v11n3

ISSN 1984-4433

2019 | Volume 11 | Número 3

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 periodico@scientiachromatographica.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.11 n.3 (jul./set. 2019). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2019.

Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

PeriĂłdico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

Scientia Chromatographica 2019 | Volume 11 | NĂşmero 3

Distribuidor Autorizado

Incorrect (interference) Quantitation peak

Quantitation peak

Resolution 35 K

Resolution 70 K

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Scientia Chromatographica 2019; 11(3):87 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial..................................................................................................................................................................................................................89 XVII COLACRO Meeting Report....................................................................................................................................................................91

HPLC Clean, Safe And Fast Method By Hplc For Quantification Of Rifaximin-Based Samples......................98 Ana Carolina Kogawa, Leena Peltonen, Hérida Regina Nunes Salgado, Marlus Chorillis

CONTROLE DA QUALIDADE Boas Práticas Para Cromatografia Líquida De Alta Eficiência: Uma Abordagem Para O Controle De Qualidade Farmacêutico............................................................................................................................................108 Rodolpho Guilherme Menezes Gama, Marcelo Henrique da Cunha Chaves

HPLC Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos para análise do dinitrato de isossorbida em comprimidos sublinguais...........................................................................................................126 Valdinea Santos Dias, Amanda dos Santos Teles Cardoso, Aylla Nunes Conceição, Edith Cristina Laignier Cazedey

Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................131 Bookstore............................................................................................................................................................................................................132 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................133

87

Scientia Chromatographica 2019; 11(3)

Scientia Chromatographica 2019; 11(3):89 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Scientia Chromatographica Volume 11, Número 3 de 2019

É com grande satisfação que chegamos ao Número 3 do Volume 11 do periódico Scientia Chromatographica, o qual apresenta trabalhos relacionados ao XVII Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Afins (COLACRO XVII), ocorrido em julho de 2019, em Aracaju, Sergipe.

Desde o COLACRO I, realizado no Rio de Janeiro em 1986, esta foi a primeira vez em que este evento teve lugar no nordeste brasileiro, tendo alcançado grande sucesso, já que reuniu um número expressivo de pesquisadores renomados tanto internacionalmente, como nacionalmente, bem como estudantes e profissionais dos mais diversos campos da Química e de áreas correlatas. Este sucesso se estendeu também à significativa participação de alunos de graduação e pós-graduação, professores, pesquisadores, representando tanto o setor público, como o privado. Cabe destacar também a expressiva contribuição dos participantes nas sessões orais e de pôsteres, assim como a contribuição das empresas de equipamentos da área de Cromatografia e assuntos afins na Feira, as quais participaram através de divulgação de trabalhos científicos e inovações instrumentais. O COLACRO consiste na maior série de eventos internacionais realizada na América Latina que envolve todas as modalidades de Cromatografia e Técnicas Afins, o qual surgiu por iniciativa do Prof. Dr. Fernando Lanças. Dentre os artigos submetidos à avaliação do Scientia Chromatographica, três de caráter bastante pragmático constam desta publicação e estão voltados à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) aplicada à análise de produtos farmacêuticos, como por exemplo, o desenvolvimento de método analítico para determinação do antimicrobiano rifaximina em comprimidos. O segundo artigo trata de uma compilação de respostas a questionamentos relativos ao preparo de soluções e amostras, bem como à manutenção de consumíveis e acessórios de CLAE, no contexto das Boas Práticas de Laboratório (BPL) e o terceiro versa sobre comparação teórica de métodos analíticos compendiais para determinação do vasodilatador dinitrato de isossorbida. Esperamos que estes artigos sejam de utilidade para o trabalho dos nossos leitores, que enriqueçam seus conhecimentos e que tragam inspiração para novas idéias de pesquisa e/ou de inovação nos procedimentos laboratoriais do dia a dia.

Agradecemos especialmente aos Editores Associados, aos revisores dos artigos, aos autores e principalmente aos leitores, os quais continuam a nos enviar sugestões, comentários e outras informações relevantes para a melhora do periódico.

Cláudia Zini Guest Editor

Scientia Chromatographica 2019; 11(3) 89

Scientia Chromatographica 2019; 11(3):91-97 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

MEETING REPORT

XVII Congresso Latino-Americano de Cromatografia (COLACRO) 2019 De 14 a 19 de julho de 2019 foi realizado, na cidade de Aracajú – capital do estado de Sergipe – o 17o Congresso Latino-Americano de Cromatografia – COLACRO 2019. O evento foi realizado pela primeira vez no nordeste brasileiro, na Universidade Tiradentes, podendo contar com as maravilhas da cidade de Aracajú.

Como atividade pré-congresso foram programados para o dia 14 de julho, domingo, o oferecimento de cinco cursos de curta duração, ministrados por especialistas brasileiros e do exterior. Os cursos contaram com grande participação de publico, especialmente de alunos pós graduação.

A abertura oficial do evento ocorreu no dia 15 de manhã, cuja cerimônia foi seguida da entrega da prestigiosa Medalha COLACRO para o Dr. Philip Marriott, o qual proferiu a palestra “Is portable GC-MS a suitable technology for bio-prospecting in a natural-product-rich emerging economy?”. A seguir, foram apresentadas duas palestras plenárias em paralelo: o Prof. Milton Lee da Universidade de Utah,USA, falou sobre “Portable GC and LC”, enquanto que o Prof.

Fernando Lanças, do IQSC-USP, apresentou a conferência “Recent Advances in Miniaturized on-line Sample PreparationScientia Chromatographica 2019; 11(3)

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Meeting Report COLACRO 2019

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry”. A seguir houve um intervalo (coffee break), o qual foi seguido por várias atividades em paralelo, incluindo uma sessão de Posters, exposição de equipamentos, seminários técnicos, apresentações orais, e outras. Na noite do mesmo dia foi oferecido um coquetel a todos os participantes, no qual foram apresentadas danças folclóricas típicas da região. Isto possibilitou a continuidade das discussões científicas, agora em um clima mais descontraido.

Nos dias seguintes, a estrutura do programa do evento foi similar, contando com um variado leque de assuntos e apresentadores.

Um número expressivo de pesquisadores brasileiros e estrangeiros estiveram presentes, trazendo ao evento um brilhantismo ímpar. O programa completo do evento pode ser visto no website https://www.colacro2019.com/copia-program-1 .

Dois outros eventos ocorreram em paralelo ao COLACRO 2019: O SIMCRO (Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afins) 2019, e o WARPA (Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras). Como parte das atividades desses eventos, o Prof. Fábio Augusto, da UNICAMP recebeu a medalha Ciola, do SiMCRO, enquanto que o Prof. Renato Zanella, da Universidade Federal de Santa Maria recebeu a Medalha Janusz Pawliszyn, do WARPA. Durante a sessão de encerramento do evento, ocorrida no último dia, o Comitê Científico Permanente do COLACRO anunciou que a próxima versão será realizada na cidade de Cartagena de Indias, no Caribe Colombiano, em 2020. Fiquem atentos pois, em breve, surgirão informações a respeito.

Afim de relembrar os que estiveram presente ao COLACRO 2019, e dar uma idéia – ainda que limitada – do que foi o evento, anexamos uma seleção para compor a Galeria de Fotos do evento. Mais fotos podem ser vistas no website do COLACRO 2019.

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Patrocinadores/Suporte/Entidades Colaboradoras:

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Meeting Report COLACRO 2019

Galeria de fotos do COLACRO 2019

Secretaria, área de inscrição e retirada de material

Prof. Carlo Bicchi, da Universidade de Turim (Itália) ministrando um curso pré congresso.

Scientia Chromatographica 2019; 11(3):91-97 93

Meeting Report COLACRO 2019

Sessão de abertura do evento. Da esquerda para a direita: Prof. Elina Caramão, da UNIT, Profa. Elena Stashenko (Colombia), Prof. Fernando Lanças (USP-IQSC), Reitor da UNIT, Pró-Reitor da UNIT, Prof. Luigi Mondello (Itália) e Prof. Alejandro Cifuentes (Espanha).

Prof. Fábio Augusto (UNICAMP) recebendo a Medalha Ciola do Sr. Luis Bravo (Nova Analítica, patrocinadora da premiação).

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Meeting Report COLACRO 2019

Entrega da Medalha COLACRO ao Prof. Philip Marriott (Austrรกlia).

Prof. Renato Zanella recebendo a Medalha WARPA. Scientia Chromatographica 2019; 11(3):91-97 95

Meeting Report COLACRO 2019

Vista da montagem da Exposição de equipamentos e acessórios.

A concorrida Sessão de Posters.

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Meeting Report COLACRO 2019

Prof. Luigi Mondello (Messina, Itália) durante apresentação da palestra.

Profa. Elena Stashenko, membro do Comitê Científico International, anuncia o local do próximo COLACRO: 2020, Cartagena de Indias, Caribe.

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Scientia Chromatographica 2019; 11(3):98-107 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2019.009 ISSN 1984-4433

HPLC

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples Ana Carolina Kogawa1,2*, Leena Peltonen3, Hérida Regina Nunes Salgado1, Marlus Chorilli1 São Paulo State University (UNESP), School of Pharmaceutical Sciences, Campus Araraquara, São Paulo, Brazil 1

Universidade Federal de Goiás (UFG), Faculdade de Farmácia, Goiânia, Goiás, Brazil 2

Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Drug Research Program, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, Finland 3

*ac_kogawa@yahoo.com.br Laboratório de Controle de Qualidade, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Goiás, Rua 240, s/n, Setor Leste Universitário, CEP 74605-170, Goiânia - GO, Brasil. +55 62 3209-6470.

Resumo

Rifaximina, é um medicamento antimicrobiano oral, pertence à Classe IV, de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica e apresenta baixa solubilidade e permeabilidade. Assim, três amostras baseadas em rifaximina foram desenvolvidas por complexação à β-ciclodextrina, usando diagrama de solubilidade de fase, malaxagem e diminuição do tamanho de partícula usando moagem úmida. A efetividade do preparo de novas amostras à base de rifaximina foi previamente confirmada por técnicas de análise térmica e espectroscópicas, mas a quantificação de rifaximina ainda não foi realizada por não haver método disponível para este fim. Um método ecologicamente correto por CLAE foi desenvolvido e validado para avaliar o conteúdo de rifaximina nestas amostras. A análise foi realizada usando-se uma coluna C18, água purificada com ácido acético a 0,1% e etanol (52:48, v/v) como fase móvel, 0,9 mL min-1, 290 nm e 25°C. O método foi linear na faixa de 5 a 50 μg mL-1 e preciso, com desvios padrão relativos de 1,15% para o nível intra-dia e 0,47% para o nível inter-dia. A exatidão foi confirmada pela recuperação de padrão com resultados entre 100,99 e 101,32%. O método foi robusto a pequenas alterações no comprimento de onda e temperatura utilizadas, fonte de água purificada, proporção de etanol e ácido acético na fase móvel e vazão. A seletividade foi confirmada pela avaliação de possíveis interferências e pelos testes de degradação forçada em meios ácido, básico, oxidativo, neutro e fotolítico e mostrou-se indicativo de estabilidade.

O método também envolve características da Química Analítica verde em análise farmacêutica: não utiliza solventes orgânicos tóxicos, é rápido, com tempo de aproximadamente 5 minutos, e geração de baixo volume de resíduos.

Palavras chaves: amostras baseadas em rifaximina, CLAE, validação de método analítico, controle de qualidade, análise farmacêutica.

Abstract Rifaximin, is an oral antimicrobial drug, belongs to Class IV, according to the Biopharmaceutic Classification System, and has low solubility and permeability. Three rifaximin-based samples were developed by complexation to β-cyclodextrin using phase solubility diagram and malaxation, and decreasing particle size using wet milling. The effectiveness of preparation of new rifaximin-based samples has been previously confirmed and characterized by thermal and spectroscopic techniques, but the quantification of rifaximin has not yet been performed because there is no method available. So an ecologically correct method by HPLC was developed and validated to evaluate the rifaximin content in them. The analysis was performed using a C18 column, water with 0.1% glacial acetic acid and ethanol (52:48, v/v) as mobile phase, 0.9 mL min-1, 290 nm, and 25°C. The method proved to be linear in the range of 5-50 μg mL-1 and precise with relative standard deviations of 1.15% for intra-day and 0.47% for inter-day precision. Accuracy was confirmed by standard recovery with mean recoveries between 100.99 and 101.32%. The method was robust to small changes in wavelength and temperature used, purified water source, the proportion of ethanol and acetic acid in the mobile phase and flow. Selectivity was confirmed by the evaluation of possible

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Kogawa A. C., Peltonen L., Salgado H. R. N., Chorilli M.

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

interferences and forced degradation tests in acidic, basic, oxidative, neutral, and photolytic media and it proved to be indicative of stability. The method also involves characteristics of green Analytical Chemistry for a pharmaceutical analysis: it does not use toxic organic solvents, it is fast (approximately 5 minutes), and waste generation is low.

Keywords: rifaximin-based samples, HPLC, analytical method validation, quality control, pharmaceutical analysis.

1. Introduction Rifaximin is an antimicrobial, marketed as tablets, used for the treatment of hepatic encephalopathy, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, Clostridium difficile, travelers’ diarrhea, and acute diarrhea (1-10).

Administration of high doses, 600 to 800 mg per day, is required for successful therapeutic effect. Rifaximin belongs to class IV according to the Biopharmaceutic Classification System (BCS). It presents low solubility in water and low permeability (11).

Whitin this context, people who have trouble swallowing, such as children and the elderly, may have to do that two to three times per day. In order to facilitate the pharmacotherapy, three rifaximin-based samples were developed by complexation to β-cyclodextrin using phase solubility diagram, malaxation, and decreasing particle size using poloxamer and wet milling. The identity of rifaximin in these new samples is usually confirmed by spectrophotometry in the infrared region, differential scanning calorimetry and X-ray diffraction (XRD), since their characteristics were different from the ones of pure drug and also from physical mixtures between drug and adjuvants. However the content of rifaximin has not yet been investigated (11).

Different research groups have already reported methods for quantitative evaluation of rifaximin in tablets, such as spectrophotometry in the ultraviolet (1213), visible (14) and infrared regions (15), capillary electrophoresis (16), thin layer chromatography (17),

high performance thin layer chromatographic (18) and high performance liquid chromatography (HPLC), but not for the developed rifaximin-based samples (19-21).

HPLC is the most commonly used method for the analysis of rifaximin in tablets, so it was chosen to evaluate rifaximin-based samples. Therefore, an HPLC method, covering the principles of green Analytical Chemistry, was developed specifically for these rifaximin-based samples, counting on the possible impacts of β-cyclodextrin and poloxamer in the quantification of the antimicrobial agent.

2. EXPERIMENTAL 2.1. Equipment HPLC system (Waters, Santa Clara CA, USA) equipped with binary gradient chromatography pump (Model 1525), manual injector (Model Breeze 7725i Rheodyne Bensheim, Germany) and UV-Vis detector (Model 2487), Eclipse Plus C18 column (Agilent, Santa Clara CA, USA), 5.0 μm particle size, 150 mm x 4.6 mm, analytical balance (Model 410, Kern, Germany), ultrasonic bath (Ultrasonic Cleaner Unique, Indaiatuba, Brazil) and water purification system (Millipore, Darmstadt, Germany).

2.2. Material and reagents Rifaximin standard (4-deoxy-4′-methylpyrido [1′,2′-1,2] imidazo [5,4-c] rifamycin, 99.0% purity, CAS No. 80621-81-4, NutraTech Development Limited, China), rifaximin-based samples in powder form named X, Y, and Z, β-cyclodextrin (Roquette, Lestrem, France) and poloxamer 188 (O-Basf, Helsinki, Finland) were used.

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Kogawa A. C., Peltonen L., Salgado H. R. N., Chorilli M.

Rifaximin samples have been obtained according to a former study of this group. Sample X refers to the rifaximin: β-cyclodextrin complex, obtained through a phase solubility diagram, sample Y refers to the rifaximin: β-cyclodextrin complex obtained by malaxation, while sample Z refers to the rifaximin: poloxamer 188 complex obtained by wet milling (11).

Reagents used were ethyl alcohol HPLC grade (J.T.Baker, Aparecida de Goiânia, Brazil), glacial acetic acid HPLC grade (Synth, Diadema, Brazil), ethyl alcohol analytical reagent grade (Synth).

2.3. Chromatographic conditions and pharmaceutical preparations Chromatographic analyses was carried out using a mobile phase consisting of water with 0.1% glacial acetic acid and ethyl alcohol (52:48, v/v), the flow rate at 0.9 mL min-1, injection volume 20 μL, wavelength set at 290 nm and temperature was 25°C. Standard and sample stock solutions equivalent to 100 μg mL-1 of rifaximin were prepared by dissolving an accurately weighed amount of standard drug in mobile phase.

2.4. Methods

2.4.1. Validation Linearity, selectivity, precision, accuracy, robustness, and limit of detection and quantification were the parameters evaluated for validation of the method according to national and international guidelines (22-25).

2.4.2. Linearity Three calibration curves were constructed in three days. The concentrations used ranged from 5 to 50 μg mL-1 (6 points = 5, 10, 20, 30, 40, 50 μg mL-1), and they were analyzed in triplicate. Linearity evaluation was performed by linear 100

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

regression analysis and analysis of variance (ANOVA).

2.4.3. Limit of detection (LOD) and Limit of quantification (LOQ) LOD and LOQ were determined using data from the mean analytical curve obtained in the linearity and the Equations 1 and 2, respectively.

LOD = (3.3 standard deviation of the average intercept)/ slope (1) LOQ = (10 standard deviation of the average intercept)/ slope (2)

2.4.4. Selectivity Selectivity was confirmed by the forced degradation of rifaximin-based samples in a bath at 80°C in addition to acidic (HCl 0.01 M), alkaline (NaOH 0.001 M), oxidative (H2O2 10%), photolytic (UV light) and neutral (H2O) conditions (26). Aliquots were taken and analyzed immediately by the proposed method.

2.4.5. Precision Precision was evaluated by intraday (analysis of 6 solutions on the same day, under the same experimental conditions and by the same analyst) and intermediate (analysis of six solutions on different days, under the same experimental conditions and by two different analysts) levels using the concentration of 30 μg mL-1.

The relative standard deviation (RSD) was calculated.

2.4.6. Accuracy Accuracy was determined through standard recovery tests. Different amounts of rifaximin standard solutions (19, 25 and 31 µg mL-1) were added to a 5 µg mL-1 sample solution to obtain solutions with final concentrations of 24 μg mL-1 (80%), 30 μg mL-1 (100%) and 36 μg mL-1 (120%). Table 1 summarizes the planning of accuracy assays.

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Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

2.4.7. Robustness

modified = 25°C), purified water source (normal = Lab

Parameters such as wavelength (normal = 290 nm and modified = 295 nm), temperature (normal = 20°C and

1 and modified = Lab 2), the proportion of ethanol in the mobile phase (normal = 48% and modified = 46%), the

Table 1. Information about the preparation of sample solutions for the analyses of accuracy

Level (%)

Concentration of standard solutions of rifaximin used to reach final solutions (µg mL-1)

Total solution concentration (standard and sample) (µg mL-1)

80

19

24

100

25

30

120

31

36

proportion of acetic acid in the mobile phase (normal = 0.1% and modified = 0.08%), flow (normal = 0.9 mL min-1 and modified = 0.88 mL min-1), injection volume (normal = 20 µL and modified = 16 µL) were evaluated by Youden Test (27).

2.4.8. Evaluation of rifaximin content in rifaximinbased samples After method validation, standards and samples were prepared at a concentration of 30 μg mL-1 and immediately analyzed under the conditions of the proposed method.

3.2. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) LOD and LOQ were 0.11 μg mL-1 and 0.34 μg mL-1, respectively.

3.3. Selectivity The method can be considered selective, because it was able to detect rifaximin in the presence of adjuvants such as β-cyclodextrin, poloxamer, as well as degradation products formed in the forced degradation tests, which also indicates stability of the process (Figure 1).

3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. Linearity

3.4. Precision

The method can be considered linear. It showed a correlation between rifaximin concentration and peak area in the range of 5 to 50 μg mL-1, with significant regression and no linearity deviation (Table 2).

The method showed proximity among results, with low RSD values for both intraday and intermediate precision (Table 3). Thus, it can be considered precise.

3.5. Accuracy The proximity of the results to the true value and the average recovery showed values within the specification Scientia Chromatographica 2019; 11(3):98-107 101

Kogawa A. C., Peltonen L., Salgado H. R. N., Chorilli M.

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

Table 2. Data related to method linearity

Parameters

Results

Slope

34089

Intercept

16325

Correlation coefficient (r)

0.9999

Among concentrations

428.43* (3.11)

Regression

2141.81* (4.75)

Lack of fit

0.09 (3.26)

Retention time (min)

~ 4.7

Range (µg mL-1)

Linearity

5-50

* significant for p <5%

of 98 to 102% (Table 3) (28-29), proving the accuracy of the method.

3.6. Robustness The method can be considered robust for variations in wavelength (nm), temperature (°C), purified water source, proportion of ethanol in the mobile phase (%), proportion of acetic acid in the mobile phase (%) and flow (mL min-1), according to information given in the section 2.4.7. It was not robust for the change in injection Figure 1. Chromatograms of the degradation of samples X, Y and Z, respectively, under acid, basic, oxidative, neutral conditions and in UV light. Black = zero condition, no degradation. Blue = degraded condition.

102

volume (µL). Therefore, this parameter must be carefully controlled, and the exact 20 µL volume must be used (Table 4).

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Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

Table 3. Results of method precision and accuracy experiments

λ

Precision Peak area

Level

290 nm

RSD (%)

1

2

3

4

5

6

Intraday

989145

1015057

985196

985990

987184

994910

Intermediate

1000339

1004508

1006675

1007168

1009267

1005688

precision

993853

1000037

1007563

998869

1006240

999039

1.15 (n=6) 0.47(n=12)

Accuracy Sample

X

Y

Z

Level (%)

Standard rifaximin added (μg mL-1)

Standard rifaximin recovered (μg mL-1)

Recovery (%)

80 100 120 80 100 120 80 100 120

19 25 31 19 25 31 19 25 31

19.13 25.38 31.35 19.10 25.43 31.52 19.10 25.39 31.27

100.68 101.50 101.12 100.55 101.73 101.69 100.54 101.56 100.87

Average recovery (%) 101.10

101.32

100.99

RSD (%) 1.18 0.05 0.41 0.82 0.28 0.10 1.10 0.29 1.60

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Kogawa A. C., Peltonen L., Salgado H. R. N., Chorilli M.

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

Table 4. Results of method robustness

Condition

Experiments

Effect Limit*

1

2

3

4

5

6

7

8

Wavelength (nm) A: 290; a: 295

A

A

A

A

a

a

a

a

-1.18

Temperature (°C) B: 20; b: 25

B

B

b

b

B

B

b

b

0.74

Purified water source C: lab 1; c:lab 2

C

c

C

c

C

c

C

c

-0.84

Ethanol (%) D: 48; d: 46

D

D

d

d

d

d

D

D

-0.78

Acetic acid (%) E: 0.1; e: 0.08

E

e

E

e

e

E

e

E

0.61

Flow (mL min-1) F: 0.9; f: 0.88

F

f

f

F

F

f

f

F

-3.26

Injection volume (µL) G: 20; g: 16 µL

G

g

g

G

g

G

G

g

6.90

Results (%)

96.95

93.53

93.34

97.21

91.40

103.01

100.04

91.33

5.95

*standard deviation multiplied by the square root of 2. Capital letters (A, B, C, D, E, F, G) = normal conditions. Small letters (a, b, c, d, e, f, g) = modified conditions.

3.7. Evaluation of rifaximin content in rifaximin-based samples The method was able to quantify rifaximin content in the samples and can be applied to evaluate the quality of these new formulations (Table 5). It also has advantages such as the analysis speed (retention time of rifaximin less than 5 minutes), which consequently streamlines analyses and improves work performance. Also, ecological awareness is highlighted due to experimental choices such as solvents (ethanol and acidified water), column (15 cm), 104

low number of steps involved, solvent (mobile phase), temperature (ambient), and flow rate (less than 1 mL min-1 decreases waste generation) (30-33).

4. CONCLUSIONS The analytical method proved to be linear, selective, precise, exact, robust, and able to quantify Scientia Chromatographica 2019; 11(3):98-107

Kogawa A. C., Peltonen L., Salgado H. R. N., Chorilli M.

Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

Table 5. Results of the evaluation of rifaximin content in rifaximin-based samples

Rifaximin content*

Sample

%

Average

RSD (%)

X

83.91

92.61

88.41

88.31

4.93

Y

95.96

94.58

98.74

96.43

2.20

Z

100.92

98.76

99.41

99.69

1.11

* Each value represents the mean of three determinations. X, Y and Z designate the three rifaximin-based samples mentioned in section 2.2.

rifaximin content in the three different types of samples of this pharmaceutical drug. It is reliable, fast, and presents ecologically correct characteristics, as it generates low amounts of waste and do not involve toxic organic solvents.

CONFLICT OF INTEREST The authors have no financial or other potential conflicts of interest.

ACKNOWLEDGMENTS The authors acknowledge CNPq (Brasília, Brazil), FAPESP (São Paulo, Brazil), and CAPES (São Paulo, Brazil).

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Clean, safe and fast method by HPLC for quantification of rifaximin-based samples

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Scientia Chromatographica 2019; 11(3):108-125 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2019.010 ISSN 1984-4433

CONTROLE DA QUALIDADE

Boas práticas para cromatografia líquida de alta eficiência: uma abordagem para o controle de qualidade farmacêutico Good practices for high performance liquid chromatography: an approach to pharmaceutical quality control Rodolpho Guilherme Menezes Gama*, Marcelo Henrique da Cunha Chaves2 Instituto de Tecnologia em Fármacos – Farmanguinhos/FIOCRUZ. Unidade CTM. Laboratório FísicoQuímico/ Controle da Qualidade Prédio 70 Avenida Comandante Guaranys 447, Jacarepaguá, Rio de Janeiro – RJ, 22775-903 Tel. Celular: +55 21 98669-6756 * rodolpho.gama@far.fiocruz.br 2

Tel. Comercial: +55 21 3882-9042

Tel. Celular: +55 21 99875-7888 marcelo.chaves@far.fiocruz.br

Resumo

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) constitui-se como uma das técnicas mais avançadas e utilizadas nos laboratórios de controle de qualidade de indústrias farmacêuticas, devido a sua grande versatilidade. Boas Práticas Cromatográficas (BPC) apresentam lógica semelhante àquela dos protocolos das Boas Práticas de Fabricação e Laboratoriais, oriundas de órgãos reguladores nacionais e internacionais e voltadas para o nicho farmacêutico, de forma a auxiliarem no cumprimento de todas estas normas de qualidade. As BPC estão presentes do início ao fim do desenvolvimento e prática dos processos cromatográficos e são comumente transmitidas, de forma empírica, pelos fabricantes de equipamentos e consumíveis cromatográficos. Procedimentos práticos de CLAE apoiados em conceitos teóricos são abordados, com base em pesquisa bibliográfica em bancos de dados de artigos científicos e também na consulta a documentos dos maiores fabricantes de itens de CLAE. A discussão das BPC para preparação de amostras e soluções utilizadas nos ensaios e na limpeza dos acessórios e consumíveis de CLAE traz a compreensão de que as mesmas são práticas fundamentais para indústria farmacêutica, agregando maior confiabilidade nos seus processos, culminando em possível redução de custos com manutenção e no pleno cumprimento dos requisitos dos órgãos reguladores. É importante, portanto que a abordagem das BPC se torne uma realidade dentro dos laboratórios de controle de qualidade das indústrias farmacêuticas, de forma que as mesmas sigam preceitos harmonizados para todos os analistas e usuários, já que estas ferramentas são indispensáveis para que resultados confiáveis sejam produzidos na rotina de laboratório.

Palavras chaves: Boas Práticas Cromatográficas. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Controle de Qualidade, Indústria Farmacêutica

Abstract High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is one of the most advanced techniques used in quality control laboratories in the pharmaceutical industry, due to its great versatility. Good Chromatographic Practices (GPC) have a logic similar to that of the Good Manufacturing and Laboratory Practices protocols, coming from national and international regulatory bodies and aimed at the pharmaceutical niche, in order to assist in complying with all these quality standards. GCP are present from the beginning to the end of the development and practice of chromatographic processes and are commonly transmitted, empirically, by chromatographic equipment and consumables manufacturers. Practical HPLC procedures based on theoretical concepts are addressed, based on bibliographic research in databases of scientific articles and also in the consultation of documents from the major manufacturers of HPLC items. The discussion of GCP for the preparation of samples and solutions used in the testing and cleaning of HPLC accessories and consumables brings the understanding that they are fundamental practices for the pharmaceutical industry, adding greater reliability to their processes,

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Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

culminating in possible cost reduction with maintenance and in full compliance with the requirements of regulatory bodies. Therefore, it is important that the GCP approach becomes a reality within the quality control laboratories of the pharmaceutical industries, so that they follow harmonized precepts for all analysts and users, since these tools are indispensable for reliable results to be produced in the laboratory routine.

Keywords: Good Chromatographic Practices. High Performance Liquid Chromatography Quality control, Pharmaceutical industry

1. Introdução A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma das técnicas mais utilizadas nos laboratórios de controle de qualidade ao redor do mundo (1). Devido a sua versatilidade, refletida por seus diferentes modos de separação (fase normal, fase reversa, supressão iônica, troca iônica, interação hidrofílica, dentre outros), bem como pela redução dos preços dos sistemas cromatográficos, miniaturização dos equipamentos, avanços tecnológicos, tem-se um ambiente favorável ao desenvolvimento e uso de métodos analíticos baseadas em CLAE na indústria farmacêutica (2).

De acordo com os preceitos de vigilância sanitária, um método de análise que se torna fundamental e crítico nesse tipo de técnica irá necessitar de um maior controle com relação aos seus parâmetros. As boas práticas de fabricação (BPF) na produção de medicamentos se fazem então necessárias para garantir a diminuição de quaisquer riscos inerentes à produção farmacêutica, que podem não ser detectáveis pelos ensaios já realizados nas etapas de controle de qualidade.

Esses riscos são, por exemplo, a ação de contaminação cruzada, contaminação por partículas e troca/mistura de produto, que podem acarretar em sérios danos para a saúde e o bem-estar da sociedade (3).

Dentro da indústria farmacêutica, um dos pilares de sustentação técnica para a certificação e vivência das BPF, é o gerenciamento da garantia e controle de qualidade, que entre outros requisitos, nos traz a vivência das Boas Práticas de Laboratório (BPL),

isto é, um sistema de qualidade que abrange o processo organizacional e as condições nas quais estudos nãoclínicos de saúde e de segurança ao meio ambiente são planejados, desenvolvidos, monitorados, registrados, arquivados e relatados (4). Para o devido cumprimento das BPL, os equipamentos geradores de dados devem possuir procedimentos que garantam seu adequado uso, conforme preconizado pelos fabricantes de equipamentos de CLAE (3). Estes, em caráter sinérgico com seus usuários, também recomendam práticas para serem utilizadas nos seus equipamentos, intitulados como Boas Práticas Cromatográficas (BPC), as quais propiciam que os equipamentos possam atingir o máximo desempenho, gerando resultados que garantam confiabilidade, reprodutibilidade para o atendimento dos requisitos de órgãos regulatórios.

O presente trabalho compila respostas a questionamentos pragmáticos relativos a preparo de soluções e amostras, à utilização e manutenção de consumíveis e acessórios de CLAE, que estão no bojo das BPC, de forma a servir de auxílio para aqueles que enfrentam dificuldades laboratoriais, nesta área.

Traz também um panorama das mesmas, e apresenta as técnicas sugeridas atualmente, relacionando-as ao padrão de qualidade desenvolvido ao longo de décadas na indústria farmacêutica.

2. Boas Práticas Cromatográficas O conceito de Boas Práticas Cromatográficas pode ser definido como um conjunto de orientações

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teóricas e práticas, que visam ao melhor aproveitamento e maximização da eficiência dos equipamentos e acessórios de CLAE, garantindo assim que requisitos regulatórios sejam plenamente atendidos. As BPC dizem respeito a toda e qualquer etapa de uma operação cromatográfica, desde a instalação e qualificação de um equipamento, passando pelo correto preparo e adequação de seus consumíveis, até a geração e rastreabilidade de dados gerados.

2.1. Boas Práticas Cromatográficas nos processos de preparação de amostras e fases móveis/ solventes utilizados na análise.

2.1.1. Reagentes, solventes e fase móvel Maximizando a eficiência do sistema cromatográfico Reagentes ou soluções preparadas que estiverem contaminadas, degradadas, fora da validade, malconservadas ou sem informações relativas ao fabricante, lote de produção, data de validade e grau de pureza não podem ser utilizados para o controle de qualidade de quaisquer medicamentos (3). A utilização de reagentes dentro do prazo de validade e em perfeitas condições de uso é parâmetro mínimo para garantir a confiança nos resultados obtidos através de um cromatógrafo. Um dos pontos de criticidade para a realização de ensaios é a qualidade e pureza dos reagentes consumidos, sendo recomendados para análises cromatográficas reagentes de grau CLAE ou, em sua falta, de grau analítico (5). É considerado reagente grau CLAE os solventes que possuem propriedades químicas e limites de temperatura que são também os aplicados à tal análise; possuam transparência óptica ou baixo índice de absorção no UV, especialmente para análises que requerem alta sensibilidade espectrofotométrica; sejam livres de partículas na faixa de exclusão em torno de 0,2 a 0,45 µm; e que apresentem baixos níveis de corrosão em aço inox SS316; além de serem livres de íons halogêneos tais como HCl, KCl, NaCl e NH4Cl, livres de gases 110

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

dissolvidos (possibilidade de formação de bolhas) e por fim, que apresentem baixos índices de viscosidade (6).

A utilização de reagentes grau CLAE traz de início um pouco mais de custos ao processo analítico, já que são reagentes mais caros devido aos inúmeros processos de eliminação de impurezas a que são submetidos. Em alguns casos, a utilização de reagentes que não sejam grau CLAE ocasionam o surgimento de picos de impurezas oriundas do próprio solvente ou ainda oriundos da degradação do analito a ser quantificado, atrapalhando a sua adequada quantificação, seja isto devido à diminuição do sinal resposta do analito, da quantificação inadequada de impurezas como se fossem o analito ou da co-eluição dessas impurezas com os compostos de interesse (7).

A coluna cromatográfica, irá reter qualquer material particulado que esteja contido na fase móvel do sistema de CLAE. Quando o laboratório opta em não usar reagentes de grau CLAE ou reagentes impuros, por questões de corte de custos, por exemplo, acaba invariavelmente tendo problemas analíticos, já que a utilização de solventes de menor pureza no sistema cromatográfico provoca adsorção irreversível de impurezas na entrada e saída da coluna. Estas impurezas podem bloquear sítios de adsorção, mudar a seletividade da coluna e eventualmente levam à distorção dos picos no cromatograma. Na eluição com gradiente, por exemplo, estas impurezas podem produzir picos fantasmas, que são picos que sempre aparecem na mesma posição no cromatograma. Sua origem não é a amostra, mas as impurezas de solventes ou outros aditivos encontrados nos solventes.

Além desses pontos, o reagente a ser utilizado em análise cromatográfica precisa de uma série de cuidados a fim de evitar a presença de bolhas (formadas por gases dissolvidos) ou contaminantes, visando-se também a não formação de fungos ou algas nas soluções tampão. A utilização de frascos limpos evita grande parte das contaminações, porém,sempre se faz necessária a lavagem destes frascos com o solvente que se for utilizar, ainda que o solvente de guarda seja água ultra Scientia Chromatographica 2019; 11(3):108-125

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purificada (8). O próprio armazenamento de soluções constitui-se como uma BPC, já que as mesmas podem sofrer oxidação ou reações fotoquímicas. Recomenda-se a utilização de frascos de vidro borossilicato âmbar, que é inerte à a maioria dos reagentes utilizados nas técnicas de CLAE, a fim de evitar quaisquer reações indesejadas (8).

Os processos de filtração e desgaseificação da fase móvel são descritos como fundamentais em diversos guias de otimização das análises de CLAE. A utilização de sistemas de filtração em 0,45 µm é justificada também no Guia de Resolução de Problemas (do inglês, Troubleshooting Guide) da fabricante Termo Scientific, pois o uso desse tipo de filtro irá reter material particulado que possa vir a bloquear ou mudar a seletividade da coluna, além de permitir um melhor desempenho e maximização da vida útil da bomba, selos e das válvulas de retenção (do inglês, check valves) (7). A escolha da porosidade de 0,45 µm se deve ao fato de que, no geral, os recheios das colunas cromatográficas usadas em laboratórios de controle de qualidade são fabricados com tamanho de partícula de 5 µm, sendo que os interstícios de passagem do leito desse tipo de coluna possui o tamanho de 0,625 µm, isto é 1/8 do diâmetro da fase estacionária, conforme pode ser visto na ilustração da Figura 1. Desse modo as membranas de 0,45 µm permitiriam apenas a passagem de partículas com tamanho inferior a 0,45 µm não havendo o entupimento do leito cromatográfico.

Quando a fase estacionária das colunas cromatográficas contém partículas de diâmetros inferiores a 4 µm, recomenda-se como boa prática cromatográfica a utilização de membranas de filtração com porosidade de 0,22 µm. Em alguns casos, fases móveis que possuem grande quantidade de solução tampão de alta concentração em sua composição, recomenda-se como BPC a sua filtração diária, a fim de evitar precipitação de sais dentro do frasco de armazenamento (9).

O tipo da membrana também influenciará a qualidade da filtração da fase móvel. Membranas de ésteres de celulose são indicadas para filtração de água, solução tampão ou água acidificada. Membranas de nylon

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

permitem a passagem de água e solventes em geral, com exceção de clorofórmio, éteres, diclorometano e ácidos

Figura 1. Ilustração do diâmetro de passagem do leito (0,625 µm) de uma coluna cromatográfica com partículas de diâmetro de 5 µm em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Fonte: Próprio Autor

fortes (9). Dessa forma, convém que o usuário da técnica de CLAE faça uso de tabelas de compatibilidade de solventes versus materiais de fabricação das membranas.

Todos os fabricantes disponibilizam tais catálogos de modo a evitar que o analista utilize um material incompatível com seu método analítico. Ressalta-se que em casos de análises que necessitem de alta sensibilidade, não é recomendada a filtração de acetonitrila ou de soluções que contenham acetonitrila, a fim de evitar vestígios de produtos da reação da acetonitrila com a membrana, em especial o nylon (8).

O processo de desgaseificação das soluções utilizadas nos sistemas cromatográficos permite uma melhor eficiência dos resultados obtidos por CLAE, proporcionando maior estabilidade ao sistema, evitando mudança de tempo de retenção de picos e até o surgimento de picos indesejados, além de evitar desgaste prematuro de peças, acessórios e componentes dos equipamentos.

Essa instabilidade do sistema ocorre pelo fato de que o gás O2 absorve em comprimento de onda abaixo de 215 nm, trazendo instabilidade em métodos de varredura ou que trabalhem nessa faixa de comprimentos de onda (9).

Os gases dissolvidos podem ser retirados pelos processos de sonicação, filtração à vácuo e borbulhamento com gás hélio (7). Na Figura 2 pode ser vista a diminuição da razão sinal/ruído e consequentemente a melhora

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da qualidade da linha de base de um cromatograma resultante de uma fase móvel que sofreu desgaseificação.

Cabe ainda ressaltar que, segundo a fabricante Thermo Scientific, o método mais efetivo para desgaseificação é o borbulhamento de gás hélio, porém devido ao menor custo, recomenda-se a utilização dos dois primeiros processos citados anteriormente na retirada dos gases dissolvidos na fase móvel, gerando uma combinação de

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

filtração com sonicação (por pelo menos 20 minutos) e agitação constante (9).

Os cuidados no preparo e manipulação das fases móveis serão os mesmos para quaisquer reagentes utilizados para CLAE. A mistura dos solventes a serem empregados como fase móvel deve ser feita, levandose em consideração que, em alguns casos, como em

Figura 2. Comparativo do sinal resposta cromatográfico quando da utilização de uma fase móvel que não sofreu desgaseificação e de outra que passou pelo processo de desgaseificação. Fonte: Adaptado de THERMO SCIENTIFIC – Aviso Legal - Vale a pena ressaltar que a propriedade intelectual relacionada ao equipamento é de propriedade exclusiva da Thermo Fisher Scientific, bem como os direitos relacionados à marca e copyright. Todo e qualquer uso dependerá de autorização prévia e por escrito da Thermo Fisher Scientific.”

(2016).

misturas de água com solventes orgânicos (por exemplo, metanol e etanol), ocorre a contração de volume devido a interações moleculares. Em alguns outros procedimentos, recomenda-se inclusive o preparo diário de solução tampão utilizada como fase móvel (9).

Por fim, resumidamente, outras medidas de boas práticas com foco em solventes, seguem as seguintes diretivas: • Caso o solvente esteja em uso pelo equipamento, garantir que não existe entrada 112

de ar entre a tampa e o canal, para que não ocorram reações indesejáveis, além da formação de bolhas. Utilizar filtros de entrada para proteger o sistema cromatográfico de possíveis partículas contaminantes (8).

• Não reciclar solventes que já tenham tido contato com os canais do equipamento para o preparo de amostras, a fim de evitar possíveis contaminações (6).

Scientia Chromatographica 2019; 11(3):108-125

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• Troca diária do frasco que tiver 100% de água ultra purificada, para que não aconteça crescimento microbiano (10).

• Substituição semanal do solvente que for utilizado para limpeza da seringa de injeção e do selo do pistão (11).

2.1.2. Escolhendo o tipo apropriado de água para análises em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A utilização de água em sistemas cromatográficos é de grande importância, seja no preparo de tampão/ fase móvel, ou na limpeza e regeneração de colunas, para sistemas de fase reversa. Os diversos fabricantes de sistemas cromatográficos preconizam a utilização de água ultra purificada, a fim de evitar o surgimento de picos espúrios na linha de base, além da detecção de impurezas indesejáveis no processo analítico (7). A água ultra purificada possui baixa concentração iônica, baixa carga microbiana e baixo nível de Carbono Orgânico Total (COT). Os baixos níveis de COT são importantes para garantir que a água não tenha em sua composição diversos tipos de compostos químicos orgânicos que possam interferir no processo de quantificação e identificação dos analitos. A água ultra purificada pode ser considerada estéril, já que uma de suas membranas de filtragem é de 0,22 µm, havendo também durante a sua produção, o uso de outros componentes de filtração e eliminação de micro-organismos, através de lâmpadas de ultravioleta. Os requisitos mínimos preconizados são: possuir condutividade menor que 0,1 µS cm-1 à 25 ºC, resistividade maior que 18,0 MΩ.cm e 0,05 mg L-1 de Carbono Orgânico Total (12).

2.1.3. Soluções Tampão – Cuidados no preparo

Diversos métodos analíticos de CLAE utilizam soluções tampão no preparo de amostras ou no transporte das mesmas, como fração total ou parcial de uma fase móvel, de modo a contribuir para o processo de separação,

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

identificação e quantificação dos analitos. Uma das propriedades de uma solução tampão é sua efetividade na separação de analitos, proporcionando a estabilidade química necessária ao resistir a variações indesejáveis de pH, que podem ocorrer devido a diluições no preparo ou no processo de separação de componentes das amostras.

O tamponamento das soluções proporciona controle dos mecanismos de reações relacionados à precipitação de sais e formação de cristais, processos indesejáveis na CLAE (13) O preparo das soluções tampão requer cuidados especiais, visto que por conter água é natural o processo de crescimento microbiano. Consequentemente, a determinação da vida útil destas soluções constitui-se como uma BPC, que traz benefícios como a economia de reagentes, a diminuição da frequência de preparo e a manutenção das condições cromatográficas ideais para a análise (7).

A utilização de água ultra purificada para o preparo de soluções tampão é indispensável para o atendimento das normas técnicas e para maximização do desempenho do equipamento de CLAE, visto que seu pH, condutividade e índice de COT, minimizam a presença de interferências na análise, conforme preconizado pela Farmacopeia Brasileira, em sua sexta edição (12).

Soluções tampão preparadas em laboratórios ou adquiridas de fornecedores externos também devem passar por filtração, já que precipitação e cristalização podem ocorrer durante o processo cromatográfico.

Isto é especialmente importante, quando se utiliza gradiente, visto que ocorrem mudanças no coeficiente de solubilidade no leito cromatográfico. (11) O intervalo de variação de valores de pH a ser observado para uma solução tampão deve ser de ± 0,05.

Isso significa que para um pH de 6,80, será possível ajustar o pH da solução entre 6,75 a 6,85. No geral, é recomendado como uma boa prática que o valor final de pH da solução tampão fique dentro de um intervalo de ± 0,02 unidades de pH (11).

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O momento mais apropriado para o ajuste de pH da fase móvel, quando a mesma é constituída por uma mistura de solventes orgânicos, também é uma questão que levanta dúvidas entre os analistas. Este ajuste pode ocorrer durante o preparo da solução tampão ou após sua mistura com solventes orgânicos. De acordo com o Guia de Resolução de Problemas para CLAE da fabricante Waters Corporation, o ajuste do pH deve ocorrer na solução tampão antes da adição de qualquer solvente orgânico na mesma, já que a adição de solventes orgânicos deslocará a concentração de íons H+ para além da escala para a qual o medidor de pH foi calibrado.

Além disso, os ajustes pertinentes a um medidor de pH são feitos para que se tenha resultados confiáveis em solução aquosas. Porém, existem exceções, como o caso de determinados sais, como por exemplo aminas de cadeia longa, que possuem solubilidade limitada em água. Nessas situações, são adicionados os solventes orgânicos na fase aquosa antes do ajuste do pH, com o intuito de melhorar a solubilidade dos sais e em seguida é realizado o ajuste do pH da fase móvel. Em outros casos, com a adição de solventes orgânicos, um novo equilíbrio é atingido, com mudanças bruscas do pH da solução final. Recomendando-se assim, um pequeno ajuste do pH da fase móvel final, que deverá ser feito em equipamento apropriado, diferente dos potenciômetros comuns que são calibrados somente para soluções aquosas (11). Sendo possível, recomenda-se um estudo da capacidade de tamponamento da solução aquosa e da fase móvel (isto é, da solução tampão com pH ajustado, misturada com solvente orgânicos), através de uma curva de titulação, onde é realizada a adição de base e ácido, em ambas as soluções, a fim de verificar se a adição antes ou depois do solvente orgânico não estará interferindo na capacidade de tamponamento da fase móvel (11).

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

2.1.4. O preparo da amostra e sua criticidade no processo de ensaio cromatográfico.

Segundo Majors em 1991, no escopo de um procedimento analítico cromatográfico padrão, 61% do tempo é utilizado no processamento da amostra, informação que pode ser visualizada na Figura 3.

Consequentemente, esta será a etapa que proporcionará também maior possibilidade de erros. De acordo com a Figura 4, 30% dos erros gerados nos processos analíticos que envolvem cromatografia são oriundos da etapa do preparo de amostra, além de indicar que o analista é responsável por 20% dos erros do procedimento completo. Logo, o melhoramento do processo de preparação de amostras e o treinamento adequado do analista poderá diminuir em até 50% os erros (14). Ainda no âmbito do preparo de amostras, e de modo a garantir a adequada quantificação do(s) analito(s), é necessário que as substâncias a serem quantificadas ou detectadas, estejam totalmente solubilizadas na solução preparada, objetivo que pode ser atingido também pelo uso de outras técnicas, como ultrassom, como já mencionado anteriormente (8).

As amostras depois de preparadas são usualmente filtradas em filtros de seringa, contendo uma membrana de filtração, descartável e não reutilizável, ou ainda, membrana funcionalizada, que possui atividade química

Figura 3. Tempo empregado em uma típica análise cromatográfica.

Fonte: Baseado em MAJORS (1991)

114

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Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

causa desta etapa do processo (16). Desse modo, é uma boa prática que se verifique possíveis interferências no uso de determinado tipo de filtro de seringa em um ensaio cromatográfico. Essa verificação deverá ser realizada tanto por meio de literatura técnica e/ou científica deste campo do conhecimentos, como através de ensaios de validação que comprovem, experimentalmente, a não interferência de nenhum material nas análises a serem realizadas.

Figura 4. Fontes de erros durante uma análise cromatográfica. Fonte: Baseado em MAJORS (1991)

e reatividade alta a certos compostos. É importante a utilização de membranas compatíveis com os solventes empregados, para não ocorrer extração de componentes das membranas, que podem interferir no processo cromatográfico (7). Os filtros de membrana mais utilizados para análises cromatográficas típicas são os de celulose regenerada (CR ou RC, do inglês regenerated cellulose), acetato de celulose (AC ou CA, do inglês cellulose acetate), nitrato de celulose (NC ou CN, do inglês cellulose nitrate), nylon, poli-tetra-fluoro-etileno (PTFE, do inglês Polytetrafluoroethylene) e fluoreto de poli-vinilideno (PVDF, do inglês Polyvinylidene Fluoride). Um dos materiais mais utilizados é a celulose regenerada, por ter baixa reatividade e ser eficaz para amostras orgânicas, como por exemplo de hidrocarbonetos poliaromáticos, soluções aquosas multicomponentes, amostras biológicas, apresentando menor adsorção de proteínas e, proporcionando recuperação compatível para amostras de diversos tipos (15). Cabe ressaltar que existe variabilidade em materiais do mesmo tipo, empregados para fabricação do corpo do filtro de seringa, os quais são produzidos por fabricantes distintos, o que pode implicar em risco de contaminações indesejadas e diferentes umas das outras, a depender da marca comercial.

Alguns profissionais definem a marca e o fabricante do filtro, a fim de evitar quaisquer interferências por

A disposição das amostras em frascos (comumente e erroneamente chamados, em linguagem coloquial de laboratório, de vials, do inglês,) também se configura como importante, já que eles serão os suportes analíticos de armazenamento da amostra, durante todo o ensaio realizado pelo cromatógrafo. Após a colocação das amostras em seu interior, eles recebem uma tampa para que fiquem vedados até a retirada de uma alíquota para injeção no equipamento, impedindo desta forma a evaporação dos solventes. Essas tampas são acompanhadas dos septos que podem ser inteiriços ou apresentar um pré-corte pequeno na sua parte central, para facilitar a penetração da agulha no frasco. A escolha de uma tampa adequada a um amostrador de frascos é uma BPC, pois evita, por exemplo, que a agulha de injeção quebre ou entorte durante o processo de injeção das amostras, minimizando prejuízos financeiros e analíticos.

Os frascos de amostras cromatográficas para laboratórios de controle de qualidade podem ser de vidro borossilicato ou de poliuretano, sendo utilizados de forma geral os do primeiro tipo, já que o vidro é inerte e de baixa reatividade. Eles podem ser incolores ou de coloração âmbar, de acordo com a foto sensibilidade de cada analito. Podem possuir diferenças no seu corpo, bocal ou interior, e sua forma de fechamento com tampa pode ser com rosca ou por pressão (17). Nos equipamentos portadores de amostradores automáticos, o uso de frascos de 2 mL é padrão, estes possuindo 12 mm de largura e 32 mm de altura. Os mesmos podem ser utilizados na sua capacidade máxima, isto

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é, até o gargalo do frasco, ou ainda, na marca de 1,5 mL, gravada no corpo do frasco, conforme se pode verificar na Figura 5 (17). Em alguns equipamentos, o preenchimento dos frascos até seu gargalo pode resultar em dados imprecisos, devido à produção de vácuo na agulha do amostrador, que ocasionaria uma sucção maior de amostra, gerando desvios nos resultados.

Como BPC recomenda-se verificar junto o fabricante do cromatógrafo se a orientação do mesmo é usar o frasco com preenchimento total ou parcial de sua capacidade (15).

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

2.2. Boas Práticas Cromatográficas para a manutenção e limpeza de equipamentos de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e seus consumíveis.

2.2.1. Colunas cromatográficas As colunas cromatográficas são indispensáveis para uma operação cromatográfica, já que é nelas que ocorrem as separações dos analitos, permitindo assim a sua quantificação, através de resultados comparados a um padrão preparado e também inserido no sistema, em concentrações conhecidas (12). Sem uma coluna cromatográfica em boas condições de uso, os resultados gerados podem estar comprometidos, não ocorrendo da forma pretendida a separação dos analitos.

Os entupimentos nas colunas cromatográficas ocorrem devido à formação de canais preferenciais de empacotamento na coluna, principalmente nas suas extremidades. Este fenômeno é, muitas vezes, irreversível, alterando a seletividade da coluna, já que pode ocorrer absorção de impurezas, que bloqueiam os sítios de adsorção das colunas e resultam em degradação química da fase estacionária.

Figura 5. Diferentes tipos de preenchimento de frascos (vials) para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Fonte: ANALÍTICA (2017)

Por fim, algumas técnicas de BPL auxiliam na diminuição da probabilidade de ocorrência de erros na análise cromatográfica, tais como: diluição e acerto do volume das amostras em temperatura adequada para o laboratório, cumprimento do protocolo de procedimento analítico reportado na literatura técnica e/ou científica, e observância da sequência correta de diluições, caso as soluções das amostras apresentem instabilidade química e/ou fotoquímica, a fim de evitar a utilização de amostras já degradadas (8).

116

A degradação química da coluna é ocasionada pelos reagentes que passam por seu interior, sendo que a vida útil de determinadas colunas se esvai devido à destruição da camada que recobre a sílica, no caso de colunas à base de sílica. Esse tipo de coluna possui estabilidade para trabalhar com solventes e soluções que estejam na faixa de pH de 2 a 8. O ideal é sempre consultar o fabricante, ainda que seja através do manual de operações contido na caixa da coluna, para identificar o pH de trabalho suportado pela mesma. Algumas colunas à base de sílica possuem faixa de pH de trabalho maior, operando entre valores de 1 e 12. A armazenagem correta da coluna também evita o fenômeno da degradação química, sendo que as colunas cromatográficas a base de sílica, que são maioria em laboratórios de controle de qualidade farmacêutico, devem ser armazenadas com solvente aprótico, para evitar a acidificação ocorrida pela liberação de prótons H+ contidas em solventes próticos.

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Desse modo, colunas de fase reversa, contêm grupos hidrofóbicos, tais como C30, C18, C8, C4, C1, CN e fenila e, devem ser armazenadas em acetonitrila:água, na proporção 50:50, caso a coluna venha a ser utilizada em período inferior a um mês. Caso fique mais de um mês armazenada, recomenda-se aumentar a proporção de acetonitrila:água para 90:10.

Colunas específicas de alguns fabricantes deverão ser estocadas também em uma proporção maior de solvente orgânico, independente do tempo de guarda estipulado. Em alguns casos, o solvente de estocagem também é acetonitrila: água, na proporção 90:10. Desse modo, recomenda-se a verificação da proporção e do tipo de solvente de estocagem contido no certificado de garantia, ou ainda, o que for preconizado pelo fabricante da coluna. No caso das colunas de fase normal, de sílica, diol, nitro, ciano ou amino, recomenda-se a estocagem em hexano:isopropanol na proporção de 90:10(5). O adequado fechamento das pontas das colunas, com seus respectivos adaptadores de extremidades, possibilitam a vedação completa das mesmas, evitando que suas fases estacionárias sequem,

durante o período de sua armazenagem. Adicionalmente, o adequado condicionamento da coluna, isto é o tempo de equilíbrio necessário antes da realização da injeção das substâncias, minimiza uma possível degradação química, por conta do equilíbrio das substâncias da fase estacionária, garantindo assim uma melhor reprodutibilidade e evitando que ocorram desvios dos tempos de retenção dos ativos analisados (11). Em geral, é necessário que o equivalente a 20 volumes internos da coluna cromatográfica, traduzidos em fase móvel, fluam pelo sistema, para que sejam alcançadas as condições de equilíbrio (5). Levando em consideração um fluxo adequado de trabalho e o volume interno da coluna devido ao seu tamanho, chegar-se-á ao tempo estimado de equilíbrio de acordo com a Tabela 1.

Após o uso da coluna cromatográfica, a mesma deve ser submetida a um processo de lavagem, que terá como objetivo a remoção de pequenas sujidades que tenham sido levadas para o interior da coluna, ou ainda, a solubilização de micro cristais que possam ter se formado, devido ao uso de soluções tampão. Este procedimento minimiza a possibilidade entupimento

Tabela 1. Tempo de equilíbrio estimado para uma coluna cromatográfica

Dimensão da Coluna (mm)

Volume interno da coluna (mL)

Vazão (mL.min-1)

Tempo de equilíbrio estimado (s)

250 x 4,6

2,91

1,00

58

150 x 4,6

1,74

1,00

35

100 x 4,6

1,16

1,00

23

50 x 4,6

0,58

1,00

12

250 x 4,0

2,20

1,00

44

125 x 4,0

1,10

1,00

22

250 x 2,0

0,55

0,25

44

150 x 2,0

0,33

0,25

26

50 x 2,0

0,11

0,25

9

Fonte: Adaptado de DC TECH LABORATORY TECHNOLOGIES (2017)

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do leito cromatográfico após seu uso ou mudança da seletividade da fase estacionária.

Conforme os Guias de Resolução de Problemas da Waters Corporation (2002), Thermo Scientific (2016) e Agilent Technologies (2016) dois tipos principais de limpezas para colunas cromatográficas: básica e profunda.

O objetivo da limpeza básica é garantir que o período de estocagem futura não altere as condições físico-químicas da coluna, além de retirar pequenas impurezas ou cristais de sais do seu interior. Comumente, para cromatografia em fase reversa é usado água e acetonitrila para esse tipo de lavagem, podendo ser lavada de forma isocrática ou através de um gradiente destes dois solventes. É recomendada após o término de uma análise bemsucedida, no que tange aos parâmetros cromatográficos (10). A limpeza profunda ou também regeneração da coluna, é uma limpeza com a utilização de diversos solventes, cujo objetivo é a restauração das condições físico-químicas ideais da fase estacionária, após a mesma estar apresentado problemas como por exemplo, distorção de picos e aparecimento de picos fantasmas. Alguns processos de regeneração são específicos para colunas de determinados fabricantes e outros assumem um caráter generalizado para outros tipos de coluna. Recomendase que a limpeza seja realizada de modo a não permitir o transporte dos solventes para dentro do detector do sistema cromatográfico, pois o mesmo conterá sujidades.

Para tanto, a saída da coluna pode ser desconectada do equipamento, durante a limpeza, ou realizada com uma bomba avulsa, fazendo-se o recolhimento dos solventes usados para seu adequado descarte. Em algumas colunas, o processo terá um desempenho melhor se realizado em conjunto com a limpeza dos filtros de entrada e saída da coluna, conforme será visto ainda no item a seguir. Esses processos de limpeza profunda podem remover, ainda que pouco, parte da fase química ligada à a sílica e, por isso, não é apropriado que a saída do fluxo dos solventes esteja ligada um detector de CLAE (10).

Para a limpeza básica de colunas de fase reversa com base de sílica, recomenda-se a passagem 118

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

inicial de água ultra purificada com acetonitrila na mesma proporção em que se encontram na fase móvel, equivalente a 10 ou 20 volumes da coluna. Neste momento, a coluna pode ser aquecida para temperatura entre 40 a 50 ºC, caso sua temperatura de trabalho seja a ambiente, para forçar a solubilização de sais. Em seguida, efetua-se um gradiente, invertendo a proporção de água e acetonitrila, até que se atinja 90% de solvente orgânico e 10% de água. Novamente, este procedimento será realizado com a passagem do equivalente a 10 a 20 volumes da coluna cromatográfica da mistura de eluentes. Após a limpeza, a coluna cromatográfica será armazenada com uma proporção adequada de solvente orgânico e água, levando-se em consideração as especificidades do fabricante e do tempo estimado de guarda. Se caso a amostra tiver sido solubilizada em solventes orgânicos de baixa polaridade ou contenha substâncias que reconhecidamente se adsorvem com facilidade à fase estacionária, pode ser realizada antes da limpeza, injeções com tetra-hidro-furano (THF), com o objetivo de fazer a remoção dos materiais orgânicos que ainda estiverem adsorvidos na coluna (9). Em algumas colunas de fase reversa, não é indicada a passagem de 100% de água ou solução aquosa na coluna, ainda que exclusivamente para limpeza, pois devido ao tipo de revestimento de suas sílicas, pode ocorrer um colapso da fase hidrofóbica, levando justamente a um bloqueio do fluxo da fase móvel. Antes de qualquer procedimento de limpeza, é recomendado a leitura do manual de instrução da coluna, a fim de se detectar qualquer tipo de instrução relacionada a cuidados preventivos. Por isso é indicado que se inicie sempre uma limpeza com no mínimo 5% de solvente orgânico, ainda que se tenha utilizado uma fase móvel com grande concentração de sais (18).

Para colunas cromatográficas de fase normal, o processo de regeneração poderá ser realizado através da passagem de 30 a 50 mL dos seguintes solventes: hexano/ octano/heptano, cloreto de metileno, isopropanol, THF, metanol e de mistura equivalente à fase móvel, que não contenha sais (9).

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No caso de limpeza profunda para colunas de fase reversa à base de sílica, recomenda-se os seguintes procedimentos. Colunas cromatográficas que foram utilizadas, durante muito tempo, com amostras que dissolvidas em alguma proporção de água, devem ser primeiramente submetidas à passagem de água ultrapura.

A passagem de 50 mL de água a 60 ºC, além de 50 mL de metanol, 50 mL de acetonitrila, 25 mL de metanol e 25 mL de mistura equivalente à fase móvel, sem a presença de sais. (19). Ou ainda, 25 mL de mistura equivalente à fase móvel utilizada sem a presença de sais, 25 mL de metanol, 100 mL de acetonitrila, 25 mL de solução 75:25 de acetonitrila: isopropanol, 25 mL isopropanol, 25 mL cloreto de metileno e 25 mL de hexano (11). Por outro lado, aquelas colunas cromatográficas utilizadas durante muito tempo, com amostras que não foram dissolvidas em nenhuma proporção de água devem ser submetidas à passagem de 50 mL de isopropanol, 50 mL de cloreto de metileno, 50 mL de hexano, 25 mL de isopropanol e 25 mL de solução equivalente à da fase móvel, sem a presença de sais (19).

O processo de regeneração poderá ser potencializado pela limpeza dos filtros de entrada e saída da coluna. É uma prática que deverá ser realizada por analista experiente, a fim de não haver perda da fase estacionária da coluna, que culminaria em perda de eficiência e até na inutilização da coluna cromatográfica, conforme pode ser visto na Figura 6.

Por fim, seguem mais algumas BPC relacionadas ao uso das colunas cromatográficas, de acordo com Guias da Agilent Technologies (2016) e da Thermo Scientific (2016): • Utilizar, preferencialmente, a coluna apenas na direção do fluxo marcada em seu corpo.

Em caso de utilização no sentido invertido, manter esta condição até que seja realizado um processo de limpeza dos filtros. Isto evita o bloqueio de ambas as extremidades e mudanças bruscas no leito cromatográfico,

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

que podem alterar a seletividade e a resposta da coluna.

• Criar formulários individuais para cada coluna cromatográfica utilizada no laboratório, com o intuito de ter um registro documentado do histórico de desempenho da mesma. Esse formulário possuirá informações como os produtos analisados, caso o laboratório não trabalhe com colunas dedicadas a determinados produtos, fluxo de trabalho utilizado, pressão média de trabalho, além de informações que servem para medir o desempenho analítico da coluna, tais como assimetria e tempo de retenção dos picos analisados, além do número de pratos teóricos para compostos de interesse. Este formulário também poderá conter informações sobre em qual (is) equipamento (s) a coluna foi utilizada, se foi realizada limpeza ao término da análise, se a coluna respondeu ao ensaio em relação aos parâmetros metodológicos e até mesmo se a coluna foi utilizada no sentido indicado pelo fabricante ou no sentido invertido. É indispensável que este formulário possua um campo de observações, para que o usuário aponte fatos relevantes relacionados ao uso da coluna. Em caso de desativação da coluna, devido à perda de eficiência da mesma, sugere-se que seja colocado um anexo à coluna, contendo um cromatograma, para que em caso de troca de produto ou tentativa de recondicionamento da mesma, tenha-se a ideia do estado real em que a coluna se encontra.

• Utilizar conectores apropriados para a coluna, sejam eles de polietileno ou de aço inoxidável. Existem equipamentos que possuem conectores específicos para colunas de determinados fabricantes, não sendo possível adaptações, devido à especificidade

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Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

Figura 6. Passo a passo para limpeza do filtro de uma coluna cromatográfica de CLAE.

da coluna. Forçar a colocação de um conector, pode trazer prejuízos ao sistema e à coluna.

• Realizar uma limpeza básica sempre ao término de uma sequência de análises, ou ainda, em caso de uso intensivo. Determinar um número de análises para proceder-se à limpeza da coluna.

• Armazenar a coluna cromatográfica em ambiente com temperatura e umidades controladas, independente da coluna ser nova 120

ou usada. Ambientes com excessiva umidade podem provocar a formação de fungos na cabeça da coluna, somente pelo contato do ar, caso a mesma não esteja devidamente fechada.

• Evitar lugares com vibração mecânica para a armazenagem da coluna cromatográfica, assim como se deve minimizar a possibilidade de quedas ou movimentos bruscos com a mesma. Sem estes cuidados, pode ocorrer Scientia Chromatographica 2019; 11(3):108-125

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deslocamento da fase estacionária e/ ou alterações nos caminhos dos leitos cromatográficos, modificando a capacidade de resposta analítica da fase estacionária.

• Armazenar as colunas cromatográficas sempre na horizontal, para que não aconteça o deslocamento da fase estacionária para alguma das extremidades, caso a mesma seja armazenada incorretamente na vertical.

• Realizar o processo de regeneração da fase estacionária sempre que se observar pontos falhos na análise cromatográfica. Contudo, existem limites para a recuperação de uma coluna, não sendo possível fazê-lo diversas vezes.

• Realizar de forma separada a guarda das colunas cromatográficas novas e usadas, garantindo relatório de uso das colunas usadas e separação adequada para as colunas.

2.2.2. Cuidados e manutenção com equipamentos de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Os equipamentos de CLAE possuem canais de entrada para a passagem de soluções específicas. Alguns equipamentos possuem 2, 4, 6 e até 8 canais de entrada diferentes. Recomenda-se como BPC a utilização de canais dedicados, isto é, de canais específicos para determinadas soluções, caso a rotina do laboratório empregue largamente os mesmos tipos de solvente.

Destaca-se que alguns equipamentos já vêm com a orientação de que tipo de solução ou solvente se deve utilizar em determinados canais, a fim de maximizar o desempenho em casos de métodos com gradiente de solvente (8).

Quando acontece a cristalização e posterior precipitação de sais, oriundos das soluções tampão dentro do sistema cromatográfico, podem ocorrer travamentos e desgastes das válvulas de retenção e dos

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

selos dos pistões, levando a uma possível quebra e danos à câmara de mistura da fase móvel. Isto induziria falhas no equipamento, levando a vazamentos, alterações no fluxo, mistura da fase móvel, que seriam detectados por alterações drásticas na pressão da bomba do equipamento (20).

A fim de proteger as tubulações de quaisquer partículas, além do processo de filtração, é recomendado como BPC, a utilização de filtros de fase móvel na entrada dos canais, garantindo assim que o eluente que percorrerá o leito cromatográfico não sofrerá interrupções. Esses filtros comumente são de aço inoxidável 316, de polietileno de altíssima densidade ou ainda de vidro de borossilicato com elemento filtrante poroso de 2µm, sendo facilmente limpos por processo de retro lavagem e sonicação (21).

De acordo com Agilent Technologies (2016) é recomendável a periodicidade de algumas boas práticas relacionadas a manutenção dos cromatógrafos. As mesmas estão apresentadas no Quadro1.

2.2.3. A Técnica de Resolução de Problemas (Troubleshooting) como ferramenta de Boas Práticas de Cromatografia

O número de artigos científicos, teses ou dissertações que apresentam, de forma pragmática, a aplicação e os benefícios das BPC é reduzido. O referido tema é discutido por diversas vezes em Guias de Resolução de Problemas, onde são apresentados diversos desafios referentes à utilização da técnica de CLAE com suas respectivas resoluções e procedimentos para evitálos, minimizá-los e/ou eliminá-los.

Defende-se, portanto, o incentivo à escrita de artigos científicos que discutam as BPC e também as soluções para os desafios que são encontrados durante a operação da CLAE. Sabe-se que as informações iniciais oferecidas a um analista, sem experiência prévia, transmitem algumas noções de BPC, mas isso ainda é incipiente quando comparado aos desafios e situações

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Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

Quadro 1. Boas Práticas Cromatográficas para manutenção de equipamentos de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Frequência de manutenção

Boas Práticas Cromatográficas recomendadas Purgar cada canal, em que tenha ocorrido troca de solvente, com 2,5 mL a 3 mL, durante 5 min, para evitar transporte de bolhas.

Aquecer a (s) lâmpada(s) durante, pelo menos, 1 hora, antes do início da análise.

Equilibrar o sistema por 15 minutos antes da análise com os solventes de aplicação.

Diária

Não deixar o frasco utilizado para lavagem do selo do pistão esvaziar. Colocar proporção de água ultrapura e solvente orgânico, conforme indicado no método de análise, a fim de evitar a precipitação de sal nas válvulas de retenção. Caso não seja indicado, utilizar a mesma proporção de água ultrapura e solvente orgânico contida na fase móvel empregada. A adequada limpeza dos selos garante a remoção de partículas, cristais de sal e outros resíduos não voláteis que podem danificar o pistão e os selos, além de que a limpeza garante a lubrificação da interface selo/pistão e o resfriamento dos pistões ao longo do uso.

Ao término da análise, programar limpeza do sistema, para que fique nas tubulações do sistema cromatográfico, a solução de água/metanol na proporção 1:1.

Purgar o amostrador do equipamento, seja antes ou depois de uma sequência de amostras. Alguns equipamentos já realizam a purga do amostrador de forma automática após a corrida de uma sequência de amostras.

Realizar a limpeza do selo do pistão com solução de água e isopropanol (90:10) Lavar todos os canais com água (2,5 mL a 3 mL) durante 5 minutos para remoção de depósitos de sal que forem formados dentro do equipamento devido ao uso de soluções tampão. Em seguida repetir o procedimento com a solução destinada ao canal.

Semanal

Inspecionar os filtros de solvente quanto a sujeiras e bloqueios e limpar através de sonicação. Caso nenhum fluxo esteja saindo do canal, recomenda-se a troca de filtro.

Realizar a limpeza externa dos módulos de CLAE, com tecido não tramado com água ultrapura, sem a utilização de solventes ou abrasivos químicos.

Longo Prazo em caso de não utilização

Limpar o sistema todo com água ultrapura para remoção de solução tampão, além de depósitos de sais. Remover todas as amostras do amostrador. Realizar limpeza de todo o sistema com solução de água/metanol na proporção 1:1.

Desligar o equipamento da rede elétrica.

Fonte: Adaptado do Guia Boas Práticas para usar em um sistema de LC AGILENT.

vividas em uma rotina de laboratório de controle de qualidade. Atualmente, em muitas ocasiões, só é possível compreender um problema cromatográfico depois que ele foi detectado e resolvido. A prevenção de situações como esta só surge depois que o dano já ocorreu.

Inclusive, em alguns casos, problemas relacionados à 122

cromatografia são demorados para serem descobertos, justamente por falta de um método adequado para a abordagem preventiva ou corretiva dos mesmos (20).

De acordo com Neto (2009), a “abordagem de resolução de problemas em cromatografia tem o objetivo de observar, isolar e corrigir problemas, de maneira Scientia Chromatographica 2019; 11(3):108-125

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direta, simples, racional e eficiente”. Assim, através da elaboração de um método prático de resolução de problema, é possível a pronta identificação dos mesmos, a identificação eficiente de suas causas e a solução ágil, de forma a corrigi-los e evitá-los em futuras utilizações. É importante destacar que o uso da abordagem de resolução de problemas para cromatografia não elimina a necessidade da visita de técnicos especializados para correções e ajustes nos equipamentos de CLAE, já que existem procedimentos que podem ser realizados apenas por analistas devidamente treinados e outros que só podem ser implementados por assistência técnica especializada. É importante que o analista saiba em qual momento ele deve solicitar auxílio especializado.

Realizar resolução de problemas cromatográficos não significa ter acesso ilimitado à manutenção e operacionalização do equipamento de CLAE (20).

A seguir são listados passos para uma correta resolução de problemas cromatográficos, adaptado de NETO (2009), inserindo-se, após cada parágrafo, frases simples em negrito, que pretendem trazer um lembrete mnemônico ao analista de CLAE. a) O operador deve conhecer um pouco da teoria geral de cromatografia, e de forma mais profunda, da técnica de CLAE, incluindo noções relacionadas aos equipamentos em que estiver operando. Existem situações que se aplicam a alguns cromatógrafos, independente do fabricante e outras que serão únicas e exclusivas de determinados modelos de CLAE, devido a suas particularidades. O operador precisa ser observador, cuidadoso e monitorar o equipamento antes, durante e depois de cada análise. O conhecimento e observação são requisitos essenciais para qualquer etapa analítica. b) A prevenção de certas falhas e o planejamento da adequada manutenção é indispensável para a adequada Resolução de Problemas cromatográficos, minimizando concomitantemente os custos. A prevenção evitará gastos desnecessários em ações corretivas.

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

c) Toda e qualquer alteração precisará ser devidamente documentada nos cadernos ou livros de registros do equipamento. Assim evita-se, por exemplo, que uma determinada peça danificada seja reutilizada em outro cromatógrafo. A abertura de registro de ocorrência é indispensável para o planejamento da manutenção do laboratório, além do mantenimento das anotações do histórico dos problemas, assim como das soluções encontradas. Sem registro, perde-se o histórico das resoluções encontradas. d) Todo o problema a ser resolvido, precisa ser abordado de forma linear e lógica. Qualquer alteração deverá ser realizada de forma individual, para que se localize rapidamente um determinado problema. Se o analista realiza a mudança de duas variáveis para uma problemática, qual terá sido a causa raiz do problema?

A realização dos testes individuais é o caminho para se isolar um problema, reconhecendo-o de forma rápida. As variáveis de um problema devem ser alteradas uma por vez. e) Quando houver a suspeita de identificação do problema, importante testar as variáveis para confirmar se realmente a causa raiz foi identificada. A resolução de um problema só poderá ocorrer se houver a certeza da identificação do problema. f) A troca de peças, consumíveis ou partes que estejam sob dúvidas de mau funcionamento por outras novas ou que sabidamente sejam identificadas como boas, garantirá que a causa raiz foi corretamente identificada. A reutilização de peças danificadas ou impróprias não auxiliará na resolução do problema. g) Deve-se realizar a divulgação da compilação de relatórios de mudanças no equipamento para todos os que usam os cromatógrafos no laboratório. A criação de um formulário que facilite o registro do problema, seus indícios de surgimento, origens e posteriores soluções, trará a economia de tempo almejada, caso o mesmo problema ocorra com outro operador. Em determinados ensaios, por particularidades dos métodos e dos ativos

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sob análise, alguns problemas são recorrentes. A divulgação e compartilhamento de informações relevantes melhoram a qualidade da rotina analítica do laboratório.

3. Comentários finais

As BPC se apresentam como ferramentas indispensáveis aos laboratórios de controle de qualidade pertencentes à indústria farmacêutica, e formam os alicerces técnicos para a sustentabilidade e segurança na aplicação das técnicas de cromatografia. É inegável que existem diferenças técnicas relacionadas a diferentes equipamentos, consumíveis e software, portanto, é necessário que as BPC sigam preceitos harmonizados, através da definição de conceitos gerais, com o intuito de normalizar o conhecimento comum.

124

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

Recomenda-se a realização de mais pesquisas, que promovam cruzamentos de informações de diversos fabricantes, além do desenvolvimento de novos procedimentos, que aliados a testes práticos, possam mensurar, de forma inequívoca, o benefício da aplicabilidade das BPC para a indústria farmacêutica. É possível inferir que com a adoção das BPC os resultados obtidos tenderão a ser mais confiáveis e robustos, pois serão oriundos de sistemas e processos cromatográficos que atingirão uma maximização de seu desempenho.

Tais resultados atenderão aos requisitos dos órgãos reguladores, além de proporcionar, possivelmente, uma redução de custos para o usuário. Defende-se, portanto, que o emprego das BPC seja realidade dentro dos laboratórios de controle de qualidade farmacêutico, onde a cultura da prevenção acaba não sendo, em alguns casos, mais interessante do que a cultura da correção ou reparo.

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Gama R. G. M., Chaves M. H. C.

Boas práticas cromatográficas para laboratórios farmacêuticos

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Fevereiro 2010.

[10] Waters Corporation. HPLC Troubleshooting Guide. 2002. Disponível em <http://www.waters.com/waters/library.htm?cid=511436&li d=1528445&locale=pt_BR>. Acesso 10 de Abril de 2020 [11] Agilent Technologies. Column User Guide for Agilent reversed-phase columns. Agilent Technologies, 2014.

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Scientia Chromatographica 2019; 11(3):126-130 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2019.011 ISSN 1984-4433

HPLC

Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos para análise do dinitrato de isossorbida em comprimidos sublinguais Valdinea Santos Dias*1, Amanda dos Santos Teles Cardoso1, Aylla Nunes Conceição1, Edith Cristina Laignier Cazedey1 Núcleo de Pesquisa e Análise de Medicamentos (NuPAM), Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia Rua Barão de Jeremoabo, s/n, 40170290, Salvador, Bahia, Brasil *wneadias@hotmail.com

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Resumo

A comparação de métodos analíticos compendiais pode nortear o desenvolvimento de novos métodos capazes de otimizar as análises farmacêuticas. Foi realizada a comparação teórica dos métodos analíticos compendiais para o doseamento do vasodilatador dinitrato de isossorbida (DNIS) em comprimidos sublinguais das Farmacopeias Britânica, Americana e Japonesa, a partir das variáveis: facilidade de aplicação do método farmacopeico na rotina laboratorial, classificação do método como um método analítico indicativo de estabilidade (MAIE) e contribuição do método com a Química Analítica Verde. Este trabalho apontou que embora fáceis de serem aplicados na rotina laboratorial, os métodos farmacopeicos podem ser otimizados para atender aos princípios da Química Analítica Verde e o desenvolvimento de MAIE. Palavras chaves: dinitrato de isossorbida, farmacopeia, cromatografia líquida de alta eficiência

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Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos

1. Introdução

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) uma das principais técnicas analíticas utilizadas com esta finalidade.

O dinitrato de isossorbida (DNIS), fármaco usado nas doenças cardiovasculares, faz parte da Relação Nacional de Medicamentos Essenciais, porém não possui monografia na Farmacopeia Brasileira (1), compêndio oficial de referência para as análises de fármacos e medicamentos no Brasil. No entanto, farmacopeias elaboradas por outros países podem ser utilizadas para os ensaios de qualidade do DNIS. Apesar de efetivos para o controle de qualidade, alguns métodos farmacopeicos não consideram questões atuais da área do controle de qualidade como a Química Analítica Verde e a importância dos métodos analíticos indicativos de estabilidade (MAIE). Um MAIE é aquele adequado para analisar amostras de estabilidade, validado, capaz de detectar ao longo do tempo mudanças nas propriedades físicas, químicas e/ou microbiológicas de uma substância (2). Assim, o desenvolvimento de novos métodos analíticos acaba por ser impulsionado, sendo a

Neste contexto, este trabalho teve como objetivo comparar, teoricamente, os métodos analíticos compendiais para o doseamento do DNIS em comprimidos sublinguais descritos nas Farmacopeias Americana (3), Britânica (4) e Japonesa (5), a partir das variáveis: facilidade de aplicação do método na rotina laboratorial, classificação do método como um MAIE e contribuição do método com a Química Analítica Verde.

Resultados e discussão Dentre as Farmacopeias analisadas, observou-se que os métodos para a quantificação do DNIS em comprimidos sublinguais (Tabela 1) são de fácil reprodução, a considerar a curta duração das corridas cromatográficas (tempo de retenção do DNIS inferior a dez minutos), o uso de solventes comercialmente disponíveis e as análises feitas

Tabela 1. Métodos analíticos compendiais das Farmacopeias Americana, Britânica eJaponesa para análise do DNIS em comprimidos sublinguais

Condições cromatográficas Farmacopeia

Fase móvel

Detector UV (nm)

Fluxo (mL.min-1)

Tamanho da coluna (mm)

220 nm

1,0

250x4

20

Americana (2018)

Água:tampão acetato de amônio: metanol (35:10:55, v.v-1)

Tempo de retenção (min) 0,75

Etanol:2,2,4trimetilpentano (15:85, v.v-1)

230nm

1,0

250x4,6,1 0

20

5,0

Etanol: 75 Trimetilpe ntano: 425

Água:metanol (11:9, v.v-1)

220 nm

-

150x4,6

10

6,0

Água: 330 Metanol: 270

Britânica (2009) Japonesa (2011)

Volume de injeção (µL)

Volume de solvente gasto por análise (mL)* Água: 35 Tampão acetato de amônio: 10 Metanol: 55

*Cálculo do volume gasto de solvente por análise: proporção do solvente x tempo de retenção, em 100mL. Scientia Chromatographica 2019; 11(3):126-130 127

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no modo isocrático, que não obriga o recondicionamento da coluna cromatográfica entre corridas e ajuda a reduzir o tempo total gasto com a análise na rotina laboratorial (6).

não permite a verificação da pureza dos picos de interesse frente a outras substâncias que possam co-eluir com ele, como os produtos de degradação (Figura 1).

Apesar destes aspectos positivos, os métodos em estudo não são classificados como MAIE. Isso não é um problema quando o objetivo da análise é o doseamento do DNIS em um lote que irá para o mercado, mas, quando se discute amostras de estudo de estabilidade, esses métodos são limitados em relação à confiabilidade para detectar mudanças no medicamento ao longo do tempo. Essa lacuna já impulsionou pesquisas em prol do desenvolvimento de MAIE para o DNIS (7,8).

Apesar disso, se necessário o uso de detectores UV, é possível provar indiretamente a pureza de pico através de alterações nas condições cromatográficas que interferem na separação e o uso do padrão analítico para confirmação da identidade do analito (10). No entanto, isso resultaria em um maior consumo de solventes e fármacos e aumentaria o tempo do desenvolvimento do método com provável aumento do custo e quantidade de resíduos. A ANVISA recomenda que os MAIE sejam desenvolvidos por CLAE com detector de arranjo fotodiodo, que permite a varredura de uma faixa de comprimentos de onda, em tempo real, e possibilita a avaliação da pureza de pico (2). O uso de detectores de espectrometria de massas (EM) juntamente com DAD é, contudo, fundamental para a confirmação da identidade do analito, o qual pode indicar co-eluições com outros componentes, como por exemplo, produtos de degradação do composto de interesse. A quantificação do analito em casos que impedem que o detector DAD seja empregado, também pode ser feita com LC/MS (2,11).

A CLAE com detector ultravioleta (UV) está presente nos ensaios farmacopeicos dos compêndios avaliados neste estudo, por ser vantajosa e largamente aplicada na análise de fármacos (9). Porém, para o desenvolvimento de MAIE não seria o mais apropriado manter o detector UV, pois este

Do ponto vista da Química Analítica Verde, o procedimento analítico apresentado pela Farmacopeia Britânica para a análise do DNIS é inadequado pelo uso do trimetilpentano, solvente altamente tóxico para humanos e para o meio ambiente, especialmente o aquático (11). Os métodos analíticos das outras farmacopeias demonstram que solventes atóxicos como a água, e menos tóxicos, como o metanol, podem ser utilizados para análises farmacêuticas do DNIS. Comparando-se os tempos de retenção e os volumes de solventes dos métodos em estudo, o da Farmacopeia Americana (0,75 min) gera menor volume de resíduo de solvente orgânico e, por isso, estaria mais alinhado aos princípios da Química Verde (13).

Figura 1. Exemplo do problema da identificação do produto de degradação devido à co-eluição com o pico principal.

128

Uma otimização possível para o método da Farmacopeia Americana consiste na retirada da solução tampão, tendo em vista que que soluções tamponantes podem promover a abrasão, corrosão e cristalização pela presença de sais e reduzir a vida útil Scientia Chromatographica 2019; 11(3):126-130

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de colunas e sistemas cromatográficos (6,13). Uma demonstração desta possibilidade é que a Farmacopeia Japonesa também utiliza como fase móvel água e metanol, porém sem o tampão. Além disso, considerando que o uso do tampão se destina a manter estável o valor do pH da solução aquosa e evitar o aparecimento de deformações no pico cromatográfico pelo surgimento de estruturas ionizadas do fármaco, uma pesquisa feita a partir do software Chemicalize® (14) demonstrou que a molécula do DNIS permanece totalmente não ionizada em qualquer valor de pH, não necessitando o uso do tampão para este fim.

Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos

Em conclusão, este trabalho demonstrou que comparação de métodos analíticos compendiais pode nortear o desenvolvimento de métodos analíticos capazes de otimizar as análises farmacêuticas e melhorar os processos em prol da qualidade e segurança dos medicamentos, reduzindo também o impacto ambiental exercido pelos laboratórios analíticos. Embora o método da Farmacopeia Americana tenha vantagens como a menor geração de resíduos e uso de solventes pouco poluentes, a comparação dos métodos farmacopeicos analisados evidenciou que diversos parâmetros destes procedimentos de análise do DNIS podem ser aprimorados para atender às demandas atuais da área de controle de qualidade e desenvolvimento de métodos analíticos indicativos de estabilidade, dentro do âmbito da Química Verde.

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Dias V. S., Cardoso A. S. T., Conceição A. N., Cazedey E. C. L.

Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos

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INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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Scientia Chromatographica 2019; 11(3):133-134 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

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Cursos 2019

IIC Calendário anual de atividades Visite www.iicweb.org

MÊS

DATA

DISCIPLINA

HORAS

Março

13 a 15

Cromatografia Líquida (HPLC ou CLAE)

24

Abril

10 a 12

Cromatografia Gasosa Moderna

24

Maio

15 a 17

Técnicas Modernas para Preparo de Amostras

24

Junho

25 a 28

Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas

32

Julho

24 a 26

Cromatografia Líquida (HPLC ou CLAE)

24

Agosto

28 a 30

Cromatografia Líquida Avançada

24

Setembro

19 a 20

Como Desenvolver e Otimizar um Método em HPLC

16

Outubro

22 a 25

Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas

32

Novembro

20 a 22

Cromatografia Gasosa Moderna

24

Dezembro

11 a 13

Cromatografia Líquida (HPLC ou CLAE)

24

Publicação disponível na internet:

www.scientiachromatographica.com

2019

Volume 11 | Número 3 98 Clean, Safe And Fast Method By Hplc For Quantification Of Rifaximin-Based Samples Ana Carolina Kogawa, Leena Peltonen, Hérida Regina Nunes Salgado, Marlus Chorilli

108 Boas Práticas Para Cromatografia Líquida De Alta Eficiência: Uma Abordagem Para O Controle De Qualidade Farmacêutico Rodolpho Guilherme Menezes Gama, Marcelo Henrique da Cunha Chaves

126 Avaliação comparativa teórica entre métodos farmacopeicos para análise do dinitrato de isossorbida em comprimidos sublinguais Valdinea Santos Dias, Amanda dos Santos Teles Cardoso, Aylla Nunes Conceição, Edith Cristina Laignier Cazedey

Instituto Internacional de Cromatografia IIC

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