Sổ tay xét nghiệm và xử lý Tinh dịch đồ người - 2011

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

BỆNH VIỆN HÙNG VƢƠNG KHOA HIẾM MUỘN

SỔ TAY XÉT NGHIỆM VÀ XỬ LÝ

TINH DỊCH NGƢỜI

2011

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

LƢU HÀNH NỘI BỘ

1

2

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Khi khảo sát khả năng sinh sản của một cặp vợ chồng thì tinh dịch đồ (của nam) là một trong những xét nghiệm cơ bản nhất, quan trọng nhất không thể thiếu. Qua khảo sát tinh dịch đồ có thể có được những thông tin về tinh trùng của nam giới (có hay không có tinh trùng).

Xét nghiệm tinh dịch đồ đã được thực hiện từ nhiều năm, với nhiều kỹ thuật, phương pháp luôn được cải tiến, thay đổi qua thời gian. Sự thay đổi quy trình kỹ thuật cũng nhằm mục đích đưa ra một đánh giá chính xác khi khảo sát chất lượng mẫu tinh dịch đồ để có một thái độ xử trí đúng cho từng kết quả đưa ra.

Dưới hướng dẫn của quy trình theo WHO 1999, từ năm 2000 Khoa Hiếm muộn Bệnh viện Hùng Vương đã thực hiện xét nghiệm tinh dịch đồ nhưng chủ yếu phục vụ tại Khoa (trung bình 20 – 25 trường hợp/tháng). Hiện nay, bộ phận xét nghiệm của Khoa Hiếm muộn đã nhận thực hiện xét nghiệm rộng rãi cho cả những đối tượng bên ngoài vào xét nghiệm, đồng thời cũng nhận đào tạo theo nhu cầu của các đơn vị khác như: trường Đại học, phòng khám tư nhân, đơn vị Bệnh viện bạn, tuyến y tế cơ sở…

Trên thế giới hiện nay đang chuẩn hóa quy trình xét nghiệm tinh dịch theo WHO 2010, nhân viên phòng xét nghiệm Nam khoa cũng đã được huấn luyện, học tập nhiều quy trình mới và đã tích lũy nhiều kiến thức, kinh nghiệm. Nhận thấy cần có một tài liệu theo chuẩn cập nhật của WHO, nhân viên phòng xét nghiệm Nam khoa đã soạn ra tập tài liệu này, mà qua đó những quy trình, kỹ thuật thống nhất, chính xác được tuân thủ đúng theo tiêu chuẩn quốc tế sẽ được thực hiện tại Khoa. Tập tài liệu này sẽ được dùng để hướng dẫn cho học viên ở các nơi khác đến học tập tại Khoa Hiếm muộn – Bệnh viện Hùng Vương.

Do đây là lần đầu tiên biên soạn, chắc chắn vẫn còn nhiều sai sót cần điều chỉnh, kính mong quý đồng nghiệp đóng góp ý kiến giúp chúng tôi về nội dung lẫn hình thức.

Xin chân thành cảm ơn!

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Bệnh Viện Hùng Vương đã giúp đỡ chúng tôi hoàn thành tài liệu này.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 12 năm 2011 Thay mặt nhóm biên dịch

BS. Nguyễn Thị Ngọc Sương

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

3

4

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chịu trách nhiệm chính Bs. Nguyễn Thị Ngọc Sƣơng Trưởng Khoa Hiếm muộn Bệnh viện Hùng Vương

Cố vấn chuyên môn Bs. Vũ Đình Tuân

Bs.Tăng Quang Thái

Trưởng Labo IVF

Phòng Khám Nam học

Bệnh viện Hùng Vương

Bệnh viện Hùng Vương

Biên dịch CNSH. Tăng Kim Hoàng Văn

CNSH. Lâm Sơn Bích Trâm

Labo IVF

PXN Nam Khoa

Bệnh viện Hùng Vương

Bệnh viện Hùng Vương

CNXN. Nguyễn Văn Nghĩa PXN Nam Khoa Bệnh viện Hùng Vương

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

5

6

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Mục lục

PHẦN II: QUY TRÌNH NHẬN MẪU A. Hƣớng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm ........................20 B.

Hƣớng dẫn bệnh nhân lấy mẫu ......................................20 I.

Chuẩn bị lấy mẫu .............................................................................. 20

II. Yêu cầu khi lấy mẫu ......................................................................... 21 III. Thu mẫu tinh dịch cho mục đích chẩn đoán hoặc ................ 21 IV. Thu mẫu vô trùng cho mục đích hỗ trợ sinh sản và ............. 22 V. Thu mẫu tinh dịch tại nhà .............................................................. 23 VI. Thu mẫu tinh dịch bằng bao cao su............................................ 23

C.

Nhận và kiểm tra mẫu tinh dịch .....................................24

D. Hẹn thời gian trả kết quả ................................................23 PHẦN III: PHÂN TÍCH TINH DỊCH A. Thời điểm phân tích mẫu ................................................28 B.

Quy trình phân tích tinh dịch: ........................................29

C.

Khảo sát đại thể ...............................................................29 I.

Tính chất tổng quát .......................................................................... 29

II. Sự ly giải............................................................................................... 29 III. Độ nhớt ................................................................................................. 31 IV. Thể tích ................................................................................................. 32 V. pH ........................................................................................................... 33

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

D. Khảo sát vi thể .................................................................... 24 I.

Trộn mẫu ................................................................................................. 34

II. Tạo tiêu bản ướt.................................................................................... 35 III. Đánh giá tổng quát .............................................................................. 36 1.

Sự kết đám (aggregation) .............................................................. 36

2.

Sự kết dính (agglutination) ............................................................ 37

3. Các tế bào lạ .................................................................................. 39

IV. Đánh giá độ di động của tinh trùng ............................................... 39 1.

Phân loại di động của tinh trùng .................................................... 40

2.

Cách đánh giá độ di động của tinh trùng ....................................... 40

V. Đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng .................................................. 44 1.

Phương pháp nhuộm Eosin – Nigrosin .......................................... 45

2.

Phương pháp nhuộm Eosin đơn thuần ........................................... 47

3. HOS test (Hypo-osmotic swelling)................................................ 48

VI. Đánh giá mật độ tinh trùng .............................................................. 49 1.

Chuẩn bị buồng đếm Neubauer cải tiến......................................... 50

2.

Chuẩn bị dung dịch đếm mật độ tinh trùng: .................................. 52

3. Chuẩn bị mẫu pha loãng ................................................................ 52 4. Đặt mẫu vào buồng đếm ................................................................ 53 5. Đánh giá mật độ tinh trùng trên buồng đếm .................................. 54 6.

Cách tính mật độ tinh trùng và tổng số tinh trùng ......................... 56

7.

Đánh giá mẫu có mật độ tinh trùng thấp: ...................................... 57

8.

Tính mật độ tế bào lạ ..................................................................... 58

9.

Bảo quản buồng đếm ..................................................................... 59

VII.Đánh giá hình dạng tinh trùng ....................................................... 60 1.

Quy trình: ....................................................................................... 60

2.

Kỹ thuật kéo lame .......................................................................... 61

3. Phương pháp nhuộm Papanicolaou: .............................................. 64 4. Phân loại hình dạng tinh trùng ....................................................... 65

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

7

8

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN IV: QUY TRÌNH LỌC RỬA TINH TRÙNG A. Giới thiệu ....................................................................................... 74 I.

Mục đích ................................................................................................................. 74

II. Chọn lựa phương pháp ..................................................................................... 74 III. Hiệu quả của kỹ thuật phân tách tinh trùng .............................................. 75

B.

Quy trình chuẩn bị tinh trùng....................................................... 76 I.

Phương pháp rửa đơn giản (Simple wash) ................................................. 77

II. Phương pháp bơi lên trực tiếp (Direct swim-up) ....................................... 78 III. Phương pháp ly tâm gradient với nồng độ ................................................. 79 IV. Chuẩn bị tinh trùng trong một số trường hợp khác ................................ 81 1. Chuẩn bị tinh trùng đối với trường hợp tinh trùng ..................................... 82 2. Chuẩn bị tinh trùng đối với trường hợp tinh trùng ..................................... 82 3. Chuẩn bị tinh trùng trong trường hợp xuất tinh ngược .............................. 84

PHẦN V: QUY TRÌNH TRỮ LẠNH TINH TRÙNG A. Giới thiệu ........................................................................................ 88 B.

Các lý do trữ lạnh tinh trùng ........................................................ 89 I.

Bảo tồn khả năng sinh sản............................................................................... 90

II. Điều trị vô sinh ..................................................................................................... 90

C.

Đánh giá rủi ro của kỹ thuật trữ lạnh và bảo quản ................... 91 I.

Nguồn mẫu ........................................................................................................... 91

II. Thiết bị bảo hộ, an toàn đối với nhân viên ................................................. 91 III. Nguy cơ lây nhiễm chéo ................................................................................... 92 IV. Đảm bảo an toàn cho mẫu đông lạnh ......................................................... 73

http://www.ivfhungvuong.com.vn

9

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

D. Quy trình đông lạnh – rã đông tinh trùng I.

Quy trình đông lạnh tinh dịch

92 92

1.

Quy trình chuẩn

92

2.

Quy trình đông lạnh

94

II. Giải đông tinh dịch đông lạnh

95

PHỤ LỤC A. Trang thiết bị và an toàn thiết bị I.

Các thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm

98 98

1.

Các trang thiết bị thông thường

98

2.

Các dụng cụ, hóa chất

99

3. Các dụng cụ, hóa chất bảo vệ an toàn

100

II. Các mối nguy trong phòng xét nghiệm

100

III. Các thao tác an toàn cho nhân viên

101

IV. An toàn khi sử dụng các thiết bị

102

V. An toàn khi sử dụng nitơ lỏng

103

B.

Cách tính lực ly tâm

104

C.

Sử dụng kính hiển vi

106

I.

Load mẫu

106

II. Điều chỉnh thị kính

107

III. Điều chỉnh làm rõ nét hình ảnh

107

IV. Lấy nét tại thị kính

108

V. Chỉnh độ sáng

108

VI. Điều chỉnh tâm tụ sáng

87

D. Mẫu kết quả phân tích tinh dịch TÀI LIỆU THAM KHẢO

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

110

10

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN I : MỞ ĐẦU

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

11

12

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

13

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Tinh dịch đồ là một xét nghiệm đầu tay giúp đánh giá sơ bộ khả năng sinh sản của nam giới, bao gồm nhiều thông số như: mật độ tinh trùng, tổng số tinh trùng, độ nhớt, độ ly giải, phần trăm di động, phần trăm hình dạng bất thường… Các thông số của tinh dịch đồ có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh.

Các thông số tinh dịch đồ chuẩn của WHO 2010 Thể tích tinh dịch

 1,5 ml

pH

 7,2

Mật độ tinh trùng

 15.106/ml

Tổng số tinh trùng

 39.106/ml

Di động: PR

 32 %

PR+ NP

 40 %

Tỷ lệ tinh trùng sống

 58 %

Hình dạng bình thường

 4%

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

14

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

SƠ LƢỢC VỀ QUÁ TRÌNH XUẤT TINH Tinh trùng trưởng thành được trữ ở mào tinh hoàn. Khi xuất tinh, tinh trùng được hoà trộn với dịch tiết từ các tuyến phụ sinh dục khác rồi phóng ra ở dạng sệt. 90% thể tích tinh dịch được tiết ra từ các cơ quan phụ (Weiske, 1994), chủ yếu là tuyến tiền liệt và túi tinh, phần còn lại được tiết từ tuyến hành niệu đạo (Cowper’s gland) và mào tinh hoàn.

Khi xét nghiệm tinh dịch, cần quan tâm đến 2 thông số sau: Tổng số tinh trùng: phản ánh khả năng sản xuất tinh trùng của tinh hoàn và tình trạng thông suốt của hệ thống ống dẫn tinh.

Tổng thể tích tinh dịch: phản ánh sự tiết dịch của các tuyến.

Các thông số cần quan tâm khác như tỷ lệ sống, độ di động, hình dạng cũng như các thành phần có trong tinh dịch đóng một vai trò quan trọng trong chức năng của tinh trùng.

Khi giao hợp, một lượng nhỏ tinh dịch được xuất ra lúc đầu rất giàu tinh trùng đi thẳng qua âm đạo và đến tiếp xúc với màng nhầy cổ tử cung (Sobrero & MacLeod, 1962), và phần dịch còn lại bị giữ lại trong âm đạo.

Trong khi đó, với quy trình lấy mẫu tại phòng xét nghiệm, toàn bộ lượng tinh dịch xuất ra được thu nhận trong một lọ chứa. Khi đó, tinh trùng bị nhốt trong một khối đông tụ. Sau một thời gian, khối đông tụ này sẽ ly giải nhờ các enzyme protease do tuyến tiền liệt tiết ra.

Một số nghiên cứu cho thấy chất lượng mẫu tinh dịch phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu tinh dịch. Lẫy mẫu bằng cách thủ dâm tại phòng lấy mẫu ở cơ sở điều trị có thể có chất lượng kém hơn so với lấy mẫu tại nhà bằng giao hợp có sử dụng bao cao su chuyên dụng (Zavos & Goodpasture, 1989). Mặt khác, thời gian kích thích để lấy mẫu bằng thủ dâm cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch (Pound và cs, 2002).

Ngoài ra, chất lượng tinh dịch còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: khả năng sinh tinh của tinh hoàn, dịch tiết của các tuyến phụ, thể http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

trạng, bệnh tật và thời gian kiêng xuất tinh. Cần ghi nhận thời gian kiêng xuất tinh để diễn giải kết quả.

Kết quả xét nghiệm tinh dịch tại phòng thí nghiệm phụ thuộc vào một số yếu tố sau: Lƣợng mẫu tinh dịch thu đƣợc có trọn vẹn hay không: Khi xuất tinh, những giọt tinh dịch đầu tiên có chứa rất nhiều tinh trùng, trong khi phần còn lại chứa chủ yếu là dịch tiết từ túi tinh (Björndahl & Kvist, 2003). Do đó, khi làm rơi vãi lượng tinh dịch ban đầu sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích tinh dịch hơn là làm rơi vãi lượng tinh dịch lúc sau.

Hoạt động của các tuyến phụ sinh dục: Mật độ tinh trùng không đánh giá được khả năng sản xuất tinh trùng của tinh hoàn vì nó bị ảnh hưởng bởi chức năng của các cơ quan sinh dục khác. Tuy nhiên, tổng số tinh trùng được phóng ra (được tính bằng cách nhân mật độ tinh trùng với thể tích tinh dịch) phản ánh khả năng sinh tinh của tinh hoàn. Ví dụ: mật độ tinh trùng trong tinh dịch của người trẻ và người lớn tuổi có thể giống nhau, nhưng tổng số tinh trùng có thể khác nhau do thể tích tinh dịch được sản xuất ra giảm theo tuổi (Ng và cs., 2004).

Thời gian kiêng quan hệ tình dục: Khi không xuất tinh, tinh trùng được trữ trong mào tinh, sau đó tràn vào ống niệu đạo và theo nước tiểu ra ngoài (Cooper và cs., 1993; De Jonge và cs., 2004). Hình dạng và nhiễm sắc thể của tinh trùng không bị ảnh hưởng bởi thời gian kiêng lâu ngày (Tyler và cs., 1982; De Jonge và cs., 2004) trừ trường hợp có rối loạn chức năng mào tinh (Correa Perez và cs., 2004).

Khoảng thời gian kiêng trƣớc đó: Dịch từ mào tinh không hoàn toàn được xuất ra hết trong một lần xuất tinh, một số tinh

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

15

16

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

trùng vẫn còn lưu lại ở mào tinh kể từ lần xuất tinh trước (Cooper và cs., 1993). Do đó sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của tinh trùng trong lần xuất tinh tiếp theo (Tyler và cs., 1982). Mức độ ảnh hưởng của yếu tố này rất khó xác định và ít được quan tâm đến.

Kích thƣớc tinh hoàn: Ảnh hưởng đến tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh (Handelsman và cs., 1984; WHO, 1987; Behre và cs., 2000; Andersen và cs., 2000). Kích thước tinh hoàn phản ảnh mức độ hoạt động sinh tinh và từ đó ảnh hưởng đến hình dạng tinh trùng (Holstein và cs., 2003).

Có rất nhiều yếu tố tác động đến kết quả xét nghiệm tinh dịch và các yếu tố này không thể kiểm soát được vì thành phần tinh dịch của mỗi người có thể thay đổi mạnh theo thời gian (Baker & Kovacs, 1985; Alvarez và cs., 2003). Hình 1 cho thấy sự biến động về thành phần tinh dịch theo thời gian của 5 nam giới tình nguyện trẻ, khoẻ mạnh tham gia vào nghiên cứu phương pháp tránh thai bằng hormone cho nam (các mẫu tinh dịch được xét nghiệm theo phương pháp do WHO đề nghị). Từ kết quả nghiên cứu này, có thể rút ra một số kết luận sau: Không thể đánh giá chất lượng tinh dịch của một người từ một mẫu tinh dịch duy nhất.

Nên kiểm tra 2 hoặc 3 mẫu để ước lượng được mức chuẩn của người đó. (Poland và cs., 1985; Berman và cs., 1996; Carlsen và cs., 2004; Castilla và cs., 2006; Keel, 2006).

Trong một số nghiên cứu cho thấy không thể xác định khả năng thụ tinh thông qua các số liệu đánh giá trên tổng tinh trùng trong một lần xuất tinh.

Do đó, tinh dịch đồ chỉ cung cấp những thông tin cần thiết cho điều trị lâm sàng đối với từng bệnh nhân. Để có được những dữ liệu có

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

giá trị và hữu ích thì các bước từ khâu thu mẫu đến phân tích cần phải được thực hiện đúng theo quy trình chuẩn. Xét nghiệm được mô tả trong sổ tay này là quy trình đã được chấp nhận bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và đang được triển khai ở hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản trong và ngoài nước.

Hình 1: Sự biến động về tổng số tinh trùng và mật độ tinh trùng qua khoảng thời gian 1,5 năm.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

17

18

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN II : QUY TRÌNH NHẬN MẪU

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

19

20

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TINH DỊCH ĐỒ 

Hướng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm



Hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu



Nhận và kiểm tra mẫu thử



Hẹn thời gian trả kết quả

 A. Hƣớng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm 

Bệnh nhân trước khi làm tinh dịch đồ phải xét nghiệm bilan nhiễm trùng (các bệnh lây nhiễm: HIV, HbsAg, BW):  Nếu kết quả âm tính, hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu tinh dịch.  Nếu kết quả dương tính, hướng dẫn bệnh nhân gặp bác sĩ tư vấn.

Ghi thông tin bệnh nhân:  Họ, tên, năm sinh của chồng và vợ  Số ngày kiêng xuất tinh Cấp phát lọ lấy mẫu cho bệnh nhân Yêu cầu bệnh nhân kiểm tra tên tuổi được ghi trong lọ.

B. Hƣớng dẫn bệnh nhân lấy mẫu I.

Chuẩn bị lấy mẫu

Mẫu tinh dịch được thu thập tại một phòng được thiết kế riêng.

Phòng này gần phòng xét nghiệm để hạn chế sự thay đổi nhiệt độ đột ngột của mẫu và để kiểm soát khoảng thời gian giữa thu nhận mẫu và bắt đầu phân tích tinh dịch.

Hướng dẫn bệnh nhân cách lấy mẫu bằng lời nói rõ ràng, ngoài ra yêu cầu bệnh nhân xem các bảng hướng dẫn được treo trong phòng lấy

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

tinh dịch. Nhấn mạnh với bệnh nhân rằng cần phải lấy trọn vẹn mẫu tinh dịch được xuất ra, nếu có rơi vãi thì phải báo lại với nhân viên y tế.

Mẫu nên được thu nhận sau khi kiêng xuất tinh tối thiểu là 2 ngày và tối đa là 7 ngày (tốt nhất là từ 3-5 ngày).

Nếu thời gian kiêng quá ngắn thì mẫu tinh trùng thu được có khả năng chứa nhiều tinh trùng non, số lượng ít.

Ngược lại, nếu thời gian kiêng quá lâu, mẫu thu được sẽ có số lượng nhiều nhưng chất lượng kém do chứa nhiều tinh trùng già yếu và tinh trùng chết.

Chú ý: Tại thời điểm lấy mẫu, bệnh nhân không bị sốt, không hút thuốc, không uống rượu, bia.

Số ngày kiêng xuất tinh nên giống nhau ở các lần xét nghiệm tiếp theo (nếu có).

II. Yêu cầu khi lấy mẫu Hướng dẫn bệnh nhân thực hiện theo các bước sau đây: 1. Đi tiểu sạch 2. Rửa tay và dương vật với xà phòng, tránh lây nhiễm vi khuẩn trên da vào mẫu.

3. Rửa sạch lại với nước 4. Lau khô tay và dương vật bằng khăn sử dụng một lần 5. Tự kích thích bằng tay (thủ dâm) và xuất tinh vào lọ vô trùng để lấy mẫu.

6. Chuyển lọ có chứa mẫu tinh dịch cho nhân viên xét nghiệm.

III. Thu thập mẫu tinh dịch trong chẩn đoán hoặc

nghiên cứu Mẫu cần được thu nhận bằng thủ dâm và xuất tinh vào trong lọ chứa sạch. Lọ chứa mẫu cần được giữ ở nhiệt độ từ 20oC đến 37oC, tránh PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

21

22

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

những thay đổi của nhiệt độ làm ảnh hưởng đến tinh trùng đã được xuất tinh vào đó.

Ghi lại thời gian xuất tinh và thời gian nhận mẫu. Đặt lọ chứa mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm ở 37oC. Chú ý: Lọ đựng mẫu phải là lọ tiệt trùng, làm từ chất liệu nhựa đặc biệt, không gây độc cho tinh trùng, có miệng rộng để thu tinh dịch dễ dàng, tránh rơi vãi ra ngoài. Chỉ nên sử dụng lọ do phòng xét nghiệm cung cấp và chỉ sử dụng một lần.

Kiểm tra lọ chứa mẫu có độc cho tinh trùng hay không Thu nhận nhiều mẫu với mật độ tinh trùng cao và di động tốt. Để một nửa mẫu trong lọ chuẩn (không độc) và nửa còn lại đựng trong lọ cần được kiểm tra. Đánh giá độ di động của tinh trùng trong 2 lọ sau mỗi giờ ở nhiệt độ phòng hoặc ở 37oC, đánh giá trong vòng 4 giờ. Nếu không có sự khác biệt giữa 2 mẫu (P > 0,05) thì lọ cần kiểm tra đó được coi là không độc đối với tinh trùng.

IV. Thu mẫu vô trùng cho mục đích hỗ trợ sinh sản và

xét nghiệm sinh hóa Trong trường hợp này cần phải tránh nhiễm sinh hoá từ các nguồn lây nhiễm khác (ví dụ: vi khuẩn trên da). Lọ chứa mẫu, đầu tip và pipette trộn mẫu phải vô trùng. Người thực hiện cần tôn trọng những nguyên tắc vô trùng. Nếu nghĩ mẫu có nguy cơ nhiễm thì xem như đã nhiễm.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

V. Thu mẫu tinh dịch tại nhà Mẫu có thể được thu nhận tại nhà trong một số trường hợp ngoại lệ như: bệnh nhân không thể lấy mẫu bằng thủ dâm trong phòng lấy tinh trùng hoặc không có đủ điều kiện để lấy mẫu gần phòng xét nghiệm.

Hướng dẫn rõ ràng cho bệnh nhân về cách lấy mẫu và vận chuyển mẫu tinh dịch. Cần nhấn mạnh rằng mẫu phải được thu thập hoàn toàn vào lọ chứa và bệnh nhân phải báo lại nếu có làm rơi vãi mẫu. Ghi chú vào phiếu trả kết quả nếu mẫu không được thu nhận hoàn toàn.

Bệnh nhân cần ghi nhận thời gian xuất tinh và chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ.

Trong suốt quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, mẫu cần phải được giữ ở nhiệt độ 20oC – 37oC. Ghi chú vào phiếu trả kết quả là mẫu lấy ở nhà hoặc ở nơi khác ngoài phòng xét nghiệm.

VI. Thu mẫu tinh dịch bằng bao cao su Mẫu chỉ có thể được lấy vào bao cao su bằng cách giao hợp trong những trường hợp đặc biệt như bệnh nhân không thể lấy mẫu bằng thủ dâm.

Chỉ sử dụng bao cao su được thiết kế riêng để chứa tinh trùng (khác với các loại bao cao su ngoài thị trường, loại bao cao su này không có chất kháng tinh trùng).

Hướng dẫn bệnh nhân cách sử dụng bao cao su, đóng gói và gửi hoặc vận chuyển đến phòng xét nghiệm.

Bệnh nhân cần phải ghi nhận thời gian xuất tinh và chuyển mẫu tới phòng xét nghiệm trong vòng 1 giờ.

Trong suốt quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm, mẫu cần phải được giữ ở nhiệt độ 20oC – 37oC.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

23

24

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Ghi chú vào phiếu trả kết quả những mẫu lấy bằng bao cao su qua giao hợp ở nhà hoặc ở nơi khác ngoài phòng xét nghiệm. Đề nghị 1: Không được sử dụng bao cao su thông thường để đựng mẫu vì chúng có chứa các tác nhân ảnh hưởng đến độ di động của tinh trùng (Jones và cs., 1986).

Đề nghị 2: Không nên thu nhận mẫu tinh dịch bằng phương pháp giao hợp gián đoạn vì những giọt tinh dịch đầu tiên chứa rất nhiều tinh trùng nhất có thể bị thất thoát. Ngoài ra, mẫu có thể bị nhiễm tế bào lạ hoặc vi khuẩn và pH thấp của dịch nhầy âm đạo, có thể ảnh hưởng đến độ di động của tinh trùng.

C. Nhận và kiểm tra mẫu tinh dịch Kiểm tra tên, tuổi bệnh nhân. Ghi lại nếu không rõ.

Cho bệnh nhân kí tên xác nhận là đã giao mẫu của chính bệnh nhân.

Kiểm tra thể tích xuất tinh: Nếu thể tích xuất tinh ≥ 1ml: để mẫu vào tủ ấm chờ ly giải.

Nếu thể tích xuất tinh < 1ml: nếu bệnh nhân có làm rơi vãi mẫu tinh dịch ra ngoài hoặc những lần xuất tinh trước nhiều hơn mẫu tinh dịch lấy được thì hẹn bệnh nhân lấy mẫu lại.

Chú ý: Ghi nhận vào phiếu trả kết quả nếu mẫu bị rơi vãi. Yêu cầu bệnh nhân nên xét nghiệm lại sau 3 – 5 ngày.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

25

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Kiểm tra thể tích

Nhiều (V ≥ 1 ml)

Ít (V < 1 ml) Rơi vãi?

Để mẫu vào tủ

Không

ấm ở 370C

Có

Lần xuất tinh trước?

Ít

Nhiều (V ≥ 1 ml)

Lấy mẫu lại

Quy trình kiêƤm tra thêƤ tích mẫu

Ghi nhận những thông tin sau đây vào phiếu trả kết quả: Họ và tên bệnh nhân, năm sinh, thời gian kiêng, ngày và giờ lấy mẫu, có lấy mẫu hoàn toàn hay không, khó khăn khi lấy mẫu, và thời gian từ lúc mẫu được thu nhận đến lúc xét nghiệm.

D. Hẹn thời gian trả kết quả Hẹn thời gian và trả kết quả đúng hẹn cho Bệnh nhân.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

26

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN III : PHÂN TÍCH TINH DỊCH

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

27

28

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

A. Thời điểm phân tích mẫu Đặt lọ đựng mẫu trong tủ ấm ở 37oC và theo dõi thời gian ly giải của tinh dịch. Mẫu tinh dịch được khảo sát cả về số lượng lẫn chất lượng tại phòng xét nghiệm trong vòng 1 giờ sau khi nhận mẫu.

An toàn khi thao tác trên mẫu Mẫu thử có thể chứa nhiều tác nhân gây hại như HIV, Hepatitis virus, BW,…Do đó, nhân viên xét nghiệm cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các thao tác vô trùng. Đây chính là nguyên tắc an toàn cơ bản trong phòng xét nghiệm (WHO 2004).

B. Quy trình phân tích tinh dịch: Trong 5 phút đầu: Đặt lọ chứa mẫu trong tủ ấm (37oC) để ly giải.

Giữa 30 phút và 60 phút: Quan sát và đánh giá sự ly giải của tinh dịch. Đo thể tích tinh dịch. Đo pH của tinh dịch (nếu cần).

Làm tiêu bản ướt để đánh giá độ di động của tinh trùng và xác định độ pha loãng cần thiết để đánh giá mật độ tinh trùng. Đánh giá tỷ lệ sống/chết của tinh trùng (nếu tỷ lệ phần trăm của các tinh trùng di động tiến tới thấp).

Pha loãng tinh dịch để đánh giá mật độ tinh trùng. Đánh giá tổng số tinh trùng.

Thực hiện thử nghiệm gắn hạt miễn dịch MAR (Mixed Antiglobulin Reaction) (nếu cần).

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Đánh giá các tế bào có hoạt tính peroxidase (nếu có sự xuất hiện của các tế bào tròn).

Ly tâm tinh dịch (nếu không tìm thấy tinh trùng trên tiêu bản ướt).

Trong 3 giờ: Gửi mẫu đến phòng thí nghiệm vi sinh (nếu cần).

Trong 4 giờ: Tạo tiêu bản, nhuộm và đánh giá hình dạng của tinh trùng.

Chú ý: Khoảng thời gian từ lúc lấy mẫu tinh dịch và thời điểm bắt đầu phân tích không nên kéo dài quá 3 giờ.

C. Khảo sát đại thể Nên tiến hành phân tích tinh dịch ngay sau khi mẫu ly giải, thường là 30 phút, nhưng không quá 1 giờ sau khi xuất tinh để tránh hiện tượng mất nước hoặc sự thay đổi nhiệt độ làm ảnh hưởng đến chất lượng mẫu tinh dịch.

I.

Tính chất tổng quát

Bình thường: Tinh dịch đồng nhất, màu trắng hoặc xám đục.

Tinh dịch màu vàng: mẫu nhiễm trùng, có lẫn nước tiểu hoặc do đang uống một số loại vitamin.

Tinh dịch màu đỏ nâu hoặc hồng: mẫu có lẫn hồng cầu.

Tinh dịch loãng, trắng trong: thường là thiểu tinh hoặc vô tinh.

Tinh dịch có cặn nhiều: có thể do viêm nhiễm đường tiết niệu.

II.

Sự ly giải

Sự ly giải là sự tự hóa lỏng của tinh dịch sau khi xuất tinh. Ngay sau khi xuất tinh vào lọ chứa, tinh dịch thường ở thể thạch đặc. Vài phút sau PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

29

30

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

đó ở nhiệt độ phòng, tinh dịch bắt đầu ly giải (trở nên lỏng hơn). Tại thời điểm này có thể thấy một hỗn hợp các mảnh thạch nhỏ trong tinh dịch.

Khi sự ly giải tiếp diễn, tinh dịch trở nên đồng nhất hơn và lỏng hơn, và trong giai đoạn cuối thì chỉ còn những vùng thạch nhỏ còn sót lại.

Tinh dịch ly giải là do các enzyme của tiền liệt tuyến tiết ra. Thường thì sau khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng, tinh dịch sẽ ly giải hoàn toàn, đôi khi quá trình này cũng có thể kéo dài đến 60 phút hoặc hơn. Thời gian ly giải kéo dài thường do các bất thường ở tuyến tiền liệt. Ở mẫu chưa ly giải thường thấy những hạt lợn cợn giống như thạch ở đáy lọ.

Cách đánh giá: Đặt lọ đựng mẫu vào tủ ấm 37oC, sau 15 phút kiểm tra sự ly giải bằng cách lắc nhẹ. Nếu mẫu chưa ly giải hoàn toàn thì tiếp tục ủ ấm thêm 15 phút nữa. Sau 30 phút tinh dịch chưa ly giải thì kiểm tra lại 1 lần nữa sau 30 phút tiếp theo. Nếu tinh dịch không ly giải hoàn toàn sau 60 phút thì ghi nhận mẫu không ly giải vào phiếu trả kết quả.

Chú ý 1: Những mẫu ly giải bình thường có thể chứa các hạt giống thạch (thể gelatin) không ly giải và không có ảnh hưởng đáng kể trong lâm sàng.

Chú ý 2: Quá trình ly giải cũng có thể quan sát được trong khảo sát vi thể khi thấy tinh trùng bất động có khả năng di động khi tinh dịch ly giải. Do đó, nếu quan sát thấy hiện tượng này thì cần để thêm một thời gian để quá trình ly giải diễn ra hoàn toàn.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý 3: Trong quá trình ly giải, nếu trộn nhẹ nhàng liên tục hoặc lắc đều mẫu trong lọ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm ở 37oC có thể thúc đẩy quá trình ly giải mẫu.

Chú ý 4: Nếu quá trình ly giải không xảy ra trong 60 phút thì chủ động cho mẫu theo các cách sau: Thêm một lượng thể tích môi trường sinh lý bằng với thể tích tinh dịch rồi dùng pipette hút lên xuống nhiều lần.

Dùng bơm kim tiêm 18G (đường kính trong 0,84mm) hoặc 19G (đường kính trong 0,69mm) hút lên – xuống nhẹ nhàng nhiều lần (6-10 lần).

Đề nghị : Các phương pháp trên có thể ảnh hưởng đến đặc tính sinh hoá, độ di động và hình dạng của tinh trùng, do đó cần ghi nhận vào phiếu trả kết quả khi sử dụng các phương pháp này. Khi pha loãng tinh dịch với môi trường, cần tính đến hệ số pha loãng khi đếm mật độ tinh trùng.

III. Độ nhớt Ngược lại với các mẫu chưa ly giải hoàn toàn, mẫu tinh dịch nhớt là một dung dịch đồng nhất, kết dính và độ nhớt không thay đổi theo thời gian. Sau khi ly giải, độ nhớt của tinh dịch được đánh giá bằng cách hút tinh dịch vào một pipette nhựa dùng một lần (có đường kính khoảng 1.5 mm), rồi để tinh dịch nhỏ giọt theo trọng lực, sau đó quan sát chiều dài của giọt.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

31

32

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

 Bình thường: giọt tinh dịch nhỏ rời rạc từng giọt.  Bất thường: tinh dịch dính chặt vào nhau khi cố dùng pipette hút lên, giọt tinh dịch kéo dài trên 2cm.

Ngoài ra còn có thể đánh giá độ nhớt bằng cách nhúng que thủy tinh vào mẫu và quan sát chiều dài giọt tinh dịch rơi ra từ que. Mẫu có độ nhớt bất thường khi có giọt kéo dài trên 2cm.

Chú ý : Độ nhớt cao thường do bất thường dịch của các tuyến phụ tiết ra. Điều này gây khó khăn cho việc đánh giá tỉ lệ di động và mật độ tinh trùng. Do đó, có thể làm giảm độ nhớt bằng cách xử lí giống như mẫu ly giải chậm hay không ly giải.

IV. Thể tích Cần đo lường chính xác thể tích tinh dịch để tính toán tổng số tinh trùng và tế bào lạ trong một lần xuất tinh. Có 2 cách đo thể tích tinh dịch:  Đo bằng pipette (hay ống nghiệm có chia vạch): Hút mẫu từ lọ vào pipette, đọc thể tích. Tuy nhiên phương pháp này có thể không chính xác do tinh dịch còn sót lại trong lọ. Sai lệch thể tích nằm trong khoảng 0,3 - 0,9ml. (Brazil và cs., 2004a; Iwamoto và cs., 2006; Cooper và cs., 2007).  Đo bằng cách cân mẫu trong lọ:. Đây là cách đo thể tích tốt nhất, cách thực hiện như sau: 1. Cân lọ trước khi lấy mẫu 2. Cân lọ có đựng mẫu 3. Trừ cân nặng của lọ 4. Thể tích của mẫu là số gam của tinh dịch. (Khối lượng riêng tinh dịch dao động trong khoảng 1.043 và 1.102 (Cooper và cs., 2007)).

Giá trị tham khảo của thể tích (chuẩn theo WHO 2010): 1,5 ml.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý 1: Lọ đựng mẫu có thể có khối lượng khác nhau, do đó cần cân lần lượt từng lọ trước khi đưa cho bệnh nhân. Sử dụng bút lông kim không xóa được để viết lên lọ hoặc lên nhãn. Nếu sử dụng nhãn thì phải dán nhãn lên lọ, sau đó cân khối lượng của lọ trước khi lấy mẫu.

Chú ý 2: Thể tích tinh dịch ít có thể do tắc hoặc thiếu ống dẫn 2 bên bẩm sinh (CBAVD) (de la Taille và cs., 1998; Daudin và cs., 2000; von Eckardstein và cs., 2000; Weiske và cs., 2000) Thể tích tinh dịch ít cũng có thể do bệnh nhân làm rơi vãi mẫu, xuất tinh ngược dòng một phần hoặc do thiếu hụt androgen.

Chú ý 3: Thể tích tinh dịch nhiều có thể do sự rỉ ứ trong các trường hợp viêm cơ quan sinh dục phụ hay do thời gian kiêng xuất tinh quá lâu.

pH

V.

pH của tinh dịch phản ánh sự cân bằng pH của các dịch tiết từ các tuyến khác nhau, chủ yếu là dịch tiết túi tinh (baz) và dịch tiết tuyến tiền liệt (acid). pH nên được đo sau khi ly giải, thường là 30 phút nhưng không được quá 1 giờ sau xuất tinh vì mẫu bị mất CO2 sau khi xuất tinh, ảnh hưởng đến đánh giá. pH được đo vào một thời điểm nhất định trong vòng 1 giờ sau khi xuất tinh. Đối với mẫu bình thường, sử dụng giấy pH có thang chia độ từ 6.0 đến 10.0: Trộn đều mẫu.

Nhỏ 1 giọt tinh dịch lên giấy quỳ.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

33

34

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Đợi màu giấy quỳ đồng nhất (< 30 giây).

So sánh màu của giấy quỳ với thang đo pH và đọc pH. Theo WHO 2010, mẫu tinh dịch bình thƣờng có pH từ 7,2 trở lên.

Chú ý 1: pH tinh dịch tăng theo thời gian do sự giảm dung dịch đệm tự nhiên, do đó giá trị pH có thể cung cấp một số thông tin hữu ích cho lâm sàng.

Chú ý 2: Nếu mẫu tinh dịch có pH < 7,0, cùng với thể tích và số lượng tinh trùng thấp thì có thể do tắc hoặc thiếu ống dẫn tinh bẩm sinh (de la Taille và cs., 1998; Daudin và cs., 2000; von Eckardstein và cs., 2000; Weiske và cs., 2000).

D. Khảo sát vi thể I.

Trộn mẫu

Trước khi lấy một mẫu tinh dịch để đánh giá vi thể cần phải trộn đều mẫu trong lọ chứa nhưng không được quá mạnh và tránh tạo bọt khí.

Có thể sử dụng pipette nhựa dùng một lần (sử dụng pipette vô trùng nếu cần) với đường kính đầu ống khoảng 1,5 mm, hút lên xuống khoảng 10 lần. Ở mẫu tinh dịch có độ nhớt cao, rất khó trộn đều mẫu để tạo tiêu bản ướt. Nếu mẫu không được trộn kỹ, khi quan sát trên 2 tiêu bản khác nhau sẽ nhận thấy sự khác biệt về độ di động, tỷ lệ sống, mật độ cũng như hình dạng tinh trùng.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý Không được trộn mẫu bằng máy vortex ở tốc độ cao vì sẽ làm tổn thương tinh trùng.

II.

Tạo tiêu bản ướt

1. Trộn đều mẫu.

2. Hút một thể tích tinh dịch chuẩn (10 μl) nhỏ ngay lên lame sau khi trộn, không để cho tinh trùng lắng trở lại.

3. Trộn lại một lần nữa khi lấy thêm mẫu tiếp theo.

4. Đậy lame bằng lamelle, tạo thành một buồng đếm có độ sâu khoảng 20 μm (ví dụ sử dụng lamelle 22mm x 22mm cho giọt tinh dịch có thể tích là 10 μl). Trọng lượng của lamelle sẽ trải đều mẫu.

5. Cẩn thận, tránh tạo bọt khí giữa lame và lamelle.

6. Đánh giá tiêu bản ướt ngay khi dịch bên trong ổn định (khoảng 60 giây).

7. Đánh giá mẫu ở nhiệt độ phòng (24 - 26oC). Có thể sử dụng kính hiển vi có bàn ấm ở 37oC để đánh giá.

8. Kiểm tra sự phân bố của tinh trùng trên 2 tiêu bản ướt. Nếu sự phân bố này là đều, tiến hành đánh giá vi thể. Ngược lại, nếu có khác biệt lớn giữa 2 tiêu bản thì làm lại 2 tiêu bản mới.

Chú ý : Nếu độ sâu của buồng thấp hơn 20 μm sẽ kiềm hãm sự di động của tinh trùng, quá sâu (>20 μm) sẽ khó đánh giá vì tinh trùng di chuyển vào/ra vùng quan sát ngoài tầm kiểm soát . Nếu các tinh trùng phân bố không đều trên nhiều vi trường, cần làm lại tiêu bản khác do mẫu thử chưa được trộn đều hay do ly giải, độ nhớt bất thường hoặc có hiện tượng kết dính, kết đám.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

35

36

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Độ sâu của tiêu bản ƣớt Độ sâu của 1 tiêu bản (D, μm) được tính bằng cách chia thể tích mẫu (V, μl) cho vùng diện tích mẫu bị bao phủ (A, mm2): D = V/A. Ví dụ, với thể tích 10 μl tinh dịch trải trên lame với lamelle 22mm x 22mm (diện tích 484mm2) tạo ra một buồng có chiều sâu 20,7μm; với thể tích 6,5 μl tinh dịch trải trên lame với lamelle 18mm x 18mm (diện tích 324mm2) tạo ra một buồng có chiều sâu 20,1μm.

III. Đánh giá tổng quát Sử dụng kính hiển vi quang học để đánh giá tinh dịch trên tiêu bản tươi. Đầu tiên, đánh giá ở độ phóng đại x100 (x10 vật kính và x10 thị kính).

Cách đánh giá này giúp ta quan sát tổng thể về mẫu thử: Sự hình thành vệt nhầy Sự kết dính hoặc kết đám của tinh trùng Sự hiện diện của các tế bào không phải tinh trùng như: tế bào biểu mô, bạch cầu, tinh trùng non, đầu hoặc đuôi tinh trùng. Đánh giá độ di động của tinh trùng.

Xác định nồng độ pha loãng cần thiết để đếm mật độ tinh trùng.

1.

Sự kết đám (aggregation)

Khi những tinh trùng di động, tinh trùng bất động cùng với các tế bào khác hoặc mảnh vụn tế bào tụ lại với nhau thì gọi là sự kết đám, nguyên nhân của hiện tượng kết đám thường do nhiễm trùng.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Hình 2 Sự kết đám không đặc hiệu của tinh trùng trong tinh dịch

Hình ảnh tinh trùng kết đám với tế bào biểu mô (a), mảnh vụn (b) hoặc tinh trùng (c,d).

2. Sự kết dính (agglutination) Kết dính là hiện tượng các tinh trùng di động dính vào nhau: đầu dính đầu, đuôi dính đuôi hoặc dính cả đầu và đuôi lẫn lộn. Đuôi tinh trùng thường di động mạnh, lắc mạnh nhưng khi tinh trùng bị kết dính quá chặt thì cử động của chúng sẽ bị hạn chế.

Loại kết dính chính (phản ảnh mức độ kết dính (từ 1-4) và vị trí kết dính (A-E) ) cần được ghi nhận trong bảng kết quả (Rose và cs., 1976) (Hình 3):  Các hình thức kết dính: A. Đầu – đầu.

B. Đuôi – đuôi (đầu di động tự do).

C. Chóp đuôi – chóp đuôi.

D. Hỗn hợp: đầu – đầu đồng thời đuôi – đuôi.

E. Quấn nhau: đầu và đuôi đan vào thành mạng lưới.  Các mức độ kết dính: Loại 1

Tách biệt

<10 tinh trùng/kết dính, nhiều tinh trùng tự do

Loại 2

Vừa phải

10 – 50 tinh trùng/kết dính, có tinh trùng tự do

Loại 3

Lớn

>50 tinh trùng/kết dính, vài tinh trùng tự do

Loại 4

Toàn bộ

Tất cả tinh trùng bị kết dính và kết dính nối liền

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

37

38

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Loại 1

Loại 2

Loại 3

Loại 4

A

B

C

D

E

Hình 3: Biểu đồ về sự phân loại kết dính Hiện tượng kết dính xảy ra do nguyên nhân tự miễn, thường gặp trong trường hợp thắt ống dẫn tinh. Khi hàng rào máu-tinh hoàn được tạo bởi tế bào Sertoli bị phá vỡ, tinh trùng tiếp xúc với tế bào máu, tạo nên kháng thể phù hợp kháng nguyên bề mặt tinh trùng. Phản ứng kháng nguyên – kháng thể sẽ gây ra sự kết dính các tinh trùng di động với nhau.

Tuy nhiên, cưa có đầy đủ chứng cứ ch thấy hiện tượng kết dính do tự miễn có là nguyên nhân của vô sinh hay không, cần phải thực hiện các thử nghiệm sâu hơn.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý : Tinh trùng di động bị kẹt với các tế bào, mảnh vụn hoặc tinh trùng không di động dính với nhau là hiện tượng kết đám, không được coi là kết dính.

3. Các tế bào lạ Trong tinh dịch, ngoài tinh trùng có thể chứa các tế bào khác. Một số tế bào này có thể lien quan đến đánh giá lâm sang, bao gồm tế bào biểu mô từ tuyến niệu sinh dục, vi khuẩn, vi sinh vật, hồng cầu, bạch cầu và tinh trùng non. Bạch cầu và tinh trùng non còn được gọi là tế bào tròn (Johanisson và cs., 2000).

Có thể phân loại các tế bào này bằng cách đánh giá trên tiêu bản nhuộm hoặc sử dụng phản ứng peroxidase để xác định số lượng và phân biệt rõ hơn.

IV. Đánh giá độ di động của tinh trùng Độ di động là kết quả khảo sát khả năng di động tự nhiên của tinh trùng, được thể hiện thành tỷ lệ phần trăm trên tổng số tinh trùng trong cùng một thể tích. Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới được cho là liên quan đến tỷ lệ có thai nên cần đánh giá chính xác. Đề nghị : Nên đánh giá độ di động ngay sau khi tinh dịch ly giải hoàn toàn để hạn chế ảnh hưởng của sự mất nước, thay đổi pH hay nhiệt độ lên di động của tinh trùng. Thời gian ly giải thường từ 30 - 60 phút sau xuất tinh.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

39

40

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

1.

Phân loại di động của tinh trùng

Độ di động của tinh trùng được phân thành 3 loại như sau: Di động tiến tới (PR_Progessive): Tinh trùng di động tiến tới theo một đường thẳng hoặc theo 1 vòng lớn.

Di động không tiến tới (NP_Non-Progessive): tinh trùng di chuyển nhưng không tiến tới như bơi trong vòng nhỏ, di chuyển khó khăn hoặc chỉ thấy đuôi cử động.

Không di động (IM_Immotile): tinh trùng bất động.

Chú ý : Khi xem xét, bàn luận về độ di động tinh trùng thì tổng số di động (PR + NP) hay di động tiến tới (PR) là đại lượng quan trọng

2. Cách đánh giá độ di động của tinh trùng

a. Cách đánh giá độ di động 1. Tạo 2 tiêu bản ướt cho mỗi mẫu với độ sâu khoảng 20μm.

2. Chờ mẫu ổn định (khoảng 60 giây).

3. Đếm tinh trùng ở vùng cách cạnh lamelle 5mm trở lên (hình 4) để tránh quan sát vùng bị khô.

4. Bắt đầu đánh giá nhanh một vi trường bất kỳ, không đợi tinh trùng bơi vào vùng đếm.

5. Đánh giá độ di động của tất cả các tinh trùng trong ở cùng một vị trí trong vi trường.

6. Đếm PR trước, sau đó đếm NP và cuối cùng là IM trong cùng một phần ô. Khi đã có kinh nghiệm thì có thể đánh giá cả 3 loại tinh trùng cùng một lúc và đánh giá trên vùng vi trường rộng.

7. Thay đổi vùng đếm liên tục. Tránh chọn những vùng chỉ thấy tinh trùng di động (phải chọn ngẫu nhiên). Không nên đợi tinh trùng bơi vào vùng đánh giá mới đếm.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

8. Đếm số lượng tinh trùng của mỗi loại bằng máy đếm phòng thí nghiệm.

9. Đếm ít nhất 200 tinh trùng trong ít nhất 5 vi trường ở mỗi tiêu bản để hạn chế sai số mẫu, trong khoảng cho phép.

10. Đếm 2 lần trên 2 tiêu bản khác nhau, so sánh kết quả của 2 tiêu bản. Nếu 2 kết quả có độ sai biệt trong giới hạn cho phép thì lấy trung bình kết quả đó, nếu độ sai biệt lớn thì làm lại tiêu bản mới.

11. Tính phần trăm trung bình và độ sai biệt giữa 2 tiêu bản.

12. Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 loại để so với độ sai biệt cho phép.

13. Nếu độ sai biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá lại.

14. Nếu độ sai biệt chấp nhận được: lấy kết quả là tỉ lệ trung bình của PR, NP, IM (làm tròn đến 0,5%)

Hình 4 Đánh giá độ di động

(a) Thị kính có ô kẻ giúp đếm tinh trùng di động và không di động dễ dàng hơn (b) Chọn vi trường đếm tinh trùng, cách mép ít nhất 5mm.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

41

42

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Bảng 1: Tỷ lệ khác biệt cho phép giữa tỷ lệ trung bình và khác biệt giữa 2 lần đếm Tỷ lệ trung

Khác biệt

Tỷ lệ trung

Khác biệt

bình (%)

cho phép

bình (%)

cho phép

0

1

66 - 76

9

1

2

77 - 83

8

2

3

84 - 88

7

3–4

4

89 - 92

6

5–7

5

93 - 95

5

8 - 11

6

96 - 97

4

12 - 16

7

98

3

17 - 23

8

99

2

24 - 34

9

100

1

35 - 65

10

Chú ý 1: Chỉ đếm những tinh trùng còn nguyên vẹn, không đếm tinh trùng đầu kim di động.

Nếu mật độ tinh trùng nhiều thì đánh giá trên một vùng giới hạn của vi trường, nếu mật độ ít nên đánh giá trên toàn bộ vi trường. Nếu đếm hết vi trường mà vẫn chưa đủ 200 tinh trùng thì ta di chuyển sang vi trường khác cách vi trường vừa đếm khoảng 1,5 vi trường

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý 2: Khi đếm đủ 200 tinh trùng trước khi tất cả các loại di động còn lại trong vi trường chưa được đếm hết thì phải tiếp tục đếm, sau đó tính ra phần trăm các loại di động. Để tránh đếm thừa tinh trùng di động thì ta đảo thứ tự phân tích (NP và IM trước), sử dụng thị kính có kẻ ô và tránh đậy lamelle xiên.

Trong một vài trường hợp đặc biệt, với mẫu không đồng nhất, có sự khác biệt giữa 2 tiêu bản vượt qua giới hạn cho phép mặc dù đã tạo tiêu bản thứ 3. Lúc này, ta tính trung bình các tiêu bản và ghi chú vào kết quả.

b. Cách tính sai số Tỷ lệ phần trăm được làm tròn đến hang đơn vị. Đối với trường hợp phần thập phân của tỷ lệ phần trăm là 0.5% thì thực hiện làm tròn 0.5% đến số chẳn gần nhất. Ví dụ: 32,5% làm tròn thành 32% nhưng 3,5% làm tròn thành 4%. Lưu ý rằng tổng phần trăm làm tròn có thể không bằng 100%.

Nếu sự sai biệt về tỷ lệ phần trăm giữa 2 tiêu bản nhỏ hơn hoặc bằng số liệu ở bảng 1 thì số liệu đó được chấp nhận và lấy phần trăm trung bình làm kết quả.

Sự sai biệt lớn hơn cho phép có thể do đếm nhầm hoặc do hút sai, hay do mẫu chưa được trộn đều. Khi đó phải bỏ tiêu bản này và đánh giá lại bằng cách tạo tiêu bản mới (Không đếm tiêu bản thứ 3 rồi lấy trung bình 3 giá trị hoặc lấy trung bình của 2 số liệu gần giống nhau nhất.)

Ví dụ 1: Khi đếm 200 tinh trùng trên 2 tiêu bản khác nhau qua 2 lần đếm ta được kết quả như sau: Đếm lần 1: PR là 30%, NP là 5% và IM là 65% Đếm lần 2: PR là 50%, NP là 15% và IM là 35%

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

43

44

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Loại chiếm nhiều nhất là IM, ta tính tỷ lệ phần trăm trung bình là 50% ((65% + 35%)/2), và sai khác giữa 2 lần đếm là 30% (65% - 35%). Tra với số khác biệt cho phép trong bảng 1 ở 50% là 10%. Vậy kết quả này không chấp nhận được, làm lại tiêu bản khác để đánh giá lại.

Ví dụ 2: Đếm 200 tinh trùng trên 2 tiêu bản khác nhau qua 2 lần đếm ta được kết quả như sau: Đếm lần 1: PR là 37%, NP là 3% và IM là 60% Đếm lần 2: PR là 28%, NP là 6% và IM là 66% Loại chiếm nhiều nhất là IM, ta tính tỷ lệ phần trăm trung bình là 63%, và sai khác giữa 2 lần đếm là 6%. Tra với số khác biệt cho phép trong bảng 1 ở 60% là 10%. Vậy sự khác biệt là chấp nhận được, độ di động của tinh trùng trong trường hợp này là: PR 32%, NP 4%, IM 63%.

V.

Đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng

Tỷ lệ tinh trùng sống trong mẫu được đánh giá thông qua tính nguyên vẹn của màng tế bào tinh trùng.

Tỷ lệ sống của tinh trùng được đánh giá bằng các phương pháp nhuộm hoặc dùng dung dịch nhược trương. Tinh trùng sống có khả năng kháng thuốc nhuộm hay căng phồng trong dung dịch nhược trương. Đề nghị 1 : Tỷ lệ sống của tinh trùng nên được đánh giá ngay khi mẫu ly giải xong (từ 30 phút đến 1 giờ sau xuất tinh) để tránh sự ảnh hưởng của mất nước hoặc thay đổi nhiệt độ lên sự sống của tinh trùng.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Đề nghị 2 : Có thể đánh giá tỷ lệ sống một cách thường qui với tất cả các mẫu, đặc biệt với những mẫu có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới <50%. Ngoài ra, tỷ lệ sống này còn được dùng để kiểm tra kết quả đánh giá tỷ lệ di động: tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động không được cao hơn tỷ lệ phần trăm tinh trùng sống.

Chú ý: Tỷ lệ sống của tinh trùng rất quan trọng đối với lâm sàng trong trường hợp tinh trùng bất động hoàn toàn trong mẫu: Tỷ lệ tinh trùng sống lớn nhưng bất động: có khiếm khuyết cấu trúc đuôi tinh trùng hoặc bất thường trong quá trình trưởng thành tinh trùng.

Tỷ lệ tinh trùng chết và bất động lớn: có bệnh lý ở mào tinh hoặc bất thường trong quá trình sinh tinh.

1.

Phƣơng pháp nhuộm Eosin – Nigrosin

a.

Nguyên lý của phương pháp nhuộm:

Tinh trùng sống: có màng tế bào còn nguyên vẹn nên không bắt màu thuốc nhuộm Eosin, khi quan sát trên kính hiển vi cho hình ảnh tinh trùng màu trắng nổi bật trên nền tím đen.

Tinh trùng chết: có màng tế bào bị tổn thương sẽ bắt màu thuốc nhuộm Eosin, khi quan sát cho hình ảnh đầu tinh trùng bắt màu đỏ hoặc màu hồng nhạt.

b.

Chuẩn bị thuốc nhuộm:

1. Eosin 1%: 1 g Eosin và 100 ml nước cất.

2. Nigrosin 10% 10g Nigrosin và 100 ml nước cất (Nigrosin cho hình nền màu tím đen để dễ phân biệt tinh trùng sống chết).

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

45

46

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

3. Đun sôi hỗn hợp, để nguội ở nhiệt độ phòng.

4. Lọc qua màng lọc, bảo quản trong bình tránh sáng ở nhiệt độ phòng.

c.

Quy trình:

1. Trộn đều mẫu 2. Dùng micropipette hút 50 µl tinh dịch đã trộn đều cho vào hộp Nune.

3. Nhỏ 1 giọt Eosin 1% tương đương 50 µl vào hộp Nune chứa tinh dịch. Lắc đều hỗn hợp trong 30 giây.

4. Nhỏ 2 giọt Nigrosin 10% tương đương 100 µl vào trong hỗn hợp trên và lắc đều trong 30 giây.

5. Trộn đều mẫu và tạo tiêu bản, để khô tự nhiên.

6. Quan sát tiêu bản với vật kính dầu 100X. 7. Đếm tinh trùng sống và chết bằng máy bách phân.

8. Đánh giá 200 tinh trùng trên mỗi mẫu.

9. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết, tỉ lệ trung bình và tỷ lệ khác biệt giữa 2 lần đếm.

10. So sánh với tỷ lệ khác biệt cho phép theo Bảng 1.

Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình.

11. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Hình 5 Quan sát smear nhuộm eosin-nigrosin dƣới kính hiển vi

Tinh trùng có đầu màu đỏ (D1) hay hồng đậm (D2) được coi là chết (tổn thương màng), còn tinh trùng có đầu trắng (L) hoặc hồng nhạt được coi là sống (màng nguyên vẹn).

2. Phƣơng pháp nhuộm Eosin đơn thuần Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, tuy nhiên không thể lưu trữ được do tiêu bản đánh giá là tiêu bản ướt.

a.

Chuẩn bị thuốc nhuộm:

1. NaCl 0,9%: hoà tan 0,9 g NaCl vào 100ml nước cất.

2. Eosin Y 0,5%: hoà tan 0,5 g Eosin Y vào 100ml NaCl 0,9%.

b.

Quy trình:

1. Trộn đều mẫu.

2. 5 μl tinh dịch + 5 μl eosin, trộn đều trên lam bằng đầu tip. Đậy lamelle, để yên mẫu trong 30 giây. Có thể sử dụng nigrosin để tăng độ tương phản của nền tiêu bản.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

47

48

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

3. Đếm tinh trùng bằng kính hiển vi phản quang (20X hoặc 40X). Đánh giá 100 tinh trùng. Tinh trùng sống chỉ bắt màu ở một phần vùng cổ, phần còn lại của vùng đầu không bắt màu.

4. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.

Chú ý: Nếu tinh trùng bắt màu thuốc nhuộm một phần ở cổ và phần đầu không nhuộm màu thì được coi là do thủng màng cổ. Đây không phải là dấu hiệu của tinh trùng chết hay phân huỷ toàn bộ màng nên những tinh trùng này được coi là sống.

3. HOS test (Hypo-osmotic swelling test) Phương pháp này được dùng để đánh giá khả năng sống của tinh trùng thay cho phương pháp nhuộm. Tinh trùng sống sẽ căng phồng và cuộn đuôi lại. HOS test được sử dụng cho những mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn nhằm chọn tinh trùng sống để ICSI. Tinh trùng với màng nguyên vẹn căng phồng lên trong 5 phút trong môi trường nhược trương và đuôi ổn định cân bằng khoảng 30 phút. Theo đó, có thể áp dụng để 30 phút ủ ấm cho chẩn đoán thường quy nhưng chỉ cần ủ 10 giây cho mẫu dùng trong kỹ thuật ICSI.

a.

Chuẩn bị thuốc thử:

1. Pha 50ml môi trường nuôi cấy với nước vô khuẩn theo tỷ lệ 1:1.

2. Trữ trong tủ lạnh 2 – 8oC đến khi sử dụng.

b.

Quy trình:

1. Làm ấm 1ml thuốc thử ở 37oC trong 5 phút.

2. Lắc đều mẫu tinh dịch.

3. Cho 100μl tinh dịch vào thuốc thử, trộn đều bằng pipette.

4. Ủ ở 37oC trong 5 – 30 phút. Hút 10 μl đặc lên lame, phủ lamelle và quan sát dưới kính phản pha (vật kính 20X hoặc 40X). http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

5. Đếm tinh trùng sống/chết bằng máy bách phân (đếm 200 tinh trùng).

6. Tính phần trăm tinh trùng sống, chết.

7. So sánh với tỉ lệ khác biệt cho phép theo Bảng 1 Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình.

Hình 6 Sự thay đổi hình dạng điển hình của tinh trùng ngƣời trong dung dịch nhƣợc trƣơng.

(a) Không thay đổi. (b)-(g) Những kiểu thay đổi của đuôi.

VI. Đánh giá mật độ tinh trùng Tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh và mật độ tinh trùng đều liên quan đến tỷ lệ có thai và là cơ sở để tiên đoán khả năng có thai. Đánh giá tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh dựa trên thể tích và mật độ tinh trùng. Trong trường hợp xuất tinh bình thường, không bị bế tắc ống dẫn tinh và thời gian kiêng xuất tinh không quá ngắn thì tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh tương quan tỷ lệ thuận với thể tích tinh hoàn. Do đó, có thể ước lượng khả năng sinh tinh trùng của tinh

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

49

50

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

hoàn cũng như sự thông suốt của ống dẫn tinh từ việc xác định tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh.

Trong khi đó, mật độ tinh trùng phụ thuộc vào thể tích dịch tiết từ túi tinh và tuyến tiền liệt. Vì vậy, đây không phải là cơ sở để đánh giá chức năng của tinh hoàn.

Chú ý: Về mặt tổng quát, tổng số tinh trùng có thể không phản ảnh đúng khả năng sản xuất tinh trùng của tinh hoàn trong trường hợp bệnh nhân lấy mẫu bằng cách kích thích xung điện (do bị tổn thương cột sống), những bệnh nhân thiếu androgen hoặc mẫu được thu sau 1 khoảng thời gian dài kiêng xuất tinh hay bị xuất tinh ngược dòng 1 phần.

1.

Chuẩn bị buồng đếm Neubauer cải tiến

Hình 7: Buồng đếm Neubauer

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

a.

Cấu tạo của buồng đếm Neubauer cải tiến

Buồng đếm được chia làm 2 buồng riêng biệt, mỗi buồng được khắc trên bề mặt những lưới ô vuông cực nhỏ có kích thước 3 x 3mm, được dùng với lame phủ đặc biệt (dày 0,44mm) dán chặt trên hai gờ buồng đếm. Mỗi buồng đếm được chia thành 9 lưới ô vuông kích thước 1 x 1 mm.

Hình 7 minh hoạ cho các vùng sau: tất cả có 9 ô trong buồng đếm (bên trái); ở giữa là ô số 5 gồm 25 ô vuông lớn; 1 phần nhỏ của buồng đếm (bên phải) là hình 25 ô vuông của ô số 5, được bao bọc bởi 3 đường kẻ và chia thành 16 ô vuông nhỏ Với độ sâu là 100μm thì thể tích mỗi ô vuông là 100nl.

1,3,7,9: mỗi lưới ô vuông có 4 hàng, mỗi hàng chia thành 4 ô vuông lớn, V = 6,25nl.

2, 8: mỗi lưới ô vuông có 4 hàng, mỗi hàng chia thành 5 ô vuông lớn, V = 5nl.

4, 6: mỗi lưới ô vuông có 5 hàng, mỗi hàng chia thành 4 ô vuông lớn, V = 5nl.

5: có 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ. Mỗi ô vuông lớn được giới hạn bởi 3 đường kẻ song song. Có 5 hàng, mỗi hàng chia thành 5 ô vuông lớn, V = 4nl.

Mỗi lưới ô vuông số 4, 5, 6 có 5 hàng, Vhàng= 20nl.

b.

Dán lamelle lên buồng đếm

Lamelle phủ phải được dán sát để đảm bảo độ sâu của buồng đếm 100μm. Có 2 cách dán lamelle phủ lên buồng đếm: Dùng nước bôi ướt 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lamelle phủ lên.

Hà hơi thở lên 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lamelle phủ lên.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

51

52

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

2. Chuẩn bị dung dịch đếm mật độ tinh trùng: 1. NaHCO3 50g: tạo pH trung tính và môi trường sinh lý cho tế bào.

2. Formol 36 – 41% 10 ml: bất động tinh trùng.

3. Tripan blue 0,25g hoặc gential violet 5ml: nhuộm màu tinh trùng để dễ quan sát hơn.

4. Nước cất vừa đủ 1000ml.

5. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

3. Chuẩn bị mẫu pha loãng Quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ pha loãng phù hợp dựa theo số lượng tinh trùng trên vi trường 40X (thường chọn độ pha loãng lúc đánh giá di động). Cách pha loãng được tính theo bảng bên dưới: Bảng 2: Cách tính hệ số pha loãng Tinh

Độ pha

Thể tích

Thể tích dung

Vùng đánh giá

trùng/vi

loãng

tinh

dịch pha loãng

(lƣới ô vuông)

trƣờng

quy định

dịch

(μl)

40X

(μl)

> 101

1:20

50

950

5, 4, 6

16 – 100

1:5

50

200

5, 4, 6

2 – 15

1:2

50

50

5, 4, 6

<2

1:2

50

50

Tất cả 1-9

1. Chỉnh pipette để hút với thể tích thích hợp, hút dung dịch đếm mật độ tinh trùng vào 2 tube ly tâm đáy tròn (5ml) , độ pha loãng như nhau.

2. Trộn đều mẫu tinh dịch.

3. Hút tinh dịch với thể tích thích hợp ngay sau khi trộn đều.

4. Lau sạch tinh dịch bên ngoài của đầu tip. http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

5. Cho tinh dịch vào 2 tube chứa dung dịch pha loãng ở trên.

6. Trộn đều bằng cách hút rửa đầu tip.

7. Trộn đều mẫu đã pha loãng bằng máy vortex trong 10 giây ở tốc độ tối đa.

Chú ý: Nếu có quá ít tinh trùng trong vi trường trong mẫu đã pha loãng thì pha loãng lại với hệ số thấp hơn. Ngược lại, nếu có quá nhiều tinh trùng chồng chéo nhau trong vi trường thì pha loãng lại với hệ số cao hơn. Đối với độ pha loãng 1/20 và 1/5, đếm tinh trùng trong những hàng của lưới ô vuông số 5 trước, tiếp tục tới lưới ô vuông số 4 và 6 khi cần thiết.

4. Đặt mẫu vào buồng đếm 1. Sau khi vortex, lấy ngay 10 μl tinh dịch đã được pha loãng để đếm mật độ, tránh để tinh trùng lắng xuống.

2. Đặt đầu tip chạm vào cạnh dưới của lame phủ buồng đếm.

3. Đẩy từ từ hỗn hợp ra, làm đầy buồng đếm thứ nhất bởi lực mao dẫn, không quá ít hay đầy tràn, lame phủ không được di chuyển khi đặt mẫu.

4. Xử lý tương tự đối với mẫu pha loãng thứ hai và đặt vào buồng đếm thứ hai.

5. Cố định buồng đếm 4 phút ở nhiệt độ phòng. Nên đặt buồng đếm lên giấy thấm ướt và đậy hộp petri lên để tránh buồng đếm không bị khô.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

53

54

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

5. Đánh giá mật độ tinh trùng trên buồng đếm

a.

Cách đếm

Trong 3 đường kẻ, đường kẻ giữa tạo thành ranh giới hình vuông (đường màu đen, bên trái). Tất cả tinh trùng trong ô vuông này đều được đếm cũng như những tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường kẻ bên trong (khoanh tròn màu trắng), nhưng những tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường kẻ ngoài (khanh tròn màu đen) thì không đếm. Một tinh trùng với hầu hết đầu của nó nằm trên đường kẻ giữa chỉ được đếm khi đường kẻ đó là đường kẻ dưới, bên trái của ô vuông (khoanh tròn màu trắng, hình giữa) và không đếm khi nó nằm ở đường kẻ trên, bên phải (khoanh tròn màu đen, hình bên phải).

Hình 8: Cách đếm tinh trùng trong ô vuông

b.

Các bước thực hiện

1. Khảo sát đánh giá với vật kính 40X. 2. Chỉ đếm tinh trùng nguyên vẹn có đầy đủ đầu và đuôi 3. Đếm tinh trùng dựa vào vị trí của đầu tinh trùng. Ranh giới của ô vuông lớn là đường giữa của 3 đường viền.

4. Đếm tất cả tinh trùng nằm trong ô vuông lớn, đếm tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường viền bên trong, không đếm tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường viền bên ngoài.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

5. Để tránh đếm lặp lại tinh trùng trong các ô vuông liền kề, đếm tinh trùng nằm trên đường phân chia giữa 2 ô vuông chỉ được đếm 1 lần: đếm tinh trùng có đầu nằm trên đường phân chia phía trên và bên trái của ô vuông.

c.

Giới hạn đếm tinh trùng trên buồng đếm

1. Đếm ít nhất 200 tinh trùng trên mỗi buồng đếm 2. Đánh giá lưới ô vuông số 5 trước, đếm theo từng hàng 3. Tiếp tục đếm hết hàng dù tổng số tinh trùng hơn 200. Nếu đếm chưa đủ 200 tinh trùng trong 4 hàng của lưới ô vuông số 5, tiếp tục đếm những hàng trong lưới ô vuông số 4 và 6.

4. Ghi nhận số hàng đánh giá. Số hàng tương tự sẽ được đếm ở buồng đếm thứ 2.

5. Đếm buồng đếm thứ 2 tương tự buồng thứ 1.

6. Tính tổng và sự khác biệt của 2 lần đếm.

7. So sánh khác biệt cho pháp theo Bảng 3 Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: pha loãng và đánh giá lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình, tính mật độ.

Chú ý: Không nên đánh giá 2 lần trên cùng 1 buồng đếm hoặc đánh giá 2 buồng với cùng 1 mẫu pha loãng vì có thể dẫn đến sai số khi lấy mẫu, do pha loãng hoặc do trộn không đều.

Cần ghi nhận nếu có nhiều tinh trùng đầu kim hoặc tinh trùng không đuôi trong mẫu. Khi cần có thể đánh giá mật độ của chúng giống như tinh trùng bình thường hoặc đánh giá qua phương pháp nhuộm

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

55

56

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Bảng 3 Khác biệt cho phép giữa tổng và hiệu số đếm trên 2 buồng đếm Tổng số tinh

Sai số cho

Tổng số

Sai số cho

trùng

phép

tinh trùng

phép

144-156

24

329-346

36

157-169

25

347-366

37

170-182

26

367-385

38

183-196

27

386-406

39

197-211

28

407-426

40

212-226

29

427-448

41

227-242

30

449-470

42

243-258

31

471-492

43

259-274

32

493-515

44

275-292

33

516-538

45

293-309

34

539-562

46

310-328

35

563-587

47

6. Cách tính mật độ tinh trùng và tổng số tinh trùng

a.

Mật độ

Mật độ: C = (N/n) x (1/20) x hệ số pha loãng x 106 (tinh trùng/ml tinh dịch)

b.

Tổng số tinh trùng

Tổng tinh trùng = Mật độ tinh trùng x Thể tích mẫu Trong đó: N: là tổng số tinh trùng đếm được trong 2 buồng đếm n: là tổng số hàng khảo sát 20: là thể tích của 1 hàng trong lưới ô vuông số 4, 5, 6. . http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

7. Đánh giá mẫu có mật độ tinh trùng thấp: Trường hợp mẫu tinh dịch có số lượng tinh trùng quá ít (0-4 tinh trùng/vi trường 40X) nếu không cần con số chính xác có thể ước lượng mật độ: <4 tt/vi trường 40X  Khoảng 1.106 tt/ml <2 tt/vi trường 40X  < 0,5.10 tt/ml Cần ghi nhận có tinh trùng di động hay không

a.

Trường hợp không tìm thấy tinh trùng trên tiêu

bản tươi: Nếu không thấy tinh trùng trên tiêu bản soi tươi thì có thể nghi ngờ azoospermia. Thuật ngữ azoospermia chỉ được sử dụng khi không tìm thấy tinh trùng trong mẫu ly tâm.

1. Trộn đều mẫu. Nếu mẫu nhớt thì phải phá nhớt.

2. Ly tâm toàn bộ mẫu với tốc độ 3000g/15 phút.

3. Bỏ phần dịch nổi phía trên, để lại khoảng 50 μl.

4. Trộn đều cặn, tạo 2 tiêu bản.

5. Khảo sát tiêu bản bằng kính hiển phản pha với độ phóng đại 200 – 250.

6. Khảo sát theo hệ thống (zic zac) toàn bộ tiêu bản.

7. Có tinh trùng trong cặn khảo sát  Cryptozoospermia.

8. Không có tinh trùng trong cặn khảo sát  Azoospermia.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

57

58

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý: Việc có tìm thấy tinh trùng hay không phụ thuộc vào thời gian, tốc độ ly lâm và cách kiểm tra mẫu. Không thấy tinh trùng di động trong mẫu kiểm tra không có nghĩa là không có tinh trùng di động trong toàn bộ mẫu.

Ly tâm 3000g trong 15 phút không làm lắng tất cả tinh trùng trong mẫu nên phương pháp này không được sử dụng để tính tổng số tinh trùng.

Sau ly tâm, tinh trùng có thể không còn di động.

b.

Kiểm tra mẫu tìm tinh trùng di động không qua

ly tâm Khi thấy có tinh trùng di động (ví dụ trong mẫu sau khi thắt ống dẫn tinh) thì tránh pha loãng mẫu hoặc ly tâm với tốc độ cao. Trong trường hợp này, chỉ cần đánh giá một mẫu không pha loãng. 

Trộn đều mẫu.



Nhỏ 15 μl tinh dịch lên lame, phủ lamelle 22mm x 22mm.



Kiểm tra tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại x40.



Kiểm tra mẫu theo hệ thống zic – zac.

Di chuyển quang trường liên tục và đếm tất cả các tinh trùng hiện diện trong tiêu bản tươi.

Chú ý: Không tìm thấy tinh trùng di động trong mẫu kiểm tra không có

nghĩa là không có tinh trùng di động trong lượng mẫu còn lại.

8. Tính mật độ tế bào lạ Sự hện diện của các tế bào lạ (tế bào tròn) với số lượng lớn trong tinh dịch thường là dấu hiệu hiệu của tổn thương tinh hoàn, bệnh lý đường dẫn tinh hoặc viêm nhiễm tuyến phụ sinh dục. http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Xác định số lượng tế bào tròn trong mẫu bằng cách pha loãng và đếm tương tự như đếm tinh trùng. Tuy nhiên, việc pha loãng sẽ làm giảm mật độ tế bào lạ, do đó kết quả không được chính xác. Có thể đánh giá mật độ tế bào tròn trong tinh dịch dựa trên sự tỷ lệ của chúng với tinh trùng (đếm song song cùng với đếm tinh trùng).

Nếu mật độ tế bào tròn vượt quá 1.106/ml, cần phân biệt bạch cầu và tinh trùng non qua phản ứng peroxidase (nhuộm leukoscreen) hoặc phân biệt qua cấu trúc của nhân bạch cầu và tinh trùng non trên tiêu bản nhuộm.

Mật độ tế bào lạ:

Sx N C= 100 N: Số tế bào tròn đếm được trong cùng số vi trường 100 tinh trùng S: mật độ tinh trùng C: mật độ tế bào tròn

9. Bảo quản buồng đếm Rửa sạch buồng đếm và lamelle với nước, lau khô bằng giấy lau mềm sau khi sử dụng. Nếu rửa không sạch, cặn khô sót lại có thể gây khó khăn khi đặt mẫu vào lần sau (mẫu pha loãng không tràn đều vào buồng đếm). Lau sạch bề mặt buồng đếm trước khi sử dụng.

Ngâm buồng đếm và lamelle qua đêm để tẩy sạch những tác nhân có khả năng lây nhiễm từ tinh dịch

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

59

60

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

VII. Đánh giá hình dạng tinh trùng Hình dạng tinh trùng rất đa dạng. Những nghiên cứu đánh giá hình dạng tinh trùng để đưa ra chỉ số bình thường được xác định căn cứ vào hình dạng của các tinh trùng lấy từ cơ quan sinh dục nữ, đặc biệt là từ chất nhầy cổ tử cung sau giao hợp hoặc từ bề mặt màng trong suốt của trứng.

Hình dạng tinh trùng là một thông số rất quan trọng giúp dự đoán khả năng thụ tinh khi đánh giá theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt (Strict Criteria). Tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường đánh giá theo Strict Criteria liên quan đến tỷ lệ phát triển của thai, khả năng có thai tự nhiên hay có thai khi điều trị bằng các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Ở những đàn ông có khả năng sinh sản bình thường và không có khả năng sinh sản, tỷ lệ này vào khoảng 0 – 30% (Menkveld và cs., 2001). Tỷ lệ này tiệm cận đến ngưỡng 3 – 5% trong nghiên cứu thụ tinh trong ống nghiệm, IUI và thụ tinh tự nhiên.

1.

Quy trình:

1. Làm sạch lame bằng cồn 70o, để khô tự nhiên (chuẩn bị ít nhất 2 lame).

2. Dùng bút chì ghi nhãn trên phần nhám để phân biệt các mẫu.

3. Tạo phiến phết tinh dịch.

4. Để khô tự nhiên, cố định và nhuộm phiến phết bằng phương pháp Papanicolaou.

5. Khảo sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi độ phóng đại x1000, có phủ dầu.

6. Đánh giá phân loại tinh trùng bình thường và bất thường.

7. Đánh giá.

8. So sánh sự khác biệt của 2 tiêu bản: nếu chấp nhận được thì ghi nhận kết quả; nếu không thì đọc lại tiêu bản. http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

9. Đánh giá 2 tiêu bản, mỗi tiêu bản khoảng 200 tinh trùng/tiêu bản, xác định phần trăm tinh trùng có hình dạng bình thường .

10. Tính phần trăm hình dạng bình thường.

2. Kỹ thuật kéo lame Chất lượng phiến phết phụ thuộc vào thể tích giọt tinh dịch và mật độ tinh trùng cũng như độ nghiêng của lame kéo và tốc độ kéo lame. Độ nghiêng càng thấp thì phiến phết càng mỏng, tốc độ kéo càng nhanh thì phiến phết càng dày.

Nếu mật độ tinh trùng > 20.106/ml  nhỏ 5 – 10 μl tinh dịch để kéo lame.

Nếu mật độ tinh trùng < 20.106/ml  nhỏ 10 – 20 μl tinh dịch để kéo lame.

Chú ý: Không được để giọt tinh dịch trên lame quá lâu trước khi trải. Đặt lame kéo phía trước giọt tinh dịch, không được kéo tinh dịch từ phía sau.

a.

Kéo đều (feathering method)

Nhỏ một giọt tinh dịch lên gần cuối lame thứ nhất, dùng cạnh của lame thứ hai chạm vào giọt tinh dịch, nghiêng 30 – 45o kéo giọt tinh dịch dọc theo bề mặt của lam thứ nhất.

Kỹ thuật này tạo phiên phết mỏng và đều, đảm bảo tất cả tinh trùng cùng nằm trên một mặt phẳng, không chồng lên nhau, độ tương phản và màu nền của tiêu bản sau khi nhuộm tốt hơn, dễ nhận biết sự khác biệt về đường nét của tinh trùng bình thường và bất thường. Tuy nhiên, kỹ thuật này không thích hợp đối với mẫu tinh dịch có độ nhớt cao.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

61

62

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Hình 9: Kỹ thuật kéo lame đều

b.

Kéo bằng pipette Pasteur

Kỹ thuật này thích hợp cho những mẫu tinh dịch có độ nhớt cao.

Rửa mẫu tinh dịch rồi nhỏ một giọt dung dịch tinh dịch sau khi rửa lên lame, sau đó dùng pipette Pasteur đặt nằm ngang để trải mẫu lên lame.

Hình 10: Kỹ thuật trải mẫu để đánh giá hình dạng

(a)

Kỹ thuật kéo lame đều đối với tinh dịch không pha loãng. Trải giọt

tinh dịch (S) từ đầu lame đến cuối lame bằng lame thứ 2. (b)

Kỹ thuật kéo lame bằng pipette pasteur đối với mẫu đã được rửa.

Trải giọt dung dịch chứa tinh trùng (SS) trên bề mặt lame bằng cách kéo ngang pipette (P).

c.

Kéo lame với mẫu tinh dịch có độ nhớt cao

Đặt giọt tinh dịch vào giữa lame thứ nhất, đặt lame thứ 2 chồng lên giọt tinh dịch đến khi tinh dịch trải đều giữa hai lame, kéo nhẹ nhàng hai lame tách thành 2 tiêu bản. Tuy nhiên, độ nhớt của tinh dịch hay cặn và

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

các thành phần không phải tinh trùng trong tinh dịch làm độ dày của phiến phết không đều nhau, gây khó khăn khi đánh giá phân loại tinh trùng. Do đó, nên pha loãng và ly tâm mẫu tinh dịch trước khi tạo phiến phết. Phần cặn được pha với thể tích thích hợp để có mật độ tinh trùng cao nhất nhưng không quá 50.106/ml. Cần ghi nhận vào phiếu trả kết quả là mẫu ly tâm để kéo lame vì hình dạng tinh trùng có thể bị ảnh hưởng bởi phương pháp này.  Tạo phiến phết 1. Pha loãng 0,2 – 0,5 ml tinh dịch với 10ml nước muối sinh lý.

2. Ly tâm 800g trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi, để lại khoảng 20 - 40 μl.

3. Trộn đều cặn, lấy 5 -10 μl làm phiến phết trên lame bằng pipette Pasteur.

4. Quan sát tổng quan tiêu bản với độ phóng đại x400, cần có ít nhất 40 tinh trùng trên một vi trường, tinh trùng không tập trung từng đám hoặc xếp chồng lên nhau.

5. Nếu mật độ tinh trùng vẫn quá dày thì làm lại tiêu bản với thể tích ít hơn hoặc tăng độ pha loãng.

6. Để phiến phết khô tự nhiên và cố định tuỳ phương pháp nhuộm.

d.

Kéo lame với những mẫu có mật độ ít

(<2x106/ml) 1. Ly tâm toàn bộ mẫu ở 600g trong 10 phút.

2. Loại bỏ dịch nổi phía trên.

3. Trộn đều cặn.

4. Nhỏ mẫu có mật độ cao lên lame kéo (không quá 50x106).

5. Tạo phiến phết nhuộm.

6. Để khô tự nhiên và cố định tuỳ phương pháp nhuộm.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

63

64

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

3. Phƣơng pháp nhuộm Papanicolaou: Phương pháp này được dùng rộng rãi nhất ở các phòng xét nghiệm Nam khoa. Đây là cách nhuộm tinh trùng và các tế bào khác rất tốt. Với phương pháp nhuộm này, cực đầu tinh trùng có màu xanh nhạt, vùng sau cực đầu xanh đậm, phần giữa đỏ, đuôi màu xanh hoặc đỏ nhạt, bào tương màu hồng hoặc đỏ.

QUY TRÌNH NHUỘM PAPANICOLOU 1.

Ethanol 80o

30 giây

2.

Ethanol 50o

30 giây

3.

Rửa nƣớc

30 giây

4.

Haematoxylin

4 Phút

5.

Rửa nƣớc

30 giây

6.

Acidic ethanol

Nhúng lên xuống 4- 8 lần

7.

Ethanol 50o

30 giây

8.

Ethanol 80o

30 giây

9.

Ethanol 95o

Ít nhất 15 phút

10.

OG6

1 phút

11.

Ethanol 95o

30 giây

12.

Ethanol 95o

30 giây

13.

EA50

1 phút

14.

Ethanol 95o

30 giây

15.

Ethanol 95o

30 giây

16.

Ethanol 100o

30 giây

17.

Ethanol 100o

30 giây

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Bảng 6: Tác dụng của các hoá chất trong phƣơng pháp nhuộm Papanicolaou Hoá chất Công dụng Ethanol Nƣớc cất

Cố định tế bào Loại bỏ ethanol trước khi nhuộm heamatoxylin và loại bỏ thành phần không bắt màu.

Haematoxylin

Nhuộm nhân tế bào (xanh)

Acidic ethanol

Tẩy sạch thành phần không bắt màu haematoxylin.

OG6, EA-50

Nhuộm tế bào chất, bào tương bắt màu hồng

4. Phân loại hình dạng tinh trùng

a.

Tinh trùng bình thường:

Hình 11: Tinh trùng bình thƣờng

Có đầu, cổ, phần giữa và đuôi đều bình thường, đầu tinh trùng sau nhuộm có kích cỡ nhỏ hơn đầu tinh trùng sống mặc dù hình dạng không khác nhiều. Đầu hình oval cân đối với màng ngoài nhẵn. Phần đầu có vùng acrosome chiếm 40 – 70% diện tích đầu. Vùng acrosome không có không bào lớn hoặc không quá 2 không bào nhỏ và không chiếm quá 20% thể tích vùng đầu. Vùng nhân không chứa không bào.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

65

66

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Phần giữa thon, chiều dài bằng chiều dài đầu, gắn thẳng trục với đầu. Bào tương sót lại < 1/3 thể tích đầu bình thường Đuôi đều, thon hơn phần thân, có thể cuộn vòng nhưng không bị gấp gãy, dài khoảng 45 μm (gấp khoảng 10 lần chiều dài đầu).

Hình 11: Tinh trùng có hình dạng bình thƣờng

Chú ý Tất cả tinh trùng không có hình dạng như trên đều coi là tinh trùng bất thường. Phân loại hình dạng tinh trùng giúp ước đoán phần nào giá trị thành công trong IVF.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

b.

Tinh trùng bất thường

Tinh trùng ở người có rất nhiều dạng dị tật khác nhau mà nguyên nhân chủ yếu do bất thường trong sinh tinh hay bệnh lý về mào tinh hoàn. Bất thường hình dạng thường ở dạng hỗn hợp. Khả năng thụ tinh của tinh trùng bất thường thấp hơn so với tinh trùng bình thường và phụ thuộc vào loại bất thường. Bất thường hình dạng tinh trùng thường liên quan đến sự phân mảnh DNA, bất thường nhiễm sắc thể, thoi vô sắc và đa bội.

Hình 11: Một số hình dạng bất thƣờng của tinh trùng ngƣời.

Sau đây là những bất thường cần lưu ý:  Bất thường đầu: Đầu to, nhỏ, hình lê, hình nến, đầu tròn, đầu có hình dạng bất định, có không bào (nhiều hơn 2 không bào hay không bào lớn hơn 20% vùng đầu), không bào ở vùng sau cực đầu, cực đầu nhỏ quá hoặc lớn quá…

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

67

68

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Tinh trùng bất định

Tinh trùng có bề mặt bất thường

Tinh trùng Acrosome lớn

Tinh trùng đầu nhọn

Tinh trùng có cực đầu ít

Tinh trùng đầu hình quả tạ

Tinh trùng đầu tròn

Tinh trùng có không bào

Hình 12. Tinh trùng bất thƣờng

phần đầu

http://www.ivfhungvuong.com.vn

69

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

 Bất thường cổ và phần giữa: Cổ gập, phần giữa nối với đầu bị lệch, dày, không đều.

Tinh trùng phần giữa dày

Tinh trùng cổ gập

Tinh trùng có bào tương cổ

Hình 13: Tinh trùng bất thƣờng phần giƣ̃a

 Bất thường đuôi Đuôi ngắn, gãy, cong, nhiều đuôi, chiều rộng đuôi không đều, đuôi cuộn (>360o).

Tinh trùng đuôi gãy

Tinh

trùng

Tinh trùng đuôi cuộn

hai đuôi Hình 13: Tinh trùng bất thƣờng phần đuôi

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

70

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

 Bào tương cổ Bào tương còn sót lại thường nằm ở phần giữa, có kích thước lớn hơn 1/3 thể tích đầu.  Tinh trùng chưa trưởng thành: Đầu tròn, to hoặc kéo dài, nhân tròn, đã mọc đuôi hoặc chưa mọc đuôi.  Đầu kim: Tinh trùng không có phần đầu, chỉ có đuôi tự do. Tinh trùng đầu kim không được xếp vào loại bất thường đầu mà chỉ ghi nhận (vì chúng không có nhiễm sắc thể).

Hình 14: Tinh trùng đầu kim

c.

Tế bào lạ

Trong mẫu tinh dịch bình thường cũng có thể có nhiều loại tế bào khác:  Bạch cầu: Bình thường không có trong tinh dịch, nếu có chỉ với số lượng rất ít (<1.106). Nếu mật độ bạch cầu cao cho thấy biểu hiện bệnh lý, thường bắt nguồn từ tuyến tiền liệt hoặc dịch túi tinh.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

 Hồng cầu: Bình thường không hiện diện trong tinh dịch, nếu có thì chỉ với số lượng rất ít nhưng không mang ý nghĩa bệnh lý.  Tinh trùng non: Tế bào mầm chưa trưởng thành, có nhiều trong tinh dịch chứng tỏ có rối loạn chức năng của ống sinh tinh (thường gặp trong bệnh giãn tĩnh mạch tinh).  Tế bào biểu mô: Xuất hiện ở hầu hết các mẫu tinh dịch với số lượng rất ít. Tuy nhiên, nếu hiện diện trong mẫu với số lượng lớn cũng không nói lên tình trạng nhiễm trùng hay rối loạn chức năng sinh sản. Nếu mẫu lấy bằng giao hợp gián đoạn sẽ có nhiều tế bào biểu mô âm đạo, trường hợp mẫu lấy bằng bao cao su chuyên dụng sẽ có nhiều tế bào biểu mô từ niệu đạo.  Bào tương từ biểu mô ống sinh tinh Tế bào lớn, không nhân (lớn hơn đầu tinh trùng được cho là tế bào tròn, nếu nhỏ hơn thì xem như mảnh vụn).  Vi khuẩn và vi sinh vật đơn bào: Bình thường không có trong tinh dịch, nhưng nếu có với số lượng lớn sẽ biểu hiện tình trạng nhiễm trùng đường sinh dục.  Cặn: Trong tinh dịch bình thường có thể có nhiều cặn. Cần phân biệt cẩn thận mảnh vụn và vi khuẩn.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

71

72

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Một số thuật ngữ sử dụng trong tinh dịch đồ Aspermia

Không có tinh dịch

Hypospermia

Thể tích tinh dịch nhỏ hơn 0,5 ml/lần xuất tinh

Hyperspermia

Thể tích tinh dịch lớn hơn 6 ml/lần xuất tinh

Oligospermia

Thể tích xuất tinh nhỏ hơn 1,5 ml

Oligozoospermia

Mật độ tinh trùng ít (< 15.106/ml)

Asthenozoospermia

Tinh trùng yếu (PR < 32%)

Teratozoospermia

Tinh trùng dị dạng

Oligo-astheno

Tinh trùng ít, yếu, dị dạng

teratozoospermia Azoospermia

Tinh dịch không có tinh trùng

Globozoospermia

Tinh trùng đầu tròn, không cực đầu

Hematospermia

Tinh dịch có hồng cầu

Cryptozoospermia

Vài tinh trùng trong mẫu

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN IV: QUY TRÌNH LỌC RỬA TINH TRÙNG

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

73

74

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

A. Giới thiệu Tinh trùng cần được tách khỏi tinh tương để sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: (1) thử nghiệm chẩn đoán chức năng của tinh trùng và (2) điều trị vô sinh thông qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART).

Với mục đích thứ nhất, tinh trùng cần phải được tách ra khỏi tinh tương trong vòng 1 giờ sau khi xuất tinh nhằm hạn chế tối đa các tổn hại đến tinh trùng do các sản phẩm của các tế bào lạ (không phải tinh trùng) gây ra.

I.

Mục đích

Trong giao hợp tự nhiên, tinh tương giúp tinh trùng thâm nhập vào chất nhầy cổ tử cung (Overstreet và cs, 1980). Tuy nhiên, trong điều trị vô sinh bằng các kỹ thuật ART (IUI, IVF), khi rào cản tự nhiên bị phá vỡ thì một số thành phần của tinh tương (như kẽm, prostaglandins) lại gây trở ngại cho việc có thai.

Mục đích của việc phân tách tinh trùng người khỏi tinh dịch là thu được mẫu cô đặc, chứa tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thường cao, đồng thời loại bỏ các mảnh vỡ, tế bào lạ và các tinh trùng chết. Đối với những mẫu tinh dịch bình thường chỉ cần pha loãng tinh dịch với môi trường nuôi cấy và ly tâm. Tinh trùng chuẩn bị theo phương pháp này thường được dùng trong IUI (Boomsma và cs, 2004). Tuy nhiên, khi mẫu có một hoặc vài thông số bất thường trong tinh dịch đồ thì cần sử dụng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ không liên tục hoặc swim-up trực tiếp.

II. Chọn lựa phương pháp Dựa trên chất lượng mẫu tinh dịch của người chồng, ta có thể lựa chọn phương pháp chuẩn bị tinh trùng thích hợp (Canale và cs, 1994). Ví

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

dụ, kĩ thuật swim-up trực tiếp thường sử dụng khi các mẫu tinh dịch có nhiều thông số bình thường, trong trường hợp mẫu là oligozoospermia, teratozoospermia hay asthenozoospermia thì sử dụng kỹ thuật ly tâm trên thang nồng độ để tăng hiệu suất thu hồi tinh trùng di động.

III. Hiệu quả của kỹ thuật phân tách tinh trùng khỏi

tinh dịch và các VSV lây nhiễm.

Hiệu quả của kỹ thuật chọn lọc tinh trùng thể hiện ở độ sạch, số lượng tinh trùng thu hồi, tổng số tinh trùng di động, hoặc khả năng thu hồi tinh trùng di động có hình dạng bình thường. Phương pháp swim-up thường cho tỷ lệ thu hồi tinh trùng di động dưới 20%, thấp hơn phương pháp ly tâm trên thang nồng độ (>20%). Hai phương pháp này có tác dụng làm giảm bớt các thành phần khác có trong tinh dịch trong mẫu sau lọc rửa.

An toàn khi thao tác trên mẫu Mẫu tinh dịch có thể chứa những tác nhân lây nhiễm, do đó nhân viên xét nghiệm cần hết sức cẩn thận khi thao tác. Các kỹ thuật chuẩn bị tinh trùng không thể đảm bảo loại bỏ 100% các tác nhân lây nhiễm trong tinh dịch. Tuyệt đối phải tuân theo các hướng dẫn an toàn nêu trong phụ lục. Thực hiện thao tác thí nghiệm tốt là nguyên tắc cơ bản đảm bảo an toàn thí nghiệm (WHO 2004).

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

75

76

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

B. Quy trình chuẩn bị tinh trùng Phƣơng pháp

Simple wash

Swim up

Gradient

Số lần ly tâm

2–3

1–2

2

Tốc độ ly tâm (g)

300 – 500

300 – 400

300 – 650

Thời gian ly tâm

10 – 15

5 – 10

15 – 30

Tổng thời gian thực hiện*

20 – 40

70 – 90

40 – 70

Hiệu suất thu hồi tinh trùng di động

90 – 95

10 – 20

20 – 40

Thấp

Thấp

Cao

sau lọc rửa (%) Chi phí

Ghi chú: *Tổng thời gian thực hiện không bao gồm thời gian lấy mẫu và ly giải của tinh dịch. Đánh giá sơ bộ tinh trùng

Mẫu tinh dịch

Lựa chọn

Có

CTMS >10 x 10

phương pháp

Không

6

Lấy thêm mẫu (Nếu có thể)

Ó Có

Không Simple wash

Swim-up

TMS <10 x 10

TMS >5 x 10

6

Có

IUI

Không

Simple wash

Có

C Ó

Ó

Ly tâm trên thang nồng độ

6

Thảo luận với bác sỹ điều trị

Hủy bỏ IUI http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Có 3 kỹ thuật cơ bản trong lọc rửa tinh trùng được mô tả trong phần này. Môi trường được khuyến cáo sử dụng là dung dịch muối cân bằng bổ sung protein và môi trường đệm thích hợp để đánh giá tinh trùng. Trong các phương pháp hỗ trợ sinh sản (như là ICSI, IVF, AI hoặc chuyển giao tử vào vòi trứng), albumin huyết thanh người phải có độ tinh khiết cao và không chứa các virus, vi khuẩn cũng như các tác nhân lây nhiễm khác. Các albumin này hiện nay đã có sẵn trên thị trường.

Nếu tủ ấm chỉ chứa không khí bình thường ở nhiệt độ 37oC, nên sử dụng đệm HEPES hoặc các dung dịch đệm tương tự và đậy chặt nắp của ống tube. Nếu không khí trong tủ ấm có chứa 5% CO2 ở nhiệt độ là 37oC, môi trường nên được đệm với dung dịch natri bicacbonat hoặc dung dịch đệm tương tự, để lỏng nắp của ống tube để không khí có thể lưu thông. Điều này sẽ đảm bảo pH tối ưu cho sự sống của tinh trùng. Bên cạnh đó, mục đích sử dụng tinh trùng cũng sẽ quy định môi trường đệm sử dụng thích hợp. Ví dụ, trong thử nghiệm chuẩn đoán chức năng của tinh trùng, môi trường sử dụng cần phải hỗ trợ cho sự hoạt hóa tinh trùng, và do đó phải chứa natri bicacbonat (25mmol/l).

Chú ý Tinh dịch nên được thu thập trong điều kiện vô trùng (thao tác và vật liệu điều phải vô trùng), đặc biệt là khi chuẩn bị tinh trùng cho mục đích điều trị.

I.

Phương pháp rửa đơn giản (Simple wash)

Phương pháp rửa đơn giản giúp thu được số lượng tinh trùng cao nhất và thích hợp với những mẫu tinh dịch có chất lượng tốt. Phương pháp này thường được sử dụng để chuẩn bị tinh trùng cho IUI. 1. Trộn đều mẫu.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

77

78

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

2. Pha loãng toàn bộ mẫu tinh dịch với môi trường theo tỷ lệ 1: 1 để loại bỏ tinh tương.

3. Chia mẫu pha loãng vào các ống ly tâm, tối đa là 3 ml/ống.

4. Ly tâm 300 – 500 g trong 5 – 10 phút.

5. Hút bỏ dịch nổi một cách cẩn thận.

6. Hòa cặn với 1 ml môi trường mới.

7. Ly tâm lặp lại ở 300 – 500g trong 3 – 5 phút.

8. Hút bỏ dịch nổi.

9. Hòa cặn với môi trường nuôi cấy để được 0,3 ml.

10. Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và di động tiến tới của mẫu sau lọc rửa.

Chú ý Có thể giảm số lần rửa bằng cách dùng ít ống nghệm hơn và tăng thể tích môi trường trong từng ống nghiệm. Tăng tốc độ ly tâm và thời gian ly tâm (500 – 600 g trong 8 – 10 phút) sẽ thu được nhiều tinh trùng hơn.

II. Phương pháp bơi lên trực tiếp (Direct swim-up) Tinh trùng được chọn lọc dựa trên khả năng tự bơi ra khỏi tinh dịch để vào môi trường nuôi cấy. Cách làm này được gọi là kỹ thuật “swim-up”.

Kỹ thuật swim-up trực tiếp được thực hiện bằng cách đặt lớp môi trường nuôi cấy lên trên lớp tinh dịch hay đặt lớp tinh dịch dưới môi trường nuôi cấy. Sau đó, các tinh trùng di động sẽ tự bơi vào trong lớp môi trường nuôi cấy. Không nên pha loãng và ly tâm tinh dịch trước khi swim-up vì có thể gây hiện tượng peroxide hóa, làm tổn thương màng tế bào tinh trùng.

Phương pháp này cho số lượng tinh trùng thấp hơn phương pháp rửa đơn giản, nhưng chọn lọc được những tinh trùng di động tốt và thích

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

hợp cho các mẫu tinh dịch có tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động thấp sử dụng cho IVF hoặc ICSI.  Môi trường sử dụng: Ferticult Flushing (Fertipro, Bỉ)  Quy trình thực hiện: 1. Trộn đều mẫu.

2. Cho 1,2 ml môi trường vào ống ly tâm đáy tròn 15 ml vô trùng, cẩn thận đặt 1 ml tinh dịch xuống đáy ống nghiệm. (Cũng có thể đặt 1 ml tinh dịch vào ống ly tâm trước, sau đó nhẹ nhàng đặt 1,2 ml môi trường nuôi cấy lên trên.)

3. Đặt ống nghiệm nghiêng 45oC để tăng bề mặt tiếp xúc giữa lớp tinh dịch và môi trường nuôi cấy, ủ trong tủ cấy 1 giờ ở 37oC. 4. Nhẹ nhàng đặt ống ly tâm thẳng đứng trở lại và hút khoảng 1 ml môi trường ở phía trên, chứa nhiều tinh trùng di động.

5. Sau khi hút, chuyển vào 1,5 – 2 ml môi trường mới.

6. Ly tâm 300 – 500 g trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.

7. Hòa môi trường vào cặn lắng để được 0,3 ml tinh trùng.

8. Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và tinh trùng di động tiến tới.

III. Phương pháp ly tâm gradient với nồng độ không

liên tục Phương pháp gradient trên thang nồng độ không liên tục được sử dụng để chọn lọc tinh trùng có chất lượng tốt, loại bỏ hầu hết các tác nhân lây nhiễm, bạch cầu, các tế bào lạ cũng như các mảnh vụn tế bào, đặc biệt hiệu quả đối với những mẫu có độ nhớt cao. Phương pháp này dễ chuẩn hóa hơn phương pháp swim-up trực tiếp nên kết quả thường ổn định hơn và thường được sử dụng để chuẩn bị tinh trùng cho IVF hoặc ICSI.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

79

80

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Trong phương pháp này, tinh dịch được ly tâm trên thang nồng độ chứa các hạt silica dạng keo được bao phủ bởi silane, chính các hạt này giúp phân tách các tinh trùng dựa trên tỷ trọng của chúng. Ngoài ra, trong quá trình ly tâm, các tinh trùng di động cũng tích cực bơi xuyên qua các lớp dung dịch và kết thành cặn ở đáy ống ly tâm.

Người ta thường sử dụng thang nồng độ 2 lớp: 40% ở trên và 80% ở dưới để tạo thang nồng độ không liên tục.  Môi trường chuẩn bị: SilSelect 90% (Fertipro. Bỉ) SilSelect 45% (Fertipro. Bỉ) Ferticult Flushing (Fertipro. Bỉ)  Quy trình thực hiện: 1. Chuẩn bị môi trường gradient trên thang nồng độ trong ống falcon: đặt 1 ml môi trường gradient 40% ở trên và 1 ml 80% ở dưới.

2. Trộn đều mẫu.

3.

Đặt 1 ml tinh dịch lên lớp môi trường lọc. Ly tâm 300 – 400g trong 15 – 30 phút. Có thể sử dụng nhiều hơn 1 ống ly tâm/ 1 mẫu tinh dịch nếu cần thiết.

4. Loại bỏ phần dịch nổi, chừa lại cặn.

5. Chuyển cặn lắng vào 4ml môi trường rửa và ly tâm ở 200g trong 4 – 10 phút.

6. Rửa lại lần 2 (lặp lại bước 4, 5).

7. Hút bỏ phần trên, chừa lại 0,3 ml, đánh giá mật độ, độ di động của cặn thu được.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

81

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

IV. Chuẩn bị tinh trùng trong một số trường hợp khác Mẫu tinh dịch

TESE

Có

Mẫu PESA

Simple wash

Không

Tìm tinh trùng

Vài tinh trùng

Lựa chọn

Có

phương pháp Nhiều Ly tâm trên thang nồng độ

Nhiều TT

Ít TT

Rất ít TT

Mẫu TT SS 45%

SS 45% SS 90% 300 – 500g / 15 – 30 phút Bỏ dịch nổi

Chuyển cặn 2ml Sperm preparation Ly tâm 300g/10 phút Lặp lại lần 2 0,2ml cặn

1

PVP + tinh trùng

1 2 3 4 5

G-MOPS Noãn ICSI

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

82

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

1.

Chuẩn bị tinh trùng đối với trƣờng hợp tinh

trùng thu từ mào tinh Kỹ thuật thu nhận tinh trùng từ mào tinh (PESA, MESA) thường dùng trong trường hợp không có tinh trùng do tắc nghẽn hơn là do rối loạn chức năng tinh hoàn. Thông thường, có thể thu được một lượng lớn tinh trùng phục vụ cho mục đích điều trị. Tinh trùng thu được trong trường hợp này thường ít lẫn hồng cầu và các tế bào không phải tinh trùng, do đó có thể phân lập và chọn lựa tinh trùng di động dễ dàng.

Nếu số lượng tinh trùng thu được nhiều thì sử dụng phương pháp gradient không liên tục, ngược lại nếu lượng tinh trùng thu được thấp (chỉ tìm thấy vài tinh trùng trong mẫu) thì nên sử dụng phương pháp rửa đơn giản.

a. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp gradient trên thang nồng độ không liên tục  Môi trường chuẩn bị: Sil Select 90% Sil Select 45% G-IVF đã làm ấm trước ở 37oC, CO2 5% ít nhất 2 giờ.  Quy trình thực hiện: 1. Thực hiện các bước chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp Gradient ở trên từ bước 1 đến bước 4.

2. Cặn tinh trùng được trộn với 3 – 4ml môi trường G-IVF, ly tâm ở 300 – 400g trong 5-10 phút.

3. Hút bỏ dịch nổi, chừa lại khoảng 0,3 ml cặn tinh trùng.

4. Để tube chứa tinh trùng ở 37oC, CO2 5% ít nhất 15 phút để tinh trùng di động bơi ra khỏi cặn.

5. Hút khoảng 0,2 ml dịch nổi chứa tinh trùng di động sang ống ly tâm mới (vô trùng). http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

6. Kiểm tra tinh trùng thu được dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá mật độ và đi động của tinh trùng sau khi chuẩn bị.

7. Để tube này trong tủ thao tác cho đến khi chuẩn bị làm ICSI.

b. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp rửa đơn giản Phương pháp rửa đơn giản giúp thu được số lượng tinh trùng cao nhất, thích hợp với những mẫu tinh dịch chỉ có vài tinh trùng để sử dụng cho ICSI. Những mẫu này thường là crypto, mẫu thu nhận từ PESA hay TESE.  Môi trường chuẩn bị: G-IVF làm ấm ít nhất 2 giờ ở 37oC, CO2 5% trước khi sử dụng.  Quy trình thực hiện 1. Trộn đều mẫu.

2. Pha loãng toàn bộ mẫu tinh dịch với môi trường theo tỷ lệ 1:1 trong ống ly tâm vô trùng đáy nhọn 15ml (ống falcon) (mẫu cryptozoospermia). Đối với mẫu PESA và TESE thì tiến hành ly tâm, không cần pha loãng.

3. Cho toàn bộ mẫu vào tube ly tâm đáy nhọn vô trùng.

4. Ly tâm gom mẫu ở 300 – 500 g trong 5 – 10 phút.

5. Hút bỏ dịch nổi một cách cẩn thận, chừa lại khoảng 0,3ml cặn.

6. Chuyển cặn sang tube ly tâm đáy tròn 5ml có sẵn 3ml môi trường mới.

7. Ly tâm lặp lại ở 300 – 500g trong 3 – 5 phút.

8. Hút bỏ dịch nổi.

9. Chừa lại khoảng 0,2 ml cặn và trộn đều.

10. Lặp lại bước 7 và 8 với 2ml môi trường mới.

11. Kiểm tra tinh trùng thu được dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá mật độ và đi động của tinh trùng sau khi chuẩn bị.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

83

84

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

12. Để tube này ở trong tủ thao tác cho đến khi chuẩn bị làm ICSI. Chú ý Có thể tăng tốc độ và thời gian ly tâm để thu được nhiều tinh trùng hơn. Điều này tùy thuộc vào kinh nghiệm của người thao tác.

2. Chuẩn bị tinh trùng đối với trƣờng hợp tinh trùng thu từ tinh hoàn Tinh trùng trong tinh hoàn được thu nhận bằng kỹ thuật sinh thiết mở (TESE). Tinh trùng thu nhận từ kỹ thuật này có lẫn các tế bào mầm và rất nhiều hồng cầu, do đó cần phải làm sạch mẫu để trước khi áp dụng các phương pháp chuẩn bị tinh trùng thông thường. Để tăng lượng tinh trùng thu được từ các ống sinh tinh, mẫu cần phải được xử lý bằng phương pháp cơ học: 1. Dùng lamelle ép mô tinh hoàn vào đáy đĩa petri để thu dịch tiết ra từ mô tinh hoàn.

2.

Dùng kim nhọn hay kẹp để xé nhỏ mô tinh hoàn, cắt đứt các ống sinh tinh để thu tinh trùng trong đĩa chứa môi trường nuôi cấy.

Mẫu tinh trùng thu nhận từ phương pháp TESE cũng được chuẩn bị

tương tự như mẫu thu nhận tinh trùng từ PESA hoặc MESA.

3. Chuẩn bị tinh trùng trong trƣờng hợp xuất tinh ngƣợc dòng Ở một số nam giới, tinh dịch đi vào bàng quang khi xuất tinh, kết quả là không có tinh dịch hoặc không xuất tinh rõ ràng. Điều trị xuất tinh ngược dòng bằng thuốc không hiệu quả, do đó tinh trùng vẫn có thể được tìm thấy trong nước tiểu. Nước tiểu có pH acid gây ảnh hưởng xấu đến tinh trùng, do đó nên kiềm hoá nước tiểu trước khi lấy mẫu. Có thể kiềm hóa nước tiểu bằng cách cho bệnh nhân uống sodium bicarbonate,

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

để gia tăng cơ hội thu được tinh trùng từ trong nước tiểu mà vẫn duy trì được đặc tính di động của tinh trùng (Mahadevan và cs, 1981).  Tại phòng xét nghiệm, bệnh nhân được yêu cầu: 1. Uống sodium bicarbonate trong 24 giờ trước khi lấy mẫu 2. Tại thời điểm lấy mẫu, bệnh nhân đi tiểu nhưng không tiểu hết.

3. Xuất tinh vào lọ vô trùng bằng cách thủ dâm.

4. Đi tiểu vào lọ vô trùng thứ 2 có chứa môi trường nuôi (nhằm kiềm hoá nước tiểu).  Xử lí mẫu 1. Ly tâm 500 g trong 8 phút để cô đặc mẫu tinh trùng từ nước tiểu.

2. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp gradient trên thang nồng độ không liên tục. Đề nghị: Có thể điều chỉnh quy trình ly tâm trên thang nồng độ với những mẫu khác nhau như: giảm thể tích dung dịch gradient để rút ngắn quãng đường di chuyển của tinh trùng hoặc tăng thời gian ly tâm đối với những mẫu có độ nhớt cao nhằm tăng tối đa hiệu suất thu hồi.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

85

86

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHẦN V: QUY TRÌNH TRỮ LẠNH TINH TRÙNG

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

87

88

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

A. Giới thiệu Trữ lạnh tinh trùng là một phần việc quan trọng của phòng xét nghiệm có phân tích tinh dịch, liên quan đặc biệt đến vô sinh lâm sàng.

Kỹ thuật này ra đời vào cuối thập niên 1940, từ việc khám phá ra vai trò của glycerol giúp bảo vệ tinh trùng chống lại những tổn thương do quá trình hạ nhiệt độ để bảo quản tinh trùng người trong nước đá khô ở 79oC (Polge và cs, 1979, Bunge & Sherman, 1953; Bunge và cs., 1954). Sau đó, nitơ lỏng được sử dụng trong đông lạnh tinh trùng và kỹ thuật này phát triển nhanh chóng ở nhiều quốc gia trên thế giới (Perloff và cs., 1964; David và cs., 1980; Clarke và cs., 1997; Leibo và cs., 2002).

Có nhiều quy trình trữ lạnh tinh trùng và chất bảo quản đông lạnh khác nhau. Tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau đông lạnh, rã đông phụ thuộc phần lớn vào việc giảm thiểu sự hình thành tinh thể nội bào. Để ngăn chặn được sự hình thành của tinh thể nội bào cần phải sử dụng chất bảo quản và tốc độ làm lạnh và làm ấm phù hợp (Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995). Khi trải qua giai đoạn trên -130oC (nhiệt độ chuyển tiếp hình thành tinh thể đá), đặc biệt trong giai đoạn rã đông, có thể xảy ra sự tái hình thành tinh thể đá nội bào, điều này gây tổn thương đến khả năng sống của tinh trùng sau rã đông.

Tinh trùng người có thể chịu được sự thay đổi nhiệt độ (làm lạnh, làm ấm). Tinh trùng ít nhạy cảm đối với nhiệt độ, do đó chúng ít bị tổn thương trong quá trình trữ lạnh, rã đông so với các loại tế bào khác.

Nguyên nhân có thể là do màng tế bào tinh trùng là màng lipid kép, được cấu tạo từ các acid béo không bão hoà nên tính thấm cao (Clarker và cs, 2003). Hơn nữa, lượng nước chứa trong tế bào tinh trùng thấp hơn (50%) so với các tế bào khác nên khả năng chịu đựng với quá trình đông lạnh cũng cao hơn. Tuy nhiên, quá trình đông lạnh gây tổn hại đến chức năng của tinh trùng, đặc biệt là khả năng di động. Tỷ lệ sống trung bình của http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

tinh trùng sau trữ lạnh, rã đông khoảng 50% (Keel và Webster, 1993). Việc tối ưu hoá quy trình trữ lạnh giúp giảm thiểu tổn thương lên tế bào tinh trùng và làm tăng tỷ lệ thai lâm sàng (Woods và cs, 2004).

Tỷ lệ có thai sau khi thực hiện các kỹ thuật thụ tinh nhân tạo với tinh trùng đông lạnh hiến có liên quan đến quá trình giải đông, thời gian bơm tinh trùng, và các yếu tố khác như tuổi của người nhận, tiền sử có thai và các rối loạn khác về buồng trứng và tử cung (Le Lannou & Lansac, 1993). Nếu tinh trùng được lưu trữ trong điều kiện thích hợp, chất lượng tinh trùng sẽ ít bị ảnh hưởng theo thời gian. Đã có trẻ được sinh ra bằng kỹ thuật thụ tinh với trứng từ tinh trùng được trữ lạnh trên 28 năm.

(Feldschuh et al, 2005;. Clarke và cs, 2006.)

B. Các lý do trữ lạnh tinh trùng Tinh dịch của người bình thường được đông lạnh để sử dụng về sau. Những người này cũng có thể hiến tinh trùng cho các trung tâm điều trị hoặc ngân hàng tinh trùng, mẫu được lưu trữ dưới dạng vô danh. Tinh trùng của người hiến tặng sử dụng trong AI, IUI, IVF hoặc ICSI cho các mục đích sau: Cho vợ của một người nam vô sinh, không có tinh trùng sống hay tinh tử thích hợp cho ICSI, hoặc đã điều trị thất bại hay chi phí cho điều trị quá cao.

Ngăn ngừa lây truyền một số bệnh do rối loạn di truyền.

Ngăn ngừa thai thiếu máu tán huyết do không tương thích nhóm máu; Sau khi sẩy thai tái phát, nếu sử dụng tinh trùng hiến có thể giúp mang thai thành công; Cho những phụ nữ độc thân muốn có con.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

89

90

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

I.

Bảo tồn khả năng sinh sản

Tinh dịch có thể được thu nhận và bảo quản trước khi nam giới chuẩn bị phẫu thuật hay điều trị một số bệnh mà có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của họ, như là: Thắt ống dẫn tinh (Trong trường hợp thay đổi hôn nhân trong tương lai hay muốn có thêm con). Điều trị với các tác nhân gây độc tế bào hoặc xạ trị, mà có thể ảnh hưởng quá trình sinh tinh vĩnh viễn (Meseguer và cs, 2006;.

Schmidt và cs, 2004.)

Thực hiện nhiệm vụ nguy hiểm. Ví dụ: trong quân đội. Ở nhiều nước việc có con với tinh trùng của người chết được sự chấp nhận của pháp luật.

II. Điều trị vô sinh Tinh trùng của chồng được trữ lạnh để sử dụng cho vợ bằng thụ tinh nhân tạo với tinh dịch của chồng (AIH), IUI, IVF hoặc ICSI trong các trường hợp: Có quá ít tinh trùng di động trong tinh dịch sau nhiều lần thử tinh dịch đồ. (Lưu trữ để dành cho ICSI) (Bourne và cs, 1995.) Điều trị vô sinh trong một thời gian dài nhưng vẫn chưa khỏi, chẳng hạn như phẫu thuật do tắc nghẽn đường sinh dục hoặc điều trị gonadotrophin ở hội chứng giảm gonadotropin ở vùng dưới đồi-tuyến yên; Thu nhận mẫu trong trường hợp đặc biệt, như xuất tinh có hỗ trợ cho bệnh nhân chấn thương cột sống, tinh trùng xuất tinh ngược dòng trong nước tiểu, hoặc phẫu thuật thu nhận tinh trùng từ đường sinh dục; Người chồng không thể lấy mẫu tươi vào ngày thực hiện quy trình ART. http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý Khi đông lạnh mẫu tinh dịch bình thường để dự trữ hoặc điều trị hiếm muộn, cần dự trữ ít nhất 03 mẫu nhằm đảm bảo cơ hội có thai. Với mẫu tinh trùng bất thường, việc chia nhỏ mẫu cho AIH chưa được chứng minh là có tác dụng tốt hơn.

Trong kỹ thuật ICSI thì chỉ cần một tinh trùng cho một tế bào trừng, do đó đông lạnh mẫu có bất kỳ tinh trùng sống nào cũng đều có ý nghĩa.

Trữ lạnh tinh dịch trước khi thực hiện kỹ thuật hỗ trợ sinh sản có giá trị tâm lý đáng kể. Nó tạo hy vọng làm cha cho bệnh nhân. Đối với bệnh nhân chuẩn bị điều trị bằng các nhân tố alkyl hóa hoặc xạ trị cần thu nhận tinh trùng trước khi điều trị vì trong quá trình điều trị, tinh trùng có thể bị đột biến. Những bệnh nhân này cần được tư vấn để trữ lạnh tinh dịch.

C. Đánh giá rủi ro của kỹ thuật trữ lạnh và bảo quản tinh dịch ngƣời I.

Nguồn mẫu Đảm bảo tình trạng vật lý của các ống lưu trữ, mẫu tinh dịch và phòng lưu trữ để giảm nguy cơ mất mẫu do trộm cắp hoặc cháy nổ, hư hỏng ống trữ đông, hoặc thiếu nitơ lỏng.

Sự dụng các thiết bị đúng với mục đích sử dụng.

Hệ thống chứa và thay nitơ.

II. Thiết bị bảo hộ, an toàn đối với nhân viên Thiết bị bảo vệ cá nhân.

Hệ thống báo động phát hiện lượng nitơ lỏng và oxy trong không khí thấp.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

91

92

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

III. Nguy cơ lây nhiễm chéo Để giảm nguy cơ lây nhiễm chéo của các mẫu lưu trữ (ví dụ như lây truyền HIV, viêm gan B hoặc C trong cung một bình trữ lạnh), cần chú ý đến: Loại dụng cụ chứa: cọng rạ hay straw và phương pháp hàn kín các ống này (nhiệt hoặc polymer); Quy trình lưu trữ và bảo quản: nitơ lỏng hoặc hơi nitơ .

Quy trình và phương pháp lưu trữ những mẫu có nguy cơ lây nhiễm cao (mẫu biết hoặc nghi ngờ có chứa virus).

IV. Đảm bảo an toàn cho mẫu đông lạnh Chia nhỏ mẫu và lưu trữ ở các vị trí khác nhau để làm giảm nguy cơ mất mẫu hoàn toàn.

Kiểm tra chéo 2 lần tên tuổi của mẫu ở mỗi bước.

Sử dụng nhãn tốt và ghi mã số nhận diện mẫu.

Có thủ tục kiểm kê thường xuyên các vật liệu và các mẫu còn lại trong bồn chứa đông.

D. Quy trình đông lạnh – rã đông tinh trùng I.

Quy trình đông lạnh tinh dịch 1.

Quy trình chuẩn

a.

Chuẩn bị chất bảo quản đông lạnh và ống đông

Sử dụng môi trường Sperm Freeze (FertiPro – Bỉ). Chia nhỏ môi trường thành tube nhỏ trong ống ly tâm có thể tích 5ml và cất trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 – 8oC cho đến khi sử dụng.

b.

Chuẩn bị cryotube

Chuẩn bị số cryotube cần thiết để đông tinh trùng.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Ghi các thông tin lên cryotube: họ tên bệnh nhân, năm sinh, số CMND; ngày trữ đông, mã số đông.

Chú ý Tất cả các quy trình liên quan đến việc xác định mẫu của bệnh nhân hay người cho (bao gồm việc nhận mẫu, chuẩn bị, ghi ký hiệu, đặt mẫu vào bình chứa, rã đông,…) được kiểm tra chéo bởi 2 người và ký tên xác nhận.

Chỉ thực hiện mỗi lần một mẫu để tránh nhầm lẫn.

c.

Chuẩn bị trước khi đông

1. Để tube môi trường Sperm Freeze ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút trước khi sử dụng.

2. Ghi các thông tin lên cryotube: họ tên bệnh nhân, năm sinh, số CMND; ngày trữ lạnh, mã số đông.

3. Đánh giá sơ bộ tinh trùng, đo thể tích tinh dịch, đánh giá độ di động và mật độ tinh trùng trước khi thực hiện trữ đông.

4. Cho toàn bộ tinh dịch vào tube 14ml đáy tròn.

5. Nhỏ từ từ từng giọt chất bảo quản đông và tube chứa tinh dịch theo tỷ lệ: 0,7 : 1.

6. Sau khi hoàn tất, nhỏ một giọt tinh dịch lên lame để đánh giá độ di dộng của tinh trùng trước khi trữ đông.

7. Đậy chặt nắp, để mẫu ổn định trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành trữ đông.

8. Chuyển hỗn hợp vào cryotube.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

93

94

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý Glycerol nồng độ cao có thể gây hại cho tinh trùng, vì vậy nên nhỏ từng giọt chất bảo quản kết hợp với lắc đều hỗn hợp.

Thể tích hỗn hợp không chiếm quá 90% thể tích cryotube.

d.

Thực hiện đông tinh trùng

Quá trình đông tinh trùng được thực hiện bằng máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất qua các bước sau:

1. Đặt cryotube vào giá đựng.

2. Đổ nitơ lỏng bồn chứa nitơ (cryobath) của máy.

3. Lắp đặt hệ thống theo hướng dẫn.

4. Khởi động máy và vặn núm chỉnh tốc độ quạt ở chế độ 500 vòng trong 6 phút

5. Chuyển sang chế độ 1000 vòng trong 20 phút.

6. Thả giá đựng có gắn cryotube vào bồn nitơ lỏng.

7. Gắn cryotube lên thanh nhuôm (cane) và đặt trong khay chứa trong bình nitơ lỏng và trữ đông cho đến khi sử dụng.

2. Quy trình đông lạnh dành cho các mẫu tinh trùng ít và tinh trùng thu nhận bằng phẫu thuật

a.

Đối với mẫu tinh dịch chỉ có ít tinh trùng di

động, hay tinh trùng được thu nhận từ tinh hoàn hay mào tinh, có thể được trữ lạnh cho ICSI: Khi cần thiết, ly tâm tinh dịch 1500g trong 10 phút để cô đặc tinh trùng trong thể tích nhỏ (0,5ml), bổ sung chất bảo quản lạnh và xử lý theo quy trình bình thường.

b.

Đối với dịch mào tinh, dịch ly trích từ tinh hoàn

hoặc các dịch huyền phù tinh trùng khác :

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Xử lý bằng phương pháp swim-up hoặc gradient, sau đó cho vào môi trường dành cho chuẩn bị tinh trùng có các chất bảo quản đông lạnh thương mại có chứa albumin người rồi đông lạnh theo quy trình bình thường.

c.

Quy trình thực hiện

1. Nếu thể tích mẫu lớn hơn 2.0 ml, và có quá ít tinh trùng di động, ly tâm ở 1500g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

2. Loại bỏ phần nổi, chừa lại khoảng 1ml và lắc đều để hòa cặn. Xác định tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động, nếu ít tinh trùng di động, ước đoán mật độ di động trực tiếp trên lame.

3. Thực hiện đông và trữ đông tinh trùng như quy trình chuẩn ở trên.

II. Giải đông tinh dịch đông lạnh 1. Trước khi sử dụng, lấy cryotube chứa tinh trùng đông lạnh cần rã đông ra khỏi bình nitơ lỏng, đặt trên giá hoặc khăn giấy cho đến đến khi đạt đến nhiệt độ phòng (khoảng 10 đến 20 phút).

2. Đánh giá độ di động tinh trùng sau rã đông (đánh giá trên tiêu bản ướt).

3. Loại bỏ chất bảo quản đông lạnh bằng cách pha loãng và rửa với môi trường. Thực hiện rửa nhiều lần, mỗi lần với thể tích nhỏ.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

95

96

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

PHỤ LỤC

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

97

98

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

A. Trang thiết bị và an toàn thiết bị I.

Các thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm

Nam khoa 1.

Các trang thiết bị thông thƣờng trong phòng xét

nghiệm Bàn làm việc, với mặt bàn không thấm nước.

Tủ thao tác Tủ lạnh Máy ly tâm.

 Máy ly tâm phải đạt 300 – 500g (đối với các mẫu tinh trùng thường quy và nước tiểu)

 Máy ly tâm tốc độ cao hơn, đạt 1500g (đối với mẫu nghi ngờ azoospermia).

Máy vortex: dùng để pha loãng tinh dịch.

Tủ ấm (37oC), thường có 5% (v/v) CO2 (nếu cần).

Kính hiển vi quang học và vật kính: dùng để đếm mật độ tinh trùng với độ nhạy cao và để xét nghiệm phản ứng cực đầu).

Máy bách phân bạch cầu Đồng hồ bấm giờ: dùng cho chuẩn bị mẫu mẫu quản lý chất lượng.

Tủ hút để trữ và làm việc với các hoá chất hoặc thuốc nhuộm.

Thùng rác:

 Thùng bỏ các vật sắc, nhọn.  Thùng chứa rác nguy hiểm.

Máy vi tính: lưu trữ, in ấn kết quả xét nghiệm Bồn rửa tay.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

2. Các dụng cụ, hóa chất dùng trong xét nghiệm tinh dịch:

a.

Dụng cụ

Găng tay dùng 1 lần.

Lọ đựng mẫu tinh dịch: Lọ dùng một lần có miệng rộng và có vạch chia thể tích.

Giấy lọc, 90g/m2 (dùng để lọc thuốc nhuộm).

Giấy đo pH (đo được trong khoảng 6 – 10).

Buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Neubauer cải tiến, có lamelle phủ dày (độ dày số 4, 0.44mm).

Lame:

 Lame làm bằng thuỷ tinh, có thiết kế bề mặt nhám và lamelle phủ (độ dày số 1.5, 0.16 – 0.19mm).

 Lame trơn dùng để kéo trải giọt tinh dịch trên lame khác để tạo tiêu bản Đầu col: vàng, xanh Micropipette: 1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl Pipette

 Pipette

Pasteur với ống nhỏ giọt bằng nhựa, pipette

chuyển bằng nhựa dùng một lần hoặc pipette tự động dùng để trộn tinh dịch.

 Pipette loại bỏ khí.  Pipette đo từ 10 - 100μl.

Bút bi/bút chì:

 Dùng để viết trên phần mờ của tiêu bản (phần nhám); chỉ cần một cây bút chì có độ mềm HB.

 Bút chì đánh dấu PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

99

100

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Đĩa Nune 4 giếng: dùng cho xét nghiệm eosin-nigrosin.

Khăn giấy: không có xơ vải.

b.

Hoá chất

Môi trường đông lạnh (nếu cần).

Môi trường gradient.

Thuốc nhuộm Papanicolaou.

Thuốc nhuộm eosine-nigrosine Dung dịch đếm mật độ tinh trùng

3. Các dụng cụ, hóa chất bảo vệ an toàn trong phòng xét nghiệm Dụng cụ sơ cứu.

Xà phòng hoặc dung dịch sát khuẩn da.

Cồn 70o Cồn 90o Thuốc rửa mắt.

Dung dịch sodium hypochlorite 1% (v/v) trong nước tinh khiết.

Cẩm nang an toàn sinh học phòng thí nghiệm (WHO, 2004).

Bảng báo cáo kết quả xét nghiệm tinh dịch.

II. Các mối nguy trong phòng xét nghiệm Nam khoa Tinh dịch có khả năng truyền nhiễm bệnh, nên mọi thao tác phải hết sức cẩn thận. Đối với phòng xét nghiệm Nam khoa, những vi sinh vật có khả năng lây nhiễm từ tinh dịch là HIV, hepatitis B và C (HBV và HCV).

Nhân viên phòng xét nghiệm nên coi tất cả các mẫu tinh dịch là mẫu có nhiễm bệnh và phải thật cẩn thận khi thực hiện các xét nghiệm với mẫu.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

III. Các thao tác an toàn cho nhân viên phòng thí

nghiệm Tất cả nhân viên phòng xét nghiệm nên được tiêm ngừa viêm gan siêu vi B. Không được ăn uống, hút thuốc hoặc cất trữ thức ăn trong phòng xét nghiệm Nam khoa.

Không hút pipette bằng miệng. Sử dụng pipette cơ học để hút tinh dịch.

Tất cả nhân viên phòng xét nghiệm nên mặc đồ phòng thí nghiệm hoặc mặc áo choàng dùng một lần trong phòng thí nghiệm và cởi bỏ khi ra khỏi phòng thí nghiệm.

Nhân viên phòng xét nghiệm nên đeo găng sử dụng một lần (bằng bao su, nhựa hoặc vinyl, có bột hoặc không bột), nhất là khi cầm mẫu tinh dịch tươi hoặc đông, hay tinh tương hoặc các mẫu sinh học khác. Phải bỏ găng tay khi rời khỏi phòng hoặc khi dùng điện thoại hay máy vi tính và không được sử dụng lại găng này.

Nhân viên nên rửa tay thường xuyên, nhất là trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm, sau khi xét nghiệm mẫu và sau khi gỡ bỏ áo choàng và găng.

Nhân viên nên tránh bị thương bởi các vật sắc nhọn để tránh nhiễm bệnh từ tinh dịch, tránh để da, vết thương tiếp xúc trực tiếp với tinh dịch.

Tránh làm đổ mẫu tinh dịch, máu hoặc nước tiểu.

Nên để các vật sắc nhọn (kim, dao) trong một hộp đựng riêng sau khi sử dụng. Niêm phong hộp này trước khi đầy và loại bỏ như các vật nguy hiểm khác.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

101

102

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Tất cả các thứ có khả năng độc hại (găng tay, lọ chứa mẫu) nên được thu gom và loại bỏ một cách hợp lý.

Tất cả nhân viên nên đeo khẩu trang thường hoặc khẩu trang phẫu thuật khi làm các xét nghiệm có khả năng tạo giọt hoặc sol khí, ví dụ như vortex và ly tâm trong các vật chứa không đậy nắp. Không nên đẩy mạnh những giọt cuối của mẫu tinh dịch ra khỏi pipette vì nó có thể tạo ra sol khí.

Nhân viên nên đeo kính bảo hộ, găng tay và giày kín khi cần thiết, ví dụ như khi sử dụng nitơ lỏng.

IV. An toàn khi sử dụng các thiết bị phòng xét nghiệm Bề mặt bàn làm việc và các dụng cụ được sử dụng lại nên được rửa sạch và tiệt trùng. Cần thực hiện các quy tắc an toàn sau:  Hằng ngày, sau khi xét nghiệm xong phải: Lau sạch chỗ làm việc bằng thuốc tẩy như sodium hypochlorite 0,1% (1g/l) hoặc những chất tẩy rửa tương tự, đợi ít nhất 1 giờ (hoặc qua đêm) rồi rửa lại bằng nước.

Ngâm các buồng đếm và lamelle phủ trong xà phòng có sodium hypochlorite 0,1% (1g/l) hoặc các chất tẩy khác qua đêm. Rửa lại bằng nước.  Khi làm đổ mẫu: Nếu bên ngoài lọ đựng mẫu bị dơ thì rửa với chất tẩy rửa, sodium hypochlorite 0,1% (1g/l) hoặc các chất tẩy tương tự, sau đó rửa lại bằng nuớc.

Nếu quá trình thao tác làm đỗ mẫu: phải rửa lại bàn làm việc bằng chất tẩy rửa (Ví dụ sodium hypochlorite 1% (10g/l) hoặc các chất tẩy rửa tương tự, đợi ít nhất 4 giờ rồi rửa lại bằng nước).

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

V. An toàn khi sử dụng nitơ lỏng Nitơ lỏng rất nguy hiểm, phải cẩn thận khi sử dụng và chỉ sử dụng những bình chứa chuẩn, không được dán kín miệng bình chứa. Dùng kẹp để lấy mẫu từ nitơ lỏng ra ngoài. Đeo mặt nạ bảo vệ hoặc kính bảo hộ để bảo vệ mắt. Sử dụng bao tay làm bằng da hoặc vật liệu cách điện khô, rộng vừa phải để bảo vệ tay. Mang giày kín để bảo vệ chân.

Khi nitơ lỏng đổ trên một bề mặt thì nó có xu hướng tràn trên khắp bề mặt và làm lạnh một vùng rộng. Những vật mềm và dẻo ở nhiệt độ phòng thường trở nên cứng và giòn ở nhiệt độ của nitơ lỏng. Nhiệt độ cực thấp có thể tạo ra những vết thương nghiêm trọng. Nếu bị nhỏ lên da thì da có triệu chứng như bị bỏng. Khí từ nitơ lỏng rất lạnh, những vùng mô mỏng manh như mắt có thể bị tổn thương do khí này mặc dù nó không ảnh hưởng đến da mặt hoặc da tay. Đứng tránh xa khi nitơ lỏng sôi và bắn ra ngoài, và tránh cả hơi nitơ lạnh. Khi sử dụng một bình chứa ấm hoặc khi nhúng một vật nào đó vào nitơ lỏng thì sẽ xảy ra hiện tượng sôi và bắn tung toé. Phải luôn thao tác chậm để hạn chế tối đa hiện tượng này. Tránh chạm những ống dẫn không cách điện. Không được chạm bất kỳ phần cơ thể không được bảo vệ nào vào ống hoặc bình chứa nitơ lỏng. Kim loại ở nhiệt độ cực lạnh có thể dán dính nhanh và thịt có thể bị xé ra khi cố tách nó ra khỏi kim loại này.

Làm việc trong khu vực thông thoáng. Một lượng nitơ lỏng nhỏ có thể hình thành một lượng khí lớn (ở nhiệt độ phòng nó tạo ra một lượng khí có thể tích nhiều gấp 9 lần so với thể tích lỏng). Nếu khí nitơ bốc hơi trong phòng kín thì phần trăm oxy

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

103

104

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

trong không khí có thể sẽ thấp và có thể gây ngạt. Nên sử dụng đầu dò đo oxy ở nơi trữ nitơ lỏng, đầu dò sẽ phát báo động khi mực oxy dưới 17% (v/v).

Chỉ sử dụng ống tube và cọng rạ được thiết kế dành riêng cho đông lạnh trong nitơ lỏng. Phải luôn luôn cẩn thận vì những vật này có thể nổ khi chúng được làm ấm.

B. Cách tính lực ly tâm Tinh trùng phải chịu một áp lực trong quá trình ly tâm và độ lớn của lực này phụ thuộc vào tốc độ quay (N, vòng/phút, r.p.m) và khoảng cách từ tâm rotor đến đáy tube ly tâm (nơi đo lực ly tâm) (radius, R, cm).

Lực ly tâm được tính theo công thức: 1,118 x 10-5R x N2. Ví dụ, với bán kính là 8,6cm, ly tâm ở 5000 r.p.m thì lực ly tâm là 2404g; với bán kính 13.5cm, ly tâm ở 3900 r.p.m thì lực ly tâm là 2296g.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Giản đồ xác định lực ly tâm từ bán kính rotor và tốc độ quay Nối một đường thẳng từ cột bán kính rotor (cm, cột bên trái) với tốc độ quay (r.p.m, cột bên phải) và cắt cột giữa ở lực ly tâm. Ví dụ, với bán kính rotor là 8cm và tốc độ quay là 2500r.p.m thì lực ly tâm ở khoảng 550g. (giá trị tính được là 559g).

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

105

106

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

C. Sử dụng kính hiển vi Để đánh giá tinh dịch theo phương pháp được giới thiệu trong cẩm nang này cần có một một kính hiển vi phản pha. Kính hiển vi này phải có công suất bóng đèn tối thiểu là 50W, có 2 thị kính, một tụ sáng và các vật kính với độ phóng đại x10, x20 (hoặc x25) và x40 (hoặc x63) (dùng cho các đánh giá tổng quan, độ di động, tỷ lệ sống và đếm tinh trùng, và tìm tinh trùng trong mẫu ly tâm), một vật kính dầu x100 (dùng cho đánh giá hình dạng và tỷ lệ sống).

Quy trình mô tả dưới đây sẽ đảm bảo cho hình ảnh tốt nhất khi quan sát kính hiển vi. Nếu đường chiếu ánh sáng được sắp thẳng hàng và điều chỉnh thì hình ảnh sẽ rõ, sinh động và hầu như không làm mỏi mắt. Cần thực hiện quy trình sau khi sử dụng một kính hiển vi mới hoặc khi hình ảnh quan sát trên kính không tốt.

I.

Load mẫu

1. Đặt 10μl tinh dịch lên lame, phủ lamelle 22mm x 22mm (độ dày 1.5; 0,17mm) và đặt tiêu bản lên bàn kính. Bạn cũng có thể sử dụng một trắc vi vật kính thay cho lame tinh dịch để điều chỉnh kính hiển vi.

2. Bật đèn và chỉnh cường độ sáng cho độ tương phản cao nhất mà mắt vẫn cảm thấy thoải mái.

3. Chọn vật kính pha dương x10. Quay bánh điều chỉnh tụ sáng đúng với độ phóng đại của vật kính.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Chú ý Nếu kính hiển vi là loại có 3 thị kính (trong đó 1 thị kính được dành cho máy quay phim để chụp hình hoặc quay phim) thì máy sẽ có một nút chỉnh độ lệch sáng, thường nằm ở bên phải thị kính. Nút này có 3 chế độ chỉnh: một chế độ cho phép tất cả ánh sáng đi qua thị kính, một chế độ cho phép tất cả ánh sáng đi tới camera và cái thứ 3 chia nửa ánh sáng qua thị kính và nửa tới camera.

II. Điều chỉnh thị kính Điều chỉnh khoảng không giữa thị kính tới mắt bằng cách kéo ra, đẩy vào.

III. Điều chỉnh làm rõ nét hình ảnh 1. Quay ốc sơ cấp để di chuyển bàn kính lên gần vật kính x20 hoặc x40. Quan sát vật kính và bàn kính ở trước hoặc 2 bên khi quay nút vặn, không nhìn qua thị kính, để tránh làm vỡ vật kính và tiêu bản. Sử dụng ốc sơ cấp để điều chỉnh độ cao của bàn kính cho đến khi tiêu bản gần đụng vào vật kính.

2. Quan sát qua thị kính, từ từ vặn ốc sơ cấp để dịch chuyển bàn kính ra xa vật kính cho đến khi quan sát thấy mẫu. Vặn ốc vi cấp đến khi quan sát rõ mẫu.

Chú ý Nếu không quan sát được mẫu thì thử lấy nét ở cuối tiêu bản để đạt khoảng cách gần với mặt phẳng lấy nét đúng.

IV. Lấy nét tại thị kính Với một số kính hiển vi, 2 thị kính có thể được điều chỉnh riêng biệt. Với một số khác khi điều chỉnh 1 thị kính thì thị kính kia cũng tự động được điều chỉnh theo.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

107

108

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Những thị kính có thể điều chỉnh được thường được thước đo “+ / 0 / -“. Để thị kính ở vạch “0” trước khi điều chỉnh. Đối với kính hiển vi điều chỉnh 1 thị kính thì chỉ nhìn qua thị kính điều chỉnh (nhắm hoặc che mắt kia đi).

Lấy nét hình ảnh của mẫu bằng ốc vi cấp. Nên quan sát một vật không di động ví dụ như tinh trùng chết, cặn hoặc lưới ô micro trên tiêu bản.

Lấy nét ở thị kính điều chỉnh bằng cách nhìn qua nó và nhắm hoặc che mắt kia. Quay vòng điều chỉnh ở dưới thị kính đến “+” hoặc “-“ cho đến khi quan sát rõ vật.

V. Chỉnh độ sáng Đóng màng chắn sáng (che nguồn sáng ở chân kính).

Tăng hoặc giảm độ sáng bằng nút vặn ở bên trái hoặc phải tụ sáng cho đến khi tụ sáng tập trung rõ nét nhất, lúc này vòng ánh sáng sẽ nhỏ và rõ, thường là khi tụ sáng ở vị trí cao nhất.

Rìa ngoài ánh sáng có thể thay đổi từ xanh qua đỏ khi tụ sáng được chỉnh đúng (quang sai màu sắc), và rìa ngoài tụ sáng sẽ hơi mờ. Ánh sáng có thể có hoặc không có tâm.

Chú ý Nếu độ mở vi trường không có màng iris thì tập trung vào một vật rõ nét (ví dụ như điểm chấm bút chì) đặt trên nguồn sáng.

VI. Điều chỉnh tâm tụ sáng Lấy tâm màng chắn sáng bằng cách chỉnh các nút vặn điều chỉnh tâm tụ sáng. Thường có 2 nút vặn chéo nhau ở đằng trước hoặc bên dưới tụ sáng.

Khi hình ảnh ánh sáng được centred thì mở màng chắn sáng để ánh sáng chiếu vào vi trường. Không được mở máng sáng dưới điểm này. http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

Đóng dần độ mở của tụ sáng cho đến khi không còn chói nữa.

Chú ý Ngay bên dưới bên phải nút vặn chỉnh tâm tụ sáng có thể có những nút vặn khoá vị trí của tụ sáng. Cẩn thận không được vặn chúng khi đang điều chỉnh tâm tụ sáng vì khi những nút này bị lỏng thì tụ sáng sẽ bị rơi ra khỏi kính hiển vi.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

109

110

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

D. Mẫu kết quả phân tích tinh dịch

http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

111

112

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

1. Alvareaz C và cs. (2003). Biological variation of seminal parameters in healthy subjects. Human Reproduction, 18:2082-2088.

2. Andersen AG và cs. (2000). High frequency of sub-optimal semen quality ini an unselected population of young men. Human Reproduction, 15:366-372.

3. Baker HW, Kovacs GT (1985). Spontaneous improvement in semen quality: regreeion towards the mean. International Journal of Andrology, 8:421-426.

4. Behre HM và cs. (2000). Diagnosis of male infertility and hypogonadism. In: Neischlag E, Behre HM, eds. Andrology, mail reproductive health and dysfunction. Berlin, Springer: 92.

5. Berman NG và cs. (1996). Methodological issues in the analysis of human sperm concentration data. Journal of Andrology, 17:68-73.

6. Boomsma CM và cs. (2004). Ssemen preparation techiniques for intrauterine insemination. Cochrane Database of Sustematic Reviews, CD004507.

7. Boure H và cs. (1995). Sperm preparation for intracytoplasmic injection:

methods

and

relationship

to

fertilization

results.

Reproduction, Fertility, Development, 7:177-183.

8. Brazil C và cs. (2004a). Standardized methods for semen evaluation in a multicenter research study. Journal of Androlody, 25:635-644.

9. Bunge RGT, Sherman JK (1953). Fertilizing capacity of frozen human spermatozoa. Nature, 172: 767-768.

10. Bunge RG et al. (1954). Clinical use of frozen semen: report of four cases. Fertility and Sterility, 5:520-529.

11. Canale D và ds. (1994). Inter- and intra-individual variability of sperm morphology adter selection with three different techniques:

http://www.ivfhungvuong.com.vn

113

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

layering,

swimup

form

pellet

and

Percoll.

Journal

of

Endocrinological Investigation, 17:729-732.

12. Carlsen E và cs. (2004). Effects of ejaculatory frequency and season on variations in semen quality. Fertility and Sterility, 82:385-366.

13. Castilla JA và cs. (2006). Influence of analytical and biological variation on the clinical interpretation of seminal parameters.

Human Reproduction, 21:847-851.

14. Clarke GN et al. (1997). Artificial insemination and in-vitro fertilization using donor spermatozoa: a report on 15 years of experience. Human Reproduction, 12:722-726.

15. Clarke GN et al. (2003). Improved sperm cryopreservation using cold cryoprotectant. Reproduction, Fertility, Development, 15:377381.

16. Clarke GN et al. (2006). Recovery of human sperm motility and ability to interact with the human zonapellucida after more than 28 years of storage in liquid nitrogen. Fertility and Sterility, 86:721-722.

17. Cooper TG et al. (1993). Effects of multiple ejaculations after extended periods of sexual abstinence on total, motile and normal sperm numbers, as well as accessory gland secretions, from healthy normal and oligozoospermic men. Human Reproduction, 8:12511258 18. Cooper

TG

et

al.

(2007).

Ejaculate

volume

is

seriously

underestimated when semen is pipetted or decanted into cylinders from the collection vessel. Journal of Andrology, 28:1-4.

19. Correa-Perez JR et al. (2004). Clinical management of men producing ejaculates characterized by high levels of dead sperm and

altered

seminal

plasma

factors

consistent

epididymalnecrospermia. Fertility and Sterility, 81:1148-1150.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

with

114

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

20. De Jonge C et al. (2004). Influence of the abstinence period on human sperm quality. Fertility and Sterility, 82:57-65.

21. de la Taille A et al. (1998). Correlation of genitourinary abnormalities, spermiogram and CFTR genotype in patients with bilateral agenesis of the vas deferens. Progress in Urology, 8:370376.

22. Daudin M et al. (2000). Congenital bilateral absence of the vas deferens: clinical characteristics, biological parameters, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations, and implications for genetic counseling. Fertility and Sterility, 74:1164-1174.

23. David G et al. (1980). The success of A.I.D. and semen characteristics:

study

of

1489

cycles

and

192

ejaculates.

International Journal of Andrology, 3:613-619.

24. Feldschuh J et al. (2005). Successful sperm storage for 28 years.

Fertility and Sterility, 84:1017.

25. Handelsman DJ et al. (1984). Testicular function in potential sperm donors: normal ranges and the effects of smoking and varicocele.

International Journal of Andrology, 7:369-382.

26. Holstein AF et al. (2003). Understanding spermatogenesis is a prerequisite

for

treatment.

Reproductive

Biology

and

Endocrinology, 1:107.

27. Iwamoto T et al. (2006). Semen quality of 324 fertile Japanese men.

Human Reproduction, 21:760-765.

28. Johanisson E et al. (2000). Evaluation of “round cells” in semen analysis: a comparative study. Human Reproduction Update, 6:404412.

29. Jones DM et al. (1986). Immobilization of sperm by condoms and http://www.ivfhungvuong.com.vn

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

their components. Clinical Reproduction and Fertility, 4:367-372.

30. Keel BA (2006). Within- and between-subject variation in semen parameters in infertile men and normal semen donors. Fertility and Sterility, 85:128-134 31. Keel BA, Webster BW (1993). Semen cryopreservation methodology and results. In: Barratt CLR, Cooke ID, eds. Donor insemination.

Cambridge, Cambridge University Press: 71-96.

32. Le Lannou D, Lansac J (1993). Artificial procreation with frozen donor semen: the French experience of CECOS. In: Barratt CLR, Cooke ID, eds. Donor insemination. Cambridge, Cambridge University Press: 152-169.

33. Leibo SP et al. (2002). Cryopreservation of human spermatozoa. In: Vayena E et al., eds. Current practices and controversies in assisted reproduction. Geneva, World Health Organization: 152-165.

34. Meseguer M et al. (2006). Sperm cryopreservation in oncological patients: a 14-year follow-up study. Fertility and Sterility, 85:640645.

35. Ng KK et al. (2004). Sperm output of older men. Human Reproduction, 19:1811-1815 36. Overstreet JW et al. (1980). In-vitro capacitation of human spermatozoa after passage through a column of cervical mucus.

Fertility and Sterility, 34:604-606.

37. Perloff WH et al. (1964). Conception with human spermatozoa frozen by nitrogen vapor technique. Fertility and Sterility, 15:501504.

38. Poland ML et al. (1985). Variation of semen measures within normal men. Fertility and Sterility, 44:396-400.

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

115

116

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

39. Polge C et al. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature, 164:626-627.

40. Pound N et al. (2002). Duration of sexual arousal predicts semen parameters for masturbatory ejaculates. Physiology and Behavior, 76:685-689.

41. Rose NR et al. (1976). Techniques for detection of iso- and autoantibodies to human spermatozoa. Clinical and Experimental Immunology, 23:175-199.

42. Schmidt KL et al. (2004). Assisted reproduction in male cancer survivors: fertility treatment and outcome in 67 couples. Human Reproduction, 19:2806-2810 43. Sherman JK (1990). Cryopreservation of human semen. In: Keel BA, Webster BW, eds. CRC handbook of the laboratory diagnosis and treatment of infertility. Boca Raton, CRC Press: 229-259.

44. Sobrero AJ, MacLeod J (1962). The immediate postcoital test.

Fertility and Sterility, 13:184-189.

45. Tyler JP et al. (1982a). Studies of human seminal parameters with frequent ejaculation.

46. vonEckardstein S et al. (2000). Seminal plasma characteristics as indicators of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene mutations in men with obstructive azoospermia.

Fertility and Sterility, 73:1226-1231 47. Watson PF (1995). Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their postthawing function. Reproduction Fertility and Development, 7:871891.

http://www.ivfhungvuong.com.vn

117

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

48. Weiske

WH

(1994).

VasektomiemittelsFulgurationstechnik.

Minimal Erfahrungenbei

invasive 1000

Patienten in 12 Jahren. Urologe, B34:448-452 49. Weiske WH et al. (2000). Clinical findings in congenital absence of the vasa deferentia. Andrologia, 32:13-18.

50. WHO (1987). (prepared by Comhaire F et al.) Towards more objectivity in diagnosis and management of male infertility.

International Journal of Andrology, (Suppl. 7): 22-24.

51. WHO (2004). Laboratory biosafety manual, 3rd ed. Geneva, World Health Organization.

52. WHO (2010). Laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5rd ed. Geneva, World Health Organization 53. Woods EJ et al. (2004). Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology, 48:146-156.

54. Zavos PM, Goodpasture JC (1989). Clinical improvements of specific seminal deficiencies via intercourse with a seminal collection device

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

118

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn