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Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.9 n.4 (out./dez. 2017). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2017.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

PeriĂłdico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2017 | Volume 9 | NĂşmero 4

Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4) 205

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4):206 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................208 Fernando Mauro Lanças

SAMPLE PREPARATION Tecnologia sol-gel: uma ponte para modificar a seletividade no preparo de amostra.................... 210 Carlos E. D. Nazario, Thiago Gomes Ricci, Amandha Kaiser da Silva, Eduardo Sobieski Neto, Karla Regina Warszawski de Oliveira

CE Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS): aspectos teóricos, práticos e aplicações no campo da metabolômica..............................................................................................................228 Ana Valéria Colnaghi Simionato, Fábio Neves dos Santos, Vinicius Veri Hernandes

HPLC Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida suportada por membrana oca (HF-LPME) para determinação de sulfonamidas em água superficial por HPLC-DAD.............. 245 Eduardo Carasek, Camila M. S. Vieira

HPLC Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor.........................................................................................................................................................................253 Giovana Silva Martins, Natália da Costa Luchiari, Rafaela Silva Lamarca, Bianca Ferreira da Silva, Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes

Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................266 Bookstore............................................................................................................................................................................................................267 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................268 Calendário de Eventos...................................................................................................................................................................................270

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

Scientia Chromatographica 2017; 9(1):70-70 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2017; 9(1)

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):208 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2017.016 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Este número encerra o volume 9 do Scientia Chromatographica trazendo dois artigos de revisão da literatura internacional e dois artigos contendo resultados experimentais de dois laboratórios. Foram 10 anos de trabalho ininterruptos para trazer aos usuários da área de cromatografia e técnicas relacionadas uma ferramenta que funcionasse como um fórum para a discussão dos últimos desenvolvimentos nesta área.

Aproveitamos a oportunidade para reiterar que o Scientia Chromatographica publica tanto artigos de revisão crítica da literatura quanto artigos descrevendo resultados experimentais obtidos pelos autores. É importante também salientar que, diferentemente da maioria dos periódicos atuais, o Scientia Chromatographica (desde sua fundação, há 10 anos) não cobra taxas nem dos autores nem dos leitores. Sua missão única é a divulgação das técnicas cromatográficas e relacionadas (um ótimo exemplo é a publicação, neste número, de um artigo sobre o acoplamento entre eletroforese capilar e espectrometria de massas, CE-MS), no sentido mais amplo possível.

A partir de 2018 iniciaremos o Volume 10 do periódico. Mais amadurecido, com trabalhos cada vez mais interessantes e diversificados, o Scientia continua sendo, desde sua fundação até o presente, o único periódico da América Latina dedicado exclusivamente às técnicas cromatográficas e associadas. A continuidade do periódico deve-se, principalmente, ao Corpo de Editores extremamente competente e dedicado; aos autores que enviaram excelentes trabalhos para avaliação e publicação; aos avaliadores e revisores dos artigos; aos leitores; e aos colaboradores que trabalham na editoração do periódico.

A todos o agradecimento do staff do Scientia Chromatographica, desejando um feliz final de 2017 e um ano de 2018 repleto de realizações profissionais e pessoais.

Fernando Mauro Lanças Editor-in-chief Scientia Chromatographica

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Scientia Chromatographica 2017; 9(1):72-72 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2017; 9(1)

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):210-227 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2017.017 ISSN 1984-4433

SAMPLE PREPARATION

Tecnologia sol-gel: uma ponte para modificar a seletividade no preparo de amostra Sol-gel technology: a bridge to modify selectivity in sample preparation

Carlos E. D. Nazario* Thiago Gomes Ricci, Amandha Kaiser da Silva, Eduardo Sobieski Neto, Karla Regina Warszawski de Oliveira Instituto de Química, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil Endereço para correspondência: Avenida Senador Filinto Muller, 1555, Instituto de Química/UFMS, Campo Grande – MS, CEP: 79074-460 Tel: +(55) 67 33457102 *carlos.nazario@ufms.br Recebido: 05/11/2017 Aceito: 23/11/2017

210

Abstract

Chemical analysis usually is seen as a big challenge due to the high sample complexity and the low concentration of the analytes. Nowadays, there is a great effort to develop analytical strategies in accordance with green analytical chemistry. In this context, the miniaturized techniques, especially the sorbent-based extraction, have been highlighting for this purpose. Recently, many research groups have synthesized new sorbents in order to improve the extraction step. Sol-gel technology has been outstanding performance in this area due to its versatility in modify the selectivity and the morphology of the new material. In this review, we present basic concepts of sol-gel process used in the synthesis of new sorbents and the most recent analytical applications in different matrices.

Keywords: sol-gel process, sample preparation, sorbent extraction

Resumo

Análise química geralmente é vista como um grande desafio devido ao elevado grau de complexi-dade das amostras e a baixa concentração dos analitos. Atualmente, há um grande esforço pelo de-senvolvimento de estratégias e metodologias analíticas adequadas sob a perspectiva da química ana-lítica verde. Nesse contexto, as técnicas miniaturizadas, principalmente as baseadas em extração por sorbente, tem se destacado para esta finalidade. Nos últimos anos, muito grupos de pesquisa têm sintetizado novos sorbentes com o objetivo de maximizar a etapa de extração. A tecnologia sol-gel tem se destacado nesse campo de atuação devido sua versatilidade na alteração da seletividade e no controle morfológico do novo material. Nesta revisão, apresentamos aspectos teóricos do processo sol-gel empregados na síntese de novas fases extratoras e as aplicações analíticas mais recentes em diferentes matrizes.

Palavras-chave: processo sol-gel, preparo de amostra, extração com sorbente

Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

Tecnologia sol-gel

1. Introdução As análises químicas se apresentam, comumente, como um grande desafio, especialmente em casos em que os analitos são encontrados em nível de traço, de µg kg-1 a ng kg-1, assim como em análises no qual a matriz seja muito complexa (1,2). O tempo necessário para realizar a etapa de preparo da amostra consome o maior tempo de todo processo de análise, fazendo assim com que a escolha da técnica de preparo de amostra e o seu desempenho sejam fatores fundamentais para o sucesso da metodologia analítica (2–4).

Atualmente, diversas opções em técnicas de preparo de amostra estão disponíveis e consolidadas, contudo, as estratégias de extração baseadas em sorbentes tem se destacado por minimizar os interferentes da matriz, aumentar a recuperação e alcançar altos valores de pré-concentração dos compostos de interesse. Essas diretrizes promovem uma melhoria na detectabilidade e outras figuras de mérito de um método (bio)analítico (5,6).

A seleção da fase extratora é um dos parâmetros mais importantes quando se trabalha com essas extrações baseadas em sorbentes e a escolha deve ser realizada com base na polaridade dos analitos e da amostra. Nos dias atuais, diversas fases extratoras têm sido utilizadas em preparo de amostra. Entre os sorbentes clássicos para SPE, podemos destacar as fases baseadas em sílica quimicamente ligada contendo os grupamentos orgânicos C18 ou C8. Esse tipo de material apresenta bons resultados na extração de compostos apolares e com polaridades intermediárias, contudo, possuem baixa eficiência na extração de compostos polares. Esta problemática tem sido parcialmente solucionada com a introdução de fases poliméricas e dos sorbentes baseados em carbono. Já nas técnicas de MEPS, SPME e SBSE a baixa disponibilidade de diferentes fases extratoras é ainda mais restritiva e esse fator afeta diretamente os rendimentos do processo de extração.

Nazario C. E. D.

Os sorbentes disponíveis comercialmente possuem seletividade limitada e muitos interferentes da matriz podem ser extraídos juntamente com os analitos e perturbar a separação cromatográfica e o processo de detecção. Nesse contexto, o grande número de trabalhos relacionados a síntese de novos sorbentes aplicados em preparo de amostra tem se destacados por promover alta seletividade, praticidade e robustez nas análises. Uma vertente interessante para preparar sorbentes seletivos em condições reacionais amenas é o uso da tecnologia sol-gel. Nessa estratégia, polímeros inorgânicos ou híbridos (inorgânico-orgânico) são sintetizados com morfologia controlada e boa estabilidade química, mecânica e térmica (7–9).

Outrossim, destaca-se a possibilidade de planejamento da estrutura polimérica assim como a modificação das propriedades seletivas dos precursores e blocos sol-gel formadores; assim mostra-se como uma interessante estratégia para a síntese de novos materiais sorbentes em diferentes formas, incluindo partículas, monólitos, filmes ou fibras. Tal versatilidade apresentada pela tecnologia sol-gel, pode ser utilizada no preparo de amostras (SPE, SBSE, SPME e MEPS), em diferentes modos (off-line, at-line, in-line e on-line) em diversas matrizes, e.g. alimentos, bebidas ou amostras ambientais ou biológicas (7).

O processo sol-gel é baseado nas reações de hidrólise (Equação 1) e condensação (Equações 2 e 3) de metais alcóxidos [M(OR)x] na presença de um agente catalisador (ácido ou base), e solvente (água ou álcool), proporcionando a formação da rede polimérica tridimensional (7,10).

Equação 1

Equação 2

Equação 3

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):210-227 211

Nazario C. E. D.

Sorbentes baseados em sílica tem sido os materiais com maior número de publicações e os precursores sintéticos mais utilizados tem sido o tetrametoxissilano (TMOS) e tetraetoxissilano (TEOS). Entretanto, óxidos baseados em zircônio, titânio ou óxidos mistos também tem sido investigados por apresentar maior estabilidade em valores extremos de pH ou temperatura (7,9). É importante destacar que a presença de grupos OH na superfície do polímero favorece a posterior modificação do sorbente através de reações de funcionalização.

A busca por interações mais seletivas entre analito-sorbente tem levado os pesquisadores a explorarem o preparo de polímeros híbridos, ou seja, com características tanto de materiais inorgânicos quanto de orgânicos. De modo geral, esses materiais podem ser classificados de acordo com o precursor utilizado e a estrutura final do polímero (Figura 1). Quando a estrutura final da rede inorgânica é modificada com um grupo orgânico sem fornecer grupos funcionais capazes de sofrer reações químicas adicionais, o precursor é classificado como modificador de rede polimérica.

Entretanto, se um grupo funcional reativo é incorporado na rede polimérica, o precursor se torna funcionalizador de rede. A situação é diferente quando grupos orgânicos são ancorados na rede polimérica (precursor construtor de rede). Neste caso, a parte orgânica integra e se torna parte da rede híbrida do material (11).

Devido ao grande número de precursores do processo sol-gel contendo diferentes grupos funcionais (ciano, amino, tiol, epóxi, alceno terminal, entre outros) e a possibilidade de combinação com diversos monômeros orgânicos ou outros materiais (grafeno, nanotubos de carbono, líquidos iônicos, β-ciclodextrinas), é possível projetar a polaridade e seletividade desejada para o novo sorbente. Assim, a tecnologia sol-gel torna-se uma “ponte de ligação” entre o suporte de extração e a seletividade pretendida da fase extratora. Outro ponto importante está relacionado com a versatilidade do processo sol-gel como ferramenta sintética para preparar novos materiais 212

Tecnologia sol-gel

em diferentes formatos, tais como, monolito, partículas (irregulares ou esféricas) ou filmes.

Nessa revisão, apresentamos uma discussão das aplicações mais recentes e relevantes do uso da tecnologia sol-gel como bloco construtor na síntese de novos sorbentes aplicados em preparo de amostra na área ambiental, alimentos, bebidas e fluidos biológicos.

No final do artigo, a Tabela 1 sumariza informações de trabalhos relacionados com o tópico dessa revisão.

2. Extração em fase sólida (SPE) A SPE, atualmente, é um dos métodos de preparo de amostra mais popular e possui ampla aplicação em amostras analíticas e (bio)analíticas. Essa técnica foi introduzida para suprir as desvantagens da extração líquido-líquido clássica e é utilizada na extração de analitos semivoláteis e não voláteis de amostras líquidas ou amostras sólidas pré-extraídas com solventes (2).

A tecnologia sol-gel em SPE tem sido empregada na análise de analitos com diferentes polaridades e estrutura química. Na análise de metais, por exemplo, pode-se citar o trabalho de Kim et al. (12) o qual desenvolveu um sólido mesoporo híbrido empregado na injeção de fluxo na SPE pelo sistema de ETAAS (FI-SPE-ETAAS) para retenção seletiva de Cr(IV) em amostras de água. O fator de enriquecimento desta proposta de sistema analítico foi comprometido entre sensibilidade e taxa de transferência, tendo obtido um valor de 27 de acordo com as condições otimizadas.

O limite de detecção para Cr(VI) foi de 1,2 ng L-1 e o tempo de vida da microcoluna foi acima de 300 ciclos de adsorção/dessorção. Enquanto, os estudos de Diniz et al.(13) reportam um sorbente baseado em óxido mixo de Nb2O5/ZnO disperso em uma matriz de SiO2 aplicado no procedimento on-line de SPE com o intuito de determinação de íons Co(II) por FAAS em amostras de água e alimentos. O trabalho de AbdolmohammadZadeh et al. (14) descreve um estudo pioneiro da síntese e aplicação de pidirina IL-sílica modificada como sorbente Scientia Chromatographica 2017; 9(4):210-227

Tecnologia sol-gel

Nazario C. E. D.

Figura 1. Classificação dos materiais híbridos inorgânico-orgânico no processo sol-gel: (A) rede construtora, (B) rede modificadora e (C) rede funcionalizadora. Adaptado com permissão da ref (7). Copyright (2015) Elsevier.

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Nazario C. E. D.

para SPE na extração efetiva de íons Fe(III) em amostras aquosas. A preparação do sorbente utilizando catálise ácida no processo sol-gel demonstrou ser simples e com reutilização do material por mais de 250 ciclos. O liquido iônico (ionic liquid – IL) utilizado no preparo deste sorbente foi [C6py][PF6] e a análise foi realizada FAAS obtendo um limite de detecção de 0,7 µg L-1.

Uma abordagem diferente foi realizada por Markina et al. (15). A síntese de sílica sol-gel multifuncional incorporada com nanopartículas de prata (SiO2-AgNP) foi realizada para a aplicação como sorbente na SPE e simultaneamente como substrato para espectroscopia de Raman amplificada por superfície (SERS). Tal metodologia teve o intuito de analisar rodamina 6G e ácido fólico em soluções aquosas.

Liu et al. (16) trabalhou com amostras de leite na extração de resíduos de glicocorticóide utilizando uma estrutura de três camadas contendo grafeno/compósitos mesoporos de sílica incorporado com C8 modificado no interior das paredes dos poros (grafeno@mSiO2-C8). As análises dessas amostras foram realizadas por LC-MS/ MS apresentando um limite de detecção absoluto de 0,0075 – 0,3 ng mL-1.

Polímeros de impressão molecular (MIPs) são macromoléculas sintetizadas artificialmente, as quais possuem estruturas predispostas e habilidade de reconhecimento molecular específico. MIPs baseado no processo sol-gel podem gerar cavidades seletivas com estrutura inorgânica ou inorgânica-orgânica rígidas. Uma das vertentes dessa estratégia a síntese do MIP baseado em sílica na superfície de um suporte. Dessa forma, a cavidade seletiva torna-se mais acessível promovendo uma maior taxa de transferência de massa. (17).

MIPs tem sido aplicado para análise de diferentes analitos em água. Han et al. (18), por exemplo, desenvolveram um método para determinação de pentaclorofenol (PCP) em amostras de águas de rio, lago e águas residuais por sistema on-line SPE-HPLC. O sorbente utilizado nesta análise foi impresso em sílica 214

Tecnologia sol-gel

amino-funcionalizada. O fator de enriquecimento obtido foi de 670 e o limite de detecção foi de 6 ng L-1. A precisão para nove replicatas on-line da extração do sorbente de 10 µg L-1 de PCP foi de 3,8 %. Enquanto, o trabalho de Jiang et al. (17) relata a síntese de um material MIP para extração em SPE-HPLC-UV na determinação de bisfenol A (BPA) em água de torneira. Esta metodologia apresentou maior seletividade para BPA em amostras de água quando comparado ao método tradicional SPEHPLC. A utilização de polímero impresso-BPA obteve recuperação maior que 99 %.

No que se refere a análise em alimentos, pode-se citar o trabalho de Samanidou et al. (19) o qual descreve o estudo de MIP como sorbente na extração em fase sólida (molecularly imprinted solid phase extraction, MISPE) de cloranfenicol em amostra de leite. A separação e quantificação foi realizada através HPLC-UV e LC-MS apresentando um limite de detecção de 17 ng g-1 e 0,1 ng g-1, respectivamente. E o estudo de Junhong et al. (20), onde um sorbente seletivo para traços de corantes Sudan em alimentos pelo método analítico MISPE acoplada com HPLC foi desenvolvido. O método proposto obteve limite de detecção de 25,2 ng L-1 e recuperação de 85,3 – 98,1 % para análise de corantes em pimenta em pó e ovo de pato. Yag et al. (21) mencionam um novo MIP com superfície de sílica sol-gel funcionalizada para a determinação seletiva do contaminante traço patulina de micotoxinas em amostras de sucos. A polimerização sol-gel do MIP utilizou a sílica ativada apenas como material suporte e o oxindol como modelo falso (Figura 2). A caracterização do material por MEV demonstra a morfologia da sílica-gel regular (Figura 3A) enquanto que a morfologia com o MIP pode-se observar uma superfície porosa (Figura 3B) o qual está relacionado com a sua capacidade de adsorção. O material impresso foi aplicado em sistema on-line em extração por SPE utilizando como detector o HPLC. O método obteve um fator de enriquecimento e limite de detecção de 125 e 0,5 µgL-1, respectivamente. E a recuperação foi de 60,13 – 97,60 %.

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Figura 2. SĂ­ntese do sorbente MIP baseado no processo sol-gel. Reproduzido da ref (21) com permissĂŁo da Royal Society of Chemistry.

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Tecnologia sol-gel

Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de sílica-gel (A) e MIP (B). Reproduzido da ref (21) com permissão da Royal Society of Chemistry.

O estudo de Svoboda et al. (22) teve como objetivo a síntese de material de MIP para extração seletiva em SPE da β-metilamino-L-alanina (BMMA) de extratos de cianobactérias. O processo sol-gel foi utilizado no processo de síntese pelo fato da molécula de BMAA possuir baixa solubilidade em solventes orgânicos, os quais são comumente utilizados em sínteses de polímeros de base acrílica. O método proposto de análise via LC/ MS-MS apresentou recuperação de eluição de 77 – 89 % e o efeito matriz foi removido ao adicionar o processo clean-up no modo misto do sorbente extraído na sílica molecularmente impressa.

Arabi et al. (23) descrevem a preparação de nanopartículas molecularmente impressas (RAM-MINP) para extração em fase sólida de ácido hipúrico (HA).

HA foi quantificado por HPLC-UV após a extração em amostras de urina em um cartucho SPE empacotado com RAM-MINP, obtendo um limite de detecção de 0,15 µg L-1.

El-Beqqali et al.(24), desenvolveram uma sorbente o formato de disco utilizando para ser utilizado em µ-SPE. O polímero MIP foi preparado via sol-gel para serem utilizados na extração de anfetamina em amostras de urina. O método desenvolvido apresentou valores de recuperação e limite de detecção consideráveis, 216

80 % e 1,0 ng mL-1 respectivamente. Bem como, este comprimido pode ser reutilizado por até 20 vezes o que aumenta a viabilidade do uso dessa fase extratora.

De modo diferente da SPE, na extração em fase sólida dispersiva (DSPE) ao invés do sorbente estar empacotado no cartucho, a fase extratora é adicionada diretamente na matriz para extração, ou clean-up dos analitos. Neste caso, a separação do sorbente da matriz analítica pode ser realizada por centrifugação, filtração ou separação magnética (3).

A técnica de extração magnética em fase sólida (MSPE) se baseia na utilização de nanopartículas magnéticas (MNPs) como sorbentes. De modo geral, estas nanopartículas são fortemente atraídas por um campo magnético externo separando a fase extratora da matriz analítica sem a necessidade de centrífugas ou sistemas de filtração no processo de extração (3).

As MNPS, geralmente são revestidas por sílicas para proteger o núcleo magnético e simultaneamente favorecer a modificação da seletividade do material final.

No trabalho de Moliner-Martínez et al. (25) foram utilizadas MNPs a base de Fe3O4­ incorporadas em uma matriz de sílica utilizando o processo sol-gel a fim de extrair e pré-concentrar contaminantes tais como Scientia Chromatographica 2017; 9(4):210-227

Tecnologia sol-gel

ácido acetilsalicílico, acetaminofeno, diclofenaco e ibuprofeno. Amostras de águas de rio foram analisadas por LC-MS, em escala capilar, obtendo recuperação entre 80 – 110 %.

Wang et al. (26) sintetizaram um material magnético com estrutura metal-orgânica baseado em zircônio modificado na superfície de polidopamina revestido de grafeno magnético (magG@PDA@ Zr-MOFs). Tal material foi preparado via reação solvotérmica e método sol-gel apresentando ampla área de superfície, tamanhos dos poros homogêneos, hidrofilicidade e boa resposta magnética. Neste trabalho, magG@PDA@Zr-MOFs foi empregado como sorbente em MSPE-HPLC para extração de bisfenóis em amostras de água.

Xu et al. (27) sintetizaram estrutura magnética core-shell baseado em Fe3O4/nanocomposito de sílica com polímero na superfície (Fe3O4@SiO2@MDN).

Neste trabalho, Fe3O4@SiO2@MDN foi utilizado como sorbente na extração por MSPE de ésteres de ftalato em amostras têxtis via análise de GC-MS apresentando limite de detecção de 0,02 – 0,09 mg Kg-1.

No estudo de Huang et al. (28) um sorbente magnético foi sintetizado para extração simultânea e específica de cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol em amostras de leite por detecção via HPLC-DAD. A nanopartícula magnética recoberta por sílica (Fe3O4@ SiO2) foi sintetizada via método sol-gel e funcionalizada com aptâmero (Fe3O4@SiO2-Apt). O sorbente apresentou boa reprodução para extração podendo ser usados pelo menos por 60 ciclos com recuperação acima de 80 %.

3. Microextração em fase sólida (SPME) A microextração em fase sólida (SPME) foi desenvolvida por Arthur e Pawliszyn (29), e consiste em uma técnica de preparo de amostra em que a extração

Nazario C. E. D.

ocorre por meio do equilíbrio de fases em uma única etapa analítica a qual contempla a homogeneização, limpeza e pré-concentração de amostras (30). No revestimento da fibra oca diversos materiais tem sido desenvolvidos, na intenção de superar as limitações da técnica como a baixa seletividade, instabilidade térmica e o curto período de vida útil da fibra de SPME (31).

A técnica de sol-gel tem se destacado em SPME por aumentar a seletividade do processo de extração, bem como, o revestimento de sol-gel possuir maior estabilidade térmica quando comparado aos revestimentos comerciais de fases extratoras de SPME (30). O primeiro revestimento sol-gel para SPME foi desenvolvido por Malik et al (32), no qual utilizaram polidimetilsiloxano com hidroxila terminal (OH-PDMS) e metiltrimetoxisilano (MTMOS) para o revestimento externo de um capilar de sílica fundida. O revestimento formado apresentou uma estabilidade térmica de 320°C, favorecendo a dessorção térmica de compostos menos voláteis com uma recuperação de 65 %.

Mu et al. (33) desenvolveram uma fibra de SPME com recobrimento de aptâmero sol-gel para a quantificação de adenosina em plasma humano, sendo o primeiro método utilizando aptâmero como recobrimento de fibra oca. Considerando que a fibra oca convencional não consegue fazer a retenção de analitos polares, o uso de aptameros sol-gel aumentou a porosidade do recobrimento promovendo a extração de adenosina que é um analito muito polar com uma recuperação de 82 %.

No estudo desenvolvido por Ebrahimi et al.

(34) foi desenvolvido um IL para ser empregado como sorbente de recobrimento na extração de pesticidas em amostras de água residuais e cabelo. Este método teve como vantagens exibir bons valores de pré-concentração (290-1190), uma alta capacidade de limpeza seletiva para pesticidas um valor de recuperação compreendido entre 81 – 91 % além de apresentar etapas experimentais simples, o que reduz o tempo de extração.

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Sarafraz-Yazdi et al. (35), realizaram o recobrimento de fibras de SPME utilizando etilenoglicol e associação de surfactante com nanotubos de carbono em uma segunda fibra, para a extração de furano em amostras de alimentos. Ambos os recobrimentos propostos maximizaram o poder de extração da fibra em relação aos recobrimentos tradicionais. O recobrimento do surfactante associado teve valores de recuperação de até 98,5 %, e o não associado em torno de 82 %.

Xiaojun et al. (36), utilizaram o grafeno como recobrimento de um eletrodo empregado em uma técnica de SPME por meio de sol-gel, para a extração de hiperina visando quantificar a luminescência emitida por esse analito. Esse método apresentou boa estabilidade durante o processo de extração, alta taxa de condutividade, indicando que o uso de filme de grafeno em eletrodos permite um melhor processo de extração, com recuperação de 86,6 % e consequentemente uma melhor quantificação do sinal de luminescência.

Devido a limitação de materiais baseados em sílica em faixas estreitas de pH, Alhooshani et al.

(37) desenvolveram um filme inorgânico-orgânico a base de zircônia como recobrimento em SPME. Essa nova fase foi utilizada no processo de extração de hidrocarbonetos aromáticos, policíclicos, aldeídos e cetonas. o recobrimento demonstrou bons valores de pré-concentração (30 vezes) e, principalmente, alta estabilidade em diferentes valores de pH (24).

4. Extração sortiva em barra de agitação (SBSE A técnica analítica de preparo de amostra por extração sortiva em barra de agitação (SBSE) está de acordo com os princípios da química verde, pois diminui a quantidade de solventes utilizados, tempo e etapas para preparação da amostra. A importância do uso da sílica nessa técnica se destaca desde a primeira publicação a qual foi introduzida por Baltussen et al. (38) em 1999.

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Tecnologia sol-gel

Nesse trabalho, a barra de agitação recoberta com polidimetilsiloxano (PDMS) apresentou resultados promissores em relação ao uso da técnica SPME, obtendo-se limites de detecção abaixo de 0,1 ng L-1.

Desde então, nota-se um grande interesse da comunidade cientifica em aprimorar o uso dessa técnica, aplicando-a para determinação de contaminantes ambientais (39,40), biológicos (41,42) e em matrizes alimentícias (43–45).

Em consequência da utilização da fase apolar (PDMS) nos primeiros trabalhos publicados, essa se tornou a fase estacionária mais utilizada em SBSE. Apesar disso, o desenvolvimento de novos recobrimentos que são capazes de extrair analitos polares está sendo relatados na literatura (46). Em decorrência recentemente os usos de silicones estão sendo bastantes empregados devido à alta estabilidade que a ligação Si-O apresenta.

Além de que os silicones são fabricados em larga escala o que diminui o preço desse tipo de material, e a seletividade pode ser facilmente modificada substituindo grupos metílicos até que a polaridade desejada seja alcançada. Um exemplo disso são as barras de agitação sortiva recoberta com poli(etilenoglicol) modificado com silicone (EG Silicone Twister) (47,48).

No trabalho de Díaz-Álvarez, Turiel, MartínEsteban (39), uma nova barra de agitação magnética foi desenvolvida a partir do conceito de impressão molecular utilizando nanopartículas magnéticas, Fe3O4, no interior do polímero de extração. As MNPs tiveram sua superfície modificada com base em uma encapsulação utilizando ácido oleico obtendo-se Fe3O4@OA. Como resultado, foi obtido um monolito impresso que apresenta propriedades magnéticas permitindo-o utilizar como uma barra sortiva magnética.

Lambert et al. (49) criou uma barra de agitação sortiva biocompatível que foi preparada utilizando alquil-diol-sílica como material de acesso restrito (RAM). A RAM-SBSE desenvolvida é capaz de fracionar simultaneamente componentes proteicos de amostra biológicas. Enquanto extrai a cafeína e seus metabolitos, esse método em contraste com outros, Scientia Chromatographica 2017; 9(4):210-227

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se mostra vantajoso reduzindo o tempo de preparo de amostra.

Um novo conceito de fase dupla para SBSE utilizando duas barras sortivas magnéticas foi proposta por Xu et al. (43) para extrair simultaneamente seis conservantes de bebidas com diferentes polaridades (log Kow com valores de 1,27 - 3,41). A fase dupla consiste em duas diferentes barras magnéticas, uma delas é revestida com APTES-OH-TSO a qual é obtida a partir dos precursores: OH-TSO, APTES, TEOS, KH-560, PMHS e TFA utilizando a técnica sol-gel. Já a segunda barra magnética é revestida com C18-Silica-PDMS, que foi primeiramente recoberta com uma fina camada de PDMS, essa camada entra em contato com C18-silica formando o revestimento, C18-Silica-PDMS, a partir do fenômeno de adesão. Na dual SBSE, essas barras são colocadas na mesma solução para extração simultânea de diferentes analitos com polaridades distintas.

Comparando com a SBSE convencional, o método desenvolvido é potencialmente promissor.

5. Microextração em sorvente empacotado (MEPS) A microextração em sorvente empacotado (MEPS) é uma extração miniaturizada da extração em fase sólida (SPE). Esse tipo de preparo de amostra tem sido amplamente aceito e utilizado em diversos grupos de pesquisas na forma online ou offline antes da análise utilizando uma técnica analítica (50). Foi desenvolvida em 2004 por Abdele e Altun. (51), e aplicada pela primeira vez para determinação de Ropivacaína e seus metabolitos em plasma humano. Três fases extratoras (C2, C8 e C18) foram avaliadas e a fase C2 apresentou melhor desempenho devido a maior seletividade com a Ropivacaína.

A partir das publicações pioneiras fica evidente a importância da sílica para a obtenção de alguns dos sorbentes mais comuns a partir do processo de síntese do

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polímero pelo processo sol-gel (42,51,52). O trabalho de Fumes e Lanças (53) descreve a síntese, caracterização e o uso de grafeno utilizado como suporte em sílica de aminopropilo, as interações que conferem boa seletividade para o tipo de sorbente sintetizado são as interações π-π.

No estudo de Du et al. (45) foi combinado um polímero molecular impresso com a técnica microextração em sorvente empacotado SMIPs-MEPS que foi desenvolvida para determinação de clenbuterol em carne de porco, o polímero foi sintetizado a partir do processo sol-gel. Haliński, Stepnowski (54) utilizaram a sílica gel como sorbente, nesse trabalho foram separados vários extratos de ceras cuticulares de plantas de espécies solenosas, obtendo-se um método rápido e confiável.

6. Conclusão O contexto do uso de técnicas modernas e miniaturizadas de preparo de amostras envolve o fato delas serem ambientalmente corretas e apresentarem vantagens sobre as técnicas clássicas. Elas geralmente consomem uma pequena e desprezível quantidade de solventes e reagentes, requerem menores quantidades de amostras, apresentam um maior fator de concentração, bem como maior seletividade na extração dos compostos de interesse.

Nesta revisão, discutimos as diferentes estratégias de preparo de novos materiais baseados na tecnologia sol-gel com aplicação em preparo de amostra. Podemos destacar a versatilidade em planejar sorbentes com características distintas pela simples alteração dos precursores sintéticos. Atualmente, inúmeros precursores e modificadores estão disponíveis para promover um aumento da interação analito-sorbente. Dentre as possibilidades de combinações, é importante ressaltar a combinação da tecnologia sol-gel com a tecnologia

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Tabela 1. Materiais baseados na tecnologia sol-gel aplicados como sorbentes em preparo de amostra.

Precursores

Compostos

Amostra

Separação/ Identificação

Recuperação (%)

Ref.

SPE Grafeno, TEOS, n-octiltrietoxissilano

Glicocorticoides

Leite

LC-MS/MS

84,5 - 103,4

(16)

3-APTES, TEPS, TMOS

Cloranfenicol

Leite

HPLC-UV LC-MS

85 - 106

(19)

Sílica sol-gel, TEOS, APS

Bisfenol A

Água de torneira

HPLC-UV

99,4 - 103,2

(17)

3-APTES, TEOS

β-metilamino-L-alanina

Extrato de cianobactéria

LC/MS-MS

77 - 89

(22)

CTAB, TEOS, APTES

Cr (VI)

DIW, mineral, efluente e rio

ETAAS

76 - 104

(12)

TEOS, Zn(CH3COO2), NbCl5

Co (II)

Água de torneira, mineral, lago, mar sintética, arroz, espinafre, chá preto e orégano

FAAS

89 - 107

(13)

TEOS e [C6py][PF6]IL

Fe(III)

Água de torneira, água mineral e água subterrânea

FAAS

97,8 - 105,4

(14)

TEOS, APTMS, MPS, AIBN

Ácido hipúrico

Urina

HPLC-UV

88 - 104

(23)

Sílica sol-gel, APTS, TEOS

Pentaclorofenol

Águas de rio, lago e águas residuais

HPLC

-

(18)

Sílica sol-gel, APTS, TEOS

Corante Sudan

Pimenta em pó e ovo de pato

HPLC

85,3 - 98,1

(20)

[Ag(NH3)2]+, TEOS

Rodamina 6G e ácido fólico

Solução aquosa

SERS

75 - 98

(15)

APTS, TEOS, Oxindol, Sílica sol-gel

Patulina de micotoxinas

Suco de maçã, pêra, suco e flocos de hawthorn

HPLC

60,1 - 97,6

(21)

MSPE Fe3O4, CTAB, SiO2

Ácido acetilsalicílico, acetaminofeno, diclofenaco e ibuprofeno

Água de rio

Capilar LC-MS

83 - 98

(25)

Grafeno, FeCl3, Dopamina, ZrCl4

Bisfenóis

Água

HPLC

67,9 - 92,8

(26)

Fe3O4, TEOS, MPS, DVB, NVP

Ésteres de ftalato

Nylon, acrílico, poliéster

GC-MS

82,9 - 116,7

(27)

Fe3O4, SiO2, APTES, Aptameros

Cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol

Leite

HPLC-DAD

77,3 - 97,4

(28)

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Tabela 1 (continuação)

Precursores

Compostos

Amostra

Separação/ Identificação

Recuperação (%)

Ref.

SPME DVB/Silicone

Compostos aromáticos

Licores chineses

CG-FID

88,48

(55)

PEG/PEG e CNTs

Furano

Suco de laranja, suco de maça e papinha de bebê

CG-FID

98,5

(35)

PEG e PEG-g-MWCNTs

Antiinflamatórios

Urina

CG-FID

96

(56)

Nanopartículas de ouro

Derivados benzênicos

Solução de derivados benzênicos

CG-FID

88,3 - 103,7

(57)

TaEO /PPGM

Hidrocarbonetos aromáticos, cetonas, álcoois, aminas, nucleosideos e nucleotideos.

Água

HPLC-UV

86,6 - 96,8

(58)

Grafeno e Sílica

Organofosfato

Água

CG-NPD

76,4 - 112,4

(59)

Apt/Sílica

Adenosina

Plasma

LC-MS/MS

82

(33)

Grafeno e Óxido de Zinco

Enxofre

Alho

CG-MS

81,6 - 91,6

(60)

Sílica octadecil

Benzodiazepnicos

Amostra biológica e água

LC-MS/MS

83

(61)

Líquido iônico

Pesticida

Água e cabelo

LC-MS

82 - 94

(34)

Grafeno

Difenil éteres

Amostra ambiental

CG-MS

81,9

(62)

Sílica

Organometais

Água

HPLC-UV

80,4

(63)

Sílica e germânia

Alquilbenzenos

Amostra salina

HPLC-UV

65

(64)

Ca(NO3)2·4H2O, (PO(OC2H5)3 e TEP

Ésteres ftalato

Água

CG-FID

85,5 - 99,2

(65)

MIP

Metadona

Plasma

LC-MS/MS

80

(66)

Acrilato e Metacrilato

Organoarsênicos

Água

CG-MS

76

(67)

Sílica/fio de titânio

BTEX

Água

CG-MS

81

(68)

N-(2-aminoethyl)-3-aminopro pyltrimethoxysilano(AAPTS)

Ions metálicos

Amostra Biológica

ICP-MS

89,2 - 101,8

(69)

Zirconia/ (polydimethyldiphenylsiloxane, PDMDPS)

Hidrocarbonetos aromáticos, cetonas, aldeídos

Água

CG-MS

43

(37)

SBSE Microfibra oca de silicasílica

N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida

Urina de rato, líquido cefalorraquidiano

CG-MS

71,8-102,3

(41)

Network de sílica

Triazines

Amostra de solo

HPLC–UV

2,4-8,7

(39)

MPTMOS, MTMOS, MeOH, TFA e PMHS

Corantes orgânicos polares

Amostra de água

UV-Vis

72 - 85

(40)

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Tabela 1 (continuação)

Compostos

Amostra

Separação/ Identificação

Recuperação (%)

Ref.

OH-TSO, APTES, TEOS, KH560, PMHS, TFA

Conservantes de bebidas

Refrigerante de cola, suco de laranja e chás de ervas.

HPLC–UV

74,6 - 119,1

(43)

TMOS, MPTS, Etanol

Cd(II)

Amostras de água

ICP-MS

95,6 – 99,8

(70)

Sílica ligada a Fe3O4, TEOS, 3-Aminopropil trietoxissilano

Cu(II) e Cd(II)

Amostra de água, arroz e solo.

F AAS

83,5 e 88,1

(71)

ADS, Propano

Cafeína

Plasma Sanguíneo

HPLC-UV

102

(49)

Precursores

MEPS G, GO, Sílica de aminopropilo, PSA

Parabenos

Água

HPLC–MS/MS

82,3 - 119,2

(53)

HPTES-SBA-15

Ácido elágico

Suco de romã e uva

HPLC-UVVis

97,6

(72)

Sílica gel

Cera cuticular

Planta

GC-FID

-

(54)

Cianopropilo-TEOS, TEOS, Etanol

Plasma sanguíneo

Antipsicóticos, antidepressivos, anti-convulsivos, ansiolíticos.

LC–MS/MS

-

(52)

Sílica

4-hydroxy-2-nonenal

Amostras biológicas

HPLC-UV Vis

47,4 - 89,2

(42)

Sílica gel

Clenbuterol

Carne de porco

HPLC

86,5 - 91,2

(45)

Sílica

Ácido L-ascórbico

Chá gelado e suco

HPLC–UV

97,46 - 106,88

(44)

de polímeros impressos, líquidos iônicos, grafeno, RAM, entre outros, para melhorar a seletividade da extração.

Além disso, a possibilidade de preparar esses materiais em diversos formatos (partícula, monolito, filme) auxilia sua ampla aplicação em diversos métodos de preparo de amostra.

Por fim, as vantagens supracitadas na obtenção de novos materiais aliada com a vertente de métodos de extração e separação miniaturizados e totalmente automatizados é uma poderosa ferramenta analítica para

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alcançar melhores valores de quantificação em matrizes muito complexas.

Agradecimentos Os autores agradecem às agências de fomento Capes, CNPq e FUNDECT pelo apoio no desenvolvimento dos projetos de pesquisa.

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Abreviações e siglas

APTES - 3-aminopropiltrietoxissilano BMMA – β-metilamino-L-alanina BPA – bisfenolDSPE – extração de fase sólida dispersiva ETAAS – espectroscopia de absorção atômica eletrotérmica FAAS – espectrometria absorção atômica de chama FI-SPE-ETAAS - injeção de fluxo na extração de fase sólida pelo sistema de espectroscopia de absorção atômica eletrotérmica HA – ácido hipurico HPLC-DAD – cromatografia liquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos IL – liquido iônico MEV – Microscopia eletrônica de varredura MIP – Polímero de impressão molecular MNPs – nanopartículas magnéticas MTMOS – metiltrimetoxisilano OH-PDMS – polidimetilsiloxano OH-TSO – hidroxigenado óleo de silicone PCP – pentaclorofenol PDMS – polidimetilsiloxano SBSE – extração sortiva em barra de agitação SERS – espectroscopia de Raman amplificada por superfície SPE – extração de fase sólida SPME - micro extração de fase sólida TEOS – tetraetoxissilano TMOS – tetrametoxissilano

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CE

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS): aspectos teóricos, práticos e aplicações no campo da metabolômica.

Ana Valéria Colnaghi Simionato* Fábio Neves dos Santos, Vinicius Veri Hernandes Laboratório de Análise de Biomoléculas Tiselius, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, SP. Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, SP. Recebido: 11/12/2017 Aceito: 19/12/2017

Abstract

There has been thirty years since the first coupling between capillary electrophoresis and mass spectrometry (CE-MS). New instrumentations and methodologies have been developed, due to several applications, including metabolomics. CE-MS interfaces are at the core of these innovations, aiming at better integration between both techniques and allying the advantages of electrophoretic separations and the power of identification of mass spectrometry. For this reason, CE-MS has been currently established as a routine approach in many laboratories within different research areas. Metabolomics and its bioanalytical applications is a stand out area towards distinct use of CE-MS methodologies and instrumentation. It encompasses a broad spectrum of applications, including the discovery of new insights related to the mechanism, diagnostics or treatment of a particular disease, and investigations related to environmental or nutritional issues. This review intends to present the most relevant innovations regarding the coupling between the two techniques that led CE-MS to be consolidated as a resourceful platform for metabolomics applications.

Keywords: capillary electrophoresis-mass spectrometry, metabolomics, fundamentals, advances, applications

Resumo

Há três décadas, a eletroforese capilar foi acoplada pela primeira vez à espectrometria de massas. Desde então, o desenvolvimento de instrumentação e metodologias vem sendo aperfeiçoado e, impulsionado, principalmente, pelas aplicações no campo da metabolômica. As interfaces CE-MS são o centro dos recentes desenvolvimentos que tentam integrar ao máximo as vantagens da separação por eletroforese e da detecção e identificação pelos analisadores de espectrometria de massas, em uma única técnica de alta eficiência. Atualmente, CE-MS é considerada uma técnica em plena consolidação, devido o crescente número de usuários e grupos de pesquisas trabalhando com aplicações em diferentes áreas da ciência.

Em particular, a metabolômica e suas aplicações em bioanalítica se destacam com o maior uso das diferentes técnicas e instrumentações de CE-MS em virtude da sua relevância para o estudo de doenças, nos diagnósticos e no entendimento dos mecanismos bioquímicos envolvidos nas patologias clínicas, mas também nas áreas de alimentos para segurança alimentar e valor nutricional, ambiental focado em poluentes e contaminantes emergentes. A abrangência das aplicações e a inserção em diferentes áreas da ciência revela a consolidação de CE-MS no campo da metabolômica.

Palavras-chave: eletroforese capilar acoplada a espectrometria de massas, metabolômica, fundamentos, avanços, aplicações 228

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1. Introdução A eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS, do inglês capillary electrophoresis – mass spectrometry) surgiu há três décadas (Figura 1) Atualmente, é uma técnica em consolidação e com grande potencial em metabolômica aplicada a bioanalítica, devido a sua utilização na separação e identificação de várias classes de biomoléculas (2). A CE-MS reúne em um mesmo sistema os processos de separação eletroforéticos e os sistemas de detecção de espectrometria de massas que conferem à técnica alta resolução e eficiência, sensibilidade, detectabilidade e informação estrutural dos compostos (3). A complementaridade em relação a LC-MS (Liquid Chromatography – Mass spectrometry) e GC-MS (Gas Chromatography – Mass spectrometry), devido à variedade de modos de separação existentes, possibilitou grandes avanços e crescente aceitação dos usuários. Tais características da CE-MS tem motivado sua aplicação em estudos de genômica, proteômica e metabolômica em aplicações de bioanalítica (3-5). Em metabolômica, a CEMS é considerada uma técnica analítica complementar

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

para caracterização dos perfis de metabólitos polares em amostras biológicas (3-6). Ao longo dos últimos anos, avanços significativos foram feitos nas abordagens para estudos de perfis metabólicos usando CE-MS e sua aplicabilidade se estendeu para áreas como biomecânica, clínica, microbiologia, ambiental e alimentos (6). Esta revisão pretende contextualizar o uso de CE-MS no campo da metabolômica, discutindo os aspectos práticos superados para permitir seu uso nesta área, bem como as limitações ainda enfrentadas. Os avanços mais recentes da técnica são apresentados, mais detalhadamente sobre as interfaces CE-MS, e as referências bibliográficas contendo informações dos aspectos teóricos e práticos são citadas.

2. Características de CE-MS e suas relações com a metabolômica A eletroforese é definida como uma técnica de separação baseada na diferença de migração de compostos iônicos ou ionizáveis na presença de um campo elétrico.

No final da década de 60, o redimensionamento da técnica para um capilar surgiu como uma alternativa

Figura 1. Linha do tempo do desenvolvimento de CE-MS (7-13).

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eficiente para dissipação do calor gerado pela aplicação do campo elétrico, aliada a alta eficiência de separação, tendo então alavancado o uso da técnica e o desenvolvimento de diversas modalidades de separação (14), como eletroforese capilar em zona (CZE, do inglês capillary zone elctrophoresis) (14-16), cromatografia eletrocinética micelar (MEKC, do inglês micellar electrokinetic capillary) (17), focalização isoelétrica capilar (CIEF, do inglês, capillary isoelectric focusing) (18), isotacoforese capilar (CIT, do inglês capillary isotacophoresis) (19) eletrocromatografia capilar (CEC do inglês, capillary electrochromatography) (20) e eletroforese capilar em gel (CGE, do inglês capillary gel electrophoresis) (21). Com exceção das duas últimas, as demais modalidades de separação se diferenciam basicamente pela composição do eletrólito de separação (BGE, do inglês background electrolyte). Independente do modo de separação, o BGE é importante na definição dos tempos de migração de cada analito, já que constitui a solução em que os analitos são separados. Uma das funções do BGE é prover condições controladas, principalmente do pH e da força iônica, para a separação

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

dos analitos, independente da composição da amostra (22).

A CE-MS é considerada uma técnica recente quando comparado com as técnicas de separação como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid Cromatography) e cromatografia gasosa (Gas Chromatography).

A técnica CE-MS alia o alto poder de resolução e eficiência da CE com a universalidade, sensibilidade, seletividade e especificidade que a MS oferece como um sistema de detecção (analisador + detector) comparado a algumas técnicas de detecção como, por exemplo, espectrofotometria na região do UV-visível e fluorescência induzida a laser (LIF, do inglês Laser Induced Fluorescence).

Um equipamento de CE-MS consiste, basicamente, em uma fonte de alta tensão, um eletrodo para condução de campo elétrico no reservatório de BGE da entrada do capilar (inlet), um capilar de separação, uma interface entre os sistemas de CE e MS, o espectrômetro de massas, que é constituído por um

Figura 2. Esquema de um equipamento de CE-MS composto pelo sistema de separação eletroforética, interface/fonte de ionização e analisadores do espectrômetro de massas.

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analisador de massas e um sistema de detecção, e um sistema de registro de dados.

Os princípios da separação por eletroforese capilar, descrevendo matematicamente cada variável responsável por influenciar o resultado analítico, já estão bem estabelecidos e publicados na literatura científica. (23-25) Por isso, o foco dessa revisão são os fundamentos, aspectos práticos e teóricos, bem como o uso desta técnica no campo da metabolômica.

CE-MS é uma técnica interessante e útil para análises metabolômicas de amostras biológicas complexas que apresentam em sua composição compostos com características distintas de polaridade.

Desta maneira, CE-MS se torna útil na separação e caracterização de metabólitos polares (ionizados ou ionizáveis) (26), utilizando CZE como principal modo de separação (27). Além disso, a possibilidade de inversão de polaridade dos eletrodos e adição de modificadores de fluxo eletrosmótico (EOF, do inglês electroosmotic flow) ou recobrimento da parede interna do capilar com polímero catiônico permite que íons positivos ou negativos atinjam a fonte de ionização apenas alterando a natureza do BGE e a configuração do equipamento.

Assim, é possível ampliar ainda mais a gama de compostos detectados através das análises nos modos de ionização positiva e negativa. Algumas características instrumentais fazem com que a inversão de fluxo não seja ainda tão simples, mas o desenvolvimento da técnica tende a facilitar a realização de análises por CE-MS com fluxo “normal” e reverso (5). Soga et al. reportaram pela primeira vez o desenvolvimento de um método CE-MS para a análise de metabólitos catiônicos e ânionicos em uma abordagem global (untargeted metabolomics), conjuntamente com um método para análise de nucleotídeos e coenzimas, aplicados a bactéria Bacilus subtilis durante a esporolução na fase exponencial de crescimento. Utilizando ferramentas de bioinformática para a identificação de analitos desconhecidos, 1692 metabólitos puderam ser identificados (11).

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

Outra característica importante desta técnica é seu alto poder de resolução, superior a técnica de cromatografia líquida, já que a ausência da fase estacionária leva a um processo de transferência de massa do analito mais efetiva e ausência dos caminhos múltiplos proporcionados pelo empacotamento da coluna cromatográfica (termos C e A da Equação de Van Deemter, respectivamente) (28, 29). Isso se torna particularmente útil na análise de amostras biológicas complexas, uma vez que minimiza a comigração de compostos, facilitando a etapa de identificação (ver item 4). Além disso, CE-MS utiliza um volume reduzido de amostra (1 – 50 nL de amostra é consumido por análise), característica desejável para a análise de amostras biológicas (30) que, comumente, são coletadas em pequenos volumes, ao passo que as técnicas cromatográficas trabalham com injeções na ordem de μL. (23) Atrelado ao pequeno volume de amostra, está também o menor custo de análise, refletido pelo baixo volume de solvente utilizado e na diferença de custo entre um capilar de sílica (o mais comumente utilizado) e uma coluna cromatográfica.

Como qualquer técnica analítica, CE-MS apresenta também algumas desvantagens que, portanto, vêm sendo alvo de pesquisas e novos desenvolvimentos a fim de aumentar a eficiência de análise. A primeira diz respeito ao próprio acoplamento entre as técnicas de eletroforese capilar e espectrometria de massas e será mais profundamente discutido no item 3. No entanto, é importante frisar que o acoplamento mais utilizado atualmente nos estudos metabolômicos se faz com o uso de um líquido auxiliar, diluindo os analitos na extremidade de saída do capilar anteriormente à ionização, e reduzindo a sensibilidade da análise. Com isso, a análise de metabólitos, geralmente encontrados em baixas concentrações nas amostras biológicas, é ainda um desafio e foco de vários estudos (30).

Outro ponto importante diz respeito à baixa reprodutibilidade em CE-MS, quando comparado às técnicas cromatográficas. As grandes variações nos

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tempos de migração (principalmente resultante de alterações na superfície interna do capilar) dificultam posteriormente a etapa de tratamento de dados, uma vez que o alinhamento de picos se torna mais difícil, especialmente em softwares desenvolvidos inicialmente para as técnicas cromatográficas, onde a variação dos tempos de retenção é menos evidente (18, 20). No caso de amostras biológicas como plasma e soro, por exemplo, essa variação pode ser ainda maior uma vez que proteínas não eliminadas no processo de preparo de amostra podem adsorver na parede interna do capilar, alterando o EOF e diminuindo ainda mais a repetibilidade dos tempos de migração (26).

3. Interfaces CE-MS e analisadores de massas O desenvolvimento das interfaces CE-MS foi baseado nas já usadas em LC-MS devido a semelhança do processo de ionização à pressão atmosférica.

Contudo, algumas adaptações foram realizadas devido a necessidade de manter um gradiente de tensão no capilar, a falta de correspondência de corrente elétrica entre CE e a fonte ESI (electrospray ionization), a baixa taxa de fluxo de CE, a dificuldade de manter a estabilidade do eletrospray e as limitações na escolha do BGE para serem compatíveis com CE e MS (6) . Desta forma, o interfaceamento de CE com MS pode ser feito com líquido auxiliar (sheath-flow) ou sem líquido auxiliar (sheathless) de acordo com a presença do líquido auxiliar e de um sistema elétrico de contato. As interfaces com ionização por nanospray podem ser também do tipo sheath-flow ou sheathless, gerando eletrospray a partir de vazões de nL/min (6, 31).

As interfaces de CE-MS podem operar com diferentes tipos de ionização, tais como ionização química à pressão atmosférica (APCI, do inglês atmospheric pressure chemical ionization), MALDI (matrix assisted laser dessorption ionization) no modo offline, e ESI (1, 31). Esses sistemas foram precedidos pelo acoplamento 232

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

on-line com ionização por bombardeamento rápido com átomos em fluxo contínuo (cf-FAB, do inglês continuous-flow fast atom bombardment) com interfaces de junção líquida e com líquido auxiliar (1, 31). A fonte de ionização mais adequada para cada aplicação depende das propriedades dos analitos, principalmente da polaridade e da massa molar. O sistema CE-MS com fonte ESI é o mais empregado atualmente devido aos avanços nas interfaces do tipo junção líquida (liquid junction) e com líquido auxiliar (2). Particularmente em metabolômica, a fonte ESI é a mais usada, uma vez que as biomoléculas analisadas por CE-MS são frequentemente polares (2, 32).

A transferência / produção de íons efetiva a partir da solução proveniente do capilar de eletroforese é fundamental nas análises por CE-MS. Nesse processo, ocorre a ejeção de íons provenientes de gotículas à pressão atmosférica para a fase gasosa, seguido pela atração dos íons pelo analisador de massas (26,33). As três configurações mais utilizadas para o acoplamento entre CE e ESI-MS são: com líquido auxiliar coaxial (coaxial sheath liquid), com junção líquida (liquid junction) e sem líquido auxiliar (sheathless ou nanospray), onde todas apresentam fechamento do circuito elétrico na extremidade de saída do capilar de separação ou no capilar de entrada do espectrômetro de massas (26, 31, 33, 34).

3.1) Interface com líquido auxiliar coaxial (coaxial sheath liquid) e ortogonal (orthogonal sheath liquid) A interface com líquido auxiliar coaxial é a mais utilizada no acoplamento CE-ESI-MS devido à estabilidade e a reprodutibilidade do sistema, porém requer a otimização de parâmetros que alteram o EOF como pH, concentração e natureza do tampão, além do modo de ionização (natureza e concentração de solvente orgânico e aditivos, e vazão do líquido auxiliar) para melhorar a detectabilidade das análises (32, 35).

Quando a otimização não é atingida ocorre a diminuição de detectabilidade devido à diluição dos analitos, ao Scientia Chromatographica 2017; 9(4):228-244

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se misturarem com o líquido auxiliar na extremidade de saída do capilar, e como resultado o aumento nos limites de detecção quando comparado as interfaces sheathless (37). O funcionamento da interface com líquido auxiliar coaxial requer um líquido auxiliar que é introduzido através de um tubo de aço inoxidável concêntrico ao capilar eletroforético, em vazões que variam de nanolitros a poucos microlitros por minuto. A mistura entre o efluente eletroforético e o líquido auxiliar ocorre na extremidade do tubo e um gás nebulizador, geralmente nitrogênio, auxilia na formação do spray.

O circuito eletroforético é fechado pelo aterramento do capilar metálico (agulha) do ESI (32, 36). A maior desvantagem da interface com líquido auxiliar coaxial é o alinhamento preciso do capilar em relação à entrada do espectrômetro de massas, pois a vazão proveniente do capilar eletroforético pode causar contaminação e supressão da ionização dos analitos, gerando espectros de massas pouco informativos (32, 35, 36).

O emprego de uma interface com posição ortogonal(10) ao eixo do espectrômetro de massas representou um grande avanço na construção de interfaces CE-MS, pois possibilitou a redução da contaminação na entrada do MS e atração eletrostática dos íons referentes aos analitos, melhorando a detectabilidade do sistema (Figura 3). Adicionalmente, a configuração ortogonal

Figura 3. Interface ortogonal introduzida por Ingendoh e colaboradores (10).

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

da interface permitiu maior flexibilidade na escolha dos eletrólitos que compõe o BGE, assim como o uso de tampões eletroforéticos moderadamente não voláteis.

3.2) Interface sem líquido auxiliar (sheathless) A utilização de liquido auxiliar é uma fonte de diluição dos analitos que leva à diminuição da detectabilidade do sistema, por isso, o desenvolvimento de interfaces sem liquido auxiliar é uma alternativa para resolver esse problema. Porém, tais interfaces são ainda pouco robustas e, embora venham sido reportadas desde os princípios da técnica de CE-MS, o lançamento de equipamentos comerciais com esta configuração é ainda recente(37). O funcionamento adequado dessa interface para o acoplamento CE-ESI-MS tem como principal desafio a dificuldade de manter simultaneamente os circuitos elétricos de CE e ESI. No entanto, a introdução da extremidade do capilar dentro de uma agulha de metal auxilia na estabilidade do contato elétrico de ambos sistemas. A tensão é aplicada diretamente na extremidade de saída do capilar através do material condutor depositado em sua extremidade afunilada. As principais limitações da interface sheathless são o curto tempo de vida útil do capilar e a formação de espécies químicas interferentes em decorrência de reações eletroquímicas.

Os mais recentes avanços no desenvolvimento das interfaces CE-MS incluem a interface sem líquido auxiliar com ponta porosa (porous tip sheathless) desenvolvida por Moini (12) (Figura 4). A interface porous tip sheathless é constituída por uma extremidade porosa disposta na saída da agulha do capilar ESI que possibilita a conexão elétrica do capilar ESI com o MS através do preenchimento da agulha com um eletrólito.

Essa extremidade porosa disposta na interface permite o acoplamento efetivo do baixo fluxo de CE em combinação com MS, resultando em limites de detecção da ordem de nmol/L para várias classes de metabólitos polares. A interface porous tip possui alta reprodutibilidade e pode ser usada tanto para nanoLC-MS como para CE-MS.

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Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

Figura 4. Esquema de interface sem líquido auxiliar com ponta porosa (porous tip sheathless) desenvolvida por Moini (12).

Outros desenvolvimentos importantes no interfaceamento de CE-MS incluem a interface “flowthrough microvial” de Chen, a interface com líquido auxiliar conduzido pelo fluxo eletrosmótico (do inglês, EOF driven sheath-liquid) de Dovichi, e a interface “porous emitter sheathless” de Wang(13). A interface flow-through microvial tem como inovação a manutenção da corrente elétrica no capilar através de soluções de católito e mobilizador. O flow-through microvial garante um ambiente químico estável e ajuda a melhorar a eficiência de ionização sem diluir significativamente o analito pós separação eletroforética, facilitando a transferência do efluente do capilar de separação para o capilar do ESI(38). A interface EOF driven sheathliquid baseia-se no fluxo eletrocinético para conduzir a separação e o eletrospray. Não é utilizada bomba mecânica para bombeamento da solução. O terminal de saída do capilar de separação faz contato com a entrada do capilar do eletrospray, através de um pequeno volume de líquido. A solução líquida é introduzida através de uma junção em T com um fluxo conduzido pela superfície de vidro borosilicato, minimizando assim a diluição do efluente eletroforético para maximizar a sensibilidade 234

e aumentando em ca. 50-100 vezes o sinal analítico, quando comparada com uma interface sheath-liquid.

A interface porous emitter sheathless consiste de um capilar de separação e um capilar de ionização por eletrospray. A extremidade do capilar do eletrospray pode ser porosa ou revestida para formar uma superfície eletricamente condutora. Uma parte do capilar é disposta dentro do capilar de separação, formando uma junção, e um tubo metálico contendo um líquido condutor possibilita a conexão do sistema CE com o MS (39).

3.3) Analisadores de massas nos acoplamentos CE-MS Na última década, a espectrometria de massas tornou-se a principal técnica de análise e detecção de compostos nos acoplamentos com CE superando, em quantidade de aplicações, os detectores de ultravioleta (UV) e arranjo de fotodiodos (DAD), os detectores de fluorescência, e os detectores eletroquímicos - como os potenciométricos, amperométricos e condutométricos (1, 40). O acoplamento de CE e MS é compatível, visto que a separação por CE é baseada nas diferentes Scientia Chromatographica 2017; 9(4):228-244

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mobilidades apresentadas pelos analitos no BGE, enquanto que a razão massa/carga (m/z) dos íons rege a detecção por MS. O baixo volume do capilar de CE, que dificulta a detecção por UV e DAD (devido ao reduzido caminho ótico – delimitado pelo diâmetro interno do capilar), facilita a evaporação do efluente eletroforético na interface e a transferência para o MS, e diminui o efeito de supressão iônica da fonte (1, 41). Dentre os diversos instrumentos de espectrometria de massas comercialmente disponíveis, é crucial conhecer as características instrumentais dos principais analisadores para sua aplicação mais adequada em metabolômica.

Atualmente, os analisadores de massas mais utilizados em aplicações metabolômicas são o quadrupolo (Q), triplo quadrupolo (QqQ) (42), Ion Trap (IT) (43), ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FT-ICR) (44) e tempo de voo (TOF) (45) e orbitrap (46). Porém os fatores que podem influenciar significativamente o desempenho de um analisador de massas em análises qualitativas e quantitativas devem ser considerados, como: (i) transmissão de íons para o detector que é estimado a partir da relação entre o número de íons que chegam ao detector e o número de íons produzidos na fonte; (ii) a resolução como o menor incremento de massa que pode ser distinguido pelo analisador; (iii) taxa de varredura (ou taxa de aquisição), que é o tempo necessário para que o analisador percorra uma determinada faixa de massa em unidades de massa atômica; e (iv) o maior limite de relação massa/carga que pode ser medido. (2) Os quadrupolos são analisadores em desuso nos instrumentos de CE-MS devido a baixa velocidade de varredura que prejudica a detecção de picos eletroforéticos por apresentarem alta eficiência e necessitarem de alta velocidade de aquisição do analisador. A resolução do quadrupolo é de aproximadamente 1 Da em toda a faixa de massa (aproximadamente até 1500 Da), portanto, é considerado um analisador de baixa resolução. Essa característica torna-se uma desvantagem em análises metabolômicas nas quais alta resolução é um requisito indispensável um requisito indispensável para a

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

identificação confiável dos metabólitos conhecidos e de novas moléculas. Entretanto, o quadrupolo pode monitorar um único íon com a máxima eficiência de coleta da fonte e máxima eficiência de transmissão e sensibilidade, operando no modo de monitoramento do íon selecionado (SIM do inglês, selected ion monitoring).

Neste modo, há aumento de seletividade do quadrupolo, pois dois ou mais íons de diferentes razões m/z que comigram na separação por CE, podem ser monitorados em diferentes canais, gerando detecção diferencial do sinal iônico para múltiplos íons. Devido à alta sensibilidade e seletividade no modo SIM, o quadrupolo é ideal para as análises quantitativas de metabólitos (2).

Os triploquadrupolos são analisadores híbridos que preservam as principais vantagens dos quadrupolos, superando algumas desvantagens. A baixa resolução é superada parcialmente pela possibilidade de fragmentação que gera a informação estrutural detalhada sobre as moléculas obtida por dissociação induzida por colisão (CID, do inglês collision induced dissociation).

O primeiro quadrupolo (Q1) e o terceiro (Q3) podem ser usados para varredura (modo scan) ou seleção de íons específicos (modo SIM), enquanto o quadrupolo central (quadrupolo de transmissão - Q2) opera também como célula de colisão. Os íons produto resultantes da colisão são analisados pelo terceiro quadrupolo e detectados. O modo SIM associado com CID para detecção no Q3 tem alta sensibilidade em comparação com IT e TOF devido ao aumento da relação sinal ruído, levando a detecção de analitos em baixos níveis de concentração em matrizes biológicas a partir de pequenos volumes de amostra.

Os Ion Traps podem ser úteis nas análises de perfil metabolômico (untargeted metabolomic) devido à capacidade de realizar as medidas de MS/MS sem a necessidade de um analisador de massas adicional, como ocorre nos instrumentos QqQ e Q-TOF ou uma célula de colisão, devido a presença do gás hélio no interior do IT. A pressão do gás hélio e a energia cinética dos íons são ajustadas para realizar o monitoramento no modo SIM ou MS/MS no qual a energia cinética de íons selecionados

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é ajustada para que ocorra fragmentação por CID. Os íons produto podem então ser ejetados sequencialmente ou permanecer no IT para sofrerem novo processo de fragmentação que pode ser repetido n vezes, fornecendo espectros de MSn e, portanto, informações estruturais mais detalhadas. Entretanto, uma limitação do MSn desse analisador é o menor limite de relação massa/carga (m/z) que pode ser detectada no modo MS/MS, visto que os íons produto de relação m/z menor do que 1/3 da relação m/z do íon precursor são perdidos. O Ion Trap também pode operar em um modo semelhante ao SIM do quadrupolo no qual um íon específico é selecionado e acumulado, com menor precisão da m/z selecionada do que o QqQ, enquanto todos os outros íons são ejetados do analisador para serem detectados.

O princípio do analisador TOF baseia-se nas diferenças de tempos de vôo e de velocidades de íons que são proporcionais à sua relação m/z. No analisador TOF, os íons produzidos na fonte são acelerados com a mesma energia cinética por um campo elétrico pulsado na entrada do tubo de vôo. Os íons de menor massa e de carga múltipla atingem o detector antes dos íons de maior massa de carga simples. O TOF possui alta sensibilidade devido à alta eficiência de transmissão dos íons e não é discriminatório com relação a razão m/z dos íons. O TOF é um analisador de alta resolução e precisão que provê massa exata para os íons, o que é essencial na identificação de compostos desconhecidos nas análises metabolômicas. Devido à sua alta sensibilidade, alta resolução de massa e precisão, o TOF tem uma faixa de massa teoricamente ilimitada que é requerida para aplicações metabolômicas. O analisador hibrido Q-TOF além dessas características do TOF pode realizar análises de MS/MS. Em relação ao IT e QqQ, a vantagem do MS/ MS no QTOF é a detecção dos íons produto com alta resolução e exatidão de massas que em metabolômica é crucial na identificação molecular.

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Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

4. Aplicações de CE-MS em metabolômica As potencialidades e novas aplicações de CE-MS no

campo da metabolômica têm sido mostradas por uma série de grupos de pesquisa no mundo, principalmente por Sonsen, GW (3), de Jong GJ (5), Ramautar R (47), Barbas C (48), Cifuentes A (49), Britz-McKibbin P (50), Tavares MF (51), Carrilho E (52) , Breadmore MC (53) e Soga T (54). Tais aplicações, ainda que expressivas, são inferiores em termos de números em relação às técnicas de separação cromatográficas, devido aos seus diferentes estágios de desenvolvimento e demais características já apontadas anteriormente.

Contudo, um estudo metabolômico abrangente deve conter tanto análises por GC e LC como por CE (acoplados a MS), de forma a garantir ampla cobertura de todos os metabólitos presentes em uma amostra. A Figura 5 apresenta o número total de publicações em metabolômica desde 2003, comparando as técnicas de GC, LC e CE. É importante salientar que embora o termo de busca utilizado não reflita exatamente o número total de trabalhos publicados com cada técnica, é fiel ao representar a grande disparidade no número de publicações que fazem o uso de cada uma destas plataformas.

Alguns fatores explicam o menor uso da técnica de CE-MS. Além das desvantagens apresentadas em termos de variação no tempo de migração e baixa sensibilidade, CE-MS é ainda considerada uma técnica desafiadora em termos práticos, o que pode ser atribuído à fatores como os problemas encontrados no acoplamento, bem como o início de seu desenvolvimento em um período mais recente que as demais técnicas cromatográficas já melhor estabelecidas (5). Além disso, 50% dos artigos encontrados para o ano de 2016 para o termo CE-MS apresentavam também outra técnica cromatográfica associada, demonstrando o uso complementar dessa técnica, em uma abordagem normalmente denominada “multiplataforma”, já que alia a vantagem de uma maior cobertura de metabólitos detectados.

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Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

Figura 5. Número de publicações nos últimos 14 anos com as técnicas de separação GC-MS, LC-MS e CE-MS. (Parâmetros de busca: Web of Science, campo “Tópico”, termos metabolomics e GC-MS, LC-MS ou CE-MS)

Dentre todas as áreas de aplicação de CE-MS, a área médica se destaca. Estudos com o objetivo de encontrar biomarcadores para diagnóstico (55, 56), elucidar mecanismos bioquímicos de doenças (57), avaliar a toxicologia de fármacos e compostos correlatos (58) ou ainda avaliar o papel da microbiota intestinal (59) são alguns dos exemplos de aplicação nesta área.

Além da medicina, áreas como a de alimentos - o termo Foodomics (60) vem sendo utilizado para essa área (do inglês, food - alimento e omics), forense, biologia celular, vegetal, animal e ambiental tem utilizado CEMS devido a capacidade promissora desta técnica. Uma revisão sobre tais aplicações foi publicada recentemente por Týčová e colaboradores (34) Na área da medicina, plasma e soro foram utilizados em diversos estudos. Para plasma, estudos com humanos (61, 62) e ratos (63, 64) foram descritos.

Já para soro, apenas estudos em humanos foram

encontrados (65-67). Além dessas matrizes, publicações empregando saliva (68), urina (69), tecido (70), fluido cerebrospinal (71), fezes (72), suor (73) e meios de cultura de microorganismos (74) foram reportados, entre outros. A Figura 6 exemplifica o uso de CE-MS em uma aplicação metabolômica, representando as etapas do estudo na análise de suor de crianças para o diagnóstico de fibrose cística como alternativa ao teste do nível de cloreto (teste padrão), uma vez que este pode produzir resultados ambíguos (73). As análises foram feitas por CE-MS com injeção multi segmentada, levando a uma elevada frequência analítica. Concluiu-se que asparagina e glutamina encontradas no suor podem auxiliar o diagnóstico de crianças com fibrose cística.

Além disso, as crianças com fibrose cística excretam menor quantidade dos metabólitos exógenos do ácido pilocárpico (o principal metabólito da pilocarpina - um fámaco estimulador do suor) e mono-(2-etil-hexil)-

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Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas (CE-MS)

Figura 6. Exemplo do uso da técnica de CE-MS no diagnóstico de fibrose cística em amostras de suor de crianças (73).

ftalato, um plastificante ubíquo oriundo da exposição ambiental.

Em termos gerais, tais estudos foram capazes de detectar e identificar compostos como aminoácidos, ácidos carboxílicos e derivados, nucleosídeos, nucleotídeos, tióis, compostos do ciclo da glicose e pentose, poliaminas, purinas, pirimidinas, oligosacarídeos, compostos fosforilados (25), dentre outros, o que demonstra o grande potencial desta técnica, bem como seu caráter complementar às demais em termos de obtenção de informação de compostos polares. Na área ambiental, matrizes como plantas (75) e insetos (76) já foram reportadas e na área de alimentos, trabalhos que utilizam milho (77), pasta de soja (45), ervas medicinais (78) e saquê (79) como matriz podem ser encontrados.

5. Identificação de metabólitos A etapa de identificação de metabólitos é ainda um grande desafio na área de metabolômica.

Independentemente da técnica de separação utilizada, 238

a identidade de uma grande fração dos compostos detectados permanece desconhecida (26, 80). Em CE-MS, a identificação normalmente se inicia com a busca em bases de dados pela massa (ou relação m/z) dos compostos em questão, uma vez que o uso de espectrômetros de massas de alta resolução fornecem valores de massa exata (27). Exemplos de base de dados incluem Kegg (81), HMDB (82), Metlin (83) e LipidMaps (84). Recentemente, uma compilação de todas estas bases de dados foi feita com o propósito de proporcionar, em uma única busca, o resultados das 4 bases de dados, denominada CEU Mass Mediator (http:// ceumass.eps.uspceu.es/). Com os resultados obtidos com a massa exata, diversas podem ser as estratégias seguintes para identificação: aquisição de padrões analíticos para confirmação dos compostos, identificar tentativamente (annotation) através de espectros de MS/MS, utilizar outras técnicas analíticas como RMN para obter dados complementares. Em alguns casos, esta etapa é a única disponível aos pesquisadores, e a confirmação pelo padrão isotópico apresentado no espectro de massas se torna o único parâmetro de confirmação, tornando a identificação apenas putativa. No entanto, existem algumas alternativas para aumentar o nível de confiança na identificação do composto candidato. Primeiramente, Scientia Chromatographica 2017; 9(4):228-244

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a padronização dos parâmetros do método de separação juntamente com o uso de um padrão interno permite criar uma biblioteca com tempos de migração relativos, ou seja, a razão entre o tempo de migração do composto em questão e o tempo de migração do padrão interno.

Com isso, faz-se necessária a introdução de padrões para confirmação uma única vez, utilizando-se os valores atribuídos de tempo de migração relativo na biblioteca para confirmar ou rejeitar possíveis identificações em análises posteriores. Essa é uma estratégia comumente usada por – Coral e colaboradores (63) e Soga e colaboradores (85), grupos de pesquisa que são referências na área de metabolômica por CE-MS. No caso em que os métodos de separação não estão padronizados, a confirmação pode ser feita de duas maneiras. Uma delas se dá através da introdução de padrões analíticos, o que pode constituir uma estratégia laboriosa e de alto custo devido ao grande número de metabólitos encontrados – ainda que consideremos apenas os estatisticamente significativos – fazendo com que seja necessário o preparo de diversas soluções para análise e a compra de diferentes padrões analíticos (27).

Além disso, muitos compostos não estão disponíveis como padrões analíticos (26). Neste caso, a obtenção de espectros de MS/MS destes compostos em específico pode ser realizada (27) em equipamentos que permitam este modo de análise. Desta maneira, equipamentos do tipo triplo quadrupolo, ion trap ou QTOF (86) podem ser de grande ajuda na elucidação de estruturas. Os espectros obtidos podem ser confrontados com as mesmas bases de dados já citadas para busca de massa exata, já que também possuem espectros de MS/MS. A limitação, neste caso, se dá pela falta de reprodutibilidade interlaboratorial para as análises por CE-MS/MS ou ainda pela ausência de espectros de MS/MS disponíveis para muitos compostos.

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Devido às limitações presentes nos métodos anteriormente descritos para identificação de metabólitos, novas estratégias vem sendo desenvolvidas na tentativa de facilitar a identificação e aumentar a confiabilidade do método. Um trabalho publicado por Sugimoto et al. relata o desenvolvimento de um modelo matemático criado com o uso de 375 padrões analíticos e baseado nas características físico-químicas de cada composto, capaz de prever o tempo de migração dos mesmos. Uma análise posterior utilizando amostras de urina aumentou de 38,9% de metabólitos identificados apenas pela massa exata para 52,2% utilizando a predição de tempo de migração (87).

6. Conclusão e perspectivas A eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas após três décadas de intenso desenvolvimento em instrumentação e metodologias pode ser considerada uma técnica em plena consolidação, devido o crescente número de usuários e grupos de pesquisas trabalhando com aplicações em diferentes áreas da ciência. Os aspectos mais críticos como pré-tratamento de amostras, condições de separação, acoplamentos CE-MS, e análise de dados tem sido intensamente discutidas em revisões publicadas por esses grupos que demonstram o pleno avanço da técnica. Os principais desafios para consolidação da CE-MS como uma técnica de rotina são os desenvolvimentos dos microdispositivos de CE-MS e a combinação on-line de pré-concentração de amostras e além do avanço nos softwares para identificação de metabólitos e construção de bibliotecas de espectros obtidos por CE-MS e CE-MS/MS.

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244

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):228-244

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2017.019 ISSN 1984-4433

HPLC

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida suportada por membrana oca (HF-LPME) para determinação de sulfonamidas em água superficial por HPLC-DAD Eduardo Carasek* Camila M. S. Vieira Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900 Florianópolis, SC, Brazil *eduardo.carasek@ufsc.br Recebido: 18/10/2017 Aceito: 21/11/2017

Abstract

A simple, precise and accurate method was developed and validated for the extraction of sulfonamides in surface water samples over a wide linear working range and based on the principles of green chemistry. Using the liquid phase microextraction technique supported by polypropylene hollow membrane in three phase configuration the main extraction parameters were optimized through experimental design. The optimum extraction conditions are addition of 11.2 g of ammonium sulfate in 15 mL of donor phase, 1-octanol to fill the hollow fiber pores, donor and receptor phases at pH 5 and 10, respectively, and 60 min of extraction time. The separation/detection was performed by high performance liquid chromatography and diode array detection.

The main analytical parameters of merit for the proposed method were evaluated, with the limit of quantification for the five sulfonamides being higher than 5 μg L-1 and relative standard deviation (RSD) less than 17%. Recovery studies revealed values between ​​ 61 - 119%. The proposed method is promising for routine analyzes in surface water, in view of the emerging concern of environmental contamination by sulfonamides.

Keywords: microextraction, hollow fiber, sulfonamides, aqueous sample.

Resumo

Um método simples, linear, preciso, com ampla faixa de trabalho e seguindo os princípios da química analítica verde foi desenvolvido e validado para extração de sulfonamidas em amostras de águas superficiais. Os principais parâmetros de extração da microextração em fase líquida suportada por membrana oca de polipropileno em configuração trifásica foram otimizados através de planejamentos experimentais.

As condições ótimas de extração foram a adição de 11,2 g de sulfato de amônio na fase doadora de 15 mL (amostra), uso de 1-octanol para o preenchimento dos poros da fibra oca, pH 5 para a fase doadora e pH 10 para a fase receptora e 60 min de extração. A separação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência e a detecção por arranjo de diodos. Os principais parâmetros analíticos do método proposto foram avaliados sendo o limite de quantificação para as cinco sulfonamidas (5 μg L-1) e desvio padrão relativo (RSD) menor que 17%. Os estudos de recuperação revelaram valores entre 61-119%. O método proposto apresenta-se promissor para análises de rotina em águas superficiais, tendo em vista a emergente preocupação da contaminação ambiental por sulfonamidas.

Palavras-chave: microextração, membrana oca, sulfonamidas, amostras aquosas.

Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

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Carasek E., Vieira C. M. S.

1. Introdução São raros os casos em que podemos analisar quimicamente uma amostra de forma direta sem a preocupação com a sua composição. Apesar dos avanços da tecnologia no campo instrumental, a maioria dos equipamentos ainda não pode operar diretamente com matrizes de amostras complexas1. Devido a essa característica, a etapa do preparo da amostra é considerada a mais importante em qualquer procedimento analítico.

Para detectar níveis traço de analitos muitas técnicas de preparo de amostra foram desenvolvidas, entre elas as técnicas com a utilização de membranas se destacam. Além de apresentarem facilidade de utilização e bons resultados, as membranas são de simples aquisição comercial por possuírem aplicações na purificação de água potável e tratamento de águas residuais2. Além disso, quando utilizadas para separações em fase líquida, membranas formam sistemas miniaturizados, diminuindo a utilização de solventes orgânicos e apresentando vantagens tanto para uma metodologia mais verde, quanto para a saúde do analista.

A técnica de microextração em fase líquida suportada por membrana oca (HF-LPME, do inglês hollow-fiber liquid phase microextraction) foi desenvolvida em 19993 e nas últimas décadas tem sido utilizada para os mais diferentes poluentes e contaminantes emergentes4.

Os fármacos pela sua tradição não são vistos como potenciais poluentes ambientais. Porém, com a recente presença deles em meios aquáticos, levantou uma grande questão devido a possíveis impactos. Estes compostos emergentes são citados como sendo agentes de diagnóstico, surfactantes, fragrâncias, aditivos industriais, ativos farmacêuticos, produtos de cuidado pessoal, esteroides entre outros5. A presença desses ativos em recursos naturais gera uma problemática de alimentos contaminados por fármacos de uso humano e veterinário6. Estudos tem se intensificado para detecção de antibióticos nos alimentos de origem animal, de leite, mel, de peixe, bem como de amostras ambientais.

246

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

De acordo com avaliações realizadas nos últimos anos, sulfonamidas (SAs) e fluoroquinolonas estão entre os antibióticos veterinários mais comumente usados7.

A alta eficiência de SAs e seu custo relativamente baixo têm estimulado o seu uso em práticas veterinárias.

Além de estarem em formulações puras e combinações com outros antibióticos, as SAs são utilizadas como aditivos em rações para animais. Como resultado de má conduta na profilaxia e no tratamento de animais, cada ser humano torna-se um consumidor passivo desses fármacos podendo ter efeitos adversos como reações alérgicas, supressão de atividade da enzima, alteração da microflora intestinal e promoção de formas sustentáveis de patógenos8.

O Ministério da Saúde juntamente com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, estabeleceram na Resolução RDC n° 53 de 2 de outubro de 20129 o Regulamento Técnico do Mercosul para Limites Máximos de Resíduos (LMR) para Medicamentos Veterinários em Alimentos de Origem Animal. O Limite é apresentado em 100 μg L-1 para matrizes de fígado, rim, músculo e leite em alimentos de origem bovina, suína e aves.

Para resíduos em água não há resolução, porém, publicações recentes da U.S. Environmental Protection Agency (EPA) apresentam as SAs como contaminantes emergentes que causam preocupação. Isso por estarem em quantidades significativas em amostras ambientais, tais como águas residuais farmacêuticas e agrícolas, águas superficiais e subterrâneas, e solos.

Como a tendência atual é o estabelecimento de limites máximos de SAs em matrizes aquosas nos próximos anos, o propósito geral deste estudo foi o desenvolvimento de um método analítico utilizando HFLPME no modo trifásico (Figura 1) para a determinação de SAs em águas superficiais utilizando cromatografia líquida de alta eficiência.

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Carasek E., Vieira C. M. S.

Figura 1. Esquema do modo de extração da HF-LPME no modo de três fases. (Fonte: Adaptado de Merib e Carasek, 2013)

2. Materiais e métodos 2.1 Materiais

Para as análises foram utilizados padrões de sulfadizina (SDZ), sulfametaxazol (SMX), sulfatiazol (STZ), sulfamerazina (SMR) e sulfametoxipiridazina (SMP), além dos solventes octanol, pentanol e tolueno obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

Sulfato de amônio e cloreto de sódio foram obtidos da Vetec, Brasil. Fosfato de potássio monobásico anidro foi obtido da Sigma-Aldrich. Frascos com tampas em volumes de 20 mL foram adquiros da Supelco, EUA. Fibras de polipropileno PP 300/120 Accurel® com 1,2 mm de diâmetro interno, 300 μm de espessura e 0,2 μm de tamanho de poro foram obtidas da Wuppertal, Alemanha. Água superficial de açude localizado em Gaspar – Santa Catarina ( 26°49’18.1”S 49°01’32.0”W) foram coletadas em frascos esterilizados e mantidos em refrigeração até a relização dos ensaios.

2.2 Equipamentos As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo líquido modelo LC 20AT (Shimadzu,

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

Japão) equipado com detector DAD modelo SPD-M20A, injetor manual, modelo Rheodyne 7725i (Rohnert Park, EUA) e loop de injeção de 20 μL. A separação cromatográfica foi realizada em fase reversa com uma coluna C18 (Phenomenex Kinetex de 250 mm x 4,6 mm d.i. e 5 μm de espesurra de filme obtido da Torrance, EUA). Entre o injetor e a coluna foi utilizada uma coluna de guarda C18 (Phenomenex Kinetex, 2 mm x 4,6 mm d.i. e 2 μm de espessura de filme da Torrance, EUA).

Também foram empregados volume de injeção de 20 μL e vazão de fase móvel de 1 mL min-1. O modo escolhido foi a eluição por gradiente e a fase móvel utilizada foi metanol e água acidificada (0,1% ácido acético) em pH ≈ 3,5. O gradiente do solvente iniciou a 20:80 mantendose por 3 min seguido de uma rampa de 3 a 5 min até a proporção de 50:50 das fases; de 5 a 7 min uma segunda rampa até 70:30 foi estabelecida mantendo até 10 min de corrida; a partir disso, até 12 min, a razão voltou a inicial (20:80) sendo reestabelecida e equilibrada até 20 min.

Os comprimentos de onda máximo escolhidos foram 267, 289, 267, 265, 269 nm para SDZ, STZ, SMR, SMP e SMX, respectivamente.

2.3 Planejamento experimental para otimização A otimização dos parâmetros que afetam a extração das sulfonamidas por HF-LPME foi realizada por experimentos multivariados em uma concentração de 50 μg L-1 dos analitos em água ultra-pura. Para a otimização da adição de sal, foram utilizados sulfato de amônio, cloreto de sódio e fosfato de potássio monobásico em quantidades próximas a sua saturação em água. A quantidade de sulfato de amônio e o tempo de extração foram avaliados utilizando o planejamento Doehlert – consistindo em 9 experimentos variando o tempo de extração (30-120 min) e a quantidade de sal (0-11,2 g).

Superfície de resposta triangular foi utilizada para a escolha do solvente orgânico de recobrimento da fibra – formação da camada líquida suportada – utilizando 1-octanol, tolueno e 1-pentanol. A adição de solvente extrator na fase doadora também foi avaliada, variando em 0, 30, 60 e 100 μL de octanol:pentanol

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252 247

Carasek E., Vieira C. M. S.

(55:45). Os resultados experimentais foram processados com auxílio do STATISTICA 7 e Excel considerando as médias geométricas das áreas cromatográficas dos cinco analitos.

2.4 Preparo das fibras de polipropileno Para os experimentos, hastes de 4 cm de comprimento de fibras de polipropileno (PP) foram cortadas e seladas em uma das extremidades para possibilitar o preenchimento com a fase receptora no momento da extração. As fibras, depois de preparadas, foram armazenadas em um frasco contendo acetona até sua utilização.

2.5 Validação Nessa etapa foi empregado o procedimento de preparo de amostra previamente otimizado. Com base nas curvas analíticas foram calculados as faixas lineares, limites de detecção (LOD), limites de quantificação (LOD) e os coeficientes de correlação lineares de cada analito para o método proposto. O LOQ foi definido como o primeiro ponto da curva analítica como definido pelo INMETRO10 e o LOD como três vezes menor do que o LOQ. A precisão e a exatidão foram avaliadas através da fortificação de amostras de água superficial de açude. A precisão avaliada pela repetitividade intraday (n=3) em dois níveis de concentração (5 e 100 μg L-1) e calculada como desvio padrão relativo (RSD), considerando valores precisos àqueles inferiores a 20%. A recuperação foi avaliada em três níveis de fortificação (2, 5 e 35 μg L-1) em triplicata sendo apresentada em termos de porcentagem de recuperação considerando valores bons entre 60 e 130% para analitos a nível traço.

3. Resultados e discussão Alguns parâmetros iniciais foram fixados de acordo com estudos anteriores de nosso grupo de 248

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

pesquisa14. A fibra de polipropileno foi utilizada em configuração de haste com 4 cm de comprimento; fase doadora (amostra) tampão pH 5 (acetato 0,05 mol L-1 ) e fase receptora tampão pH 10 (carbonato 0,05 mol L-1); 15 mL de amostra com aditivo de 30 μL de 1-octanol:1pentanol (55:45); e 10 g de sulfato de amônio para alterar a força iônica.

3.1 Fase doadora, fase receptora e a influência do pH É conhecido que o pH da amostra exerce influência sobre a eficiência de extração dos analitos devido a possibilidade de ionização. Na metodologia proposta por HF-LPME os analitos devem necessariamente estar na forma molecular. Isso porque, nessa forma, ocorre a interação com o solvente orgânico e, consequentemente, a extração. Por isso é necessário trabalhar com amostras tamponadas na fase doadora sempre abaixo do pKa dos analitos em aproximadamente duas unidades - em meios mais ácidos que isso pode ocorrer a protonação do grupo amino, reduzindo a interação com o solvente orgânico11,12. Dessa forma na fase doadora o tampão acetato (0,05 mol L-1) foi utilizado garantindo assim o pH 5.

O sistema de três fases utilizado em HF-LPME está sob influência dos equilíbrios entre o analito na fase doadora-solvente e o analito no solvente-fase receptora.

Neste caso para aumentar a eficiência da extração é necessário aumentar o equilíbrio para a fase receptora, uma vez que esta armazena o analito. Para isso é necessária uma fase receptora com pH duas unidades acima do pKa dos analitos estudados de modo a promover a ionização do analito na interface solvente-fase receptora e garantir a permanência do mesmo nessa fase devido à falta de interação com o solvente orgânico13,14. Utilizando uma fase receptora em pH 10 (tampão carbonato 0,05 mol L-1 ) é garantida a ionização dos analitos.

3.2 Solvente orgânico como membrana líquida suportada Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252

Carasek E., Vieira C. M. S.

Testes foram realizados para confirmar a importância da presença do solvente orgânico nos poros da fibra. Para o método proposto é importante que o solvente tenha polaridade similar as SAs, de modo a obter um elevado coeficiente de partição. Os resultados obtidos pelo planejamento de superfície triangular são apresentados na Figura 2, sendo avaliados 1-octanol, 1-pentanol e tolueno, individualmente, em misturas binárias com 33% e 66 % (v/v) de cada solvente e uma mistura ternária contendo 33% (v/v) cada.

A superfície resposta triangular apresentou melhores resultados com os solventes orgânicos puros, naqueles com maior similaridade de polaridade com os analitos. As melhores respostas foram obtidas nas misturas contendo maiores quantidades de 1-octanol. A utilização de 25 % de tolueno em 1-octanol também seria possível porem não foi utilizada ao considerar os efeitos toxicológicos do tolueno (LD 50tolueno>LD 50octanol).

Dessa forma o solvente escolhido como recobrimento da membrana foi o 1-octanol.

3.3 Força iônica e tempo de extração Para verificar o efeito da adição de sal na solução

Figura 2. Superfície resposta triangular obtida a partir da extração com os solventes: tolueno, 1-octanol e 1-pentanol. Condições: volume de amostra de 15 mL tamponada em pH 5,0 com tampão acetato, 10 g sulfato de amônio, 30 μL de solvente extrator octanol:pentanol (45:55) , tempo de extração 60 minutos e 50 μgL-1 de solução mista de sulfonamidas. Fase receptora: tampão carbonato em pH 10,0 .

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

mista de padrões em água foi realizado um estudo inicial. O efeito “salting out” faz com que as moléculas de água solvatem preferencialmente os íons provenientes de sal, liberando dessa forma os analitos para que estes sejam extraídos pelo solvente orgânico. Os sais de sulfato de amônio, cloreto de sódio e fosfato de potássio monobásico anidro foram testados, sendo adicionados à amostra em quantidades um pouco abaixo da saturação da solução. Os resultados estão apresentados na Figura 3.

O gráfico de barras, em porcentagem (%) normalizada, apresenta a média das respostas em triplicata para os sais sulfato de amônio e fosfato de potássio monobásico. As extrações utilizando cloreto de sódio não foram eficientes, portanto não utilizadas na comparação. Sulfato de amônio apresentou o efeito mais significativo na extração devido a sua alta solubilidade em água que leva a uma maior força iônica na solução.

Para a otimização da quantidade de sal adicionada (0 a 11,2 g – considerando de 0 a 97,5 % de saturação) e o tempo de extração (30 a 120 min) foram obtidas superfícies de respostas individuais e, através da média geométrica, uma superfície compromisso para todos os analitos da extração. Com a superfície resposta de compromisso, Figura 4, podemos observar resultados ótimos com a utilização de 11,2 g de sulfato de amônio e 60 min de extração.

Figura 3. Estudo do ajuste da força iônica utilizando 3 g de KH2PO4, 10 g de (NH4)2SO4. Condições: volume de amostra de 15 mL com tampão acetato, 30 uL de solvente extrator octanol:pentanol (45:55) , tempo de extração 60 minutos e 50 μgL-1 de solução mista de sulfonamidas. Fase receptora: tampão carbonato em pH 10,0.

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Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

solvente extrator. Para os analitos SDZ e STZ a adição não apresentou alteração na extração, enquanto para SMR, SMP e SMX a eficiência diminuiu. Uma vez que esses analitos são mais polares e interagiram mais com o solvente orgânico coextrator, a extração foi prejudicada não sendo interessante utilizar o solvente adicionado.

Figura 4. Superfície de resposta compromisso para os analitos na otimização da força iônica e do tempo de extração. Condições fixas: volume de amostra de 15 mL com tampão acetato, 30 uL de solvente extrator octanol:pentanol (45:55) e 50 ppb solução mista de sulfonamidas. Fase receptora: tampão carbonato em pH 10,0.

3.4 Solvente orgânico Coextrator É conhecido que solventes extratores adicionados na amostra (fase doadora) melhoram a eficiência da extração15. Porém, quando utilizado a fibra de polipropileno como suporte para a membrana líquida, esta adição de solvente orgânico pode não influenciar na extração. Com os resultados experimentais foi possível a elaboração de um gráfico de barras (Figura 5) comparando a adição de diferentes volumes do

3.5 Condição final otimizada Após as otimizações foi definido como condição ótima de extração o uso de 15 mL de amostra adicionada de tampão acetato (0,05 mol L-1 pH 5) como fase doadora, tampão carbonato (0,05 mol L-1 pH 10) como fase receptora, 11,2 g de sulfato de amônio para o aumento da força iônica na amostra, 60 min de extração e 1-octanol como solvente orgânico para preenchimento dos poros da fibra de polipropileno.

3.6 Parametros de validação Após a otimização dos parâmetros para extração das SAs o método foi avaliado através das principais figuras de mérito. Testes de seletividade foram realizados e uma curva na matriz foi requerida. A tabela 1 apresenta os valores determinados para a linearidade (coeficiente de correlação), faixa linear, limite de quantificação e detecção, e a precisão do método. Os ensaios de repetitividade (intra-day) apresentaram desvio padrão relativo (RSD) entre 0,5 e 16,2% para os níveis 5 e 100 μg L-1 (n=3), confirmando a boa precisão do método.

Estudos de recuperação (tabela 2) foram realizados em triplicata utilizando níveis concentração 2, 3 e 35 μg L-1 apresentando resultados entre 61,4 e 118,7%.

4. Conclusões

Figura 5. Comparação entre a adição de diferentes volumes do solvente extrator 1-octanol: 1-pentanol (55:45) para a extração de sulfonamidas, utilizando HF-LPME. 250

A utilização da técnica de HF-LPME trifásica, utilizando membrana líquida suportada de 1-octanol apresentou bons resultados para extração de sulfonamidas em águas superficiais. O método desenvolvido e validado mostrou-se adequado por ser preciso, linear, exato, com Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252

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Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

Tabela 1. Faixa linear, coeficiente de correlação, limites de detecção e quantificação obtidos para o método proposto com HF-LPME para determinar sulfonamidas em água superficial através de uma curva na matriz.

Analito

LOD (μg L-1)

LOQ (μg L-1)

Faixa Linear (μg L-1)

Curva Analítica

r

RSDa (%)

RSDb (%)

SD

1,6

5

5-100

y = 554,69x -40,252

0,998

1,2

0,8

STZ

1,6

5

5-100

y = 492,69x +1155,6

0,997

8,0

0,5

SM

1,6

5

5-100

y = 910,99x +89,223

0,999

0,8

3,7

SMP

1,6

5

5-100

y = 768,47x +133,15

0,998

2,8

5,8

SMX

1,6

5

5-100

y = 1109,8x -314,7

0,998

12,5

16,2

Tabela 2. Resultados de recuperação para água superficial de açude, realizada em três níveis de fortificação.

recuperações dentro dos limites aceitáveis e ter uma ampla faixa linear.

Analito

Nível Fortificado (μg L-1)

REC (%)

SD

2 5 35

95,7 112,4 85,7

Agradecimentos

STZ

2 5 35

118,7 88,1 65,1

SM

2 5 35

117,3 73,2 63,6

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro para a realização da pesquisa.

SMP

2 5 35

90,0 69,1 71,5

SMX

2 5 35

61,4 77,6 68,8

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252 251

Carasek E., Vieira C. M. S.

Desenvolvimento de método empregando microextração em fase líquida

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252

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):245-252

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2017.020 ISSN 1984-4433

HPLC

Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor Remoção de sulfametoxazol e trimetoprima usando biorreator anaeróbio horizontal de leito fixo

Giovana Silva Martins, Natália da Costa Luchiari, Rafaela Silva Lamarca, Bianca Ferreira da Silva, Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes* Institute of Chemistry, Department of Analytical Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 14800-060, P.O. Box 355, Araraquara, SP, Brazil *pauloclair@iq.unesp.br Recebido: 04/11/2017 Aceito: 19/11/2017

Abstract

Sulfamethoxazole (SMTX) and trimethoprim (TMP) are antibiotics present in wastewater in a concentration range µg L−1 to ng L−1. The stability in aquatic environment characterizes them as potential risk to the environment which explains the interest of monitoring environmental matrices. The development of simple analytical method to monitor antibiotics in wastewater is essential to evaluate new treatment technologies. The aim of this paper is to evaluate the removal efficiency of sulfamethoxazol and trimethoprim using a horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor (HAIB). A liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/ MS) method was developed using column-switching online solid-phase extraction as sample preparation procedure to monitor influent and effluent samples. LC-MS /MS were performed in positive mode (ESI +) and selected-reaction monitoring mode (SRM). The total analysis time was 13 minutes integrating the sample preparation and chromatographic run. Injection volume of 100 μL was sufficient to sample extraction. This method presented precision, linearity, quantification and detection limit for simultaneous detection of very low concentrations (ng L-1) from HAIB bioreactor influent and effluent. The precision intra-days showed values lower than 5%, linearity (75-500 ng L-1) and quantification limit (LOQ) of 75 ng L-1 for both antibiotics to the influent and effluent samples from the bioreactor.

Keywords: Horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor (HAIB), Liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS), sulfamethoxazol, trimethoprim.

Resumo

Sulfametoxazol (SMTX) e a trimetoprima (TMP) são antibióticos utilizados na terapêutica humana e, atualmente, na veterinária. Esses fármacos estão presentes em matrizes ambientais, como o esgoto doméstico e águas residuárias de suinocultura em níveis de concentração de µg L−1 a ng L−1. A ocorrência desses fármacos no ambiente aquático está relacionada com sua larga utilização bem como estabilidade em meio aquoso. O monitoramento desses fármacos em matrizes ambientais é fundamental para verificar a eficiência dos tratamentos aplicados em águas residuárias, além de avaliar novas tecnologias de tratamento. O desenvolvimento de métodos analíticos que permitam análises rápidas, confiáveis e sensíveis é fundamental para estudar

Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

253

Gomes P. C. F. L.

Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor

novas tecnologias de tratamento. A cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) é uma das técnicas de escolha. Dessa maneira, o objetivo desse estudo é avaliar a remoção de SMTX e TMP usando um biorreator anaeróbio horizontal de leito fixo (HAIB). Esse biorreator foi operado com tempo de detenção hidráulica (HRT) de 12h, tendo como substrato esgoto lab-made isento de SMTX e TMP. Foram monitorados parâmetros operacionais do biorreator como vazão, pH e alcalinidade. Além disso, um método de extração em fase sólida online (SPE) usando column-switching foi acoplado ao LC-MS/MS para determinar SMTX e TMP em níveis de ng L-1 A análise teve seu tempo total de 13 minutos integrando preparo de amostra e separação cromatográfica. As análises por LC-MS/MS foram realizadas no modo positivo (ESI+) e modo SRM (selected-reaction monitoring) permitindo determinar os parâmetros de precisão intra-dia com valores inferiores a 5%, linearidade (75-500 ng L-1) e limite de quantificação (LOQ) de 75 ng L-1 para ambos os antibióticos no afluente e no efluente do biorreator.

Palavras-chave: Bioreator anaeróbio horizontal de leito fixo, Chromatografia Líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS), sulfametaxazol, trimetoprima.

1. Introduction The occurrence of antibiotics in environmental matrices is a result of their intense use in human and veterinary medicine, whether to prevent, cure or treat diseases (1). The antibiotic main function is to inhibit the growth of microorganisms such as fungi and bacteria (2). Carvalho & Santos (2016), emphasize antibiotics importance in the common treatments of human medicine, such as in orthopedic surgeries, chemotherapy for cancer, besides the use in transplanted patients (3).

In recent years, there has been growing concern about the potential risks of antibiotics might be bringing to the aquatic environment. The occurrence of drugs, mainly antibiotics, in the environment comes from the contamination from sewage containing animal and human excreta and the disposal of expired or unused drugs in hospitals, pharmacies directly in the sewage (4).

As sewage treatment plants are not designed for removal of these compounds and this scenario comes worse about 82% of municipalities in Brazil dispose of sewage directly into rivers (5). Thus, due to the incomplete antibiotics removal in wastewater, these emerging micropollutants could be determinant to multiresistant bacteria dissemination (6,7). The concern increases since rivers receive wastewater containing pharmaceuticals compounds and their metabolites. Most of the rivers 254

are used to domestic usage and agriculture. Over the years, there has been an increase in the antimicrobial consumption, a fact that may also be associated with indiscriminate antibiotics use by a large part of the population, leading to a true global pandemic, causing the so-called superbugs. This fact presents, as main characteristics, many microbial disease do not respond to treatments with broad-spectrum antibiotics (3).

Among several antibiotics groups currently available for human or animal consumption, sulfonamides are a prominent group due its widely used to treat various infections and because its high stability in the aquatic environment (8). Sulfonamides are mainly used in veterinary medicine for the treatment of infections such as bronchitis. The combined administration of the sulfamethoxazole (SMTX) with trimethoprim (TMP) increases the treatment efficiency, inhibiting folic acid synthesis, essential for the growth of bacteria (9). Besides pharmaceutical compounds are present in wastewater at concentration level of µg L−1 to ng L−1, there is a possibility of causing bacteria selection even at these low levels of concentration (10). Both SMTX and TMP (Figure 1) are persistent to treatment used in wastewater treatment plants, thus they are classified as high risk for the environment. These compounds are polar, water soluble and chemically stable, which contributes to their mobility in environmental matrices (11). Several researchers found SMTX and TMP in Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264

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Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor

Figure 1. Trimethoprim and sulfamethoxazole chemical structures.

a range of 100-800 ng L-1 in influents and effluents of wastewater treatment plant (12-14). Thus, it is important to develop analytical methods that allow a rapid, reliable and sensitive analysis to monitor these compounds in wastewater. Moreover, analytical methods are essential to evaluate new treatment technologies applied to remove these compounds. In order to determine emerging contaminants such as SMTX and TMP, liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/ MS) is technique of choice. Sample preparation is important step to LC-MS/MS to minimize matrix effect and to quantify sample at low concentration levels such as ng L-1.

Anaerobic bioreactors are an effective alternative for wastewater treatment, since it is a cheap technology, offer operational simplicity with high removal efficiency of organic matter. Moreover, anaerobic digestion generates biogas such methane and hydrogen which could be used as an energy source. Anaerobic bioreactors present different configurations such as a horizontal fixed-bed anaerobic bioreactor (HAIB). This bioreactor was successfully applied to remove formaldehyde, benzene, toluene, and xylenes, pentachlorophenol and ciprofloxacin (15-18). Based on these facts, this study aims to evaluate SMTX and TMP removal efficiency present in lab-made sewage samples using horizontalflow anaerobic immobilized bioreactor (HAIB). SMTX

and TMP were spiked in the lab-made sewage at ng L-1 concentration level. LC-MS/MS method was applied using column-switching solid-phase extraction online as sample preparation technique (19).

2. Experimental

2.1 Materials and reagents

High-purity water was obtained from a MilliQPlus (Billerica, MA, USA) purification system.

Analytical standards of SMTX and TMP were supplied

by Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) as well isotopic labeled compounds used as internal standard (IS) 13 C-SMTX and TMP-D9. All drug standards used were high purity grade (> 98%). HPLC-grade acetonitrile (ACN) and formic acid were purchased from J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Antibiotics stock solutions containing 500 mg L-1 were prepared dissolving each of the analytes in ACN and formic acid to improve dissolution.

2.2 LC-MS/MS analysis (QTRAP) LC analyses were carried out by an Agilent 1200 HPLC series system constituted of LC quaternary pump; autosampler ALS 1200. Autosampler with injection volume capacity from 0.1 to 100 ΟL volume and column oven was maintained at 20°C. The column switching

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Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor

Table 1. MS/MS parameters for the target analytes by SRM and positive ionization mode.

Compound

Q1 (m/z)

Q3 (m/z)

DP (volts)

CE (volts)

EP (volts)

CEP (volts)

C - SMTX*

260

162

46

17

4.0

14

13

C - SMTX

260

98

46

35

4.0

14

13

C - SMTX

260

114

46

29

4.0

14

TMP*

291

123

56

31

8.5

16

TMP

291

230

56

23

8.5

16

TMP

291

261

56

23

8.5

16

SMTX*

254

156

36

19

7.5

12

SMTX

254

92.0

36

35

7.5

12

SMTX

254

108

36

31

7.5

12

TMP-D9

300

123

61

35

10

14

TMP-D9

300

243

61

23

10

14

TMP-D9

300

264

61

23

10

14

13

* SRM used for quantification.

and SPE online system required an additional LC pump, model ProStar 210 solvent delivery module from Varian, for sample loading. The chromatographic separation was performed on a reversed-phase HPLC column C18 Agilent (50 mm x 2.1 mm x 5.0 μm). The mobile phase consisted by 0.1% formic acid in ACN (B) and water with 0.1% formic acid(A). The gradient program is reported by: 5% of mobile phase B used during 3.10 minutes, at 3.50 min changed to 65 % (B) until 9.00 min. From 10.00 to 13.00 minutes (B) reached 95%, and finally it returned to the initial condition of 5% (B) from 13.10 to 18.00 minutes. The flow rate was 600 μL min1 and the injection volume was of 100 μL. The hybrid mass spectrometer system Quadrupole Linear Ion Trap (3200 QTRAP, AB SCIEX) analyzer was coupled to a LC system. It is equipped with a turbo spray ion source (ESI) and controlled by Analyst software (1.5.2). The source conditions were as follows: curtain gas of 20 V, ion source gas at 50 psi, nitrogen collision gas (CAD) medium, source temperature (TEM) of 650 °C, ions 256

spray voltage of 5500 V. The QTRAP was performed in positive ionization mode (ESI+) and the analytes were detected using selected reaction monitoring (SRM) using a dwell time of 75 ms for each SRM transition.

Three different SRM transitions were monitored for each analyte. The MS/MS system conditions: declustering potential (DP), collision energy (CE), collision cell entrance potential (CEP), and collision cell exit potential (CXP) were optimized through direct infusion of standard sample of each compound at concentration ranging from 10 to 50 µg L−1. CXP was set at 4.0 V to all compounds. Three SRM transitions were monitored for all analytes (two transitions for confirmation and one for quantification). The more intense transition was used for quantification.

2.3 Column-switching System The presents study made use of columnswitching solid-phase extraction online-coupled to a liquid chromatography/ tandem mass spectrometry Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264

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(SPE-LC-MS/MS) method for sulfonamides detected in lab-made sample, influent and anaerobic bioreactor effluent. The samples were submitted for pH adjustment through formic acid and filtration process using cellulose acetate 0.22 µm filter before injection LC system.

Foreflush and backflush modes were compared based on the theoretical plates and asymmetry shape peaks.

Backflush mode showed narrower and defined peaks for analytes elution through SPE online and was adopted for this reason. The sample was introduced in SPE column (Oasis HLB, cartridge column 20 mm x 2.1 mm x 25.0 μm) from pump A using an aqueous mobile phase while the analytical column was conditioned by ACN mobile phase from pump B. The valve switched after 3.00 minutes to position B and the analytes eluted from the SPE column to the analytical column and the MS/MS detector on opposite direction of sample loading.

2.4 Validation Study The LC-MS/MS method was validated as a quantitative confirmatory method according to national and international requirements for (20-22). The analytes were identified by monitoring retention times and ion intensities of each SRM transition. The quantitative parameters evaluated in the validation procedure were: linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ) and precision.

The linearity was evaluated by linear regression analysis of the lab-made calibration curves and also for anaerobic bioreactor effluent. A maximum injection volume of 100 μL was introduced in the system to obtain minor LOQ as possible correlated to variations coefficient less than 20 %. The precision intra-day was determined for all the range concentrations. Method linearity was evaluated by analysis of variance (ANOVA). The linear regression analysis was performed by weighted calibration curve: 1/x, 1/x2, 1/x0.5 and 1/y2.

2.5 Standard solutions The dilute solutions (intermediate solutions) of each standard analyte were obtained from a stock

Table 2. Lab-made wastewater composition.

Component

Concentration (mg L-1)

Cellulose

47.0

Sucrose

98.0

Starch

149

Beef extract

262

Sodium bicarbonate

370

NaCl

250

MgCl2

4.50

CaCl2

7.00

LAS (tensoactive)

1.00

Soybean oil

79.0

solution in a range of 1000 to 1 μg L-1 prepared in water taking into account of the content 0.1% formic acid.

These intermediate solutions were diluted to prepare working standard mixed solutions for a lab-made sample fortification at 10 different concentrations (75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ng L-1). The calibrations were done in lab-made samples and HAIB effluent absent of SMTX and TMP. Table 1 presents labmade sewage composition.

Calibration curve for lab-made sample and effluent bioreactor were obtained by on the peak area ratio of analyte compared to corresponding internal standard. Also, calibration curve were evaluated by external standards for both analytes.

2.6 Anaerobic bioreactor One acrylic bench-scale HAIB bioreactor was used to evaluate SMTX and TMP removal. The bioreactor has a total volume of 2.5 L, length of 100 cm, internal diameter of 5 cm and four equally spaced sampling ports along its length. Cubic polyurethane foam (0.5 cm cubes, 23 kg m-3 apparent density and 95% porosity) was used to fill the bioreactor for biofilm adhesion, resulting in a working volume of 1 L. The inoculum immobilized

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in the polyurethane foam was collected from a poultry slaughterhouse wastewater. The inoculation procedure was made keeping in contact the polyurethane foam with the inoculum for 2 hours before being allocated into the bioreactor.

2.7 Bioreactor Operation After immobilization, the bioreactor was fed with lab-made sewage as substrate with COD of 550 mg O2 L-1 to promote biomass development and adhesion of micro-organisms in the packed bed. The composition of the lab-made sewage is shown in Table 1. The bioreactor was operated at 28 ºC and hydraulic retention time (HRT) of 12 h during 37 weeks. Antibiotics were added to the lab-made sewage after the bioreactor reached the steady-state regimen. Both antibiotics SMTX and TMP were studied at the concentration of 200 ng L-1.

2.8 Analytical Methods The chemical oxygen demand (COD), pH and alkalinity were determined according to the Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (23). These analyses were performed weekly to ensure the steady-state of the anaerobic bioreactor. Analyses of influent and bioreactor effluent were performed using SPE-online coupled to LC-MS/MS method.

3. Results and discussion 3.1 Optimization of MS/MS parameters Positive ionization mode (ESI+) was used for antibiotics analysis with formic acid as mobile phase additive. SRM mode was used for ion acquisition.

Products ions of m/z 230, 261 and 123 were selected for SMTX. For TMP, the m/z of products ions selected were 156, 92.0 e 108.

3.2 LC-MS/MS analysis 258

Sample preparation was made by online SPE and column switching, optimized by Gomes et al (2015) (19). The sorbent used on SPE has both hydrophobic and hydrophilic characteristics, allowing to analytes preconcentration and also to eliminate interferents from the matrix. LC pump used 100 % aqueous mobile phase to sample loading, 3.00 minutes were enough to complete interferents discard. Thereafter, the column-switching valve position was changed and analytes were eluted from the SPE column to the analytical column. The elution was conducted on backflush mode.

The separation was tested using gradiente with formic acid 0.1 % in the aqueous and organic phases.

Analytes separation reached 99.3 % with resolution of 1.5. This result is satisfactory since the antibiotics are structurally similar. Cross talking phenomena was not observed using SRM in the sample analysis although it has been noted a minimal co-elution.

Injection volume was 100 μL corresponding to the maximum capacity of autosampler. This volume provide the lowest LOQ (75 ng L-1) without peak distortion. The memory effect was assessed to avoid compromising method precision. A minimal of 0.5 % was observed in samples at higher than 500 ng L-1. The autosampler was programmed to clean the internal and external parts of the needle with a mixture of acetonitrile, isopropyl, methanol and water containing 0.1 % of formic acid (25 % V/V each solvent) using an auxiliary pump.

Furthermore, the valve the position changed several times to remove any possible compounds that could be remained in the system.

3.3 Method validation and linearity Before injection LC system the samples were submitted for pH adjustment through formic acid (pH of 3.0) and filtration process using cellulose acetate 0.22 µm filter. At pH of 3.0, SMTX is in neutral form and TMP are in ionized form. HLB phase of SPE showed adequate selectivity to pre-concentrate and extract the Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264

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Figure 2. Extracted ion chromatogram (XIC) influent bioreactor spiked with 100 ng L-1 of TMP (RT = 4.77 min) and SMTX (RT = 4.93 min). SMTX 254 > 156; TMP 291 > 123; SMTX-13C 260 > 162 e TMP-D9 300 > 123.

analytes presents in lab-made sewage, as shown in Figure 2.

Linearity was assessed by analytes fortification in 10 concentration levels (75 a 500 ng L-1) and evaluated by least-squares method. Internal standards isotopically labelled were used to minimize matrix effect. Calibration curves were assessed by internal and external calibration method; both showed linearity and no lack of adjustment.

For TMP presents in HAIB influent weighted calibration of 1/y was used and for SMTX no weighted calibration was used. In HAIB effluent, weighted calibration of 1/x and 1/x2 were used for TMP and SMTX, respectively. The chosen of the weighting factors it was

based on both lowest relative error and sum of statistical error, for these parameters should be lower than 15 % on LOQ level. The most analytes showed R2 regression over 0.99 and no lack of adjustment.

3.4 Figures of merit Table 2 shows in details parameters such as linearity, LOQ, precision intra-day for influent and effluent of HAIB bioreactor. The precision intra-days is adequate according international and national standards (20-22), with values lower than 5%, acceptable for complex samples analysis.

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Table 3. Validation parameters used in influent and effluent samples of HAIB bioreactor.

Antibiotics

Linear range (ng L-1)

LOQ

Precision intra-day (%)

Weighting

(slope/interception)

SMTX - influent

75-500

75

0.040 - 4.8

NA*

1.97 x 101/ 2.34 x 102

TMP - influent

75-500

75

0.51 – 4.3

1/y

1.07 x 101/ 2.62 x 102

SMTX - effluent

75-500

75

0.59 – 4.6

1/x2

4.07 x 101/ 5.41 x 102

TMP - effluent

75-500

75

1.1 – 5.0

1/x

1.35 x 101/ 2.18 x 102

*NA – not applied

3.5 Bioreactor performance The bioreactor operated during 37 weeks with a HRT of 12 hours. A lab-made sewage was used as substrate over the period. The operation on the correct HRT was ensure by measuring the flow rate. The mean value of the flow was 1.35 ± 0.33 mL min-1 and below ideal value (1.39 mL min-1) due to the formation of biofilm in the pumping system, providing flow resistance. Flow and HRT values over the operation weeks are presented in Figure 3.

Figure 3. Flow rate and HRT during HAIB operation.

Parameters such as pH and alkalinity were often monitored to ensure that the medium is suitable for bacterial growth and do not prejudice the COD and antibiotics removal. The data are summarized in the Table 3. The mean values of pH remained between 8.25

Table 4. Mean values of operating variables during the bioreactor operation.

Average values (± standard deviation)

Parameters

effluent

452 ± 103

67.3 ± 37.1

84.6 ± 8.30

Alkalinity (mg CaCO3 L )

-

189 ± 31.5

-

pH

8.07 ± 0.08

7.38 ± 0.180

-

SMTX (ng L-1)

212 ± 5.68

<LOQ

96.6 ± 1.66

TMP (ng L-1)

195 ± 10.9

<LOQ

100 ± 0.00

Total COD (mg L-1) -1

260

Removal efficiency %

influent

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concentration was very low (200 ng L-1) to cause any inhibition on the microorganism metabolism. Aydin et al. (2015) observed significant inhibitory effects on methanogenesis of a bacterial community after exposure to SMTX in concentration above 1 mg L-1 (26).

Figure 4. COD removal by HAIB bioreactor over the weeks of operation. Filled square influent stream, white triangle effluent stream, asterisk removal efficiency.

and 7.00 in the acceptable range to avoided anaerobic metabolism inhibition (24,25).

The mean COD removal efficiency was 84.6 ± 8.30 % (Figure 4). Both SMTX and TMP were added in lab-made sewage in 29 weeks of operation, when HAIB bioreactor has already reached the steady-state regimen.

Over this period was not observed changes in the COD removal. This was expected since the antibiotics

The SMTX and TMP removal were assessed

by SPE-online-LC-MS/MS analysis in HAIB effluent samples. In some analysis, analytical signal of SMTX and TMP was not observed as shown by the chromatogram of Figure 5. SMTX and TMP removal were 96.60 ± 1.66% and 100 ± 0.00%, respectively (Figure 6). In several analyses, TMP concentration was lower than the LOD, therefore it was considered a removal efficiency of 100%. For SMTX, in some samples it was possible to obtain signal above LOQ which explain a sligh lower removal efficiency. The removal rates obtained found in our study are similar to those found by Feng et al.(2017) which applied anaerobic batch reactors to treat antibiotics present in pig manure. These authors reached removal efficiency higher than 98% for both SMTX and TMP. However, concentration level were higher (μg L-1) and the manure digestion spent 40 days while the HAIB bioreactor obtained the same efficiency in only 12 hours.

Figure 5. Extracted ion chromatogram (XIC) of SMTX (a) and TMP (b) present treated effluent by HAIB bioreactor.

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Figure 6. SMTX (a) and TMP (b) removal by HAIB bioreactor over 4 weeks of operation. Filled square influent stream, white triangle effluent stream, asterisk removal efficiency.

Figure 5 is a represents results obtained during 4 weeks of operation.

Conclusion The method SPE online-LC-MS/MS was essential to monitor SMTX and TMP present in influent and effluent samples. Moreover, this method was fundamental to evaluate removal efficiency of SMTX and TMP in HAIB bioreactor present in concentration level ng L-1. The bioreactor was successful for removal of organic matter and also for antibiotics at 200 ng L-1 in a TDH of 12 hours. Rates above 90% for antibiotic

262

removal and above 81% for organic matter degradation were obtained. HAIB bioreactor shows as promising technology for antibiotics removal present in sewage which provides basis for new studies pilot-scale anaerobic bioreactors.

Acknowledgements The authors thank CNPq process no 475756/20134 and Unesp Prope process no 568.

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Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264 263

Gomes P. C. F. L.

Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor

[20] BRASIL, Resolução RE n° 27 de 2012. “Dispõe sobre os requisitos mínimos para a validação de métodos bioanalíticos empregados em estudos com fins de registro e pós-registro de medicamentos.”. Órgão emissor: ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

[21] THOMPSON, M.; ELISSON, S. L. R.; WOOD, R. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pureand Applied Chemistry, 2002, 74 (5), 835-85.

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4):253-264

Cursos 2018

IIC Calendário anual de atividades Visite www.iicweb.org

MÊS

DATA

DISCIPLINA

HORAS

Março

14 a 16

Cromatografia Líquida (HPLC ou CLAE)

24

Abril

18 a 20

Cromatografia Líquida Moderna

24

Maio

08 a 10

Cromatografia Gasosa Moderna

24

Junho

03 a 06

Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas

32

Agosto

22 a 24

Cromatografia Líquida Moderna

24

Setembro

19 a 21

Técnicas Modernas para Preparo de Amostras

24

Novembro

27 a 30

Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas

32

Dezembro

05 a 07

Cromatografia Líquida Avançada

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

Scientia Chromatographica 2017; 9(4) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos ­co-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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Scientia Chromatographica 2017; 9(4)

Scientia Chromatographica 2017; 9(4):268-268 269 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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