Wyniki odległe leczenia operacyjnego chorych z niedrobnokomórkowymi rakami płuca
Z bloczków parafinowych wycinków guzów krojono skrawki (grubości 5 µm), umieszczano je na szkiełkach podstawowych pokrytych silanem firmy Sigma (nr katalogowy A-3648), po czym inkubowano w cieplarce w temp. 60°C przez 24 h. Przygotowane w ten sposób preparaty histologiczne odparafinowywano w ksylenie (2x30 min), uwadniano kolejno w alkoholu (etanolu absolutnym) przez 5 min, alkoholu 96% przez kolejne 5 min, a następnie płukano w wodzie destylowanej. Tak uwodnione skrawki inkubowano przez 15 min w 3% roztworze nadtlenku wodoru w wodzie w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Jeśli oznaczano antygen proliferacyjny Ki-67, preparaty poddawano wstępnemu trawieniu roztworem trypsyny (Sigma, nr kat. T7 168) przez 5 min w temp. pokojowej. W celu oceny ekspresji białka p53 oraz antygenu Ki-67 preparaty umieszczano w buforze cytrynianowym i poddawano inkubacji w kuchence mikrofalowej o mocy 540 W, odpowiednio dwukrotnie przez 10 min i dwukrotnie przez 7 min. W przerwach uzupełniano ubytek buforu. Preparaty ochładzano następnie do temp. pokojowej, przenoszono do buforu TRIS i inkubowano w roztworach surowic i przeciwciał (tab. 2). Po wypłukaniu w buforze TRIS, preparaty inkubowano w roztworze chromogenu – diamino-benzydyny (DAB firmy DAKO S3000) z
787
peroxidase. If Ki-67 antigen was to be measured, such specimens received preliminary etching with trypsin solution (Sigma, cat. No. T7 168) for a period of 5 min at room temperature. In order to assess p53 protein expression and Ki-67 antigen, the specimens were placed in a citrate buffer and incubated in a 540 W microwave, twice for 10 min and 7 min The buffer was filled up during the breaks. The specimens were then cooled down to room temperature, transferred to the TRIS buffer, and incubated in serum solution as presented in the table (tab. 2). After washing in the TRIS buffer, the specimens were incubated in di-amino-benzidine chromogen solution (DAB) (DAKO S3000) with addition of 3% hydrogen peroxide solution (15 ml H2O2 per each 2 ml DAB solution). After washing, the specimens were stained with Harris hematoxylin, dehydrated, and locked away in Canada balsam. The immunohistochemical reaction for p53 protein was only considered positive if at least 10% of tumor cells demonstrated nuclear staining (8, 9). Where the immunohistochemical reaction was assessed to show the presence of Ki-67 antigen, the percentage of stained nuclei was only considered. In each case 500 cells were assessed, that is 100 in five visual areas ma-
Tabela 2. Przygotowanie materiału archiwalnego do badań immunohistochemicznych – inkubacja w surowicach Table 2. Archival material preparation for immunohistochemical examinations – serum incubation Postępowanie w fazie inkubacji w surowicach / Procedures in serum incubation phase Wstępne trawienie / initial etching Inkubacja w kuchence mikrofalowej / incubation in microwave Surowica blokująca / blocking serum
Rodzaj wykrywanego antygenu / Type of detected antigen białko p53 (klon BP) / Ki-67 (klon MIB1) / p53 protein (clone BP) Ki-67 (clone MIB1)
2 x 10 min
trypsyna T 7168 5 min, temp. pokojowa / trypsin solution T 7168 5 min, room temperature 2 x 7 min
świńska DAKO X901, 20%, inkub. 30 min kozia DAKO X907, 20%, inkub. 30 min w temp. pokojowej / swine DAKO X901, 20%, w temp. pokojowej / goat DAKO X907, 20%, 30 min incubation at room temperature 30 min incubation at room temperature Pierwotne /mysie/ przeciwNovocastra NCl- p53- BP 1:50 / Immunotech nr kat. 0607 1:1 / ciało monoklonalne / Novocastra NCl- p53- BP 1:50 Immunotech cat. No. 0607 1:1 o o mouse monoclonal inkubacja 20 h/4 C / incubation 20 h/4 C antibody Biotynylowane przeciwz zestawu LSAB2 DAKO K675 1:1 / Immunotech nr kat. 816 1:1500 / ciała antymysie / LSAB2 DAKO kit K675 1:1 Immunotech cat. No. 816 1:1500 biotinied anti-mouse inkubacja 15 min w temp. pokojowej / 15 min incubation at room temperature antibodies Streptaewidyna z peroz zestawu LSAB2 DAKO K0675 / Immunotech nr kat. 309 1:500 / ksydazą / streptavidine LSAB2 DAKO kit K0675 Immunotech cat. No. 309 1:500 and peroxidase inkubacja 15 min w temp. pokojowej / 15 min incubation at room temperature