912
B. H. Noszczyk i wsp.
ki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem rozcieńczonym w PBS w stężeniu 4 µg/ml przez 30 min., płukano w PBS (Gibco BRL, Life Technologies) i ponownie inkubowano przez 30 min z wtórnym przeciwciałem biotynylowanym. Po wypłukaniu w PBS skrawki inkubowano według zaleceń przez 30 min ze streptawidyną znaczoną peroksydazą, płukano w PBS i inkubowano w chromogenie DAB przez 5-10 min. Kolejno skrawki odwadniano w etanolu i ksylenie i po pokryciu klejem (DPX, Fluka, BioChemika) zamykano. Negatywną kontrolę reakcji immunohistochemicznej przeprowadzano wymieniając pierwotne przeciwciała nieswoistą immunoglobuliną mysią lub PBS. Wszystkie kontrole wypadły negatywnie. WYNIKI Ekspresja =6>4 i ,Np63 w zdrowym naskórku Ekspresja integryny = 6 > 4 odpowiadała uprzednim doniesieniom, przejawiając najsilniejszą reakcją w okolicach dolnych biegunów komórek podstawnych, o ciągłym linijnym charakterze barwienia w strefie połączenia skórno-naskórkowego. Mimo najsilniejszej reakcji na powierzchniach podstawnych komórek bazalnych, słabsze barwienie wykazywały również boczne i szczytowe powierzchnie błon (ryc. 1a). Ekspresja białka ,Np63 w jądrach komórek podstawnych wykazywała charakterystyczny plamisty rozkład. Komórki pozytywne na ,Np63 znajdowały się w grupach rozdzielonych komórkami o słabszej ekspresji (ryc. 1b).
Ryc. 1a. Ekspresja integryny =6>4 w zdrowym naskórku dotyczy warstwy podstawnej komórek (pow. 400x) Fig. 1a. Expression of =6>4 integrin in the healthy epidermis is restricted to the basal layer of keratinocytes (magn. 400x)
Dako. Mouse monoclonal antibody 4A4 against ,Np63 was purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc, and the mouse monoclonal antibody NCL-Ki67-MM1 against Ki67 from Novocastra. Binding of antibodies was demonstrated by the LSAB + detection system (LSAB + peroxidase, Dako) with the use of the DAB chromogen (Dako). Immunohistochemical studies The study was performed as described previously (23). In brief, frozen sections (6 µm) were fixed in cold acetone or 1% formalin in phosphate – buffered saline (PBS) for 10 min., and incubated in 0.1% hydrogen peroxide diluted in PBS for a period of 5 minutes. Immunolocalization of proteins was performed as described by the antibodies’ producers. Sections were incubated with the primary antibody (4 µg/ml) diluted in PBS for 30 min, washed in PBS (Gibco BRL, Life Technologies), followed by incubation for 30 min. with a biotinylated secondary antibody. After PBS washing, sections were incubated for a period of 30 minutes with the provided enzyme reagent (streptavidine), washed in PBS and incubated with the DAB chromogen for 5-10 minutes. Sections were then dehydrated in ethanol and xylene, mounted in a permanent, mounting medium (DPX, Fluka, BioChemika) and covered with glass cover slips. Negative controls of the immunohistochemical procedure consisted of replacing the primary antibody with PBS, and with non-immune mouse immunoglobulins. All controls were consistently negative.
Ryc. 1b. Ekspresja białka ,Np63 w zdrowym naskórku o charakterystycznym plamistym rozkładzie (pow. 400x) Fig. 1b. Expression of the ,Np63 protein in the healthy epidermis has a characteristic „patchy” pattern. (magn. 400 x)