Technology

Flaivoloka freeimages.com

Improved Protection against Evaporation of PCR Solution Author info นิลส์ เกอร์เค่ สตีเฟน รอท ปอรวี ประมูลกิจ Nils Gerke Stefan Roth Porawee Pramoolkit Eppendorf AG Eppendorf Instrumente GmbH Application Specialist, Eppendorf (Thailand) Co., Ltd. Porawee.p@eppendorf.co.th

เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) หรือ โพลีเมอเรส เชน รีแอคชัน เป็นเทคนิค สำ�หรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยอาศัยหลักการจำ�ลองตัวของดีเอ็นเอ (DNA Replication) เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอเป็นล้านเท่าในระยะ เวลาอันสัน้ ซึง่ ได้รบั การยอมรับว่าเป็นเทคโนโลยีทมี่ คี วามสำ�คัญอย่าง ยิ่งต่องานด้านอณูชีวโมเลกุล เพื่อการทำ�พีซีอาร์ที่มีประสิทธิภาพ สูงสุด ทุกพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องในการทำ�ปฏิกิริยาพีซีอาร์ ไม่ว่าจะ เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ (Template DNA) ไพรเมอร์ (Primer) เอนไซม์ หรือความเข้มข้นของแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) และความเข้มข้น ของบัฟเฟอร์ เป็นต้น ล้วนต้องได้รับการปรับหาสภาวะที่เหมาะสม นอกจากนี้ยังมีอีกหนึ่งปัจจัยสำ�คัญที่หลายคนมักมองข้าม ในการทำ�พีซีอาร์ คือ การระเหยของสารละลาย (Evaporation of reaction fluids) การปิดฝาหลอดพีซีอาร์ (PCR tubes) สตริปขนาด 8 หลุม (PCR strip) หรือการปิดผนึกเพลทพีซีอาร์ชนิด 96 หลุม (PCR 96-well plate) สามารถสรุปได้ว่าเป็นปัจจัยสำ�คัญที่ทำ�ให้ เกิดการระเหยของสารละลายระหว่างการทำ�พีซีอาร์ การปิดผนึก ขึ้นอยู่กับแรงกดของฝาเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (เทอร์โม ไซเคลอร์) (Thermocycler/PCR machine) หากแรงกดไม่เพียงพอ อาจทำ�ให้ฝาหรือพลาสติกทีป่ ดิ ผนึกนัน้ ไม่แนบสนิท ส่งผลให้เกิดการ ระเหยของสารละลาย หากแรงกดมากเกินไปอาจทำ�ให้หลอด พีซอี าร์ แตก ผิดรูปร่าง และนำ�มาสูก่ ารสูญเสียสารละลายได้เช่นกัน นอกจาก นี้ แรงกดทีไ่ ม่สม่�ำ เสมอทัว่ ทัง้ ฝาปิดเป็นอีกปัจจัยหนึง่ ทีม่ คี วามสำ�คัญ ที่ทำ�ให้เกิดการระเหยของสารละลาย ยกตัวอย่างกรณีที่ฝาปิดนั้นให้ แรงกดเฉพาะตำ�แหน่งศูนย์กลางของตัวฝานัน้ จะทำ�ให้เกิดการระเหย ที่ขอบด้านข้างของบล็อกบรรจุหลอดพีซีอาร์ได้ ดังนั้น ผลการทดลองต่อไปนี้จะเป็นส่วนสำ�คัญที่ทำ�ให้เห็น ถึงพัฒนาการป้องกันการเกิดการระเหยของสารละลายจากเครื่อง พีซีอาร์ ซึ่งจะช่วยให้การทำ�พีซีอาร์นั้นได้ประสิทธิภาพและมีความ สามารถในการทำ�ซ้ำ�สูงสุด อุปกรณ์และวิธีการ 30

www.innolabmagazine.com

P

CR or polymerase chain reaction is DNA replication technique which can replicate millions folds of DNA quantity in short time. It is crucial in the field of molecular biology. In order to achieve an efficient and robust PCR, all reaction parameters need to be optimized, such as template DNA, primers, and enzyme, as well as optimal buffer and magnesium ion concentrations. One major criterion is minimization of evaporation of reaction fluids. It can be assumed that the highest risk of evaporation stems from the seal of the single PCR reaction tubes, 8- strip tubes or PCR 96-tubes plates. Here, successful sealing of the reaction vessel depends heavily on the correct pressure applied by the lid of the thermocycler. Insufficient sealing pressure may lead to leaky sealing and subsequent loss of reaction liquid. These effects can also be observed in the case of excessive sealing pressure, as this may lead to deformation correct intensity, uniformity of sealing pressure across all reaction tubes is of critical importance. In the case where cycler lids exert increased pressure on the samples in the center of the block, evaporation problems could arise in samples placed in the peripheral locations of the block. The data presented in this article will highlight the significance of improved evaporation protection with regards to obtaining optimal and reproducible PCR conditions. Materials and Methods The experiments to determine evaporation protection were performed on the Mastercycler pro S and five thermocyclers made by other manufacturers. First, 20 μL of a solution containing 1 x concentrated PCR buffer and 1 μM fluorescein were pipetted into all 96 positions of a PCR plate using the epMotion 5070