320
A. Rehders i wsp.
wykrycia antygenów nabłonkowyh w mezenchymalnej tkance limfatycznej stosowano przez 45 min biotynylowane przeciwciała Ber-EP4 w rozcieńczeniu 1:300 (które grzecznościowo dostarczył Instytut Immunologii, Monachium, Niemcy). Następnie preparat inkubowano przez 75 min z dodatkiem fosfatazy zasadowej skoniugowanej ze streptawidyną (Dako, D 0396, rozcieńczenie 1:100). Kolejno utrwalano koloidalne złoto przez 5 min w 5% roztworze glutaraldehydu (Glutaraldehyde 25%, Merck, Nr. 4239). Po trwającym 15 min płukaniu preparatu destylowaną wodą, dodawano na około 20 min świeżo przygotowaną mieszaninę wzmacniającą zawierającą srebro (IntenSETMM silver enhancement kit, Amersham RPN 491). Następnie obserwując co 5 min skrawki pod mikroskopem monitorowano wytrącanie cząsteczek srebra. W celu określenia właściwego momentu zakończenia reakcji wzmacniania zasadnicze znaczenie ma jednoczesna inkubacja dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych. W celu zatrzymania reakcji wzmacniania, przepłukiwano badane skrawki wodą destylowaną. Aktywność fosfatazy zasadowej wykrywano dodając do preparatu Neufuchsing Fast Red TT (Sigma, Deisenhofen, Germany), co skutkuje intensywnie czerwonym wybarwieniem. Barwienie tła, konieczne dla oceny histologicznej skrawków, przeprowadzono przy użyciu hematoksyliny Gilla. Przeciwciała monoklonalne W badaniu stosowano mysie przeciwciała przeciw następującym ludzkim antygenom: HLA-A, HLA-B i HLA-C. Przeciwciało W6/32 (Dako) jest skierowane przeciw monomorficznemu epitopowi MHC-I ciężkich łańcuchów związanych z b2-mikroglobuliną. Przeciwciało to (IgG2a) stosowano w stężeniu 1,1 µg/ml (rozcieńczenie 1:150) zgodnie z wynikami przeprowadzonych poprzednio testów. Przeciwciało ICAM-I 6,5B5 (Dako) jest skierowane przeciw domenie 1 antygenu ICAM-I. Białko to należy do podklasy IgG1k i było stosowane w stężeniu 1,26 µg/ml (rozcieńczenie 1:300). Przeciwciało PG 5,1 (Progen, Germany) przeciw plakoglobinie, należące do podklasy IgG2b, stosowano w stężeniu 1,21 µg/ml (rozcieńczenie 1:80). Przeciwciało przeciw antygenowi Ki-67 (Dako) wchodzi w skład podklasy IgG1k i było stosowane w stężeniu 1,61 µg/ml. W celu uniemożliwienia reakcji nieswoistych, przygotowano ujemne preparaty kon-
with b2-microglobulin). The IgG2a antibody was used at a concentration of 1.1 µg/ml (dilution 1:150) as previously tested. The ICAM-I antibody, 6.5B5 (Dako), is directed against domain 1 of ICAM-I. This antibody belongs to the subclass IgG1k and was used at a concentration of 1.26 µg/ml (dilution 1:300). The plakoglobin antibody, PG 5.1 (Progen, Germany), belongs to the subclass IgG2b and was used at a concentration of 1.21 mg/ml (dilution 1:80). Ki-67 (Dako) belongs to the antibody subclass IgG1k and was applied at a concentration of 1.61 mg/ml. To exclude non-specific binding, negative controls were performed with irrelevant mouse proteins of identical isotypes (MOPC 21, IgG1 (Sigma) and UPC 10, IgG2 (Sigma)) at corresponding concentrations to the respective primary antibodies. Controls Apart from isotype controls, HLA class-I negative esophageal primary tumors served as negative controls for HLA class-I analysis. The lymphocytes of the examined lymph nodes known to express HLA class-I served as internal positive controls. For ICAM-I staining, ICAM-I negative tumors as well as normal esophageal mucosa were used as negative controls. Lymphocytes as well as lymphatic capillaries were used as internal positive controls for ICAM-I. Due to the absence of epithelial tissue and the small proportion of proliferating cells, lymph node tissue from a patient without malignancy was used as negative control for the evaluation of plakoglobin as well as Ki-67. Normal esophageal mucosa was used as positive control for plakoglobin. Evaluation of the specimen Slides of the primary tumors were evaluated double blinded by two observers using light microscopy as described previously (13). Double stained specimens were evaluated using light microscopy with an epipolarization filter for simultaneous visualisation of immuno-gold colloids and alkaline phosphatase labelling. As most of the primary tumors showed heterogenous expression of the respective antigens, the staining signal was evaluated semiquantitatively in a representative area. Tumors were classified according to the percentage of cells expressing the respective antigen. HLA class-I expression was considered to