportaron valores normales para producción de trucha en sistemas de recirculación. Palabras clave: Acuicultura, cultivo, recirculación del agua, tratamiento, trucha (Fuente: CAB, DeCS).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The high deterioration of productive soils caused by overexploitation processes makes possible discerning that aquaculture will be the future, since development and population growth levels increase every day, requiring nutritive and high quality food; however, the availability and quality of water has been impacted by both natural and anthropogenic activities, leading to the low quality of the liquid and reduced productivity in aquatic ecosystems, therefore water pollution has become a serious problem for the industry (1).

El elevado deterioro de los suelos productivos por procesos de sobreexplotación hace vislumbrar que la acuacultura será el futuro, puesto que los niveles de desarrollo y crecimiento de la población aumentan día a día, precisando de alimentos nutritivos y de alta calidad; sin embargo, la disponibilidad y calidad del agua ha sido impactada por actividades tanto naturales como antropogénicas, conduciendo a la baja calidad del líquido y una reducida productividad en ecosistemas acuáticos, por ello la contaminación del agua se ha convertido en un grave problema para la industria acuícola (1).

The aspects that limit the growth of aquaculture include the reduction of cultivable water bodies, as well as increased pollution of surface water with harmful chemicals and the eutrophication of rivers and lakes with excesses of nutrients which can lead to various problems such as toxic algal blooms, low concentrations of dissolved oxygen, dead fish and biodiversity reduction (2).

Entre los aspectos que limitan el crecimiento de la acuacultura está la reducción de los cuerpos de agua cultivables, así como la creciente contaminación de las aguas superficiales con químicos perjudiciales y la eutroficación de ríos y lagos con excesos de nutrientes que pueden conducir a diversos problemas como las floraciones de algas tóxicas, bajas concentraciones de oxígeno disuelto, muerte de peces y reducción en la biodiversidad (2).

Contaminants may exert their action on aquaculture cultures in any of the following ways: by modifying the hydrobiological characteristics of water; through the direct action of bio-acid substances that may cause physiological changes or high mortality; or by the contamination of animal tissues with biotoxins, pathogens or chemicals that render animals unusable for consumption (3).

Los contaminantes pueden ejercer su acción sobre los cultivos acuícolas de alguna de las siguientes formas: modificando las características hidrobiológicas del agua; mediante una acción directa de substancias biocidas que pueden originar alteraciones fisiológicas o grandes mortalidades; o por contaminación de los tejidos animales con biotoxinas, microorganismos patógenos o productos químicos que inutilizan a los animales para el consumo (3).

Water is a natural resource whose location and geographic distribution is dramatically affected by anthropogenic actions, an example of this is the alteration in the availability of the liquid due to the climate change induced by human beings (4), which is expressed as the longterm variations in average weather conditions at multiple temporal and spatial scales, and may represent a natural threat, such as floods, droughts, cold or heat waves and storms (5). Water scarcity and the increasing negative alteration of its characteristics make it

El agua es un recurso natural cuya localización y distribución geográfica es dramáticamente afectada por las acciones antrópicas, un ejemplo de ello es la alteración en la disponibilidad del líquido debido al cambio climático inducido por el ser humano (4), el cual se expresa como la modificación a largo plazo de las condiciones meteorológicas medias con variaciones en múltiples escalas temporales y espaciales, y pueden representar una amenaza natural, como inundaciones, sequías, olas de frío o de calor y tormentas (5).

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necessary to investigate the use of intensive and semi-intensive production techniques for hydrobiological species, such as aquaculture recirculating systems (ARS). ARSs were developed as a technology for intensive fish production and have been mainly used when water availability is limited because they allow recycling between 90 and 99% of the liquid (6). Generally, an ARS consists of mechanical and biological filtration components, cultivation tanks, pumps, and may include additional elements for water treatment and disease control in the system (7). ARSs are a technology that allows fish culturing at a greater intensity under a completely controlled environment where animals are bred in tanks under the safest possible conditions. In addition, in such systems the reuse of water after its physical and biological treatment is accomplished as a response to the attempt to reduce water and energy needs as well as the emission of nutrients to the environment (8). Due to the importance of the maintenance of water quality in recirculating systems, virtually all wastewater treatment levels described by von Sperling (9) are applied, because they range from preliminary treatment devices that remove elements that may cause operation and maintenance problems, systems for the removal of suspended solids, to the removal of organic solids, nutrients and disinfection by means of physical, chemical and/or biological processes. In the ARSs, the main application of biological treatment processes is the removal of biodegradable organic substances present in wastewater in both colloidal and dissolved form. The biological treatment is based on a process in which a mixed population of microorganisms uses water pollutants as nutrients, which when in contact for sufficient time allows these microorganisms to break down and eliminate polluting solutes as appropriate. In year 2010, diadromous fish accounted for 6% of world aquaculture production, of which the trout ranked third with about 0.7 million tons (10). Trout farming requires waters of an excellent quality, in which suspended solids do not exceed 10 mg/l, total ammoniacal nitrogen of less than 1 mg/l, ammonia below 0.02 mg/l, nitrite below 0.1 mg/l, temperatures between 10 and 18°C and dissolved oxygen concentrations between 6 and 8 mg/l (11). The main objective of this research was to monitor a water recirculating system for rainbow trout cultivation (Oncorhynchus mikyss) in its culturing phase in terms of the efficiency in

La escasez del agua y la creciente alteración negativa de sus características hacen necesario investigar en relación al uso de técnicas de producción semiintensiva e intensiva de especies hidrobiológicas, como los sistemas de recirculación para acuicultura (SRA). Los SRA se desarrollaron como una tecnología para la producción intensiva de peces y han sido principalmente utilizados cuando la disponibilidad del agua es limitada pues permiten el reciclaje de entre el 90 y el 99% del líquido (6). Generalmente, un SRA está constituido por componentes de filtración mecánica y biológica, bombas, tanques de cultivo, y puede incluir elementos adicionales para tratamiento del agua y control de enfermedades en el sistema (7). Los SRA son la tecnología que permite el cultivo de peces a mayor intensidad bajo un ambiente totalmente controlado en donde los animales se crían en tanques en las condiciones más seguras posibles. Adicionalmente, en tales sistemas el reuso del agua después de su tratamiento físico y biológico se logra como respuesta al intento de reducir las necesidades de agua y energía, así como la emisión de nutrientes al ambiente (8). Debido a la importancia del mantenimiento de la calidad del agua en sistemas de recirculación, prácticamente se implementan todos los niveles de tratamiento de aguas residuales descritos por von Sperling (9), pues se involucran desde dispositivos para tratamiento preliminar que remueven elementos que puedan provocar problemas de operación y mantenimiento, pasando por sistemas para remoción de sólidos suspendidos, hasta la remoción de materia orgánica, nutrientes y desinfección por medio de procesos físicos, químicos y/o biológicos. En los SRA’s La principal aplicación de los procesos de tratamiento biológico es la eliminación de las sustancias orgánicas biodegradables presentes en el agua residual en forma tanto coloidal, como en disolución. El tratamiento biológico se basa en un proceso en el que una población mixta de microorganismos utiliza como nutrientes sustancias que contaminan el agua, que al estar en contacto durante un tiempo suficiente le permite a dichos microorganismos descomponer y eliminar según se desee los solutos contaminantes. En el año 2010, los peces diádromos representaron el 6% de la producción acuícola mundial, de los cuales la trucha ocupó el tercer lugar con cerca de 0.7 millones de toneladas (10). El cultivo de trucha requiere de aguas de excelente calidad, en la cual los sólidos suspendidos no superen 10 mg/l, nitrógeno amoniacal total menor de 1 mg/l, amoníaco menor de 0.02 mg/l, nitrito por debajo de 0.1 mg/l, temperaturas entre 10 y 18°C y concentraciones de oxígeno disuelto entre 6 y 8 mg/l (11). El principal objetivo de la presente investigación fue monitorear un sistema de recirculación de agua

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) the removal of solids and ammonium, the contribution to DO concentration and the most important productive variables.

MATERIALS AND METHODS Location. The research project was conducted in the Living Organisms Laboratory of the Aquaculture Production Engineering program of University of Nariño, located to the northeast of the city of Pasto, Department of Nariño, 01° 09’ north latitude, 77° 08’ east longitude and an approximate altitude of 2540 m; the multiyear monthly average temperatures of the city vary between 9.3 and 18.1°C (12). Description of the ARS and its operation. The recirculating system evaluated consisted of 12 circular polyethylene tanks with a maximum individual capacity of 250 liters; two 2 HP centrifugal pumps; a conventional sedimentation rectangular tank; an upflow biofilter made of by a tank with a maximum capacity of 1.0 m3, inside which recycled PVC vertical segments with a diameter of ½” and a waterfall degasser tank were included. Nine cubic meters of drinking water were taken for the operation of the system from the municipal aqueduct and stored in the underground settler, culture units, elevated tank reservoir and auxiliary tanks for the natural removal of residual chlorine. The water circulation cycle began with the opening of the valves of the elevated tanks (reservoir and its passage to the biofilter). Tanks of 1.0 m3 were arranged for the periodic partial replacement of the liquid in the system in which dechlorinated water was stored. Water and culture storage units were cleaned, disinfected, and filled and emptied three times before being placed into operation. The effluent of the 12 culture tanks, collected by a sanitary pipe with a diameter of 3”, passed to a sedimentation tank whose input and output devices were formed by thick-walled weirs. The dimensions of the settler made our from common and waterproof masonry with ceramic veneer and mortar were: total length of 2.3 m and effective sedimentation length of 1.45 m; 0.50 m wide and 0.90 m deep. This device with a surface area of 0.725 m2 and a sedimentation volume of 0.653 m3 was cleaned weekly for the removal of precipitated sludge. The water, once subjected to pretreatment in the settler, passed to the output chamber which

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para el cultivo de trucha arco iris (Oncorhynchus mikyss) en su fase de levante en términos de la eficiencia de la remoción de sólidos y amonio, del aporte en la concentración del OD y de las variables productivas más importantes.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El proyecto de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Organismos Vivos del programa Ingeniería en Producción Acuícola de la Universidad de Nariño, ubicada al noreste de la ciudad de Pasto, departamento de Nariño, con Latitud 01° 09’ norte, longitud 77° 08’ Oeste y altitud aproximada de 2540 msnm; las temperaturas medias mensuales multianuales de la ciudad oscilan entre 9.3 y 18.1°C (12). Descripción del SRA y su funcionamiento. El sistema de recirculación evaluado constó de 12 tanques circulares de polietileno con una capacidad máxima individual de 250 litros; dos bombas centrífugas de 2 HP de potencia; un sedimentador convencional de sección rectangular; un biofiltro de flujo ascendente constituido por un tanque de 1.0 m3 de capacidad máxima, en cuyo interior se incluyeron segmentos verticales de tubería reciclada de PVC de ½” de diámetro y un tanque desgasificador por medio de caída del agua por gravedad. Para el funcionamiento del sistema se captaron 9 m3 de agua potable del acueducto municipal y se almacenaron en el sedimentador enterrado, las unidades de cultivo, el tanque reservorio elevado y en tanques auxiliares para la remoción natural del cloro residual. Con la apertura de válvulas de los tanques elevados (reservorio y su paso al biofiltro) se inició el ciclo de circulación del agua. Para sustitución y reposición parcial periódica del líquido en el sistema se dispuso de tanques de 1.0 m3 donde se almacenó agua declorinada. Las unidades de almacenamiento de agua y de cultivo fueron limpiadas, desinfectadas y sometidas a llenado y vaciado en tres oportunidades antes de ponerlas en funcionamiento. El efluente de los 12 tanques de cultivo, colectado por medio de tubería sanitaria de 3” de diámetro pasó a un tanque sedimentador cuyos dispositivos de entrada y salida estuvieron conformados por vertederos de pared gruesa. Las dimensiones del sedimentador en mampostería común e impermeabilizado con enchape cerámico y mortero fueron de: 2.3 m de largo total y 1.45 m de longitud efectiva de sedimentación; 0.50 m de ancho y 0.90 m de profundidad. Este dispositivo con área superficial de 0.725 m2 y volumen de sedimentación

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in turn served as the suction chamber of a 2 HP electric plant that subsequently discharged the liquid onto an elevated tank located at a height of 8 m in relation to the initial level of culture tanks; said tank was used as temporary storage from where the liquid was discharged towards the biological treatment unit consisting of the upflow biofilter with a maximum capacity of 1 m 3, usable volume of 0.750 m3 and a water surface diameter of 0.85 m (Figure 1A). To ensure the homogenous distribution of the upflow an acrylic plate with holes of 0.5 cm in diameter was arranged, located at the base of the biofilter and which in turn provided support for the vertical tubes that served as supporting base. The biological community colonizing the surface of the tube segments used as support contributes to the transformation of the ammonium produced in the trout culture into nitrites and nitrates.

de 0.653 m3 se limpió semanalmente para efectos de remoción de los lodos precipitados. El agua una vez sometida a pretratamiento en el sedimentador pasó a la cámara de salida que a su vez sirvió como cámara de succión de una electrobomba de 2 HP que posteriormente descargó el líquido a un tanque elevado localizado a 8 m de altura con relación al nivel inicial de los tanques de cultivo; dicho tanque funcionó como medio de almacenamiento temporal desde donde se descargó el líquido hacia la unidad de tratamiento biológico constituida por el biofiltro de flujo ascendente con capacidad máxima de 1 m3, volumen aprovechado de 0.750 m3 y diámetro superficial de la lámina de agua de 0.85 m (Figura 1A). Para garantizar la distribución homogénea del flujo ascendente se dispuso de una placa acrílica con orificios de 0.5 cm de diámetro, localizada en la base de biofiltro y que a su vez sirvió de apoyo para los tubos verticales que conformaron el medio de soporte. La comunidad biológica que coloniza la superficie de los segmentos de tubos usados como medio de soporte propicia la transformación del amonio producido en el cultivo de las truchas en nitritos y nitratos.

The effluent of the biofilter passed to a waterfall aeration system that at the same time served as a degassing mechanism for the removal of gases such as CO2. The water was finally transported to the 12 culture units where the input of the liquid was carried out through a perforated standpipe (Figure 1B), which generated a tangential flow and an adequate turbulence level for the needs of the species. Air from a 2 HP blower was injected through diffuser stones to improve DO conditions in tanks.

El efluente del biofiltro pasó hacia un sistema de aireación por caída hidráulica que a la vez sirvió como mecanismo de desgasificación para remoción de gases como el CO2. Finalmente el agua se transportó hacia las 12 unidades de cultivo donde la entrada del líquido se realizó por medio de tubería vertical perforada (Figura 1B) que generó un flujo tangencial y un nivel de turbulencia adecuada a las necesidades de la especie. Para mejorar las condiciones de OD en los tanques se inyectó aire proveniente de un soplador de 2 HP por medio de piedras difusoras.

The general layout of culture and wastewater treatment units is shown in the diagram of figure 2. Study period. The experiment was divided into two phases: Pretest: It was carried out between July 1 and September 13, 2008, where operating adjustments were made to culturing and water treatment units, as well as to the protocols for

La disposición general de las unidades de cultivo y de tratamiento del agua residual se presenta en el esquema de la figura 2. A

Figure 1. Top view of the biofilter (A); water and air distribution network to culture tanks (B)

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss)

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Tanque de almacenamiento enterrado (Nivel -2,0m)

Drenaje por Tubería Sanitaria Ø 3"

Tanques circulares con Rebalse Central (Nivel 0,0m)

Caseta de bombeo y filtros granulares

LABORATORIO DE ESPECIES VIVAS

Tanques desgasificadores (Nivel 4,5m)

Biofiltro de lecho fijo de flujo descendente (Nivel 6,0m) Tanque reservorio (Nivel 8,0m)

Figure 2. Plan view of the components of the ARS evaluated.

the handling, evaluation and acclimatization of animals. Test: Performed between September 13 and November 22, 2008, where the operation of the ARS and the variables of productive interest for the cultivation of rainbow trout during the culturing phase were evaluated. Biological material. In each culture tank 27 rainbow trout fries were cultivated, with an average weight of 32.4 g and a length of 14.2 cm for a total of 324 and came from floating cages of the Intiyaco station of the University of Nariño, located in lake Guamues. Adaptation of experimental units. To maintain a constant water level in culture tanks to the central drainage system, an external lateral overflow pipe was adapted using concentric pipes (Figure 3A) where the effluent from each tank underwent an upward vertical motion in the inner tube, once water reached its upper edge the edge it operated as a horizontal circular weir that caused the fluid evacuated to flow evenly through the space between the two concentric tubes to finally move towards the main pipe for the collection and transport of effluents. Culturing units were cleaned and disinfected with water and commercial chlorine. They were subsequently washed with drinking water and each tank was filled with a net water volume of 235 liters; then ventilation was provided by means of

Periodo de estudio. El experimento tuvo dos fases: Pre-ensayo: Se llevó a cabo entre el 1 de julio y el 13 de septiembre de 2008, donde se realizaron los ajustes de funcionamiento de las unidades de cultivo y tratamiento de agua, así como los protocolos de manejo, evaluación y aclimatación de los animales. Ensayo: Realizado entre el 13 septiembre hasta 22 de noviembre de 2008, donde se evaluó el funcionamiento del SRA y las variables de interés productivo del cultivo de trucha arcoiris en la fase de levante. Material biológico. En cada tanque de cultivo se sembraron 27 alevinos de trucha arcoiris, con un peso promedio de 32.4 g y una longitud de 14.2 cm para un total de 324 y fueron provenientes de jaulas flotantes de la estación Intiyaco de la Universidad de Nariño, localizada en el lago Guamués. Adecuación de las unidades experimentales. Para mantener constante el nivel del agua en los tanques de cultivo al drenaje central se le adaptó un rebalse lateral externo por medio de tubos concéntricos (Figura 3A) donde el líquido efluente de cada tanque experimentó un movimiento vertical ascendente por el tubo interno, una vez el agua alcanzaba su borde superior dicho borde funcionó como un vertedero circular horizontal que propició que el líquido evacuado fluyera de manera homogénea a través del espacio comprendido entre los dos tubos concéntricos para finalmente

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medium pore diffuser stones. Once the ARS was put into operation, the inflow of water from each tank was regulated with a flow rate of 50 ml/s, favoring a replacement (R) of 0.85 R/hour or 20 R/day during the experiment. Culture units were covered with a mesh to avoid animals jumping out from the tanks (Figure 3B). Transfer of animals. The fish were moved from the Intiyaco station to the laboratory located at University of Nariño, to this end the animals were subject to a fast for a period of 24 hours, they were then packed in groups of 15 specimens in plastic bags with 10 liters of water and oxygen for their transport and subsequent acclimatization. Acclimatization and farming. The bags with the animals were placed into the culture units for 15 minutes, then they were opened and the water in the bag mixed with the water of the ARS in order to gradually stabilize pH, DO, temperature and alkalinity values. As a prophylactic treatment 15 g of sea salt was added to each bag for a period of 15 minutes. The acclimated animals were released in each experimental unit for an adaptation period of 15 days, during which time they were fed with food prepared with florfenicol. Sampling of animals. Samples were taken every 15 days, 12 animals were used which accounted for 44% of the total population of each experimental unit. To facilitate the handling of fish in order to record weight and size, the specimens were tranquilized with a solution of commercial quinaldine at a concentration of 5.0 mg/l, the activity was carried out in a plastic container with a capacity of 12 liters and the exposure time was from 2 to 3 minutes. Finally, the individuals sampled received a prophylactic wash with potassium permanganate at a concentration of 10 ppm.

dirigirse hacia la tubería principal de colecta y transporte de efluentes. Las unidades de cultivo se limpiaron, desinfectaron con agua y cloro comercial. Posteriormente se lavaron con agua potable y se llenó cada tanque con un volumen de agua neto de 235 litros; luego se proporcionó aireación por medio de piedras difusoras de poro mediano. Una vez puesto en funcionamiento el SRA se reguló el flujo de entrada de agua de cada tanque con un caudal de 50 ml/s, propiciando durante el experimento un recambio (R) de 0.85 R/hora o 20 R/día. Las unidades de cultivo se cubrieron con malla polisombra para evitar que los animales saltaran fuera de los tanques (Figura 3B). Traslado de animales. Los peces se trasladaron desde la estación Intiyaco hasta el laboratorio ubicado en la Universidad de Nariño, para ello se sometió a los animales a un período de ayuno de 24 horas, posteriormente se empacaron en grupos de 15 ejemplares en bolsas plásticas con 10 litros de agua y oxígeno para su transporte y su posterior aclimatación. Aclimatación y siembra. Las bolsas con los animales se introdujeron en las unidades de cultivo durante 15 minutos, luego se abrieron y se mezcló el agua de la bolsa con la del SRA con el fin de estabilizar progresivamente los valores de pH, OD, temperatura y alcalinidad. Como tratamiento profiláctico se agregó a cada bolsa 15 g de sal marina por un lapso de 15 minutos. Los animales aclimatados se liberaron en cada unidad experimental dejándolos por un periodo de adaptación de 15 días, tiempo en el cual se suministró alimento preparado con florfenicol. Muestreo de los animales. Los muestreos se realizaron cada 15 días, se utilizaron 12 animales que representaron el 44% de la población total de cada unidad experimental. Para facilitar la manipulación de los peces con el fin de registrar peso y talla los especímenes fueron tranquilizados con una solución de quinaldina comercial en una

Rebalse externo por tubo interno para control de nivel

Tubo externo Drenaje central

Figure 3. Tank with central drain and external lateral overflow pipe (A); laboratory culture units (B).

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) Feeding. The food provided was based on a commercial concentrate with 48% of crude protein, 2.800 kcal/kg of EM in granules 3.5 mm in diameter. The amount of food to be supplied was calculated taking into account the feed conversion, condition factor, temperature and population for each experimental unit. The calculated ration was distributed in three meals supplied at 7 a.m., 11 a.m. and 6 p.m. recording the relevant data in a logbook. Water quality monitoring. The methodologies recommended by APHA, AWWA & WEF (13) were adopted for the measurement of water quality parameters monitored. The parameters studied were measured at the entry and exit of the treatment system of the ARS, i.e. in the mixed and homogenized effluent of culture units and at the exit of the biofilter. Eight samples were taken of pH values -Electrometric method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 4500-H+ B-, temperature -Direct reading: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 2550 B-, dissolved oxygen (DO) -Sodium azide modified winkler: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 4500-O C-, total ammoniacal nitrogen (NAT) -Colorimetric method - APHA, AWWA and WEF (1998) No. 4500 D-, nitrites -Colorimetric method – APHA, AWWA and WEF (1998) No. 4500-NO2 - and nitrates - Cadmium reduction method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 4500-NO 3 I-; conductivity values were measured three times –Electrometric method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 2510-, hardness - Titrimetric method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 2340 C-, salinity - Electrical conductivity method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 2520 B-, as well as the analysis of total suspended solids (TSS) at the entry and exit of the conventional sedimentation tank Gravimetric method: APHA, AWWA and WEF (1998) No. 2540 D-. A portable pH meter EC10 model 50050 HACH, a conductivity meter HACH model CO 150 and a colorimeter HACH DR 700 were used for the measurement of parameters. System water replacements. The water in the ARS was partially and periodically replaced as follows: every 8 days 10% of the biofilter volume and 100% of the settler volume, every fortnight 80% of each experimental unit. Such substitutions were carried out with previously dechlorinated water; in addition, siphoning was performed to the settler every week for the evacuation of the sediment solids. Variables evaluated. Weight increase (IP). Twenty percent of the animals of each replication were sampled at the beginning of the experiment and then every 15 days to determine the weight gain. The variable

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concentración de 5.0 mg/l, la actividad se realizó en un recipiente plástico con 12 litros de capacidad y el tiempo de exposición fue de 2 a 3 minutos. Finalmente a los individuos muestreados se les realizó un baño profiláctico con permanganato de potasio a una concentración de 10 ppm. Alimentación. La alimentación proporcionada fue a base de concentrado comercial con 48% de proteína bruta, 2.800 kcal/kg de EM, en presentación de gránulos de 3.5 mm de diámetro. La cantidad de alimento a suministrar se calculó teniendo en cuenta la conversión alimenticia, el factor de condición, la temperatura y la población por cada unidad experimental. La ración calculada se distribuyó en tres comidas suministradas a las 7 a.m., 11 a.m. y 6 p.m. registrando los datos correspondientes en una bitácora. Monitoreo de la calidad del agua. Para la medición de los parámetros de calidad del agua monitoreados se adoptaron las metodologías recomendadas por APHA, AWWA & WEF (13). Los parámetros estudiados se midieron a la entrada y salida del sistema de tratamiento del SRA; es decir, en el efluente mezclado y homogenizado de las unidades de cultivo y a la salida del biofiltro. Se realizaron 8 muestreos de los valores de pH – Método electrométrico: APHA, AWWA, WEF (1998) n° 4500-H+ B-, temperatura –Lectura directa: APHA, AWWA, WEF (1998) n° 2550 B-, oxígeno disuelto (OD)- Winkler modificado azida de sodio: APHA, AWWA, WEF (1998) no 4500-O C-, nitrógeno amoniacal total (NAT) –Método colorimétrico – APHA, AWWA, WEF (1998) n° 4500 D-, nitritos –Método colorimétrico – APHA, AWWA, WEF (1998) no 4500-NO2- y nitratos –Método reducción de cadmio: APHA, AWWA, WEF (1998) Nro. 4500NO3 I-; se midió en tres oportunidades los valores de conductividad –Método electrométrico: APHA, AWWA, WEF (1998) Nro. 2510-, dureza –Método titrimétrico: APHA, AWWA, WEF (1998) Nro. 2340 C-, salinidad -Método de conductividad eléctrica: APHA, AWWA, WEF (1998) Nro. 2520 B-, así como el análisis de sólidos suspendidos totales (SST) a la entrada y salida del sedimentador convencional –Método Gravimétrico: APHA, AWWA, WEF (1998) Nro. 2540 D-. Para la medición de los parámetros se utilizó un pHmetro portátil EC10 modelo 50050 HACH, un conductivímetro HACH modelo CO 150 y un colorímetro HACH DR 700. Recambios del sistema. Al SRA se le realizaron sustituciones de agua parcial y periódicamente de la siguiente manera: cada 8 días un 10% del volumen del biofiltro y 100% del sedimentador; cada quince días un 80% de cada unidad experimental. Tales sustituciones se efectuaron con agua previamente declorinada; adicionalmente, al sedimentador se le realizó

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was calculated based on the equation 1: [1]

cada media semana un sifoneo para evacuación de los sólidos sedimentados.

Where Pf is the final weight and Pi the initial weight in each period.

Variables evaluadas. Incremento de peso (IP). Para determinar la ganancia de peso se muestreó el 20% de los animales de cada réplica, al inicio del experimento y luego cada 15 días. La variable se calculó con base en la ecuación 1:

Length increase (IL). Twenty percent of the animals of each replication were also sampled to determine this variable, under the same conditions for the determination of IP. The increase in length was calculated using equation 2: [2] Where Lf is the final length and Li the initial length in each sample. Mortality percentage (M%). The amount of fish that died during the study period was calculated using equation 3: [3] Where PI and PF are the initial and final populations respectively. Feed conversion (CA). It is estimated using equation 4:

[1] Donde Pf fue el peso final y Pi el peso inicial de cada periodo. Incremento de longitud (IL). Para determinar esta variable se muestreó también el 20% de cada réplica, en las mismas ocasiones realizadas para la determinación de IP. El incremento de longitud se calculó por medio de la ecuación 2: [2] Donde Lf fue la longitud final y Li la inicial en cada muestreo. Porcentaje de mortalidad (M%). La cantidad de peces que murieron durante el periodo de estudio se calculó mediante la ecuación 3:

[4]

[3]

Where AS corresponds to the food supplied and IP the weight increase.

Donde PF y PI fueron las poblaciones final e inicial, respectivamente.

RESULTS

Conversión alimenticia (CA). Se estimó mediante la ecuación 4:

Water quality parameters. In general terms, water quality parameters in culture units remained within the allowable and recommendable ranges for the cultivation of the species. Table 1 shows the most important values related to the behavior of each parameter.

Table 1. Minimum, average and maximum values of the water quality parameters monitored. Parameter

Minimum

Average

Maximum

6.34

6.90

7.41

15.40

16.10

17.20

3.90

6.09

7.10

21.50

30.78

44.80

Alkalinity (mg/l)

4.85

6.06

7.26

Conductivity (µmho/cm)

211

265

295

pH Temperature (°C) Dissolved oxygen (mg/l) Hardness (mg/l of CaCO3)

[4] Donde AS correspondió al alimento suministrado e IP el incremento de peso. RESULTADOS Parámetros de calidad del agua. En términos generales, los parámetros de calidad del agua en las unidades de cultivo se mantuvieron dentro de los rangos permisibles y recomendables para el cultivo de la especie. La tabla 1 presenta los valores más importantes relativos al comportamiento de cada parámetro. Nitrógeno amoniacal total (NAT). Se registraron altas concentraciones de NAT, con valores medios a la entrada y salida del biofiltro de 4.82 mg/L y 4.47 mg/L respectivamente.

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss)

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Total ammoniacal nitrogen (TAN). High concentrations of TAN were recorded, with average values of 4.82 mg/L and 4.47 mg/L at the entry and exit of the biofilter, respectively.

Nitritos. Con base en los valores medidos, la concentración media calculada a la entrada del biofiltro fue de 0.53 mg/l y el valor medio calculado a la salida fue de 0.61.

Nitrites. Based on the values measured, the average concentration calculated at the entry of the biofilter was 0.53 mg/l and the average value calculated at the exit was 0.61%.

Nitratos. Las concentraciones medias de nitratos calculadas en el afluente y efluente del biofiltro fueron de 2.77 mg/l y 2.60 mg/l respectivamente.

Nitrates. The average nitrate concentrations calculated in the influent and effluent of the biofilter were 2.77 mg/l and 2.60 mg/l, respectively. Efficiencies of the treatment system. Removal of solids. An inflow of 36 l/min was regulated in the conventional sedimentation tank, representing a hydraulic retention time (HRT) for the settler of 14.51 minutes and a surface application rate (SAR) of 71.5 m3/ m2/d. Based on the results measured, it was determined that the efficiency in the removal of total suspended solids by the system was 31%. Biofilter performance. The submerged and upflow biofilter with an inflow of 36 l/min, a HRT of 20.83 minutes and a surface application rate of 117.4 m3/m2/d favored the nitrification processes of the ammonia produced in the system and reported an average removal TAN percentage of 9.47%. Degasser. The degassing for the release of CO2 and the increase in dissolved oxygen of the system reported an average percentage increase in the DO concentration in water of 6.5%. Productive Variables. Weight increase. On average, the initial weight in the culturing phase was 32.45±2.20 g and the final weight obtained after 75 days of study was 111.81±8.79 g; the average values obtained in six surveys are shown in Figure 4. Average weight increases calculated were 1.06 g/day and 15.90 g/fortnight. Length increase. On average, the initial length in the culturing phase was 14.22±0.46 cm and the final size obtained after 75 days was 20.50±0.37 cm, as shown in figure 5. Feed conversion. On average, feed conversion during the phase analyzed was 1.82:1, with a maximum value of 2.91:1 and 1.0:1.0 as minimum value.

Eficiencias del sistema de tratamiento. Remoción de sólidos. En el sedimentador convencional se reguló un caudal de ingreso de 36 l/min, representando para el sedimentador un tiempo de retención hidráulica (TRH) de 14.51 minutos y una tasa de aplicación superficial (TAS) de 71.5 m3/m2/d. Con base en los resultados medidos se determinó que la eficiencia en la remoción de los sólidos suspendidos totales por parte del sistema fue del 31%. Desempeño del biofiltro. El biofiltro de lecho sumergido y flujo ascendente con un caudal de ingreso de 36 l/min, un TRH de 20.83 minutos y una tasa de aplicación superficial de 117.4 m3/ m2/d propició los procesos de nitrificación del amoníaco producido en el sistema y reportó en promedio un porcentaje de remoción del NAT de 9.47%. Desgasificador. La desgasificación para liberación del CO 2 y el aumento de oxígeno disuelto del sistema reportaron un valor medio de incremento porcentual de la concentración de OD en el agua del 6.5%. Variables Productivas. Incremento de peso. En promedio el peso inicial de la fase de levante fue de 32.45±2.20 g y el peso final que se obtuvo después de 75 días de estudio fue de 111.81±8.79 g; los valores medios obtenidos en los seis muestreos se presentan en la figura 4. Los incrementos de peso promedio calculados fueron de 1.06 g/día y de 15.90 g/quincena. Incremento de longitud. En promedio la longitud inicial de la fase de levante fue de 14.22±0.46 cm y la talla final que se obtuvo después de los 75 días fue de 20.50±0.37 cm, tal como lo ilustra la figura 5. Conversión alimenticia. En promedio la conversión alimenticia durante la fase analizada fue de 1.82:1; con valor máximo de 2.91:1 y como valor mínimo 1.0:1.0.

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120

Valores medios

Talla (cm)

Peso (gr)

100

60 40

15 10

Valores medios

20 0

0 m1

Muestreo

Figure 4. Curve of average weights sampled during the study.

Figure 5. Longitudinal growth curve.

Mortality. During the research, a total mortality of 4.9% was recorded in the study period, mainly in the final stage. This situation could occur due to higher biomass per cubic meter, which increased the DO consumption and ammonium production with the consequent deterioration in water quality.

Mortalidad. Durante la investigación se registró una mortalidad total del 4.9% en el periodo del estudio, principalmente en la etapa final. Dicha situación se pudo presentar debido a la mayor biomasa por metro cúbico, que incrementó el consumo de OD y la producción de amonio con el consiguiente deterioro de la calidad de agua.

Biomass production. The initial biomass was on average 3.49 kg/m3 for each experimental unit, increasing up to a maximum value of 12.08 kg/m3.

Producción de biomasa. La biomasa inicial fue en promedio de 3.49 kg/m3, para cada unidad experimental, incrementándose hasta un valor máximo de 12.08 kg/m3.

DISCUSSION

DISCUSIÓN

During the experiment, pH fluctuated within the ranges recommended for aquaculture (11), the cultivation of rainbow trout (14) and the sound performance of the fixed bed biofilter (15).

Durante el experimento el pH osciló dentro de los rangos recomendados para acuacultura (11), para el cultivo de trucha arco iris (14) y para el buen desempeño del biofiltro de lecho fijo (15).

Water temperatures recorded in the ARS were within the optimal range for the species as recommended by Timmons and Ebeling (11), providing favorable conditions for growth and development.

Las temperaturas del agua registradas en el SRA se enmarcaron en el rango óptimo para la especie recomendado por Timmons y Ebeling (11), propiciando las condiciones favorables para el crecimiento y desarrollo.

The average DO concentration stood near the lower range recommended for the proper growth of trout (11) and above the minimum value recommended for systems with fixed bed biofilters (15).

La concentración media del OD se localizó cerca del rango inferior recomendado para el adecuado crecimiento de la trucha (11) y por encima del valor mínimo recomendado para sistemas con biofiltros de lecho fijo (15).

During the experiment, hardness values were lower than 100 mg/l recommended for aquaculture (11), even though they were above the minimum acceptable value of 20 mg/l for trout (14). Alkalinity, which exerts a marked influence on the biochemical processes developed in the ARS – such as nitrification, which consumes alkalinity (16) - decreased gradually with the passage of time and recorded values lower than the optimum for the cultivation of the species (14), therefore it is recommended to maintain their levels stable and

Durante el experimento los valores de dureza fueron menores a los 100 mg/l recomendados para acuacultura (11), aunque estuvieron por encima del mínimo valor aceptable de 20 mg/l para trucha (14). La alcalinidad, que ejerce marcada influencia en los procesos bioquímicos desarrollados en los SRA -como la nitrificación, que consume alcalinidad (16)- disminuyó progresivamente con el transcurrir del tiempo y siempre registró valores inferiores a los óptimos para el cultivo de la especie (14), por ello es

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) prevent possible effects on the biofiltration system in subsequent experiences. The average value for conductivity is within the normal ranges for natural fresh water from 20 to 1000 µmho/cm (17), providing conditions similar to those for the development of the species in nature. While TAN concentrations in the ARS exceeded the maximum value of 1.0 mg/l recommended for trout growing (11, 18), there were no deaths that could be attributed to such situation since these concentrations together with pH values close to neutrality and the low temperatures registered ensured that ammonia was practically present in ionized form (9). Differences in concentrations at the entry and exit of the treatment system showed the nitrification process. The highest concentrations of nitrites in the effluent of the biofilter, as compared to those recorded in its affluent, ratify the development of the nitrification process in this unit, as the increase in concentration and the decrease in total ammoniacal nitrogen values indicate the transformation of ammonia into nitrites. Furthermore, the values for nitrates were within the ranges recommended for aquaculture (11) and in particular for trout (14). In Colombia, Standard RAS (19) stipulates that for high rate trickling filters, removal efficiencies of NH3-N for domestic wastewater commonly range between 8 and 15% for surface application rates in plastic mediums between 14 and 84.2 m3/ m2/d. The relatively low removal value obtained from the experiment may be due to the type of substrate used for the formation of the biofilm of nitrifying bacteria - smooth recycled PVC pipe segments with a diameter of ½” - represented a smaller contact surface to that produced by other support mediums, although the material used in this research is much cheaper and environmentally friendly due to its recycled condition. Al-Hafedh et al (20) investigated the use of various plastic support mediums, such as segments of corrugated PVC pipes in trickling biofilters for tilapia culture in ARS under a HRT of 112.5 minutes and reported a NAT removal efficiency in the order of 25.5%; moreover, Lekang and Kleppe (21) reported efficiencies exceeding 40% for trickling biofilters with surface application rates of 91 m3/m2/d with granular support mediums in expanded clay and synthetic mediums with a specific surface area much higher than that offered by the pipe segments used in this experiment. In terms of design parameters and the performance of conventional settlers for the treatment of wastewater, Spellman (22) reported SS removal

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recomendable en posteriores experiencias mantener sus niveles estables y evitar los posibles efectos en el sistema de biofiltración. El valor medio de la conductividad se encontró dentro de los rangos normales para agua dulce natural de 20 a 1000 µmho/cm (17), proporcionando condiciones semejantes a las del desarrollo de la especie in natura. Pese a que las concentraciones de NAT registradas en el SRA superaron al valor máximo de 1.0 mg/l recomendado para cultivo de trucha (11, 18), no hubo mortalidades que se pudieran atribuir a tal situación ya que dichas concentraciones junto con los valores de pH cercanos a la neutralidad y a las bajas temperaturas registradas garantizaron que el amoníaco se presentó prácticamente en la forma ionizada (9). Las diferencias de concentraciones a la entrada y salida del sistema de tratamiento evidenciaron el proceso de nitrificación. Las mayores concentraciones de nitritos en el efluente del biofiltro, con relación a las registradas en su afluente, ratifican el desarrollo del proceso de nitrificación en esta unidad, pues el aumento de su concentración y la disminución de los valores del nitrógeno amoniacal total indican la transformación del amoniaco en nitritos. Por su parte, los valores de nitratos se encontraron dentro de los rangos recomendables para acuacultura (11) y en particular para trucha (14). En Colombia, la Norma RAS (19) estipula que para filtros percoladores de alta tasa las eficiencias de remoción de NH3-N para aguas residuales domésticas comúnmente oscilan entre el 8 y el 15% para tasas de aplicación superficial en medios plásticos entre 14 y 84.2 m3/m2/d. El relativamente bajo valor de remoción obtenido en el experimento puede deberse a que el tipo de sustrato que sirvió para la formación de la biopelícula de bacterias nitrificantes -segmentos reciclados de tubos de PVC lisos de ½ de diámetro”representó una superficie de contacto menor a la que producen otros medios soporte, aunque el material utilizado en esta investigación es mucho más económico y ambientalmente recomendable por su condición de reciclaje. Al-Hafedh et al (20) investigaron el uso de diversos medios soporte plásticos, tales como segmentos de tubos de PVC corrugado en biofiltros percoladores para cultivo de tilapia en SRA bajo un TRH de 112,5 minutos y reportaron una eficiencia de remoción del NAT del orden del 25,5%; por su parte, Lekang y Kleppe (21) han reportado eficiencias superiores al 40% para biofiltros percoladores con tasas de aplicación superficial de 91 m3/m2/d con medios de soporte granulares en arcilla expandida y medios sintéticos con superficie específica muy superiores a la ofrecida por los segmentos de tubería utilizados en este experimento.

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efficiencies between 40 and 60% for units with SAR between 12.2 and 48.8 m3/m2/day and HRT between 1.5 and 2.5 hours, Romero (23) recommended a SAR between 24 and 33% m/day and HRT between 1 and 2 hours for the design of primary sedimentation tanks to obtain a removal of SS between 50 and 70%, and Title E of the Standard RAS (19) defined an interval between 50% and 65% as the range of efficiencies for the removal of SS in primary sedimentation tanks with surface overflow rates of 33 m3/m2/d and a minimum HRT of one hour. In previous cases, the SAR recommended are lower and the HRT greater than those applied in the settler used in this research, which explains the lower removal efficiency of TSS in relation to the values expected according to the literature. However, the settler was within the design parameters recommended by Lekang (24) for aquaculture systems with SAR between 24 and 120 m3/m2/d and HRT close to the lower value suggested of 15 to 40 minutes; additionally, the settler operated under the SAR range recommended by Timmons and Ebeling (11) for this type of units with a SAR from 24 to 94 m3/m2/d to obtain TSS removal efficiencies between 40 and 60%. The removal of 31% of the TSS produced by system could obey to the low HRT of the treatment unit, the relatively high surface application rate, and the limited distribution uniformity of the flow produced by the thick wall weir used as input device to the settler. For subsequent experiences, it will be necessary to adapt an inlet system to the sedimentation unit such as for example a perforated screen that favors a homogeneous affluent flow and thus optimize the volume used for the removal of solids. The implementation of this type of devices allows the optimization of the volume allocated to the sedimentation of particles, prevents the presence of dead zones or preferential flows and improves the performance of these treatment units; while it is true that the system managed to maintain TSS levels below 80 mg/L, the maximum standard value recommended for aquaculture (11) exceeded that required for trout, where water with low turbidity is recommended for its cultivation (14). During the research, DO levels reported upon entry to culture units - provided by the degassing device by hydraulic drop - remained above 6.0 mg/l, hence conforming to the values recommended for trout (11), (14). In order to obtain greater efficiencies in the transfer of atmospheric oxygen from free-flow hydraulic systems, it is possible to use another natural ventilation mechanism such as rectangular and especially triangular weirs, whose high efficiency has been tested by Baylar

En cuanto a los parámetros de diseño y al desempeño de sedimentadores convencionales para el tratamiento de aguas residuales, Spellman (22) reporta eficiencias de remoción de SS entre el 40 y el 60% para unidades con TAS de entre 12.2 y 48.8 m3/m2/día y TRH entre 1.5 y 2.5 horas, Romero (23) recomienda para el diseño de sedimentadores primarios TAS entre 24 y 33 m/día y TRH entre 1 y 2 horas para obtener remociones de SS entre 50 y 70% y el Título E de la Norma RAS (19) define como rango de eficiencias de remoción de SS entre el 50 y 65% para sedimentadores primarios con tasas de desbordamiento superficial de 33 m3/ m2/d y TRH de mínimo una hora. En los anteriores casos, las TAS recomendadas son menores y los TRH mayores a los otorgados al sedimentador utilizado en esta investigación, lo que explica la menor eficiencia de remoción de SST con relación a los valores esperados según la literatura. Sin embargo, el sedimentador se estuvo dentro de los parámetros de diseño recomendados por Lekang (24) para sistemas acuícolas con TAS entre 24 y 120 m3/m2/día y con TRH cercano al valor inferior sugerido de 15 a 40 minutos; adicionalmente el sedimentador operó bajo el rango de TAS recomendado por Timmons y Ebeling (11) para este tipo de unidades en SRA de 24 a 94 m3/m2/día para obtener eficiencias de remoción de SST entre el 40 y 60%. La remoción del 31% de los SST producidos por el sistema pudo obedecer al bajo TRH de la unidad de tratamiento; la relativamente alta tasa de aplicación superficial; y la limitada uniformidad de distribución del flujo producida por el vertedero de pared gruesa utilizado como dispositivo de entrada al sedimentador. Para experiencias posteriores será necesario adecuar un sistema de ingreso a la unidad de sedimentación como por ejemplo una pantalla perforada que propicie un flujo afluente homogéneo y así optimice el volumen utilizado para remoción de los sólidos. La implementación de este tipo de dispositivos permiten la optimización del volumen destinado a la sedimentación de las partículas, evita la presencia de zonas muertas o flujos preferenciales y mejora el desempeño de dichas unidades de tratamiento; pues si bien es cierto el sistema logró mantener los niveles de SST por debajo de los 80 mg/L, valor máximo estándar recomendado para acuacultura (11) pudo superar los requeridos por la trucha, para cuyo cultivo se recomiendan aguas con baja turbidez (14). Durante la investigación los niveles del OD registrados al ingreso de las unidades de cultivo -proporcionados por el desgasificador mediante caída hidráulicapermanecieron por encima de 6.0 mg/l, cumpliendo de esta manera con los valores recomendados para trucha (11), (14). Para efectos de obtener mayores eficiencias de transferencia del oxígeno atmosférico a partir de sistemas hidráulicos a flujo libre podría optarse por otro mecanismo de aireación natural

Sánchez - Evaluation of a rainbow trout (Oncorhynchus mikyss) and Bagatur (25) and tried in hydraulic recirculating systems by Baylar et al (26). The best results regarding weight increase occurred between sampling 3 and 4. The growth curve raised 83% of the time recorded in the study; the decline in values between samplings 2 and 3 can be explained by the variety of animal weights within the population sampled, which could affect the average value. As reference data, the weight gain for trout at a temperature of 16°C is 0.92 g/day or 28.1 g/ month (11), values lower than those recorded in this study were where increments of 1.13 g/day and 34.47 g/month were obtained. According to Observatorio de Agrocadenas de Colombia (27), the production cycle for trout is 9.75 months. Usually, its cultivation begins with fingerlings of 2 g and ends with animals with an average weight of 307 g, for an increase of 1.04 g/day and 31.32 g/ month, values surpassed by this study in about 2%. The daily increase of size calculated from the data reported was 0.084 cm/day for a periodic increment of 1.26 cm/fortnight. The best results in terms of increased size occurred in samplings 3 and 4 showing a steeper slope in Figure 5. The effect of the diversity in the size of animals measured in the third sampling was once again evidenced. The longitudinal growth of trout is directly related to the temperature of the water, which in this study was on average at 19.99°C; by applying the growth formula proposed by Timmons and Ebeling (11), animals should have a minimum growth of 0.088 cm/day or 2.63 cm/month; in this research the growth calculated was 0.084 cm/day or 2.52 cm/ month, 4.5% lower than those expected according to the reference quoted. The average production cycle of trout is 9.75 months (27), starting with 5 cm fingerlings and ending with animals of 29 cm in length, for an increase in size of 0.082% cm/day or 2.46 cm/ month, values exceeded in this study by 7.3%. The more favorable values for feed conversion are similar to those reported by Arredondo et al (28) and by van Rijn (29) in ARSs. The variability observed in feed conversion can be explained by the progressive increase in biomass and the increased load per unit volume in each experimental unit throughout the study, which could cause stress in fish, increased DO consumption and the eventual deterioration of certain water quality parameters. This reduces the efficiency of animals to convert balanced food into biomass, since part of the protein supplied could be used in basal metabolism processes and not in the construction of tissues.

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como los vertederos rectangulares y especialmente los triangulares, cuya alta eficiencia ha sido probada por Baylar y Bagatur (25) y ensayada en sistemas de recirculación hidráulica por Baylar et al (26). Los mejores resultados de incremento de peso se presentaron entre el muestreo 3 y 4. La curva de crecimiento fue ascendente el 83% del tiempo registrado en el estudio; el descenso de valores entre el muestreo 2 y 3 se explica por la variedad de pesos de los animales dentro de la población muestreada, lo que pudo afectar el valor promedio. Como datos de referencia, la ganancia de peso de la trucha a una temperatura de 16°C es de 0.92 g/día o de 28.1 g/mes (11), valores inferiores a los registrados en este estudio donde se obtuvieron incrementos de 1.13 g/día y 34.47 g/mes. De acuerdo con el Observatorio de Agrocadenas de Colombia (27), el ciclo de producción de la Trucha es de 9.75 meses. Generalmente su cultivo inicia con alevinos de 2 g y finaliza con animales con peso promedio de 307 g, para un incremento de 1.04 g/día y 31.32 g/mes, valores superados por este estudio en cerca del 2%. El incremento de talla diario calculado a partir de los datos registrados fue de 0.084 cm/día, para un incremento periódico de 1.26 cm/quincenal. Los mejores resultados en cuanto al aumento de talla se presentaron entre los muestreos 3 y 4 donde se observa una pendiente más pronunciada en la figura 5. Nuevamente se puso en evidencia el efecto de la diversidad de tallas de los animales medidos en el tercer muestreo. El crecimiento longitudinal de la trucha está directamente relacionado con la temperatura del agua, que en esta investigación presentó un promedio de 16.09°C; aplicando la fórmula de crecimiento propuesta por Timmons y Ebeling (11), los animales debían tener un crecimiento mínimo de 0.088 cm/ día o 2.63 cm/mes; en la presente investigación los crecimientos calculados fueron de 0.084 cm/día o 2.52 cm/mes, inferiores en un 4,5% a los esperables según la referencia citada. El ciclo promedio de producción de trucha es de 9.75 meses (27), iniciando con alevinos de 5 cm y finalizando con animales de 29 cm de longitud, para un incremento de talla de 0.082 cm/día o de 2.46 cm/ mes, valores superados por este estudio en un 7.3%. Los valores más favorables de la conversión alimenticia se asemejan a los reportados por Arredondo et al (28) y por van Rijn (29) en SRA. La variabilidad observada en la conversión alimenticia se puede explicar debido al incremento progresivo de la biomasa y mayor carga por unidad de volumen en cada unidad experimental a lo largo del estudio; lo que pudo provocar estrés en los peces, mayor consumo de OD y el eventual

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In conclusion, the water treatment system evaluated allowed maintaining physicochemical water quality parameters within the ranges required by the culturing phase of rainbow trout. Wastewater treatment units allowed to remove 30% of TSS (conventional sedimentation tank), allowed a 9% removal of TAN (biofiltration unit), and increased dissolved oxygen to the final effluent in 6% (degasser). The productive variables analyzed: weight and size increase, feed conversion, mortality and production; were within the normal values for the production of the species cultivated. The recirculating system evaluated commenced with a load of 3.5 kg/m3 and ended with a load of 12.1 kg/ m3, indicating an increase in biomass of 345%. The mortality percentage recorded during the entire study period was 4.9%. Acknowledgements To the VIPRI of University of Nariño, to Professor Roberto Salazar Cano and the students of the Aquaculture Production Engineering Program: Karen Larrañaga; Viviana Cardenas; Carlos Caicedo; Luis Enriquez; Diego Miramac; Adriana Arce; Silvia Bolaños; Felix Jojoa; Lorena Ortega; Diana Beltran and Nataly Sarasty.

deterioro de algunos parámetros de calidad de agua. Ello reduce la eficiencia de los animales para convertir el balanceado en biomasa, ya que parte de la proteína suministrada pudo ser utilizada en procesos de metabolismo basal y no en la construcción de tejidos. En conclusión, el sistema de tratamiento del agua evaluado permitió mantener los parámetros físicoquímicos de la calidad de agua dentro de los rangos requeridos por la fase de levante de la Trucha arco iris. Las unidades de tratamiento del agua residual permitieron la remoción de 30% de los SST (sedimentador convencional), proporcionaron la remoción del NAT en un 9% (unidad de biofiltración), e incrementaron el oxígeno disuelto al efluente final en un 6% (desgasificador). Las variables productivas analizadas: incremento de peso y talla, conversión alimenticia, mortalidad y producción; se encontraron dentro de los valores normales de producción piscícola de la especie cultivada. El sistema de recirculación evaluado inició con una carga de 3.5 kg/m3 y finalizó con una carga de 12.1 kg/m3, indicando un incremento de la biomasa del 345%. El porcentaje de mortalidad registrado durante todo el periodo de estudio fue del 4,9%. Agradecimientos A la VIPRI de la Universidad de Nariño, al Profesor Roberto Salazar Cano y a los estudiantes del Programa Ingeniería en Producción Acuícola: Karen Larrañaga; Viviana Cárdenas; Carlos Caicedo; Luis Enríquez; Diego Miramac; Adriana Arce; Silvia Bolaños; Félix Jojoa; Lorena Ortega; Diana Beltran y Nataly Sarasty.

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Efficacy of clinoptilolite supplementation on milk yield and somatic cell count La eficacia de la suplementación con clinoptilolita sobre la producción de leche y el recuento de células somáticas Deniz Alic Ural, Ph.D. Adnan Menderes University, Bozdogan Vocational School, Campus of Rasim Mentese, 09760, Bozdogan, Aydın, Turquía. Corresponding: alicdeniz@gmail.com. Received: November 2013; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. To determine the efficiency of clinoptilolite supplements on milk production and somatic cell count (SCC). Materials and methods. 80 Holstein–Friesian cows were used, between 2 and 4 years of age ad between their first and third lactation. Two groups made up of 40 animals were constituted, and one of the following treatments were assigned randomly: Control group (n=40) with a basal diet, and experimental group (Clinoptilolite; n=40) with a basal diet + 3% (p/p) of clinoptilolite. The basal diet consisted of corn, hay, sunflower flour, barley grains, wheat bran and soy flour. The experiment lasted 16 weeks (February to June 2013) and began 4 weeks before the expected delivery date. 2560 milk samples were taken (morning and evening), and the farm was visited twice a week. Results. The mean values for the control group and the clinoptilolite group were 30.63±0.851 and 33.66±0.756, respectively. Milk prouction for the clinoptilolite group was higher than that of the control group (p<0.01). SCC for the control and clinoptilolite groups was 5.06±0.045 and 4.79±0.011, respectively (p<0.01). Conclusions. Supplementing with 3% (p/p) clinoptilolite in dairy cows increases milk production and decreases somatic cell count. Key words: Diet, feeding, milk yield, zeolita (Fuente: CAB).

RESUMEN Objetivo. Determinar la eficacia de la suplementación con clinoptilolita sobre la producción de leche y recuento de células somáticas (RCS). Materiales y métodos. Se utilizaron 80 vacas Holstein–Friesian, entre 2 y 4 años de edad y entre la primera y tercera lactancia. Se conformaron dos grupos de 40 animales y al azar se les asignó uno de los siguientes tratamientos: Grupo control (n=40) con dieta basal y un grupo experimental (Clinoptilolita; n=40) con dieta basal + 3% (p/p) de clinoptilolita. La dieta basal consistió de maíz, heno, harina de girasol, granos de cebada, salvado de trigo y harina de soja. El experimento se llevó a cabo en 16 semanas (febrero a junio de 2013) y se inició 4 semanas de la fecha esperada del parto. Se tomaron 2.560 muestras de ordeño de leche (mañana y tarde), las visitas a la granja fueron realizadas dos veces por semana. Resultados. Los valores medios para el grupo control y el grupo clinoptilolita fueron 30.63±0.851 y 33.66±0.756, respectivamente. La 4242

Ural - Efficacy of clinoptilolite supplementation on milk yield

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producción de leche para el grupo clinoptilolita fue mayor que en el grupo control (p<0.01). El RCS para los grupo control y clinoptilolita fue de 5.06±0.045 y 4.79±0.011, respectivamente (p<0.01). Conclusiones. La suplementación de 3% (p/p) de clinoptilolita en la dieta de vacas lecheras incrementa la producción de leche y disminuye el recuento de células somáticas. Palabras clave: Alimentación, dieta, rendimiento lechero, zeolita, (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The quality of milk yield possess importance in the dairy industry and milk quality as milk yield of dairy cattle is majorly impressed by diet (1). Recently, the natural zeolite, clinoptilolite has a widespread area of usage as feed additive in dairy rations (1-3). Clinoptilolite is a crystalline hydrated alluminosilicates (4) including a chemical elements as the vast majority [alkaline (Na, K, Rb, Cs) and earth alkaline (Mg, Ca, Sr, Ba] (5-9). Clinoptilolite is very substantial because of causing increase in feed efficienciency and milk production on dairy cattle, besides it may reduce mastitis problems (10). There is scarcity and spatially defined information relevant to dietary addition of clinoptilolite on milk yield. Besides, according to the present author’s knowledge detailed data is lacking for the efficacy of clinoptilolite on SCC.

La calidad de la producción de leche posee importancia en la industria láctea, ya que la producción de leche del Ganado lechero se ve influenciada en su mayor parte por la dieta (1). Recientemente, la clinoptilolita, una zeolita natural, ha tenido un amplio campo de uso como aditivo alimenticio en las raciones de alimento (1-3). La clinoptilolita es un aluminosilicato cristalino hidratado (4) incluyendo elementos químicos como la vasta mayoría [alcalinos (Na, K, Rb, Cs) y alcalinotérreos (Mg, Ca, Sr, Ba](5-9). La clinoptilolta es muy sustancial porque causa un incremento en la eficiencia de la dieta y la producción láctea del ganado lechero, además de que puede disminuir los prolemas de (10). La información acerca de la suplementación dietaria de clinoptilolta sobre la producción lechera es escasa y dispersa. Además, de acuerdo con el conocimiento actual del autor, hacen falta datos detallados acerca de la eficacia de la clinoptilolita sobre el RCS.

The present author’s interest to this subject was aroused following the evaluation and interpretation of a prior original research, involving clinoptilolite supplementation to diet for increasing milk yield (11). According to the positive results of the latter study, the increasing demands of the dairy farmers request for dietary improvement for milk yield and given the results of prior researches evaluating the effect of different levels of supplemental zeolite, it was hypothesized that clinoptilolite would be effective for improving milk yield. Thus, the purpose of the present study was to asses the efficacy of dietary clinoptilolite addition on milk yield and besides somatic cell count.

MATERIAL AND METHODS Site of the study and animals. This study was carried out using clinically healthy 80 head Holstein-Friesian cows between 1 st and 3 rd lactation, 2-4 years old in a private dairy farm in Aydin province, Turkey. The animals were enrolled into two groups. Assigment of treatments. Group 1: Control Group comprised of 40 cows. They were fed basal diet (Table 1).

El interés del presente autor sobre este tema surgió luego de la evaluación e interpretación de una investigación original previa, que incluía la suplementación dietaria con clinoptilolita para incrementar la producción lechera (11). De acuerdo con los resultados positivos del estudio posterior, las crecientes necesidades de los granjeros lecheros require de un mejoramiento de la dieta para la producción lechera, y dados los resultados de las investigaciones previas al evaluar los efectos de diferentes niveles de zeolita suplementaria, surgió la hipótesis de que la clinoptilolita podría ser efectiva para mejorar la producción lechera. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue evaluar la eficacia de la adición de clinoptilolita en la dieta sobre la producción lechera, y de paso, sobre el recuento de células somáticas.

MATERIALES Y MÉTODOS Lugar de estudio de los animales. Este estudio se llevó a cabo usando 80 vacas HolsteinFresian clínicamente sanas, entre 2 y 4 años de edad y entre la primera y tercera lactancia, en

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Table 1. Ingredient composition of basal diet. Ingredient

%DM

Corn silage (35% v/v DM)

48.39

Hay

18.20

Sunflower meal (44% v/v CP) Barley grains

8.0 8.0

Wheat bran

6.25

Soybean meal (25% v/v CP)

4.45

Vitamin and mineral premix

1.88

Calcium carbonate

1.75

Sodium bicarbonate

1.68

Dicalcium phosphate

1.02

Salt

0.38

Crude protein of basal diet (Dry Matter(DM) %): 15.40; NE1 (Net energy lactation) (Mcal/kg DM): 1.46; Contained in kg of mineral-vitamin premix: Vitamin A 90.000 UI; Vitamin D 6000 UI; Vitamin E 60 mg; Vitamin PP 900 mg; Vitamin B1 7.50 mg; Vitamin B2 7.50 mg; Zinc 240 mg kg-1; Iron 150 mg kg-1; Selenium 1 mg kg-1;Iodium 3 mg kg-1

Group 2: Clinoptilolit group involved 40 cows. They were fed basal diet +3% clinoptilolite. Clinoptilolite material. Natural Clinoptilolite was assured from Gordes Zeolit Mining, Izmir, Turkey. The NH 4 ion exchange capacity of clinoptilolite material was 1.7-2.1 meq/g and its chemical composition is SiO2 67.11 % (w/v), Al2O3 11.84% (w/v), Fe2O3 1.47% (w/v), MgO 1.15% (w/v), CaO 2.18% (w/v), Na2O 0.38% (w/v), K 2O 3.44% (w/v) and LOI (Loss on ignition) 12.5%. Experimental design. The experiment was carried out for 16 weeks, from 2013 February to 2013 June. The experiment was started 4 weeks before expected day of parturition. Each cow in control and clinoptilolite groups were fed 30 kg corn silage, 3 kg molasses and 3 kg concentrates per day until parturition. Through lactation each cow received 35 kg corn silage in conjunction with 3 kg molasses and 400 g concentrates per liter of milk production. The feeding was twice a day 09:00 and 16:00 in barn. The ingredients composition of basal diet was shown in table 1. Somatic cell count (SCC) analysis. Farm was visited biweekly and approximately about 2560 milk samples (morning and evening milking samples) were collected. The milk samples from each cow were withdrawn from each teat into tubes among both the morning and evening milking. Morning milking was stored in a cooler box and then was immediately transferred to the laboratory and milk samples were analyzed within the same day. Evening milk samples were kept in a refrigerator and analyzed the next day immediately. All samples were treated according to the directions given previously (12) and Standard Methods for the Examination of

una granja lechera privada en la provincial de Aydin, Turquía. Los animales se separaron en dos grupos. Asignación de los tratamientos. Grupo 1: Grupo control compuesto por 40 vacas. Se alimentó con dieta basal (Tabla 1). Grupo 2: Grupo experimental compuesto por 40 vacas. Se les alimentó con dieta basal + 3% de clinoptilolita. Material de clinoptilolita. Se adquirió clinoptilolita natural de Gordes Zeolit Mining, Izmir, Turquía. La capacidad de intercambio de iones NH4 del material de clinoptilolita fue de 1.7-2.1 meq/g y sucomposición química es SiO2 67.11 % (w/v), Al2O3 11.84% (w/v), Fe2O3 1.47% (w/v), MgO 1.15% (w/v), CaO 2.18% (w/v), Na2O 0.38% (w/v), K2O 3.44% (w/v) y LOI (Pérdida por Ignición, por sus siglas en inglés) 12.5%. Diseño experimental. El experimento se llevó a cabo durante 16 semanas, entre febrero y junio de 2013. Se dio comienzo al experimento 4 semanas antes dela fecha esperada de parto. Cada vaca de los grupos de control y de clinoptilolita recibió 30 kg de ensilado de maíz, 3kg de melaza y 3kg de concentrado al día, hasta el parto. Durante la lactancia, cada vaca recibió 36 kg de ensilado de maíz junto con 3kg de melaza y 400 g de concentrados por litro de leche producida. La alimentación se hizo dos veces al día, a las 09:00 y a las 16:00 en un establo. La composición de la dieta basal se muestra en la tabla 1. Análisis del recuento de células somáticas (RCS). Se hicieron visitas a la granja dos veces por semana y se tomaron aproximadamente 2560 muestras de leche (ordeños de mañana y tarde). Las muestras fueron tomadas de cada teta por tubos tanto en el ordeño de la mañana como en el de la tarde. El ordeño de la mañana fue almacenado en un una caja refrigerada y transferido inmediatamente al laboratorio, y se examinaron el mismo día. Las muestras del ordeño de la tarde se guardaron en un refrigerador y se analizaron al día siguiente. Todas las muestras fueron tratadas de conformidad con las indicaciones previamente dadas (12) y con los Métodos Estándar para el Examen de Productos Lácteos (13). El RCS de las muestras se determinó por medio del método microscópico directo de RCS (14). Las muestras de leche se esparcieron sobre dos áreas del portaobjetos de microscopio, con un tamaño de 5×20 mm2. Las láminas se prepararon de acuerdo con el Recuento Directo de Células Somáticas, y almacenadas a 37°C en una incubadora.

Ural - Efficacy of clinoptilolite supplementation on milk yield Dairy Products (13). SCC in the samples was determined by direct microscopic SCC method (14). Milk samples were spread on 2 microscope slide areas, within 5×20 mm2 in size. Slides were prepared according to Direct Microscopic Somatic Cell Count and were kept at 37°C in an incubator. Then, milk samples on slides were stained by use of methylene blue. The dye solution was prepared comprising 0.6 g of certified methylene blue chloride to 54 mL of 96% (v/v) ethyl alcohol, 40 mL of tolien and 6 mL glacial acetic acid. The counting was fulfilled in 20 fields under a 100x immersion objective in each slide, followed by average calculation. The multiplication of the microscope factor with the latter average values was corresponded to SCC in per mL of milk. Statistical analysis. Statistical analysis was performed by use SPSS 17.0 for Windows (15). The repeated measures analysis approach was analyzed by using ANOVA procedure with mixed linear models was used for statistical analysis of data. The significance of the differences between groups was compared by Duncan’s multiple range test (16).

RESULTS The results relevant to SCC and milk production were shown in table 2. Table 2. The effects of clinoptilolite on somatic cell count and milk production. Control Group

X ± SX

No.of cows Daily Milk production SCC (log SCC) Re-transformation SCC

Clinoptilolite Group

X ± SX

Posteriormente se tiñeron las muestras de leche con azul de metileno. La solución de tinción se preparó con 0.6 g de azul de metileno cloruro en 54 mL de alcohol etílico al 96% v/v, 40 mL de tolien/tolueno, y 6 ml de ácido acético glacial. El conteo se hizo en 20 campos bajo un objetivo de inmersión de 100x en cada lámina, seguido de un cálculo de promedios. La multiplicación del factor del microscopio por los valores promedio correspondió al RCS por mL de leche. Análisis estadístico. El análisis estadístico se llevó a cabo con el uso de SPSS 17.0 para Windows (15). El enfoque de análisis de medidas repetitivas se analizó por medio del procedimiento ANOVA con modelos lineales mixtos para el análisis estadístico de los datos. La significancia de las diferencias entre grupos se comparó por medio del test de rango múltiple de Duncan (16).

RESULTADOS Los resultados relevantes para el RCS y la producción de leche se muestran en la tabla 2. Se halló que los valores medios para la producción diaria de leche para los grupos de control y de clinoptilolita fueron 30.63±0.851 y 33.66±0.756, respectivamente. La producción diaria de leche en el grupo de clinoptilolita fue mayor que la del grupo de control. La diferencia entre la producción de cada grupo es estadísticamente significativa (p<0.01).

Statistical significance

DISCUSIÓN

30.63±0.851a

33.66±0.756b

5.06±0.045

4.79±0.011

115.456

62.245

4245

**= p<0.01; a,b = Means with different superscripts in each line are different

The mean values of control and clinoptilolite group for daily milk production were found as 30.63±0.851 and 33.66±0.756, respectively. The daily milk production in clinoptilolite group was higher than control group. The difference between groups in milk yield was found statistically significant (p<0.01).

DISCUSSION The overall means of control and clinoptilolite group for SCC were found as 5.06±0.045 and

Se halló que los promedios para los grupos de control y de clinoptilolita para el RCS fueron 5.06±0.045 y 4.79±0.011, respectivamente. El RCS en el grupo de control fue menor que en el de clinoptilolita. Se halló que la diferencia del RCS entre grupos es estadísticamente significativa (p<0.01). Los resultados de estudios previos pueden ser de ayuda para la interpretación de los datos disponibles obtenidos en el presente estudio. Dschaak et al (2) reportaron que no había diferencia entre tres grupos en tratamiento (control, control +1.4% bicarbonato sódico, y control + 1.4% zeolita). De forma similar, la adición de zeolita 6% (p/v) a la dieta concentrada de ganado Pardo Suizo no arrojó diferencias significativas en cuanto a la producción lechera (17). En otra prueba en Italia, la adición de 200g/ día de clinoptilolita a 32 vacas Holstein lactantes no afectó la producción de leche (5).

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4.79±0.011, respectively. The control group SCC was found lower than clinoptilolite group. The difference between groups for SCC was found statistically significant (p<0.01). The results of prior studies may help for the interpretation of the available data obtained in the present study. Dschaak et al (2) reported that there was no difference among 3 treatment groups (control, control +1.4% sodium bicarbonate and control + 1.4% zeolite). Similarly, 6% (w/v) zeolite added to the concentrate diet to the lactating Brown Swiss cattle did not result in significant difference regarding milk yield (17). In another trial in Italy, 200 g/day clinoptilolite addition to 32 lactating Holstein cows did not affect milk yield (5). In this study, the effect of clinoptilolite addition on milk production was observed and statistically significant difference was detected between the groups. Similarly, Dyachenko and Lysenko (18) recorded that addition of type A/B zeolite to Russian diet resulted in increased milk production. Furthermore, additive sodium zeolite into corn silage with varying ranges as 0.5% (w/v) (19), 2% (w/v) (20) and as 4% (w/v) (21) caused increased milk yield. Ilić et al (1) described that milk yield was increased by supplementation of 4% (w/v) and 2% (w/v) zeolite. A novel original study performed by the present author also suggested that 2% (w/v) clinoptilolite supplementation for 120 days significantly (p<0.01) affected milk yield (11). The results obtained from the present study and aforementioned researchers suggested that clinoptilolite supplementation may have positive influence on milk yield. In a prior study in Holstein cows with spontaneous mastitis, the effects of natural mixture involving zeolite powder on the somatic cell count was investigated with 3 different experimental models. Neither experiment I (stevia liquid) nor II (astaxanthin mixed feed), did not have any effect on reducing the linear score or bacteria count of the mastitis cows. However Experiment III revealed that zeolite powder reduced the milk somatic cell count (22). In another trial determining the effect of long-term dietary clinoptilolite supplementation on performance and selected serum biochemical values in dairy goats, concentrated feed along of with 2.5% (w/v) clinoptilolite improved milk fat percentage, without adverse effects on the serum variables evaluated. Besides the reduction of SCC achieved with clinoptilolite supplementation suggested improved milk hygiene (23). In the present study SCC was found significantly lower (p<0.01) in clinoptilolite group (4.79±0.011) in contrast to the control group (5.06±0.045). On the contrary, the difference between clinoptilolite

En este estudio, se observe el efecto de la adición de clinoptilolita sobre la producción de leche y se detectó una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. Así mismo, Dyachenko y Lysenko (18) registraron que la adición de zeolite de tipo A/B daba como resultado una producción de leche aumentada. Además, la adición de sodium zeolite/zeolita sódica/zeolita al ensilado de maíz en variedad de rangos tales como 0.5% (p/v) (19), 2% (p/v) (20) y 4% (p/v) (21) causaban una producción lechera aumentada. Ilić et al (1) describieron que la producción de leche se incrementaba al suplementar con zeolita al 4% (p/v) y 2% (p/v). Un nuevo estudio original llevado a cabo por el presente autor también sugiere que una suplementación de 2% (p/v) de clinoptilolita durante 120 días, afectaba significativamente (p<0.01) la producción de leche (11). Los resultados obtenidos a partir del presente estudio y de los investigadores mencionados sugirieron que la suplementación con clinoptilolita podría tener una influencia positiva en la producción lechera. En un estudio anterior sobre vacas Holstein con mastitus espontánea, se investigaron los efectos de la mezcla natural incluyendo p o l vo d e ze o l i t a s o b r e e l r e c u e n r t o d e células somáticas en tres diferentes modelos experimentales. Ni el experimento I (estevia líquida) ni el II (astaxantina mezclada en la dieta), tuvieron efecto alguno sobre la reducción del linear score/conteo lineal o del recuento de bacterias de las vacas con mastitis (22). En otra prueba para determinar los efectos a largo plazo de la suplementación de la dieta con clinoptilolita sobre valores séricos bioquímicos específicos en cabras lecheras, la alimentación con concentrado y 2.5% (p/v) de clinoptilolita mejoró el porcentaje de grasa, sin efectos adversos sobre las variables séricas evaluadas. Además de la reducción de RCS logrado con la clinoptilolita, la suplementación sugirió una mayor higiene de la leche (23). En el presente estudio se halló que el RCS fue significativamente inferior (p<0.01) en el grupo de clinoptilolita (4.79±0.011) en contraste con el grupo de control (5.06±0.045). Por el contrario, Bosi et al hallaron que la diferencia para el RCS entre el grupo de clinoptilolita y el grupo de control no era significativa. Tomando en cuenta este estudio experimental, la producción de leche y el recuento de células somáticas se vieron afectados de forma positiva y estadísticamente significativa en las vacas lecheras que recibieron un suplemento de 3% (p/v) de clinoptilolita. Finalmente,

Ural - Efficacy of clinoptilolite supplementation on milk yield and control group was found non-significant for SCC by Bosi et al (5). Taking regard this experimental study, milk yield and somatic cell count were positive affected statistically significant in dairy cows that was fed clinoptilolite supplementation with 3% (w/v). Finally, both elevation of milk yield and reduction of SCC were provided in dairy cow that was fed with 3% (w/v) clinoptilolite supplementation. Furthermore, other management practices must be applied with at most care accompanying to clinoptilolite supplementation of diets for dairy farms.

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tanto la elevación de la producción de leche como la reducción del RCS se dieron en las vacas lecheras alimentadas con suplemento de 3% (p/v) de clinoptilolita. Adicionalmente, otras prácticas de manejo deben ser aplicadas con el mayor cuidado en el acompañamiento de la suplementación dietaria en las granjas lecheras.

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Association of the bovine growth hormone gene with Holstein cattle reproductive parameters Asociación del gen de la hormona de crecimiento bovino con parámetros reproductivos en ganado Holstein Juliana Arango G,* M.Sc, Julián Echeverri Z, Ph.D, Albeiro López H, Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Producción Animal, Grupo BIOGEM, Sede Medellín, AA 1779, Colombia. *Correspondencia: jarangog@unal.edu.co.

Received: November 2013; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. To determine the association of intron 3 polymorphism of the bovine growth hormone (BGH) gene, with age at first service, first birth, first postpartum service and second birth in a population of Holstein cows in the state of Antioquia. Materials and methods. The study was conducted on 408 Holstein cows in 8 herds. Genotyping was performed using PCR-RFLP technique with DNA extracted from peripheral blood by the salting out technique. The Phenotypic information used was collected for 4 years, from a dairy production control program. To determine the association between characteristics and gene polymorphism, parametric statistical analyzes were performed as generalized linear models and linear regression analysis. Results. Allele frequency (positive) was 0.91 and was 0.09 for (negative) allele. Genotypic frequencies were 0.77, 0.2 and 0.03 for (positive/positive), (positive/negative) and (negative/negative) respectively. There were significant differences between the mean of age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth. For all of the (negative/negative) genotype characteristics there were greater ages for each event. Conclusions. These results suggest that intron-3 polymorphism of the BGH gene is associated with reproductive traits, facilitating the selection of individuals with favorable genotypes for use in breeding programs. Key words: Animal reproduction, molecular markers, PCR-RFLP (Source: Mesh).

RESUMEN Objetivo. Determinar la asociación del polimorfismo del intrón 3 del gen de la hormona de crecimiento bovino (BGH) con las edades al primer servicio, primer parto, primer servicio posparto y segundo parto en una población de vacas Holstein del departamento de Antioquia. Materiales y métodos. El estudio se realizó con 408 vacas Holstein ubicadas en 8 hatos. La genotipificación se llevó a cabo usando la técnica de PCR-RFLP con ADN extraído de sangre periférica mediante la técnica de salting out. La información fenotípica utilizada fue recopilada durante 4 años, a partir de un programa de control de producción lechera. Para determinar la asociación entre las características y el polimorfismo del gen, se realizaron análisis estadísticos paramétricos mediante modelos lineales generalizados y análisis de regresión lineal. Resultados. La frecuencia para el alelo (positivo) fue de 0.91 y para el alelo (negativo) fue de 0.09. Las frecuencias genotípicas fueron 0.77, 0.2 y 0.03 para (positivo/ positivo), (positivo/negativo) y (negativo/negativo) respectivamente. Se presentaron diferencias 4249

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significativas entre las medias de la edad al primer servicio, la edad al primer parto, edad al primer servicio postparto y edad al segundo parto. Para todas las características el genotipo (negativo/ negativo) presentó edades más tardías para cada eventos. Conclusiones. Estos resultados sugieren que el polimorfismo del intrón 3 del gen BGH, está asociado con características de tipo reproductivo, facilitando la implementación de un programa de selección de individuos con genotipos favorables, para su uso en programas de mejoramiento genético animal. Palabras clave: Marcadores moleculares, PCR-RFLP, reproducción animal (Fuente: Mesh).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

In specialized dairy herds, reproductive efficiency has a direct influence on productivity. Without efficient reproductive performance, milk production is strongly affected and thus the profitability of the herd. Cow fertility is affected by many factors, the age of the animal at puberty has a very strong influence and is transcendental due to the fact that older ages at the start of breeding and first calving reflect low reproductive efficiency (1).

En los hatos lecheros especializados, la eficiencia reproductiva tiene una influencia directa sobre la productividad. Sin un desempeño reproductivo eficiente, la producción de leche es afectada fuertemente y por tanto, la rentabilidad económica del hato. La fertilidad de la vaca se encuentra afectada por muchos factores, la edad a la pubertad del animal tiene una influencia muy fuerte y es trascendental debido a que las edades elevadas al inicio de la reproducción y al primer parto se reflejan en una baja eficiencia reproductiva (1).

A delay in the age of service or birth of each cow, or even, each cow discarded as a result of infertility affects the economic performance of the herd. When a heifer is delayed in entering the breeding program or a cow delays in returning to heat after delivery, there are expenses for the additional non-lactating period and lengthening of the generational interval (1, 2). In contrast, reduction of the heifers’ rearing period and rapid growth, which brings them to the reproductive stage in a shorter amount of time, produces more births and more production during their lifetime. Therefore, it is essential to consider the factors that influence these parameters. The bovine growth hormone (BGH) gene has polymorphisms that influence these characteristics differently (2) and play a key role in the regulation of growth and development; indirectly influencing the reproductive efficiency of cattle (3-7). BGH effect on growth is observed in several tissues including bone, muscle and adipose tissue. These effects result from both direct action of BGH on nutrient partitioning and on cell multiplication, as in the action mediated by the insulin-like growth factor 1, which stimulates cell proliferation and metabolic processes associated with protein deposition (8). In addition, significant relationships have been reported between BGH concentrations and the postpartum period, and consequently with cow fertility (9.10). The main concern behind the analysis of this association is to determine the influence of genetic variants of growth hormone on the scope of an earlier active reproductive stage. The aim

El retraso en la edad de servicio o parto de cada vaca, o aun, cada vaca descartada por infertilidad, afecta el rendimiento económico del hato. Cuando una novilla se demora en entrar al programa reproductivo o una vaca se demora en retornar al celo después del parto, se generan gastos por el período adicional no lactante y el alargamiento del intervalo generacional (1,2). En contraste, la reducción del período de levante de las novillas y un crecimiento rápido, que las acerque en menor tiempo a la etapa reproductiva, produce como resultado más partos y más producción durante su vida. Por tanto es esencial considerar los factores que influyen sobre el conjunto de estos parámetros. El gen de la hormona del crecimiento bovino (BGH) presenta polimorfismos que influyen de manera diferente estas características (2) y juegan un papel clave en la regulación del crecimiento y el desarrollo; influyendo de forma indirecta la eficiencia reproductiva del bovino (3-7). Los efectos de la BGH sobre el crecimiento se observan en varios tejidos, incluyendo huesos, músculos y tejido adiposo. Estos efectos resultan tanto de la acción directa de la BGH en la partición de nutrientes y en la multiplicación celular, como en la acción mediada por el factor de crecimiento insulinoide tipo 1, que estimula la proliferación celular y los procesos metabólicos, asociados a la deposición de proteínas (8). Además, se han reportado relaciones significativas entre las concentraciones de BGH, con el período postparto y consecuentemente con la fertilidad de la vaca (9,10).

Arango - Association of the bovine growth hormone gene of the research was to determine the association of intron 3 polymorphism of the bovine growth hormone (BGH) gene, with ages at first service, first birth, first postpartum service and second birth, in a population of Holstein cows in the state of Antioquia.

MATERIALS AND METHODS Study areas and population. 408 Holstein cattle were used, belonging to 8 dairy herds located in the high tropics of Antioquia, northern and eastern areas of the state, in the municipalities of San Pedro de los Milagros (height 2475 mamsl; with a temperature of 14°C, Belmira (height 2550 mamsl, T° 14°C) and Santa Elena township of Medellín (height 2500 mamsl, T° 17°C). DNA extraction and determination of genotypic variants. To determine the genotypic variants, coccygeal vein blood was extracted and DNA extraction was performed using the salting out technique (11). Only genomic DNA with suitable purity between 1.8-2.0 was considered for the studies to be performed. The following oligonucleotides were synthesized, of 20 base pairs (pb) F 5’CCC ACG GGC AAG AAT GAG GC 3’, R5’ TGA GGA ACT GCA GGG GCC CA 3’, which enabled amplification of the 329bp fragment which has the restriction site for endonuclease MspI (12). This was carried out by PCR amplification for the specific region, using a final volume of 25 µl containing 2.5 µl 10X PCR buffer (1.0-1.5 mM of MgCl2, 50 mM of KCl, 10 mM of Tris-HCl, pH of 8.3), 0.2 μM of primers; 0.4 mM of each dNTPs, 2 mM of MgCl2, 1 unit of Taq polymerase and ~30-60 ng of genomi DNA. PCR was performed in a thermocycler (Biometra®). The conditions for amplification of the specific region of the BGH gene were: initial denaturation with heating for five minutes at 94°C, followed by 39 cycles of denaturation at 94°C for 1 minute, primer alignment (anneling) at 55°C for 1 minute, extension at 72°C for 1 min, and a final extension step of 3 minutes at 72°C to complete the reaction (12). The annealing temperature used was determined by following the recommendation of the primer supplier and through different trials that yielded more efficient alignment to said temperature (55°C) (12). As a positive control for all reactions, amplification of samples that were previously evaluated was performed and as negative control reactions in the absence of DNA. Genotypic variants were determined by using RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), using the

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El interés principal del análisis de esta asociación, viene dado por la determinación de la influencia de las variantes genéticas de la hormona del crecimiento sobre el alcance de un estado reproductivo activo más temprano. El objetivo de la investigación fue determinar la asociación del polimorfismo del intrón 3 del gen de la hormona de crecimiento bovino (BGH), con las edades al primer servicio, primer parto, primer servicio posparto y segundo parto en una población de vacas Holstein del departamento de Antioquia.

MATERIALES Y MÉTODOS Áreas y población en estudio. Se utilizaron 408 bovinos de la raza Holstein pertenecientes a 8 hatos lecheros ubicados en el trópico alto Antioqueño, zonas norte y oriental del departamento, en los municipios de San Pedro de los Milagros (altura 2475 msnm; con una temperatura (T°) de 14ºC), Belmira (altura 2550 msnm; Tº 14ºC) y Medellín corregimiento Santa Elena (altura 2500 msnm; Tº 17ºC). Extracción de ADN y determinación de las variantes genotípicas. Para la determinación de las variantes genotípicas, se extrajo sangre de la vena coccígea y se realizó la extracción del ADN, mediante la técnica de salting out (11). Sólo el ADN genómico con una pureza adecuada entre 1.8-2.0 se consideró para los estudios a realizar. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos, de 20 pares de bases (pb) F 5’ CCC ACG GGC AAG AAT GAG GC 3’, R 5’ TGA GGA ACT GCA GGG GCC CA 3’, que permitieron amplificar el fragmento de 329 pb que presenta el sitio de restricción para la endonucleasa MspI (12). Se llevó a cabo una amplificación mediante PCR para la región específica, usando un volumen final de 25 µl que contenía 2.5 µl tampón PCR 10X (1.0-1.5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH de 8.3), 0.2 μM de cebadores; 0.4 mM de cada dNTPs, 2 mM de MgCl2, 1 unidad de Taq polimerasa y ~30-60 ng de ADN genómico. La PCR se realizó en un termociclador (Biometra®). Las condiciones para la amplificación de la región específica del gen BGH fueron: la desnaturalización con calentamiento inicial durante cinco minutos a 94°C, seguido por 39 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 minuto, alineamiento de cebadores (anneling) a 55°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 1 min y un paso de extensión final de 3 minutos a 72°C para terminar la reacción (12). La temperatura de alineamiento utilizada se determinó siguiendo la recomendación de los distribuidores de los cebadores y mediante diferentes ensayos que arrojaron mayor eficiencia de alineamiento a la temperatura citada (55ºC), (12). Como control positivo de todas las

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restriction enzyme MspI. A final volume of 20 µl was used, containing 5 µl of PCR product, 2 µl of buffer Tango 1X, 12.5 µl of ultra-pure water, which was subjected to digestion by 5 units of restriction enzyme MspI for three hours at 37°C. The resulting product was observed by electrophoresis in agarose gel at 2.5% (w/v) and ethidium bromide staining. The restriction pattern expected for the (negative/negative) genotype was a 329 pb fragment, for the (positive/negative) genotype three fragments (329, 224 and 105 pb) and for the (positive/ positive) genotype two fragments (224 and 105 pb). Estimation of allele frequencies. The frequency of the different alleles was estimated by determining the proportion of each form of the gene among the total number of copies in the study population. Homozygotes (two copies of the same allele) and heterozygous (one copy of each allele) were identified, and the frequency (F) of each allele was calculated by counting homozygotes and adding half the heterozygotes, with the method described by Hartl (13). Statistical Analysis. To determine the association of each characteristic with the genotype for the BGH, several generalized linear models were adjusted based on known sources of variation for each of the dependent variables (age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth). The Tukey analysis was used to determine differences between the means for each of the fixed effect levels included in the models. The statistical packet SAS v9.2 was used for all analyzes (SAS Inst Inc., Cary, NC), (14). The general model of fixed effects was carried out as follows: Yijklmnopq= µ + Gi+ Hj + ANk + MNl + (MN*AN)m + (H*AN)n + (H*MN)O + (H*MN*AN)P + (H*G)q + eijklmnopq Where: Yijklmnopq = age at first service, age at first birth, age at first postpartum service or age at second birth, of individual X, carrier of genotype i, located in herd j, with year of birth k and month of birth l µ= mean for the characteristic Gi= fixed effect of the gentoype for BGH (i= 1...3) Hj= fixed effect of the herd (j = 1…8) ANk= fixed effect of the year of birth (k=1…15) MNl= fixed effect of the month of birth (l=1…12) (MN*AN) m = fixed effect of the interaction between the month of birth and the year of birth (m=1…86) (H*AN)n= fixed effect of the interaction between

reacciones se realizó la amplificación de muestras que fueron previamente evaluadas, y como control negativo reacciones en ausencia de ADN. Las variantes genotípicas fueron determinadas mediante la utilización de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), usando la enzima de restricción MspI. Se usó un volumen final de 20 µl que contenía 5 µl del producto de PCR, 2 µl de tampón Tango 1X, 12.5 µl de agua ultra pura, los cuales fueron sometidos a digestión por 5 unidades de enzima de restricción MspI durante tres horas a 37°C. El producto resultante se observó por electroforesis en gel de agarosa al 2.5% (p/v) y tinción con bromuro de etidio. El patrón de restricción esperado para el genotipo (negativo/negativo) fue un fragmento de 329 pb, para el genotipo (positivo/negativo) tres fragmentos (329, 224 y 105 pb) y para el genotipo (positivo/positivo) dos fragmentos (224 pb y 105 pb). Estimación de las frecuencias alélicas. La frecuencia de los diferentes alelos se estimó determinando la proporción de cada forma del gen entre el número de copias totales de la población en estudio. Se identificaron los homocigotos (dos copias del mismo alelo) y los heterocigotos (una copia de cada alelo), y se calculó la frecuencia (F) de cada alelo contando los homocigotos y añadiendo la mitad de los heterocigotos, con el método descrito por Hartl (13). Análisis estadístico. Para determinar la asociación de cada una de las características con el genotipo para BGH, se llevó a cabo el ajuste de varios modelos lineales generalizados, basados en las fuentes de variación conocidas para cada una de las variables dependientes (edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto y edad al segundo parto). El análisis de medias de Tukey fue utilizado para determinar las diferencias entre las medias para cada uno de los niveles de los efectos fijos incluidos en los modelos. Se utilizó el paquete estadístico SAS v9.2., para todos los análisis (SAS Inst. Inc., Cary, NC), (14). El modelo general de efectos fijos llevado a cabo fue el siguiente: Yijklmnopq= µ + Gi+ Hj + ANk + MNl + (MN*AN)m + (H*AN)n + (H*MN)O + (H*MN*AN)P + (H*G)q + eijklmnopq Dónde: Yijklmnopq = edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto o edad al segundo parto, del individuo X, portador del genotipo i, ubicado en el hato j, con año de nacimiento k y mes de nacimiento l µ= media para la característica Gi= efecto fijo del Genotipo para BGH (i= 1...3) Hj= efecto fijo del hato (j = 1…8) ANk= efecto fijo del Año de Nacimiento (k=1…15)

Arango - Association of the bovine growth hormone gene the herd and the year of birth (n=1…46) (H*MN)o= fixed effect of the interaction between the herd and the month of birth (o=1…68) (H*MN*AN)P = fixed effect of the interaction between the herd, the month of birth and the year of birth (p=1…41) (H*G)q= fixed effect of the interaction between the herd and the genotype (q=1….13) eijklmnopq = experimental error. An analysis of simple linear regression was conducted to determine the effect of allelic substitution on each of the study variables. For this, the genotype was converted to a quantitative scale 0, 1 and 2 for (negative/negative), (positive/ negative) and (positive/positive), respectively. The linear regression model used was the following: Yi = β0 + β1 Xi + ei Where: Yi= value of the dependent variable (age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth) depending on the number of + alleles β0= intercept β1= coefficient of linear regression estimated for allele replacement (+) Xi= number of + alleles in individual i. (0, 1, 2) ei= experimental error.

RESULTS Determination of genotype and allele frequencies of the gene for the growth hormone (BGH). A 329pb fragment was amplified from the DNA of 408 animals. The analysis of the restriction fragments using the MspI enzyme originated two restriction patterns; 329 pb, corresponding to the (negative) allele and 224 and 105 pb, corresponding to the (positive) allele. Allele frequencies (positive) and (negative) were 0.91 and 0.09, respectively. The genotype frequencies were 0.77, 0.2 and 0.03 for (positive/positive), (positive/negative) and (negative/negative), respectively. Descriptive analysis. The average age at first service was 589±91.17 days. For the age at first birth an average of 911±126.2 days was obtained, for the first postpartum service 1013±142.57 days, and for the second birth 1314±138.01 days was obtained. All characteristics showed a relatively low Coefficient of Variation (CV), with the age at first service having the highest value (15.4%) (Table 1). However, these values are too

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MNl= efecto fijo del mes de Nacimiento (l=1…12) (MN*AN) m = efecto fijo de la interacción entre el mes de nacimiento y el año de nacimiento(m=1…86) (H*AN)n= efecto fijo de la interacción entre el hato y el año de nacimiento (n=1…46) (H*MN)o= efecto fijo de la interacción entre el hato y el mes de nacimiento (o=1…68) (H*MN*AN) P = efecto fijo de la interacción entre el hato, el mes de nacimiento y el año de nacimiento (p=1…41) (H*G)q= efecto fijo de la interacción entre el hato y el genotipo (q=1….13) eijklmnopq = error experimental. Se realizó un análisis de regresión lineal simple, para determinar el efecto de sustitución alélica con cada una de las variables en estudio. Para este fin, el genotipo se convirtió a una escala cuantitativa 0, 1 y 2 para (negativo/ negativo), (positivo/negativo) y (positivo/ positivo), respectivamente. El modelo de regresión lineal utilizado fue el siguiente: Yi = β0 + β1 Xi + ei Dónde: Yi= valor de la variable dependiente (edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto y edad al segundo parto) en función del número de alelos + β0= intercepto β1= coeficiente de regresión lineal estimado para el alelo de sustitución (+) Xi= número de alelos + en el individuo i. (0, 1, 2) ei= error experimental.

RESULTADOS Determinación de las frecuencias alélicas y genotípicas del gen de la hormona de crecimiento (BGH). Se amplificó un fragmento de 329 pb a partir del ADN de 408 animales. El análisis de los fragmentos de restricción usando la enzima MspI, originó 2 patrones de restricción; 329 pb, correspondiente al alelo (negativo) y 224 y 105 pb, correspondiente al alelo (positivo). Las frecuencias alélicas de (positivo) y (negativo) fueron de 0.91 y 0.09, respectivamente. Las frecuencias genotípicas fueron 0.77, 0.2 y 0.03 para (positivo/positivo), (positivo/negativo) y (negativo/negativo), respectivamente. Análisis descriptivo. El promedio para la edad al primer servicio fue de 589±91.17 días. Para la edad al primer parto se obtuvo un promedio de

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high with respect to the reproductive goals that efficient milk production systems should have (1). Descriptive statistics for all characteristics are summarized in table 1.

911±126.2 días, para el primer servicio postparto de 1013±142.57 días y para el segundo parto de 1314±138.01 días. Todas las características mostraron unos Coeficientes de Variación (CV) relativamente bajos, siendo la edad al primer servicio la que presentó el valor más elevado (15.4%) (Tabla 1). Sin embargo, estos valores son demasiado elevados con respecto a las metas reproductivas que deberían de tener los sistemas de producción lechera eficientes (1). En la tabla 1 se resume la estadística descriptiva para todas las características.

Table1. Mean, standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) for the age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth in Holstein cows in the state of Antioquia. Characteristic

Mean

CV%

Age at first service (days)

433

589

91.1

15.4

Age at first birth (days)

448

911

126.2

13.8

Age at first postpartum service (days)

391

1013

142.5

14.0

Age at second birth (days)

453

1314

138.0

10.5

Efecto del genotipo sobre las edades de los eventos reproductivos. El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al primer servicio; el modelo presentó un coeficiente de determinación de 0.88; indicando que el hato, el año de nacimiento, mes de nacimiento, la interacción entre el mes y año de nacimiento, entre el hato y año de nacimiento, hato y mes de nacimiento y la interacción entre el hato el mes y el año de nacimiento, explicaron en un 88% la variación de la característica. El análisis de medias de Tukey, que se realizó posteriormente, mostró como las novillas con genotipo (negativo/negativo) tardaron 69 días más para su primer servicio que las novillas con genotipo (positivo/positivo). De la misma forma, los individuos (positivo/negativo) se demoraron 13 días más que las (positivo/positivo). Los animales con genotipo (negativo/negativo) presentaron un menor rendimiento, ya que tuvieron su primer servicio a edades más tardías Estos resultados son presentados en la tabla 2.

Effect of genotype on the age of reproductive events. The genotype had a highly significant effect (p≤0.01) on age at first service; the model showed a coefficient of determination of 0.88; indicating that the herd, year of birth, month of birth, interaction between the month and year of birth, between the herd and year of birth, herd and month of birth, and interaction between the herd, month and year of birth, explained an 88% variation of the characteristic. The Tukey analysis, which was performed subsequently, showed that heifers with the (negative/negative) genotype took 69 days more for their first service than heifers with the (positive/positive) genotype. Likewise, (positive/negative) individuals were delayed 13 days more than (positive/positive) individuals. Animals with the (negative/negative) genotype had a lower performance because they had their first service at later ages. These results are presented in table 2.

El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al primer parto y al primer servicio postparto; el modelo presentó un coeficiente de determinación de 0.81 y 0.83 respectivamente, indicando que los efectos incluidos en el modelo explicaron en el 81% la variación en la edad al primer parto y en el 83% la variación en la edad al primer servicio postparto. El análisis de medias de Tukey, llevado a cabo posteriormente, mostró diferencias significativas (p<0.05), denotando al genotipo (negativo/negativo) como el menos

The genotype had a highly significant effect (p≤0.01) on age at first birth and first postpartum service; the model showed a coefficient of determination of 0.81 and 0.83 respectively, indicating that the effects included in the model explained the 81% variation in age at first birth and 83% variation in age at first postpartum

Table 2. Tukey analysis for age at first service, first birth, first postpartum service and second birth in Holstein cows in the state of Antioquia. Genotype

Age at first service (days)

Age at frst birth (days)

Age at first postpartum service (days)

Age at second birth (days)

(positive/positive)

577.4ª

905.0ª

998.2ª

1304.6ª

(positive/negative)

590.3b

905.3ª

1000.1ª

1305.8ª

(negative/negative)

646.3

967.3

1040.4

1375.3b

Different letters in the same column indicate significant differences.

Arango - Association of the bovine growth hormone gene service. The Tukey analysis, subsequently carried out, showed significant differences (p≤0.05), denoting the (negative/negative) genotype as the least favorable, as it showed the later age for both characteristics. The analysis of means for the (positive/positive) and (positive/negative) genotypes showed no significant differences (p>0.05, Table 2). The genotype had a highly significant effect (p≤0.01) on age at second birth; the model showed a coefficient of determination of 0.79, indicating that the effects included in the model explained the 79% variation of this characteristic. The Tukey analysis showed significant differences (p≤0.05) among the means, denoting the (negative/negative) genotype as the least favorable for age at second birth, with an average of more days. The analysis of means of the (positive/positive) and (negative/positive) genotypes showed no significant differences (p>0.05, Table 2). Effect of allelic replacement of BGH gene polymorphism on the ages at which some reproductive events occur. For the age at first service, a regression coefficient (β) of -20.3 was found, indicating that for each (positive) allele that the individual bears, the age at first service decreases by 20 days; age at first birth had a regression coefficient (β) of -11.67, ie, for each (positive) allele, the age at first birth decreases by 11 days. For the age at first postpartum service the β coefficient was -8.5, indicating that for each (positive) allele, the age decreases by 8 days, and the β for the age at second birth was -15.83 indicating that for each (positive) allele, the age at second birth decreases by 15 days. Regression coefficients for each of the characteristics are shown in table 3. The estimated regression coefficients for age at first and second birth were highly significant (p<0.01). The regression coefficient for age at first birth was significant (p<0.05). For age at first postpartum service, the regression coefficient was not statistically significant (p>0.05). Table 3. Regression Analysis for characteristics: age at first service, first birth, first postpartum service and second birth. Characteristic Age at first service (days) (p<0.01) Age at first birth (days) (p<0.01) Age at first postpartum service (days) (p<0.05) Age at second birth (days) (p>0.05)

Intercept (I)

Beta (β)

Standard Error β

617.21

-20.3

3.09

927.37

-11.67

4.4

1015.05

-8.5

4.9

1335.04

-15.83

5.2

4255

favorable, pues mostraba la edad más tardía para ambas características. El análisis de medias de los genotipos (positivo/positivo) y (positivo/ negativo) no mostró diferencias significativas (p>0.05, Tabla 2). El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al segundo parto; el modelo mostró un coeficiente de determinación de 0.79, indicando que los efectos incluidos en el modelo explicaron en el 79% la variación de esta característica. El análisis de medias de Tukey mostró diferencias significativas (p<0.05) entre las medias, denotando al genotipo (negativo/ negativo) como el menos favorable para la edad al segundo parto, con un promedio de días mayor. El análisis de medias de los genotipos (positivo/ positivo) y (negativo/positivo) no mostraron diferencias significativas (p>0.05, Tabla 2). Efecto de sustitución alélica del polimorfismo del gen BGH sobre las edades a las cuales se presentan algunos eventos reproductivos. Para la edad al primer servicio se encontró un coeficiente de regresión (β) de -20.3, indicando que por cada alelo (positivo) que porte el individuo, la edad al primer servicio disminuye en 20 días; la edad al primer parto tuvo un coeficiente de regresión (β) de -11.67, es decir, por cada alelo (positivo) la edad al primer parto disminuye en 11 días. Para la edad al primer servicio postparto el coeficiente β fue de -8.5, indicando que por cada alelo (positivo) la edad disminuye en 8 días, y el β para la edad al segundo parto fue de -15.83 indicando que por cada alelo (positivo) la edad al segundo parto disminuye en 15 días. Los coeficientes de regresión para cada una de las características son mostrados en la tabla 3. Los coeficientes de regresión estimados para la edad al primer servicio y segundo parto, fueron altamente significativos (p<0.01). El coeficiente de regresión para la edad al primer parto fue significativo (p<0.05) y para la edad al primer servicio postparto no fue estadísticamente significativo (p>0.05).

DISCUSIÓN Las frecuencias genotípicas y alélicas obtenidas en el presente trabajo coinciden con las reportadas por Gorbani et al (15), quienes en una población de 183 animales de raza Holstein, encontraron frecuencias de 0.787, 0.191 y 0.022 para los genotipos (positivo/positivo), (positivo/negativo) y (negativo/negativo) respectivamente, y 0.883 y 0.117 para los alelos (positivo) y (negativo) respectivamente.

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DISCUSSION Genotypic and allelic frequencies obtained in this study agree with those reported by Gorbani et al (15), who, in a population of 183 Holsteins, found frequencies of 0.787, 0.191 and 0.022 for (positive/positive), (positive/negative) and (negative/negative) genotypes, respectively, and 0.883 and 0.117 for (positive) and (negative) alleles respectively. Mullen et al (16) found an association between three of six polymorphisms located in the first exon (5’ region) of the GH gene. These newly found SNP were associated with pregnancy rate and first service; however, no association with the age at which the event occurs were performed. Reports generated by Katalin et al (17) mentioned that polymorphism recognized by the AluI enzyme in the exon 5 region position 127, and designated L and V alleles, is not associated with the age at first birth in Holstein cows. The age at first breeding in heifers is an important parameter of reproductive efficiency; reducing the rearing period and rapid entry to the breeding program generates a higher economic return; a later age, the result obtained in this research, reflects low reproductive efficiency in the herd (1.2). The age at first birth is another important factor in the productive life of the animal. Advanced ages at which this event occurs impact lesser milk production and increased feed intake, resulting, therefore, in a higher initial cost of breeding (18). Establishing the age around which heifers are giving birth evaluates the growth rate from birth to the time they contribute milk or calves to the system and return the rearing investment. The age at first birth in this study was also high and therefore should be the subject of work by both farmers and researchers. The (negative/negative) genotype was less favorable, as it delays the age at first service, as well as the age at first birth, postpartum service and second birth. Although the low frequency of the (negative/negative) genotype may indicate some limitation when performing association analysis, the intron 3 polymorphism of the BGH showed significant results for all characteristics. The greatest effect of genotype polymorphism of the BGH was on age at first service. For each (positive) allele, the first service occurred 20 days before. This effect decreased age at first birth by 11 days and for age at second birth by 15 days. The decrease in each of these parameters is important for the herd’s breeding performance, resulting in

Mullen et al (16), encontraron asociación entre tres de seis polimorfismos, situados en el primer exón (región 5 ‘) del gen GH. Estos nuevos SNP encontrados, se asociaron con la tasa de preñez al primer servicio; sin embargo, no se realizaron asociaciones con la edad a la cual ocurre dicho evento. Reportes generados por Katalin et al (17) mencionan que el polimorfismo reconocido por la enzima AluI de la región del exón 5 posición 127, y con alelos designados L y V, no están asociados con la edad al primer parto en vacas Holstein. La edad al primer servicio en las novillas es un importante parámetro de eficiencia reproductiva; la reducción del periodo de levante y una entrada rápida al programa de reproducción genera mayor rendimiento económico; una edad tardía, resultado obtenido en esta investigación, refleja una baja eficiencia reproductiva en el hato (1,2). La edad al primer parto es otro factor importante en la vida productiva del animal. Edades avanzadas en las que ocurre este evento repercuten en una menor producción láctea y en un mayor consumo de alimento, derivando, por tanto, en un mayor costo inicial de crianza (18). Establecer la edad alrededor de la cual las novillas están pariendo evalúa la velocidad de crecimiento desde el nacimiento hasta el momento en que pueden aportar leche o terneros al sistema para retornar la inversión de su levante. La edad al primer parto en este estudio fue también alta y por ende, debería ser materia de trabajo por parte de los productores e investigadores. El genotipo (negativo/negativo) fue el menos favorable, pues retrasa la edad al primer servicio, así como también la edad al primer parto, al servicio postparto y al segundo parto. Aunque la baja frecuencia del genotipo (negativo/ negativo), puede significar una cierta limitación al realizar análisis de asociación, el polimorfismo del intrón 3 de la BGH mostró resultados significativos para todas las características. El mayor efecto del genotipo del polimorfismo de la BGH se presentó sobre la edad al primer servicio. Por cada alelo (positivo), el primer servicio se presentó 20 días antes. Este efecto disminuyó en la edad al primer parto en 11 días y para la edad al segundo parto en 15 días. La disminución en cada uno de estos parámetros es importante en el desempeño reproductivo del hato, dando como resultado una vida útil productiva más prolongada (19, 20). Es así como la asociación del polimorfismo de la BHG puede utilizarse como ayuda para seleccionar animales que tiendan a entrar a

Arango - Association of the bovine growth hormone gene a longer productive life (19, 20). Thus, association of BHG polymorphism can be used to help select animals that tend to enter reproductive stages earlier, decreasing economic losses generated in the breeding of animals to maturity (21). The finding that the positive/positive genotype influences the age at first service, reducing the rearing period, may indicate a lower age at second birth and increased productive life of these carrier animals. Early entry to breeding programs generates greater economic performance and lower feed intake which results in lower breeding costs. This information, in productive and reproductive terms, is an important contribution to breeding programs (1). In conclusion this is a pioneering study on the association of intron 3 polymorphisms of the BGH with reproductive characteristics of dairy cows. The results suggest that the intron 3 polymorphism of the BGH is associated with age at first service, first birth, first postpartum service and second birth by facilitating the selection of individuals with favorable genotypes for use in breeding programs. We found that the positive/positive genotype is optimal for reducing age at first service, first birth, first postpartum service and second birth; the genotype’s greatest effect being on age at first service. Due to the low frequency of the negative/ negative genotype; increasing the sample size is recommended for future studies and to achieve greater reliability in the results.

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etapas reproductivas tempranas disminuyendo pérdidas económicas que se generan en la cría de los animales hasta la madurez (21). El hallazgo de que el genotipo positivo/positivo tiene influencia sobre la edad al primer servicio repercute en la reducción del periodo de levante, lo que podría indicar menor edad al segundo parto y una mayor vida productiva de estos animales portadores. La entrada temprana a los programas de reproducción genera mayor rendimiento económico y menor consumo de alimento que se deriva en un menor costo de crianza, por lo que esta información, en términos productivos y reproductivos, es un aporte importante para los programas de selección (1). En conclusión este es un estudio pionero en la asociación de los polimorfismos del intrón 3 del gen BGH con características reproductivas en vacas lecheras. Los resultados sugieren que el polimorfismo del intrón 3 de la BGH está asociado con las edades al primer servicio, primer parto, primer servicio posparto y segundo parto facilitando la selección de individuos con genotipos favorables para su utilización en programas de mejoramiento genético. Se encontró que el genotipo positivo/positivo es el óptimo para la disminución de la edad al primer servicio, primer parto, primer servicio postparto y segundo parto; teniendo el genotipo mayor efecto en la edad al primer servicio. Debido a la baja frecuencia del genotipo negativo/ negativo; se recomienda aumentar el tamaño de la muestra para futuros estudios y conseguir mayor confiabilidad en los resultados.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4259-4268, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Prevalence of stereotypies in thoroughbred race horses at Club Hípico Concepción, Chile Prevalencia de estereotipias en caballos fina sangre de carrera del Club Hípico Concepción, Chile Lisandro Muñoz A,1* M.Sc, Felipe Ainardi C,1 MV, Christian Rehhof V,1 MV, Jaime Cruces L,1 MV, Reinaldo Ortiz R,1 MV, Mario Briones L,2 M.Sc. Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Veterinarias. 1Departamento de Ciencias Clínicas, 2 Departamento de Ciencias Pecuarias, Victoria 495. Concepción, Chile. *Correspondencia: lismunoz@ udec.cl

Received: September 2013; Accepted: February 2014.

ABSTRACT Objective. To determine the prevalence of classic stereotypies in Thoroughbred racehorses at the Club Hípico Concepción (CHC) in Chile and its association with sex and age. Materials and methods. The entire population of resident horses at the CHC was studied (n=341). Each horse trainer (n=23) was asked for the name, sex and age of the horses under his/her supervision. After that, all the animals were continuously observed inside their stalls for 8 hours by only one person, to record the absence or presence of classic stereotypies (cribbing, weaving, stall-walking). To analyze the data, the animals were divided by sex into 3 groups: stallions, geldings and mares. According to age, they were divided into 2 groups: < 5 years old and 5 years old or more. Descriptive statistics were used and association was tested using the chi square test using p≤0.05. Results. 13.2% of all CHC’s horses displayed stereotypies: cribbing (4.99%), weaving (2.93%) and stall-walking (5.28%). No association was found between the presence of stereotypies and sex or age. Conclusions. Thoroughbred race horses at the CHC showed a high prevalence of classic stereotypies, especially stall-walking. Key words: Cribbing, equine, stall-walking, stereotyped behavior, weaving (Source: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Determinar la prevalencia de estereotipias clásicas en caballos fina sangre de carrera (FSC) del Club Hípico Concepción (CHC), Chile y su asociación con el sexo y la edad. Materiales y métodos. Se estudió la totalidad de los caballos FSC (n=341) residentes en el CHC. A cada entrenador (n=23), se le consultó nombre, sexo y edad de los caballos a su cargo. Luego, con la finalidad de detectar la presencia o ausencia de estereotipias clásicas (aerofagia, balanceo y caminar en pesebrera), durante 8 horas una sola persona observó directamente los caballos mientras se encontraban en sus pesebreras. Los caballos se dividieron por sexo en 3 grupos: machos enteros, machos castrados y hembras. De acuerdo con la edad se dividieron en 2 grupos: <5 años y 5 años o más. Los resultados en la parte descriptiva se entregan como porcentajes simples y para el análisis estadístico de las variables sexo y edad, se utilizó la prueba de X2, con un nivel de significancia de p<0.05. Resultados. El 13.2% de los caballos de CHC presentaron estereotipias: aerofagia (4.99%), balanceo (2.93%) y caminar en 4259

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pesebrera (5.28%). No se encontró asociación entre la presencia de estereotipias y las variables sexo y edad. Conclusiones. Los caballos FSC del CHC presentan una alta prevalencia de estereotipias clásicas, principalmente caminar en pesebrera. Palabras clave: Aerofagia, balanceo estereotipado, caminar en pesebrera, comportamiento estereotipado, equino (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

In the wild, horses live in groups of 3-10 individuals, providing them with security and allowing them to have intense social interaction. They can also walk up to 65 to 80 km (1) and spend about 80% of the day feeding (2). For this reason, captivity and handling associated with domestication have compromised their nutritional, social, sexual and kinetic behavior, which in some horses has stimulated the development of abnormal behaviors and stereotypies. Stereotypies are defined as repetitive behavior that is relatively unchanged and has no apparent function (1). Therefore, the presence of a stereotypy is indicative of a welfare problem (2). In horses, the most common stereotypies (also called classic stereotypies) are cribbing, weaving and stall-walking. In some countries, these stereotypies must be declared at auctions, and in general, tend to decrease the price of horses (1). Worldwide, several studies have been performed to determine the frequency and risk factors associated with these stereotypies (3-20). However, within the risk factors, sex and age have shown very contradictory results (1,3,9-13,16,19-23). However, none of the studies’ results were based on information obtained from direct observation of an entire determined population, but from direct observation of a sample of a population (13,16,20) or on information provided by the owners through personal interviews or surveys conducted at a distance by telephone, mail or email (3-12,14,15,17-19).

En vida silvestre, los equinos viven en grupos de 3 a 10 individuos, lo que les brinda seguridad y les permite desplegar una intensa interacción social, además, pueden caminar hasta 65 a 80 km (1) y ocupar cerca del 80% del día alimentándose (2). Razón por la cual, el cautiverio y los manejos asociados a la domesticación, han comprometido su comportamiento alimenticio, social, sexual y cinético, lo que en algunos equinos ha estimulado el desarrollo de comportamientos anormales y dentro de éstos de estereotipias. Las estereotipias son definidas como un comportamiento repetitivo, relativamente invariable y sin una función aparente (1). Por lo que, la presencia de una estereotipia es indicativa de un problema de bienestar (2). En equinos, las estereotipias más comunes (también llamadas clásicas) son aerofagia, balanceo y caminar en pesebrera. Estas estereotipias en algunos países deben ser obligatoriamente declaradas en los remates y en general, tienden a disminuir el precio de los equinos (1). En el mundo, se han realizado varios estudios tendientes a establecer la frecuencia y factores de riesgo asociados a estas estereotipias (3-20). Sin embargo, dentro de los factores de riesgo, el sexo y la edad han mostrado resultados muy contradictorios (1,3,913,16,19-23). No obstante, en ninguno de los estudios realizados los resultados se basaron en información obtenida por observación directa del total de una población determinada, sino que en observación directa de una muestra de una población (13,16,20), o bien en información entregada por los propietarios a través de entrevistas personales o encuestas realizadas a distancia por teléfono, correo o correo electrónico (3-12,14,15,17-19).

The aim of this study was to determine, by direct observation, the prevalence of classic stereotypies in all Thoroughbred racehorses (FSC) at the Concepción Equestrian Club (Chile) and their association with gender and age.

MATERIALS AND METHODS Study site and geo-climate. Concepción Equestrian Club (CHC), Biobío Region, Chile (36º47’32”S; 73º05’44”W). Warm temperate climate with dry summers, high humidity and less than 50 m above sea level (24). Animals studied. All Thoroughbred horses residing at the CHC were studied (n=341), with

El objetivo del presente estudio fue determinar por observación directa la prevalencia de estereotipias clásicas en la totalidad de los caballos fina sangre de carrera (FSC) residentes del Club Hípico Concepción (Chile) y su asociación con el sexo y la edad.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio del estudio y geoclima. Club Hípico Concepción (CHC), Región del Biobío, Chile

Muñoz - Prevalence of stereotypies in thoroughbred race horses an age range of 2-13 years. All were enclosed for more than 22 hours a day in individual stalls with shavings, without any physical contact with other horses, without access to paddocks or pastures, and kept on a diet of grain, hay and water ad libitum. All horses had a similar training program that consisted of one or more of the following activities performed 1 or 2 times a day: walking (20-30 minutes), galloping riderless in a round pen (20 minutes) and galloping with a rider at different intensities (5-10 minutes). Horses that were competing the following day would not receive exercise. Recording Stereotypies. Each trainer (n=23), was asked the name, sex and age of the horses in their care. Then, based on an ethogram (Table 1) and with the purpose of identifying and detecting the presence or absence of classic stereotypies (or cribbing, weaving and stallwalking), a continuous recording system (25) was used. The study was conducted between January 3 rd and February 25 th, 2008. Each day, and per block (where there are several individual stalls whose doors open onto a hallway or common area) for 8 hours divided into two direct, continuous observation periods (8:00 to 13:00 hours and 14:00 to 17:00 hours), one person directly observed all horses while they were in their stalls. The horses were divided by sex into 3 groups: stallions (n=50), geldings (n=173) and mares (n=118). They were also divided into 2 groups according to age: <5 years (n=213) and 5 years or more (n=128). Table 1. Ethogram of observed stereotypies. Stereotypy

Description

Cribbing

The horse, with or without supporting the upper incisors on any solid material, tenses the neck muscles, forcing the entry of air into the cranial portion of the esophagus, making a characteristic noise.

Weaving

The horse moves its head from side to side, alternately putting its weight on the forelimbs.

Stall-walking

The horse walks, trots, or canters around the interior perimeter of the stall.

Descriptions adapted by Tadich et al (20) and McDonnell (2).

Analysis of results. The results in the description are presented as percentages. For statistical analysis of the sex and age variables, the X2 test was used, and alternatively Fisher’s exact test was used when a result was <5. Both tests had a significance level of p ≤ 0.05.

RESULTS Forty-five (13.2%) of the horses at CHC had stereotypies: 17 (4.99%) cribbing, 10 (2.93%)

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(36º47’32”S; 73º05’44”O). Clima templado cálido con verano seco, gran humedad atmosférica y a menos de 50 m sobre el nivel del mar (24). Animales del estudio. Se estudió la totalidad de los caballos FSC (n=341) residentes en el CHC, con un rango de edad de 2 a 13 años. Todos estabulados por más de 22 horas diarias, en pesebreras individuales, con cama de viruta, sin contacto físico con otros caballos, sin acceso a corrales ni a pastoreo, mantenidos con una alimentación basada en avena en grano, heno de alfalfa y agua ad libitum. Todos los caballos tenían un programa de entrenamiento similar que consistía en una o más de las siguientes actividades realizadas 1 ó 2 veces al día: paseo de tiro al paso (20 a 30 min), galope sin jinete en picadero circular (20 min) y galope con jinete a diferentes intensidades (5 a 10 min). Los caballos que competían al día siguiente no realizaban ejercicio. Registro de estereotipias. A cada entrenador (n=23), se le consultó nombre, sexo y edad de los caballos a su cargo. Luego, basado en un etograma (Tabla 1) y con la finalidad de identificar y detectar la presencia o ausencia de estereotipias clásicas (aerofagia, balanceo y caminar en pesebrera), se utilizó un sistema de registro continuo (25). El estudio se realizó entre el 3 de enero y el 25 de febrero del año 2008. En un día por cuadra (lugar en donde hay varias pesebreras individuales cuyas puertas dan hacia un pasillo o área común), durante 8 horas divididas en 2 períodos de observación directa y continua (8:00-13:00 horas y 14:00-17:00 horas), una sola persona observó directamente todos los caballos mientras se encontraban en sus pesebreras. Los caballos se dividieron por sexo en 3 grupos: machos enteros (n=50), machos castrados (n=173) y hembras (n=118). De acuerdo con la edad, se dividieron en 2 grupos: <5 años (n=213) y 5 años o más (n=128). Análisis de resultados. Los resultados en la parte descriptiva se presentan como porcentajes simples. Para el análisis estadístico de las variables sexo y edad, se utilizó la prueba de X2 y alternativamente la prueba exacta de Fisher cuando un resultado era <5. Ambas pruebas con un nivel de significancia de p<0.05.

RESULTADOS Cuarenta y cinco (13.2%) de los caballos del CHC presentaron estereotipias: 17 (4.99%) aerofagia, 10 (2.93%) balanceo y 18 (5.28%) caminar en pesebrera. En la tabla 2 se muestra la prevalencia de estereotipias clásicas en caballos FSC del CHC de acuerdo con el sexo.

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weaving and 18 (5.28%) stall-walking. Table 2 shows the prevalence of classic stereotypies in Thoroughbred horses at CHC according to sex.

Table 2. Prevalence of classic stereotypies in Thoroughbred racehorses at the Club Hípico Concepción, according to sex (n=341). Sex Stereotypy

Stallions (n=50)

Geldings (n=173)

Mares (n=118)

Cribbing %

4.04

6.77

Weaving %

3.46

1.69

Stall-walking %

2.31

8.47

9.81

16.93

Total

No association was found between the presence of individual and total classic stereotypies in connection to the sex variable (p> 0.05). Table 3 shows the prevalence of classic stereotypies in Thoroughbred horses at CHC according to age. Table 3. Prevalence of classic stereotypies in Thoroughbred racehorses at the Club Hípico Concepción, according to age. (N=341). Age Stereotypy

< 5 years (n=213)

5 years or more (n=128)

Aerophagia %

4.23

6.25

Swaying %

1.88

4.69

Stall-walking % Total

6.1

3.91

12.2

14.84

No association was found between the presence of individual and total classic stereotypies in connection to the age variable (p> 0.05).

DISCUSSION The prevalence of classic stereotypies found in horses at CHC is well within the range reported in other studies, which varies between 0.7 and 66% (3-20), and is one of the highest worldwide. In fact, it is the highest reported prevalence among studies done on competing Thoroughbreds (4,6,8,9,20) and those done in South America on Chilean rodeo horses (16, 19), sport horses (18), racehorses (20) and military horses (14) which have been reported a frequency of classic stereotypies of 2.32 to 10%. As stereotypies have not been reported in free horses (1), the high prevalence of stereotypies found in CHC horses could be explained in part by a greater breed predisposition, reported for Thoroughbreds (4,6,10-13,15), associated with the nervous or reactive temperament of this breed (11). The high prevalence may also be hereditary, as it has been shown that there are families with a prevalence 5 to 10 times higher than the

No se encontró asociación entre la presencia de estereotipias clásicas individuales y totales con la variable sexo (p>0.05). En la tabla 3, se muestra la prevalencia de estereotipias clásicas en caballos FSC del CHC de acuerdo con la edad. No se encontró asociación entre la presencia de estereotipias clásicas individuales y totales con la variable edad (p>0.05).

DISCUSIÓN La prevalencia de estereotipias clásicas encontrada en los caballos del CHC si bien está dentro del rango reportado en otros estudios, el que varía entre 0.7% y 66% (3-20), es una de las más alta a nivel mundial. De hecho, es la prevalencia más alta reportada entre los estudios realizados en FSC en competencia (4,6,8,9,20) y los realizados en Sudamérica en caballos de rodeo chileno (16, 19), deporte (18), carreras (20) y uso militar (14) en los que se han reportado frecuencias de estereotipias clásicas de 2.32% a 10%. Como las estereotipias no han sido reportadas en equinos de vida libre (1), la alta prevalencia de estereotipias encontrada en los caballos del CHC, se podría explicar en parte, por la mayor predisposición racial reportada para los FSC (4,6,10-13,15), asociada al temperamento más nervioso o reactivo de esta raza (11). También a un origen hereditario, ya que se ha demostrado que existen familias con prevalencias 5 a 10 veces mayores al promedio observado en una determinada población de caballos FSC (4). No obstante, como lo señalan diversos estudios, al parecer más importante que la raza son las condiciones de manejo diario. Dentro de los factores de riesgo a los que son sometidos los caballos del CHC están: estabulación por más de 22 horas diarias (6, 21), encierro en pesebreras individuales sin contacto físico con otros caballos (6,11,19), uso de viruta como material de cama (20,21), no tener acceso a un corral o a pastoreo (8,11), alimentación fraccionada (1), basada principalmente en concentrado (6,11,12) y una menor proporción de forraje (6,12,19,21). En relación al sexo, el no haber encontrado asociación significativa con las estereotipias clásicas, coincide con otras investigaciones (3,11,12,16,22). Tadich et al (19) en un estudio realizado en 325 caballos de raza chilena, encontraron una asociación significativa (p<0.0001) entre el sexo y la presentación de estereotipias, siendo éstas más frecuentes en machos enteros que en machos castrados y hembras. Lo que fue justificado por

Muñoz - Prevalence of stereotypies in thoroughbred race horses average observed in a determined population of Thoroughbred horses (4). However, as pointed out by several studies, daily handling conditions are more important than breed. The risk factors to which the CHC horses are subjected are: stabling for more than 22 hours a day (6,21), confinement in individual stalls without physical contact with other horses (6,11,19), use of shavings as bedding material (20,21), no access to a paddock or to grazing (8,11), prepared feed (1), mainly concentrated (6,11,12) and a lower rate of foraging (6,12,19,21). In relation to sex, no significant association with the classic stereotypies was found, which is consistent with other studies (3,11,12,16,22). Tadich et al (19) in a study of 325 Chilean horses, found a significant association (p<0.0001) between sex and the appearance of stereotypies, being that they are more common in stallions than in castrated males and females. The finding was justified by these researchers based on the social isolation that stallions are subjected to in Chile, by being kept in paddock and stalls without physical contact and at times without eye contact with other horses. On the other hand, the present study and Tadich et al (19), differ completely with findings reported by Mills et al (9) who conducted a study of 4061 Thoroughbreds, and found that the prevalence of classic stereotypies was higher in geldings (6.9%) and mares (6.4%) than in stallions (3%). They suggest that the increased risk in castrated horses may be associated with stress caused by the Gonadectomy which they have undergone. These contradictory results suggest that sex is not a risk factor in horses without sexual experience and that the reported differences might be more related to specific handling than to the sex itself. Not finding a significant increase in the overall prevalence of stereotypies associated with age is consistent with reported results in other studies (1,11,16). This result was not expected, since it has been reported that the prevalence of stereotypies increases with age (1,10,11,19,20), partly because once stereotypies are acquired, they are very difficult to eliminate (1) and because horses face stressful situations and other risk factors that could stimulate the development of a stereotypy (3) on a daily basis. But on the other hand, due to the fact that some owners believe that stereotypies are imitated (9), and negatively affect health (1,4) and performance (1,9), there is a high probability that a significant percentage of horses with stereotypies have, after a while, been withdrawn from CHC for poor performance.

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estos investigadores, por el aislamiento social al que son sometidos los machos enteros en Chile, al ser mantenidos en corrales y pesebreras sin contacto físico y a veces visual con otros equinos. Por otro lado, el presente estudio y el de Tadich et al (19), difieren totalmente con lo reportado por Mills et al (9), quienes en un estudio realizado en 4061 FSC encontraron que la prevalencia de estereotipias clásicas fue mayor en caballos castrados (6.9%) y yeguas (6.4%) que en machos enteros (3%) y sugieren que el mayor riesgo en los caballos castrados podría estar asociado con el estrés provocado por la gonadectomía a la que han sido sometidos. Estos resultados contradictorios, sugieren que el sexo no es un factor de riesgo en equinos sin experiencia sexual y que las diferencias reportadas podrían estar más asociadas a manejos específicos que al sexo propiamente. El no haber encontrado un aumento significativo de la prevalencia total de estereotipias asociada con la edad concuerda con lo reportado en otros estudios (1,11,16). Este resultado no era el esperado, ya que se ha reportado que la prevalencia de estereotipias aumenta con la edad (1,10,11,19,20), debido en parte a que una vez adquiridas son muy difíciles de eliminar (1) y porque los caballos día a día se enfrentan a situaciones de estrés y otros factores de riesgo que pudieran estimular la presentación de una estereotipia (3). Pero, por otro lado, debido a que algunos propietarios creen que las estereotipias son imitadas (9), y que afectan negativamente la salud (1,4) y rendimiento (1,9), existe una alta probabilidad que un porcentaje considerable de los caballos con estereotipias luego de un tiempo, hayan sido retirados del CHC por bajo rendimiento. En este estudio se observó una tendencia al respecto sólo para el caminar en pesebrera. Esto coincide con lo reportado por Mills et al (9), quienes encontraron que el 16.4% de los caballos FSC de 2 años presentaban alguna estereotipia, porcentaje que disminuía drásticamente hasta los 6 años, no porque éstas habían desaparecido, sino porque la mayor parte de los caballos con estereotipias habían sido vendidos por disminución de rendimiento. Con relación a la aerofagia con o sin apoyo, la prevalencia encontrada está dentro del rango reportado en otros estudios, la cual varía entre 0.4% y 14.08% (3-6,8-12,14-16,18-20). Sin embargo, es la prevalencia más alta entre los estudios realizados en América del Sur, donde el rango reportado no supera el 2.8% (14,16,1820) y la segunda más alta entre los estudios realizados en caballos FSC en competencia en Italia, Suecia, Australia, Reino Unido, EEUU y Chile

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In this study there was a tendency in this respect only for stall-walking. This is consistent with results reported by Mills et al (9), who found that 16.4% of 2 year old Thoroughbreds had some stereotypies, a percentage that decreased drastically up to 6 years of age, not because the stereotypies were gone, but because most of the horses with stereotypies had been sold due to declining performance. Regarding cribbing, with or without support, the prevalence found is within the range reported in other studies, which varies between 0.4 and 14.08% (3-6, 8-12, 14-16, 18-20). However, it is the highest prevalence among studies conducted in South America, where the reported range does not exceed 2.8% (14,16, 18-20) and the second highest among studies conducted on Thoroughbred horses competing in Italy, Sweden, Australia, UK, USA and Chile that reported frequencies between 2.15 and 13.3% (4,6,8,9,15,20). This high prevalence, and the observed stereotypies in general, could be related to a genetic predisposition (4,10,15) since a prevalence of 30% cribbing has been reported in some families of Thoroughbreds when the average was 2.4 % (4). The high prevalence could also be associated with handling by the breeder before arriving at the CHC, such as abrupt weaning (10,26), receiving concentrated feed post-weaning (1,10), since according to one study the highest percentage of foals with cribbing display it between 3 and 9 months of age, and at an average age of 5 months (10). In addition, there are risk factors associated with routine handling at CHC that can stimulate the development of cribbing such as not using straw bedding (3,20), no access to pasture (3,8,26), receiving small amounts of forage (3,7,21), receiving a highly concentrated diet (3,7,26) and not having physical contact with other horses (3,15,19,26). Normando et al (22) indicate that the type of bedding material does not affect the prevalence of cribbing. Christie et al (3) and Albright et al (15) also suggest that when there is a lack of visual and physical contact the prevalence of cribbing doubles (12.3%) when compared with horses that have access to pasture (5.9%), only eye contact (5.9%) or limited visual and physical contact (5.6%), therefore stress associated with isolation could cause this increase (15,19). Regarding age, and coinciding with the results of this study, other studies also indicate that it is not a risk factor (3,16,20,21,23). However, sex is more contradictory due to the fact that in many studies no association has been found (3,6,20,21), Mills et al (9) found that cribbing was higher in castrated males than in females and stallions. The study

que reportan frecuencias entre 2.15% y 13.3% (4,6,8,9,15,20). Esta alta prevalencia al igual que lo observado para las estereotipias en general, podría estar relacionada con una predisposición genética (4,10,15) ya que se ha reportado una prevalencia de aerofagia de 30% en algunas familias de FSC cuando el promedio era 2.4% (4). También la alta prevalencia, podría estar asociada al manejo recibido en el criadero antes de llegar al CHC como: destete abrupto (10,26), recibir concentrado post destete (1,10), ya que según un estudio el mayor porcentaje de los potrillos que comienzan con aerofagia lo hacen entre los 3 y 9 meses con una edad promedio de 5 meses (10). Además, hay factores de riesgo asociados al manejo rutinario en el CHC que pueden estimular el desarrollo de aerofagia tales como: no usar cama de paja (3, 20), no tener acceso a potrero (3,8,26), recibir poca cantidad de forraje (3,7,21), recibir una dieta alta en concentrado (3,7,26) y no tener contacto físico con otros caballos (3,15,19,26). Normando et al (22) señalan que el tipo de material de cama no afecta la prevalencia de aerofagia. También Christie et al (3) y Albright et al (15) señalan que cuando falta contacto visual y físico la prevalencia de aerofagia aumenta al doble (12.3%) al compararla con caballos que tienen acceso a potrero (5.9%), sólo contacto visual (5.9%) o con contacto visual y físico limitado (5.6%), por lo que el estrés asociado al aislamiento podría provocar este aumento (15, 19). Respecto a la edad, en coincidencia con resultados del presente estudio, asi como otros estudios señalan que no es un factor de riesgo (3,16,20,21,23). Sin embargo, el sexo es más contradictorio ya que si bien, en muchos estudios no se ha encontrado asociación (3,6,20,21), Mills et al (9), encontraron que la aerofagia era mayor en machos castrados que en hembras y machos enteros. Estudio que difiere de otro realizado por Tadich et al (19) en caballos de raza chilena, en donde se encontró que los machos enteros tuvieron mayor frecuencia de aerofagia (p=0.001) que machos castrados y hembras, sugiriendo que esto podría estar más asociado al aislamiento social que al sexo. Además, en ese mismo estudio encontraron que los machos enteros que en un mismo período competían en rodeo chileno y eran utilizados como sementales tenían un mayor riesgo de presentar estereotipias que los que realizaban sólo una función (19). Con relación al balanceo, también llamado mal del oso (18) o bamboleo (16), la prevalencia encontrada si bien está dentro del amplio rango reportado en otros estudios realizados tanto en América del Sur como en el resto del mundo, la cual varía de 0.1% a 50% (3-6,8,10,13,14,16-

Muñoz - Prevalence of stereotypies in thoroughbred race horses differs from another done by Tadich et al (19) on Chilean horses, where stallions had a higher frequency of cribbing (p = 0.001) than castrated males and females, suggesting that this could be more related to social isolation than to sex. Furthermore, the same study found that stallions who both competed in the Chilean rodeo and were used as sires in the same period had a higher risk of displaying stereotypies than those engaged in only one function (19). In regard to weaving, also called swaying (2), the prevalence found is well within the range reported in other studies conducted in both South America and the rest of the world, which varies 0.1 to 50% (3-6,8,10,13,14,16-20), and is close to the average of other studies of Thoroughbred horses competing in Italy, Sweden, Australia, Chile and the United Kingdom, where reported frequencies are between 0.1 and 5% (4,6,8,20). Among the risk factors associated with weaving is heritability (4,11). In a study of 1035 Thoroughbreds in Italy where the weaving average was 2.5%, in some families it was 26% (4). Although not unanimous (10), other studies indicate that breed is a risk factor, the most prevalent breeds being Thoroughbred (11,13) and Arab (17), perhaps associated with their more reactive temperament (13) or with the athletic activity that they perform (6). It has also been observed in Thoroughbred competing that the prevalence is higher in horses stabled all day than those who had access to pasture for a few hours (8,21). Christie et al (3) found no association with access time to a pasture. They have also identified other risk factors such as not having access to a paddock (22), receiving less than 6.4 kg of forage per day (21) and being a brood mare mother without young (17). Furthermore, Ninomiya et al (13) suggest that it could be imitated by means of social learning; however, Clegg et al (27), discard that. With regard to gender, the results are contradictory because, like the present study, others indicate no other association with weaving (3,10,16,19,28). However, the study by Mills et al (9) conducted in 4061 horses indicated that the frequency of weaving was higher in females (2.13%) than in stallions (0.57%) and geldings (0.63%). Also, the study conducted by Tadich et al (20) on 743 competing Thoroughbreds reported that the frequency was higher in females (3.04%) and stallions (2.52%) than in geldings (0.48%). With regard to gender, there was a striking result from the study conducted by Behjahali et al (17) on breeding Arabian mares, which reported that 21.9% of broodmares displayed weaving, suggesting a relationship with sex. However, in that same study, of the 25 females with weaving, just 1 was foaling and the rest had no nursing young with them. The

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20), es cercana al promedio de otros estudios realizados en caballos FSC en competencia en Italia, Suecia, Australia, Chile y Reino Unido, los que reportan frecuencias entre 0.1 y 5% (4,6,8,20). Dentro de los factores de riesgo asociados al balanceo está la heredabilidad (4, 11) ya que en un estudio realizado a 1035 FSC en Italia en donde el promedio de balanceo era de 2.5%, en algunas familias éste era de 26% (4). Aun cuando, no hay unanimidad (10), otros estudios señalan que la raza es un factor de riesgo, siendo las razas con mayor prevalencia los FSC (11,13) y árabe (17), tal vez asociado con su temperamento más reactivo (13) o a la actividad deportiva que realizan (6). También, ha sido observado en FSC en competencia, que la prevalencia es mayor en caballos estabulados todo el día que los que tenían acceso a potrero algunas horas (8, 21). Christie et al (3), no encontraron asociación con el tiempo de acceso a un potrero. Además, han sido identificados otros factores de riesgo como: no tener acceso a un corral (22), recibir menos de 6.4 kg de forraje al día (21) y ser yegua madre sin cría al pie (17). Por otro lado, Ninomiya et al (13), sugieren que podría ser imitado por aprendizaje social; sin embargo, Clegg et al (27), lo descartan. Con relación al sexo, los resultados son contradictorios ya que al igual que en el presente estudio, otros señalan que no tendría asociación con la presentación de balanceo (3,10,16,19,28). Sin embargo, el estudio de Mills et al (9), realizado en 4061 caballos señaló que la frecuencia de balanceo fue mayor en hembras (2.13%) que en machos enteros (0.57%) y machos castrados (0.63%). También, el estudio realizado por Tadich et al (20), en 743 caballos FSC en competencia reportó que la frecuencia fue mayor en hembras (3.04%) y machos enteros (2.52%) que en machos castrados (0.48%). Con relación al sexo, llama la atención el resultado del estudio realizado por Behjahali et al (17) en un criadero de yeguas árabes, que reportó que el 21.9% de las yeguas madres presentaba balanceo, lo que sugiere alguna relación con el sexo. Sin embargo, en ese mismo estudio, de las 25 hembras con balanceo, sólo 1 estaba en período de lactancia y el resto no tenía cría al pie. La diferencia reportada entre las yeguas madres con cría y sin cría al pie, en ese estudio se podría explicar por un lado por el estado hormonal asociado a la lactancia o más probablemente por un aspecto social asociado al tener o perder el lazo madre-cría. Respecto a la edad, el estudio realizado por Waters et al (10), mostró que la edad promedio de inicio de balanceo era la semana 60. En otro estudio Christie et al (3), encontraron que la frecuencia

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reported difference between mares with or without a nursing foal in that study could be explained by the hormonal state associated with lactation or most likely by a social aspect associated with having or losing the mother-foal bond. Regarding age, the study conducted by Waters et al (10) showed that the average age of onset for weaving was week 60. In another study Christie et al (3) found that the frequency was higher in individuals older than 10 years of age, which they justified by noting that increasing age increases the likelihood of encountering stressful situations. However, other studies conducted on competing horses showed no differences associated with age (12,16,19). With regard to stall-walking, also called box-walking (2), the prevalence found was well within the range reported in other studies in both South America and the rest of the world, which varies between 0.2 and 8.8% (4-8,10,13,16-20), and is the fourth highest worldwide. But, the highest among the studies performed on Thoroughbred horses competing in Italy, Sweden, Australia, Chile and the United Kingdom reported frequencies from 0.2 to 3.9% (4,6,8,20,21). Although it is believed that the cause is associated with social needs (1), two studies have shown that there is a genetic predisposition (4,10) and that there has been a prevalence of stall-walking of 13% in some Thoroughbred families in circumstances where the average for the same study was 2.5% (4). However, other studies indicate that risk factors are also: lack of physical contact with other horses (11), no access to pasture (8,11,28) and breed, as it is reported to be more common in Thoroughbred (6,11) Arab (17) and Warm-blood horses, perhaps for being more reactive breeds (11). It is speculated that the cause may be motivation to keep moving, frustration or little environmental stimulation (1). With regard to sex, some studies indicate that this would not be a risk factor (9-11,19,22). Although Muñoz et al (16), in a study performed on 100 Chilean horses, found that it was significantly more frequent (p<0.05) in stallions (6%) than in females (0%), suggesting that it could be associated with the handling to which they are subjected in Chile because they remain stabled all day, without physical contact and sometimes without eye contact with other horses. On the contrary Tadich et al (20) observed that stall-walking in Thoroughbreds was more common in mares (3.72%) than in geldings (1.44%) and stallions (0.42%). Regarding age, the average age of onset for stall-walking is 64 weeks (10) and this should increase with age (1). However, in accord with the present study, no association between the prevalence of stall-walking and age (11,16,19,28) was found. Although, in this study, a decreasing

fue mayor en individuos mayores a 10 años, lo que justificaron, señalando que al aumentar la edad aumenta la posibilidad de encontrarse con situaciones estresantes. Sin embargo, otros estudios realizados en caballos en competencia no muestraron diferencias asociadas a la edad (12,16,19). Con relación al caminar en pesebrera, también llamado paseo circular en pesebrera (16) o caminar estereotipado (18), la prevalencia encontrada si bien estuvo dentro del rango reportado en otros estudios realizados tanto en América del Sur como en el resto del mundo, la cual varía entre 0.2% y 8.8% (4-8,10,13,16-20), es la cuarta más alta a nivel mundial. Pero, la más alta entre los estudios realizados en caballos FSC en competencia en Italia, Suecia, Australia, Chile y Reino Unido que reportan frecuencias de 0.2% a 3.9% (4,6,8,20,21). Aún cuando, se cree que su causa está asociada a necesidades sociales (1), dos estudios han mostrado que existe una predisposición genética (4,10) ya que se ha observado una prevalencia de caminar en pesebrera de 13% en algunas familias de FSC, en circunstancias que el promedio en ese mismo estudio era de 2.5% (4). No obstante, otros estudios señalan que también son factores de riesgo: la falta de contacto físico con otros caballos (11), no tener acceso a potrero (8, 11, 28) y la raza ya que se reporta que es más frecuente en caballos FSC (6,11), árabes (17) y de sangre templada, tal vez por ser razas más reactivas (11), por lo que se especula que las causas podrían ser una mayor motivación a seguir moviéndose, frustración o poca estimulación ambiental (1). Con relación al sexo, algunos estudios señalan que éste no sería un factor de riesgo (9-11, 19, 22). Aun cuando Muñoz et al (16), en un estudio realizado en 100 caballos de raza chilena, encontraron que fue significativamente más frecuente (p<0.05) en machos enteros (6%), que en hembras (0%), sugiriendo que podría estar asociado al manejo al que son sometidos los machos enteros en Chile, ya que permanecen estabulados casi todo el día, sin contacto físico y a veces tampoco visual con otros caballos. Contrariamente Tadich et al (20), observaron que el caminar en pesebrera en caballos FSC fue más frecuente en yeguas (3.72%), que en machos castrados (1.44%) y machos enteros (0.42%). Con relación a la edad, el promedio de inicio de caminar en pesebrera en caballos es 64 semanas (10) y ésta debería aumentar con la edad (1). Sin embargo, en coincidencia con el presente estudio no se encontró asociación entre la prevalencia de caminar en pesebrera y la edad (11,16,19,28), aún cuando, en este estudio se observó una tendencia de disminución de esta estereotipia

Muñoz - Prevalence of stereotypies in thoroughbred race horses trend was observed for this stereotypy in horses 5 years of age or more, which suggests that horses that display stall-walking are discarded due to poor performance. It is suggested that the prevalence of stereotypies in general and stall-walking in horses at CHC, the highest reported in competing Thoroughbred horses, is a consequence of the stressful handling they undergo at the CHC, which does not allow the expression of normal social, nutritional, sexual and kinetic behavior. On the other hand, not finding an association between the presence of stereotypies and sex could result from a similar handling of individual horses without general sexual experience, or maternal experience in the case of females. Finally, not finding a significant increase in stereotypies associated with age could explain why a significant percentage of horses with stereotypies are discarded from competition for low performance, which apparently occurs mainly in horses that display stall-walking. In conclusion, Thoroughbred horses at the CHC have a high prevalence of classic stereotypies, mainly stall-walking.

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en caballos de 5 años o más, lo que hace pensar que los caballos con caminar en pesebrera son descartados por mal rendimiento. Se sugiere que el hecho de que la prevalencia de estereotipias en general y de caminar en pesebrera en los caballos del CHC, sea la más alta reportada en caballos FSC en competencia, es consecuencia del manejo estresante al que son sometidos los caballos en el CHC, lo que no permite la expresión normal de su comportamiento social, alimenticio, sexual y cinético. Por otro lado, el no encontrar asociación entre la presencia de estereotipias y el sexo puede ser consecuencia de un manejo similar en individuos sin experiencia sexual en general y experiencia materna en el caso de las hembras. Finalmente, el no haber encontrado un aumento significativo de estereotipias asociado a la edad se podría explicar porque un porcentaje importante de los caballos con estereotipias son descartados de la competencia por bajo rendimiento, lo que en forma aparente ocurre principalmente en caballos que presentan caminar en pesebrera. En conclusión los caballos FSC del CHC presentan una alta prevalencia de estereotipias clásicas, principalmente caminar en pesebrera.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4269-4276, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Serological survey for equine viral arteritis in several municipalities in the Orinoquia region of Colombia Monitoreo serológico de arteritis viral equina en municipios de la Orinoquia, Colombia Agustín Góngora O,1* Ph.D, María Barrandeguy,2 Ph.D, Karl Ciuoderis A,3 MVZ. Universidad de los Llanos, School of Animal Sciences, Reproduction and Animal Genetics Investigation Group, Villavicencio, Km. 12 Vía Puerto López, Meta, Colombia. 2Universidad del Salvador, Infectious Diseases Department, Veterinary Career and Equine Virus Laboratory, Institute of Virology CICVyA INTA. Av. Callao y Córdoba (C1023AAB) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 3WisconsinMadison University, Department of Pathobiological Sciences, Veterinary Medicine School, Madison, WI 53706, USA. *Correspondence: agongora@unillanos.edu.co 1

Received: October 2013; Accepted: April 2014.

ABSTRACT Objective. The goal of this study was to determine the current status of the Equine Arteritis virus (EAV) in horse populations in the Orinoquia region of Colombia. Materials and methods. A transversal study was conducted by serological survey of equine (n=100) from 11 municipalities of the Colombian Orinoquia region. Serum samples were tested by virus seroneutralization assay according to the guidelines provided by the World Organization for Animal Health. Results. After testing was carried out no positives samples to EAV were found in the population analyzed. Conclusions. Although the sample size of the population screened in this study does not represent the total equine population size for the region or the country, data obtained has shown the absence of EAV infection in these animals. However, a wider study area including other regions of the country, with a feasible statistical design, would determine if this infection continues to be an exotic disease for Colombia. Key words: Antibodies, epidemiology, prevalence, virus (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivo. Determinar la condición sanitaria relativa a la infección con el virus de la arteritis (VAE) en equinos de la Orinoquia, Colombia. Materiales y métodos. Se realizó un muestreo serológico transversal en equinos (n:100) provenientes de 11 municipios, de la región de la Orinoquia, Colombia. Los sueros fueron analizados por la técnica de seroneutralización viral de acuerdo con lo recomendado por la Organización Internacional de Sanidad Animal (OIE). Resultados. No se identificaron reactores al VAE en la población analizada. Conclusiones. Si bien la población estudiada no representa el total de los equinos de la región, ni del país, los datos obtenidos evidencian la ausencia de infección por VAE en estos animales. Un estudio ampliado, estadísticamente diseñado, incluyendo otras regiones del país permitiría determinar fehacientemente si esta infección continua siendo exótica para Colombia. Palabras clave: Anticuerpos, epidemiología, prevalencia, virus (Fuente: DeCS). 4269

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The arteritis virus is a widely diffused infectious disease around the world that, in addition to affecting equines, affects donkeys, mules and zebras. It is produced by a RNA virus of the Arteriviridae family of the Nidoviral order that includes three other virus; the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRVS), the simian hemorrhagic fever virus (SHFV) and the murine lactate dehydrogenase elevating virus (LDV) (1).

La arteritis viral es una enfermedad infecciosa de amplia difusión mundial que además de los equinos, afecta asnos, mulas y cebras. Es producida por un virus RNA de la familia Arteriviridae del orden Nidovirales que incluye otros tres virus, el virus del síndrome respiratorio reproductivo porcino (PRRVS), el virus de la fiebre hemorrágica del simio (SHFV) y el virus del aumento de la lactato deshidrogenasa murina (LDV) (1)

The name of the disease is associated with inflammatory lesions in the veins, especially the arterioles (2), and has been reported in North And South America, Europe, Asia, Australia and Africa, with the exception of Iceland and Japan (3), and more recently in New Zealand (4). Seroprevalence varies considerably from country to country and among breeds (5). The infection can be asymptomatic (in the majority of cases) or present several symptoms such as fever, loss of appetite, nasal secretion, and conjunctivitis, which are similar to those caused by other respiratory virus (influenza or equine herpes virus 1 and 4). Some other clinical signs can be present such as pruritus, edema of the scrotum or mammary glands, and abortions (6). After an acute infection in sexually mature males, between 30-50% of the animals can maintain a persistent infection and the virus is expelled with semen (7). These animals become the principal disseminators of the virus, whether in the short or medium term or for the rest of their lives, becoming the greatest threat to free populations (5). The World Organization for Animal Health (OIE) included it in the unique list of diseases of compulsory notification for land and marine animals since its presence restricts commerce between countries (8).

El nombre de la enfermedad se asocia con las lesiones inflamatorias que ocasiona a nivel de los vasos sanguíneos, especialmente las arteriolas (2), ha sido reportada en Norte y Suramérica, Europa, Asia, Australia y Africa con excepción de Islandia y Japón (3) y más recientemente Nueva Zelanda (4). La seroprevalencia varia considerablemente entre países y entre razas (5). La infección puede ser asintomática (en la mayoría de los casos) o presentar diversos signos clínicos, como fiebre, inapetencia, secreción nasal, conjuntivitis que son similares a los ocasionados por otros virus respiratorios (influenza o herpesvirus equino 1 y 4). También pueden presentarse otros signos clínicos como prurito, edema de miembros, escroto o glándula mamaria, y abortos (6). Después de una infección aguda en machos sexualmente maduros, entre el 30-50% de los animales pueden permanecer infectados persistentemente y el virus es eliminado por semen (7). Estos animales, se convierten en los principales diseminadores del virus ya sea por un período corto, de mediano plazo o por el resto de la vida, constituyéndose en la mayor amenaza para las poblaciones libres (5). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), la incluyó en la lista única de enfermedades de notificación obligatoria para animales terrestres y acuáticos debido a que constituye una limitante para el comercio entre países (8).

Colombia is not presently aware of the presence of this disease; however, identification of herpes virus 1 and 4 reactors (9) that presents clinical symptoms similar to EAV, importing animals from countries where the disease has been reported in addition to the possible illegal entry of persistently infected animals over the extensive land borders increases the probability that this infection is present in the country and is not being diagnosed by the health authorities and veterinarians.

En la actualidad, en Colombia no se tiene conocimiento de la presencia de esta enfermedad; sin embargo, la identificación de reactores a los herpes virus 1 y 4 (9) que presentan cuadros clínicos similares a la EAV, la importación de animales de países en donde la enfermedad ha sido reportada, más el posible ingreso de animales infectados persistentemente de manera ilegal a través de la extensa frontera terrestre, aumentan la probabilidad de que esta infección se encuentre en el país y no esté siendo diagnosticada por las autoridades sanitarias y el cuerpo médico veterinario.

In the Orinoquia region equines are a valuable resource for managing extensive livestock and more recently due to the popularity of sporting

Para la región de la Orinoquia los equinos representan un valioso recurso para el manejo de la ganadería extensiva y más recientemente, por

Góngora - Serological survey for equine viral arteritis

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and recreational activities which have caused a notable increase in the equine population. The objective of this study was to determine the presence of EAV serological reactors in the equine population of this region that constitutes 38% of the Colombian territory.

el auge en las actividades deportivas y recreativas, lo que ha incrementado notablemente la población equina. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de reactores serológicos a la EAV en la población equina de esta región que constituye el 38% del territorio colombiano.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Animals. A transversal sampling was done with a selected group of 100 equines from the municipalities of Villavicencio (n=19), San Martin (n=10), Restrepo (n=10), Puerto López (n=10), Puerto Lleras (n=10), Yopal (n=10), Arauquita (n=7) Arauca (n=3), Puerto Gaitán (n=10), San José del Guaviare (n=10) and Guamal (n=1), (Figure 1). The animals came from 22 farms and the following breeds: Silla Argentina 10 (10%), Quarter Horse 12 (12%), criollo 74 (74%), mule 3 (3%) and Percheron 1 (1%). Distribution by sex of the adult animals was 47 males and 53 females. The municipalities that the animals came from are found in the 4 departments of the subregion known as Los Llanos Orientales.

Animales. Se realizó un muestreo transversal con selección de individuos por conveniencia en 100 equinos, provenientes de los municipios de Villavicencio (n=19), San Martin (n=10), Restrepo (n=10), Puerto López (n=10), Puerto Lleras (n=10), Yopal (n=10), Arauquita (n=7) Arauca (n=3), Puerto Gaitán (n=10), San José del Guaviare (n=10) y Guamal (n=1), (Figura 1). Los animales provenían de 22 fincas y pertenecían a las razas Silla Argentina 10 (10%), Cuarto de Milla 12 (12%), criollo 74 (74%), mular 3 (3%) y Percherón 1 (1%). La distribución por sexo en animales adultos fue 47 machos y 53 hembras. Todos los municipios de procedencia de los animales se encontraban ubicados en 4 departamentos en la subregión conocida como los Llanos orientales.

5 ml of blood from each animal was taken from the jugular vein in ad-hoc vacuum tubes (vacutainer ® ), after clot retraction it was centrifuged at 3500 rpm for 5 minutes, the resulting serum was fractioned by duplication in aliquots of 1 ml into plastic Ependorff® tubes and maintained at -70°C until processed.

De cada animal se obtuvieron 5 ml de sangre de la vena yugular en tubos ad-hoc con vacío (vacutainer®), luego de la retracción del coagulo se centrifugaron a 3500 rpm por 5 minutos, el suero obtenido fue fraccionado por duplicado en alícuotas de 1 ml en tubos plásticos tipo Ependorff® y mantenidos a -70°C hasta su procesamiento.

Viral neutralization test. The serum was processed at the Institute of Virology - Veterinary and Agronomic Investigation Center (INTAArgentina) using the microseroneutralization technique for EAV virus (Arvac vaccination s trai n) . E q u i n e s e r u m s o f i n t e rnati onal reference were used as positive and negative controls, provided by Dr. P. Timoney from The Gluck Equine Research Center (Kentucky University, USA) following the procedure described in the OIE manual (10). Briefly, the equine serums were inactivated at 56°C for 30 minutes and were then diluted in a cellular culture (MEM E) in base two dilutions from 1:2 to 1:256 and incubated for 1 hour at 37°C with a virus suspension that contained 100 DICT 50%/ml. After incubation a cellular suspension was added that contains 10000 cells (RK13) per ml. All this was done in microplates for cellular cultures of 98 plates. Controls were carried out to confirm the title of the virus and a strong positive control, a weak one, and a negative serum were incorporated into the study. The reaction was read in an inverted microscope at 100 magnification where the cytopathic effect produced by the non-

Figure 1. EAV sampling areas in Orinoquia. 1: Arauca, 2: Arauquita, 3: Yopal, 4: Puerto Gaitán, 5: Puerto López, 6: Restrepo, 7: Villavicencio, 8: San Martín, 9: Guamal, 10: Puerto Lleras, 11: San José del Guaviare.

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neutralized virus was determined. The antibody title of a determined serum was expressed as the inverse of the maximum dilution of serum that totally “neutralized” the 100 DICT 50%/ ml of viral equine Arteritis virus.

RESULTS All of the analyzed samples (100/100) were negative for seroneutralization for detecting EAV antibodies.

DISCUSSION The results obtained infer that EAV is not present in the equine population in the region, this being the first study done in Colombia that tries to indirectly determine the presence of EAV. In spite of the number of breeds included in the sampling and the varied origin of the animals, the absence of reactors indicates that these animals have not been in contact with the virus. Similarly, due to the small amount of animals sampled, the need for a new study in a statistically determined population that allows a greater certainty of the EAV health situation in the country is considered. In Colombia, importing equines and semen has been continually increasing in recent years. In 2008 1.212 animals and 400 semen doses were imported, and in 2009 1.436 animals and 1.548 semen doses were imported, in 2010 1,004 animals were imported. This tendency was maintained through 2011-2013, with the entry of 1.347 animals, the majority of them for competitions, recreation or breeding (Table 1), (11). The Table 1. Equines imported into Colombia by country of origin and number of animals during the period 2011-2013 (ICA, 2013). (11) Country of origin

Number of animals

Destination

United States*

547

Breeding

Argentina*

436

Breeding, work horses

Spain*

Reproducción, Competition and sport

Belgium*

106

Breeding

Holland*

Breeding

Portugal

Breeding, Performance

France*

Breeding

Chile

Competition and sport

Puerto Rico

Competition and sport

Venezuela

Competition and sport

Mexico Ecuador

Competition

Breeding

Peru

Breeding

Aruba

Competition and sport

Costa Rica

Competition and sport

Uruguay

Breeding

Total

1360

*Countries where EAV outbreaks have been reported

Prueba de neutralización viral. Los sueros se procesaron en el Instituto de Virología-Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (INTA-Argentina), mediante la técnica de microseroneutralización frente a virus de EAV (cepa vacunal-Arvac). Se utilizaron como control positivo y negativos sueros equinos de referencia internacional provistos por el Dr. P. Timoney, del Gluck Equine Research Center (Universidad de Kentucky-USA), siguiendo el procedimiento descrito en el manual de la OIE (10). Brevemente, los sueros equinos fueron inactivados a 56°C durante 30 minutos y posteriormente diluidos en medio de cultivo celular (MEM E) en diluciones de base dos, desde 1:2 hasta 1:256 e incubados durante 1 hora a 37°C con una suspensión de virus que contenia 100 DICT 50%/ml. Luego de la incubación se agrega una suspensión celular que contiene 10.000 células (RK13) por ml. Todo esto se realiza en microplacas para cultivos celulares de 96 pocillos. Se realizan controles para confirmar el título del virus y se incorporan al ensayo, un control positivo fuerte, uno débil y un suero negativo. La reacción se leyó en microscopio invertido a 100 aumentos donde se determinó el efecto citopático producido por el virus no neutralizado. El título de anticuerpos de un determinado suero se expresó como la inversa de la máxima dilución de suero que “neutralizó” totalmente las 100 DICT 50%/ml de virus de Arteritis viral equina.

RESULTADOS El total de muestras analizadas (100/100) resultaron negativas por seroneutralización para la detección de anticuerpos contra el EAV.

DISCUSIÓN Los resultados obtenidos permiten inferir que el EAV no ha circulado en la población equina de la región, siendo este el primer estudio realizado en Colombia que intenta determinar de manera indirecta la presencia del EAV. A pesar del número de razas incluidas en el muestreo y la variada procedencia de los animales, la ausencia de reactores indica que estos animales no han estado en contacto con el virus. Asimismo, debido al reducido número de animales muestreados, se plantea la necesidad de un nuevo estudio en una población estadísticamente determinada que permita conocer con mayor certeza la situación sanitaria relativa a EAV en el país. En Colombia, la importación de equinos y semen en los últimos años ha venido en constante aumento. En 2008 se importaron 1.212 animales y 400 dosis de semen, en 2009 fueron 1.436 animales y 1.548 dosis de semen, en el 2010 se importaron 1.004 animales. Esta tendencia se mantuvo para

Góngora - Serological survey for equine viral arteritis introduction of imported animals occurred by air at the El Dorado airports (Bogota) and José María Córdoba (Rionegro-Antioquia) and their final destination were the departments of Cundinamarca and Antioquia, where the greatest population of equines in the country is, far from where this study was performed. In Colombia a large number of imported animals or frozen semen comes from countries that have reported EAV outbreaks, such as Argentina (12), the European Union (13), France, (14), Spain (15), Holland (16) and Belgium (17), which carries the potential risk of introducing persistently infected animals or infected frozen semen. An example that illustrates this situation is the entry of the virus into Argentina through frozen semen from Holland on more than one occasion (12, 18). In another example the first outbreak occurred in the United Kingdom was due to importing a horse from Eastern Europe that had the virus (19). An EAV outbreak in the Normandy region in France (20) had a similar origin. In Italy an outbreak was reported associated with a horse imported from Germany that was seronegative, but after remaining for a time on the farm it presented seroconversion and later the virus was isolated from the semen (21). Lastly, the most recent outbreak in the United Kingdom occurred due to the entry of an animal infected in a breeding center (22). Another aspect that merits analysis is the increase in the national commercialization of semen. Although the requirements to register technical units related to verifying the quality of seminal material and auditing semen and embryo production centers were established by means of ICA’s Resolution 01426 from 2002 (23), said regulation is not complied with since there are few artificial insemination (AI) and embryo transfer centers. Resolution 02820 of 2001 regulates the technical control of producing, importing, and commercializing semen and embryos (24). The above shows that a large part of obtaining and commercializing semen is done among farms, without the supervision of health authorities. This fact suggests the need to constantly monitoring donor animals, which should be done with a permanent diagnostic support, whether through the official sanitary authorities or universities. In this respect, certain countries require semen donor animals to be seronegative or viral isolation tests performed on the semen for those that are seropositive (3), requirements that are not met by the breeders in the country.

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el 2011-2013, con un ingreso de 1.347 animales, la mayoría con destino a la competencia, la recreación o la reproducción (Tabla 1), (11). El ingreso de los animales importados ocurrió vía aérea por los aeropuertos El dorado (Bogotá) y José María Córdoba (Rionegro-Antioquia) y su destino final fueron los departamentos de Cundinamarca y Antioquia, en donde se concentra la mayor población equina del país, lugares distantes al sitio en donde se realizó este estudio. En Colombia, un gran número de animales importados y/o semen congelado provienen de países en donde se han reportado brotes de EAV, como Argentina (12), EU (13), Francia (14), España (15), Holanda (16) y Bélgica (17), lo cual conlleva un riesgo potencial de introducir animales persistentemente infectados, o semen congelado infectado. Un ejemplo que ilustra esta situación, es el ingreso del virus a Argentina a través de semen congelado proveniente de Holanda en más de una oportunidad (12,18). Otro ejemplo, el primer brote ocurrido en el Reino Unido por la importación de un caballo portador del virus desde Europa del Este (19). Similar origen tuvo un brote de EAV en la región de Normandía en Francia (20). En Italia se reportó un brote el cual se asoció con un caballo importado desde Alemania que había sido seronegativo, pero que luego de permanecer algún tiempo en la finca presentó seroconversión y posteriormente se aisló el virus del semen (21). Por último, el brote más recientemente en el Reino Unido ocurrió por el ingreso de un animal infectado a un criadero (22). Otro aspecto que amerita el análisis, es el aumento de la comercialización del semen a nivel nacional. Si bien mediante la resolución 01426 de 2002 del ICA (23), se establecen los requisitos para el registro de las Unidades técnicas relacionadas con la verificación de la calidad del material seminal y la auditoria de los centros de producción de semen y embriones, dicha reglamentación no se cumple puesto que son pocas las centrales de inseminación artificial (IA) y transferencia de embriones. Igualmente la resolución 02820 de 2001 reglamenta el control técnico de la producción, importación y comercialización de semen y embriones (24). Lo anterior evidencia que gran parte de la obtención y comercialización del semen se realiza entre fincas, sin la supervisión de las autoridades sanitarias. Este hecho permite sugerir un monitoreo constante de los animales donantes, que debería estar acompañado por un permanente apoyo diagnóstico, ya sea por parte de las autoridades sanitarias oficiales o las Universidades. A este respecto, ciertos países exigen que los animales donantes de semen sean seronegativos o se realicen pruebas de aislamiento viral en el semen de los que resultan

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Within the breeds included in this study, samples come from the municipality of San Martín, belonging to the Silla Argentina breed. In 2009 1000 horses from this country were imported, however in 2010 ICA temporarily suspended importations for 6 months due to a state of alert concerning EAV outbreaks (25). In spite of this precedent, there was no evidence of the presence of virus reactors in these imported animals. The absence of reactors in this group also shows that these animals had not been vaccinated. Another area of concern was along the extensive border with Venezuela, close to the Arauca and Arauquita municipalities where 10% of the samples were from; however, the results were also negative. The need for new studies in other municipalities along the border is seen, since the presence of the virus in the neighboring country is not clear. A preliminary study of 1008 samples in 5 states in the center of the country showed a prevalence of 2.48% (26). The equine population in Colombia is estimated to be at about 1.533.432 animals (27); therefore the presence of this disease would be devastating for the national industry. In countries that have suffered the effects of this disease the direct economic loss has been associated with abortions, death of young animals, loss in the commercial value of the breeders, reduction in the demand for semen, vaccination costs, cancelation of equine events and international markets (3,28). There is a need for active surveillance regarding the presence of this disease in the country. There is no evidence of EAV infection in the analyzed population, which is to say that these animals have not had contact with the EAV virus. These results are very encouraging; however new studies are required in a wider population that can be extended to other regions of the country to confirm the state of this exotic disease in Colombia. Conflict of interests. The authors declare that there is no conflict of interests. Acknowledgement Dra. Piedad Cristina Rivas from the Universidad de la Salle for supporting in obtaining the samples. María Roció Parra Molina for managing and preserving the samples.

seropositivos (3) exigencias que no se cumplen con los reproductores en el país. Dentro de las razas incluidas en el estudio, las muestras que provenían del municipio de San Martín pertenecían a la raza Silla Argentina, con relación a esto, en el año 2009 se importaron 1.000 equinos de este país, no obstante, en el 2010 las importaciones fueron suspendidas temporalmente por el ICA durante 6 meses, debido al estado de alerta como resultado de un brote de EAV (25). A pesar de este antecedente, no se evidenció la presencia de reactores al virus en estos animales importados. La ausencia de reactores en este grupo señala además, que estos animales tampoco habían sido vacunados. Otro motivo de preocupación, lo representaba la extensa frontera con Venezuela, cercana a esta, se ubican los municipios de Arauca y Arauquita de donde procedía el 10% de las muestras; sin embargo, los resultados también fueron negativos. Surge así la necesidad de nuevos estudios en otros municipios de frontera ya que es incierta la presencia del virus en el país vecino. Un estudio preliminar en 1.008 muestras de 5 estados del centro del país, arrojó una prevalencia de 2.48% (26). La población equina en Colombia se estima en 1.533.432 animales (27), por tanto la presencia de esta enfermedad sería devastadora para la industria nacional. En los países que han padecido los efectos de esta enfermedad, las pérdidas económicas directas se ha asociado con abortos, muerte en animales jóvenes, perdida en el valor comercial de los reproductores, disminución en la demanda de semen, gastos de vacunación, cancelación de eventos ecuestres y de mercados internacionales (3,28). De allí que se requiere una vigilancia activa sobre la presencia de esta enfermedad en el país. Se concluye que no hay evidencia de infección con EAV en la población analizada, es decir estos animales no han tenido contacto con el virus de EAV. Estos resultados son muy alentadores; sin embargo, se requieren nuevos estudios en una población más amplia, que puede hacerse extensiva a otras regiones del país para confirmar el estado de esta enfermedad exótica en Colombia. Conflicto de intereses. Los autores declaran no tener conflicto de intereses. Agradecimientos Dra. Piedad Cristina Rivas Universidad de la Salle por el apoyo en la obtención de las muestras. Licenciada María Roció Parra Molina por el manejo y conservación de las muestras.

Góngora - Serological survey for equine viral arteritis

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4277-4288, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Thrombocyte indices in dogs infected with Ehrlichia canis and Anaplasma phagocytophilum Índices de trombocitos en perros infectados con Ehrlichia canis y Anaplasma phagocytophilum Funda Özata, M.Sc, Kerem Ural, Ph.D. University of Adnan Menderes, Faculty of Veterinary, Department of Internal Medicine. Isikli, 09016. Aydin, Turkey. *Corresponding: uralkerem@gmail.com

Received: January 2014; Accepted: July 2014.

ABSTRACT Objectives. In the present study alterations in trombocyte numbers and trombocyte indices were investigated in 51 dogs naturally infected with E. canis and/or A. phagocytophilum. Achieved results were compared to those of 20 healty dogs comprising control group. Materials and methods. Naturally occuring vector borne diseases were diagnosed by use of a canine point-of-care ELISA kit (Snap 4Dx, Idexx). Dogs were enrolled into 3 groups as follows; II. group involved A. phagocytophilum infected dogs (n=10), III. group (n=13) E. canis+ A. phagocytophilum co-infected, and IV. group (n=28) E. canis infected dogs. Healthy controls (n=20) were enrolled in group I. Results. Mean PLT counts were significantly decreased in II., III. and IV. groups (159.6±63.5, 142.3±44.3, 148.7±33.5, respectively) in comparison to control group (370.4±28.6) (p≤0.01). Mean PCT values in groups II., III. and IV. (0.1530±0.590, 0.1531±0.0441, 0.1450±0.314, respectively) were significantly decreased in contrast to control group (0.3695±0.0283) (p≤0.01). Between PLT and PCT values, statistically significant positive correlation (p≤0.01) (r=0.988, 0.990 and 0.981, respectively) was evident among groups II., III. and IV. Conclusions. Infected dogs showed significant alterations (p≤0.01) among mean PLT and PCT values and a positive correlation was evident between those 2 parameters (p≤0.01), whereas alterations on mean MPV and PDWc were not statistically significant. Finally it was suggested that according to the aforimentioned results, PLT and PCT values may be used as valuable parameters for diagnosis and probably for monitorization and prognosis in infected dogs with Ehrlichiosis and/or Anaplasmosis. Key words: Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis,indices, thrombocyte (Source: CAB).

RESUMEN Objetivos. Comparar las alteraciones en el número de trombocitos y en los índices de trombocitos en perros infectados naturalmente con E. canis y A. phagocytophilum. Materiales y métodos. Los perros fueron distribuidos en cuatro grupos: Grupo I; perros sanos (n=20), Grupo II; perros infectados con A. phagocytophilum (n=10), Grupo III; perros infectados con E. canis + A. phagocytophilum (n=13) y grupo IV; perros infectados con E. Canis (n=28). Resultados. Los recuentos de PLT se redujeron significativamente (p≤0.01) en los grupos II, III y IV (159.6±63.5, 142.3±44.3, 148.7±33.5, respectivamente) en comparación con el grupo control (370.4±28.6). La media de los valores de PCT en los grupos II, III y IV fue de 0.1530±0.590, 0.1531±0.0441 y 0.1450±0.314 respectivamente, cuyas reducciones fueron significativas (p≤0.01) en contraste con el grupo control (0.3695±0.0283). Entre los valores de PLT y el PCT la correlación fue positiva (r =0.988) y significativa (p≤0.01), 0.990 y 0.981, respectivamente, entre los grupos II, III y IV. Conclusiones. Los perros infectados 4277

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mostraron alteraciones significativas (p≤0.01) entre PLT y los valores del PCT, así como una correlación positiva entre esos dos parámetros (p≤0.01), mientras que las alteraciones de MPV y PDWc no fueron significativas. Se sugiere que de acuerdo con los resultados obtenidos, los valores de PLT y el PCT se pueden utilizar como parámetros valiosos para el diagnóstico y probablemente, para el monitoreo y el pronóstico en perros infectados con la Ehrlichiosis o la Anaplasmosis.

Palabras clave: Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, indices, trombocitos (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The Ehrlichial organisms Ehrlichia canis (E. canis) and Anaplasma phagocytophilum (A. phagocytophilum) are both tick-borne obligate intracellular pathogens, presenting a tropism for leukocytes (1). Infection with the latter pathogens is characterized by thrombocytopenia, fever, depression, anorexia, and other relevant signs. Dogs are involved host range of E. canis and A. phagocytophilum (1).

Los organismos de Ehrlichia canis (E. canis) y Anaplasma phagocytophilum (A. phagocytophilum) son ambos patógenos intra-celulares producidos por garrapatas, presentando un tropismo para leucocitos (1). La infección con estos patógenos se caracteriza por trombocitopenia, fiebre, depresión, anorexia y otros signos relevantes. Los perros son una gama de huéspedes de E. canis y A. phagocytophilum (1).

Previous data support that platelet count may be a reliable screening test for canine monocytic ehrlichiosis (2) and canine granulocytic ehrlichiosis (3, 4) and that the severity of thrombocytopenia may increase the reliability of diagnosis (2). Albeit the diagnostic and prognostic importance of thrombocytopenia, alterations in values for platelet indices involving plateletcrit (PCT) and mean platelet volume (MPV) in response to aforementioned pathogens are still less recognized and underestimated because of scarcity information. Therefore the aim of the present study was to evaluate platelet, besides erythrocyte counts with their indices concerning cell volume and distribution, in naturally occurring E. canis and A. phagocytophilum infections among dogs in Turkey.

Estadística anterior sirve de base de que el conteo de plaquetas puede ser una prueba confiable para cribar ehrlichiosis monolítica canina (2) y ehrlichiosis granulo citica canina (3, 4) y que la severidad de la trombocitopenia puede aumentar la fiabilidad del diagnóstico (2). A pesar de la importancia diagnóstica y de prognosis de la trombocitopenia, alteraciones en los valores para índices de plaquetas que conllevan plateletcrit (PCT) y el volumen medio de plaquetas (MPV) en respuesta a los patógenos antes mencionados son todavía menos reconocidos y subestimados debido a la escasez de información. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio era el evaluar plaquetas, además de conteo de eritrocitos con sus índices relativos a volumen y distribución de células, en infecciones de E. canis y A. phagocytophilum que ocurren naturalmente en los perros en Turquía.

MATERIALS AND METHODS Study design and subjects. The present study was enrolled among 71 dogs (32 male/39 female; aged from 1 to 9 years) reffered to the Adnan Menderes University, Faculty of Veterinary, Department of Internal Medicine and to those of privately owned small animal clinics in located in Aydın and İzmir provinces. The animals from different breeds (8 Terrier, 7 Golden Retriever, 4 Cocker spaniel, 3 Rottweiler, 2 Turkish shepherd dog, 1 for each Doberman, German shepher dog, Jack Russel, Samoyed, Pointer, Setter, Daschund, Siberian Husky, and 39 crossbred) involved were selected to those of presenting clinical signs compatible with a suspectible Ehrlichial infection such as anorexia, weight loss, fever, generalized lymphadenopathy, splenomegalia, muscle weakness, petechiae and ecchymosis,

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño del estudio y sujetos. El presente estudio fue realizado en 71 perros (32 machos/39 hembras; con edades de 1 a 9 años) remitidos a la Universidad Adnan Menderes, Facultad de Veterinaria. Departamento de Medicina Interna y aquéllos de pequeñas clínicas veterinarias de pequeños animales de propiedad privada localizadas en las provincias de Aydın e İzmir. Los animales, de diferentes razas (8 Terrier, 7 Golden Retriever, 4 Cocker spaniel, 3 Rottweiler, 2 perros Pastor Turco, 1 por cada Doberman, perro Pastor alemán, Jack Russel, Samoyedo, Pointer, Setter, Daschund, Siberian Husky, y 39 de razas mixtas) que fueron involucradas fueron seleccionados para aquéllos que presentaron signos clínicos compatibles con una posible infección de Ehrlichia, tales como anorexia, pérdida de peso, fiebre,

Özata - Thrombocyte indices in dogs infected with E. canis and A. phagocytophilum epistaxis, limb edema and/or polyarthritis. The study protocol was approved by the institutional laboratory animals ethics committee of Adnan Menderes University HADYEK (with no: B.30.2.ADÜ.0.00.00.00 - 0.50.0.4-2010-077). Besides informed written consent was obtained from all of the dogs owners prior to enrolment of the dogs participated in study. The dogs participated in the study were selected to those of 200 dogs (with or without thrombocytopenia) by use of a canine point-of-care ELISA kit for diagnosis of naturally occuring vector borne diseases (Snap 4Dx, Idexx). Formation of study groups. Dogs with naturally occuring Ehrlichiosis and/or Anaplasmosis (n=51) were enrolled into 3 groups as follows; II. group involved A. phagocytophilum infected dogs (n=10) (7 crossbred, 1 for each Terrier, Setter and Golden Retriever), III. group (n=13) E. canis+ A. phagocytophilum co-infected (13 crossbred), and IV. group (n=28) E. canis infected dogs (10 crossbred, 5 Terrier, 3 Golden Retriever, 2 for each Rottweiler, Turkish shepherd dog and Cocker Spaniel, 1 for each Doberman, German shepherd dog, Jack Russel Terrier and Samoyed). Healthy controls (n=20), as detected by complete physical examination and were detected to be non-infected within the test kits, were enrolled in group I. All dogs enrolled were selected to those of untreated dogs against aformentioned diseases. All dogs underwent complete physical examination and related data were recorded along within necessary labaoratory analysis. Written consent was obtained from all of the dogs owners prior to enrolment of the dogs participated in study. Haematological and Biochemical examinations. Blood samples were withdrawn from vena cephalica antebrachii into anticoagulated (EDTA) tubes. Complete blood counts were performed on referral within Abacus Junior Vet hematology analyzer with special reference to thrombocyte indices Mean Plateled Volume (MPV), Plateletcrit (PCT) and Red Distribution Width (RDW). Serological analysis. Each sample was tested by use of an ELISA kit (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, USA) in an attempt to diagnose antigen of Dirofilaria immitis, and antibodies against Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, and Borrellia burgdorferi according to the protocol listed in the product insert. This assay detects antibodies reacting to 2 immunodominant proteins (p30 and p30-1) of E. canis, immunodominant protein (msp2) of A. phagocytophilum and the C6 peptide for B. burgdorferi, along with a circulating carbohydrate

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linfoadenopatía generalizada, crecimiento del bazo, debilidad muscular, petequia y equimosis, epistaxis, edema de los miembros y/o poli artritis. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética de laboratorio institucional de animales de la Universidad de Adnan Menderes HADYEK (con el número: B.30.2.ADÜ.0.00.00.00 - 0.50.0.42010-077). Además se obtuvo el consentimiento informado escrito, de todos los propietarios de los perros antes de meterlos al estudio. Los perros que participaron en el estudio fueron seleccionados de aquéllos 200 perros (con o sin trombocitopenia) mediante el uso de un kit de prueba canina ELISA para el diagnóstico del vector de enfermedades que ocurren naturalmente (Índice Snap 4Dx). Formación de grupos de estudio. Los perros con Ehrlichiosis y/o Anaplasmosis (n=51) de ocurrencia natural, fueron incluidos en t3 grupos así; Grupo II que comprendía perros infectados con A. phagocytophilum (n=10) (7 de razas mixtas, 1 por cada Terrier, Setter y Golden Retriever), Grupo III (n=13) co-infectados de E. canis+ A. phagocytophilum (13 de raza mixta), y grupo IV. (n=28) perros infectados con E. canis (10 de raza mixta, 5 Terrier, 3 Golden Retriever, 2 de cada Rottweiler, pastor turco y Cocker Spaniel, 1 por cada Doberman, perro Pastor alemán, Jack Russel Terrier y Samoyedo). Los perros de control por estar saludables (n=20), detectados por examen físico completo y se detectó que no estaban infectados con los kit de detección, fueron metidos en el grupo I. Todos los perros incluidos fueron seleccionados entre los perros que no habían sido tratados contra las enfermedades arriba mencionadas. Todos los perros pasaron por un completo examen físico y la estadística relativa fue registrada junto con los análisis de laboratorio necesarios. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los propietarios de perros, antes de hacerlos partícipes en el estudio. Exámenes hematológicos y biológicos. Se tomaron muestras de sangre de la vena cefálica antebrachii en tubos anti-coagulados (EDTA). Se realizaron conteos completos de sangre en remisión dentro del Abaco Analista junior Veterinario con referencia especial a índices de trombocitos Volumen Medio Plaqueteado (MPV), Plateletcrit (PCT) y grosor de distribución de rojos (RDW). Análisis serológico. Cada muestra fue probada mediante el uso de un kit ELISA (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, USA) en un intento de diagnosticar antígenos de Dirofilaria immitis, anticuerpos andan contra Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, y Borrellia burgdorferi de acuerdo con el protocolo listado en el informe del producto. Este ensayo detecta anticuerpos que reaccionan a 2 proteínas inmuno-dominantes (p30 y p30-1) de E. canis, proteína inmuno dominante (msp2)

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antigen of D. immitis. The test results were recorded in an Excel spreadsheet. Statistical analysis. Descriptive statistics were performed. Correlation coefficient among those parameters were calculated within Pearson test. Clinical signs obtained based on presence/ absence such as nasal discharge, anorexia, weight loss, tick infestation, muscle weakness, dermal petechiae, epistaxis, poliarthritis and lymphadenopthy among groups were subjected to Chi square test of independence. One way analysis of variance (ANOVA) was employed for data involving hematological parameters. Thus differences for mean values among groups were detected. Moreover Tukey test was applied to determine significant differences existing among group means within variance analysis.

RESULTS Hematological analysis. Table 1 showed hematological variables obtained. Anemia, thrombocytopenia and leukocytosis were frequently detected among dogs co-infected with E. canis and A. phagocytophilum (group III) whereas leukopenia was significantly evident in dogs infected with E. canis (group IV) in contrast to other groups. Besides only 10% of dogs infected with A. phagocytophilum presented leukopenia. Significant differences were observed in mean WBC [between control group and IV. (E. canis) group (p≤0.05)], and RBC values [among control group and groups III. and IV. (p<0.01)] (Table 2). Variance analysis showed significant differences for mean Hb values among control group and groups III and IV (p≤0.01), and for mean Ht values among control group and groups III and IV (p≤0.01). Variance analysis showed significant differences for mean MCV values between control group and group IV (p≤0.05). Non-significant differences were detected for mean MCHC values among groups (p˃0.05) (Table 2). Statistically significant differences were observed for mean values of PLT and PCT for groups II, III and IV in contrast to the control group at the level of p≤0.01, respectively (Table 3). Variance analysis showed that there was no significant

de A. phagocytophilum y el péptido C6 para B. burgdorferi, junto con un antígeno de carbohidrato circulante de D. immitis. Los resultados de las pruebas fueron registrados en una hoja de cálculo de Excel. Análisis estadístico. Se realizaron estadísticas descriptivas. Se calcularon los coeficientes de correlación entre esos parámetros dentro de la prueba Pearson. Los signos clínicos obtenidos con base en la presencia/ausencia de síntomas como flujo nasal, anorexia, pérdida de peso, infestación de garrapatas, debilidad muscular, petequias en la piel, epistaxis, poliartritis y linfoadenopatía entre los grupos fueron sometidos a la prueba de independencia de Chi al cuadrado. Se empleó una forma de análisis de varianza (ANOVA) para estadísticas relacionadas con parámetros hematológicos. De esta forma, se detectaron las diferencias para valores medios entre los grupos. Más aún, se aplicó la prueba Tukey para determinar diferencias significativas existentes entre medias entre los grupos dentro de análisis de varianza.

RESULTADOS Análisis hematológico. La tabla 1 mostró las variables hematológicas obtenidas. Se detectaron frecuentemente entre los perros co-infectados con E. canis y A. phagocytophilum (grupo III) anemia, trombocitopenia y leucocitosis mientras que la leucopenia fue significativamente evidente en perros infectados con E. canis (grupo IV) en contraste con otros grupos. Además, solo el 10% de los perros infectados con A. phagocytophilum presentaron leucopenia. Se observaron diferencias significativas en la media WBC [entre el grupo de control y el grupo IV (E. canis) (p≤0.05)], y los valores RBC [entre el grupo de control y los grupos III. y IV. (p<0.01)] (Tabla 2). El análisis de varianza mostró diferencias significativas para los valores medio de Hb entre el grupo de control y los grupos III y IV (p≤0.01y para los valores medios de Ht entre el grupo de control y los grupos III y IV (p≤0.01). El análisis de varianza mostró diferencias significativas para los valores medios de MCV entre el grupo de control y el grupo IV (p≤0.05). Se detectaron diferencias no significativas para los valores medios de MCHC entre los grupos (p>0.05) (Tabla 2).

Table 1. Haematological abnormalities among E. canis and/or A. phagocytophilum infected dogs. Haematological abnormality

A. phagocytophilum (n:10) (%)

E. canis+A. phagocytophilum (n:13) (%)

E. canis (n:28) (%)

Anemia

6/10 (60)

10/13 (76)

19/28 (67)

Thrombocytopenia

5/10 (50)

8/13 (76.9)

20/28 (71.4)

Leukocytosis

4/10 (40)

5/13 (38)

4/28 (14)

Leukopenia

1/10 (10)

0/13 (0)

6/28 (21)

Özata - Thrombocyte indices in dogs infected with E. canis and A. phagocytophilum

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Table 2. Descriptive statistics relevant to leukocyte and eryhtrocyte parameters in all groups. Control (n: 20)

A. phagocytophilum (n:10)

E. canis +A. phagocytophilum (n: 13)

E. canis (n: 28)

WBC

11.435±0.735a

13.19±2.10ab

15.73±1.82ab

10.61±1.08b

RBC

6.623±0.226a

5.470±0.239ab

4.845±0.356b

4.671±0.296b

HGB

15.069±0.485a

11.870±0.639ab

10.362±0.822b

9.829±0.754b

HCT

43.83±1.35a

35.39±1.77ab

30.96±2.34b

29.36±1.97b

MCV

66.000±0.557a

64.60±1.19ab

63.846±0.839ab

62.679±0.911b

MCHC

34.505±0.386

33.510±0.440

33.385±0.350

32.246±0.738

Values were indicated as mean ± SE mean. a, b: Parameters presented within different letters at the same row indicated statistical significance (*p≤0.05, **p≤0.01)

Table 3. Descriptive statistics relevant to thrombocyte parameters in all groups. Control (n: 20)

A. phagocytophilum (n:10)

E. canis +A. phagocytophilum (n: 13)

E. canis (n: 28)

PLT

370.4±28.6a

159.6±63.5 b

142.3±44.3 b

148.7±33.5 b

PCT

0.3695±0.0283 a

0.1530±0.590b

0.1531±0.0441 b

0.1450±0.314 b

MPV

9.807±0.232

9.080±0.647

10.123±0.982

8.921±0.578

38.755±0.510

37.84±1.46b

34.40±4.33

36.30±2.02

PDWc

Values were indicated as mean ± SE mean. a, b: Parameters presented within different letters at the same row indicated statistical significance. (*p≤0.05, **p≤0.01).

difference between mean MPV and PDWc values of the four groups (p˃0.05). Serological results. In vitro diagnostic rapid test kits (Snap4Dx) revealed positivity against antibodies E. canis 28/200 (14%), A. phagocytophilum 10/200 (5%) and 13/200 (6.5%) both for E. canis and A. phagocytophilum. Clinical signs. Chi-square test was used for independence controls among groups (I, II, III, IV) and clinical findings observed based on presence (1)- or absence (0) such as nasal discharge, anorexia, weight loss, tick infestation, fever, muscle weakness, petechiae and ecchymosis, epistaxis, polyarthritis, lymphadenopathy. Nasal discharge, anorexia, weight loss, tick infestation and lymphadenopathy were dependent variables among groups at the level of p≤0.01. Other clinical signs aforementioned did not reveal statistical significance among infected groups. Taking into account the probable transmission is through the bite of ticks for Ehrlichial organisms, active tick infestation was evident among 90%, 53.85%, and 71.43% of dogs infected with A. phagocytophilum, mixed E. canis and A. phagocytophilum and E. canis, respectively. When cases were deemed individually, a Boxer dog infected with E. canis presented distal limb edema, whereas A. phagocytophilum infected Rottweiler dog showed lameness and central nervous system signs. Dogs infected with E. canis or A. phagocytophilum showed bleeding tendency. Correlation analysis for relevant hematological variables. In the present study correlation among

Se observaron diferencias estadísticamente significativas para los valores medios de PLT y PCT para los grupos II, III y IV en contraste con el grupo de control al nivel de p≤0.01, respectivamente (Tabla 3). El análisis de varianza mostró que no diferencia significativa entre los valores medios de MPV y PDWc para los cuatro grupos (p>0.05). Resultados serológicos. Los kits de pruebas diagnósticas rápidas In vitro (Snap4Dx) revelaron positividad contra anticuerpos E. canis 28/200 (14%), A. phagocytophilum 10/200 (5%) y 13/200 (6.5%) ambos para E. canis y A. phagocytophilum. Signos clínicos. Se utilizó la prueba de Chicuadrado para controles de independencia entre grupos (I, II, III, IV) y los resultados clínicos observados, basados en la presencia (1)- o ausencia (0) tales como flujo nasal, anorexia, pérdida de peso, infestación de garrapatas, fiebre, debilidad muscular, petequias y equimosis, apitaxis, poliartritis, linfoadenopatías. El flujo nasal, anorexia, pérdida de peso, infestación de garrapatas y linfoadenopatías fueron variables dependientes entre los grupos al nivel de p≤0.01. Los otros signos clínicos, arriba mencionados, no revelaron significancia estadística entre grupos infectados. Teniendo en cuenta que la posible transmisión se da a través de picadas de garrapatas para organismos Ehrliquiales, la infestación activa de garrapatas fue evidente entre el 90%, 53.85%, y 71.43% de los perros infectados con A. phagocytophilum, E. canis y A. phagocytophilum mezcladas y E. canis, respectivamente. Cuando se consideraron casos individualmente, un perro Boxer infectado con E. canis presentó edema distal de miembro,

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those three thrombocyte indices(PCT, MPV and PDWc) and paralel red blood cell parameters (HCT, MCV and RDW) were investigated for all groups and for intragroup comparison. When all groups were evalauted completely Pearson correlation analysis revelaed positive strong (r:0.383) significant (p≤0.01) correlation between PCT and HCT. Besides a positive strong (r:0.372) significant (p≤0.01) correlation was also evident between PLT and RBC. Between MPV and MCV a positive but nonsignificant correlation (r=0.220; p˃0.05) was found (Table 4). Taking into account PLT and relevant thrombocyte indices, a positive strong significant correlation between PLT and PCT (r= 0.983; p≤0.01), indeed a positive but nonsignificant correlation among PLT and MPV, and PLT and PDWc (p˃0.05, both) were found (Table 4).

mientras que un perro Rottweiler infectado con A. Phagocytophilum mostró cojera y signos del sistema nervioso central. Perros infectados con E. canis o A. phagocytophilum mostraron tendencia a sangrar. Análisis de correlación para variables hematológicas relevantes. En el presente estudio, se estudiaron la correlación entre tres índices trombocíticos (PCT, MPV y PDWc) y parámetros paralelos de células de sangre rojas (HCT, MCV and RDW) para todos los grupos y para una comparación intra grupo. Cuando todos los grupos fueron evaluados completamente, el análisis de correlación de Pearson reveló fuerte y positiva (r:0.383), significativa (p≤0.01) correlación entre PCT y HCT. Además una correlación positiva y fuerte (r:0.372) significativa (p≤0.01) también fue evidente entre PLT y RBC. Entre MPV y MCV se encontró una correlación positiva pero no significativa (r=0.220; p>0.05) (Tabla 4).

Table 4. Correlation coefficients and statistical analysis among thrombocyte indices (PCT, MPv and PDwc) and paralel erythrocyte parameters for all groups. WBC

RBC

HGB

HCT

MCV

MCHC

PLT

PCT

RBC

0.084 0.484

HGB

0.096 0.426

0.966 0.000

HCT

0.096 0.427

0.978 0.000

0.991 0.000

MCV

0.080 0.478

0.234 0.050

0.425 0.000

0.422 0.000

MCHC

0.167 0.163

0.518 0.000

0.616 0.000

0.549 0.000

0.283 0.017

PLT

0.080 0.509

0.372 0.001

0.376 0.001

0.134 0.267

0.265 0.026

PCT

0.061 0.611

0.365 0.002

0.385 0.001

0.383 0.001

0.183 0.127

0.283 0.017

0.983 0.000

MPV

0.043 0.724

0.001 0.992

0.068 0.572

0.044 0.717

0.220 0.066

0.103 0.391

0.162 0.176

0.247 0.038

PDWc

0.071 0.556

0.050 0.467

0.088 0.467

0.066 0.585

0.112 0.352

0.076 0.527

0.229 0.055

0.272 0.022

MPV

0.848 0.000

Cell content; Pearson correlation coefficient (r) P value.

Intragroup comparison revealed a strong negative significant correlation between PCT and HCT (r:-0.512; p≤0.05) for control group. Comparative correlation among PLT and thrombocyte indices revealed a positive significant correlation between PLT and PCT (r=0.943; p≤0.01), whereas negative significant correlations among PLT and MPV (r:-0.554; p≤0.05) and PLT and PDWc (r:-0.548, p≤0.05) (Table 5). In group II. of dogs infected with A. phagocytophilum, positive but nonsignificant (p˃0.05) correlations were found among PCT and HCT (r:0.361), MPV and MCV (r:0.085), PLT and RBC (r:0.391). Within this group a positive strong (r:0.988) significant (p≤0.01) correlation

Teniendo en cuenta índices relevantes de PLT y trombocíticos, se encontraron una correlación positiva y significativa entre PLT y PCT (r= 0.983; p≤0.01), una correlación realmente positiva pero insignificante entre PLT y MPV, y entre PLT y PDWc (p>0.05, ambas) (Tabla 4). La comparación intra grupos reveló una correlación fuerte negativa entre PCT y HCT (r:-0.512; p≤0.05) para el grupo de control. Una correlación comparativa entre los índices de PLT y trombocítico mostró una correlación positiva significativa PLT y PCT (r=0.943; p≤0.01), mientras que [resultaron] correlaciones negativas significativas entre PLT y MPV (r:-0.554; p≤0.05) y entre PLT y PDWc (r:0.548, p≤0.05) (Tabla 5).

Özata - Thrombocyte indices in dogs infected with E. canis and A. phagocytophilum

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Table 5. Correlation among thrombocyte indices (PLT, PCT, MPV) and anemia parameters (RBC, HCT, MCV). PCT-HCT I. Control

MPV-MCV

PLT-RBC

PLT-PCT

PLT-MPV

PLT-PDWc

-0.512 0.021*

0.100 0.676

-0.503 0.024*

0.943 0.000**

-0.554 0.011*

-0.548 0.012*

II. A. phagocytophilum

0.361 0.305

0.085 0.815

0.391 0.264

0.988 0.000**

0.208 0.564

0.178 0.623

III.E. canis +A. phagocytophilum

0.069 0.824

0.514 0.072

0.019 0.951

0.990 0.000**

0.175 0.567

0.361 0.225

IV. E. canis

0.265 0.173

0.134 0.498

0.334 0.082

0.981 0.000**

0.235 0.229

0.221 0.258

Cell content; Pearson correlation coefficient (r) P value * p≤0.05 * * p ≤0 . 0 1

was evident between PLT and PCT. Similarly in groups III. and IV. positive correlations, (r:0.990; p≤0.01) and (r:0.981; p≤0.01), respectively, were found between PLT and PCT, whereas other parameters showed non-significant correlations (Table 5).

DISCUSSION The most commonly detected hematological alteration was thrombocytopenia, which was observed in 71.4, 90 and 76.9% of dogs infected with E. canis (IV group), A. phagocytophilum (II group) and E. canis+ A. phagocytophilum (III group). Among total population enrolled, 71.8% were infected with E. canis and/or A. phagocytophilum, and to those of 51 animals, bleeding tendency (petechia/echimoses) was determined in 13 dogs. Thrombocytopenia is also consistent feature of A. phagocytophilum infection (5,6). Antibodymediated haemolytic anaemia accompanying thrombocytopenia has been detected in relation to A. phagocytophilum infection in a dog (3). Indeed there is no proof of antibodymediated immune-mediated disease. Mouse model of infection suggested that neither splenic sequestration of platelets nor antibodymediated destruction did not have a direct effect for the acute thrombocytopenia seen with infection (5). Although haematopoietic cells including megakaryocytes were found susceptible to A. phagocytophilum, infectioninduced thrombocytopenia was not suggested to be in relation with a direct effect of intracellular pathogen (7). Taking into account all infected E. canis and/or A. phagocytophilum dogs significant differences (p≤0.01) were observed among clinical findings such as nasal discharge, appetite, tick infestation, muscle weakness, dermal petechia/echimoses, poliarthritis and lymphadenopathy in contrast to the control group. Moreover cases involved in groups II, III and IV. were dependent to the presence/

En el grupo II de perros infectados con A. phagocytophilum, se encontraron correlaciones positivas pero no significativas (p>0.05) entre PCT y HCT (r:0.361), MPV y MCV (r:0.085), PLT y RBC (r:0.391). Dentro de este grupo, se hizo evidente una correlación positiva fuerte (r:0.988) significativa (p≤0.01) entre PLT y PCT. En forma similar, en los grupos III y IV se encontraron correlaciones positivas (r:0.990; p≤0.01) y (r:0.981; p≤0.01), respectivamente, entre PLT y PCT, mientras que otros parámetros mostraron correlaciones no significativas (Tabla 5).

DISCUSIÓN La alteración hematológica más comúnmente detectada fue la trombocitopenia, que se observó en 71.4, 90 y 76.9% de los perros infectados con E. canis (grupo IV), A. phagocytophilum (grupo II) y E. canis+ A. phagocytophilum (grupo III). Entre la población total involucrada, 71.8% se infectaron con E. canis y/o A. phagocytophilum, y para ellos, se determinó tendencia al sangrado (petequia/equimosis) en 13 perros de un total de 51 animales. La trombocitopenia también es una característica consistente de la infección de A. phagocytophilum (5,6). Se detectó anemia hemolítica mediada por anti cuerpos acompañando la trombocitopenia, en relación con la infección de A. phagocytophilum en un perro (3). En realidad, no hay prueba de enfermedad mediada por anticuerpos o por inmunidad. El modelo de infección de Mouse sugirió que, ni la retención de plaquetas por el vaso, ni la destrucción mediada por anti cuerpos, tuvieron un efecto directo en la trombocitopenia aguda observada con la infección (5). Aunque se encontraron células hematopoyéticas incluyendo megacariocitos susceptibles a A. phagocytophilum, la trombocitopenia inducida por la infección no se sugirió que tuviera relación con un efecto directo de patógeno intracelular (7). Teniendo en cuenta todos los perros infectados con E. canis y/o A. Phagocytophilum, se observaron diferencias significativas (p≤0.01) entre resultados clínicos tales como fluido nasal, apetito, in festación de garrapatas, debilidad muscular, petequia de la

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absence of clinical signs aforementioned. In E. canis infected dogs (group IV.) the mean values for leukocyte responses signifricantly decreased in contrast to control group. In groups II and IV mean values for RBC, Hb and HCT were significantly decreased in contrast to control group (p≤0.01). A common pattern of the hemopathological effects of CME may be variable during different phases of the disease (8). The effects of CME on the circulating blood cells may be accompanied by bone marrow suppression depending of the stage of the disease, thus may result with deficient production of one or more of the blood elements (8). Another research indicated that in the acute or chronic phases of CME leukopenia accompanied anemia and thrombocytopenia (9). It was suggested that a significant percentage of pancytopenic or anemic dogs with CME were serologically positive and PCR negative (9). Pancytopenia, anemia and leukopenia were already described in acute and chronic stages of CME (10). Serology positive however PCR negative dogs may be at a chronic stage, even cells are reduced due to bone marrow damage and E. canis is in the tissue, thus may not be PCR detectable. All dogs with leukocytosis were PCR positive, and 50% were also serologically positive in the latter study (9). The latter cases could be involved in acute stage of CME, as leukocytosis exist in the first 2- 3 weeks due to bone marrow hyperplasia (9). In the present study among E. canis infected dogs 14% presented leukocytosis, whereas 21% leukopenia. A. phagocytophilum infected dogs showed 40% leukocytosis, whereas 10% leukopenia. Aforementioned hematological results may be relevant to the different stages of the infection. Automated blood cell analyzers recently are of beneficial in an attempt to provide novel data about platelets via the measurement of platelet indices, involving MPV, PDW and PCT (11, 12). Platelet indices may be of beneficial and suggests clinical data relevant to the underlying causes of thrombocytopenia in humanbeing (12), and in dogs (13, 14). MPV has also been reported to be an indirect marker of alterations in platelet production and activity and of bone marrow response in septic patients (13-15) and inflammatory diseases in dogs (12). In a canine model of endotoxemia, elevated MPV values were reported whereas PLT and PCT decreased (16). In the latter study thrombocytopenia was signiﬁcantly associated with alterations in MPV, and to those

piel/ equimosis, poliartritis y linfoadenopatías, en contraste con el grupo de control. Por otra parte, casos involucrados en los grupos II, III y IV fueron dependientes de la presencia/ausencia de los signos clínicos antes mencionados. En perros infectados con E. canis (grupo IV.) los valores medios para respuestas de leucocitos disminuyeron significativamente en contraste con el grupo de control. En los grupos II y IV los valores medios de RBC, Hb y HCT fueron significativamente disminuidos en contraste con el grupo de control (p≤0.01). Un patrón común de los efectos hemopatológicos de CME puede ser variable durante las diferentes fases de la enfermedad (8). Los efectos de CME en las células de la sangre circulante, pueden estar acompañados por supresión de la médula ósea , dependiendo de la fase de la enfermedad, y así puede resultar con una deficiente producción de uno o más de los elementos de la sangre (8). Otra investigación indicó que, en las fases agudas o crónicas de CME la leucopenia acompañó a la anemia y trombocitopenia (9). Se sugirió que un porcentaje significativo de pancitopénicos o perros anémicos con CME eran serológicamente positivos y PCR negativos (9). La pancitopenia, anemia y leucopenia ya estaban descritas en etapas aguda y crónica de CME (10). Los perros con serología positiva pero con PCR negativa pueden estar en la etapa crónica, las células pares se reducen debido a daños en la medula y a que E. canis se encuentra en el tejido, y por ello puede no ser detectable el PCR. Todos los perros con leucocitosis fueron positivos para PCR y 50% también fueron serológicamente positivos en el último estudio (9). Los últimos casos pueden estar involucrados en una etapa aguda de CME, puesto que la leucocitosis existe en las primeras 2- 3 semanas debido a hiperplasia de la medula (9). En el presente estudio, entre los perros infectados con E. Canis, 14% presentaron leucocitosis, mientras que 21% presentaron leucopenia. Los perros infectados con A. phagocytophilum mostraron 40% leucocitosis, mientras que el 10% tenían leucopenia. Los resultados hematológicos arrioba mencionados pueden ser relevantes a las diferentes etapas de la infección. Analizadores automatizados de las células de la sangre, son un intento reciente para proveer estadística novedosa sobre plaquetas vía la medición de índices de plaquetas que involucran MPV, PDW y PCT (11, 12). Los índices de plaquetas pueden ser beneficiosos y sugieren estadísticas clínicas relevantes a los casos subyacentes de tromobocitopenia en humanos (12), y en perros (13, 14). También se ha reportado que MPV puede ser un marcador indirecto de alteraciones en la producción y actividad de las plaquetas y de las respuestas de la medula en pacientes sépticos (13-15) y enfermedades inflamatorias en perros (12). En un modelo canino

Özata - Thrombocyte indices in dogs infected with E. canis and A. phagocytophilum of ﬁndings may be attributable to changes in platelet production and reactivity, furthermore platelet indices may be used for diagnosis and monitoring of dogs with endotoxemia (16). For healthy dogs Yilmaz et al (16) detected mean MPV values as 9.3 ± 0.5, whereas in a prior study min-max values of 7.9-13.5 fL (17) was detected. In 2 different studies performed among dogs infected with Babesiosis, Poland side reported MPV values of 6.1-10.1 fL in 248 dogs naturally infected with large Babesia form (18), indeed Crotian research revealed MPV min-max values of 5-13.1 fL for diseased dogs (17). For both of the studies MPV values above reference ranges may be attributable to release of immature platelets from the bone marrow due to responsive thrombopoiesis occuring in Babesisosis or beacuse of immune-mediated thrombocytopenia. In the present study indeed expectations, mean MPV values did not present significant alterations in dogs infected with E. canis and/or A. phagocytophilum in contrast to the control group, therefore MPV may not be a sensitive platelet index in those dogs or it should be suggested that it may be an independent index at least for infected dogs involved. The quantitation of thrombocytes in peripheral blood is well known and recognized tool. Recently, new indices related to platelet counts are provided within the use of automated hematologic analyzers (19). As platelet indices are relatively novel parameters for veterinary medicine, the scientific literature is lacking expected and expanded knowledge. The correlation between the platelet indices and parallel RBC parameters has been the subject of some studies (19). PCT denotes the term for the percentage of blood volume occupied within the thrombocytes (20). Surfaces of cells are required for clotting alterations taking place, therefore the present authors examined PCT, as was also reported (17). In healthy dogs Yilmaz et al (16) reported PCT values of 0.33±0.01. In dogs with Babesiosis PCT values were significantly decreased before and after therapy, in contrast to the healthy dogs (17). In the latter study the reference ranges changed from 0.01 to 0.08% in dogs infected with Babesiosis, prior to therapy (17). In the present study among healthy dogs PCT was 0.3695 ± 0.0283, however the latter parameter was decrased significantly in other 3 groups with infected dogs.

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de endotoxemia, se reportaron valores elevados de MPV mientras que los de PLT y PCT decrecieron (16). En el último estudio, la trombocitopenia estaba significativamente asociada con alteraciones en MPV, y para ellos, esas observaciones pueden ser atribuibles a cambios en la producción y reactividad de las plaquetas. Más aún, los índices de plaquetas pueden ser utilizados para diagnóstico y monitoreo de perros con endotoxemia (16). Para perros sanos, Yilmaz y otros (16) detectaron valores medios de MPV como 9.3 ± 0.5, mientras que en un estudio previo los valores mínimos y máximos detectados fueron de 7.9-13.5 fL (17). En 2 estudios diferentes realizados en perros infectados con Babesiosis, el lado de Polonia reportó valores de MPV de 6.1-10.1 fL en 248 perros infectados naturalmente con una forma grande de Babesia (18), por cierto que la investigación Croata reveló valores mínimo y máximo de MPV de 5-13.1 fL para perros enfermos (17). Para ambos estudios , los valores de referencia de MPV arriba señalados pueden ser atribuidos a una descarga de plaquetas inmaduras de la medula debido a trombopoesis de respuesta que ocurre en Babesisosis o por trombocitopenia mediada por inmunidad. En el presente estudio, ciertamente las expectativas, los valores medios de MPV no presentaron alteraciones significativas en perros infectados con E. canis y/o A. phagocytophilum en contraste con el grupo de control, por lo tanto, MPV puedo no ser un índice sensible de plaqueta en esos perros o puede sugerirse que puede ser un índice independiente al menos para perros infectados involucrados. La cuantificación de trombocitos en la sangre periférica es una herramienta bien conocida y reconocida. Recientemente, nuevos índices relativos al conteo de plaquetas se proveen dentro del uso de los analistas hematológicos automatizados (19). Puesto que los índices de plaquetas son unos parámetros relativamente novedosos para la medicina veterinaria, a la literatura científica le faltan conocimientos esperados y expandidos. La correlación entre los índices de plaquetas y parámetros paralelos de RBC ha sido objeto de algunos estudios (19). PCT es el término para el porcentaje del volumen de la sangre ocupado por los trombocitos (20). Se requieren superficies de células para alteraciones en coagulación que toman plac. Por lo tanto los autores de este artículo examinaron los valores de PCT, dado que también fueron reportados (17). En perros sanos, Yilmaz y otros (16) reportaron valores de PCT de 0.33±0.01. En perros con Babesiosis los valores de PCT habían disminuidos significativamente antes y después de la terapia, en contraste con los perros sanos (17). En este estudio, los rangos de referencia cambiaron de 0.01 a 0.08% en perros infectados con

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In the present study mean MPV values were decreased in II and IV groups along with decrases in PCT values, indeed alterations among mean MPV and PDWc values did not show any differences compared with the control group. Furthermore thrombocytopenia was significantly correlated with the alterations in PCT. Those findings might show alterations in PLT production and reactivation or the percent of blood volume occupied within the thrombocytes, therefore we concluded that PCT, as a PLT index, may have potential value in the interpretation, diagnosis and monitorization of dogs infected with E. canis and/or A. phagocytophilum. Taking into acoount the platelet indices, as aforementioned above PCT, MPV and PDW may be interpreted from the blood analysis (19). Albeit there is scarcity and lacking data reported in the literature regarding those parameters. MPV, actually the best recognized parameter in contrast to other relevant ones, is an index of platelet function and activation (15,). In our study mean MPV values did not show statistical differences among groups. M o r e ove r n o s t a t i s t i c a l c o r r e l a t i o n wa s presented between mean MPV values and paralel red blood cell parameter, MCV. In general elevated MPV should be observed in regenerative thrombocytopenia (increased peripheral loss, destruction/utilization of platelets and elevated production of platelets by marrow)(15,19). In our study as infected dogs in groups II, II and IV. did not show significant chnages among mean MPV values, it might be attributable to lacking regenerative thrombocytopenia or the duration of the diseases. The present authors did not evaluate antigenic status, solely examined antibodies against E. canis and/or A. phagocytophilum. Especially for E. canis antigenic load was not evaluated therefore active or acute stages of the disease were not determined, not allowing for entirely interpreting megakaryocytic alterations in bone marrow. The correlation between PLT count and the three parameters and those among the three parameters and paralel RBC indices were studied. In the present study correlation among those three PLT indices (PCT, MPV and PDWc) and paralel RBC parameters (HCT, MCV and RDW) were investigated for all groups and for intragroup comparison. When all groups were evalauted completely Pearson correlation analysis revelaed positive strong (r:0.383) significant (p≤0.01) correlation between PCT and HCT. Besides a positive strong (r:0.372) significant (p≤0.01) correlation was also evident between PLT and RBC.

Babesiosis, antes de la terapia (17). En el presente estudio entre perros sanos, los valores de PCT fueron 0.3695 ± 0.0283. Sin embargo, este último parámetro se disminuyó significativamente en otros 3 grupos con perros infectados. En el presente estudio, los valores medios de MPV decrecieron en los grupos II y IV al mismo tiempo que disminuyeron los valores en PCT. Ciertamente, las alteraciones entre los valores medios de MPV y PDWc, no mostraron diferencia alguna comparada con el grupo de control. Más aún, la trombocitopenia estaba significativamente correlacionada con las alteración es en PCT. Esas observaciones pueden mostrar alteraciones en la producción y reactivación de PLT o el porcentaje de volumen de sangre ocupado dentro de los trombocitos. Por lo tanto nosotros concluimos que PCT, como el índice PLT pueden tener un valor potencial en la interpretación, diagnóstico y monitoreo de perros infectados con E. canis y/o A. phagocytophilum. Teniendo en cuenta los índices de plaquetas, como se mencionó antes, PCT, MPV y PDW pueden ser interpretados desde el análisis de la sangre (19). Aunque hay escases y falta de información repostada en la literatura relativa a esos parámetros. MPV, actualmente el parámetro mejor reconocido, en contraste con otros relevantes, es un índice de función y activación de plaquetas (15,). En nuestro estudio, los valores medios de MPV no mostraron diferencias estadísticas entre grupos. Más aún, no se presentó correlación estadística entre los valores medios de MPV y parámetros paralelos de células de sangre rojas, MCV. En general debe observarse un valor elevado de MPV en trombocitopecia regenerativa (pérdida periférica incrementada, destrucción/utilización de plaquetas y elevada producción de plaquetas por la medula (15,19). En nuestro estudio, comoquiera que los perros infectados en los grupos II, II y IV no mostraron cambios significativos entre valores medios de MPV, esto puede ser atribuido a la falta de trombocitopenia regenerativa o a la duración de las enfermedades. Los autores de este artículo, no evaluamos el estatus antigénico, solamente examinamos anticuerpos contra E. canis y/o A. phagocytophilum. Especialmente para E. Canis, no se evaluó la carga de antígenos. Por lo tanto, no se determinaron etapas activas o agudas de la enfermedad, no permitiendo la interpretación completa de alteraciones megacariocíticas en la medula. Se estudiaron las correlaciones entre el conteo de PLT y los tres parámetros y aquélla entre los tres parámetros y los índices RBC paralelos. En el presente estudio, se investigaron las correlaciones entre esos tres índices PLT (PCT, MPV y PDWc) y parámetros RBC paralelos (HCT, MCV y RDW) para todos los grupos y para una comparación intra grupo. Cuando se evaluaron todos los grupos completamente, el análisis

Özata - Thrombocyte indices in dogs infected with E. canis and A. phagocytophilum Taking into account PLT and relevant PLT indices, a positive strong significant correlation between PLT and PCT (r=0.983; p˂0.01), intragroup comparison revealed a strong negative significant correlation between PCT and HCT (r:-0.512; p≤0.05) for control group. Comparative correlation among PLT and PLT indices revealed a positive significant correlation between PLT and PCT (r=0.943; p≤0.01), whereas negative significant correlations among PLT and MPV (r:-0.554; p≤0.05), besides PLT and PDWc (r:-0.548, p ≤ 0.05) (Tab l e 5). Si mi l arl y a p osit ive significant correlation between PLT and PCT was detected in groups II, III and IV. In conclusion, regarding to the data achieved from the present study, it may be suggested that in dogs infected with E. canis and/or A. phagocytophilum, RBC and PLT indices should be interpreted along, in an attempt to scrutinize anemia and/or trombocytopenia. Infected dogs showed significant alterations (p≤0.01) among mean PLT and PCT values and a positive correlation was evident between t h o s e 2 p a ra m e t e r s ( p ≤ 0 . 0 1 ) , w he r e as alterations on mean MPV and PDWc were not statistically significant. Finally it was suggested that according to the aforimentioned results, PLT and PCT values may be used as valuable parameters for diagnosis and probably for monitorization and prognosis in infected dogs with mentioned agents. Acknowledgement This study was summarized paritally from the master thesis of Funda OZATA, M.Sc., DVM, under the advisory of Dr. Kerem URAL, DVM and was funded by Adnan Menderes University Research Projects Funding Unit with project number VTF-11025.

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de correlación de Pearson reveló una correlación positiva y fuerte (r:0.383) significativa (p≤0.01) entre PCT y HCT. Además, también fue evidente una correlación positiva y fuerte (r:0.372) significativa (p≤0.01) entre PLT y RBC. Teniendo en cuenta PLT e índices relevantes de PLT, en una comparación intra-grupo, una correlación positiva, fuerte y significativa entre PLT y PCT (r=0.983; p<0.01), reveló una correlación fuerte negativa y significativa entre PCT y HCT (r:-0.512; p≤0.05) para el grupo de control. Una correlación comparativa entre PLT e índices de PLT mostró una correlación positiva y significativa entre PLT y PCT (r=0.943; p≤0.01), al paso que se presentaron correlaciones negativas significativas entre PLT y MPV (r:-0.554; p≤0.05), además de PLT y PDWc (r:-0.548, p≤0.05) (Tabla 5). En forma similar, se detectó una correlación positiva significativa entre PLT y PCT en los grupos II, III y IV. En conclusión, en relación con las estadísticas logradas por el presente estudio, se puede sugerir que en perros infectados con E. canis y/o A. phagocytophilum, los índices RBC y PLT deben ser interpretados al tiempo, en un intento de escrutar anemia y/o trombocitopenia. Los perros infectaos mostraron alteraciones significativas (p≤0.01) entre los valores medios de PLT y PCT y fue evidente una correlación positiva entre esos dos parámetros (p≤0.01), mientras que las alteraciones en las medias de MPV y PDWc no eran estadísticamente significativas. Finalmente, se sugirió que, de acuerdo con los resultados antes mencionados, los valores de PLT y PCT pueden ser utilizados como parámetros valiosos para el diagnóstico y probablemente para el monitoreo prognosis en perros infectados con los agentes mencionados. Agradecimientos Este estudio fue parte de la tesis de maestria de Funda Ozata, M.Sc., bajo la asesoria del Dr. Kerem URAL, DVM y financiado por Adnan Menderes University Research Projects, proyecto número VTF-11025.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4289-4300, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Analgesic effect and side effects of celecoxib and meloxicam in canine hip osteoarthritis Efectos analgésicos y secundarios de celecoxib y meloxicam en osteoartritis de cadera canina Víctor Molina D,* M.Sc, David Álzate V, M.Sc, Jhon Ruíz B, Ph.D, Manuela Urrea A, MVZ, Juan Tobón J, MVZ. Universidad CES, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics. INCA-CES Group, MedellinColombia, AA 054591. *Correspondence: dooncanmc@hotmail.com

Received: September 2014; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. To evaluate the pharmacological, clinical and toxicological effects of celecoxib and meloxicam for analgesia for 30 days in dogs with hip osteoarthritis. Materials and methods. Twenty-four patients were evaluated, 75% were females with an average age of 7.16 ± 2.06 years and twenty five percent were males with an average age of 7.83 ± 2.22 years. All patients had hip osteoarthritis and they were randomized into two groups; one group received oral celecoxib 5 mg/kg every 12 hours during one month and the second group received oral meloxicam 0.2 mg/kg every 24 hours during 1 month. The patients were evaluated for analgesia, and hematological, renal, liver, and coagulation tests on days 0, 10th and 30th after treatment initiation, and a gastric endoscopy on day 30. Statistical analysis was performed using a HSD Tukey test and c2 with a 5% level of statistical significance. Results. Both drugs reduced articular pain according to the Melbourne scale during the 30 days of treatment (p≤0.05). Hematological, renal, hepatic and coagulation tests were normal in both treatment groups. All patients presented chronic gastritis on endoscopy on day 30th. Conclusions. Both drugs decreased pain at day 30th without causing alterations in hematological, renal, hepatic or coagulation tests after 30 days of treatment. However, both drugs induced chronic gastritis. Key words: Dog, NSAIDS, pain, pharmacology (Source: Mesh).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto farmacológico, clínico y toxicológico de celecoxib y meloxicam utilizados como analgésicos durante 30 días en caninos con osteoartritis de cadera. Materiales y métodos. Fueron evaluados 24 pacientes, 75% hembras, con edad de 7.16 ± 2.06 años, y el 25% machos; con edad de 7.83 ± 2.22 años, todos tenían osteoartritis de cadera, se asignaron aleatoriamente a dos grupos; un grupo recibió celecoxib 5 mg/kg oral cada 12 horas durante 1 mes y el segundo grupo recibió 0.2 mg/kg de meloxicam, oral cada 24 horas durante 1 mes. Todos fueron evaluados por grado de analgesia y pruebas renales, hepáticas y de coagulación al día 0, 10 y 30. Se realizó una endoscopía gástrica al día 30. Para el análisis estadístico se utilizó el test HSD Tukey y c2, con nivel significancia del 5%. Resultados. Ambos tratamientos redujeron el dolor articular durante los 30 días, según la escala Melbourne (p≤0.05). Las variables hemáticas, renales, hepáticas y de 4289

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coagulación estuvieron dentro de los valores normales sin diferencia. Todos presentaron gastritis crónica por endoscopia a los 30 días. Conclusiones. Ambos fármacos redujeron el dolor, ninguno tuvo efectos sobre la hematología, función renal, hepática y de coagulación a los 30 días; sin embargo, hubo gastritis crónica a los 30 días. Palabras clave: Aines, dolor, farmacología, perro (Fuente: Mesh).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The long-term use of non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDS) for the treatment of osteoarticular pain in canines is routine (1, 2), the most used therapeutic tool being selective NSAIDS (3, 4). Meloxicam, a selective NSAIDS, has been used as the standard treatment for osteoarticular pain canines (5) but it has been determined that continued use of this drug provokes digestive alterations and hepatic and renal insufficiencies (6-8) in canines. It has been detailed that other NSAIDS, specific as well as Coxibs, are less damaging in the long-term due to specificity because of cyclooxygenase 2 (COX2) (9). But few studies have been done for celecoxib in canines (10). Specifically in Colombia, where the availability of new COXIBs in veterinary medicine is non-existent, as well as the variety of breeds and crossbreeds, makes the use of these specific COX2 inhibitors a new therapeutic alternative for canines with articular pain.

El uso permanente de anti-inflamatorios no esteroides (AINES) para el tratamiento del dolor osteoarticular en los caninos es rutinario (1,2). Siendo los AINES selectivos la herramienta terapéutica más utilizada (3,4). El meloxicam, un AINES selectivo, ha sido usado como el tratamiento de referencia para el dolor osteoarticular en caninos (5). Pero se ha determinado que este fármaco tras su uso continuado provoca alteraciones digestivas, insuficiencia hepática y renal (6–8) en la especie canina. Se ha descrito que otros AINES, los específicos como los Coxibs, son menos dañinos a largo plazo por su especificidad por la ciclooxigenasa 2 (COX2) (9). Pero son pocos estudios los que se han realizado para el celecoxib en la especie canina (10). En especial en el medio colombiano donde la oferta de nuevos COXIBs en medicina veterinaria es nula, además de la variedad de razas y cruces, hace que el uso de estos inhibidores específicos de la COX2, sean una nueva alternativa terapéutica en caninos con dolor articular.

Celecoxib is used on humans with arthrosis, rheumatoid arthritis and osteoarthritis, improving pain after 2-13 weeks of treatment (11). In canines Coxibs have been used more frequently for hip arthrosis treatment (2, 9, 12). The renal effects of NSAIDS include: reduction of the glomerular filtration rate and suppression of prostaglandin E 2 , which leads to renal insufficiency with prolonged use (3). Selective and specific NSAIDS are supposed to be less damaging (13); however, this is not completely true, since renal function is not preserved, due to serious renal toxicity when used for long periods in people (8, 14). In dogs, meloxicam used for one month caused renal damage due to blockage of PGE2 (15). This differs from studies done by Doig et al (16) where it was found that canines tolerate meloxicam for four weeks. Theoretically celecoxib, on the other hand, should not alter renal function, due to its specificity, but it has been found to cause papillary necrosis in humans (17) due to COX2 inhibition, that it affects the glomerular filtration rate and therefore behaves like the majority of NSAIDS, in addition to modifying sodium elimination (13, 17). In canines, renal effects are arguable since long-term therapies with COXIBs have not demonstrated renal damage (18, 19).

El celecoxib se utiliza en humanos con artrosis, artritis reumatoide y osteoartritis; produciendo mejoría en el dolor, después de 2-12 semanas de tratamiento (11). En caninos, los Coxibs, se han usado cada vez más para el tratamiento de la artrosis de cadera (2,9,12). Los efectos renales de los AINES incluyen: disminución en la tasa de filtración glomerular y supresión de la acción de la prostaglandina E2, lo que lleva a insuficiencia renal, por el uso prolongado (3). Los AINES selectivos y específicos se supone que son menos dañinos (13); sin embargo, esto no es del todo cierto, ya que no preservan la función renal, por toxicidad renal grave al utilizarlos durante períodos extensos en personas (8,14). En perros, meloxicam utilizado durante un mes, ocasionó daño renal mediante el bloqueo de PGE2 (15). Esto difiere de los estudios realizados por Doig et al (16) donde se encontró que los caninos toleran el meloxicam durante 4 semanas. Teóricamente el celecoxib por el contrario no debe alterar la función renal, debido a su especificidad, pero se ha encontrado que causa necrosis papilar en personas (17), por inhibición de la COX2, que

Molina - Effects of celecoxib and meloxicam for analgesia

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The effects of NSAIDS on the liver are not conclusive in veterinary medicine (15) and it is presumed that hepatic reactions are idiosyncratic and not due to the drug. Hepatic lesions described are caused by meloxicam (7) and have not been described for celecoxib in canines (18, 19).

afecta la tasa de filtración glomerular y que por lo tanto se comporta como la mayoría de los AINES, además la modificación de la eliminación de sodio (13,17). En la especie canina los efectos renales son discutibles pues terapias a largo plazo con COXIBs no demostraron daño renal (18,19).

Hematologic alterations in canines due to meloxicam have not been described, but are presumed due to COX1 inhibition in lesser proportion that interferes with platelet aggregation (15, 20) and increases hemorrhagic risk, although with greater selectivity there is less inhibition of platelet aggregation.

Los efectos de los AINES en el hígado no son concluyentes en medicina veterinaria (15) y se presume que las reacciones hepáticas son idiosincrásicas y no se deben al fármaco. Las lesiones hepáticas descritas son causadas por meloxicam (7) y no se han descrito por celecoxib en la especie canina (18,19).

An evaluation of the digestive tract has demonstrated that the use of any NSAIDS causes gastritis (6). In humans, the prolonged use of celecoxib did not produce gastrointestinal effects (14), while meloxicam did (21). Other authors affirm that celecoxib, like other NSAIDS, is harmful to gastric mucous due to acidic pKa (22).

Las alteraciones hematológicas en caninos debido al meloxicam no han sido descritas, pero se presumen por su inhibición de la COX1 en menor proporción, que interfiere con la agregación plaquetaria (15,20), incrementando el riesgo hemorrágico. Mientras que a mayor selectividad es menor la inhibición de la agregación plaquetaria.

The objective of this study was to evaluate and compare the pharmacologic, clinical and toxicological effects of celecoxib and meloxicam in dogs with hip osteoarthritis (OA) during a 30 day treatment period.

MATERIALS AND METHODS Study site and methodology. A controlled, random, double blind clinical prospective experiment was performed. Neither the investigators nor the executers knew the treatment to be administered, and the heads of lab tests and histopathology did not know which therapy each patient received (double blind study). Groups were chosen randomly and assigned by numerical lottery. All the patients had been diagnosed with hip arthrosis, with a hip radiography showing a degree of dysplasia IV and visited the veterinary center of the Universidad CED in Envigado, Colombia. Ethical aspects. This project was carried out under ethical act no. 69 of the Ethical Committee on Animal Experimentation of the Universidad de Antioquia. Protocol evaluation. The evaluation of the evolution of both protocols was done by qualified medical personnel that did not know what treatment was given and was based on data collecting formats for each variable. Patient inclusion criteria. Males and females from 2 to 10 years of age and a variety of breeds were included, all having gone to the veterinary

La evaluación del tracto digestivo ha demostrado que el uso de cualquier AINES causa gastritis (6). En los seres humanos, el uso prolongado de celecoxib no produjo efectos gastrointestinales (14), mientras que meloxicam sí (21). Otros autores afirman que el celecoxib es perjudicial para la mucosa gástrica tanto como otros AINES, debido a su pKa ácido (22). El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar los efectos farmacológicos, clínicos y toxicológicos de celecoxib y meloxicam en perros con osteoartritis de cadera (OA) durante un período de tratamiento de 30 días.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio y metodologia. Se realizó un experimento controlado aleatorio experimental doble ciego prospectivo clínico. Ni los investigadores ni los ejecutores conocían, el tratamiento que administraron, los encargados de las pruebas de laboratorio y la histopatología no conocían cual terapia recibió cada paciente (estudio a doble ciego). Los grupos fueron escogidos de manera aleatoria y repartidos por sorteo numérico. Todos los pacientes tenian diagnóstico artrosis de cadera, realizado por radiografía de cadera con grado de displasia IV y que asistió al centro de veterinaria de la Universidad CES en Envigado, Colombia. Aspectos éticos. Este proyecto se llevó a cabo bajo la garantía del acto ético no 69 del Comité de Ética de la experimentación animal de la Universidad de Antioquia.

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center, weighing 10 kg or more, without individual history of renal, hepatic or digestive insufficiency or clotting diseases, with a normal endoscopic evaluation and stomach mucous biopsy. All the patients presented hip osteoarthritis, with hip dysplasia symptoms diagnosed by radiography, presenting changes to the femur head, acetabulum, Nolberg Angle and Rhodes Distance at grade IV for all the patients. Patient selection criteria. Twenty four patients were included, 18 females and 6 males; 12 were crossbreeds, 9 Labradors, 1 French bulldog, 1 Dalmatian, 1 Boxer. They were randomized into two groups by number selection. Sample calculations had a standard error of 2.05. Treatments. Celecoxib Group, twelve dogs received celecoxib 5 mg/kg orally every 12 hours for 30 days. 66.6% were females and 33.3% males; 58.3% Labradors, 25% crossbreed, 8.3% and 8.3% Dalmatians and Boxers respectively, with an average age of 7±2.4 years. The average weight was 30.5±13.9 kg. Meloxicam Group, twelve dogs received meloxicam 0.2 mg/kg orally every 24 hours for 30 days. The meloxicam group was made up of 12 dogs, 83.3% females, 16.6% males, 75% crossbreeds, 16.6% Labradors and 8.3% French bulldog, with an average age of 7.7±1.7 years old, and a weight of 26.1 ± 11.4 kg. Pain evaluation. Each patient received a complete general evaluation before beginning medication; the evaluator did not take part in the investigation project and did not know about the therapy, and each patient was evaluated for: age, sex, weight, breed, reproductive state, cardiac frequency and respiratory frequency. All the patients were evaluated with the Ortolanni orthopedic test. The presence or absence of pain was evaluated according to the Melbourne scale (UMPS) 0-27 (23). Corresponding: 0, absence of pain, 1-8 light pain, 9-15 moderate and more than 15, severe pain (Table 1). Hematologic evaluation. Samples were obtained from the external jugular vein after skin disinfection and were collected in an EDTA tube (Vacutainer®, Becton, Dickinson) and refrigerated at 2°C and were sent to the Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT), where they were processed in the Abacus Junior Vet ® device (Diatron Ltda, Austria). The hematologic tests performed were: hematocrit (Hto), hemoglobin (Hg), mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean concentration of cell hemoglobin (MCHC), erythrocyte and plasma

Evaluación de protocolos. La evaluación de la evolución de ambos protocolos fue realizada por personal médico calificado, que desconocía el tratamiento suministrado y se basó en formatos de recolección de datos para cada variable. Criterios de inclusión de pacientes. Machos y hembras, de 2 a 10 años de edad, se incluyeron varias razas, que asistieron al centro veterinario, con un peso de 10 kg o más, sin antecedentes individuales de insuficiencia renal, hepática, digestiva o enfermedades de coagulación, con una evaluación endoscópica y biopsia de mucosa estomacal considerada normal. Todos los pacientes presentaron osteoartritis de cadera, posterior a un cuadro de displasia de cadera, diagnosticado por radiografía, con cambios en cabeza de fémur, acetábulo, ángulo de Nolberg y Distancia de Rhodes para un grado IV, para todos los pacientes. Criterios de selección de pacientes. Fueron incluidos veinticuatro pacientes, 18 hembras y 6 machos; 12 fueron cruces, 9 labradores, 1 bulldog francés 1 dálmata, 1 bóxer. Fueron asignados al azar en dos grupos por selección numérica. El cálculo de la muestra se realizó con un error estándar de 2.05. Tratamientos. Grupo Celecoxib, doce perros recibieron celecoxib 5 mg/kg por vía oral cada 12 horas durante 30 días. El 66.6% eran hembras y 33.3% machos; el 58.3% labradores, 25% cruces, 8.3% y 8.3% dálmata y bóxer respectivamente, con una edad media de 7±2.4 años. El peso promedio fue de 30.5±13.9 kg. Grupo Meloxicam, doce perros recibieron meloxicam 0.2 mg/kg por vía oral cada 24 horas durante 30 días. El grupo meloxicam fue formado por 12 caninos, 83.3% eran hembras, 16.6% machos, 75% cruces, 16.6% labradores y 8.3% bulldog francés, con una edad media de 7.7±1.7 años, un peso de 26.1 ± 11.4 kg. Evaluación del dolor. Cada paciente recibió una evaluación general completa antes de comenzar la medicación, el evaluador no hacia parte del proyecto de investigación y no conocía sobre la terapia, se considero de cada paciente: edad, sexo, peso, raza, estado reproductivo, frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. Todos los pacientes fueron evaluados con la prueba ortopédicamente Ortolanni. La presencia o ausencia de dolor se evaluó según la escala de Melbourne (UMPS) 0-27 (23). Correspondiente a 0 ausencia de dolor, 1-8 dolor leve, moderada 9-15 y más de 15 el dolor agudo (Tabla 1).

Molina - Effects of celecoxib and meloxicam for analgesia Table 1. University of Melbourne pain scale (UMPS). Category Biological variables

Behavior variables Response to palpation

Motor activity

Mental state

Posture

Vocalization

Description

Scale

Dilated pupil Normal pupil Percentage of increase in Cardiac frequency <20% >20% >50% >100% Salivation No salivation

2 0

No changes Reaction to touch Reaction before being touched

0 2 3

Resting, sleeping Semiconscious Awake Restless, moving around Eating Submissive Sociable Cautious Agressive

0 0 1 3 0 0 1 2 3

Protects the affected area (fetal position) Lateral position Prone position Sitting or standing Moving Abnormal posture

2 0 1 1 1 2

Does not vocalize Vocalizes when touched Intermitent vocalization Continuous vocalization

0 2 2 3

0 1 2 3 2 0

protein count. The tests were done on days 0, 10 and 30. The laboratory supplied the reference values. Renal evaluation. All the patients were tested for renal function. Samples obtained in sample tubes were refrigerated and sent to ICMT. They measured levels of: creatinine, urea and phosphorus. Additionally, medial cystocentesis was performed to evaluate urine, which was evaluated with strips and an optic microscope for sediment. Results were evaluated according to the reference values provided by the laboratory and samples were collected on days 0, 10 and 30. Hepatic function evaluation. Samples obtained in the external jugular vein in a red tube. Levels of alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (AP), direct and indirect bilirubin and albumin were measured on days 0, 10 and 30 of the treatment. The device used was Biosystems® A15 (Biosystem SA, Barcelona, Spain). The reference values were supplied by ICMT. Clotting evaluation. Samples were obtained in a tube with a blue cap, with potassium citrate, and the tests performed were: prothrombin time and partial thromboplastin time, on days 0, 10 and 30 after beginning medication. Data was obtained through manual coagulometry.

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Evaluación hematológica. Las muestras se obtuvieron de la vena yugular externa después de la desinfección de la piel, se recolectaron en un tubo de EDTA (Vacutainer®, Becton, Dickinson), y refrigeraron a 2°C y fueron enviadas al Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT), donde fueron procesadas en el dispositivo Abacus junior veterinario® (Diatron Ltda, Austria). Las pruebas hematológicas realizadas fueron: hematocrito (Hto), hemoglobina (Hg), volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HGCM), la concentración media de hemoglobina corpuscular (CHGCM), recuento de eritrocitos y proteínas plasmáticas. Las pruebas se realizaron en los días 0, 10 y 30. El laboratorio suministró los valores de referencia. Evaluación renal. Todos los pacientes fueron sometidos a pruebas de función renal. Las muestras obtenidas en tubo seco fueron refrigeradas y enviadas al ICMT. Se midieron niveles de: creatinina, urea y fósforo. Además, se realizó cistocentesis medial para la evaluación de orina, la cual fue evaluada con tirilla y con microscopio óptico para el sedimento. Los resultados fueron evaluados de acuerdo con los valores de referencia proporcionados por el laboratorio y las muestras fueron recolectadas los días 0, 10 y 30. Evaluación de la función hepática. Las muestras se obtuvieron de la vena yugular externa en un tubo de rojo seco. Se midieron los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP), la bilirrubina directa e indirecta y albúmina en los días 0,10 y 30 de tratamiento. El dispositivo utilizado fue Biosystems® A15 (Biosystem SA, Barcelona, España). Los valores de referencia fueron proporcionados por el ICMT. Evaluación de la coagulación. Las muestras se obtuvieron en un tubo de tapa azul con citrato de potasio y las pruebas realizadas fueron: tiempo de protrombina y tiempo de parcial de tromboplastina, en los días 0, 10 y 30 después de comenzar la medicación. Los datos fueron obtenidos a través de coagulometría manual. Evaluación digestiva. Todos los perros fueron sometidos a una evaluación digestiva, una evaluación diaria cualitativa. Los síntomas digestivos que se presentan durante el tratamiento fueron: hiporexia 1, anorexia 2, náuseas 3, vómito 4 y diarrea 5. La hiporexia sé consideró como disminución del apetito y anorexia completa ausencia de apetito durante 24 horas, estos datos se evaluaron de acuerdo con una escala subjetiva dada por el investigador. A cada paciente se le realizó una endoscopia digestiva superior,

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Digestive evaluation. All the dogs went through a digestive evaluation, a daily qualitative evaluation. Digestive symptoms presented during the treatment were: hyporexia 1, anorexia 2, nausea 3, vomiting 4 and diarrhea 5. Hyporexia was considered to be a decrease in appetite and anorexia was the complete absence of appetite during 24 hours; this data was evaluated according to the subjective scale given by the investigator. Each patient was given a superior digestive endoscopy, under general anesthesia, using the following protocol: Propofol 3 mg/ kg intravenous (IV) and isoflurane 1 minimum alveolar concentration (MAC) for 100% of the patients (24). The endoscopic evaluation was done in a descriptive manner, according to the presence or absence of visual alterations in the gastric mucous such as edema, erythema, inflammation and hemorrhaging, assigning numeric values in case of presence or absence of symptoms, without knowledge of each patient’s treatment. Five biopsies were performed on gastric mucous kept in formaldehyde at 10% (v/v) for histopathologic evaluation. The biopsies were evaluated in the pathologic laboratory in the Clinica Medellin (Poblado headquarters), Medellin, Colombia, where the presence or absence of alterations and the state of gastric mucous was described (polymorphonuclear presence, edema, erythrocytes and inflammatory changes). The evaluations were done on days 0 and 30.

bajo anestesia general, utilizando el siguiente protocolo: Propofol 3 mg/kg intravenoso (IV) e isoflurano 1 concentración alveolar mínima (CAM) para el 100% de los pacientes(24). La evaluación endoscópica fue realizada de manera descriptiva, sobre la presencia o ausencia de alteraciones visuales en la mucosa gástrica, como edema, eritema, inflamación y hemorragia, dando valoración numérica a la presencia o ausencia, estas fueron realizadas sin conocer el tratamiento de cada paciente. Fueron realizadas cinco biopsias de la mucosa gástrica conservadas en formaldehido al 10% (v/v) para evaluación histopatológica. Las biopsias fueron evaluadas en el laboratorio de patología de la Clínica Medellín sede Poblado, Medellin, Colombia, donde se informó la presencia o ausencia de alteraciones en la mucosa gástrica y su estado, por método descriptivo (presencia polimorfanuclear, edema, eritrocitos y cambios inflamatorios). Las evaluaciones se realizaron en los días 0 y 30.

Statistical analysis. Data was collected using Microsoft© Excel and analyzed using Statgraphics Centurion XV®, with a signification level of 5%. Multiple range tests was done, Tukey HSD and c2 for all the qualitative data. All data was subjected to ANOVA; additionally, significant statistical differences were determined between groups and protocols for each variable.

RESULTADOS

RESULTS There were no differences between the two protocols with relation to age, sex or weight and there was no relation between these variables and osteoarticular pain. Pain evaluation. Both treatment groups began medication on day 0 with moderate pain according to the University of Melbourne pain scale (UMPS). Ten days later, pain was reduced in both groups for slight pain and there between both groups (p≥0.05). By day 30, pain in both groups had diminished and all presented slight pain, with a significant difference between celecoxib and meloxicam (p≤0.05). Both drugs were effective to diminish pain (Figure 1). Evaluation of the

El análisis estadístico. Fueron recolectados los datos en el programa Excel de Microsoft© y analizados Statgraphics Centurion XV®, con un nivel de significación del 5%. Fueron realizadas Prueba de rango múltiple, Tukey HSD y c2 para los datos cualitativos. Todos los datos fueron sometidos a ANOVA; además, se determinaron diferencias estadísticas significativas entre grupos y protocolos para cada variable

No hubo diferencia entre los dos protocolos con relación a la edad, el sexo o el peso y no hubo ninguna relación entre estas variables y el dolor osteoarticular. Evaluación del dolor. Ambos grupos de tratamiento se iniciaron en la medicación en el día 0 con un dolor moderado según la escala de dolor de la Universidad de Melbourne (UMPS). Diez días más tarde, el dolor se redujo en ambos grupos para el dolor leve y entre los grupos de tratamiento (p≥0.05). Para el día 30 el dolor en ambos grupos había disminuido y todos presentaron dolor leve, con una diferencia significativa entre celecoxib y meloxicam (p≤0.05). Ambos fármacos fueron eficaces para disminuir el dolor (Figura 1). La evaluación de la analgésia demostró que el celecoxib presentó una diferencia estadística entre los días 0 y 30 (p≤0.05), con una disminución del dolor de moderado a leve (Figura 1). Por otro lado el meloxicam no mostró diferencias entre día 0 y día 10 de evaluación (p≥0.05). Todos los pacientes permanecieron con un dolor leve durante el experimento.

Molina - Effects of celecoxib and meloxicam for analgesia analgesic showed that celecoxib presented a statistical difference between days 0 and 30 (p≤0.05) with a lessening of pain, from moderate to slight (Figure 1). On the other hand, meloxicam did not show differences between treatment periods (p≥0.05). All patients had slight pain during the experiment.

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Evaluación hematológica. El hemograma no mostró diferencia entre los protocolos y los días de tratamiento (p≥0.05). Hemoglobina corpuscular media (HGCM) mostró una diferencia entre los protocolos y los días de tratamiento, pero los valores estuvieron dentro de los normales y área de distribución de la especie canina. El leucograma no mostró diferencias entre celecoxib y meloxicam, ni entre días de terapia (p≥0.05). Evaluación renal. No se encontró diferencia (p≥0.05) entre tratamientos y no hubo efectos adversos con respecto a la función renal (Tabla 2).

Table 2. Average values ± SD of creatinine, urea, phosphorus, urine density, protein in urine and urinary pH for celecoxib and meloxicam during treatment. Variable

Day 0

Day 10

Day 30

Creatinine (mg/dl)

Figure 1. Values measured on the UMPS pain scale for celecoxib and meloxicam in treatment time periods (day 0, 10 and 30). Letters (a, b) are statistical intragroup comparisons in the celecoxib group. Numbers (1, 2) are intragroup comparisons in the meloxicam group. Different letters or numbers are a significant statistical difference.

Hematologic evaluation. The hemogram showed no difference between protocols and treatment days (p≥0.05). Mean cell hemoglobin (MCH) was different between protocols and treatment days, but the values were within normal range and distribution area for canines. The leukogram showed no differences between celecoxib and meloxicam or between treatment days (p≥0.05). Renal evaluation. No difference was found (p≥0.05) between treatments there were no adverse effects relating to renal function (Table 2). Hepatic function evaluation. No alterations between protocols and treatment days were found. Only ALT and ALP showed differences (p≤0.05) between treatment days, but they are not indicative of damage, since they are considered normal for canines (Table 3). Clotting evaluation. There was no difference in prothrombin time between protocols or treatment days (p≥0.05). Partial thromboplastin times showed a significant difference (p≤0.05) between patients treated with celecoxib and meloxicam

Celecoxib

0.9±0.1

0.9±0.2

Meloxicam

1.0±+0.2

1.0±0.2

Celecoxib

14.7±14.8

17.6±17.6

16.3±16.3

Meloxicam

14.9±14.9

18.0±4.0

14.2±4.2

Celecoxib

5.2±1.3

6.6±3.4

5.8± 5.8

Meloxicam

5.0±1.6

5.8±1.6

4.7±0.9

Celecoxib

1.002±0.009

1.014±0.011

1.028±0.002

Meloxicam

1.007±0.008

1.012±0.002

1.025±0.001

Celecoxib

1.3±4.3

3.8±6.8

Meloxicam

2.0±4.7

0.0±0.0

Celecoxib

5.8±0.9

6.1±0.2

5.8±0.2

Meloxicam

5.8±0.8

6.2±0.3

6.0±0.1

Urea (mg/dl)

Phosphorus (mg/dl)

Urine density

Protein (mg/dl)

Urinary pH

Table 3. Average ± SD values of variables for liver celecoxib and meloxicam, days of treatment Variable

Celecoxib

Meloxicam

Day 0 Day 10 Day 30 Day 0 Day 10 Day 30 33 ±10 52 ±20 33 ±5

31.00 ±9 46 ±8 30 ±3

36 ±14 47 ±21 34 ±3

34. ±19 44 ±26 33 ±4

33 ±10. 37 ±18 31 ±4

Conjugated Bilirubin 0.29 mg/dl ±0.41

1.01 ±1.87

0.42 ±0.45

0.29 ±0.25

0.78 ±0.97

0.35 ±0.28

Unconjugated 0.19 Bilirubin ±0.18 mg/dl

0.71 ±1.09

0.19 ±0.22

0.22 ±0.12

0.670 ±0.94

0.20 ±0.12

ALT mg/dl* ALP mg/dl** Albumin mg/dl

37 ±16. 60 ±12 33 ±3

Values with asterisk show statistical difference between days of treatment (p<0.05).* ALT, **ALP. Values are within the averages for canines.

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between days 0 and 10. However, the results were within the normal range for canines (Table 4). Table 4. Average values ± standard deviation for clotting tests for celecoxib and meloxicam, days of treatment. Celecoxib

Variable

Meloxicam

Day 0 Day 10 Day 30 Day 0 Day 10 Day 30 Prothrombin Time (sec)

8.2 ±3.4

12.4 ±9.8

7.3 ±1.0

8.2 ±2.1

17.5 ±26.2

7.9 ±1.3

Thromboplastin Time 12.6 (sec) ±1.2

17.8 ±7.3

11.1 ±1.1

12.2 ±3.0

16.6 ±5.3

12.7 ±4.1

Digestive evaluation. Although the majority of clinical digestive symptoms occurred in similar proportions in both groups, in the celecoxib group diarrhea was the most common symptom (60%) while in the meloxicam group it was found in 33.33% (Table 5). Table 5. Percentage of patients with digestive symptoms during treatment period with celecoxib and meloxicam. Digestive symptoms during treatment % % Patient Patient hyporexia anorexia

% Patient nausea

% % Patient Patient vomiting diarrhea

Protocol

Celecoxib

6.66

13.33

60*

Meloxicam

26.66

33.33*

* Value p≤0.05 in the group.

Clinical symptoms associated with digestive disorders were found in both treatment groups. Macroscopic evaluation in digestive endoscopy and microscopic evaluation found compatible lesions with gastric irritation (inflammation, edema, congestion and/or erythema) in both groups at the end of the evaluation period, with a significant difference (p≤0.05) compared with day 0 (Table 6). Table 6. Percentage of gastric alterations found in the endoscopic and histologic evaluation of gastric mucous at days 0 and 30. Group

% Individuals day 0 % Individuals day 30

Celecoxib

80*

Meloxicam

60*

Macroscopic Evaluation (gastritis)

Microscopic Evaluation (gastritis) Celecoxib

100*

Meloxicam

100*

*Values p≤0.05, compared with day 0.

Evaluación de la función hepática. No se encontraron alteraciones entre los protocolos y los días de tratamiento. Sólo ALT y ALP, presentaron diferencia (p≤0.05), entre días de tratamiento, pero no son indicativos de daño, ya que se consideran normales para la especie canina (Tabla 3). Evaluación de la coagulación. El tiempo de protrombina no mostró diferencia entre los protocolos o días de tratamiento (p≥0.05). El tiempo parcial de tromboplastina, mostró una diferencia significativa (p≤0.05) entre los pacientes tratados con celecoxib y meloxicam entre los días 0 y 10. Sin embargo, los resultados estuvieron dentro del rango normal para caninos (Tabla 4). Evaluación digestiva. Aunque la mayoría de los signos clínicos digestivos ocurrieron en proporciones similares en ambos grupos, en el de celecoxib la diarrea fue el síntoma más común (60%) mientras que en el de meloxicam se produjo en 33.33% (Tabla 5). Los signos clínicos asociados a los trastornos digestivos se produjeron en ambos grupos de tratamiento. La evaluación macroscópica en endoscopia d i g e s t i va y l a e va l u a c i ó n m i c r o s c ó p i c a encontraron lesiones compatibles con irritación gástrica (inflamación, edema, congestión y / o eritema) en ambos grupos al final del período de evaluación, con una diferencia significativa (p≤0.05), en comparación con el día 0 (Tabla 6).

DISCUSIÓN El treinta por ciento de los pacientes eran labradores y esto está relacionado con la predisposición racial que tienen para la presentación de displasia de la cadera y la osteoartritis posterior (25). Para los autores, la frecuencia mayor en la raza labrador, puede estar relacionada a que es una de las razas más comunes en la ciudad de Medellín, lo cual hace pensar que la enfermedad es más común en ellos, aunque la literatura describe a esta raza como una de las más predispuestas, el presente estudio no permite determinar la frecuencia de esta alteración en la zona de influencia, por ende sólo es una posible hipótesis. La presencia de la enfermedad y los signos clínicos corresponden con los encontrados por otros autores (12,25,26). La artrosis de cadera es más frecuente en los perros mayores de 5 años (1,5,12), coincidiendo con lo encontrado en este estudio (7.33 años). No

Molina - Effects of celecoxib and meloxicam for analgesia

DISCUSSION Thirty percent of patients were Labradors and this is related to the predisposition of the breed towards hip displacement and rear osteoarthritis (25). The authors feel that the frequency of the Labrador breed can be associated to its being one of the most common breeds in Medellin, making it seem that the disease is more common in them, and although literature describes this breed as one of the most predisposed, the present study does not determine the frequency of this problem in the zone of influence, and therefore it is only a possible hypothesis. The presence of the disease and clinical symptoms correspond to those found by other authors (12, 25, 26). Hip arthrosis is more frequent in dogs over 5 years (1, 5, 12), coinciding with what was found in this study (7.33 years). There was no relation between sex, reproductive state, weight, and the clinical symptoms or the presence of disease, which has been related to physical condition. There was no relationship in this study that weight (28.8 kg) is related to incidence of the disease, as has been described by other authors (12), since there was no difference found between weight and the presence of the disease in this study; a possible explanation is family inheritance, which is hypothetical. All the patients had a positive Ortolanni at the inclusion and had a level of 9.10 on day 0 on the UMPS scale, which indicates moderate pain, very common in OA. Pain diminished with both NSAIDS by the end of the treatment with the last UMPS level at 6 to 7 for celecoxib and 8 to 9 for meloxicam; these levels corresponded to slight pain. Both groups had decreased pain, which corresponds to the descriptions made by other authors for meloxicam and coxibs, and was expected (1, 2, 15). Celecoxib and meloxicam lessened pain according to UMPS values (4). Therefore, it was determined that both are good analgesics for the treatment of pain related to hip arthrosis in canines and coincides with that described for humans (27). Evaluation of red blood cells in this study determined that none of the drugs caused any damage. Blood cell values were not altered, contrary to what has been previously described (20, 28). Continued use for 30 days did not affect this variable. The white cell line variable was not modified in this study and differences found did not have clinical relevance to the health of the patients, since it was within the normal range for canines (29). Measuring plasmatic levels of creatinine, urea, phosphorus, urinary density, aspect, color, sediment, cellularity, crystals, and proteins in

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hubo relación entre el sexo, estado reproductivo, peso y los signos clínicos o la presencia de enfermedad, que se ha relacionado a condición física. No se pudo relacionar en este estudio que peso (28.8 kg) está relacionado con la incidencia de la enfermedad, como ha sido descrito por otros autores (12), pues para el presente trabajo, no se encontró diferencia entre peso y presencia de enfermedad, posiblemente la explicación esta dada más por herencia familiar, lo cual es hipotético. Todos los pacientes tuvieron un Ortolanni positivo a la inclusión y tenían un nivel de 9.10 en el día 0 en la escala UMPS, que se interpreta como dolor moderado, muy común en la OA. El dolor disminuyó con ambos AINES al final del tratamiento con un último nivel UMPS 6 a 7 para celecoxib y 8 a 9 para meloxicam; estos niveles corresponden a dolor leve. En ambos grupos disminuyó el dolor, que corresponde a la descripciones hechas por otros autores para meloxicam y coxibs, siendo lo que se esperaba (1,2,15). El celecoxib y meloxicam mejoraron el dolor de acuerdo con los valores UMPS (4). Por lo tanto se determina que ambos son buenos analgésicos para el tratamiento del dolor en la artrosis de cadera en la especie canina y coincide con lo descrito en humanos (27). La evaluación de la línea de células rojas de la sangre en este estudio determinó que ninguno de los fármacos causó ningún daño. No hubo alteración en los valores de las células sanguíneas; contrariamente a lo que se ha descrito previamente (20,28). El uso continuo por 30 días no afectó esta variable. La variable de línea de células blancas de la sangre no se modificó en este estudio y las diferencias encontradas no tenían relevancia clínica para la salud de los pacientes, ya que se encontraban dentro de los rangos normales para la especie canina (29). La medición de los niveles plasmáticos de creatinina, urea, fósforo, densidad urinaria, aspecto, color, sedimento, celularidad, cristales, y proteínas en orina no mostraron alteración, se presume que la funcionalidad renal estuvo conservada, lo cual es similar a los datos para otro coxib como el firocoxib, usado durante 90 días (18). En este estudio no se encontró una relación entre el uso de estos medicamentos durante 30 días y los incrementos en creatinina, urea y cambios en la densidad urinaria, relacionados con la falla renal aguda. Esto es similar a lo que se ha encontrado con otros coxibs y meloxicam en perros con artrosis (18,19,30).

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urine showed no alteration; it is presumed that renal functionality was conserved, which is similar to data for other coxib, such as firocoxib, used for 90 days (18). This study did not find a relationship between the use of these medicines for 30 days and an increase in creatinine, urea and changes in urinary density related to acute renal failure. This is similar to what has been found with other coxibs and meloxicam in dogs with arthrosis (18, 19, 30). With meloxicam and celecoxib patients did not show modifications in the evaluation of hepatic variables, which was similar to results found by Luna and Steagall (15), but they do not coincide with reports of hepatotoxicity in dogs and human beings (7) or other hepatic-renal lesions described after their continued use (17) due to the 2C9/3A4 metabolism by cytochrome P450 that avoids bioaccumulation and toxicity. The results of levels of alkaline phosphatase and alanine aminotransferase were similar to other reports (30). Hepatic lesions reported in dogs are idiosyncratic and not toxic (3). Prothrombin time and partial thromboplastin time were not different in this study due, perhaps, to the specificity and selectivity of the drugs for COX2 (3). Neither meloxicam nor celecoxib affected clotting times in canines compared with reports from other authors that found a COX1 inhibitor as an inhibiting factor of platelet aggregation or thrombotic action of celecoxib. The anticlotting effect of meloxicam was not found in this study, compared with reports from other authors. Digestive evaluation in this study found that celecoxib and meloxicam produce lesions in the gastric structure from day 10, which is similar to the results found in other studies with humans and animals (6, 15). COX2 inhibition does not impede the drugs from causing chronic gastritis due to their pharmacologic characteristics, since they are acidic. Therefore it is necessary to use gastric protectors or chlorhidric acid antisecretory agents when they are used for extended periods (6). The presence of diarrhea as a predominant clinical symptom in dogs using celecoxib is due to the damaging effects of NSAIDS on the digestive enzymes of intestinal mucous, described by some authors in rodents and canines. The decrease in the absorption capacity of the intestines (31) would produce osmotic type diarrhea symptoms due to decreasing the absorption capacity of water and salts. In conclusion, celecoxib and meloxicam diminished osteoarticular pain in the short and long term, from day 10 to day 30 of the treatment. Analgesia was

Con meloxicam y celecoxib los pacientes no mostraron modificaciones en la evaluación de las variables hepáticas, lo cual fue similar a los resultados encontrados por Luna y Steagall (15), pero no coinciden con los informes de hepatotoxicidad en perros y seres humanos (7), ni otras lesiones hepato - renales descritas después de su uso continuo (17), debido a la 2C9/3A4 metabolismo por citocromo P450 que evita bioacumulación y la toxicidad. Los resultados de las mediciones de los niveles de fosfatasa alcalina y alanina aminotransferasa fueron similares a otros informes (30). Las lesiones hepáticas reportadas en los perros son idiosincrásicas y no tóxicos (3). El tiempo de protrombina y tiempo parcial de tromboplastina no mostraron diferencias en este estudio debido quizás a la especificidad y la selectividad de los fármacos para la COX2 (3). Ni meloxicam, ni celecoxib afectaron los tiempos de coagulación en caninos en comparación con las publicaciones de otros autores que encontraron una inhibición de COX1 como un factor inhibidor de la agregación plaquetaria o la acción trombótica de celecoxib (28). El efecto anticoagulante de meloxicam no se encontró en el presente estudio, en comparación con los informes de otros autores. La evaluación digestiva en este estudio encontró que el celecoxib y meloxicam producen lesiones en la estructura gástrica, a partir de los primeros 10 días, lo cual es similar a los resultados de otros estudios con seres humanos y animales (6,15). La inhibición de la COX2 no impide que los fármacos puedan causar gastritis crónica, debido a sus características farmacológicas, ya que tiene un carácter ácido. Por lo tanto, es necesario utilizar protectores gástricos o agentes antisecretores de ácido clorhídrico, cuando el uso sea por un período prolongado (6). La presencia de diarrea como un signo clínico predominante en perros utilizando el celecoxib es debido a los efectos dañinos de los AINES sobre las enzimas digestivas de la mucosa intestinal, descrito por algunos autores en roedores y caninos. La disminución de la capacidad de absorción intestinal (31) llevaría a un cuadro de diarrea de tipo osmótica por disminución en la capacidad de absorción de agua y sales. En conclusión celecoxib y meloxicam disminuyeron el dolor osteoarticular en el corto y largo plazo, desde 10 hasta 30 días de tratamiento. La analgesia se encontró desde los primeros días de tratamiento y el dolor se redujo de moderado a leve, según los UMPS. La mayor disminución se encontró en el grupo de celecoxib en comparación con meloxicam. Ninguno de los fármacos evaluados durante 30

Molina - Effects of celecoxib and meloxicam for analgesia found from the first days of treatment and pain was reduced from moderate to slight, according to the UMPA. Greater decrease was found in the celecoxib group in comparison to meloxicam. None of the drugs evaluated during 30 days showed adverse effects in renal, hepatic, coagulation or hematologic function. Meloxicam and celecoxib cause acute gastritis. Acknowledgements To the School of Veterinary Medicine and Zootechnics at the Universidad CES for their sponsorship of this project, and to Caninos y Felinos© Clínica Veterinaria in Medellin, Colombia, for their logistic support. Conflict of interest The authors declare that no sponsorship from commercial laboratories was received. The idea came from personal interest in drug development and the search for new alternatives.

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días mostró efectos adversos en la función renal, hepática, la coagulación o la función hematológica. El meloxicam y celecoxib causan gastritis aguda. Agradecimientos A Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad CES, por el patrocinio de este proyecto y a Caninos y Felinos©, Clínica Veterinaria en la ciudad de Medellín, Colombia por el apoyo logístico. Conflicto de intereses Los autores declaramos que no se recibió ningún patrocinio de laboratorios comerciales. La idea surgió del interés personal para el desarrollo farmacológico y la búsqueda de nuevas alternativas.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4301-4315, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Blood biochemical parameters of broilers fed differently thermal processed soybean meal Parámetros bioquímicos en sangre de pollos alimentados con harina de soja procesada bajo distintos procesos térmicos Mojgan Nahavandinejad,1 M.Sc, Alireza Seidavi,1* Ph.D, Leila Asadpour,2 Ph.D, Rita Payan-Carreira3 Ph.D. Islamic Azad University, Rasht Branch, Department of Animal Science, Rasht, Iran. 2Islamic Azad University, Rasht Branch, Department of Veterinary Medicine, Rasht, Iran. 3Animal and Veterinary Research Centre-CECAV; Department of Zootecnics, ECAV, UTAD, Vila Real, Portugal. *Correspondence: alirezaseidavi@iaurasht.ac.ir 1

Received: February 2014; Accepted: July 2014.

ABSTRACT Objective. A 42-days feeding trial was carried out to evaluate the influences of differently thermal processed soybean meal on the broilers blood biochemical parameters. Materials and methods. A total of 200 male birds of Ross strain were allocated into five different diets formulated using differently heat-treated soybean meals, with ten birds per treatment and per replicate. Diets contained: raw soybean (controls), autoclaved for a short (121°C, 20 min; Aut1 group) or medium length period (121°C, 30 min; Aut2 group) soybean meal, micro-waved soybean meal (46°C, 540 Watt, 7 min; McW group) and browned soybean meal (120°C, 20 min; Brn group). Results. Blood serum metabolites showed that all treated diets presented lower lipid metabolism makers and higher protein metabolism markers. Broilers showed increased final body weight when fed heat-treated meals compared with control. Results suggested that thermal treatments altered the lipid metabolism in broilers that might originate a decrease in abdominal fat deposition. Conclusions. Comparison of the results for all the treated groups showed the Aut2 treatment is the most suitable method for soybean thermal treatment processing; in contrast, the Aut1 treatment had the closest results to the control group. Key words: Broiler chicken, cholesterol, processing, soybean meal, total protein (Source: CAB). RESUMEN Objetivo. Se llevó a cabo un estudio de 42 días para determinar la influencia de la introducción de harina de soja sometida a diferentes procesos térmicos sobre los parámetros sanguíneos bioquímicos de pollos de engorde. Materiales y métodos. Un total de 200 pollos machos, de raza Ross, fueron asignados a cinco dietas equivalentes conteniendo harina de soja sometida a diferentes tratamientos térmicos, creando grupos de10 aves por cada tratamiento y por replicado. Los tratamientos térmicos fueron: harina de soja en bruto (Grupo control), harina de soja en autoclave durante un período de tiempo corto (121°C, 20 min; Grupo Aut1) o medio (121°C, 30 minutos; Grupo Aut2), harina de soja irradiado en el microondas (46°C, 540 Watts, 7 min; Grupo McW) y harina tostada de soja (120°C, 20 min; Grupo Brn). Resultados. Todos los grupos de tratamiento mostraron una disminución delos 4301

4302

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niveles de los marcadores de metabolismo de los lípidos y un aumento del metabolismo de la proteína circulante, en comparación con el grupo control. Los pollos alimentados con dietas conteniendo soja tratada mostraron además un aumento en su peso corporal final, en comparación con los del control. Los resultados sugieren que los tratamientos térmicos interfieren con el metabolismo de los lípidos, lo que puede originar una menor deposición de grasa abdominal en los pollos. Conclusiones. La comparación de los datos obtenidos para los diferentes tratamientos térmicos identifica el tratamiento en autoclave (Aut2) como el método más adecuado para el procesamiento de la soja. En contraste, el tratamiento en autoclave (Aut1) demostró ser el método con resultados más semejantes a los del control. Palabras clave: Dieta deharina de soja; procesamiento; colesterol; proteínas totales; pollos de engorde (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Growing of global population is accompanied by an increased demand for continuous and diversified food supply, which drove the need for the production of sufficient, safe, nutritious and affordable food, not only for feeding but also for people wealth. Further, livestock production plays a major social role in developing countries, while providing food, income, employment and many other contributions to rural development.

El crecimiento de la población global se acompaña de una demanda creciente de un suministro continúo y diversificado de alimentos, lo que impulsó la necesidad de producir cantidades suficientes de alimentos seguros, nutritivos y económicos para alimentar a la población. Además, la producción de aves de corral desempeña un papel social importante en países en vías de desarrollo al proveer comida, ingresos, empleo y muchas otras contribuciones al desarrollo rural.

The structure of the world livestock industry changed accordingly, in several parameters, such as size, intensification, efficiency and genetic background of the animals (1).

Por eso la industria agropecuaria a nivel mundial cambió en varios parámetros, tales como tamaño, intensificación, eficiencia y antecedentes genéticos de los animales (1).

Feeding assumed a major importance in poultry production and aims to maintain relatively low prices while increasing poultry meat and egg production. The main aspects targeted in research include the improvement of feed digestibility and feed efficiency (2); the use of least-cost and alternative ingredients in diet formulation; the interaction of feed value and nutrient metabolism on meeting bird requirements (2); influences of feed on the birds immunology and health (3); and the production of a high quality final product meeting the market requirements.

La alimentación adquirió una importancia mayor en la producción de aves de corral para mantener precios relativamente bajos mientras aumenta la producción de carne y huevos. Los aspectos principales que fueron el enfoque de la investigación incluyen el mejorar la digestibilidad de los alimentos y la eficiencia alimenticia (2); el uso de ingredientes alternativos y de menor costo en la formulación de dietas; la combinación del valor de la alimentación y el metabolismo de nutrientes para suplir los requisitos de las aves (2); la influencia del alimento en la inmunología y salud de las aves (3); y la producción de un producto final de alta calidad que satisface los requerimientos del mercado.

There are several factors that may affect feed and nutrient intake level, and consequently compromise the efficiency of poultry production. Among such factors, the physical form of feed, the feed flavour, the presence of anti-nutritional factors, the changes in the digestive tract microflora and the nutrient absorption are main issues that need attention. Corn has been gradually changed by soybean in many poultry diets. Soybeans are widely used as protein sources in human and animal diets, but it contains certain anti-nutritional factors (such as the trypsin inhibitor and lectins) that may interfere with protein digestibility and absorption

Hay varios factores que pueden afectar el nivel de la alimentación y la absorción de nutrientes, y que comprometen la eficiencia en la producción de aves. Entres tales factores están la forma física del alimento, el sabor del alimento, la presencia de factores antinutricionales, los cambios en la microflora del aparato digestivo, y la absorción de nutrientes, siendo los principales factores que requieren atención. En muchas dietas para aves el maíz ha sido reemplazado por la soya. La soya es utilizada ampliamente como fuente de proteína en las dietas humanas y animales, pero posee ciertos factores antinutricionales (tales como los inhibidores de tripsina y

Nahavandinejad - Haematology under feed thermal processing as well as with gut homeostasis, thus reducing of weight gain. Thereby, it is important to explore the effects of different processing methods on its nutritional quality (4), and consequently on birds health and growth rates. Though non-thermal treatments may be used to neutralize anti-nutritional factors in soybeans (2), a wide range of heat-treatments are the most commonly used as they promote protein denaturation (4); however excessive heat-treatment may compromise also the nondeleterious protein and amino acid availability in the meal, which is particularly prejudicial on what concerns the essential amino acids and vitamins, even if overheating is avoid (2, 5). So, it is important to determine the proper heat-treatment for an adequate formulation of soybean diets. Autoclaving, extrusion and microwave irradiation have been described as effective methods for reducing deleterious constituents from seed legumes (4). Due to differences in the methods, the success in the inactivation of non-nutritional factors surely differs between these methods, since the degree of protein denaturation depends on the intensity and duration of the thermal treatments and also on the parallel effect of pressure that is used in certain methods such as autoclaving. The goal for the thermal processing of seed legumes for poultry nutrition is to increase the nutritional value of feed and to maximize the bird performance. To select the appropriate method for these heat procedures it is ought to compare the process outcome in the same conditions, to minimize the side effects of environmental factors on the groups’ performances. However, limited research has been conducted in poultry fed soybean based diets in regard to soybean processing on blood parameters of broilers. Therefore, this study aimed to investigate the effect of different heat processing methods on the blood serum parameters in broilers.

MATERIALS AND METHODS Study site. This study was conduct in 2011, in the poultry farm facilities and the Nutrition and Milk Industry Animal Nutrition Laboratory of the Agriculture Faculty of Islamic Azad University, Rasht Branch, Iran (37°15’ N and 49°36’, 5 m above sea level). The experiments lasted 42 days. The study was approved by the Scientific Board of the Islamic Azad University, and was conducted

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lecitinas) que pueden interferir con la digestibilidad de la proteína y su absorción, además del homeostasis de los intestinos, reduciendo así el aumento de peso. Por eso, es importante explorar los efectos de diferentes métodos de procesamiento sobre la calidad nutritiva (4) y en consecuencia la salud de las aves y los índices de crecimiento. Aunque los tratamientos no térmicos pueden ser usados para neutralizar los factores anti-nutricionales de la soya (2), un amplio rango de tratamientos térmicos son usados con más frecuencia, puesto que promueven la desnaturalización de proteínas (4); sin embargo, el exceso de tratamiento térmico puede adicionalmente comprometer las proteínas que no son nocivas y la disponibilidad de los aminoácidos en el alimento, lo que sería particularmente perjudicial en lo que concierne a los aminoácidos esenciales y vitaminas, aun si se evita sobrecalentamiento (2), 5). Así que es importante determinar el tratamiento térmico apropiado para formular de manera adecuada la dieta de soya. Para reducir constituyentes nocivos de legumbres de granos, se han descrito como métodos efectivos el autoclave, la extrusión, y la irradiación por micro ondas (4). Debido a diferencias entre estos métodos, el éxito al inactivar los factores no nutricionales difiere entre los métodos, puesto que el grado de desnaturalización de la proteína depende de la intensidad y duración de los tratamientos térmicos y también en los efectos paralelos de presión que se usa en ciertos métodos, como el de autoclave. El objetivo en el procesamiento térmico de leguminosas de grano, para alimentar aves de corral, es de aumentar el valor nutricional del alimento, y maximizar el rendimiento del ave. Para seleccionar un método apropiado para estos procedimientos térmicos, se debe comparar el resultado de los procesos bajo las mismas condiciones para minimizar los efectos secundarios de los factores ambientales en el rendimiento del grupo. Sin embargo, solo se han hecho investigaciones limitadas en aves sometidas a tratamientos a base de soya en lo que tiene que ver con los parámetros sanguíneos de pollos de engorde. Por ende, este estudio tiene el objetivo de investigar el efecto que tienen diferentes métodos de procesamiento térmico en los parámetros sanguíneos de pollos de engorde.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio del estudio. Este estudio se llevó a cabo en 2011 en las instalaciones de la granja avícola y el Laboratorio de la Industria de Nutrición y Leche Nutrición Animal de la Facultad Agropecuario de la Islamic Azad University, Rasht Branch, Iran (37°15’ N y 49°36’, 5 msnm). Los experimentos duraron 42 días.

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in respect to the International Guidelines for research involving animals (Directive 2010/63/ EU). Animals. In this study, 200 male Ross 308 broilers were randomly distributed into 5 treatments with 4 replicates per treatment, in a total of 40 birds per treatment. The experiments started with one-day-old chicks, which were randomly assigned into groups with similar mean body weights, with a starting average weight of 42 g.

El estudio fue aprobado por el Scientific Board of the Islamic Azad University, y se llevó a cabo respetando las Normas Internacionales para investigaciones con animales (Directiva 2010/63/EU). Animales. Para este estudio, 200 machos de la raza Ross y 308 pollos de engorde fueron distribuidos en 5 grupos de tratamiento y 4 por tratamiento, con un total de 40 aves por tratamiento. Los experimentos empezaron con pollitos de un día que fueron asignados a grupos según el peso corporal medio, con un peso mínimo promedio de 42 g.

The experimental diets were maintained until the age of 42 days, thus covering 3 periods: the starter (1-14 days), the grower (15-35 days) and finisher (36-42 days) periods.

Las dietas experimentales se mantuvieron hasta la edad de 42 días, abarcando así 3 periodos: los periodos de iniciador (1-14 días) crecimiento (15-35 días), y finalizador (36-42 días).

Soybean thermal processing and diets formulation. All thermal treatments were performed at the Nutrition and Milk Industry Laboratory of the Faculty of Agriculture, Islamic Azad University, Rasht Branch. For the heattreatment, portions of 1.5 kg were placed into the centre of trays and then distributed homogeneously over the tray surface to achieve uniformity during treatment. After the thermal treatments, the meals were allow to cooling in a different tray before being transferred into plastic bags and stored at an adequate temperature (25ºC, 60% humidity).

Procesamiento térmico de soya y dietas de formulación. Se efectuaron todos los tratamientos térmicos en el Laboratorio de la Industria de Nutrición y Leche de la Facultad de Agropecuaria de la Islamic Azad University, sede Rasht. Para el tratamiento térmico, se colocaron porciones de 1.5 kg en el centro de bandejas y luego fueron distribuidos de manera homogénea sobre la superficie de la bandeja para alcanzar la uniformidad durante el tratamiento. Después de los tratamientos térmicos, se enfrió la harina en otra bandeja antes de ser transferida a bolsas pasticas y almacenadas bajo a una temperatura adecuada (25ºC, humedad 60%).

In this study, the five treatments evaluated and the soybean processing was as follows:

En este estudio, los cinco tratamientos que se evaluaron y el procesamiento de soya se llevaron a cabo de la siguiente manera:

a) Raw soybean meal, originated from the Cerrado region of Brazil, as controls (Ctr group); b) Soybean meal autoclaved at 121°C under 1 Pascal pressure (Iran TebZaeem autoclave 2000), for short or medium length treatment (respectively 20 minutes for Aut1, or 30 minutes for Aut2). c) Soybean meal browned at 120°C (20 min; Brn group)-Soybean browning was conducted using Do 636 Memert Oven, UNB400 model, with beans poured into a special aluminium container of 2cm height, for achieving an homogeneous temperature for the entire meal. The tray entered the oven when the temperature stabilized at 120°C and remained in the oven for 20 min. d) Micro-waved soybean meal (46°C, 540 Watt, 7 min; McW group)- Microwave treatment was performed on a household LG microwave, TCR 4284-CC. Before treated in the microwave, soybean was milled, the atmospheric humidity was determined using a psychrometer and the moisture in the sample adjusted to 25%.

a) Harina de soya cruda, de la región Cerrado de Brasil, como grupo de control (grupo Ctr); b) Harina de soya en autoclave a 121°C bajo presión a 1 Pascal (Iran TebZaeem autoclave 2000), por tratamientos de plazo corto o mediano (20 minutos para Aut1, o 30 minutos para Aut2, respectivamente). c) Harina de soya tostada a 120°C (20 min; grupo Brn). Fue tostada utilizando un horno Do 636 Memert, modelo UNB400, con granos vaciados en un envase de 2 cm de altura para logar una temperatura homogénea para toda la harina. La bandeja fue introducida en el horno cuando la temperatura se estabilizó a 120°C y permaneció en el horno por 20 min. d) Harina de soya en microondas (46°C, 540 W, 7 min; grupo McW). El tratamiento microondas fue llevado a cabo en un microonda LG de uso doméstico, TCR 4284-CC. Antes de ser tratado en microondas, el grano fue molido y la humedad atmosférica fue determinada utilizando un psicrómetro, y la humedad en la muestra fue ajustada a 25%. Después, los granos fueron introducidos en microondas dentro de

Nahavandinejad - Haematology under feed thermal processing Afterwards, the soybeans entered the microwave within 7 cm diameter Pyrex and treated at 540 watt for 7 min. The composition of the diets used in this study is presented in table 1. Soybean was incorporated in all the diets in a fixed proportion of 40%, 35% and 39.97% respectively in the starter, the grower and the finisher diets (Table 1). Table 1. Composition of the diets used in this study for the different rearing periods. Starter

Grower

Finisher

Corn

Ingredient (%)

46.09

50.91

48.88

Soybean Meal

40.00

35.00

39.97

Oil

4.56

5.45

7.39

Fish Meal

3.00

Meat Meal

3.00

DL-Methionine

0.29

0.23

0.17

L-Lysine*HCL

0.04

L-Threonine

0.03

Ca22%P18%

0.99

0.75

1.64

‍CaCO3

0.98

0.76

1.00

K-Bicarbonate

0.05

NaCl

0.37

0.45

0.03

0.60

0.50

100

KCl Vitamins & Minerals Mixture Total (%)

Sampling and blood parameters. Forty birds in each experimental group were weighted at the end of the first week and at the end of the experiment, at the age of 42 days. Moreover, at the end of the feeding trials, one bird from each replicate, in a total of 4 birds for each experimental diet, was randomly selected for blood sampling. Blood samples (~1 mL/bird) were collected from the wing veins into tubes for serum separation and rapidly transferred to the laboratory for analysis (within 2 h of collection). After centrifugation (3000 g, for 10 min at room temperature) serum was harvested. Blood parameters analysed in this study included: glucose (GLU), cholesterol (Chol), triglycerides (TG), very low-density lipoprotein (VLDL), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), HDL/LDL ratios, uric acid (UAc), albumin (Alb), total protein (TP), calcium (Ca) and phosphorus (P). The measurements were performed with commercial kits from Pars Azmoon (Pars Azmoon Co., Tehran, Iran), according to the manufacturer’s instructions. GLU was measured by a glucoseoxidase photometric assay (6), while Chol, TG, HDL, LDL and VLDL were determined by enzymatic

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un envase Pyrex de 7 cm y tratado a 540 W por 7 minutos. La composición de las dietas utilizadas en este estudio se presentó en Tabla 1. Harina de soya fue incorporada en todas las dietas en una proporción establecida de 40%, 35% y 39.97% respectivamente para las dietas de iniciador, crecimiento y finalizador (Tabla 1). Muestreo y parámetros sanguíneos. Cuarenta aves de cada grupo experimental fueron pesadas al final de la primera semana y al final del experimento, a la edad de 42 días. Además, al final de los ensayos alimenticios, un ave de cada replicado, un total de 4 aves para cada dieta experimental, fueron escogidas para un muestreo de sangre. Muestras de sangre (~1 mL/ave) fueron sacadas de las venas de las alas en tubos para separar suero y transferidas de manera rápida (dentro de dos horas de ser extraídas) al laboratorio para análisis. Después de centrifugar (3000 g por 10 min a temperatura de ambiente) el suero fue analizado. Los parámetros sanguíneos analizados en este estudio incluyeron: glucosa (GLU), colesterol (Chol) triglicéridos (TG), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), índice HDL/LDL, ácido úrico (UAc), albumina (Alb), proteínas totales (TP), calcio (Ca) y fosforo (P). Las medidas fueron tomadas con kits comerciales de Pars Azmoon (Pars Azmoon Co., Teherán, Irán), según las instrucciones del fabricante. Se midió la GLU por medio de un ensayo fotométrico de glucosa-oxidase (6), mientras que se determinó los valores de Chol, TG, HDL, LDL y VLDL por ensayos enzimáticos CHOD-PAP, la reacción siendo revelada por la reacción con aminoantipyrin (6). Se determinó el Alb basado en el método de bromocresol verde (6), mientras el UAc fue determinado por los métodos enzimáticos utilizando el método uricaseTOOS (6) y se ensayó el TP usando el método Biuret (6). Se estimó el calcio del complejo formado de kersulphetalina (6), y el fosforo fue determinado por el método fotométrico (6) por medio de una prueba UV. Analisis de datos. Datos complicados durante los ensayos experimentales se organizaron en hojas de Excel y los análisis estadísticos se hicieron con SAS® 8.0 (7). Para el análisis estadístico el promedio de los resultados replicados fue considerado con una unidad experimental. Datos recolectados en este experimento fueron sujetos a análisis de varianza utilizando procedimientos GLM en una forma completamente aleatoria; antes de practicar el análisis de varianza, la prueba de normalidad se llevó a cabo. La comparación promedio entre grupos y replicados se logró por medio de la prueba Tukey multi-dominio a un 5% de probabilidad.

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CHOD-PAP assays, the reaction being revealed by reaction with aminoantipyrin (6). Alb was determined based on the bromocresol green method (6), whilst the UAc was determined by enzymatic methods using the uricase-TOOS method (6) and TP was assayed by the Biuret method (6). Calcium was estimated from formed kersulphetaline complex (6), and phosphorus was determined by photometric method (6) by means of UV test. Data analysis. Data gathered during the experimental trials were organised in Excel data sheets and the statistical analysis performed with SAS® 8.0 (7). For statistical analysis the mean of replicate results was considered as the experimental unit. Data gathered in this experiment were subjected to analysis of variance using GLM procedures in a completely randomized design; before performing the analysis of variance, normality test was carried out. Mean comparisons between groups and replicates was achieved by the multi-domain Tukey test at 5% probability.

RESULTS Data obtained in this study are summarized in tables 2 and 3. At the end of the experimental period, the soybean thermal processing influenced the final body weight (p=0.012). By week 1, the groups presenting the highest body weights were the Aut1 and McW (p=0.017 and p=0.002, respectively), whilst the Aut2 group tend to present lower weight than all others heat-treated groups (p=0.015). All treatment Aut2, Brn, and McW groups presented higher body weight than controls at the end of the study (Table 2), with Aut2 and McW groups being those with the highest values at the end of the trials (respectively, p≤0.000 and p=0.000), just fallowed by Brn group (p=0.006). Soybean treatment did not significantly affect glucose concentration in blood (p=0.687; Table 3). The GLu concentrations in serum were similar between groups Aut1, McW and control, whilst an increase was noticed in Aut2 and Brn groups (Figure 1). Serum Chol levels did not vary between groups (p=0.158), thought they were generally lower than control group. Still, though no differences were found in absolute serum values between soybean treatment groups (Table 3), a tendency was detected in Aut2 group to present the lowest serum values for Chol (p=0.0523; Figure 1). Similarly, TG serum levels did not differ among the dietary groups (p=0.589). Nevertheless, lower serum levels were observed in birds fed

RESULTADOS Datos obtenidos en este ensayo se resumen en tablas 2 y 3. Al final del periodo experimental, el tratamiento térmico de la soya afectó el peso corporal final (p=0.012). Para la semana 1, los grupos que presentaron los pesos corporales más altos fueron Aut1 y McW (p=0.017 y p=0.002, respectivamente), mientras que el grupo Aut2 presento peso corporal más bajo que todos los demás grupos de tratamiento térmico (p=0.015). Todos los grupos de tratamiento Aut2, Brn, y McW presentaron peso corporal más alto que los grupos de control para el final de los ensayos (Tabla 2), con los grupos Aut2 y McW siendo los que tenían los valores más altos para el final de los ensayos (respectivamente, p≤0.000 y p=0.000), seguido por el grupo Brn (p=0.006). El tratamiento con soya no afectó de manera significativa la concentración de glucosa en la sangre (p=0.687; Tabla 3). Las concentraciones de GLu en suero fueron similares entre los grupos Aut1, McW y control, mientras se notó aumentó en los grupos Aut2 y Brn (Figura 1). Los niveles Chol en suero no variaron entre los grupos (p=0.158), aunque fueron más bajos en general que el grupo de control. Aunque no se encontraron diferencias en los valores absolutos de suero entre grupos de tratamiento con soya (Tabla 3), se detectó una tendencia en el grupo Aut2 a presentar los valores más bajos en suero para Chol (p=0.0523; Figura 1). Asimismo, los niveles TG en suero no variaron entre los grupos de tratamiento (p=0.589). Sin embargo, se vieron niveles de suero más bajos en aves alimentadas con alimento de autoclave e irradiadas con micro ondas (Tabla 3); Brn el grupo que mostró los valores más cercanos en comparación con Ctr (Figura 1). El tratamiento térmico con soya afectó de manera significativa las concentraciones HDL en el suero de pollos de engorde (p=0.043), siendo más baja en los grupos tratados cuando se comparó con el control Table 2. Comparison of the total body weight (in grams) of chicks at 1st week and by the end of the feeding trials, at 42 days. Treatments**

Day 7

Day 42

126.50c±1.24

2423.57b±15.43

Aut1

132.88a±1.74

2546.50ab±91.96

Aut2

128.63ab±1.66

2676.70a±32.09

Brn

129.00ab±2.79

2595.45a±27.42

McW

132.63a±0.55

2613.82a±28.82

P-value

0.0174

0.0121

Ctr

In each column, the averages with different letters indicate significant differences (P<0.05) between treatments. ** Ctr: raw soybean (controls), Aut1: autoclaved for a short (121°C, 20 min) soybean meal; Aut2: autoclaved for a medium length period (121°C, 30 min) soybean meal; Brn: browned soybean meal (120°C, 20 min; Brn group); McW: micro-waved soybean meal (46°C, 540 Watt, 7 min; McW group). *

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Table 3. Comparison of blood serum metabolites (mean ±SEM) at day 42 in the blood of broilers from the five studied treatments*. Glu [mg/dl] Chol [mg/dl] TG [mg/dl] VLDL [mg/dl] HDL [mg/dl] LDL [mg/dl] HDL/LDL UAc [mg/dl] Alb [g/dl] TP [g/dl] P [mg/dl] Ca [mg/dl]

Ctr 265.500 ± 4.093 115.000± 4.664 88.500± 5.838 17.700 ± 1.168 68.000 ± 2.041 a 29.750± 1.702 2.297± 0.107 6.950± 0.762 1.130± 0.063 b 3.025± 0.103 b 5.425± 0.131 9.820± 0.531

Aut1 Aut2 262.250± 6.909 273.500± 10.822 102.500± 5.809 98.250± 5.721 72.250± 12.566 74.000± 6.272 14.450± 2.513 14.950± 1.181 b 62.750± 2.839 59.000± 2.739 b 31.250± 3.326 26.000± 1.780 2.052 ± 0.197 2.277 ± 0.083 8.250± 0.835 10.525± 1.694 1.400± 0.071 a 1.370± 0.048 a 3.625± 0.197 a 3.550± 0.119ab 5.325± 0.228 5.275± 0.085 10.620± 0.303 10.270± 0.335

Treatments** Brn McW 281.750± 16.800 269.500± 6.035 100.000± 5.788 111.750± 5.282 83.500± 6.764 74.750± 8.076 16.700± 1.252 14.950± 1.615 b 58.750± 2.097 66.750± 2.097 a 27.750± 2.750 29.250± 1.652 2.162± 0.177 2.272± 0.081 9.100± 1.207 10.450± 1.502 1.270± 0.025 ab 1.300± 0.041 ab 3.375± 0.103 ab 3.475± 0.125 ab 5.175± 0.149 5.350± 0.050 10.370± 0.629 10.400± 0.234

CV (%) 7.400 10.360 21.050 20.880 7.580 16.260 12.400 27.690 8.000 7.860 5.000 8.400

P-value 0.687 0.158 0.589 0.598 0.043 0.584 0.692 0.263 0.016 0.050 0.762 0.789

In each row, the averages with different letters indicate significant differences (P<0.05) between treatments. Ctr: raw soybean (controls), Aut1: autoclaved for a short (121°C, 20 min) soybean meal; Aut2: autoclaved for a medium length period (121°C, 30 min) soybean meal; Brn: browned soybean meal (120°C, 20 min; Brn group); McW: micro-waved soybean meal (46°C, 540 Watt, 7 min; McW group). SEM: Standard error of the mean. CV :Coefficient of variation *

with autoclaved and microwave irradiated meals (Table 3); Brn was the group that showed the closest values compared to Ctr (Figure 1). Soybean thermal treatment significantly affected the HDL concentrations in broilers´ serum (p=0.043), being lower in all treated groups when compared to control (Table 3). HDL levels did not differ between groups Ctr and McW (Figure 1). Values for blood concentrations of HDL were particularly lower in groups Aut1, Aut2 and Brn and statistically different from the other groups (p<0.01; Figure 1). Small and not significant changes were observed in the LDL absolute values between birds feed with differently treated soybean meals (Table 3). LDL serum values were lower than controls in all the treatment groups except Aut1 that showed a small increase in serum LDL concentrations (Figure 1). Still, the differences were voided of significance (p=0.584). The HDL/LDL ratio was showed small, nonsignificant changes amongst all treatment groups and the controls (p=0.692), the main decrease being presented by Aut1 group (Table 3). The HDL/LDL ratio was lower than the control in all treatments despite no significant different were evident. Soybean thermal treatment did not influence VLDL levels in the blood serum (p=0.598), despite that all treated groups presented lower blood concentrations than the control (Table 3; Figure 1). The largest changes were observed in the Aut1, Aut2 and McW groups. Serum levels for UAc were raised in all treated groups compared with controls (Table 3); still no statistical differences were found between groups (p=0.263). Yet, a tendency was noticed to

(Tabla 3). Los niveles HDL no difirieron entre los grupos Ctr y McW (Figura 1). Los valores de concentraciones sanguíneos de HDL fueron particularmente más bajos en los grupos Aut, Aut2 y Brn y diferentes de manera estadística de los otros grupos (p<0.01; Figura 1). Cambios pequeños e insignificantes se observaron en los valores absolutos de LDL, entre aves alimentadas con harinas de soya tratadas de manera diferentes (Tabla 3). Los valores LDL de suero fueron más bajos que los controles en todos los grupos de tratamiento con la excepción de Aut1, que mostró un pequeño aumento en concentraciones LDL en suero (Figura 1). Sin embargo, las diferencias no fueron significativas (p=0.584). La proporción HDL/LDL mostró cambios pequeños y no significantes en comparación con todos los grupos de tratamiento y los controles (p=0.692), el descenso principal siendo presentado por el grupo Aut1 (Tabla 3). La proporción HDL/LDL fue más bajo que el control en todos los tratamientos a pesar de que no hubo diferencias significativas. El tratamiento térmico de soya no afectó los niveles VLDL en el suero sanguíneo (p=0.598), a pesar del hecho de que todos los grupos tratados presentaron concentraciones en la sangre más bajos que en el control (Tabla 3, Figura 1). Los cambios más grandes fueron observados en los grupos Aut1, Aut2 y McW. Los niveles de suero de UAc se elevaron en todos los grupos tratados en comparación con los grupos de control (Tabla 3); sin embargo, no había diferencias estadísticas entre los grupos (p=0.263). Aún, se notó una tendencia a registrar concentraciones más altas de UAc en pollos de engorde de los grupos Aut2 y McW (p=0.091 y p=0.071, respectivamente; Figura 1). El Tratamiento de calor durante el procesamiento de harina de soya mostró tener un impacto importante

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Figure 1. Box-plot representation for effects of thermal soybean treatment in blood serum metabolites concentration at day 42 in male Ross 308 broilers.

record higher UAc concentrations in broilers from groups Aut2 and McW (p=0.091 and p=0.071, respectively; Figure 1). Heat-treatment during soybean meal processing showed to have an important impact on the blood albumin levels in broilers (p=0.016). Autoclaving of soybean meals was the thermal treatment with largest differences from controls (p=0.022 and p=0.016, respectively for groups Aut1 and Aut2), in comparison to Brn and McW groups that showed moderate changes towards controls

en los niveles de albumina en la sangre de pollos de engorde (p=0.016). El tratamiento termal por autoclave de la harina de soya mostró las diferencias más grandes en comparación con los grupos de control (p=0.022 y p=0.016, respectivamente para grupos Aut1 y Aut2), en comparación con los grupos Brn y McW que mostraron cambios moderados hacía los controles (p=0.073 y p=0.054, respectivamente; Figura 1). Brevemente, las diferencias en valores promedios de albumina en la sangre fueron significativos para Aut1 y Aut2 cuando se compararon con Crt solamente, y no difirieron entre tratamientos térmicos.

Nahavandinejad - Haematology under feed thermal processing (p=0.073 and p=0.054, respectively; Figure 1). Briefly, differences in mean values of blood albumin were significant for Aut1 and Aut2, when compared with Crt, only, and they do not differ between thermal treatments. Blood concentrations of total proteins significantly differed among all groups (p=0.050), with major differences found between broilers with treated meals and controls (respectively p=0.027, p=0.010, p=0.043, p=0.024 for groups Aut1, Aut2, Brn and McW). Treatment groups showed higher protein serum levels than controls (Table 3; Figure 1), with major differences found in Aut1 group, whilst the mean values for the remainder groups (Aut2, Brn and McW) tend to be closer to controls (p=0.090). Briefly, the only difference observed is related with Aut1, and this treatment only differ from Crt. Total protein in serum do not varied with the other treatments Thermal treatments did not influence the serum concentrations of Ca (p=0.789) or P (p=0.762) (Figure 1). Still, Ca average concentrations were higher for soybean treated meals than in controls (Table 3). There are no significant differences among the groups on respect to P (Table 3).

DISCUSSION Inclusion of soybean in poultry diet demands for a balanced pre-treatment to neutralize the anti-nutritional factors to an acceptable levels without compromising the availability of essential amino acids, and therefore the nutritional quality of the diet. An adequate control of both the temperature and processing time is crucial to achieve such balance and to allow the production of an acceptable carcass both in weight and in composition. In the present experiment we compared the effect of different heat or heat and pressure treatments on the blood serum metabolites of broilers feed soybean-based diets. Previously, it was showed that feeding birds with raw soybean meal the chicks revealed very poor feed utilization (8). In general, in the study presented herein, none of the treatments compromised nutrient availability when compared to the control (raw soybean), estimated from the body weight at the end of the experiment. Similar findings were reported in the literature for soybean submitted to different extrusion temperatures or dietary inclusion rate of wet EFFSB (extruded full-fat soybean) in meal (8). There was a distinct disadvantage of feeding raw soybean meal on body weight in this study, so

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Las concentraciones de proteínas totales en la sangre difieren de manera significativa entre todos los grupos (p=0.050) con diferencias grandes encontrados entre pollos de engorde con harinas y controles tratados (respectivamente p=0.027, p=0.010, p=0.043, p=0.024 para los grupos Aut1, Aut2, Brn y McW). Los grupos de tratamiento mostraron niveles más altos de proteína en suero que los grupos de control (Tabla 3, Figura 1), con diferencias importantes encontradas en el grupo Aut1, mientras que los valores medios para los otros grupos (Aut2, Brn y McW) tienden a acercarse más a los grupos de control (p=0.090). Brevemente, la única diferencia observada se vio con Aut1, y este tratamiento solamente difiere de Crt. Proteínas totales en suero no variaron con los otros tratamientos. Los tratamientos térmicos no influenciaron las concentraciones en suero de Ca (p=0.789) o P (p=0.762) (Figura 1). Sin embargo, las concentraciones promedios para Ca fueron más altos para harinas de soya tratadas que en los grupos de control (Tabla 3). No hay diferencias significativas entre los grupos con respeto a P (Tabla 3).

DISCUSIÓN Incluir soya en la dieta de aves de corral, requiere un equilibrado tratamiento previo, para neutralizar los factores anti-nutricionales a niveles aceptables, sin comprometer la disponibilidad de los aminoácidos esenciales, y por ende la calidad nutricional de la dieta. Un control adecuado tanto de la temperatura y el tiempo de procesado es crucial para lograr tal balance y permitir la producción de un cadáver aceptable tanto en peso como composición. En el presente experimento se compararon los efectos de diferentes tratamientos de calor, o calor y presión en los metabolitos de suero sanguíneo en pollos de engorde que fueron alimentados con dietas basadas en la soya. Previamente se mostró que al alimentar las aves con harina de soya cruda, estas mostraron una pobre utilización del alimento (8). En general en este estudio, ninguno de los tratamientos comprometió la disponibilidad de los nutrientes comparados con el grupo de control (soya cruda), estimado según el peso corporal al final del experimento. Se registraron hallazgos similares en la literatura referente a la soya que ha sido sometido a diferentes temperaturas de extrusión o la tasa de inclusión de EFFSB húmedo (soya de grasa completa extruida) en harina (8). En este estudio hubo una marcada desventaja en el peso corporal al alimentar las aves con harina de soya cruda, así que el peso corporal de las aves en los tratamientos Aut2, Brn y McW a los 42 días de edad fue significantemente más alto que el de las aves de control. Además, puede ser que algunos de los

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body weight of Aut2, Brn, and McW treatment birds at 42nd day of age was higher than control birds significantly. Also, some of the thermal treatments (Aut1) may not successfully destroy deleterious compounds in soybean. The body weight at 42 days in chickens fed with raw soybean or autoclaved soybean for 20 min was lower than those of birds fed with meals submitted to autoclaving for 30 min or microwave treated, although Aut1 treatment had not significant differences from the other treatments. The lowest body weight was observed in Aut1 and Brn. Therefore, the reduction of the birds’ weight at the end of the trials suggests that a short (20 min) autoclaving or browning treatments were insufficient to adequately neutralise antinutritional substances found in raw soybean. The differences found among body weights for the different thermal processing of the meals were not so clearly expressed by the end of the first week in birds, but it might be possible that differences were related to differences in growth rates and on the energy demands between the two periods (day 7 and day 42) for maintenance and meat production. Another explanation could be that ingestion of soybean meal submitted to different thermal treatments induces differences in intestinal microbial flora, thus interfering with the absorption ability of ingesta within the digestive tract. Still, available data from Nahavandinejad et al (9) showed that no differences were found among heat treatments on regards to total bacteria, E. coli and lactobacillus content in the cecum, although the lactic acid bacteria population increased significantly in birds fed heat-treated meals. The combination of the temperature, pressure and length of the autoclaving treatment seemed not to be detrimental to the production of an acceptable body weight at the end of rearing (9). In heat-treated soybean meal, particular attention must be paid to the protein content and protein quality in the final product, as thermal treatments may change the amino acid composition of diets, most importantly on the essential amino acids. Changes in protein or amino acids availability and additionally the presence of isoflavones may affect cholesterol and energetic metabolism (10). It is generally accepted that, in birds, manipulation of diets may originate modification of the profiles of metabolic hormones and metabolites in blood, alike it happens with variations due to the strain, age or sex. In the present study, blood indicators for energy, protein or lipid metabolism showed small variations amongst groups.

tratamientos térmicos (Aut1) no destruyen con éxito los componentes nocivos de la soya. El peso corporal a los 42 días en pollos alimentados con soya cruda o soya autoclave por 20 min fue más bajo que el de aves alimentados con harinas sometidas a autoclave por 30 min o tratada con micro onda, aunque el tratamiento de Aut1 no tenían una diferencia significativa con los otros tratamientos. El peso corporal más bajo se observó en Aut1 y Brn. Por eso, la disminución del peso de las aves al final de los ensayos sugiere que un tratamiento corto (20 min) de autoclave o tostar no fueron suficientes para neutralizar de manera adecuada las sustancias anti-nutricionales presente en soya cruda. Las diferencias entre pesos corporales en los diferentes tratamientos térmicos del alimento no fueron claramente expresadas al final de la primera semana en las aves, pero puede ser posible que fueron relacionadas a diferencias en las tasas de crecimiento o en la demanda de energía entre los dos periodos (día 7 y día 42) para mantenimiento y producción de carne. Otra razón podría ser que la ingesta de harina de soya bajo otros tratamientos térmicos provoca diferencias en la flora intestinal microbio, y por ende interfiere con la capacidad de absorber del aparato digestivo. Todavía, data disponible de Nahavandinejad et al (9) mostró que no se encontraron diferencias entre tratamientos térmicos referentes al contenido de bacteria total, E.coli y lactobacilos en el ciego, aunque la población de bacteria ácido láctico aumento de manera significante en aves alimentados con harina con tratamiento térmico. La combinación de temperatura, presión y duración del tratamiento autoclave pareció no ser nocivo a la producción de un peso corporal aceptable al final de la cría (9). En harina de soya con tratamiento térmico, hay que prestar atención particular al contenido de proteína y la calidad de la proteína en el producto final, puesto que tratamientos térmicos pueden variar la composición de aminoácidos de la dieta, especialmente de los aminoácidos esenciales. Los cambios la disponibilidad de proteína o aminoácidos y adicionalmente la presencia de isoflavonas pueden afectar el colesterol y el metabolismo energético (10). Es generalmente aceptado que en aves, manipular la dieta puede originar la modificación de perfiles de hormones metabólicas y metabolitos sanguíneos, y puede suceder con variaciones debido a la raza, edad o sexo. En este estudio, los indicadores sanguíneos para energía, proteína o metabolismo de lípidos mostraron variaciones pequeñas entre los grupos. En la data presentada en este estudio, no encontraron diferencias en los valores GLU circulación entre los grupos de tratamiento o grupos de control. Sin embargo, un aumento

se en los en

Nahavandinejad - Haematology under feed thermal processing In data presented herein, no statistical differences were found in GLU circulating values between the treatment groups or towards the controls. However, an increased in absolute concentrations were found in birds from groups Aut2, Brn and in a lesser extent also in McW. Thought GLU levels are maintained within strict values in circulation due to a finely tuned control mechanism, these may vary with the meal carbohydrate content, the genetic lines, sex and age, stress or the husbandry conditions. Still, it is now accepted that such variations are not consistently associated with changes in body weight. Glucose is an important cellular source for energy and serves as metabolic substrate. The higher absolute values in blood GLU were found in the groups presenting heavier body weights. Nevertheless, this slight increase indirectly suggests that for the groups Aut2, Brn and McW, the thermal treatment of meals did not disturbed nutrient absorption or compromised liver glycogenolysis, in which case a decrease in GLU levels would be expected (11). Lipid metabolites in blood are strongly associated to the energy metabolism (12). In general, elevated circulating lipids levels indicate enhanced de novo lipolysis, while low lipid profile in blood reflects an increased rate of amino acid transportation and enhanced lipid metabolism with consequent decreased in fat deposition (13). In the present study, the analysis of the lipid profile suggests an overall decrease in lipid availability in the blood of birds feed heat-treated meals. The main changes were recorded for Chol and HDL; still, significant differences among groups were only found for HDL concentrations in blood. Moreover, the circulating values for both lipid metabolites were markedly lower than in controls compared with similar groups of Ross 308 broilers, reared under analogous management at the same station, also feed a soybean-based diet (14). This difference may be related to differences in soybean concentration of anti-nutritional factors, which may differ with the variety (15), the origin (16) or the maturation of the crops (17), or on the absorption or metabolism of cholesterol, which might be either associated to changes in the intestinal environment or to the meal content in isoflavones and fibre. Still, an increased in isoflavones would expectably be associated with an increase in total blood lipid levels, which was not the case in this experiment. On the other hand, older studies reported that changes in nutrient availability in animals fed soybean-based meals might be related to a

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las concentraciones absolutas se encontró en aves de grupos Aut2, Brn y a un grado menor también en McW. Aunque los niveles GLU se mantuvieron dentro de valores estrictos en circulación debido a un cuidadosamente ajustado mecanismo de control, estos pueden variar con el contenido de carbohidratos de la harina, las líneas genéticas, sexo y edad, estrés o condiciones agrícolas. Sin embargo, es aceptado ahora que tales variaciones no son asociadas de manera consistente con cambios en peso corporal. La glucosa es una fuente importante de energía a nivel celular y sirve como substrato metabólico. Los valores absolutos más altos en la GLU sanguíneo se encontraron en los grupos presentando pesos corporales más altos. Sin embargo, este leve aumento sugiere de manera indirecta que para los grupos Aut2, Brn y McW, el tratamiento térmico de harina no afectó la absorción de nutrientes ni comprometió la glicogenolisis del hígado, puesto que en tal caso se esperaría ver un descenso en los niveles GLU (11). Los metabolitos lípidos sanguíneos están estrechamente asociados con el metabolismo energético (12). En general, niveles lípidos en circulación elevados indican un novo lipolisis acentuado, mientras que perfiles lipídicos bajos en la sangre reflejan una tasa aumentada de transporte de aminoácidos y un metabolismo lipídico acentuado con la consecuente baja en depósitos grasos (13). En este estudio, el análisis del perfil lípido sugiere un descenso general en disponibilidad lipídica en la sangre de aves alimentadas con harina con tratamiento térmico. Los cambios principales fueron registrados para Chol y HDL; sin embargo, diferencias significativas entre grupos se encontraron solo para concentraciones de HDL en la sangre. Además, los valores en circulación para los metabolitos lipídicos fueron significativamente más bajos que en los grupos de control en comparación con grupos similares de pollos de engorde de raza Ross 308, criados bajo un manejo análogo en la misma estación, y también alimentados con una dieta de soya (14). Esta diferencia puede estar relacionada a diferencias en la concentración de soya de factores anti-nutricionales, que pueden variar con el tipo (15), origen (16) o maduración de los cultivos (17), o en la absorción o metabolismo del colesterol, que puede ser asociado o a cambios en el ambiente intestinal o al contenido de isoflavonas y fibra en la harina. Aún, un aumento en isoflavonas sería asociado a un aumento de niveles lipídicos totales en la sangre, lo que no fue el caso en este experimento. Por otro lado, estudios más antiguos reportaron que cambios en la disponibilidad de los nutrientes en animales alimentados con harina de soya puede estar relacionados con una reducción en la digestibilidad de grasa debido al aumento de excreción de ácidos biliares. Los valores absolutos para colesterol total bajaban en todos los grupos de tratamiento en

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reduction in fat digestibility due to increased excretion of bile acids. The absolute values for total cholesterol were decreased in all the treatment groups compared to control, particularly in Aut2 and Brn group. Contrasting, blood triglycerides concentrations in blood, though decreased in comparison with controls, were more alike among groups of heat-treated meals. The Brn group presented closer values to the controls for blood TG. Triglycerides decreased values in bloodstream may suggest a decreased in the intensity in lipid metabolism and transport (12). Triglycerides are the most important source of fatty acids for fat accumulation (18), and its levels in blood correlated well with body fat. Thus, its decreased levels in blood suggest that fat deposition may be delayed in animals feed with treated soybean meals, in particular for the groups feed with autoclaved and microwaved meals. The major source for TG variations is the food or GLU conversion (11). However, a clear relation between the blood GLU levels and those for TG were not established in the present work. As previously said, HDL concentrations in blood encompassed the lower Chol circulating levels, as naturally expected since HDL carries 70% of total cholesterol in birds (19). In the present experiment, HDL/Chol ratios were relatively similar among the groups fed soybean treated diets and the control; the content of HDL fraction varied from 57 to 61% of the total cholesterol. Still, a non-significant reduction in the HDL concentrations in blood was found in birds fed autoclaved, browned and micro-waved meals. Additionally, HDL concentrations in all the groups were below those reported by Jahanpour et al. (14) in their Ctr group, using similar chicks and environmental conditions. Being a cholesterol carrier, lower values for HDL reflect the reduction in cholesterol availability for lipogenesis in liver (19), may account for a decrease of fat deposition in carcasses. The diet is an important source of variation for HDL concentrations in blood. Thus it is possible that heat-treatment in soybean based meals might interfere either with the absorption of fat and cholesterol or with lipid metabolism. LDL levels in bloodstream are relatively constant in birds and reflect the availability of cholesterol and triglycerides for tissue metabolism. In this experiment, despite the absence of differences between control and the meal treated groups an increased absolute value for circulating LDL was found in Aut1 group, just followed by Crt group, opposing to the Aut2 group, which showed the lowest levels. VLDL is usually envisaged as a good indicator for fat deposition in broilers (8). Synthesised in the

comparación con el grupo control, particularmente en los grupos Aut2 y Brn. En contraste, las concentraciones de triglicéridos en la sangre, aunque disminuyeron en comparación con los grupos de control, fueron más parecidos entre grupos de harinas con tratamiento térmico. El grupo Brn presentó valores más cercanos a los grupos de control para TG sanguíneo. Los valores reducidos de triglicéridos en el torrente sanguíneo pueden sugerir una reducción en la intensidad de metabolismo y transporte de lípidos (12). Los triglicéridos son la fuente más importante de ácidos grasos para acumulación de grasa (18), y sus niveles en la sangre correlacionan bien con grasa corporal. Por ende, los niveles reducidos en la sangre sugieren que la deposición de grasa puede demorar en animales alimentados con harina tratada, en particular para los grupos alimentados con harina tratada con autoclave y micro ondas. Una fuente importante de variaciones TG es la comida o la conversión GLU (11). Sin embargo, una relación clara entre los niveles sanguíneos de GLU y los para TG no fueron establecidos en este estudio. Como expresado anteriormente, las concentraciones de HDL en la sangre encerraron los niveles más bajos de Chol en circulación, según lo esperado puesto que HDL transporta el 70% del colesterol total en las aves (19). En este experimento, los índices fueron relativamente similares entre los grupos alimentados con harina de soya y el grupo de control; el contenido de fracciones HDL varió entre 57 a 61% del colesterol total. Sin embargo, una reducción no significante en las concentraciones HDL en la sangre se encontró en aves alimentados con harinas autoclave, tostada o en micro onda. Adicionalmente, las concentraciones HDL in todos los grupos fueron por debajo los reportados por Jahanpour et al. (14) en su grupo Ctr, usando pollitos y condiciones ambientales similares. Siendo un transportador de colesterol, los valores más bajos de HDL reflejen la reducción de la disponibilidad de colesterol para la lipogenesis en el hígado (19), y puede explicar la reducción de grasa depositada en los cadáveres. La dieta es una importante fuente de variación para concentraciones HDL en la sangre. Por eso es posible que el tratamiento térmico en harina de soya puede interferir o con la absorción de grasa y colesterol o con el metabolismo lipídico. Los niveles LDL en la sangre son relativamente constantes en aves y reflejan la disponibilidad de colesterol y triglicéridos para el metabolismo de tejido. En este experimento, a pesar de la ausencia de diferencias entre el grupo de control y el grupo con harina con tratamiento, un valor absoluto aumentado se encontró en LDL en circulación se encontró entre el grupo Aut1, seguido por el grupo Crt, en oposición al grupo Aut2, que mostró los niveles más bajos. La VLDL normalmente es un buen indicador de deposición de grasa en pollos de engorde (8). Procesado en el hígado, es un transportador principal

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liver, this is the main transporter of endogenous fat and its amount correlates well with ability for fat deposition (12, 19). In the present work, though no differences were found between soybean treatments, lower absolute values were found in autoclaved and microwave irradiated meals compared to those browned. Further, VLDL concentrations in bloodstream were lower than those reported in controls from another study developed in similar environmental and dietetic conditions (14). Decreased VLDL is associated with a decrease in hepatic expression and activity of lipogenic enzymes provoking an alteration in lipids metabolism in the liver and reducing de novo fatty acid synthesis (19).

de grasa endógena y su cantidad está correlacionada con la capacidad de depositar grasa (12, 19). En este estudio, sin embargo, no se encontraron diferencias entre los tratamientos de soya, valores absolutos reducidos fueron hallados en harina de autoclave e irradiación por micro onda en comparación con la harina tostada. Además, las concentraciones VLDL en la sangre fueron más bajos que los reportados en grupos de control de otro estudio desarrollado en condiciones ambientales y dietéticas similares (14). Una reducción VLDL se asocia con un descenso en la expresión hepática y la actividad de enzimas lipogenicas que provocan una alteración en el metabolismo de lípidos en el hígado y una reducción del síntesis de novo de ácidos grasos (19).

VLDL concentrations in plasma and HDL/LDL ratios obtained herein are suggestive of a limitative availability of lipids for abdominal fat deposition in all the groups, including control. This in fact is indirectly support by the increases recorded in the chicks’ body weight, in particular those with heat-treated meals, since decreased lipid profile in blood has been associated with increased weight of the breast muscle and decreased abdominal fat content (20).

Las concentraciones en plasma e índices HDL/LDL obtenidos sugieren una disponibilidad limitativa de lípidos para deposición de grasa abdominal en todos los grupos, incluido el grupo de control. Este hecho es apoyado indirectamente por los aumentos registrados en el peso corporal de los pollitos, en particular los con harina tratada de manera térmica, puesto que un perfil reducido de lípido en la sangre ha sido asociado con un aumento en el peso del musculo del pecho y una reducción en el contenido de grasa abdominal (20).

All the metabolites generally used as markers for the protein metabolism (TP, Alb and UAc) were increased in broilers fed heat-treated soybean meals compared to control. Total proteins in the bloodstream are a currently used parameter to estimate body condition in birds, and when taken together, TP and Alb are indicative of the protein synthesis (12). In the present study, all groups fed heat-treated meal presented significantly higher concentrations of TP and Alb in the bloodstream than Ctr. In all the groups, the concentration of albumin in plasma followed the TP concentrations. Further it also indicates that heat-treatments were beneficial for the overall protein content or the protein availability of diets, and also that the protein content in the diets was enough to support normal blood indicators for protein metabolism. Similar results have been reported by other researchers which obtained improvement of nitrogen retention in broilers following the soybean processing (8, 15). Uric acid is a marker for protein catabolism. It corresponds to the major avian nitrogenous waste product. Changes in UAc circulating levels reflects the changes occurring in protein catabolism, even if the levels of this molecule may present individual variations in birds under standard management and nutritional conditions according to the protein content or the protein quality of the diet (12, 21). Further, UAc concentrations are directly proportional to

Todos los metabolitos generalmente usados como marcadores para el metabolismo de proteína (TP, Alb y UAc) aumentaron en pollos de engorde alimentados con harina de soya tratamiento térmico en comparación al grupo de control. El total de proteínas en la sangre son un parámetro usado para estimar la condición corporal en aves, y cuando son vistos juntos, TP y Alb son indicativos de una síntesis de proteína (12). En este estudio, todos los grupos alimentados con harina tratada térmica presentaron concentraciones significantemente más altas de TP y Alb en la sangre que Ctr. En todos los grupos, la concentración de albumina en plasma siguió las concentraciones de TP. Además, indica que los tratamientos térmicos fueron beneficios para el contenido de proteína en general o la disponibilidad de la proteína en dietas, y también que el contenido de proteína en la dieta fue suficiente para apoyar los indicadores normales en la sangre para metabolismo de proteína. Resultados similares se han reportado por otros investigadores que obtuvieron una mejoría de retención de nitrógeno en pollos de engorde después de procesar la soya (8, 15). El ácido úrico es un marcador para catabolismo de proteína. Corresponde a un producto de desecho importante de nitrógeno aviar. Cambios en los niveles de circulación de UAc reflejen los cambios que ocurren en el catabolismo de proteína, aun si los niveles de esta molécula pueden presentar variaciones individuales en aves bajo manejo estándar y condiciones nutricionales según el contenido de proteína o la calidad de proteína

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the weight recorded in birds (2). In the study reported herein, though no statistical differences were found between groups, absolute values for UAc in bloodstream were increased in birds fed heat-treated meals in comparison to Ctr, and the higher increased were found in Aut 2 and McW meal groups. These results suggest that all the thermal treatments in this study increased the protein biological value, in particular the autoclaving for 30 min and the microwave irradiation. The presence of anti-nutritional factors in soybean meals, especially trypsin inhibitors, is an important constraint to diet protein availability (22), requesting for the use of an inhibitory treatment to decrease the activity of those substances to increase the nutritional value of the meal. Minerals are essential for body growth. Further, they are also important players in central physiological and synthetic body processes. In the present experiment, no differences were found between groups in calcium or phosphorus concentrations in blood. Calcium is needed for bone ossification and muscle activity, while phosphorus is a major constituent of phospholipids, therefore being essential for energy accumulation. In conclusion, the results from this experiment showed that all the tested thermal-treatments of soybean diets were advantageous rather than control (raw soybean) diet, in regard to body weight and concentrations of blood lipids and protein metabolites. Further, these essays also suggest that the heat treatment of soybean meals interferes with lipogenesis, and might reduce the abdominal fat deposition, without disturbing the protein metabolism. Comparison of the final body weight and the variations in blood metabolites demonstrated that the most suitable method for soybean thermal treatment processing was, in a decreasing order: Aut2→McW→Brn→Aut1. Acknowledgments We are grateful to the Islamic Azad University, Rasht Branch, Rasht, Iran for support.

de la dieta (12, 21). Además, las concentraciones UAc son directamente proporcionales al peso registrado en las aves (2). En este estudio, aunque no se encontraron diferencias estadísticas entre los grupos, los valores absolutos para UAc en la sangre aumentaron en aves alimentadas con harina con tratamiento térmico comparado a Ctr, y el aumento mayor se encontró en los grupos Aut2 y McW. Estos resultados sugieren que todos los tratamientos térmicos en este estudio aumentaron el valor biológico de proteína, en particular el autoclave por 30 min y la irradiación de micro onda. La presencia de factores anti-nutricionales en harina de soya, especialmente inhibidores tripsina, son una importante limitación a la disponibilidad de proteína en la dieta (22), necesitando el uso de un tratamiento inhibidor para reducir la actividad de esas substancias para aumentar el valor nutricional del alimento. Los minerales son esenciales para el crecimiento corporal. Adicionalmente, son factores importantes en los procesos corporales fisiológicos centrales y sintéticos. En este experimento, no se encontraron diferencias entre los grupos en las concentraciones sanguíneas de calcio o fosforo. Se necesita calcio para la osificación del hueso y la actividad muscular, mientras que el fosforo es un constituyente importante de fosfolípidos, siendo esencial para acumular energía. En conclusión, los resultados de este experimento mostraron que todos los tratamientos térmicos de harina de soya probados fueron de ventaja sobre la dieta de control (soya cruda) en lo que tiene que ver con peso corporal y concentraciones de lípidos y metabolitos de proteína sanguínea. Además, estos ensayos sugieren que el tratamiento térmico de harina de soya interfiere con la lipogenesis, y puede reducir la deposición de grasa abdominal sin perturbar el metabolismo de proteína. Comparar el peso corporal final y las variaciones en metabolitos sanguíneos demostró que el método más adecuado para el tratamiento térmico de soya fue, en orden descendiente: Aut2→McW→Brn→Aut1. Agradecimientos Agradecemos a la Islamic Azad University, sede Rasht, Rasht, Iran por su apoyo.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4316-4327, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Early feeding to modify digestive enzyme activity in broiler chickens La alimentación temprana como modificador de la actividad de enzimas digestivas en pollos de engorde Milagro León T, M.Sc, Gerardo Garrido G, M.Sc, María Castañeda D, TSU, Emma Rueda de A, Ph.D. Central University of Venezuela, Faculty of Veterinary Science, Department of Biomedical Science, Nutritional Biochemistry Center, Enzymology and Toxicology Laboratory. Final Prolongation 19 de Abril Avenue, El Limón Lane, Maracay, Venezuela. Correspondence: emmarueda@gmail.com. Received: November 2013; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. To evaluate the effect on digestive enzyme activity in broiler chickens by providing food in the first 48 hrs. after birth. Materials and methods. After incubating 300 fertile eggs from Hubbard breeding and immediately after hatching, the chicks were randomly assigned to treatments: fasting (from hatching to 48 hrs.); Hydrated Balanced Food (HBF) from birth to 48 hrs.; commercial hydrating supplement (CHS) from birth to 48 hrs. The diets were provided ad libitum. After 48 hrs. a commercial diet was fed. At birth and at 48 and 72 hrs. of age 30 chicks/treatment were sacrificed to determine the enzyme activity of maltase, sucrase, alkaline phosphatase, phytase, a-amylase, trypsin and lipase in samples of duodenal or pancreatic homogenate. Results. The supply of HBF or CHS during the first 48 hrs. of life increased the activity of maltase, sucrase and phytase in the first 3 days of life, with values between 1.2 and up to 4-fold compared to the control (p<0.05). Chickens that fasted for the first 48 hrs. had higher activity of the pancreatic enzymes a-amylase, trypsin, and lipase at 72 hrs. of life (p<0.05). Conclusions. The food supply in the first 48 hrs. after hatching increases the duodenal enzyme activity in the intestinal brush border during the first 3 days of age in broiler chickens. Key words: Feeding, diet, enzymes, broiler chickens (Source: Agrovoc).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto sobre la actividad de enzimas digestivas en pollos de engorde al suministrar alimento en las primeras 48 h de nacidos. Materiales y métodos. Después de incubar 300 huevos fértiles provenientes de reproductoras Hubbard e inmediatamente después de la eclosión, los pollos fueron asignados al azar a los tratamientos: ayuno (desde la eclosión hasta 48 h); alimento balanceado hidratado (ABH) desde el nacimiento hasta las 48 h; suplemento hidratante comercial (SHC) desde el nacimiento hasta las 48 h. Las dietas fueron suministradas ad libitum. A partir de las 48 h se suministró una dieta comercial. Al nacer y a las 48 y 72 h de nacidos, fueron sacrificados 30 pollos/tratamiento para las determinaciones de las actividades de las enzimas maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina, fitasa, α-amilasa, tripsina y lipasa en muestras de homogenado duodenal o pancreático. Resultados. El suministro de ABH o SHC durante las primeras 48 h de vida aumentó la actividad de 4316

León - Early feeding digestive in broilers chickens

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maltasa, sacarasa y fitasa en los primeros 3 días de edad, con valores entre 1.2 y hasta 4 veces en comparación con el control (p<0.05). Los pollos en ayuno durante las primeras 48 h presentaron mayor actividad de las enzimas pancreáticas α-amilasa, tripsina y lipasa a las 72 h de vida (p<0.05). Conclusiones. El suministro de alimentos en las primeras 48 h después de la eclosión aumenta la actividad de las enzimas duodenales del borde en cepillo intestinal durante los primeros 3 días de edad en pollos de engorde. Palabras clave: Alimentación, dieta, enzimas, pollo de engorde (Fuente: Agrovoc).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

I n c u r r e n t p o u l t r y p r o d u c t i o n , p hy s i c a l separation between the hatchery and farms can cause newborn chickens to spend a variable period of time without food, and usually between 36 to 48 hrs. pass after birth before birds have access to feed, reducing the weight of the birds during this time (1). Delayed feed consumption can reduce the rate of growth and cause weight loss (2).

En la producción avícola actual, la separación física entre la planta incubadora y las granjas puede ocasionar que los pollos recién nacidos pasen un período variable de tiempo sin agua ni alimento y, generalmente, transcurren entre 36 y 48 h después del nacimiento para que las aves tengan acceso al alimento, reduciéndose en este período el peso de las aves (1). Un retraso en el consumo de alimento puede reducir la tasa de crecimiento y provocar pérdidas de peso (2).

By contrast, immediate access to food and water after hatching may promote development of the digestive tract, increase body weight (3.4) and reduce mortality in the first 3 days of life (5). With early feeding, nutrients necessary for infants are supplied during the first 48-72 hrs. It has been reported that this can reduce dehydration and promote rapid reabsorption of the yolk sac (6), the development of the liver, pancreas and intestine (7), increase the bird’s immediate development post-hatch, improve young chickens’ resistance against exposure to low temperatures (8) and promote further development of the immune system (9). When studying the effect of feeding immediately after hatching on activation of the genetic program that regulates hepatic lipogenesis, it was found that during the first week after hatch regulating key lipogenic genes was significant, including ATP citrate lyase enzymes, malic enzyme, fatty acid synthase, acetyl-CoAcarboxilasa, alpha stearyl-CoA desaturase-1, etc. (10). Food restriction during the first 48 hrs. post-hatching caused a significant decrease in weight gain, plasma glucose and the regulation of lipogenic genes, which reverts to the beginning of feeding (10). There are no previous reports about how digestive enzyme activity can be affected, mainly those that are an integral part of the intestinal brush border, such as disaccharidases, phosphatases and phytase. It is of practical interest to study nutritional requirements and effects of early feeding in birds at an early age, or in the period of time

Por el contrario, el acceso inmediato al alimento y al agua después de la eclosión puede promover el desarrollo del tracto digestivo, aumentar el peso corporal (3,4) y disminuir la mortalidad en los primeros 3 días de edad (5). Con la alimentación temprana se suministran nutrientes necesarios para los pollos recién nacidos durante las primeras 48 a 72 h. Se ha reportado que esta práctica puede reducir la deshidratación y promover la rápida reabsorción del saco vitelino (6), el desarrollo del hígado, páncreas e intestino (7), incrementar el desarrollo del ave inmediatamente después de la eclosión, mejorar la resistencia contra la exposición a las bajas temperaturas en pollos jóvenes (8) y promover un mayor desarrollo del sistema inmunitario (9). Al estudiar el efecto de la alimentación, inmediatamente después de la eclosión sobre la activación del programa genético que regula la lipogénesis hepática, se encontró que durante la primera semana post eclosión fue significativa la regulación de los genes clave lipogénicos incluyendo los de las enzimas ATP citrato liasa, enzima málica, ácido graso sintasa, acetil-CoA carboxilasa, alfa estearil-CoA desaturasa-1, entre otros (10). La restricción de alimentos durante las primeras 48 h post-eclosión provocó una disminución significativa de la ganancia de peso, de la glucosa en plasma y de la regulación de los genes lipogénicos, que se revierte al iniciarse la alimentación (10). No existen reportes previos acerca de cómo puede afectarse la actividad de enzimas digestivas, principalmente las que forman parte integral del borde en cepillo intestinal, tales como las disacaridasas, fosfatasas y fitasa.

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from hatching to their arrival at the farm, on the development of the gastrointestinal tract, as it can affect body development. Therefore, this research was conducted in order to evaluate the effect of providing two different supplements at an early age on the activity of pancreatic and duodenal digestive enzymes in broiler chickens.

MATERIALS AND METHODS Incubation and hatching of fertile eggs. A total of 300 fertile eggs from the Hubbard breeder line of hens, 33 weeks old, purchased from the Vipraca Farm, CA located in the state of Yaracuy, were incubated at 37.8°C in a Chick master hatchery with automatic dump from the Nutritional Biochemistry Center of the Faculty of Veterinary Science (FVS) at the Central University of Venezuela (CUV) located 67°36’36’’ east longitude, 10°16’20’’ north latitude and 443 meters above sea level, with an average temperature of 25.1°C and an average annual rainfall of 1063 mm. At hatching, the chicks were removed from the hatcher, assigned to metal battery cages for their accommodation in the Department of Biochemistry’s animal facility at the FVS-CUV, maintained in suitable conditions of hydration, ventilation and density, and immediately subjected to experimental treatments (100 birds / treatment). The food and water were provided ad libitum from hatching to 72 hours old. Management of birds and feeding. The hydrated balanced feed was formulated in accordance with international recommendations (11). In Tables 1, 2 and 3, the composition and compositional analysis are shown (12) for the food and food supplements provided. All birds received water ad libitum. In order to take their measurements, at birth and at 48 and 72 hrs. of age, they were sacrificed by cervical dislocation, 30 chicks / treatment / interval to extract, at temperatures between 0 and 4°C, the duodenal segments and pancreas from which the homogenates were prepared to determine intestinal enzyme activity for maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase. In duodenal homogenate samples, pancreatic enzyme activity was determined for α-amylase, trypsin and the activity of lipase was determined in samples of pancreatic homogenate. International ethical standards for animal research were respected, avoiding the provocation of pain or suffering. Experimental design and treatment. Birds were assigned in a completely randomized design

Es de interés práctico el estudio de los requerimientos nutricionales y los efectos de alimentar las aves a temprana edad, o en el intervalo de tiempo que transcurre desde la eclosión hasta su llegada a la granja, sobre el desarrollo del tracto gastrointestinal, ya que puede repercutir en el desarrollo corporal, por lo cual se realizó la presente investigación con el objetivo evaluar el efecto de suministrar dos suplementos diferentes a temprana edad sobre la actividad de enzimas digestivas duodenales y pancreáticas en pollos de engorde.

MATERIALES Y MÉTODOS Incubación y eclosión de los huevos fértiles. Un total de 300 huevos fértiles, provenientes de gallinas reproductoras de la línea Hubbard de 33 semanas de edad, adquiridos de la Granja Vipraca, C.A. ubicada en el estado Yaracuy, fueron incubados a 37.8°C en una incubadora-nacedora, marca Chick master, con volteo automático del Centro de Bioquímica Nutricional de la Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV) de la Universidad Central de Venezuela (UCV) ubicada a 67°36’36’’ longitud este, 10°16’20’’ latitud norte y 443 m.s.n.m, con una temperatura media de 25.1°C y una pluviosidad promedio anual de 1063 mm. En la eclosión, los pollos fueron extraídos de la nacedora, asignados a jaulas metálicas de batería para su alojamiento en el bioterio de la Cátedra de Bioquímica de la FCV-UCV, mantenidos en adecuadas condiciones de hidratación, ventilación y densidad, y sometidos de inmediato a los tratamientos experimentales (100 aves/tratamiento). Los alimentos y el agua fueron suministrados ad libitum desde la eclosión hasta las 72 horas de edad. Manejo de las aves y alimentación. EL alimento balanceado hidratado fue formulado de acuerdo con las recomendaciones internacionales (11). En las tablas 1, 2 y 3 se presenta la composición y el análisis bromatológico (12) de los alimentos y suplementos suministrados. Todas las aves recibieron agua a voluntad. Para realizar las respectivas mediciones, al nacer y a las 48 y 72 h de nacidos, fueron sacrificados, por dislocación cervical, 30 pollos/tratamiento/intervalo, para extraer, a temperaturas entre 0 y 4ºC, los segmentos duodenales y el páncreas a partir de los cuales se prepararon los homogenizados para las determinaciones de las actividades de las enzimas intestinales maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa. En las muestras de homogenizado duodenal se determinó la actividad de las enzimas pancreáticas a-amilasa, tripsina y la actividad de la lipasa se determinó en muestras de homogenizado pancreático.

León - Early feeding digestive in broilers chickens Table 1.Characteristics of hydrated balanced feed (HBF). Ingredients

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Table 3. Compositional analysis of food mixtures. Composition1 (g/Kg)

g/Kg

HBF2

CHS3 212

Cornmeal

543

Crude Protein

264

Soybean meal

350

Ether Extract

Crude Fiber

Soybean oil

Monocalcium phosphate

Calcium carbonate

Vitamin-mineral pre-mix1

Salt

DL-Methionine

L-Lysine. HCl

Composition2

g/Kg

Crude protein

215.5

Ether extract

80.3

Crude fiber

33.1

Lysine

12.2

Calcium

10.2

Phosphorous AME (Kcal/Kg)

7.8 3,100

Mineral-vitamin Pre-mix Content (mg/kg): 80 Iron, Zinc (ZnO) 40, Manganese 60, 0.8 Iodine, 8 Copper, 0.2 Selenium, 0.4 mg Cobalt, Vitamin A 4,500 IU, 1,000 IU Cholecalciferol, Vitamin E 25 IU, Menadione 1.5, 0.02 Vitamin B12, 3 Riboflavin , 5 pantothenic acid, 20 Niacin, 0.5 folic acid, 1.5 Thiamine, 0.5 Biotin, 2.5 Pyridoxine. 2 Calculated values 3Determined according to AOAC (8). 1

Table 2. Characteristics of the commercial hydrating supplement (CHS). Ingredients

g/Kg

Soy flour

400

Corn flour

150

Corn Syrup

180

Citric Acid Water

20 250

Composition1

g/Kg

Crude protein

212

Ether extract Crude fiber

6 27

Values determined according to AOAC (8).

to the following treatments: T0: Fasting from hatching to 48 hrs. T1:Hydrated balanced food (HBF) from hatching to 48 hrs. of life. T3: Commercial Hydrating Supplement (CHS) from hatching to 48 hrs. of life.

Values determined according to AOAC (8). HBF= Hydrated balanced feed CHS= Commercial hydrating supplement

1 2 3

Diseño experimental y tratamientos. Las aves fueron asignadas, en un diseño completamente al azar, a los siguientes tratamientos: T0: Ayuno desde la eclosión hasta 48 h T1: Alimento balanceado hidratado (ABH) desde la eclosión hasta las 48 h de vida. T3: Suplemento hidratante comercial (SHC) desde la eclosión hasta las 48 h de vida. Análisis bromatológico de los alimentos. Los análisis bromatológicos fueron realizados en un laboratorio comercial, e incluyeron la determinación de proteína cruda, extracto etéreo y fibra cruda, según los métodos estandarizados (12). Preparación del homogeneizado intestinal. Los segmentos duodenales fueron extraídos a temperaturas entre 0 y 4ºC, cortados longitudinalmente, colocados sobre una placa de vidrio y raspados suavemente con una lámina portaobjeto para obtener la mucosa que fue homogeneizada a máxima velocidad durante 1 min en solución tampón con 2 mM de HEPES a pH 7.1 y almacenada en alícuotas a –20ºC hasta el momento del análisis, en un lapso no mayor a 15 días. Preparación del homogenizado pancreático. Todo el procedimiento se realizó entre 0 y 4°C. Los páncreas fueron homogeneizados, a máxima velocidad, por 3 min en 4 g/ml de solución salina fisiológica, filtrados a través de un liencillo estéril y el extracto almacenado en alícuotas a -20°C hasta que fueron requeridos para las determinaciones enzimáticas, en un lapso de tiempo no mayor a 15 días.

Comp osition al an alys is of food. T h e compositional analyzes were performed in a commercial laboratory, and included the determination of crude protein, crude fat and crude fiber, according to standardized methods (12).

Actividades enzimáticas. Los análisis enzimáticos se realizaron en el Laboratorio de Enzimología y Toxicología adscrito a la Cátedra de Bioquímica, FCV-UCV. Se analizaron réplicas de homogenizado compuestas, en todos los casos, por un pool proveniente de 3 pollos para un total de 10 determinaciones/tratamiento en cada intervalo de tiempo.

Preparation of intestinal homogenates. Duodenal segments were extracted at temperatures between 0 and 4°C, cut longitudinally, laid on a glass plate and gently scraped with a glass slide to obtain the mucous that was homogenized at maximum speed for

Maltasa (EC 3.2.1.20) y Sacarasa (EC 3.2.1.48). La actividad específica de las disacaridasas maltasa y sacarasa fue determinada utilizando como sustrato una solución de maltosa o sacarosa 56 mM en maleato de sodio 100 mM a pH 6.0 y disuelto en NaOH al 15% (p/v) (13). La mezcla de reacción

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1 min in buffer with 2 mM HEPES pH 7.1 and stored in aliquots at -20°C until analysis, within a period not exceeding 15 days. Pancreatic homogenate preparation. The entire procedure was conducted between 0 and 4°C. The pancreas were homogenized at maximum speed for 3 min at 4 g/ml of physiological saline, filtered through a sterile cotton cloth and the extract was stored in aliquots at -20°C until they were required for enzymatic determinations, within a period no longer than 15 days. Enzymatic activities. Enzyme analyzes were performed at the Enzymology and Toxicology Laboratory attached to the Department of Biochemistry, FVS-CUV. Homogenized composite replicas were analyzed in all cases, with a pool of 3 chicks for a total of 10 determinations / treatment in each time interval. Maltase (EC 3.2.1.20) and Sucrase (EC 3.2.1.48). The specific activity of the disaccharidases maltase and sucrase was determined using 56 mM maltose or sucrose as substrate in 100 mM sodium maleate, pH 6.0 and dissolved in 15% NaOH (w / v) (13). The reaction mixture was incubated at 41°C, for 15 and 30 min for maltase and sucrase respectively, after which stopped by placing the tubes in boiling water for 20 sec. The amount of glucose released in the reaction was quantified using a GOD-PAP kit 900® Bioscience. The absorbance was measured in a spectrophotometer (Perkin Elmer, Lambda 11, California, USA) at a wavelength of 510 nm. The specific activity was expressed as nmoles of glucose released / min / mg protein (13). Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1). The activity of this enzyme was determined using LABTEST ® Kits. The alkaline phosphatase present in the sample hydrolyzes the substrate thymolphthalein monophosphate, releasing thymolphthalein and inorganic phosphate. 50 ml of substrate, 500 ml of buffer supplied by the manufacturer and 50 ml of the sample were incubated for 10 min at 41°C. The reaction was stopped with a solution containing 150 mM sodium carbonate and 100 mM sodium hydroxide. Absorbance was measured in a spectrophotometer at a wavelength of 590 nm and compared against a known concentration standard. The activity was expressed in (Units/L)/ min/mg protein (13). Phytase (EC 3.1.3.8). Determined at 41°C by incubating 40 ml of duodenal homogenate with 200 μl of 1 mM inositolhexaphosphoric sodium salt and 200 μl of 25 mM MgCl2 and 50 mM MES

fue incubada, a 41ºC, durante 15 y 30 min para maltasa y sacarasa respectivamente, luego de lo cual se detuvo colocando los tubos en agua en ebullición por 20 seg. La cantidad de glucosa liberada en la reacción fue cuantificada utilizando un kit Bioscience GOD-PAP 900®. La absorbancia se cuantificó en un espectrofotómetro (Perkin Elmer, Lambda 11, California, USA) a una longitud de onda de 510 nm. La actividad específica se expresó como nmoles de glucosa liberada/min/mg de proteína (13). Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1). La actividad de esta enzima fue determinada utilizando Kits LABTEST®. La fosfatasa alcalina presente en la muestra hidroliza al sustrato timolftaleína monofosfato, liberando timolftaleína y fosfato inorgánico. Se incubaron 50 µl de sustrato, 500 µl de tampón suministrado por el fabricante y 50 µl de la muestra durante 10 min a 41ºC. La reacción de detuvo con una solución conteniendo carbonato de sodio 150 mM e hidróxido de sodio 100 mM. La absorbancia fue medida en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 590 nm y comparada contra la de un patrón de concentración conocida. La actividad se expresó en (Unidades/L)/min/mg de proteína (13). Fitasa (EC 3.1.3.8). Se determinó a 41ºC incubando 40 µl del homogenado duodenal con 200 µl de la sal sódica de inositol hexafosfórico 1 mM y 200 µl del tampón conteniendo 25 mM de MgCl2 y 50 mM de MES a pH 6.0. La reacción se detuvo agregando 3600 µl de una solución con 0.28% (p/v) de molibdato de amonio, SDS al 1.1% (p/v) y ácido ascórbico al 1.1% (p/v). La concentración de fosfato liberado fue determinada en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 820 nm. Los valores de absorbancia se compararon con los de una curva estándar elaborada a partir de una solución 0.5 mM de KH2PO4 y fue expresada como nmoles de PO4 hidrolizados/minuto/mg de proteína (13,14). α-Amilasa (EC 3.2.1.1). El homogenado (50 μl) se incubó durante 15 min a 41°C en una mezcla de reacción conteniendo 100 μl de Tris-HCl 160 mM a pH 7.5 y 200 μl de almidón al 0.15% en ácido sórbico saturado. La reacción se detuvo agregando 100 μL de HCl al 0.5N luego de lo cual se añadió 2 ml de agua destilada y 100 ml de solución de yodo 0.01 N. La cantidad de almidón degradado por la amilasa se determinó por espectrofotometría midiendo la disminución de la coloración azul del complejo iónico almidón-yoduro a una longitud de onda de 620 nm (15). Los valores se compararon con los una curva estándar elaborada a partir de una solución de almidón al 0.15% (p/v). La actividad se expresó como μg de almidón degradado/min/ mg de proteína (15).

León - Early feeding digestive in broilers chickens buffer pH 6.0. The reaction was stopped by adding 3600 ml of a solution containing 0.28% (w/v) ammonium molybdate, 1.1% Sodium dodecyl sulfate (w/v), and 1.1% ascorbic acid (w/v). The concentration of phosphate released was determined in a spectrophotometer at a wavelength of 820 nm. Absorbance values were compared to a standard curve prepared from a 0.5 mM KH2PO4 solution and expressed as nmoles of PO4 hydrolyzed/min/mg protein (13,14). a-Amylase (EC 3.2.1.1). The homogenate (50 μl) was incubated for 15 min at 41°C in a reaction mixture containing 100 μl of 160 mM Tris-HCl pH 7.5 and 200 μl of 0.15% starch in saturated sorbic acid. The reaction was stopped by adding 100 μL of 0.5N HCl after which 2 ml of distilled water was added along with 100 ml of 0.01N iodine solution. The amount of starch degraded by amylase was determined spectrophotometrically by measuring the decrease of blue color of the starch-iodine complex ion at a wavelength of 620 nm (15). The values were compared to a standard curve prepared from a 0.15% starch solution (w/v). The activity was expressed as μg of starch degraded/min/ mg protein (15). Trypsin (EC 3.4.21.4). Pancreatic homogenate was incubated for 15 min at 41°C with 200 μl of 1% (w/v) casein as substrate in 0.1 M sodium phosphate pH 7.4. The reaction was stopped by adding 1 ml of 5% (w/v) trichloroacetic acid and the mixture was filtered on 42 Whatman paper. 250 μl of the filtrate reacted with 1250 μl of 0.2 M Na2CO3 and 250 μl Folin-Ciocalteu reagent diluted 1:5 in distilled water (16). After incubation for 20 min at 41°C absorbance was measured at a wavelength of 625 nm. The activity was expressed as Units of Proteolytic Activity (UPA) defined as the amount (mEq) of amino acid tyrosine released as a result of proteolysis of the substrate in the experiment conditions (15). Lipase (EC 3.1.1.3). The activity of this enzyme was determined in pancreatic homogenate, determining the volume of 0.05M NaOH required to neutralize the fatty acids released during 3 hrs. of incubation, with gentle stirring, at 37°C with 3 ml of olive oil used as substrate. The activity was expressed as ml of NaOH/mg protein (16). Protein Analysis. Protein content was determined by reacting the samples with a filtered solution on 40 Whatman paper containing 1% Coomassie Brilliant Blue G250 in ethanol, diluted 1:2 in 8.9% orthophosphoric acid (13) using the corresponding buffer as a

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Tripsina (EC 3.4.21.4). El homogenizado de páncreas fue incubado durante 15 min a 41°C con 200 μl del sustrato caseína al 1% (p/v) en fosfato de sodio 0.1 M a pH 7.4. La reacción se detuvo con la adición de 1 ml de ácido tricloroacético al 5% (p/v) y la mezcla filtrada en papel Whatman 42. Se hicieron reaccionar 250 μl del filtrado con 1250 μl de Na2CO3 0.2 M y 250 μl del reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 1:5 en agua destilada (16). Después de una incubación durante 20 min a 41°C se midió la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm. La actividad se expresó como Unidades de Actividad Proteolítica (UAP) definidas como la cantidad (mEq) del aminoácido tirosina liberado como producto de la proteólisis del sustrato en las condiciones del ensayo (15). Lipasa (EC 3.1.1.3). La actividad de esta enzima se determinó en homogenizado de páncreas, determinando el volumen de NaOH 0.05 M requerido para neutralizar los ácidos grasos liberados durante 3 h de incubación, con agitación moderada, a 37°C con 3 ml de aceite de oliva utilizado como sustrato. La actividad se expresó como µl de NaOH/mg de proteína (16). Análisis de proteína. El contenido de proteína se determinó haciendo reaccionar las muestras con una solución filtrada en papel Whatman 40 conteniendo azul comassie brillante-G250 al 1% en etanol, diluida 1:2 en ácido ortofosfórico al 8.9% (13) utilizando el tampón correspondiente como blanco y Albúmina Sérica Bovina (BSA) como estándar. Análisis estadístico. Los resultados fueron expresados como el promedio ± la desviación estándar, y analizados estadísticamente a través del Análisis de Kruskal-Wallis y la prueba de rangos promedios a un nivel de significancia p≤0.05 (17).

RESULTADOS Maltasa (EC 3.2.1.20). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima maltasa, determinada en homogenizado de segmentos duodenales, fue de 39 ± 1 nmoles de glucosa/min/mg de proteína. Tanto a las 48 como a las 72 h de nacidos, la actividad fue mayor (p≤0.05) en los animales que recibieron SHC desde el nacimiento hasta las 48 h post-eclosión (T2) en comparación con el control, que se mantuvo en ayuno durante 48 h (Figura 1). Las aves que recibieron ABH presentaron mayor actividad de esta enzima a las 48 h de nacidos (p≤0.05). Sacarasa (EC 3.2.1.48). En el momento de la eclosión, la actividad específica de la enzima sacarasa, determinada en homogenizado de segmentos duodenales, fue de 1.2 ± 0.1 nmoles

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blank and Bovine Serum Albumin (BSA) as a standard. Statistical analysis. The res ul t s w ere expressed as the mean ± standard deviation and statistically analyzed through a KruskalWallis analysis and the average range tests at a significant level of p≤0.05 (17).

RESULTS Maltase (EC 3.2.1.20). Immediately after hatching, the specific activity of maltase enzyme determined in homogenate of duodenal segments was 39 ± 1 nmoles of glucose/min/mg protein. At both 48 and 72 hours old, the activity was higher (p≤0.05) in animals receiving CHS from birth until 48 hrs. post-hatching (T2) in comparison with the control, which was kept in fasting for 48 hrs. (Figure 1). Birds receiving HBF showed higher activity of this enzyme at 48 hrs. old (p≤0.05). Sucrase (EC 3.2.1.48). Upon hatching, the specific activity of sucrase, determined in the homogenate of duodenal segments was 1.2±0.1 nmoles glucose/min/mg protein, about 32 times lower than the maltase activity after hatching. In the first 48 hrs. after hatching there were no significant differences between treatments. However, at 72 hrs. there were significant differences in favor of T1 and T2 (Figure 1). Therefore, supplying HBF and CHS in the first 48 hrs. of life improved sucrase activity in birds that were 72 hrs. old (p≤0.05), leading to increased activity about 3-fold compared to the control. Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1). Immediately after hatching, the specific activity of the alkaline phosphatase enzyme, determined in homogenate of duodenal segments was 53 ± 12 (U/L)/min/mg protein. At 48 hrs. of life, animals that consumed CHS (T2) had 1.2 times higher activity, with significant differences (p<0.05) compared to the control group (T0) (Figure 1). However, in birds that fasted for 48 hrs. after hatching (T0) activity significantly increased (p≤0.05) on the third day, 24 hrs. after receiving food. Phytase (EC 3.1.3.8). Immediately after hatching, the specific activity of the phytase enzyme, determined in homogenate of duodenal segments was 5.1 ± 0.2 nmoles of PO4/min/ mg protein. The trend, as in the case of alkaline phosphatase, is increasing in the first 72 hours post-hatching. Early feeding of both CHS and HBF promoted greater phytase activity in the first 72 hours of life (p≤0.05), with increases of up to 3.2 fold compared to the control (Figure 1).

de glucosa/min/mg de proteína, cerca de 32 veces más baja que la actividad de la maltasa después de la eclosión. En las primeras 48 h después de la eclosión no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos. No obstante, a las 72 h se presentaron diferencias significativas a favor de T1 y T2 (Figura 1). Por tanto, el suministro de ABH y SHC en las primeras 48 h de vida mejoró la actividad de la sacarasa a las 72 h de edad de las aves (p≤0.05), provocando un incremento de la actividad de cerca de 3 veces en comparación con el control. Fosfatasa Alcalina (EC 3.1.3.1). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima fosfatasa alcalina, determinada en homogenado de segmentos duodenales, fue de 53 ± 12 (U/L)/min/mg de proteína. A las 48 h de vida, los animales que consumieron el SHC (T2) presentaron una actividad 1.2 veces más alta, con diferencias significativas (p<0.05) en comparación con el grupo control (T0) (Figura 1). No obstante, en las aves mantenidas en ayuno durante 48 h después de la eclosión (T0) se presentó una actividad significativamente mayor (p≤0.05) en el tercer día de edad, 24 h después de recibir el alimento. Fitasa (EC 3.1.3.8). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima fitasa, determinada en homogenado de segmentos duodenales, fue de 5.1 ± 0.2 nmoles de PO4/min/ mg de proteína. La tendencia, al igual que en el caso de la fosfatasa alcalina, es a aumentar en las primeras 72 h post-eclosión. El suministro de alimentación temprana, tanto del ABH como del SHC promovió una mayor actividad fitásica en las primeras 72 h de nacidos (p≤0.05), con incrementos de hasta 3.2 veces en comparación con el control (Figura 1). En términos generales, en los animales del grupo control que se mantuvieron en ayuno durante 48 h, se evidenció, como efecto de suministrar alimentación después del período de ayuno, un aumento en la actividad de las enzimas integrales del borde en cepillo intestinal, en este caso en el segmento duodenal, maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa, a las 72 h después de la eclosión. Asimismo, en las aves que recibieron algún tipo de alimento o suplemento (ABH o SHC) durante las primeras 48 h de edad, se observó una marcada tendencia al incremento de la actividad de estas enzimas digestivas. α-Amilasa (EC 3.2.1.1). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima α-amilasa, determinada en homogenizado de páncreas, fue de 94 ± 7 μg de almidón degradado/ min/mg de proteína. La tendencia fue a presentarse un valor mayor en las 48 h y a disminuir a las 72 h.

León - Early feeding digestive in broilers chickens Overall, in animals in the control group that fasted for 48 hrs. there was an effect of providing food after the fasting period, which caused an increase in the activity of integral enzymes in the intestinal brush border. In this case, in the duodenal segment, maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase, at 72 hrs. after hatching. Similarly, in birds given some food or supplement (HBF or CHS) during the first 48 hrs. of life, a marked increasing tendency in the activity of these digestive enzymes was observed. α-Amylase (EC 3.2.1.1). Immediately after hatching, the specific activity of the α-amylase enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 94 ± 7 μg of degraded starch min/mg protein. The trend was to present a greater value at 48 hrs. and to diminish at 72 hrs. At 48 hrs. old, chickens receiving all treatments showed significantly lower activity of this enzyme (p≤0.05) in comparison with control animals, with greater activity in T0 very close to 300% with respect to immediately lesser treatment [T2] (Figure 2).

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A las 48 h de edad los pollos de todos los tratamientos presentaron una actividad de esta enzima significativamente menor (p≤0.05) en comparación con los animales del grupo control, siendo mayor la actividad en T0 muy cercana al 300% con respecto al tratamiento inmediatamente inferior [T2], (Figura 2). Tripsina (EC 3.4.21.4). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima tripsina, determinada en homogenizado de páncreas, fue de 0.3 ± 0.06 UAP/min/mg de proteína y mostró una tendencia, en los animales del grupo control, al incremento en las primeras 72 h de vida. El suministro de ABH o SHC no aumentó la actividad de esta enzima (Figura 2). En las primeras 48 h de edad, la actividad fue semejante tanto en los animales en ayuno como en aquellos que recibieron algún tipo de alimento o suplemento. A partir de las 48 h de edad, se observa un marcado incremento en la actividad de la tripsina únicamente en los animales que se habían mantenido en condiciones de ayuno (T0) y una disminución significativa (p≤0.05) en

Figure 1. Specific activity of duodenal digestive enzymes in broiler chickens in fasting or early feeding. Fasting from hatching to 48 hrs. HBF = hydrated balanced feed supplied from hatching to 48 hrs. CHS=commercial hydrating supplement supplied from hatching to 48 hrs *(p<0.05).

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Figure 2. Specific activity of pancreatic digestive enzymes in broiler chickens in fasting or early feeding. Fasting from hatching to 48 hrs. HBF = hydrated balanced feed supplied from hatching to 48 hrs. CHS=commercial hydrating supplement supplied from hatching to 48 hrs. * (p ≤ 0.05).

Trypsin (EC 3.4.21.4). Immediately after hatching, the specific activity of the trypsin enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 0.3 ± 0.06 PAU/min/mg protein and showed an increasing trend in the control animals, in the first 72 hrs. of life. Supplying CHS or HBF did not increase the activity of this enzyme (Figure 2). In the first 48 hrs. of life, activity was similar in both animals that fasted and those that received any food or supplements. After 48 hours of age, a marked increase in trypsin activity was observed only in animals that had been fasting (T0) and a significant reduction (p≤0.05) in activity is observed in groups that received HBF and CHS (T1 and T2). Lipase (EC 3.1.1.3). Immediately after hatching, the specific activity of the lipase enzyme, determined in pancreatic homogenate, was 106 ± 17 ml of NaOH/mg protein. The general trend was increasing in the first 72 hrs.

la actividad en los grupos que recibieron ABH y SHC (T1 y T2). Lipasa (EC 3.1.1.3). Inmediatamente después de la eclosión, la actividad específica de la enzima lipasa, determinada en homogenizado de páncreas, fue de 106 ± 17 µl de NaOH/ mg de proteína. La tendencia general fue a incrementarse en las primeras 72 h. Al segundo día de edad, todos los tratamientos presentaron una tendencia al incremento en la actividad de esta enzima, con relación a la actividad al nacimiento, aún en las aves que estuvieron bajo ayuno total (T0). A las 72 h, se observó un incremento acelerado en la actividad de esta enzima en el grupo de animales que estuvo bajo ayuno durante 48 h (Figura 2).

DISCUSIÓN

DISCUSSION

Tanto el suministro de ABH como el SHC suministrados desde el nacimiento hasta las 48 h post-eclosión provocaron un aumento en la actividad de la enzima maltasa. Este efecto pudiese repercutir favorablemente en una mejor actividad digestiva y mayor absorción de glucosa proveniente de la dieta, lo que al mismo tiempo permitiría mejorar el metabolismo energético del ave. La actividad específica de la maltasa presentó una tendencia marcada al incremento con la edad, en concordancia con lo reportado por otros autores (13).

The supply of both HBF and CHS provided from birth until 48 hrs. post-hatching caused an increase in the activity of the maltase enzyme. This effect could have a favorable impact, in terms of better digestive activity, increased glucose uptake from the diet, and at the same

La actividad de la sacarasa fue casi 32 veces más baja que la actividad de la maltasa después de la eclosión. En pollos de mayor edad se ha reportado que la actividad de la sacarasa suele ser alrededor de 13 a 16% menor que la de la maltasa (13). El suministro de ABH y SHC en las

On the second day of life, all treatments showed a tendency to increase this enzyme’s activity in relation to birth, even in birds that were under total fasting conditions (T0). At 72 hrs. accelerated activity of this enzyme was observed in the group of animals that fasted for 48 hrs. (Figure 2).

León - Early feeding digestive in broilers chickens time would improve the energy metabolism of the bird. The specific activity of maltase showed a marked increase with age, in agreement with trends reported by other authors (13). Sucrase activity was almost 32 times lower than maltase activity after hatching. In older chickens, it has been reported that sucrase activity is usually about 13 to 16% lower than that of maltase (13). Providing HBF and CHS in the first 48 hrs. of life increased sucrase activity at 72 hrs. (p≤0.05). Like maltase, specific sucrase activity increased with the age of the animals over the time span of the study period and increased after food restriction; similar to findings reported by Pinheiro et al (18). It has been reported that digestive enzyme activity may be affected by characteristics of diet and availability of substrate (19), among other factors. The activity of the enzymes maltase, sucrase, alkaline phosphatase and phytase, all integral catalytic proteins of the intestinal brush border, determined in the duodenal segment, increased in the first 72 hrs. of life in groups that received some type of food or supplement immediately after hatching. In assessing the effect of feed restriction between 7 and 14 days of life in broiler chickens, an increase was reported in maltase and sucrase activity immediately after the restriction period (18). This could be applied to partially explain the effect of the food supply at 48 hrs. on birds in the control group, by increasing the activity of duodenal enzymes.

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primeras 48 h de vida aumentó la actividad de la sacarasa a las 72 h (p≤0.05). Al igual que la maltasa, la actividad específica de la sacarasa se incrementó con la edad de los animales en el lapso de tiempo que duró el estudio y aumentó después del período de restricción de alimentos; de manera similar a lo reportado por Pinheiro et al (18). Se ha reportado que la actividad de las enzimas digestivas puede ser afectada por las características de la dieta y la disponibilidad del sustrato (19), entre otros factores. La actividad de las enzimas maltasa, sacarasa, fosfatasa alcalina y fitasa, todas proteínas catalíticas integrales del borde en cepillo intestinal, determinadas en el segmento duodenal, aumentó en las primeras 72 h de edad de las aves en los grupos que recibieron algún tipo de alimento o suplemento desde inmediatamente después de la eclosión. Al evaluar el efecto de la restricción de alimento entre 7 y 14 días de edad, en pollos de engorde, se reportó un aumento en la actividad de las enzimas maltasa y sacarasa inmediatamente después del período de restricción (18). Esto podría aplicarse para explicar en parte el efecto del suministro de alimento a las 48 h de edad, en las aves del grupo control, al incrementar la actividad de las enzimas duodenales.

As for pancreatic enzymes, some authors have reported that specific activity of digestive enzymes increases with age, peaking in the pancreas on the 8th day for amylase and lipase, on the 11th day for trypsin and on the 17th day for amylase (9). During the first 48 hrs. of life, trypsin activity was similar in all groups, including animals that were fasting, indicating that activity is not very dependent on the presence of substrate, in accordance with findings reported by other authors (20) who observed that trypsin activity was not affected after evaluating two different energy levels in the diet of broiler chickens during the first week of life. The results obtained in the present study may be related to previous studies which have shown that when you start feeding chickens 36 hrs. after hatching there is a significant decrease in body weight in the first three days of life (11) as well as growth retardation and reduced meat production (6), which may result from decreased digestive enzyme activity in the intestinal brush border.

En cuanto a las enzimas pancreáticas, algunos autores han reportado que la actividad específica de las enzimas digestivas aumenta con la edad, alcanzando valores máximos en el páncreas al 8vo día para amilasa y lipasa y al 11vo día para tripsina. En el contenido intestinal la actividad máxima se observó al 4to día para lipasa, al 11vo día tripsina y al 17vo día en amilasa (9). Durante las primeras 48 h de edad, la actividad de la tripsina fue semejante en todos los grupos, incluyendo a los animales en ayuno, indicando una actividad poco dependiente de la presencia del sustrato, en concordancia por lo reportado por otros autores (20) al observar que la actividad de la tripsina no fue afectada después de evaluar dos niveles diferentes de energía en la dieta en pollos de engorde durante la primera semana de vida. Los resultados obtenidos en el presente estudio podrían estar relacionados con estudios previos en los cuales se ha demostrado que al iniciar la alimentación de los pollos 36 h después de la eclosión se produjo disminución significativa del peso vivo en los primeros tres días de edad (11), así como retardo del crecimiento y menor producción de carne (6), lo que puede ser consecuencia de una menor actividad de las enzimas digestivas del borde en cepillo intestinal.

In conclusion, providing HBF or CHS to chickens during the first 48 hours of life increased specific

En conclusión el suministro de ABH o SHC durante las primeras 48 h de vida de los pollos aumentó

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activity of duodenal enzymes along the intestinal brush border: maltase, sucrase and phytase, and decreased pancreatic enzyme activity for a-amylase, trypsin and lipase in the first 3 days of life.

la actividad específica de las enzimas duodenales del borde en cepillo intestinal maltasa, sacarasa y fitasa y disminuyó la actividad de las enzimas pancreáticas α-amilasa, tripsina y lipasa en los primeros 3 días de edad.

Acknowledgements

Agradecimientos

The Council of Scientific and Humanistic Development of the Central University of Venezuela for funding this research through Project Group No. PG-11-7118-2008/1.

Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de la presente investigación, a través del Proyecto de Grupo Nº PG-11-71182008/1.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4328-4337, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Effect of L-glutamine levels in piglets diets challenged with Escherichia coli lipopolysacharides Efecto de los niveles de L-glutamina en dietas para lechones desafiados con lipopolisacáridos de Escherichia coli Arturo Pardo L,1 Ph.D, Angela Poveda P,2* Ph.D, Caio da Silva,1 Ph.D, Andréa dos Santos,2 Ph.D, Emerson Venâncio,3 Ph.D, Vânia Arantes,4 Ph.D, Eduardo Nogueira,5 Ph.D. Londrina State University, Animal Science Department. Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380, University Campus. Londrina-Paraná, Brasil. 2Federal University of Mato Grosso, Zootechnical Department, Rondonópolis Campus, Rodovia MT-270, Parque Sagrada Familia. Rondonópolis-Mato Grosso, Brasil. 3Londrina State University, Departament of Pathological Science. Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380, University Campus. Londrina-Paraná, Brasil. 4Federal University of Mato Grosso, Zootechnical Department, Cuiabá Campus, Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367. Cuiabá-Mato Grosso, Brasil. 5Ajinomoto of Brasil. Ajinomoto Animal Nutrition. Rua Joaquim Távora, 845. São Paulo-São Paulo, Brasil. *Correspondence: angelpov@gmail.com 1

Received: October 2013; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. To evaluate the effect of different levels of L-glutamine on weaned and immunologically challenged piglets with Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS) on performance parameters, serum cortisol and defense cells. Materials and methods. Four levels of L –glutamine were evaluated (0, 1.0, 1.5, 2.0%) as well as the addition, or no addition, of LPS (0.3μg). 96 piglets were used (48 castrated males and 48 females) of Agroceres x PenArlan lineage, with an initial age of 21 days and 6.06±0.852 kg live weight. An experimental design was used on randomized blocks in a factorial setting 4 x 2 (levels of L- glutamine with or without challenge). Results. Cubic effect was shown for daily weight gain of unchallenged animals, and was better with the addition of 0.41% L- glutamine. Feed conversion improved with increased levels of L -glutamine for challenged animals. In the evaluation of defense cells, there was interaction of leukocytes with the levels of L- glutamine and the immune challenge. Eosinophils and lymphocytes showed a quadratic effect for the levels of L –glutamine, with a maximum value of 1.30% and 0.5%, respectively. Conclusions. L -glutamine supplementation of up to 2% in the diet improves feed conversion and favors the immune serum of weaned piglets challenged with LPS of E. coli. Key words: Animal performance, immunity, leukocytes, stress (Source: Agrovoc).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de diferentes niveles de L-glutamina en lechones destetados y desafiados imunológicamente con lipopolisacáridos de Escherichia coli (LPS) sobre parámetros de desempeño, cortisol sérico y células de defensa. Materiales y métodos. Se evaluaron cuatro niveles de L-glutamina 4328

Pardo - Effect of L-glutamine levels in piglests diets

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(0, 1.0, 1.5, 2.0%) y la adición o no de LPS (0.3 μg). Se utilizaron 96 lechones (48 machos castrados y 48 hembras) de linaje Agroceres x PenArlan, con edad inicial de 21 días y 6.06 ± 0.852 kg de peso vivo. Se utilizó un diseño experimental en bloques al azar en un arreglo factorial 4 x 2 (niveles de L-glutamina con o sin desafío). Resultados. Se evidenció efecto cúbico para la ganancia de peso diaria para los animales no desafiados, que fue mejor con la inclusión de 0.41% de L-glutamina. La conversión alimenticia mejoró con el aumento de los niveles de L-glutamina para los animales desafiados. En la evaluación de las células de defensa hubo interacción de los leucocitos con los niveles de L-glutamina y el desafío inmunológico. Lo esosinofilos y linfocitos presentaron un efecto cuadrático para los niveles de L-glutamina siendo el valor máximo de 1.30% y 0.59%, respectivamente. Conclusiones. El suplemento de L-glutamina hasta el 2% en la dieta, mejora la conversión alimenticia y favorece la inmunidad sérica de lechones destetados y desafiados con LPS de E. coli. Palabras clave: Desempeño animal, estrés, leucocitos, inmunidad (Fuente: Agrovoc).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Weaning in the swine industry is done between 21 and 28 days of age, at this stage psychological factors (maternal and litter segregation), social (establishment of the hierarchy in the new group) and nutritional (physical change of diet and type of food) significantly affect the development of the animals (1,2).

El destete en la indústria porcina es realizado entre los 21 y 28 días de edad, en esta fase factores sicológicos (segregación maternal y de su camada), sociales (establecimiento de la jerarquia en el nuevo grupo) y nutricionales (cambio físico de la dieta y tipo de alimento) afectan de manera importante el desarrollo de los animales (1,2).

From the dietary or nutritional point of view, interruption of breastfeeding and substitution of this source of energy/protein with plant products requires morphological, enzymatic and metabolic adaptation (3). This leads to alterations in intestinal flora, causing a reduction in the population of beneficial bacteria as a result of pathogens, which produce toxic metabolic, causing inflammation and exfoliation of the piglet’s intestinal mucous membrane, generating diarrhea and underdevelopment, when death does not occur (4).

Desde el punto de vista alimenticio o nutricional, la interrupción de la ingesta de leche materna y la sustitución de esta fuente energética/proteica por productos de origen vegetal demandan una adaptación morfológica, enzimática y metabólica (3). Esto conlleva a alteraciones en la flora intestinal, provocando una reducción de la población de bacterias benéficas, como consecuencia de los agentes patógenos, los cuales producen metabólicos tóxicos, causando inflamación y exfoliación de la mucosa intestinal del lechón, generando cuadros diarreicos y subdesarrollo, cuando no ocurre la muerte del lechón (4).

The set of alterations causes a typical picture of stress, increasing levels of corticotropin releasing factor (CRF) and serum cortisol, influencing the behavior of the animal and corresponding to an increase in the production of immune cells, which may interfere with metabolism and animal performance (5). Various remedies have been used to minimize problems resulting from weaning. The inclusion of glutamine in the piglets’ diet is one of the recent tools that favor high replication of gastrointestinal tract and immune system cells (6). Glutamine is the most abundant free amino acid in physiological fluids (plasma, cytoplasm, milk and fetal fluids), and is also present in animal and plant protein (7, 8). It is considered the main energy substrate for rapidly proliferating cells such as activated enterocytes and lymphocytes (9); moreover, it is essential in the synthesis of mucin and for maintaining barriers against bacterial attacks (10).

El conjunto de alteraciones causa un cuadro típico de estrés, aumentando los niveles del factor liberador de corticotropina (CRF) y del cortisol sérico, influenciando el comportamiento del animal y coincidiendo con un aumento en la producción de células del sistema inmune, el cual puede interferir en el metabolismo y desempeño animal (5). Diversos recursos han sido utilizados para minimizar los problemas resultantes del destete, la inclusión de glutamina a la dieta de lechones representa una de las herramientas recientes que favorecen la alta replicación de las células del tracto gastrointestinal y de las células del sistema inmune (6). La glutamina es el aminoácido libre más abundante en los fluidos fisiológicos (plasma, citoplasma, leche y fluidos fetales), asimismo está presente en la proteína animal y vegetal (7,8). Es considerado el principal sustrato energético de las células de proliferación rápida como enterocitos y linfocitos activados (9); además, es esencial en la síntesis de mucina y en

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Due to the many important metabolic processes in which glutamine participates, such as nitrogen transport and donation, control, acid-base balance and in the integrity of tissues (11), research has intensified with the aim of establishing glutamine as an amino acid conditionally essential for health (12). Administration of lipopolysaccharide (LPS) of E. coli causes a series of direct morphological alterations in the gastrointestinal tract, characterized by the decrease in height of intestinal villi and the increase of intestinal crypts (13), increased levels of pro inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 (14), and reduced consumption. The aim of this study was to evaluate different levels of L-glutamine in the diets of weaned piglets challenged with Escherichia coli lipopolysaccharides, on performance parameters, serum cortisol and defense cells.

MATERIALS AND METHODS Study site and animals. The experiment was performed in the Swine Sector of the Farm School at Londrina State University (Paraná-Brazil) located at an altitude of 532 meters above sea level with coordinates between 23°20’23.45” South latitude and 51°12’32.28” West longitude; with a pre mountain humid tropical climate; with an average temperature of 20°C, ranging from 16 to 27ºC with annual rainfall of 1588 mm. 96 piglets were used with Agroceres x PenArlan lineage (48 castrated males and 48 females) weaned at 21 days of age, with an average weight of 6.06 ± 0.852 kg, housed in 48 cages (24 metal cages with raised floors and 24 on concrete floors) with one male and one female per cage. The animals received food and water “ad libitum” during the entire experimental period. Treatments. The experimental diets were formulated to meet recommendations described by Rostagno (15) for pigs in the pre-initial phase I (1-15 days) and initial phase II (15-30 days). The nutritional and centesimal composition is found in table 1. The experimental diets had different inclusions (0, 1.0, 1.5 and 2.0%) of L-glutamine (Ajinomoto Brazil) and were either associated or not associated with an immunological challenge with LPS from E. coli (serotype 0111:B4, Sigma Aldrich®). The challenge program with LPS was performed between 43 to 47 days after birth, where half of the animals received 0.3 µg of LPS (serotype 0111:B4, Sigma Aldrich®) diluted in 5

el mantenimiento de las barreras contra ataques de bacterias (10). Debido a sus múltiples procesos metabólicos de gran importancia en los cuales la glutamina participa como en el transporte y donación de nitrógeno, control, equilibrio acido-base y en la integridad de tejidos (11), las investigaciones se han intensificado con el objetivo de establecer la glutamina como un aminoácido condicionalmente esencial para la salud (12). La administración de lipopolisacáridos (LPS) de E. coli provoca una serie de alteraciones morfológicas directas en el tracto gastrointestinal, caracterizados por la disminución de la altura de las vellosidades intestinales y aumento de las criptas intestinales (13), aumentar los niveles de citocinas pro inflamatorias TNF-α y IL-6 (14), y reducir el consumo. El objetivo de este trabajo fue evaluar diferentes niveles de L-glutamina en dietas para lechones destetados y desafiados con lipopolisacáridos de Escherichia coli, sobre parámetros de desempeño, cortisol sérico y células de defensa.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio y animales. El experimento se realizó en el Sector de Porcicultura de la Fazenda Escola de la Universidade Estadual de Londrina (Paraná-Brasil) ubicada a una altitud de 532 msnm con las coordenadas entre 23°20’23.45” latitud Sur y 51°12’32.28” longitud oeste; con clima de tropical humedo pre montaña; con temperatura promedio de 20ºC, que varía de 16 a 27ºC y precipitación anual de 1588 mm. Se utilizaron 96 lechones de linaje Agroceres x PenArlan (48 machos castrados y 48 hembras) destetados a los 21 días de edad y con peso promedio de 6.06± 0.852 kg, los cuales fueron alojados en 48 jaulas (24 jaulas metálicas de piso elevado y 24 en piso concreto) ubicando un macho y una hembra por jaula. Los animales recibieron agua y alimento “ad libitum” durante todo el período experimental. Tratamientos. Las dietas experimentales fueron formuladas para atender las recomendaciones descritas por Rostagno (15) para cerdos en la fase pre-inicial I (1 a 15 días) e inicial II (15 a 30 días). La composición centesimal y nutricional se encuentra en la tabla 1. Las dietas experimentales tuvieron diferentes inclusiones (0, 1.0, 1.5 y 2.0%) de L-glutamina (Ajinomoto Brasil) y asociados o no a un desafío

Pardo - Effect of L-glutamine levels in piglests diets Table 1. Calculated percentage composition of the basal diet. Ingredients % Corn Soybean meal, 45% Powder Skim Milk Soybean Oil Sugar Whey Powder Dicalcium Phosphate Calcium carbonate L–Lysine HCL Common Salt L-Threonine DL-Methionine Vitini- Sui1 L-Tryptophan Total Calculated Values Metabolizable energy (kcal/kg) Crude protein (%) Calcium (%) Available Phospohorus (%) Digestible Lysine (%) Digestible Methionine (%) Digestible Met+Cis (%)

Pre-initial I (1-15 days)

Pre-initial II (15 to 30 days)

53.26 23.73 10.00 3.79 3.00 2.00 1.66 0.64 0.63 0.51 0.29 0.24 0.20 0.05 100.00

67.78 20.88 4.00 0.23 2.00 2.00 1.36 0.70 0.33 0.36 0.09 0.05 0.20 0.01 100.00

3.400 20.00 0.85 0.50 1.45 0.55 0.81

3.230 17.50 0.72 0.39 1.02 0.32 0.57

Vitamin-mineral supplement, composition by kg of product: Vit A, 1.800.000 UI; Vit D3, 360.000 UI; Vit E, 4.000 UI; Vit K3, 600mg; Vit B1, 280mg; Vit B2, 800mg; Vit B6, 300mg; Vit B12, 3.600mcg; Niacin, 6.000mg; Ac. Pantothenic, 3.200mg; Biotin, 20mg; Folic Ac., 80mg; Choline, 31g; Iron, 20.000mg; Copper, 50.000mg; Cobalt, 120mg; Manganese, 11.000mg; Zinc, 18.000mg; Selenium, 60mg; Iodine, 200mg; Lysine,140g; Antioxidant, 20g; vehicle q.s.p., 1.000 g. 1

mL of skim milk and administered orally between 7:30 and 8:00 h. The other animals also received 5 mL of skim milk free of LPS orally. Sampling. Weekly growth performance, feed intake, weight gain and feed conversion of the animals were estimated. For the cortisol and leukogram analysis, blood samples were collected from all animals by puncturing the cranial cava vein. The sample was collected in tubes containing 0.1 mL anticoagulant EDTA 10%. The first sample was taken on the 43rd day of life between 7:30 and 8:00 h, before LPS inoculation and after an 8-hour fast. Other samples were taken at the same time, day 45°, 47° and 49° of life. Leukogram was determined by the method of impedance in hematology BC-280Vet (Mindray) in an authorized clinical veterinary laboratory. For determination of serum cortisol, samples were collected in tubes without anticoagulant, then were centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The serum obtained was then transferred to 1.5 ml micro tubes, identified and stored at -20°C for later analysis. Cortisol was determined by the ELISA technique (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) competitive in the immunology IV laboratory at the State University of Londrina.

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imunológico con LPS de E. coli (serotipo 0111:B4, Sigma Aldrich®). El programa de desafío con LPS fue realizado entre el 43 a 47º día de vida, donde la mitad de los animales recibieron 0.3 µg de LPS (serotipo 0111:B4, Sigma Aldrich®) diluido en 5 mL de leche desnatada y administrado vía oral, entre las 7:30 y 8:00h. Asimismo, los demás animales recibieron oralmente 5 mL de leche desnatada libre de LPS. Toma de muestras. Semanalmente se estimaron los parámetros productivos, consumo de ración, la ganancia de peso y conversión alimenticia de los animales. Para el análisis del cortisol y del leucograma se colectaron muestras de sangre de todos los animales, a través de la punción de la vena cava craneal. La muestra fue colectada en tubos que contenían 0.1 mL de anticoagulante EDTA 10%. La primera toma fue realizada al día 43º de vida entre las 7:30 y 8:00h, antes de la inoculación de los LPS y después de un ayuno previo de 8 horas. Las demás muestras fueron realizadas en el mismo horario los día 45º, 47º y 49º de vida. El leucograma fue determinado por el método de impedancia en hematología BC-280Vet (Mindray) en un laboratorio clínicoveterinario autorizado. Para la determinación del cortisol sérico las muestras se colectaron en tubos sin anticoagulante, después fueron centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos. El suero obtenido fue transferido a micro tubos de 1.5 mL, identificados y conservados a -20°C para su posterior análisis. El cortisol fue determinado por la técnica de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) competitiva en el laboratorio de inmunología IV de la Universidad Estadual de Londrina. Diseño experimental. Se utilizó un diseño experimental en bloques completos al azar con un arreglo factorial 4x2 (cuatro niveles de L-glutamina y el desafío inmunológico con o sin LPS de E. coli). Los datos obtenidos fueron sometidos a análisis de normalidad, aditividad y homocedasticidad y posteriormente sometidos a análisis de variancia y regresión utilizando el paquete estadístico ExpDes del programa estadístico R (16). Para el consumo de ración, conversión alimenticia y ganancia de peso, la jaula fue considerada como unidad experimental, siendo dos animales por unidad. Para las demás variables el animal fue considerado unidad experimental.

RESULTADOS El consumo diário de alimento y la conversión alimenticia no fueron influenciados por la inclusión

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Experimental design. An experimental design was used on randomized complete blocks with a factorial arrangement 4x2 (four levels of L-glutamine and immune challenge with or without LPS of E. coli). The data obtained was subjected to analyses of normality, additivity and homoscedasticity and then subjected to an analysis of variance and regression using the statistical package ExpDes from the R statistical program (16). For feed intake, feed conversion and weight gain, the cage was considered as an experimental unit, with two animals per unit. For all other variables the animal was considered the experimental unit.

RESULTS Daily feed intake and feed: gain rate conversion were not influenced by the inclusion of L-glutamine or by the E. coli LPS immunological challenge. Meanwhile, the immunological challenge influenced weight gain (Table 2). Table 2. Production parameters of weaned piglets supplemented with different levels of glutamine and immunologically challenged with E. coli LPS. % of Glutamine

DFI (kg)

DWG (kg)

FGR

0.363±0.0125

0.203±0.0132

1.828±0.1351

1.0

0.382±0.0231

0.225±0.0097

1.704±0.1134

1.5

0.355±0.0223

0.194±0.0136

1.864±0.0864

2.0

0.352±0.0165

0.216±0.0094

1.612±0.0768

LPS, μg 0.0

0.371±0.0130

0.221±0.0089a

1.711±0.0716

0.3

0.355±0.0137

0.198±0.0072b

1.793±0.0791

General Average

0.363±0.0094

0.210±0.0059

1.752±0.0531

CV(%)

17.98

19.51

21.00

Table 3. Interaction between glutamine and LPS levels for variables daily weight gain (DWG) and feed conversion (FGT). DWG (kg) LPS

FGR LPS

Gln ,%1

0.3μg

0.0 μg

0.3μg

0.0 μg

0.17 ±0.009b

0.24 ±0.010a

2.13 ±0.207a

1.53 ±0.061b

1.0

0.21 ±0.012a

0.24 ±0.010a

1.70 ±0.171a

1.70 ±0.164ª

1.5

0.21 ±0.017a

0.17 ±0.018b

1.75 ±0.081a

1.97 ±0.145ª

2.0

0.20 ±0.010a

0.23 ±0.013a

1.58 ±0.067a

1.64 ±0.141ª

p-value

0.0618

0.0021

0.0317

0.1754

de L-glutamina ni por el desafio inmunológico de LPS de E. coli. Entre tanto, el desafio inmunológico influyó en la ganancia de peso (Tabla 2). Se observó interacción entre los niveles de glutamina y el desafío con LPS para la ganancia de peso y conversión alimenticia (Tabla 3). Los animales no desafiados presentaron un efecto cúbico de los niveles de glutamina sobre la ganancia de peso, siendo el punto máximo 0.41% de inclusión de L-glutamina. Además, no se observaron diferencias en la ganancia diaria de peso entre los animales desafiados o no suplementados con 1.0 y 2.0% de glutamina (Tabla 3). Para los animales que no fueron suplementados con L-glutamina y no fueron desafiados se observó una mayor ganancia diaria de peso. Sin embargo, para los animales suplementados con 1.5% de glutamina y desafiados obtuvieron una ganancia de peso mayor con relación a los no desafiados (Tabla 3). La conversión alimenticia de los animales desafiados presentó un efecto lineal decreciente a medida que aumentaba la inclusión de L-glutamina, indicando una reducción de 0.254 kg para cada nivel de inclusión (Tabla 3). Los animales que no fueron suplementados con L-glutamina presentaron diferencia (p<0.05) en la conversión alimentar. La concentración de cortisol sérico no fue influenciada por el desafío inmunológico ni por la inclusión de L-glutamina (Tabla 4). Entretanto, hubo interacción entre los niveles de glutamina y el desafío con LPS para los valores de cortisol (Tabla 5). Los animales no desafiados presentaron un efecto cuadrático, obteniendo un valor máximo de cortisol con la inclusión de 1.45% de L-glutamina. Los animales desafiados presentaron un efecto cúbico siendo el valor máximo para el cortisol con un nivel de 1.68% y un valor mínimo de 0.51% de inclusión de L-glutamina. También, se presentó diferencia entre los niveles de glutamina 0, 1.0 y 1.5 para los animales desafiados inmunológicamente o no. Entre tanto, los niveles de cortisol de los animales desafiados o no y suplementados con 2% de L-glutamina se mantuvieron similares durante el período experimental (Tabla 5).

Regression Equation GDP (kg)

0.0 μg

Ŷ=0.2413+0.3269X-0.4982X2+0.1665X3 (R2=1.00)

0.3 μg

Ŷ = 2.080-0.254X (R2=0.762)

Values followed by different letters in the row differ statistically by the F test (p<0.05). 1

El conteo de leucocitos y monocitos no fue influenciado por los niveles de L-glutamina, entre tanto, se presentó un efecto cuadrático en los eosinófilos y linfocitos influenciados por los diferentes niveles de L-glutamina; siendo el valor máximo de 1.30% y

Pardo - Effect of L-glutamine levels in piglests diets Interaction between levels of glutamine and the LPS challenge were observed for weight gain and feed conversion (Table 3). Unchallenged animals had a cubic effect of glutamine levels on weight gain, the maximum point of inclusion of L-glutamine being 0.41%. In addition, there were no observed differences in daily weight gain between challenged or unchallenged animals supplemented with 1.0 and 2.0% glutamine (Table 3). For animals that were not supplemented with L-glutamine and were not challenged, increased daily weight gain was observed. However, challenged animals supplemented with 1.5% glutamine obtained a greater weight gain compared to non-challenged (Table 3). Feed conversion of the challenged animals showed a decreasing linear effect with increasing inclusion of L-glutamine, indicating a reduction of 0.254 kg for each inclusion level (Table 3). The animals that were not supplemented with L-glutamine showed a (p<0.05) difference in feed conversion. Serum cortisol concentration was not influenced by the immunological challenge or by the inclusion of L-glutamine (Table 4). Meanwhile, there was interaction between levels of glutamine and the LPS challenge for cortisol values (Table 5). Unchallenged animals showed a quadratic effect, obtaining a maximum value of cortisol with the inclusion of 1.45% of L-glutamine. The challenged animals showed a cubic effect reaching a maximum cortisol value with a level of 1.68% of L-glutamine inclusion, and a minimum value with 0.51% of L-glutamine inclusion. There was also a difference between glutamine levels 0, 1.0 and 1.5 for immunologically challenged animals or unchallenged animals.

Table 4. Serum cortisol values (ng/mL) of weaned piglets immunologically challenged with E. coli LPS and supplemented with L-glutamine.

0.59% de inclusión, respectivamente. Los neutrófilos presentaron un efecto lineal creciente con cada nivel de inclusión de la L-glutamina (Tabla 6). El desafío inmunológico influyó sobre el conteo de leucocitos; presentando valores superiores para los animales desafiados con LPS de E. coli (Tabla 6). Para los leucocitos hubo interacción entre los niveles de L-glutamina y el desafío inmunológico (Tabla 7). Hubo diferencia entre los animales suplementados con 0, 1.0 y 1.5% de L-glutamina y desafiados inmunológicamente, entre tanto, los animales desafiados y suplementados con L-glutamina (1.0, 1.5 y 2.0 %) presentaron un mayor conteo de linfocitos, comparados con los no desafiados; sin embargo, esta diferencia se invirtió al suplementar los lechones con 1.5% de L-glutamina (Tabla 7).

DISCUSIÓN El consumo de alimento es uno de los factores que tienen gran importancia sobre el desarrollo del tracto digestivo de lechones recién destetados. La producción enzimática es proporcional a la cantidad del sustrato en el tracto intestinal, así, el efecto observado sobre la ganancia de peso con la inclusión de 1.5% de L-glutamina se debe principalmente al aumento en la actividad de la amilasa y de la tripsina pancreática de los lechones, lo cual mejora la digestibilidad (17). El efecto positivo sobre la conversión alimenticia puede ser explicado por la acción de la glutamina sobre el metabolismo, estructura y función intestinal, el cual inhibe la disminución del crecimiento y la atrofia de las vellosidades de la mucosa de los animales desafiados con LPS, aumenta la absorción de los nutrientes de la dieta y mejora la eficiencia alimenticia (18).

Table 5. Interaction between levels of glutamine and LPS for the serum cortisol.

1.0

92.20±7.30

Gln1 % 0 1.0 1.5 2.0

1.5

114.86±5.60

p-value

2.0

106.38±6.92

Levels of Glutamine, %

Serum Cortisol, ng/mL

66.18±6.98

89.80±5.75

0.3μg

101.29±4.27

General average

95.51±3.60

CV(%)

51.08

Cortisol sérico, ng/mL 0.3μg 0.0μg 105.77±8.88a 33.48±3.11b b 68.66±5.02 116.81±11.95a 126.71±7.49a 102.48±7.68b 104.68±7.98a 108.16±11.55a 0.00065

0.00034 Regression Equation

LPS 0.0μg

4333

0.3μg

Ŷ=105.7695-335.9840x+430.0320x2–131.1558x3 (R2=1.00)

0.0μg

Ŷ=34.9786+110,4813x–38.0710x2 (R2=0.9407)

Serum Cortisol

Levels of L-glutamine inclusion. Values followed by different letters in the row differ statistically by the F test (p<0.05). 1

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Meanwhile, cortisol levels in challenged and unchallenged animals supplemented with 2% L-glutamine remained similar throughout the experimental period (Table 5).

Table 6. Defense cell values for weaned pigs fed different levels of L-glutamine and immunologically challenged with E. coli LPS. Gln1 % Leukocytes Eosinophils Monocytes Neutrophils Lymphocytes

The counting of leukocytes and monocytes was not influenced by levels of L-glutamine, meanwhile, there was a quadratic effect on eosinophils and lymphocytes influenced by different levels of L-glutamine; with a maximum value of 1.30% and 0.59% of inclusion, respectively. Neutrophils showed an increasing linear effect with each level of L-glutamine inclusion (Table 6). The immunological challenge influenced the leukocyte count; with higher values for the animals that were challenged with E. coli LPS (Table 6).

The positive effect on feed conversion can be explained by glutamine action on the metabolism, intestinal structure and function, which inhibits the decrease of growth and atrophy of the mucosal villi in animals challenged with LPS, increases absorption of dietary nutrients and improves feed efficiency (18). The differences obtained in feed conversion for animals that didn’t receive inclusion of L-glutamine (which were not challenged with E. coli LPS) may be due to metabolic stress processes during which there is a reduction in luminal transport of glutamine and in the activity

1.51 ±0.186

1.58 ±0.204

41.71 ±1.560

55.04 ±1.544

1.0

16192.7 ±408.5

0.97 ±0.158

1.97 ±0.267

41.20 ±1.293

55.75 ±1.270

1.5

17145.8 ±590.6

0.89 ±0.141

1.51 ±0.214

44.57 ±1.386

52.94 ±1.448

2.0

18118.5 ±769.4

1.10 ±0.158

2.10 ±0.247

47.28 ±1.783

46.91 ±1.75

p-value

0.326

0.0412

0.184

0.0063

0.000024

0.0μg

16197.4 ±464.4b

1.20 ±0.12

1.74 ±0.16

43.41 ±1.07

52.23 ±1.11

0.3μg

17496.3 ±367.4a

1.00 ±0.10

1.85 ±0.17

44.07 ±1.09

52.97 ±1.08

General Average

16855.0 ±297.4

1.10 ±0.08

1.79 ±0.11

43.74 ±0.76

52.60 ±0.77

CV,%

31.56

131.27

117.52

31.30

26.39

Levels of L-glutamine inclusion. 2 Ŷ= 1.512 – 0.915x + 0.350x2 (R2= 0.99); 3 Ŷ= 40.462 + 2.828x (R2= 0.61); 4 Ŷ= 55.006 + 5.843x – 4.921x2 (R2= 0.91). Values followed by different letters in the column differ statistically by the F test (p<0.05). 1

Table 7. Interaction between levels of glutamine and LPS for the Leukocyte variable.

DISCUSSION Food consumption is one of the factors that have great importance on the development of the digestive tract of recently weaned piglets. Enzyme production is proportional to the amount of substrate in the intestinal tract, therefore, the observed effect on weight gain with the inclusion of 1.5% of L-glutamine is largely due to the increase in activity of amylase and pancreatic trypsin in the piglets, improving digestibility (17).

15847.9 ±527.1

LPS

For leukocytes, there was interaction between L-glutamine levels and the immunological challenge (Table 7). There was a difference between the animals supplemented with 0, 1.0 and 1.5% of L-glutamine and the immunologically challenged, meanwhile, challenged animals supplemented with L-glutamine (1.0, 1.5 and 2.0%) had increased lymphocyte counts compared with unchallenged; however, this difference was reversed by supplementing piglets with 1.5% of L-glutamine (Table 7).

Leukocytes

Gln1 %

0.3μg

0.0μg

17702.86±768.6934a

14044.44±606.4233b

1.0

17334.88±649.6234a

14965.00±415.5094b

1.5

16013.95±535.2634b

18362.00±1041.5945a

2.0

19082.50±900.1488a

17178.05±1237.7677ª

p-valor

0.0686

0.0008 Regression Equation

Leukocyte

0.0μg

Ŷ=13929.907+1975.748x (R2= 0.6993)

Levels of L-glutamine inclusion. Values followed by different letters in the line differ statistically by the F test (p<0.05). 1

Las diferencias obtenidas en la conversión alimenticia para los animales que no recibieron inclusión de L-glutamina (que fueron o no desafiados con LPS de E. coli), pueden ser debidas a que durante los procesos de estrés metabólico ocurre una reducción en el transporte luminal de la glutamina y de la actividad de la glutaminasa de la mucosa (19), existiendo la posibilidad de que el intestino supla las necesidades de otros órganos como parte del proceso para priorizar la síntesis proteica y de esa manera no sea comprometido el aprovechamiento de los nutrientes.

Pardo - Effect of L-glutamine levels in piglests diets of the mucosal glutaminase (19), with the possibility of the intestine meeting the needs of other organs as part of the process for prioritizing protein synthesis and thus not compromising the use of nutrients. Stress is a physical-chemical or emotional process which promotes the release of pro-inflammatory cytokines, corticotropin-releasing hormone and cortisol. When stressors become chronic they cause cortisol levels to remain elevated, which leads to an imbalance of neuro-endocrine immunological interactions (20). Exposure to low doses of E. coli LPS causes activation of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis, increasing cortisol levels in the blood, and indicates the level of stress to which the animal is being subjected (19, 21). Using 0.3 µg of LPS/pig/day did not follow the physiological pattern of moderate or transient cortisol during collections, as the values were expected to decrease in comparison to the first challenge. Increased cortisol values in challenged animals can be explained by the effects of endotoxemia induced by E. coli LPS and the effect of stress (20). Glutamine may reduce the synthesis of cortisol in the adrenal cortex due to reduction in key enzyme activities or in the availability of NADPH. In normal situations, cortisol values may vary, it is therefore necessary to consider normal periodic changes and physiological responses to stress (21). The observed increase in the number of lymphocytes in challenged animals is attributed to the role of glutamine as a source of ATP for lymphocytes and macrophages, enhancing the immune response of the performance of the intestinal barrier (22). In addition, a simple stress stimulus causes changes in the number of leukocytes in the blood, which can affect the immune system’s availability in responding to these changes. The difference observed in leukocytes for challenged or unchallenged animals indicates that LPS stimulates increased production of leukocytes and this increase is dependent on extracellular glutamine present at the time of challenge; however, these concentrations may also vary depending on genetics, environment, the health of the animals and serum cortisol values (23). The evident effect for neutrophils was possibly caused by the inclusion of L-glutamine on the immune response, as the amino acid enhances proliferation of phagocytic activity and the rate of production of superoxide (free radical necessary for bacterial death), decreasing the number of E. coli present after a challenge (24).

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El estrés es un proceso físico-químico o emocional que promueve la liberación de citocinas proinflamatorias, hormona liberadora de corticotropina y cortisol. Cuando los estímulos estresantes se vuelven crónicos hacen que los niveles de cortisol se mantengan elevados, lo que induce a un desequilibrio de las interacciones neuroendocrinoinmunológicas (20). La exposición a bajas dosis de LPS de E. coli causa la activación del eje hipotálamico-hipofisiario-adrenal, aumentando los niveles de cortisol en la sangre, e indica el nivel de estrés a que el animal está siendo sometido (19, 21). La utilización de 0.3 µg de LPS/lechón/día no siguió un patrón fisiológico de cortisol moderado o transitorio durante las colectas, una vez que se esperaban que los valores disminuyeran en comparación al primer desafío. El aumento en los valores del cortisol de los animales desafiados puede ser explicado por los efectos de la endotoxemia inducida por el LPS de E. coli y los efectos del estrés (20). La glutamina puede reducir la síntesis del cortisol en la corteza adrenal debido a la reducción en las actividades de las enzimas claves o en la disponibilidad del NADPH. En situaciones normales, los valores del cortisol pueden variar, por tanto, es necesario considerar las variaciones periódicas normales y las respuestas fisiológicas al estrés (21). El aumento observado en el número de linfocitos de los animales desafiados es atribuido a la función de la glutamina como fuente de ATP para los linfocitos y macrófagos mejorando la respuesta inmunológica y la función de la barrera intestinal (22). Además, un simple estímulo al estrés genera cambios en el número de leucocitos en sangre, los cuales pueden afectar la disponibilidad del sistema inmune en responder a estas alteraciones. La diferencia observada para los leucocitos en los animales desafiados o no indican que el LPS estimula la mayor producción de leucocitos y que este aumento depende de la glutamina extracelular presente en el momento del desafío; sin embargo, estas concentraciones también pueden variar en función de la genética, el ambiente, el estado de salud de los animales y de los valores de cortisol séricos (23). El efecto evidenciado para los neutrofilos posiblemente fue causado por la inclusión de la L-glutamina sobre la respuesta inmunitaria, una vez que este aminoácido mejora la proliferación de la actividad fagocítica y de la tasa de producción de superóxido (radical libre necesario para la muerte bacteriana), disminuyendo el número de E. coli presente después de un desafío (24). Cuando los animales son desafiados con LPS de E. coli y son suplementados con L-glutamina, se

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When animals are challenged with E. coli LPS and are supplemented with L-glutamine, one can observe the beneficial effect of the amino acid, attenuating the decrease in growth and inefficient use of nutrients. In this case, L-glutamine serves as a metabolic regulator to increase protein synthesis and reduce protein catabolism in infectious and inflammatory processes, maintaining a rate of protein deposition in the skeletal muscle (25). Depending on the severity of the challenge, it is difficult to correctly estimate the beneficial effect of L-glutamine inclusion, since inclusion levels determine different responses in the evaluated parameters. Furthermore, it is known that immunological challenges cause inflammatory alterations and a variety of physiological responses (26). When challenged and not supplemented with L-glutamine, the release of cytokines by macrophages occurs, and the activation of the hypothalamic-pituitary axis, which causes protein degradation in skeletal muscle, reducing intracellular concentration of glutamine, altering the intermediary metabolism and absorption of nutrients (27). In conclusion L-glutamine inclusion of up to 2% in the diet improves the feed conversion of animals subjected to the challenge with E. coli LPS. Therefore, positive responses regarding cellular immunity serum in weaned piglets are due to the inclusion of L-glutamine, and its use is recommended at this stage. Acknowledgements To the Foundation for Research Support of Mato Grosso- Brazil (FAPEMAT) for the research grant, and to Ajinomoto Brazil / Animal Nutrition for donating L-glutamine and to CAPES for the PEC-PG program scholarship.

puede observar el efecto benéfico del aminoácido, atenuando la disminución en el crecimiento y la utilización ineficiente de los nutrientes. En este caso la L-glutamina actúa como un regulador metabólico para aumentar la síntesis proteica y disminuir el catabolismo proteico en procesos infecciosos e inflamatorios, manteniendo una tasa de deposición de proteína en el músculo esquelético (25). Dependiendo de la intensidad del desafío es difícil estimar correctamente el efecto benéfico de la inclusión de la L-glutamina, ya que los niveles de inclusión determinan las diferentes respuestas en los parámetros evaluados. Además, es conocido que los desafíos inmunológicos causan alteraciones inflamatorias y una variedad de respuestas fisiológicas (26). Cuando se desafia y no se suplementa con L-glutamina, ocurre la liberación de citocinas por los macrófagos y una activación del eje hipotálamo-hipófisis, que causa degradación de la proteína en el músculo esquelético, reduciendo la concentración intracelular de la glutamina, alterando el metabolismo intermediario, así como la absorción de nutrientes (27). En conclusión la inclusión de L-glutamina hasta un 2% en la dieta mejora la conversión alimenticia de los animales sometidos al desafío con LPS de E. coli. Por tanto, las respuestas positivas relacionadas con la inmunidad celular sérica en lechones destetados se debe a la inclusión de la L-glutamina, recomendándose su uso en esta fase. Agradecimientos A la Fundación de Amparo a la Investigación de Mato Grosso- Brasil (FAPEMAT) por la beca de investigación, así como a Ajinomoto Brasil/ Animal Nutrition por la donación de la L-glutamina utilizada y a CAPES por la beca de estudio del programa PEC-PG.

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4338-4349, 2014. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Transient GUS gene expression in cassava (Manihot esculenta Crantz) using Agrobacterium tumefaciens leaf infiltration Expresión transitoria del gen GUS en yuca (Manihot esculenta Crantz) utilizando infiltración con Agrobacterium tumefaciens Paula Díaz T,1 M.Sc, Adriana Bernal G,2 Ph.D, Camilo López C,1* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Science Faculty, Biology Department, Manihot Biotec Investigation Group, Calle 30 N 45-03, Bogota, Colombia. 2Universidad de los Andes, Science Faculty, Biology Department, LAMFU, Cra 1 N 18A- 12, Bogota, Colombia. *Correspondence: celopezc@unal.edu.co 1

Received: November 2013; Accepted: March 2014.

ABSTRACT Objective. Assess transient gene expression of GUS in cassava (Manihot esculenta Crantz) leaves using Agrobacterium tumefaciens infiltration. Materials and methods. A. tumefaciens strains GV3101 and AGL1 containing pCAMBIA1305.2 were used to evaluate transient gene expression of β-glucuronidase (GUS). A. tumefaciens infiltration (agroinfiltration) was made using both leaves from in vitro and 1 month old greenhouse plants. Leaves were incubated in X-GLUC buffer, stained and photographed to detect GUS activity. Results. Agroinfiltration assays showed GUS transient expression in leaves of cassava varieties widely cultivated in the north coast and eastern savannah, MCOL2215 (Venezuelan) and CM6438-14 (Vergara), respectively. A. tumefaciens agressive strain AGL1 showed high efficiency inducing GUS expression in cassava leaves. Conclusions. We recommend using A. tumefaciens agressive strain AGL1 for agroinfiltration to assess transient expression in cassava leaves. Key words: Cassava, transient gene expression, Agrobacterium tumefaciens, beta-glucuronidase (Source: NAL USDA).

RESUMEN Objetivo. Evaluar la expresión transitoria del gen GUS en hojas de yuca (Manihot esculenta Crantz) por medio de infiltración con Agrobacterium tumefaciens. Materiales y métodos. Se utilizaron las cepas GV3101 y AGL1 de A. tumefaciens conteniendo el plásmido pCAMBIA1305.2, para evaluar la expresión transitoria del gen GUS. La infiltración de A. tumefaciens (agroinfiltración) se realizó tanto en hojas de plantas “in Vitro” como de plantas adultas de 1 mes. Las hojas se incubaron en tampón X-GLUC, se destiñeron y se fotografiaron para detectar la actividad de la enzima β-glucuronidasa (GUS). Resultados. Los ensayos de agroinfiltración en hoja muestraron la expresión transitoria del gen GUS en variedades cultivadas en la costa norte y en los llanos orientales, MCOL2215 (Venezolana) y CM6438-14 (Vergara) respectivamente, 4338

Díaz - Transient GUS gene expression in cassava Manihot esculenta Crantz

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tanto en plantas “in Vitro” como en plantas adultas. La cepa hipervirulenta de A. tumefaciens AGL1 mostró una mayor eficiencia para la expresión transitoria en hojas de yuca. Conclusiones. Se recomienda utilizar la cepa AGL1 para evaluar la expresión transitoria de genes de interés por agroinfiltración en hojas de yuca. Palabras clave: Agrobacterium tumefaciens, beta-glucuronidasa, expresión transitoria, yuca (Fuente: NAL USDA).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a perennial shrub of the Amazon (1). It was initially domesticated in the southern Amazon basin, and in the XVI century was taken to East Africa by Portuguese sailors (1). In spite of it’s Amazonic origin, it is currently cultivated in more than 100 countries, principally in low-land tropical regions, with an estimated production of 240 million tons a year in 2009 (2). Cassava is considered one of the main sources of food and energy in many countries around the world and is the third source of calories in the tropics, after rice and corn (3).

La yuca (Manihot esculenta Crantz) es un arbusto perenne de origen amazónico (1). Fue domesticada inicialmente en el Sur de la cuenca amazónica y en el siglo XVI fue llevada al Este de África por navegantes portugueses (1). A pesar de su origen amazónico, actualmente es cultivada en más de 100 países, principalmente en tierras bajas del trópico, con una producción estimada en 240 millones de toneladas por año para el 2009 (2). La yuca es considerada como una de las principales fuentes de alimento y energía para muchos países en el mundo y ocupa el tercer puesto como fuente de calorías en el trópico después del arroz y el maíz (3).

The most important part of the plant for food production is the root (4). The high starch concentration (20-40% p/p) makes this crop the focus of interest as an energy source not just for human consumption but also for its industrial applications, such as bioethanol (3.5), which is currently obtained from a diversity crops including cassava. Cassava crop is highly resistant to agroecological conditions adverse for many crops, this is mainly due to it’s tolerance to drought and acidic soils (6). Additionally, a high content of cyanogenic glycosides makes it highly tolerant to generalist herbivores. All these characteristics, as well as the cassava’s response to high concentrations of CO2, make this crop potentially highly resilient to global climate changes (2). However, cassava production is compromised due to various diseases and pests that are produced by virus, fungus, bacteria and insects (4). There are currently no resistance genes to any of the diseases affecting this crop, and therefore it is important to study the molecular mechanisms (especially resistant genes) that explain immunity of the resistance varieties in order to introduce them, by means of conventional or biotechnological breeding strategies, into the susceptible cultivated varieties. Recent advances in the development of new technologies in the area of molecular biology have produced a drastic reduction in the sequencing costs of complete genomes (7). Since the release of the Arabidopsis genome in the year 2000 (8) complete genome sequences of many plant species have been made available to the public. The complete

El órgano más importante para la producción son las raíces almacenadoras (4). Su alto contenido de almidón (20-40% p/p)), convierte a este cultivo en un foco de interés para su utilización como fuente de energía no sólo por el consumo humano, sino también por sus aplicaciones industriales dentro de las que se destaca actualmente la obtención de bioetanol (3,5). El cultivo de yuca es resistente a condiciones agroecológicas adversas para muchos cultivos, debido a su tolerancia al estrés hídrico y suelo ácidos (6). Adicionalmente, su alto contenido de glicósidos cianogénicos lo hace altamente tolerante a herbívoros generalistas. Todas estas características junto con la respuesta de la yuca a altas concentraciones de CO2, lo convierten en un cultivo con un alto potencial de resistencia frente al cambio climático global (2). Sin embargo, la producción de este cultivo está comprometida por causa de varias enfermedades y pestes, producidas por virus, hongos, bacterias e insectos (4). Actualmente no existen genes de resistencia a ninguna de las enfermedades de este cultivo, es por esto que cobra importancia el estudio de los mecanismos moleculares (especialmente genes de resistencia) que explican la inmunidad en las variedades resistentes para introducirlos mediante estrategias de mejoramiento convencional o biotecnológico a las variedades susceptibles cultivadas.

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genome sequence of cassava is currently available, which contains around 30,000 genes that codify for proteins and almost 3,500 alternative transcripts (9). The availability of this information creates a need to develop simple and efficient strategies that allow functional validation of genes. Usually, stable genetic transformation assays have been used to express or silence genes in order to evaluate their function (10, 11). However, for the majority of plants these approximations take time and are costly, even more so for a tetraploid species with high heterozygosity and a long lifecycle, such as cassava (5). Additionally, characterizing genes using the generation of transgenic plants requires using several lines due to differences in the levels of expression between individuals and the localization of the transgene in the genome (12). Transient expression mediated by Agrobacterium tumefaciens emerged as an alternative and quick approximation for gene characterization (13). This approximation, as well as stable transformation, is based on the use of the tumorogenic bacteria A. tumefaciens (14), which has been previously transformed with a plasmid that contains the gene of interest. Studies of the gene that codify for the β-glucuronidase enzyme (GUS) have shown that when plants are stably transformed with the gene, healthy and fertile plants are produced. The β-glucuronidase enzyme from Escherichia coli, incubated with a colorless or non-fluorescent substrate, is capable of transforming it so that it is easily visible. The commonly used substrate is X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide). This, together with the fact that the protein is highly stable in the cytoplasm of vegetable cells, makes it into an excellent reporter on gene expression in plants (15). This approximation has been widely exploited in species such as Nicotiana benthamiana, N. tabacum and Arabidopsis thaliana, the first of these being a model for the study of transient expression due to easy leaf infiltration and high levels of expression over 48 hours. Additionally, this technique has been adopted in other species of agronomic and commercial interest such as beans, lettuce, pepper, and flax (10, 16). Transient expression in leaves by infiltration of Agrobacterium tumefaciens (also known as agroinfiltration) is routinely used in several areas of investigation in molecular biology, not only to express external genes or gene silencing (11) but also to evaluate possible promoter sequences and to detect protein interactions (13). In the field of molecular plant-microbe interactions this approximation is especially used to characterize resistance genes (13, 16, 17). In cassava, in spite of

Recientes avances en el desarrollo de nuevas tecnologías en el área de la biología molecular ha generado una drástica disminución en los costos de secuenciación de genomas completos (7). Desde la liberación del genoma de Arabidopsis en el año 2000 (8), se ha hecho disponible al público las secuencias de genomas completos de muchas especies vegetales. Actualmente se encuentra disponible la secuencia del genoma completo de yuca, el cual contiene alrededor de 30.000 genes que codifican para proteínas y casi 3.500 transcritos alternativos (9). La disponibilidad de esta información hace necesario el desarrollo de estrategias simples y eficientes que permitan la validación funcional de genes. Usualmente, ensayos de transformación genética estable han sido empleados para sobre-expresar o silenciar genes, con la finalidad de evaluar la funcion de los mismos (10, 11). Sin embargo, para la mayoría de plantas estas aproximaciones consumen tiempo y son costosas, más aún para una especie tetraploide, con alta heterocigocidad y con un largo ciclo de vida, como la yuca (5). Adicionalmente, la caracterización de genes utilizando la generación de plantas transgénicas requiere la utilización de varias líneas debido a las diferencias en los niveles la expresión entre individuos y a la localización del transgen en el genoma (12). La expresión transitoria mediada por Agrobacterium tumefaciens ha surgido como una aproximación alternativa y rápida para la caracterización génica (13). Esta aproximación, al igual que para transformación estable, se basa en el uso de la bacteria tumorogénica A. tumefaciens (14), la cual ha sido previamente transformada con un plásmido que contiene el gen de interés. Estudios del gen que codifica para la enzima β-glucuronidasa (GUS) han mostrado que cuando plantas son transformadas establemente con el gen, éstas producen individuos saludables y fértiles. La enzima β-glucuronidasa proveniente de Escherichia coli cuando se incuba con un sustrato incoloro o no fluorescente es capaz de transformarlo para que sea visible facilmente. El sustrato mas empleado es el X-gluc (5-bromo4-chloro-3-indolyl glucuronido). Esto, junto con el hecho de que la proteína es altamente estable en el citoplasma de la célula vegetal, convierte a este gen en un excelente reportero de la expresión de genes en plantas (15). Esta aproximación ha sido ampliamente explotada en especies como Nicotiana benthamiana, N. tabacum y Arabidopsis thaliana, siendo la primera de éstas un modelo para el estudio de expresión transitoria debido a la facilidad de infiltración de las hojas y a los altos niveles de

Díaz - Transient GUS gene expression in cassava Manihot esculenta Crantz the importance of transient gene expression, there are few reports on the use of this approximation, and none of them by means of leaf agroinfiltration. The objective of this study was to transiently express GUS gene from Escherichia coli in cassava leaves by infiltration with Agrobacterium tumefaciens in order to generate a quick methodological approximation for the functional analysis of cassava genes.

MATERIALS AND METHODS A g r o b a c te r i u m tu m e f a c i e n s s t rai n s . Electrocompetent cells of GV3101 and AGL1 strains of A. tumefaciens were prepared. Bacteria were grown in a YEPA medium (yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L, glucose 20 g/L, agar-agar 15 g/L), with their respective antibiotics (Table 1). A colony was taken to inoculate 2mL of YEP medium (yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L, glucose 20 g/L). From this preculture 400 μL were taken and 300 mL were inoculated in YEP medium and incubated at 28°C to 250 rpm in darkness until the culture reached DO600nm = 0.75 – 0.95. Washing steps were done using sterile 10% glycerol and bacteria were centrifuged at 3000g during 10 min at 4ºC. Bacteria was resuspended in sterile 1M sorbitol and stored at -80°C. The strains were transformed by electroporation with pCambia1305.2 plasmid (Canberra, Australia), which contains the GUSPlus gene in the T-DNA interrupted by a catalase intron with the objective of evaluating the gene expression produced by the plant. The selection was performed in LB medium (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, Sodium chloride 5 g/L), agar 15 g/L using antibiotics for each strain and kanamycin (50 μg/mL) for the plasmid selection. The colonies were picked and the presence of the GUSPlus gene was directly evaluated using PCR (Polymerase Chain Reaction). All PCR reactions were done in a final volume of 10 μL : 1x of DreamTaqTM Buffer (ThermoScientific, Waltham, MA, USA), 0.2 μM of GUSPlusFw primer (5´-CTC TTG CCA TCC TTG TCC TC-3´), 0.2 μM of GUSPlusRv primer (5´-AGC CGA AAT CTG GAA TGT TG-3´), 0.1 mM dNTPs (each), 0.25 U of DreamTaqTM DNA polymerase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). An initial denaturation at 95°C was done for 5 min, followed by 35 cycles of amplification (denaturation at 95°C for 30 sec, Table 1. Strains of A. tumefaciens used in this study. Strain

Gene marker

Plasmid Ti

GV3101

Rif

pMP90 (pTiC58DT-DNA)

AGL1

Carb

pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)

a The antibiotic rifampicin (100 μg/mL) was used as gene marker of the chromosome for GV3101, and Carbenicillin (100 μg/mL) for AGL1.

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expresión después de 48 horas. Adicionalmente, esta técnica ha sido adoptada en otras especies de interés agronómico y comercial como fríjol, tomate, lechuga, pimentón y lino (10, 16). La expresión transitoria en hojas por la infiltración de Agrobacterium tumefaciens (también llamada agroinfiltración) se emplea rutinariamente en varias áreas de investigación en biología molecular, no sólo para la expresión de genes externos o silenciamiento génico (11) sino también para la evaluación de posibles secuencias promotoras y para detectar interacciones proteicas (13). En el campo de la fitopatología molecular, esta aproximación se usa especialmente para la caracterización de genes de resistencia (13, 16, 17). En yuca, a pesar de la importancia de la expresión transitoria de genes, existen pocos reportes del uso de esta aproximación, ninguno de ellos por medio de agroinfiltración en hojas. Es por eso que en este trabajo se evaluó la expresión transitoria del gen GUS proveniente de Escherichia coli en hojas de yuca por medio de infiltración con Agrobacterium tumefaciens, con el fin de generar una aproximación metodológica rápida para el análisis funcional de genes en yuca.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas de Agrobacterium tumefaciens. Se prepararon células electrocompetentes de las cepas GV3101 y AGL1 de A. tumefaciens. Para esto se crecieron las bacterias en medio YEPA (extracto de levadura 10 g/L, peptona 10 g/L, glucosa 20 g/L, agar-agar 15 g/L), con sus respectivos antibióticos (Tabla 1). Se tomó una colonia y se realizó un precultivo en 2mL de medio YEP (extracto de levadura 10 g/L, peptona 10 g/L, glucosa 20 g/L). De este precultivo se tomaron 400 μL y se inocularon 300 mL de medio YEP y se incubó a 28°C a 250 RPM en oscuridad hasta que el cultivó alcanzó una DO600nm = 0.75 - 0.95. Los lavados se realizaron utilizando glicerol estéril al 10% (v/v) y las bacterias se centrifugaron a 3000g durante 10min a 4ºC. Las bacterias se resuspendieron en sorbitol 1M estéril y se almacenaron a -80°C. Las cepas fueron electroporadas con el plásmido pCambia1305.2 (Canberra, Australia), el cual contiene el gen GUSPlus en el T-DNA interrumpido por un intrón de catalasa, con el objeto de evaluar la expresión del gen producido por la planta. La selección se realizó en medio LB (triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, agar 15 g/L) utilizando los antibióticos para cada cepa y kanamicina (50 μg/mL) para la

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annealing at 53°C for 30 sec, extension at 72°C for 2 min), a final extension at 72°C for 10 min and a final incubation at 20°C for 10 min. In each case a sample without DNA was included as a negative control and pCAMBIA1305.2 plasmid DNA as a positive control. Vegetal material and growth conditions. In vitro plants and one month old plants propagated from woody cuttings were used. The woody cuttings were obtained from stems of adult plants from La Vega, Cundinamarca, Colombia. All plants were grown in a greenhouse on the property of the Universidad Nacional de Colombia in Bogotá. The greenhouse temperature varied between 28 and 35°C during the day and between 22 and 27°C at night. Humidity was kept at 70% and a 12 h light/ 12 h darkness photoperiod was maintained. The plants were kept in trays with water to provide a continuous supply of moisture. The in vitro plants were obtained from a germplasm collection at the Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), under a material transfer agreement (MTA). They were transferred to soil and kept in the greenhouse under the previously mentioned conditions for adult plants. The 60444, CM6438-14 and MCOL2215 varieties were used. The 60444 variety has proved to be more efficient in genetic transformation in cassava (18) and is used as a model in transformation studies (19, 20). The MCOL2215 and CM643814 varieties are commercial ones that are widely cultivated on the Caribbean coast and the plains (Los Llanos) of Colombia (21). Leaf agroinfiltration. An isolated colony was taken from a fresh culture for each one of the strains used (GV3101 and AGL1). It was inoculated using LB with the respective antibiotics and it was incubated at 28°C at 250 rpm in darkness until it reached DO600nm = 0.8 - 1.0. The culture centrifuged at 3000 rpm for 10 min, the supernatant was removed and it was washed using an infiltration solution of 0.5X (MES 5 mM, MgCl2 5 mM, acetosyringone 75 μM, pH 5.6). The culture was again centrifuged and was resuspended in an agroinfiltration solution 1X (MES 10 mM, MgCl2 10 mM, acetosyringone 150 μM, pH 5.6). For each culture DO600nm = 0.3 and 0.03 (depending on the experiment) was adjusted and it incubated at room temperature (20°C) for 4 hours (13). For agroinfiltration assays young, green leaves were selected. The leaves were kept on the plant during and after agroinfiltration, and were removed just before staining to visualize the β-glucuronidase (GUS) enzyme activity. Before infiltration a small puncture was performed with a needle close to

selección del plásmido. Se realizó un repique de las colonias y se evaluó directamente la presencia del gen GUSPlus mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). Todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 10 μL: 1x de DreamTaqTM Tampón (ThermoScientific, Waltham, MA, USA), 0.2 μM de primer GUSPlusFw (5´-CTC TTG CCA TCC TTG TCC TC-3´), 0.2 μM de primer GUSPlusRv (5´-AGC CGA AAT CTG GAA TGT TG-3´), 0.1 mM dNTPs (cada uno), 0.25 U de DreamTaqTM DNA polymerase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Se realizó una denaturación inicial a 95°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de amplificación (denaturación a 95°C durante 30 seg, anillamiento a 53°C durante 30 seg, extensión a 72°C durante 2 min), una extensión final a 72°C durante 10 min y una incubación final a 20°C durante 10 min. En todos los casos se incluyó como control negativo una muestra sin ADN y como control positivo el ADN plasmídico de pCAMBIA1305.2. Material vegetal y condiciones de crecimiento. Se utilizaron plantas “in Vitro” y plantas de 1 mes propagadas a partir estacas leñosas. Las estacas leñosas fueron obtenidas a partir de tallos de plantas adultas crecidas en La Vega, Cundinamarca. Todos los cultivares fueron crecidos en un invernadero en las instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. La temperatura del invernadero durante el día osciló entre 28-35°C y durante la noche entre 22-27°C. La humedad se mantuvo alrededor de 70% y se mantuvo un fotoperíodo de 12 h luz/ 12h oscuridad. Las plantas se mantuvieron sobre bandejas con agua para permitir la continua disponibilidad de humedad. Las plantas “in Vitro” fueron obtenidas de la colección de germoplasma del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), previo un acuerdo de transferencia de material (ATM). Se transfirieron a suelo y se mantuvieron en el invernadero bajo las condiciones mencionadas anteriormente para las plantas adultas. Se emplearon las variedades 60444, CM643814 y MCOL2215. La variedad 60444 es la que ha presentado mayores eficiencias en transformación genética en yuca (18) y se emplea como modelo en estudios de transformación (19, 20). Las variedades MCOL2215 y CM6438-14 son variedades comerciales ampliamente cultivadas en la Costa Caribe y en los Llanos de Colombiana (21). Agroinfiltración de la hoja. Se tomó una colonia aislada de un cultivo fresco para cada una de las cepas empleadas (GV3101 y AGL1). Se inoculó medio LB con los respectivos antibióticos

Díaz - Transient GUS gene expression in cassava Manihot esculenta Crantz the central nerve on the underside of the leaf. The infiltration was performed using a 1 mL syringe without a needle, allowing the solution to enter through the opening made with the needle (13). Infiltrations were done at room temperature (20ºC) and the plants were kept in these conditions until the GUS staining was performed. GUS staining. After three days of post-infiltration (DPI) the leaves were separated from the plant and submerged in 50 mL polypropylene tubes with a X-Gluc buffer (NaH2PO4 0.02 M, Na2HPO4 0.03 M, K3FeCN6 0.25 mM, K4FeCN6 0.25 mM, triton X-100 0.5 % (v/v), DMSO 10 % (p/v) and X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide) 1 mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA). In the last assays the tubes were placed in an empty chamber during 15-30 min (depending on the test) at a pressure of 20 mmHg and were incubated at 37ºC for 16 h without agitation (22). In vitro cassava plants that constitutively express the GUSPlus gene were used as a positive control (22), and plants infiltrated with the infiltration solution as a negative control.

RESULTS Use of the GV3101 strain for agroinfiltration assays in cassava plants. As a preliminary assay it was decided to evaluate in first instance transient expression only in the GV3101 strain, widely used in transient expression assays in Nicotiana benthamiana (10, 13, 23). For this, A. tumefaciens GV3101::pMP90 was transformed with the pCAMBIA1305.2 plasmid for evaluation of cassava. This strain was infiltrated in cassava leaves of the MCOL2215 and 60444 varieties, and after 3 DPI the activity of the GUS enzyme was determined by means of staining with an X-gluc buffer. As seen in Table 2, no expression of the GUSPlus gene in either of the two varieties was observed. No coloring in the in vitro plants was observed, or in the adult plants obtained from cuttings (Table 2). However, an intense blue coloring was observed in transgenic plants that express the GUSPlus gene constitutively under the CP2 promoter (22), which were used as a positive control in the GUS staining. All of these experiments were repeated twice with similar results. Transient expression of the GUSPlus gene in the leaves of in vitro cassava plants using the aggressive A. tumefaciens AGL1 strain. Although the GV3101 strain is frequently used in transient expression assays in a wide variety of vegetal species, the hypervirulent AGL1 strain was evaluated, which is used for the stable transformation of friable embryogenic callus (FEC)

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y se incubó a 28°C a 250 rpm en oscuridad hasta que alcanzó una DO600nm = 0.8 - 1.0 El cultivo se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min, se descartó el sobrenadante y se realizó un lavado utilizando solución de infiltración 0.5X (MES 5 mM, MgCl2 5 mM, acetosiringona 75 μM, pH 5.6). Se centrifugó nuevamente el cultivo y se resuspendió en solución de agroinfiltración 1X (MES 10 mM, MgCl2 10 mM, acetosiringona 150 μM, pH 5.6). Para cada cultivo se ajustó la DO600nm = 0.3 y 0.03 (dependiendo del experimento) y se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas (13). Para los ensayos de agroinfiltración se seleccionaron hojas jóvenes y verdes. Las hojas se mantuvieron en la planta durante y después de la agroinfiltración, se eliminaron justo antes de realizar la tinción para visualizar la actividad de la enzima β-glucuronidasa (GUS). Previo a la infiltración se realizó una pequeña punción con una aguja cerca al nervio central por el envés de la hoja. La infiltración se realizó usando una jeringa de 1 mL sin aguja permitiendo la entrada de la solución por la abertura realizada con la aguja (13). Las infiltraciones se realizaron a temperatura ambiente (20ºC) y las plantas se mantuvieron en estas condiciones hasta la realización de la tinción GUS. Tinción GUS. Después de 3 días post-infiltración (DPI) se separaron las hojas de la planta y se sumergieron en tubos de polipropileno de 50 mL con tampón X-Gluc (NaH2PO4 0.02 M, Na2HPO4 0.03 M, K3FeCN6 0.25 mM, K4FeCN6 0.25 mM, tritón X-100 0.5 % (v/v), DMSO 10 % (p/v) y X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronido) 1 mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA). En los últimos ensayos se colocaron los tubos en una cámara de vacío durante 15 y 30 min (dependiendo del ensayo) a una presión de 20 mmHg y se incubaron a 37ºC durante 16 h sin agitación (tomado de (22)). Como control positivo se emplearon plantas de yuca “in Vitro” que expresan constitutivamente el gen GUSPlus (22) y como control negativo plantas infiltradas con la solución de infiltración.

RESULTADOS Uso de la cepa GV3101 para ensayos de agronfiltración en hojas de yuca. Como ensayo preliminar se decidió evaluar en primera instancia la expresión transitoria solamente con la cepa GV3101, ampliamente utilizada en ensayos de expresión transitoria en Nicotiana benthamiana (10, 13, 23). Para esto, se

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Table 2. Transient expression assay of the GUSPlus gene in cassava leaves using GV3101 strain of Agrobacterium tumefaciens containing the pCAMBIA1305.2 plasmid. Genotype

Material

60444

in Vitro

0.03

60444

in Vitro

0.3

60444

Greenhouse

0.03

60444

Greenhouse

0.3

MCOL2215

in Vitro

0.03

MCOL2215

in Vitro

0.3

MCOL2215

Greenhouse

0.03

MCOL2215

Greenhouse

0.3

600nm

GUS strain

60444 (Cp2::GUSPlus)a in Vitro NA + a Transgenic plants that express the GUSPlus gene under the CP2 promoter (22). NA, not applicable.

in cassava (22). To do this, in virtro plant leaves of the MCOL2215 variety were infiltrated with the AGL1 strain containing the pCAMBIA1305.2 plasmid, and after 3 DPI the activity of the GUS enzyme was determined by X-Gluc staining. In figure 1 blue-stained regions are observed at the infiltration site, which indicates biochemical activity of the GUS enzyme and therefore a transient expression of the GUSPlus gene. Additionally, the intensity of the stained region is directly related to the OD of the bacteria culture used in the infiltration (Figure 1). This same assay was done in in vitro plant leaves of the 60444 variety with similar results (data not shown). However, in spite of having used

Figure 1. Transient expression of the GUS gene in in vitro cassava leaves (MCOL2215 variety) using the AGL1 strain containing pCAMBIA1305.2 plasmid. Infiltration of the solution without A. tumefaciens (negative control) (a), infiltration of the AGL1 strain containing pCAMBIA1305.2 plasmid to a DO600= 0.03 (b) o DO600= 0.003 (c).

transformó A. tumefaciens GV3101::pMP90 con el plásmido pCAMBIA1305.2 para la evaluación en yuca. Se infiltró esta cepa en hojas de yuca de las variedades MCOL2215 y 60444, y después de 3 DPI se determinó la actividad de la enzima GUS mediante la tinción con el tampón X-gluc. Como se observa en la tabla 2, no se observó expresión del gen GUSPlus en ninguna de las dos variedades empleadas. Tampoco se observó ninguna coloración en plantas “in Vitro” ni en plantas adultas obtenidas a partir de estacas (Tabla 2). Sin embargo, sí se observó coloración azul intensa en las plantas transgénicas que expresan el gen GUSPlus constitutivamente bajo el promotor CP2 (22), las cuales fueron empleadas como control positivo de la tinción GUS. Todos estos experimentos se repitieron dos veces con resultados similares. Expresión transitoria del gen GUSPlus en hojas de yuca de plantas in Vitro usando la cepa agresiva de A. tumefaciens AGL1. Aunque la cepa GV3101 es frecuentemente empleada en ensayos de expresión transitoria en una amplia gama de especies vegetales, se decidió evaluar la cepa hipervirulenta AGL1, la cual es utilizada para la transformación estable de callo embriogénico friable (CEF) en yuca (22). Para esto, se infiltraron hojas de plantas “in Vitro” de la variedad MCOL2215, con la cepa AGL1 conteniendo el plásmido pCAMBIA1305.2, y después de 3 DPI se determinó la actividad de la enzima GUS mediante la tinción con X-Gluc. En la figura 1 se observan regiones que presentan una coloración azul en el sitio de la infiltración, lo que indica actividad bioquímica de la enzima GUS y por lo tanto expresión transitoria del gen GUSPlus. Adicionalmente, se observa que la intensidad de la coloración está directamente relacionada con la DO del cultivo bacteriano empleado en la infiltración (Figura 1). Este mismo ensayo se realizó en hojas de plantas “in Vitro” de la variedad 60444 obteniéndose resultados similares (datos no mostrados). Sin embargo, a pesar de haber empleado las mismas condiciones de infiltración con Agrobacterium, en plantas adultas obtenidas a partir de estacas no se obtuvo coloración azul para ninguna de las dos variedades de yuca empleadas (datos no mostrados). Infiltración del tampón X-gluc con vacío en hojas de estacas. Mientras que las hojas de yuca de las plantas “in Vitro” son delgadas y de consistencia membranosa, las hojas de yuca de plantas provenientes de estacas presentan un mayor grosor y una consistencia ligeramente coriácea, además de la producción de exudado de látex blanco. Estas características de las hojas de plantas provenientes de estacas generan una

Díaz - Transient GUS gene expression in cassava Manihot esculenta Crantz the same infiltration conditions with Agrobacterium, blue staining was not obtained in adult plants from cuttings for either of the two varieties of cassava used (data not shown). Infiltration of the X-gluc buffer in vacuum in leaves from cuttings. While cassava leaves from in vitro plants are thin and membranous, cassava leaves from plants from cuttings are thicker and have a slightly leathery consistency, and produce a white latex exudate. These characteristics of the leaves of plants from cuttings generate greater resistance to liquid penetration to the tissues. The X-Gluc buffer’s inaccessibility in the infiltrated tissue could explain the negative results in detecting GUS enzyme activity when performing the infiltration of leaves from cuttings. In order to efficiently detect GUS enzyme activity, the vacuum effect on the X-Gluc buffer entering the infiltrated tissue was evaluated. The leaves of adult plants were subject to a vacuum chamber for 15 min with the purpose of promoting the entrance of the X-Gluc buffer into

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mayor resistencia a la entrada de líquidos a los tejidos. La inaccesibilidad del tampón X-Gluc al tejido infiltrado, podría explicar los resultados negativos en la detección de la actividad de la enzima GUS al realizar la infiltración en hojas de estacas. Con miras a detectar eficientemente la actividad de la enzima GUS, se evaluó el efecto del vacío sobre la entrada del tampón X-Gluc al tejido infiltrado. Las hojas de plantas adultas fueron sometidas a una cámara de vacío durante 15 min con el fin de promover la entrada del tampón X-Gluc al tejido. En la figura 2 se puede observar la región infiltrada ocupada de puntos azules, lo cual demuestra la actividad bioquímica de la enzima GUS y por lo tanto la expresión transitoria del gen GUSPlus en hojas provenientes de plantas de estaca de la variedad comercial CM6438-14. Con el propósito de obtener mayores niveles de expresión transitoria en hojas adultas provenientes de plantas de estaca, se aumentó la incubación en la cámara de vacío a 30 minutos con una presión de -20mmHg. En la figura 3 se observa una coloración azul intensa que abarca toda la región infiltrada, correspondiente a la expresión transitoria del gen GUSPlus en hojas de plantas de estaca de la variedad comercial CM6438-14.

DISCUSIÓN La expresión transitoria mediante infiltración en hojas mediante Agrobacterium tumefaciens es una herramienta ampliamente utilizada en diversos campos dentro de la biología molecular de plantas (10, 11, 13-17).

Figure 2. Transient expression of the GUS gene by leaf agroinfiltration of an adult plant of the CM6438-14 variety. The AGL1 strain containing pCAMBIA1305.2 plasmid at DO600= 0.03 (a) was infiltrated, agroinfiltration solution was used as a negative control (b). The image below shows an increase in the a region.

En yuca, se ha logrado estandarizar protocolos de transformación genética estable usando callo embriogénico friable (CEF) a partir del cultivar modelo cv. 60444 (18-20). Esto ha permitido la introducción de características de interés agronómico, la cuales por mejoramiento genético tradicional podrían haber tomado mucho más tiempo. Considerando el largo ciclo de vida de la yuca se ha establecido que la generación de variedades mejoradas puede tardar entre 4 a 7 años (4, 18, 20). Sin embargo, en yuca el proceso desde la producción de CEF hasta la obtención de plantas transgénicas puede tardar entre 1216 meses (18, 19). Por lo tanto, la posibilidad de evaluar de forma rápida y eficiente genes candidatos a ser transformados establemente, mediante expresión transitoria en hojas de yuca, podría constituirse una herramienta útil previa a la transformación genética estable. Esto ayudaría a disminuir costos y tiempo en la transformación estable de genes que puedan

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the tissue. In figure 2 the infiltrated region has blue spots, which demonstrates the biochemical activity of the GUS enzyme and therefore the transient expression of the GUSPlus gene in leaves from cuttings of the CM6438-14 commercial variety. In order to obtain greater levels of transient expression in adult leaves from cuttings, incubation in the vacuum chamber was increased to 30 minutes with -20mmHg pressure. In figure 3 an intense blue stained region was observed taking up the whole infiltrated region, corresponding to the transient expression of the GUSPlus gene in leaves of cuttings from the CM6438-14 commercial variety.

DISCUSSION Transient expression by means of Agrobacterium tumefaciens leaf infiltration is a widely used tool in several fields of plant molecular biology (10, 11, 13-17). In cassava, protocols of stable genetic transformation have been standardized using friable embryogenic callus (FEC) from model cultivar cv. 60444 (18-20). This has allowed the introduction of characteristics of agronomic interest, which by traditional breeding may have taken much longer. Considering the long lifecycle of cassava, it has been established that generation of improved varieties can take between 4 to 7 years (4,18,20). However, in cassava production process from FEC to the generation of transgenic plants can take between 12 to 16 months (18,19). Therefore, the possibility of quickly and efficiently evaluating gene candidates to be stably transformed by means of transient expression in cassava leaves could become a useful tool previous to stable genetic transformation. This will help diminish costs and time in the stable transformation of genes that can cause adverse effects in the plants. For example, the introduction of toxicity genes will not allow plants to be regenerated. Also, the introduction of resistance genes whose constitutive expression would cause cellular death (one of the principal plant response mechanisms to pathogens) will not allow plant regeneration. On the contrary, transient expression of putative R genes in leaves followed by later inoculation with a pathogen will allow a quick validation of their role in resistance. In this study, transient expression of the GUSPlus gene was evaluated in cassava leaves by A. tumefaciens infiltration. Although activity of the GUSPlus gene was not detected in leaves of the MCOL2215 variety and cv. 60444 when using the GV3101 strain, the possibility that this strain could also be able to promote transient expression in cassava is not dismissed, though with less efficiency

Figure 3. Transient expression of the GUSPlus gene by means of leaf agroinfiltration from a plant cutting of the commercial variety CM6438-14. The AGL1 strain containing pCAMBIA1305.2 plasmid at DO600= 0.3 (a) was infiltrated, agroinfiltration solution was used as a negative control (b).

causar efectos adversos en la planta. Por ejemplo la introducción de genes de toxicidad no permitiría regenerar plantas. Así también la introducción de genes de resistencia cuya expresión constitutiva provocaría una muerte celular (uno de los principales mecanismos de respuestas de las plantas a los patógenos) tampoco permitiría la regeneración de plantas. Por el contrario la expresión transitoria de genes R putativos, seguido de la posterior inoculación con un patógeno permitiría una rápida validación de su función en resistencia. En este trabajo se evaluó la expresión transitoria del gen GUSPlus en hojas de yuca por infiltración de A. tumefaciens. Aunque no se detectó actividad del gen GUSPlus en hojas de la variedad MCOL2215 y cv. 60444 al emplear la cepa GV3101, no se descarta la posibilidad de que esta cepa también pueda ser capaz de promover la expresión transitoria en yuca, pero con menor eficiencia comparada con la cepa hipervirulenta AGL1. Se ha encontrado que la eficiencia de la expresión transitoria por agroinfiltración es altamente dependiente de la cepa de A. tumefaciens y del genotipo de la planta (10, 13). Es posible que genotipos

Díaz - Transient GUS gene expression in cassava Manihot esculenta Crantz compared to the hypervirulent AGL1 strain. It has been found that the efficiency of transient expression by agroinfiltration is highly dependent on the strain of A. tumefaciens and the genotype of the plant (10, 13). It is possible that particular genotypes (varieties) of plants are capable of specifically recognizing certain types of strains and cause resistance; avoiding the introduction of T-DNA of A. tumefaciens, which would be reflected in low efficiencies in the transient expression genes of reporter genes or of interest. Preliminary data in our investigation group showed that in cassava greater levels of expression of the GUSPlus gene are obtained when the AGL1 strain is used, compared with LBA4404 and GV3101 strains (data not published). This could suggest that varieties of cassava are more sensitive to this type of strain. These results additionally show consistency and structure of the leaves dependence for the detection of transient expression of the GUSPlus gene. In vitro plants leaves are thinner with a membranous consistency, rendering them adequate for agroinfiltration assays in cassava. On the other hand, plants from cuttings have thicker leaves with a slightly leathery consistency, which combined with the production of a latex exudate, restrict the entrance of aqueous solutions to the interior of the leaf. However, as observed in figures 2 and 3, this limitation is overcome by the use of the vacuum chamber which decreases pressure temporarily. The above, followed by the re-establisement of atmospheric pressure leads to the entrance of the solution to the interior of the tissue. Optimization in assays of transient expression by A. tumefaciens diminishing pressure by using vacuum chambers has already been previously reported for several plant species (10, 24). In summary, these results suggest the use of the hypervirulent AGL1 strain and in vitro plants to perform transient expression assays by means of agroinfiltration in cassava leaves. Acknowledgments Paul Chavarriaga and members of the Manihot Biotec investigation group for scientific advice in the development of assays and the enriching discussions. To the Universidad Nacional de Colombia, Vicerrectoría Académica, PDT is beneficiary of the BESP scholarship. Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest

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particulares (variedades) de plantas sean capaces de reconocer de manera específica cierto tipo de cepas y desencadenen una resistencia; evitando de esta manera la introducción del T-ADN de A. tumefaciens, lo cual se reflejaría en bajas eficiencias en la expresión transitoria de los genes reporteros o de interés. Datos preliminares en nuestro grupo de investigación muestran que en yuca, se obtienen mayores niveles de expresión del gen GUSPlus cuando se emplea la cepa AGL1, comparados con la utilización de las cepas LBA4404 y GV3101 (datos no publicados). Esto podría sugerir que las variedades de yuca son más sensibles a este tipo de cepa. Los resultados demuestran adicionalmente una dependencia de la consistencia y estructura de las hojas en la detección de expresión transitoria del gen GUSPlus. Las plantas in Vitro al presentar hojas con una consistencia membranosa y un menor grosor, son más adecuadas para los ensayos de agroinfiltración en yuca. Por otro lado, las plantas de estacas presentan hojas más gruesas y con una consistencia ligeramente coriácea, lo cual junto con la producción de un exudado de látex, restringe la entrada de soluciones acuosas al interior de las hojas. Sin embargo, como se observa en las figuras 2 y 3, esta limitación es superada por el uso de una cámara de vacío la cual genera una momentánea disminución de la presión. Lo anterior, seguido de la recuperación de la presión atmosférica es lo que permite la entrada de la solución al interior del tejido. La optimización en ensayos de expresión transitoria mediada por A. tumefaciens disminuyendo la presión mediante el uso de cámara de vacío ya ha sido reportada anteriormente para diversas especies vegetales (10, 24). En síntesis estos resultados sugieren el uso de la cepa hipervirulenta AGL1 y plantas “in Vitro” para realizar ensayos expresión transitoria mediante agroinfiltración en hojas de yuca. Agradecimientos Paul Chavarriaga y miembros de grupo de investigación Manihot Biotec por la asesoría científica en el desarrollo de los ensayos y a las discusiones enriquecedoras. A la Universidad Nacional de Colombia, Vicerrectoría Académica, PDT es beneficiaria de la beca BESP. Conflicto de intereses Los autores declaran que no existe conflicto de intereses

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Rev.MVZ Córdoba 19(3):4350-4357, 2014. ISSN: 0122-0268 CLINICAL CASE

Diagnosis of contagious ecthyma in goats in a quarantine station in Panama Diagnóstico de ectima contagioso en caprinos dentro de una estación de cuarentena en Panamá Angie Magaña Ch,1* MMVZ, Nathaniel Kadoch Z,2 M.Sc, Anarvik Sánchez P,3 M.Sc, César Maure M,2 MV, Rolando Tello J,2 M.Sc. Ministry of Agricultural Development, National Directorate of Animal Health, Laboratory of Diagnosis and Veterinary Research Dr. Gerardino Medina H., Río Tapia, Tocumen, Edificio LADIV, Panamá, Panamá. 2Ministry of Agricultural Development, Executive Management of Agricultural Quarantine, Altos de Curundu, Calle River, Building 577, Panamá, Panamá. 3Ministry of Agricultural Development, Laboratory of Vesicular Disease Diagnosis, Río Tapia, Tocumen, LADIVES Building, Panamá, Panamá. *Correspondence: patovetpanama@gmail.com 1

Received: September 2013; Accepted: April 2014.

ABSTRACT We report an outbreak of contagious ecthyma (CE) in a herd of goats at Paso Canoas quarantine station, Panama. The goats were adult intact females. Visible clinical signs became apparent from day 13 after the start of quarantine. We performed clinical examination. Serum biopsy and scabs were collected from crusted lesions in the epithelium of the lips, nose and eyelid corners. Samples were studied by histopathology,complement fixation test, transmission electron microscopy (TEM), DAS-ELISA, viral isolationand nucleic acid amplification tests. Histopathology revealed ortho and parakeratotic hyperkeratosis, epithelial hyperplasia, viral inclusion bodies, keratinocytes with balonoid degeneration, vesicles with neutrophils and degenerated cells, in superficial dermis there is marked neovascularization. Complement fixation test, DAS-ELISA and nucleic acid amplification tests resulted positive for contagious ecthyma. TEM showed viral particles, consistent with Parapoxvirus. Clinical and laboratory findings were consistent with poxvirus infection in the quarantine goat herd. Key words: Disease prevention, goats, orf virus, parapoxvirus (Source: MeSH MEDLINE).

RESUMEN El presente reporte describe un brote de ectima contagioso (EC) en un rebaño de cabras. Este caso tuvo lugar en la estación cuarentenaria de Paso Canoas, Panamá. Las cabras eran hembras, adultas, enteras y los signos clínicos fueron observados 13 días después de dar inicio al período de cuarentena. Se practicó el examen clínico, se colectaron fragmentos de costras y suero, además se realizaron biopsias de lesiones costrosas en el epitelio de los labios, nariz y comisuras palpebrales. Las muestras fueron analizadas por histopatología, prueba de fijación de complemento, microscopía electrónica de transmisión (MET), DAS-ELISA, aislamiento viral y amplificación de ácidos nucleicos. La histopatología reveló hiperqueratosis orto y paraqueratósica, hiperplasia epitelial, cuerpos de inclusión viral, eosinofílicos intracitoplasmáticos, degeneración balonoide de los queratinocitos, así como vesículas que contenían neutrófilos y células degeneradas; además, en la dermis superficial se observó una marcada 4350

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neovascularización y edema. Las pruebas de fijación de complemento, DAS-ELISA y amplificación de ácidos nucléicos resultaron positivas para EC. El resultado de MET reveló partículas virales consistentes con Parapoxvirus. Los hallazgos clínicos y los resultados de laboratorio confirmaron el brote infeccioso de Parapoxvirus, agente etiológico de EC, en el hato en cuarentena. Palabras clave: Cabras, orfvirus, parapoxvirus, prevención de enfermedades (Fuente: MeSH MEDLINE).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Contagious Ecthyma (CE) is an acute viral disease, with a benign, self-limiting course, affecting epithelia. It is not systemic, is important in public health, and is also related to high economic losses (1-3). This disease has not been reported in the Republic of Panama or in any of the groups of animals previously received at the Paso Canoas quarantine station.

Ectima contagioso (EC) es una enfermedad viral, aguda, de curso benigno y autolimitado, que afecta los epitelios, no es sistémica, tiene importancia en la salud pública y además, está relacionada con altas pérdidas económicas (13). Esta enfermedad no ha sido reportada en la Republica de Panamá ni en ninguno de los lotes de animales, recibidos anteriormente en la estación de cuarentena de Paso Canoas.

The CE etiologic agent is a DNA virus, epitheliotropic (2-4,6,7) of the Parapoxvirus genus, Poxviridae family (Orf virus) (1,2,6,7). The Poxvirus is oval and the surrounding area is distinguished by a spiral tubule, characteristic of this family. The dimensions of the Poxvirus range from 220 to 300 nm in length x 140 to 170 nm in width (4). CE affects ruminants, particularly sheep, and less frequently goats, and has been reported in humans (1-8), dogs as well as in several wild species (1.4). The infection in both animals and humans is transmitted by direct contact with the virus from infected animals, fomites, or grass; immunosuppressed animals and those with persistent infection keep the virus in the herd. The incubation period is four to eight days (1). The virus enters the body through broken skin and replicates in the cytoplasm of the host epithelial cell (1-3,6,7). The first cellular changes observed are epithelial hyperplasia, balanoid degeneration of the stratum spinosum cells, hyperplasia of the basal membrane of the epidermis, edema and granulomatous inflammation and in a few days the lesions become pustules (1). The lesions spontaneously disappear over a period that can last up to six weeks (2,4,7-9), but there have been cases of CE that persist for a longer period in goats and sheep (7). In goats, signs of CE are located in the epithelium of the lips, gingiva, tongue, nose, eyelid corners, inter-digital region, nipples, vulva and scrotum (1,4,6,7). The most frequent clinical lesions include: erythematous macules (1,2), papules (1, 2, 7), vesicles (1,2,4,10) and pustules (1,2,4,7,10). These lesions progress to scabs (1,2,7,8,10) and ulcers (7). CE is also known as sore mouth, contagious pustular dermatitis (1,3,8,9), scabby mouth (1,4,9), Orf (35,9) or cutaneous pustular dermatitis (3,4).

El agente etiológico de EC es un virus DNA, epiteliotrópico (2-4,6,7), del género Parapoxvirus, familia Poxviridae (Orf virus) (1,2,6,7). EL Poxvirus es ovalado y rodeando su superficie se distingue un túbulo en espiral característico de esta familia. Las dimensiones del Poxvirus varían desde 220 a 300 nm de longitud x 140 a 170 nm de ancho (4). EC afecta rumiantes, principalmente ovinos y con menor frecuencia caprinos, se ha reportado en seres humanos (1-8), perros, así como en diversas especies silvestres (1,4). La infección tanto en animales como en el ser humano se trasmite por contacto directo con el virus, a partir de animales infectados, fómites, pasto; siendo los animales inmunosuprimidos y aquellos con infección persistente, los que mantienen el virus en el rebaño. El período de incubación es de cuatro a ocho días (1). El virus ingresa al organismo a través de la piel lacerada y se multiplica en el citoplasma de la célula epitelial hospedadora (1-3,6,7). Los primeros cambios celulares que se observan son hiperplasia epitelial, degeneración balonoide de las células del estrato espinoso, hiperplasia de la membrana basal de la epidermis, edema e inflamación granulomatosa y en unos cuantos días las lesiones se convierten en pústulas (1). Las lesiones desaparecen espontáneamente en un período que puede durar hasta seis semanas (2,4,7-9), pero se han reportado casos de EC que persisten por un período mayor en cabras y ovejas (7). En las cabras, los signos de EC se localizan en el epitelio de los labios, gingiva, lengua, nariz, comisuras palpebrales, región interdigital,

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CE morbidity may reach 100% of the animals during an outbreak. However, mortality is low, and is usually linked to the presence of bacterial infections (1, 2, 4, 7-10) and secondary fungal infections (7). Clinical observation of lesions may suggest the presence of CE in the herd. However, the characteristic CE lesions can be similar to those observed in foot and mouth disease, goat pox, vesicular stomatitis, Staphylococcal dermatitis, dermatophilosis, ulcerative dermatosis (1, 7) and blue tongue (7). Definitive diagnosis of CE requires laboratory tests that allow confirmation of the virus (2, 7). This report describes an outbreak of Contagious Ecthyma (CE) in a herd of goats that took place at the Paso Canoas quarantine station in Panama.

CLINICAL CASE In October 2012, an import of 214 intact female goats was received at the Paso Canoas Ministry of Agricultural Development quarantine station, located 200 meters from the border between Panama and Costa Rica. This herd of goats was moved by land and entered Panama through the Paso Canoas border and would fulfill a quarantine period of fifteen days at the quarantine station before being delivered to the owner. Upon arrival, all animals were inspected and a serum sample was collected from each one. Four (1.9%) animals died during the first 24 hours after arrival in Panama. The technical staff at the quarantine station determined that these deaths were associated with bloat. Four (1.9%) animals were serologically positive for Caprine Arthritis Encephalitis (CAE). Additionally, the animals showed some of these conditions or a combination thereof: poor body condition, pregnancy, mucopurulent nasal discharge, frequent coughing and overgrown hooves. Clinical History. After 13 days of quarantine, 11 (5.2%) animals had erythematous lesions and were devoid of hair on the lips, nose and palpebral fissures. At day 18, a total of 105 (50%) animals were affected with lesions similar to those described above. The characteristics of the lesions and the morbidity were suggestive of a viral process. The team considered ruling out the following differential diagnoses: CE, goat pox, foot and mouth disease, vesicular stomatitis, staph dermatitis, dermatophilosis, bluetongue and ulcerative dermatosis. Quarantine facilities were disinfected daily with Virkon S (Antec International Ldt., England) diluted to 100 ppm and insect control was performed with Nuvan EC 1000 (Chemical Formulations SA, Costa Rica) at a dilution of 1.5 ml / L water.

pezones, vulva y escroto (1,4,6,7). Las lesiones clínicas más frecuentes incluyen: máculas eritematosas (1,2), pápulas (1, 2, 7), vesículas (1,2,4,10) y pústulas (1,2,4,7,10). Estas lesiones evolucionan a costras (1,2,7,8,10) y úlceras (7). EC también es conocida como boca dolorosa, dermatitis pustular contagiosa (1,3,8,9), boca costrosa (1,4,9), Orf (3-5,9) o dermatitis pustular cutánea (3,4). La morbilidad de EC puede alcanzar al 100% de los animales durante un brote. Sin embargo, la mortalidad resulta baja, usualmente ligada a la presencia de infecciones bacterianas (1, 2, 4, 7-10) y fúngicas secundarias (7). La observación clínica de las lesiones puede sugerir la presencia de EC en el rebaño. Sin embargo, las lesiones características de EC pueden ser similares a las observadas en fiebre aftosa, viruela caprina, estomatitis vesicular, dermatitis por Estafilococos, dermatofilosis, dermatosis ulcerativa (1, 7) y lengua azul (7). El diagnóstico definitivo de EC requiere de pruebas de laboratorio que permitan la confirmación del virus (2, 7). El presente reporte describe un brote de ectima contagioso (EC) en un rebaño de cabras que tuvo lugar en la estación cuarentenaria de Paso Canoas, Panamá.

CASO CLÍNICO En octubre del 2012, se recibió una importación de 214 cabras hembras, enteras, en la estación cuarentenaria de Paso Canoas del Ministerio de Desarrollo Agropecuario, localizada a 200 metros lineales de la frontera de Panamá con Costa Rica. Este rebaño de cabras fue trasladado por vía terrestre e ingresó a Panamá a través del puesto fronterizo de Paso Canoas y cumpliría un periodo de cuarentena de quince días en la estación cuarentenaria, antes de ser entregados al propietario. A su llegada, todos los animales fueron inspeccionados y de cada uno se colectó una muestra de suero. Cuatro (1.9%) animales murieron durante las primeras 24 horas después de su llegada a Panamá. El personal técnico de la estación cuarentenaria determinó que dichas muertes estaban asociadas a timpanismo. Cuatro (1.9%) animales fueron serológicamente positivas a artritis encefalitis caprina (AEC). Adicionalmente, los animales presentaban algunas de estas condiciones o la combinación de las mismas: mala condición corporal, preñez, secreción nasal mucopurulenta, tos frecuente y pezuñas sobrecrecidas. Historia clínica. Transcurridos 13 días de iniciada la cuarentena, 11 (5.2%) animales presentaron

Magaña - Diagnosis of contagious ecthyma in goats The initial diet was based on concentrate and was replaced with fresh grass to avoid aggravating lesions on the lips.

RESULTS Clinical examination findings. In general, the physiological variables were within the normal range for the species. The animals were maintained a good appetite but with poor body condition, mucopurulent nasal discharge, coughing and overgrown hooves. On the lips, nose and palpebral fissures, shiny and hairless erythematous macules were observed, as well as vesicles and pustules, these lesions bleed easily when touched. At 11 days after the onset of clinical signs, the lesions evolved into scabs, multifocal and coalescing ulcers as a result of the detachment of the crusts (Figure 1).

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lesiones eritematosas y desprovistas de pelo en los labios, nariz y comisuras palpebrales. Al día 18, un total de 105 (50%) animales estaban afectados con lesiones similares a las antes descritas. Las características de las lesiones y la morbilidad eran sugestivas de un proceso viral. El equipo de trabajo consideró descartar los siguientes diagnósticos diferenciales: EC, viruela caprina, fiebre aftosa, estomatitis vesicular, dermatitis por estafilococos, dermatofilosis, lengua azul y dermatosis ulcerativa. Las instalaciones de cuarentena se desinfectaron diariamente con Virkon S (Antec Internacional Ldt., Inglaterra) diluido a 100 ppm y el control de insectos se realizó con Nuvan EC 1000 (Formulaciones Químicas SA, Costa Rica) a una dilución de 1.5 ml/L de agua. La dieta inicial estuvo basada en concentrado y se reemplazó por pasto fresco para evitar agravar las lesiones de los labios.

RESULTADOS

Figure 1. Left side view of the head. Lips show dark brown scabs. Translucent mucus coming out of the nostril is observed.

Samples of skin lesions (10 animals), serum (5 animals) and cobalt (20 animals) were collected. The samples obtained were analyzed by histopathology, virus isolation, DAS-ELISA and nucleic acid amplification, following the standard procedures (11,12). Also, scab and serum samples were sent to the National Laboratory of Veterinary Services APHIS-USA (Ames, Iowa, USA) in order to perform the complement fixation test and transmission electron microscopy (TEM). Conventional histopathological analysis of skin samples. The stratum corneum of the epidermis shows hyperkeratosis (ortho-and parakeratotic). In some sections of the lucid and granular stratum, the keratinocytes are degenerated (balanoid degeneration) with pyknotic nuclei and eosinophilic and refractile intracytoplasmic inclusions. Degenerated keratinocytes arise, leading to the formation of vesicles occupied by neutrophils and pus cells. The latter extend to the superficial

Hallazgos al examen clínico. En general, las variables fisiológicas estaban dentro de los rangos normales para la especie. Los animales se mantenían con buen apetito aunque con mala condición corporal, secreción nasal mucopurulenta, tos y pezuñas sobrecrecidas. En los labios, nariz y comisuras palpebrales, se observaron máculas eritematosas, brillantes y desprovistas de pelo, así como vesículas y pústulas, estas lesiones sangraban fácilmente al tacto. A 11 días de iniciados los signos clínicos, las lesiones descritas evolucionaron a costras, multifocales coalescentes y úlceras como resultado del desprendimiento de las costras (Figura 1). Se colectó muestras de piel lesionada (10 animales), suero (5 animales) y costras (20 animales). Las muestras obtenidas fueron analizadas por histopatología, aislamiento viral, DAS-ELISA y amplificación de ácidos nucleicos, siguiendo los procedimientos de rutina (11, 12). Asimismo, se enviaron muestras de costras y suero, al Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios de APHIS-USA (Ames, Iowa, USA) para la realización de prueba de fijación de complemento y microscopía electrónica de transmisión (MET). Análisis histopatológico convencional de las muestras de piel. El estrato córneo de la epidermis muestra hiperqueratosis (orto y paraqueratósica). En algunas secciones del estrato lúcido y granuloso, los queratinocitos están degenerados (degeneración balonoide)

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dermis. The dermis showed neovascularization with congestion, edema and hemorrhage (Figure 2).

Figure 2. A. Skin sample with neovascularization, hematoxylin and eosin staining, 100X, bar = 100 µm. Epidermis and superficial dermis. The black arrow shows neovascularization. Congestion and edema located in the A. zone. B. Skin sample with scabs, hematoxylin and eosin staining, 400X, bar = 100 µm. Epidermis and superficial dermis. Hyperkeratosis in the A zone. The black arrows show intracytoplasmic inclusions. The white arrows indicate the balanoid degeneration of keratinocytes.

Viral isolation and DAS-ELISA. The DAS-ELISA test was performed on scabs for the detection of vesicular stomatitis and foot and mouth disease. The scabs were also used to inoculate Vero cells and in a period of less than 24 hours, the cytopathic effect was apparent. The DAS-ELISA technique was applied again, but this time the average with viable viral particles were isolated. Both scabs and viral particles were negative for vesicular stomatitis and foot and mouth disease. Nucleic acid amplification test. DNA was extracted from the scabs, and from the viral particles isolated in Vero cells. Individual amplification of nucleic acids was performed for vesicular stomatitis, foot and mouth disease and contagious ecthyma. Viral amplification was only observed in all samples processed for the diagnosis of contagious ecthyma (Figure 3). Serology. The complement fixation test was positive for CE for four of the five animals tested. Transmission electron microscopy (TEM). TEM results showed electron-dense, ovoid, viral structures, with a crosslinked membrane pattern. The size of these structures was 308nm x 207nm and they were consistent with the Parapoxvirus genus (Figure 4).

con núcleos pignóticos e inclusiones intracitoplasmáticas, eosinofílicas y refringentes. A su vez queratinocitos degenerados se desprenden dando paso a la formación de vesículas ocupadas por neutrófilos y piocitos. Estos últimos se extendian hasta la dermis superficial. La dermis presentaba neovascularización con congestión, edema y hemorragia (Figura 2). Aislamiento viral y DAS-ELISA. Se realizó la prueba de DAS-ELISA a las costras para la detección de estomatitis vesicular y fiebre aftosa. Las costras también fueron usadas para inocular células Vero y en un período inferior a 24 horas se observó el efecto citopático. Nuevamente se aplicó la técnica DAS-ELISA, pero en esta ocasión al medio con partículas virales viables, aisladas. Tanto las costras como las partículas virales fueron negativas para estomatitis vesicular y fiebre aftosa. Prueba de amplificación de ácidos nucléicos. El ADN fue extraído de las costras, así como de las partículas virales aisladas en las células Vero. Se realizó la amplificación de ácidos nucléicos individual para estomatitis vesicular, fiebre aftosa y ectima contagioso. Solamente, se observó amplificación viral en todas las muestras procesadas para diagnóstico de ectima contagioso (Figura 3). Serología. La prueba de fijación de complemento resultó positiva a EC para cuatro de los cinco animales analizados. Microscopía electrónica de transmisión (MET). Los resultados de la MET mostraron estructuras virales ovoides, electrodensas con un patrón de membrana entrecruzado. El tamaño de estas estructuras fue de 308nm x 207nm y fueron consistentes con el género parapoxvirus (Figura 4).

DISCUSIÓN En esta comunicación se reporta el diagnóstico de un brote de EC en la estación cuarentenaria de Paso Canoas, Panamá. Este brote ocurrió en un rebaño de cabras importadas a los 13 días de iniciada su cuarentena, los animales no fueron liberados en el territorio panameño. Esta enfermedad no ha sido reportada en la República de Panamá, ni en ninguno de los lotes de animales importados recibidos en la estación cuarentenaria. Asimismo, en el país fronterizo más cercano, Costa Rica, tampoco hay reportes escritos de EC.

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Figure 3. Nucleic acid amplification by PCR, wherein the product is shown amplified 350pb. Lane 1: negative control, Lanes 2 and 3: positive control for CE. Lanes 4 to 9: Scab samples. Lanes 10 to 15: virus isolated in Vero cells.

DISCUSSION This message reports the diagnosis of a CE outbreak in the Paso Canoas quarantine station in Panama. This outbreak occurred in a herd of imported goats at 13 days into their quarantine, the animals were not released in Panamanian territory. This disease has not been reported in the Republic of Panama, or in any of the groups of imported animals received by the quarantine station. Also, in the nearest border country, Costa Rica, there are no written reports of CE. In this outbreak, erythematous macules were apparent after 13 days of quarantine, which differs from literature that mentions a 4-8 day incubation period (1); Also, according to consulted literature, CE mainly affects young animals and sheep (1-3, 7, 8), at this point it is important to mention that the quality and intensity of the infection could be related to the immune system’s ability to control virus multiplication (1-3); the trip and other stressors may have played an important role in the timing of the disease. Also, one cannot dismiss the presence of persistently infected animals, which keep the virus circulating in the herd. These lesions were exclusively distributed on the lips, nose and palpebral fissures. The distribution pattern of the lesions differs with that reported in literature where lesions can occur on the rest of the skin, genitals, udders and even on digestive epithelia (1, 2, 4, 8, 10).

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Figure 4. Transmission electron microscopy (TEM), negative staining. The image shows two viral particles with morphology and dimensions that are compatible with Parapoxvirus.

En este brote se observaron máculas eritematosas transcurridos 13 días de iniciada la cuarentena, lo cual difiere con la literatura que menciona 4 a 8 días como período de incubación (1); asimismo, según la literatura consultada, EC afecta principalmente a animales jóvenes y a ovejas (1-3, 7, 8), en este punto es importante mencionar que la calidad e intensidad de la infección estaría relacionada con la capacidad del sistema inmunitario de controlar la multiplicación del virus (1-3); por que el viaje y otros factores estresantes, pudieron haber jugado un papel importante en el tiempo de presentación de la enfermedad. Tampoco se puede descartar la presencia de animales con infección persistente, los cuales mantienen el virus circulando en el rebaño. Estas lesiones estuvieron distribuidas exclusivamente en los labios, nariz y comisuras palpebrales. El patrón de distribución de las lesiones observadas, difiere con el reportado en la literatura donde las lesiones pueden presentarse en el resto de la piel, órganos genitales, ubres e incluso en epitelios digestivos (1, 2, 4, 8, 10). Usualmente, las lesiones agudas y eritematosas evolucionan a costras en aproximadamente seis semanas (1). Sin embargo, en este caso, los caprinos mostraron formación de costras desde el día 11 después de iniciadas las lesiones macroscópicas agudas. En la histopatología, las muestras de piel mostraron hiperqueratosis, degeneración balonoide de los queratinocitos, cuerpos de inclusión eosinofìlicos, intracitoplasmáticos, infiltrado neutrofìlico, neovascularización

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Usually, acute erythematous lesions progress to scabs in about six weeks (1). However, in this case, the goats showed scabbing on day 11 after the start of acute macroscopic lesions. In the histopathology, skin samples showed hyperkeratosis, balanoid degeneration of k e ra t i n o c y t e s , n e u t r o p h i l i c i n f i l t r a t e d , i n t ra c y t o p l a s m i c , e o s i n o p h i l i c i n c l u s i o n bodies, neovascularization with congestion, edema and hemorrhage. These lesions are characteristic of CE (1,7,10). Clinical, histopathological and TEM diagnosis of CE were confirmed. The presence of other vesicular viral diseases was ruled out by means of the complement fixation test, DAS-ELISA and nucleic acid amplification tests. Viral diseases such as foot and mouth disease, vesicular stomatitis, blue tongue and goat pox are differential diagnoses of CE, and are also considered important diseases for quarantine. For this reason, and upon reaching the etiologic agent of the disease described in this report, it was necessary to discard the presence of other diseases. Biosecurity and disinfection measures were based on the physicochemical properties of the virus of the Poxvirus genus. These viruses are sensitive to high temperatures, and to benzene (5) which contains Virkon S. CE in ruminants affects the development of the livestock industry (8), since CE outbreaks cause economic losses related to decreased food intake and lower weight gain (1, 2, 6, 7). Furthermore, CE has an impact on animal welfare due to pain caused by lesions on the animal (2) and is of importance in public health as zoonosis (1-8). Effective therapy against Parapoxvirus infection remains contentious. (1,2,7). The goats also didn’t have a severe bacterial infection. Therefore, animals affected with CE remained without drug treatment. Only feed was improved with fresh grass as a palliative treatment. After confirmation of CE in the herd, all animals were returned by land to their country of origin. Quarantine stations are points of disease contention of vital importance to the country. Disease outbreaks in these facilities should be contained through strict biosecurity measures and diagnostic tests that establish the specific etiologic agent in the shortest possible period of time. For all imported animals, clinical inspection and alertness must be maintained in the event of any signs of disease manifestation during quarantine.

con congestión, edema y hemorragia. Dichas lesiones son características de EC (1, 7, 10). Se confirmó el diagnóstico clínico, histopatológico y de MET de EC. La presencia de otras enfermedades virales vesiculares fue descartada por medio de prueba de fijación de complemento, DAS-ELISA y pruebas de amplificación ácidos nucléicos. Enfermedades virales como fiebre aftosa, estomatitis vesicular, lengua azul y viruela caprina son diagnósticos diferenciales de EC, también consideradas enfermedades de importancia para la cuarentena, por tal motivo además, de llegar al agente etiológico de la enfermedad descrita en este reporte, fue necesario descartar la presencia del resto de las enfermedades. Las medidas de bioseguridad y desinfección e s t uv i e ro n b as ad as e n l as p ro p i e d ad e s fisicoquímicas de los virus del género Poxvirus. Estos virus son sensibles a altas temperaturas, así como al benceno (5) que contiene Virkon S. La EC en los rumiantes afecta el desarrollo de la industria ganadera (8), ya que los brotes de EC ocasionan pérdidas económicas relacionadas con disminución en el consumo de alimentos y baja ganancia de peso (1, 2, 6, 7). Por otro lado, la EC tiene un impacto en el bienestar animal debido al dolor que producen las lesiones sobre el animal (2) y es de importancia en la salud pública por ser considerada zoonosis (1-8). La terapia eficaz contra la infección de Parapoxvirus continúa en discusión. (1,2,7). Las cabras tampoco presentaron infección bacteriana severa. Por tal motivo, los animales afectados con EC permanecieron sin tratamiento medicamentoso. Únicamente se mejoró la alimentación con pasto fresco como tratamiento paliativo. Después de la confirmación de EC en el rebaño, todos los animales retornaron por vía terrestre hasta el país de origen. Las estaciones para cuarentena son puntos de contención de enfermedades de vital importancia para el país. Los brotes de enfermedades dentro de dichas instalaciones deben contenerse por medio de medidas estrictas de bioseguridad y pruebas diagnósticas que establezcan el agente etiológico específico en el menor tiempo posible. En todos los animales que se importen, se debe mantener la alerta y la inspección clínica ante cualquier manifestación de enfermedad durante la cuarentena.

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Acknowledgements

Agradecimientos

The authors acknowledge the financial, technical and logistical support of the following people and institutions: Dr. Enrique Evans, Dra. Kirian Cerceño, Dr. José Barrera, Licda. Yiris Rovira, Dr. Enzo Rodríguez, Dr. Manuel González Cano, Dr. Bredio Velasco, Dr. Humberto Hernández, Dr. Francisco Pinilla, Dr. Franklin Clavel, Dr. Carlos Lorenzo, Licda. Cristella Martínez y Licda. Krislly Ramírez from the Ministry of Agricultural Development and Palo Alto Laboratory of the México-United States Commission for the prevention of foot and mouth disease and other exotic diseases (CPA).

Los autores agradecen la colaboración financiera, técnica y logística de las siguientes personas e instituciones: Dr. Enrique Evans, Dra. Kirian Cerceño, Dr. José Barrera, Licda. Yiris Rovira, Dr. Enzo Rodríguez, Dr. Manuel González Cano, Dr. Bredio Velasco, Dr. Humberto Hernández, Dr. Francisco Pinilla, Dr. Franklin Clavel, Dr. Carlos Lorenzo, Licda. Cristella Martínez y Licda. Krislly Ramírez del Ministerio de Desarrollo Agropecuario y al Laboratorio de Palo Alto de la Comisión MéxicoEstados Unidos para la prevención de la Fiebre Aftosa y otras enfermedades exóticas (CPA).

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Pulmonary adenocarcinoma in cattle Adenocarcinoma pulmonar en bovinos Diogo Sousa Z,1 MV, Luis Rivera C,2* MVZ, Didier Quevedo C,1 M.Sc, Ana Claudia Gorino,1 MV, Simone Biagio C,1 Ph.D, Renée Laufer A,1 Ph.D. São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Faculty of Veterinary and Zootechnical Medicine, Clinical Veterinary Department, Botucatu, São Paulo, Brasil. 2São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Faculty of Agricultural and Veterinary Sciences, Veterinary Pathology Department, Jaboticabal, São Paulo, Brasil. Correspondence: lgriveramvz@gmail.com 1

Received: November 2013; Accepted: April 2014.

ABSTRACT The Macroscopic, histological and immunohistochemical aspects of lung acinar adenocarcinoma and the presence of nodules in the abdominal cavity of an adult female bovine are reported. In the necropsy analysis samples were collected from the: lung, heart, spleen, liver, pancreas, kidney, uterus, intestine, brain, and from nodules found in the lung and abdominal cavity, which were routinely processed to be stained by hematoxylin-eosin and for an immunohistochemistry exam with the antibodies: cytokeratin (dilution 1:200 µL) and vimentin (dilution 1:1000 µL). The histopathological examination revealed neoplastic epithelial cells with acini formation. The immunohistochemical examination of the tumor cells showed positive marking for cytokeratin and the absence of marking for vimentin. According to anatomical, morphological, and histopathological findings, as well as the result of the immunohistochemical examination, the tumor was characterized as lung acinar adenocarcinoma. Key words: Histopathology, immunochemistry, lung, metastasis, neoplasia (Source: CAB).

RESUMEN Se relatan los aspectos macroscópicos, histológicos e inmunohistoquímicos de un adenocarcinoma acinar pulmonar y la presencia de nódulos en la cavidad abdominal en una hembra bovina adulta. En el análisis necroscópico fueron colectados fragmentos de: pulmón, corazón, bazo, hígado, páncreas, riñón, útero, intestino, encéfalo y de los nódulos hallados en pulmón y cavidad abdominal, los cuales fueron procesados rutinariamente para ser teñidos mediante Hematoxilina-Eosina y para examen inmunohistoquímico con los anticuerpos: citoqueratina (con dilución 1:200 µL) y vimentina (dilución 1:1000 µL). El examen histopatológico reveló células epiteliales neoplásicas con formación de acinos. El examen inmunohistoquímico de las células neoplásicas demostró marcación positiva para citoqueratina y ausencia de marcación para vimentina. De acuerdo con los hallazgos anatómicos, morfológicos, histopatológico, y el resultado del examen inmunohistoquímico, se logró caracterizar el tumor como adenocarcinoma acinar pulmonar. Palabras clave: Histopatología, inmunohistoquímica, metástasis, neoplasia, pulmón (Fuente: CAB). 4358

Sousa - Pulmonary adenocarcinoma in cattle

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Primary lung tumors are rare in cattle, so it is an unusual finding in slaughterhouses. The incidence of these tumors is 2.8% among all neoplasms found in the species (1).

Los tumores primarios de pulmón son raros en bovinos, por lo que es un hallazgo atípico en mataderos. La incidencia de estos tumores es del 2.8% entre todas las neoplasias encontradas para la especie (1).

Malignant tumors of epithelial origin related to lung tissue in cattle may arise from the epithelium, bronchial mucous glands (goblet cells) and alveolar liner. These tumors can be subdivided into four different histological types: papillary, acinar, solid and mixed, the papillary and acinar types are the most common in domestic animals (2). Metastasis of lung carcinomas occurs due to local invasion by a hematogenous or lymphatic route (1). Due to the rare frequency of this neoplasm in cattle, little is known about its biological behavior. In Brazil, in a retrospective study performed by Lucena et al (3), between 1964 and 2008, samples were obtained in paraffin blocks from bovine necropsies performed on 6706 cattle, stored in the Pathology Service archives, at St. Mary’s University, Rio Grande do sul. Of these samples, 586 were neoplasms. It was determined that four adenocarcinomas were of pulmonary origin, including two papillary adenocarcinomas, one acinar and one of small anaplastic cells. However, Viott et al (4) described, in detail, the first case of pulmonary adenocarcinoma in this country. The aim of this study was to report the occurrence and describe the macroscopic, histological and immunohistochemical aspects of pulmonary acinar adenocarinoma, and the presence of malignant nodules distributed in the abdominal cavity of an adult female bovine.

CLINICAL CASE A female bovine, Nelore breed, age nine, was received by the Department of Veterinary Pathology at the UNESP-Veterinary Hospital, Botucatu (SP), Brazil, for post mortem analysis. In the clinical history, clinical signs of hyperoxia, ruminal hypotonia, and persistent tachycardia were described during the first clinical examination. These clinical signs progressively intensified and 15 days after the first examination, an exploratory laparotomy was done where 50 liters of pink-colored abdominal fluid were drained and a mass in the left sacral wing with suspected mesothelioma was also observed. Due to the precarious economic condition of the animal owner, complementary procedures and examinations were not performed. Finally, with the authorization of the owner, the euthanasia of

Los tumores malignos de origen epitelial relacionados con el tejido pulmonar del bovino pueden surgir a partir del epitelio, glándulas mucosas de los bronquios (células caliciformes) y revestimiento alveolar. Esos tumores pueden ser subdivididos en cuatro tipos histológicamente distintos: papilar, acinar, sólido y mixto, los tipos papilar y acinar son los más frecuentes en los animales domésticos (2). La metástasis de los carcinomas pulmonares ocurre por invasión local y por vía linfática o hematógena (1). Debido a la rara frecuencia de esta neoplasia en bovinos, poco se conoce sobre su comportamiento biológico. En Brasil, en un estudio retrospectivo realizado por Lucena et al (3), entre los años 1964 y 2008, se obtuvieron muestras en bloques de parafina de necropsias realizadas en 6706 bovinos, almacenadas en los archivos del servicio de Patología, Universidad de Santa María, Rio grande do Sul. De estas muestras, 586 eran neoplasias. Se determinó que cuatro adenocarcinomas eran de origen pulmonar, incluyendo dos adenocarcinomas papilares, uno acinar y uno de células pequeñas y anaplásicas. Sin embargo, fueron Viott et al (4) quienes describieron detalladamente el primer caso de adenocarcinoma pulmonar en este país. El objetivo de este trabajo fue relatar la ocurrencia y describir los aspectos macroscópicos, histológicos e inmunohistoquímicos en un adenocarinoma acinar pulmonar, y la presencia de nódulos malignos distribuidos en cavidad abdominal de una hembra bovina adulta.

CASO CLÍNICO Una hembra bovina de raza Nelore, de nueve años de edad, fue recibida en el Servicio de Patología Veterinaria del Hospital Veterinario–UNESP, Botucatu (SP), Brasil, para análisis post mortem. En la historia clínica fueron descritos signos clínicos de hiporexia, hipotonía ruminal y taquicardia persistente durante el primer examen clínico. Estos signos clínicos se intensificaron de forma progresiva y 15 días después del primer examen, se efectúo una laparotomía exploratoria donde se drenó 50 litros de líquido abdominal de color rosado y se observó además una masa en el ala sacral izquierda con sospecha de mesotelioma. Debido a la precaria condición económica del propietario del animal, procedimientos y exámenes complementarios no

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the animal was performed for academic purposes in the Veterinary Pathology sector.

fueron realizados. Finalmente, previa autorización del propietario, la eutanasia del animal se llevó a cabo para fines académicos del sector de Patología Veterinaria.

During the necropsy, the animal obtained a body condition 3/5 (5), with oculo-palpebral mucous, oral and external genital of normal color. During In situ analysis, the lung showed areas of atelectasis in the cranial lobe, and left caudal, associated with multifocal fibrosis (Figure 1A), nodules between 1 and 4 cm in diameter were also present, with a firm consistency, ranging in color from white to yellow, and diffusely distributed in this organ (Figure 1B).

Durante la necropsia, el animal obtuvo una condición corporal 3/5 (5), con mucosas oculopalpebral, oral y genital externa de color normal. Al análisis in situ, el pulmón presentó áreas de atelectasia en el lóbulo craneal y caudal izquierdo, asociada a fibrosis multifocal (Figura 1A), además de presentar nódulos entre 1 y 4 cm de diámetro, con consistencia firme, coloración que varió de blanco a amarillo y distribución difusa en este órgano (Figura 1B).

In the abdominal cavity, multi-sized nodules were observed, mainly in parietal and visceral serous, and diffusely distributed, measuring 0.2 to 2.0 cm in diameter (Figure 1C). A mass of 10.0 x 8.0 cm was also observed in the left sacral wing. The nodule in the sacral region was mainly composed of adipose tissue encapsulating a neoplastic mass of 2 cm in diameter. The uterus was found to be thickened, with a firm consistency, and upon cutting, viscous, translucent content was noted.

En cavidad abdominal, se observó principalmente en serosa parietal y visceral, y con distribución difusa, nódulos de múltiples tamaños, midiendo de 0.2 a 2.0 cm de diámetro (Figura 1C) y una masa de 10.0 x 8.0 cm en el ala sacral izquierda. El nódulo en la región sacral estaba constituido principalmente por tejido adiposo que encapsulaba una masa neoplásica de 2 cm de diámetro. El útero se encontró engrosado, con consistencia firme, al corte, se notó de aspecto viscoso y contenido translúcido.

Samples were collected from the: Lung, heart, spleen, liver, pancreas, kidney, uterus, intestine, brain and from nodules found in the lung and abdominal cavity. All were set in 10% formalin, and routinely processed, using the hematoxylineosin method.

Se colectaron fragmentos de: pulmón, corazón, bazo, hígado, páncreas, riñón, útero, intestino, encéfalo y de los nódulos hallados en pulmón y cavidad abdominal. Todos fueron fijados en formol al 10%, y procesados rutinariamente, por el método de Hematoxilina-Eosina.

The histopathological examination of the nodules revealed neoplastic epithelial cells with acini formation. The cells exhibited moderately sized, eosinophilic cytoplasm, basophilic round nucleus with basal localization (Figure 2A). Little chromatin was found, identifying one or two nucleoli per cell; further observations included: anisokaryosis, anisocytosis, high pleomorphism and increased nucleus:cytoplasm ratio. On average, two mitotic figures per high magnification field (400x) were determined.

El examen histopatológico de los nódulos, reveló células epiteliales neoplásicas con formación de acinos. Las células exhibían citoplasma de tamaño moderado y eosinofílico, núcleo redondo, basofílico, y de localización basal (Figura 2A). La cromatina se encontró escasa, identificándose uno o dos nucléolos evidentes por cada célula; se observó además, anisocariosis, anisocitosis, alto pleomorfismo y relación aumentada núcleo:citoplasma. Se

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Figure 1. Macroscopic examination of bovine pulmonary acinar adenonocarcinoma. 1A) Multifocal fibrosis in the lung. 1B) Nodule in the lung, yellow with a firm consistency upon cutting. 1C) Multiple nodules in the abdominal cavity (Arrows). 1D Nodules in the spleen (Arrows).

Sousa - Pulmonary adenocarcinoma in cattle In some areas of the cut, multifocal and coalescing necrosis was found, mononuclear inflammatory cells predominantly infiltrated with lymphocytes, plasmocytes and discrete reactive macrophages. When performing Ziehl-Neelsen stain, the result was negative for Mycobacterium sp. (Figure 2B). Areas of mineralization and fibrosis, of moderate quantity, with multifocal and coalescent distribution were also identified. The spleen, sternal lymph node and abdominal nodes, showed infiltration of previously described neoplastic cells. The Immunohistochemical technique by means of the endogenous peroxidase method was used for pan-cytokeratin (Mouse anti Cytokeratin (Pan) AE1/AE3, Invitrogen, Frederick, USA) (Dilution 1:200 ul) and Vimentin (Mouse anti Vimentin (V9), Invitrogen, Frederick, USA) (Dilution 1:1000 ul), both with cytoplasmic marking. For the revelation DAB was used (chromogen 3,3 ‘Diaminobenzidine, Dako, Glostrup, Denmark).

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determinó en promedio dos figuras de mitosis por campo de grande aumento (400x). En algunas áreas del corte se halló necrosis multifocal y coalescente, infiltrado inflamatorio mononucleado predominando linfocitos, plasmocitos y discretos macrófagos reactivos. Al realizar la coloración de Ziehl-Neelsen esta resultó negativa a Mycobacterium sp., (Figura 2B). Se identificaron además, áreas de fibrosis y mineralización en cantidad moderada con distribución multifocal y coalescente. El bazo, el nódulo linfático esternal y los nódulos abdominales, presentaron infiltrado de células neoplásicas, descrita previamente. La técnica de inmunohistoquímica por el método de peroxidasa endógeno fue utilizada para Pancitoqueratina (Mouse anti Cytokeratin (Pan) AE1/AE3, Invitrogen, Frederick, USA) (Dilución 1:200 µl) y Vimentina (Mouse anti Vimenetin (V9), Invitrogen, Frederick, USA) (Dilución 1:1000 µl), ambas de marcación citoplasmática. Para la revelación fue utilizado DAB (cromógeno 3,3’Diaminobenzidine, Dako, Glostrup, Dinamarca).

Figure 2. Microscopic examination of bovine pulmonary acinar adenocarcinoma. 2A) Formation of alveoli through neoplastic cells, lung, HE, 400x. 2B) Ziehl-Neelsen staining, lung, 200x. 2C) Immunohistochemistry with positive reactivity to neoplastic epithelial cells, cytokeratin antibody AE1/AE3, lung, 100x. 2D) Positive immunohistochemical reaction in connective tissue and negative in neoplastic epithelial cells, vimentin antibody, lung, 100x. 2E) Positive marking of neoplastic cells, antibody AE1/AE2, nodule in the sacral wing, 100x. 2F) Positive immunohistochemical reaction in connective tissue and negative in neoplastic epithelial cells, vimentin antibody, nodule in the sacral wing, 100x.

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The immunohistochemistry test showed positive immunoreactivity for cytokeratin, being moderately cytoplasmic and diffused in neoplastic cells (Figure 2C, 2E). In malignant cells, no Vimentin marking was observed, this antibody was only positive for connective tissue (Figures 2D, 2F). According to morphological, anatomical, and histopathological findings and to positive immunoreactivity for cytokeratin, the tumor was characterized as acinar adenocarcinoma in the lung and in the nodes identified in the abdominal cavity.

La prueba de inmunohistoquímica evidenció inmunoreactividad positiva para citoqueratina, siendo ésta citoplasmática moderada y difusa en las células neoplásicas (Figura 2C, 2E). En las células malignas no se observó marcación con Vimentina, este anticuerpo solo fue positivo para el tejido conjuntivo (Figuras 2D, 2F). Conforme a los hallazgos morfológicos, anatómicos, histopatológicos y a la inmunoreactividad positiva para citoqueratina, el tumor fue caracterizado como adenocarcinoma acinar en el pulmón y en los nódulos identificados en la cavidad abdominal.

DISCUSSION

DISCUSIÓN

Pulmonary malignant neoplasms are classified according to their origin, epithelial cells in the lung originate lung adenocarcinomas (1,3,6), while the mesenchymal cells can produce osteosarcomas, chondrosarcomas, hemangiosarcomas, malignant histiocytosis, lymphomatoid granulomatosis, granular cell tumors and mesothelioma (7).

Las neoplasias malignas pulmonares son clasificadas de acuerdo con su origen, las células epiteliales del pulmón originan los adenocarcinomas pulmonares (1,3,6), mientras que las células mesenquimales pueden producir osteosarcomas, condrosarcomas, hemangiosarcomas, histiocitosis maligna, granulomatosis linfomatoide, tumor de células granulares y el mesotelioma (7).

Pulmonary adenocarcinoma may be differentiated from mesothelioma by the presence of basal, uniform nuclei in cells that form acini, a feature which is absent in mesotheliomas, which have granular cells with irregular nuclei and primitive acini (8).

El adenocarcinoma pulmonar puede ser diferenciado del mesotelioma por la presencia de núcleos basales y uniformes de las células que forman acinos, una característica que se encuentra ausente en los mesoteliomas, los cuales poseen células granulares con núcleos irregulares y acinos primitivos (8).

Additionally, immunohistochemistry is a useful tool in differentiating these tumors, since neoplastic cells in mesothelioma express epithelial cytokeratin and mesenchymal markers, such as Vimentin (9), whereas adenocarcinomas are specifically marked by cytokeratin.

Adicionalmente, la inmunohistoquímica es una herramienta útil para la diferenciación de esos tumores, puesto que las células neoplásicas del mesotelioma expresan citoqueratinas epiteliales y marcadores mesenquimales, tales como la Vimentina (9), mientras que los adenocarcinomas son marcados específicamente por las citoqueratinas.

Pulmonary adenocarcinomas, with esquirrosa, in cattle should be differentiated from other epithelial neoplasms, mainly primary neoplasms of the uterus and pancreas (3,9). Endometrial adenocarcinoma, besides being esquirroso and possessing large amounts of fibrous tissue, presents a disruption in glandular epithelial cells and high pleomorphism. This was not evident in uterine tissue and nodules scattered in the abdominal cavity of the animal under study (9). Moreover, pancreatic adenocarcinoma exhibits several cellular patterns: tubular, not delineated or solid. The cells may form acini or gross tubules, with a uniform, oval nucleus and dispersed chromatin. These tumors have areas of hemorrhage, mineralization or necrosis in the pancreas (7); the absence of macroscopic and microscopic alterations in this organ repudiate the emergence of this carcinoma

Los adenocarcinomas pulmonares con característica esquirrosa en bovinos deben diferenciarse de otras neoplasias epiteliales, principalmente, neoplasias primarias de útero y páncreas (3,9). El adenocarcinoma endometrial además de ser esquirroso y poseer grandes cantidades de tejido fibroso, presenta desorganización en las células epiteliales glandulares y alto pleomorfismo. Lo cual, no fue evidenciado en el tejido uterino y los nódulos diseminados en cavidad abdominal del animal en estudio (9). Por otro lado, el adenocarcinoma pancreático exhibe varios patrones celulares: tubulares, no delineados o sólidos. Las células pueden formar acinos o túbulos groseros, con núcleo uniforme, oval, y cromatina dispersa. Esos tumores presentan áreas de hemorragia, mineralización o necrosis en el páncreas (7); la ausencia de alteraciones macroscópicas y microscópicas en este órgano descartó el surgimiento de este carcinoma.

Sousa - Pulmonary adenocarcinoma in cattle During the necropsy, the cheesy and calcareous appearance of the nodules suggested tuberculosis. However, histological sections subjected to the Ziehl-Neelsen stain were negative. In humans, infection with Mycobacterium sp. was already associated with pulmonary adenocarcinoma (10,11). However, until now there has not been any report of animals associated with these diseases. In conclusion, anatomical and histomorphological findings, and contributions described in the literature allow the tumor to be classified as lung acinar adenocarcinoma, this pattern of organization was also identified in the nodules collected from the abdominal cavity; suggesting that the primary focus of the neoplasm was from pulmonary origin. Positive immunoreactivity for AE1/AE3 and negative marking for vimentin were key determinants in completing the case.

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Durante la necropsia el aspecto caseoso y calcáreo de los nódulos sugirió tuberculosis. Sin embargo, las secciones histológicas sometidas a la coloración de Ziehl-Neelsen resultaron negativas. En humanos ya fue asociada la infección por Mycobacterium sp., con el adenocarcinoma pulmonar (10,11). Sin embargo, hasta ahora no se tiene ningún relato sobre animales en los que se hayan asociado estas enfermedades. En conclusión, los hallazgos anatómicos, histomorfológicos, y los aportes descritos en la literatura permitieron clasificar el tumor como adenocarcinoma acinar pulmonar, este patrón de organización también fue identificado en los nódulos colectados en la cavidad abdominal; sugiriendo que el foco primario de la neoplasia fue de origen pulmonar. La inmunoreactividad positiva para AE1/ AE3 y la marcación negativa para vimentina fueron determinantes para concluir el caso.

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