cellen?

De meest voorkomende leukemie op de volwassen leeftijd, chronische lymfatische leukemie (CLL), reageert meestal gunstig op therapie. Na behandeling zijn de leukemiecellen in het bloed vaak niet langer met de microscoop detecteerbaar. Toch keert de ziekte na verloop van tijd bijna altijd weer terug. Met de huidige middelen is CLL, enkele uitzonderingen daargelaten, een ongeneeslijke ziekte.

Dit betekent dat er na behandeling een klein aantal weerbarstige kankercellen in het lichaam achterblijven, die zich na verloop van tijd weer gaan vermenigvuldigen, hetgeen leidt tot een recidief van de ziekte.

Dit ziektestadium, wanneer de leukemiecellen niet langer met routine bloedbeeldonderzoek detecteerbaar zijn, wordt minimale restziekte genoemd (minimal residual disease, MRD). Hoe kleiner het aantal resterende cellen na behandeling, hoe dieper de MRD en hoe langer de te verwachten remissieduur[1]. De diepte van MRD wordt gewoonlijk uitgedrukt als de verhouding tussen de resterende leukemiecellen en de gezonde witte bloedcellen. Zo is de prognose van een patiënt met één leukemiecel per duizend witte bloedcellen (1:1000 of MRD 10-3) aanmerkelijk slechter, dan de prognose van een patiënt met slechts één leukemiecel per tienduizend witte bloedcellen (1:10.000, of MRD 10-4). De MRD-diepte na behandeling kan daarom ook worden gebruikt om de prognose van een patiënt in te schatten en doet regelmatig dienst als eindpunt in klinische studies om de effectiviteit van behandelingsschema’s te kunnen vergelijken.

Figuur 1.Prent uit een editie van Waar is Wally? Op een grote getekende, drukke prent moet de kijker Wally terugvinden. Het is niet altijd eenvoudig om Wally te vinden, gezien het grote aantal andere figuren op de prent. Toch kun je Wally uiteindelijk herkennen aan zijn unieke kenmerken: een stok, een bril en een rood-wit gestreepte trui en muts. Deze draagt Wally altijd bij zich. In deze prent bevindt Wally zich in het midden van de tekening, iets onder het centrum, op het strand.

De speld in de hooiberg

Het meten van MRD kan worden vergeleken met het zoeken naar een spelt in een hooiberg, of met het vinden van Wally in de populaire zoekboekenserie “Waar is Wally?” (zie Figuur 1). In beide scenario’s is het noodzakelijk om in een (zeer) grote deler, een kleine noemer van interesse te vinden die slechts subtiel verschilt van de omringende tegenhangers. Dit vereist het gebruik van een gevoelige en robuuste meettechniek, die feilloos een leukemiecel van een gezonde cel kan onderscheiden.

Het meten van MRD-diepte

In de meeste klinische studies van de afgelopen jaren werd de MRD-diepte gemeten met behulp van multikleur-flowcytometrie, of met kwantitatieve PCR. Aan deze technieken kleven echter een aantal belangrijke methodologische nadelen. Daarnaast kunnen deze technieken in huidige vorm niet routinematig gebruikt worden om dieper te meten dan MRD 10-4. Dit is een belangrijk nadeel, omdat met de huidige, doelgerichte therapieën nog slechts weinig patiënten na behandeling een MRD hebben hoger dan 10-4

In een recente publicatie in het vaktijdschrift Blood beschrijven wij een nieuw, door ons ontwikkeld assay voor het meten van MRD voorbij de grens van 10-4 [2]. Het principe achter deze test is weergegeven in Figuur 2. Elke B-cel vormt tijdens de ontwikkeling, door middel van genetische recombinatie, een unieke DNAsequentie, die codeert voor de zware keten van de B-cel receptor (Immunoglobulin heavy-chain, IGH). Omdat CLL een klonale ziekte is, waarbij alle leukemiecellen zijn ontstaan uit één enkele ontspoorde B-cel, zal elke leukemiecel deze unieke IGH-sequentie in zijn genoom dragen. Deze IGH-sequentie, die per patiënt uniek is, kan worden gebruikt als een soort ‘DNA-vingerafdruk’ om leukemiecellen te herkennen.

Figuur 2

Schematische weergave van het principe achter het IGHV-leader NGS-assay. DNA wordt gezuiverd uit perifere witte bloedcellen van een patiënt na behandeling. De immunoglobuline zware keten wordt met behulp van leader-primers geamplificeerd uit het DNA, waarna deze sequenties worden uitgelezen met behulp van Next-Generation sequencing. Na data-analyse in een immunoprofiler kan de leukemie-specifieke aminozuursequentie (rood) worden teruggezocht in de vergaarde data. De aanwezigheid en talrijkheid van deze sequentie hangt samen met de aanwezigheid en hoeveelheid leukemiecellen.

Ons assay maakt gebruik van dit principe. Na behandeling wordt bloed afgenomen van een patiënt, waarna er uit de witte bloedcellen DNA wordt gezuiverd. Vanuit dit DNA worden de aanwezige IGH-sequenties geamplificeerd. Dit gebeurt met behulp van zogenaamde leader-primers, waarna deze in kaart worden gebracht door middel van Next-Generation Sequencing (NGS) [3] Vervolgens kan met behulp van speciale analyse-software tussen deze IGH-sequenties worden gezocht naar de aanwezigheid van de leukemie-specifieke sequentie: de aanwezigheid en talrijkheid van deze sequentie correleert met de aanwezigheid en diepte van MRD.

De resultaten

In onze publicatie beschrijven wij de eigenschappen van ons IGHleader NGS-assay. We toonden aan dat deze techniek kan meten tot voorbij één leukemiecel per 100.000 gezonde cellen, of zelfs per 1 miljoen gezonde cellen, indien er genoeg DNA beschikbaar is (respectievelijk MRD 10-5 en 10-6). Het assay is dus 10-100 keer gevoeliger dan de conventionele technieken. Om de klinische meerwaarde van de diepere MRD-metingen aan te tonen, gebruikten wij het IGH-leader NGS-assay om de MRD-diepte te meten bij patiënten uit een klinische studie, namelijk de CLL11-studie [4] Met het IGH-leader NGS-assay bleek het mogelijk om drie groepen patiënten te onderscheiden: patiënten met meer dan één leukemiecel per 10.000 gezonde cellen (MRD >10-4), patiënten met één leukemiecel per 10.000-100.000 gezonde cellen (MRD 10-4 – 10-5) en patiënten met minder dan één leukemiecel per 100.000 gezonde cellen (MRD <10-5). Na vier jaar was in de eerste groep patiënten nog slechts 7% in remissie, vergeleken met 25% in de tweede groep, en 67% in de laatste groep. Het verschil tussen de groepen was statistisch significant (zie Figuur 3).

Samenvattend

We ontwikkelden een IGH-leader NGS-assay voor het meten van MRD in CLL. Dit assay bleek 10-100x gevoeliger dan de huidige beschikbare conventionele assays. Het gevoeliger kunnen meten van MRD leidde tot verbeterde prognostificatie in de CLL11-studie [4]. Dit is het eerste, niet-commerciële NGS-assay dat ontwikkeld is voor het meten van MRD in CLL. De primersequenties en protocollen zijn openlijk beschikbaar [1].

Referenties

1. Molica S, Giannarelli D, Montserrat E. Minimal Residual Disease and Survival Outcomes in Patients With Chronic Lymphocytic Leukemia: A Systematic Review and Meta-analysis. Clin. Lymphoma, Myeloma Leuk. 2019;19(7):423–430.

2. Hengeveld PJ, van der Klift MY, Kolijn PM. Detecting measurable residual disease beyond 10-4 through an IGHV leaderbased NGS approach improves prognostic stratification in CLL. Blood. 2022. Online ahead of print.

3. Langlois de Septenville A, Boudjoghra M, Bravetti C, et al. Immunoglobulin gene mutational status assessment by next generation sequencing in chronic lymphocytic leukemia. Meth Mol Biol, Vol. Immunogenet. 2022;2453:153–167.

4. Goede V, Fischer K, Busch R, et al. Obinutuzumab plus chlorambucil in patients with CLL and coexisting conditions. N. Engl. J. Med. 2014;370(12):1101–1110.

Figuur 3. Kaplan-Meier overlevingscurve, waar de proportie van patiënten met progressievrije overleving (PFS) is uitgezet over de tijd in maanden. De rode curve heeft betrekking op patiënten met meer dan één leukemiecel per 10.000 gezonde cellen (MRD >10-4), de groene curve op patiënten met één leukemiecel per 10.000-100.000 gezonde cellen (MRD 10-4 – 10-5) en de blauwe curve op patiënten met minder dan één leukemiecel per 100.000 gezonde cellen (MRD <10-5). De P-waarde is bepaald door middel van een omnibus log-rank test. Kruisje symboliseren gecensureerde patiënten.