v10n3

ISSN 1984-4433

2018 | Volume 10 | Número 3

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 periodico@scientiachromatographica.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.10 n.3 (jul./set. 2018). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2018.

Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

PeriĂłdico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

Scientia Chromatographica 2018 | Volume 10 | NĂşmero 3

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3):125 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................127 Os Editores

Prof. Harold M. McNair 85 years old......................................................................................................................129 Fernando Mauro Lanças

GAS CHROMATOGRAPHY Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography.................................................................... 138 Abhijit Ghosh, Milton L. Lee

HPLC Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT) em cromatografia líquida miniaturizada......................................................................................................................150 Juliana Soares da Silva Burato, Fernando Mauro Lanças

SAMPLE PREPARATION Sample preparation techniques for biological samples................................................................................ 174 Maria Eugênia Costa Queiroz, Israel Donizeti de Souza

Calendário de Eventos...................................................................................................................................................................................195 Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................208 Bookstore............................................................................................................................................................................................................209 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................210

Scientia Chromatographica 2018; 10(3) 125

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):127 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Scientia Chromatographica Volume 10, Número 3, 2018

Colocamos à disposição dos leitores mais um número do Scientia. Neste número publicamos

uma entrevista com o Professor Harold McNair, um dos ícones da Cromatografia, no momento em que completa 85 anos de vida. Figura carismática, um dos pesquisadores mais ativos na divulgação da técnica em todas suas formas, Professor reverenciado por todos da área, e pessoa de muitos amigos.

Um artigo do Prof. Milton Lee, mais um dos importantes pesquisadores na área de Cromatografia, Espectrometria de Massas e técnicas relacionadas, discutindo a miniaturização da técnica, dá seguimento ao presente número. A seguir, um artigo do laboratório do Prof. Lanças discute o estadoda-arte das colunas tubulares abertas com a parede interna recoberta com materiais porosos (PLOT) em cromatografia líquida miniaturizada. Um artigo da Prof. Maria Eugênia Queiroz discute as várias técnicas disponíveis para o preparo de amostras biológicas, com ênfase nas micro técnicas de extração.

Este conjunto diversificado de enfoques em técnicas de separação, permitirá ao leitor uma

atualização nos diversos assuntos abordados, por especialistas na área.

Esperando que os artigos sejam de interesse dos leitores, lembramos que o Scientia

Chromatographica publica artigos submetidos também pelos leitores, e que não existe qualquer custo para a publicação, assim como também para a leitura dos artigos. Caso tenha dúvidas a respeito, entre em contato conosco.

Os Editores

Scientia Chromatographica 2018; 10(3) 127

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.008 ISSN 1984-4433

INTERVIEW

Prof. Harold M. McNair 85 years old No dia 31 de Maio deste ano Harold M. McNair, professor Emérito do Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, USA e um dos ícones da Cromatografia, celebra seus 85 anos de vida. O Editor-in-Chief, Editores Associados, staff e leitores do Scientia Chromatographica se juntam para desejar ao Prof. McNair muitas felicidades nesta ocasião.

Na oportunidade, o Editor-in-Chief do Scientia editou uma entrevista realizada em várias etapas com o aniversariante, a qual revela importantes aspectos de sua história, personalidade e carreira acadêmica.

Fernando M. Lanças

Scientia Chromatographica 2018; 10(3)

129

Fernando M. Lanças

Como conheci o Professor Harold M. McNair Meu primeiro encontro com o Professor McNair ocorreu em Abril de 1981, quando ele se encontrava na Universidade de Campinas (UNICAMP), Brasil, como consultor do PNUD/UNESCO. Eu estava defendendo minha tese de doutorado e o Prof. McNair assistiu a apresentação pública da minha tese. Logo depois da tese tivemos uma conversa bastante agradável para mim – obviamente sobre cromatografia e ensino de química. Ele me incentivou a visitá-lo na Virginia Tech para desenvolver um projeto de Pos Doc, assim como envolver-me nos cursos que ministrava. Naquela ocasião eu já era docente na Universidade de São Paulo em São Carlos, e o Prof. McNair era tão entusiasta

Prof. Harold M. McNair

com a idéia e tão convincente que no final do mesmo ano eu iniciei um programa de dois anos como visitante em seu laboratório. Concluida a visita, retornei ao Brasil e à USP e pouco tempo depois começamos – com a ajuda de dois outros ícones da Cromatografia, Prof. Karel Cramers da Universidade de Eindhoven, Holanda, e Prof. Patrick (Pat) Sandra, da Universidade de Guent, Bélgica – o COLACRO, Congresso LatinoAmericano de Cromatografia. O evento tornou-se o mais importante forum para a discussão das ciências cromatográficas e técnicas relacionadas da América Latina e, posteriormente, dentre os mais prestigiados do mundo na área.

Figura 1. Comitê Científico do 3o Congresso Latino-Americano de Cromatografia (COLACRO III) realizado no Brasil em 1990. Da esquerda para a direita: Harold McNair, Pat Sandra, Fernando Lanças (Chairman) e Karel Cramers. Re-impresso de Scientia Chromatographica 2014; 6(1): 9-1.

130

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136

Fernando M. Lanças

Durante o período após minha visita ao laboratório do Prof. McNair, ele teve a oportunidade de passar vários períodos como visitante em meu laboratório na Universidade de São Paulo, sempre incentivando meu progresso na área de pesquisa e formação de novos pesquisadores. Vários de meus alunos de pós graduação tiveram a oportunidade de visitá-lo no Virginia Tech, alguns por períodos curtos e outros um ano de Pos Doc. Todos tiveram uma excelente oportunidade de aproveitar um ambiente científico bastante profícuo e, ao mesmo tempo, a acolhida que ele dedicava aos visitantes internacionais.

Além da minha experiência com o Prof.

MacNair no Virginia Tech e na USP, tive também a oportunidade de participar com ele em vários eventos em outros países, particularmente na América Latina incluindo o Brasil (muitas vezes), Argentina (várias vezes), Chile (algumas vezes), Colombia e México (algumas vezes) e Venezuela (duas vezes). Durante esses eventos pude perceber que ele era o pesquisador Americano da área mais conhecido na América Latina, sem dúvida alguma. Em resumo, a interação com o Prof. McNair trouxe um grande incentivo a minha vida professional durante décadas, assim como influenciou minha vida pessoal.

Nesta ocasião, na qual celebra seu 85o Aniversário, e tendo tido recentemente a oportunidade de ter sua animada companhia em um jantar durante congresso científico em Riva del Garda, Itália, aproveito para desejar ao Prof. McNair e ao amigo Harold muitos anos mais de vida, com o mesmo entusiasmo de sempre, sem esquecer das piadas e histórias que sempre animaram as reuniões durante os eventos.

A entrevista a seguir resume em apenas 10 perguntas parte de documentos obtidos em diferentes ocasiões, geralmente pessoalmente ou por email, e em uma delas através de conversa telefônica, após a aposentadoria do Prof. McNair. A entrevista foi traduzida, editada e resumida pelo Editor, para maior clareza. Como sempre, o Prof. McNair foi muito gentil

Prof. Harold M. McNair

em nos conceder a entrevista de maneira que pudessemos levar aos leitores do Scientia um pouco da trajetória científica e pessoal desse grande Professor.

1. Qual foi a principal motivação que o levou à área de Cromatografia?

Acredito que devo esta escolha a meus primeiros mentores científicos: Dr. A.J.P. Martin (prêmio Nobel de química pela proposta da partição), Dr. Seteve del Nogare, então na DuPont, USA, e o Professor A.I.M. Keulemans da Universidade de Eindhoven, Holanda. Em 1957, havia concluido meu mestrado na Purdue University, West Lafayette, USA, na área de eletroquímica, e e estava procurando por um tema atual e motivador para minha tese de doutorado.

Nesta época, consegui um trabalho durante o período do verão no laboratório de pesquisa da empresa Amoco em Whiting, Indiana, ficando responsável por avaliar fases estacionárias para algumas separações cromatográficas.

Um fato marcante neste estágio foi a visita do Dr. A.J.P. Martin, já premio Nobel de Química na época pela proposta da partição, para instalar um detector que havia inventado para cromatografia gasosa, técnica esta também inventada por ele. Seu entusiasmo em pesquisa, vasto conhecimento, e generosidade para transmiti-los, me cativaram e definitivamente me dirigiram para esta área de pesquisa. No verão seguinte trabalhei na empresa Du Pont, em Wilmington, Delaware, diretamente com Steve Dal Nogare, tendo a oportunidade de aprender programação de temperatura em cromatografia gasosa. Foi uma excelente oportunidade para ampliar os conhecimentos em GC, graças aos conhecimentos e entusiasmo de Steve. Em 1959, havendo concluido o doutorado, obtive uma bolsa Fulbright para trabalhar na Holanda com o Professor Keulemans. Tratava-se de um laboratório o qual contava com intensa atividade na área de Cromatografia, e que recebia com frequencia visitantes dentre os quais estavam os principais pioneiros da área, incluindo Martin, Golay, Huber, e muitos outros. Este clima de excelência e a oportunidade de trabalhar próximo de tantos grandes pesquisadores

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Fernando M. Lanças

definitivamente me influenciaram a escolher esta técnica com a qual trabalharia por toda minha carreira científica.

2. Com uma experiência científica tão fascinante obtida no laboratório do Prof. Keulemans, o que fez escolher trabalhar em uma empresa de equipamentos científicos ao invés de iniciar na carreira acadêmica?

Durante meu doutorado eu já tinha em mente que gostaria de ir para a área industrial ao invés da acadêmica, devido a duas motivacões principais: por um lado o salário era bem melhor na indústria e por outro os equipamentos eram bem mais atuais, o que me permitiria desenvolver pesquisas mais interessantes. Na época a Universidade de Purdue não era bem equipada e os salários na indústria eram quase o triplo do valor. Outro fator foi o desafio de resolver problemas do “mundo real” ao invés de discutir apenas idéias abstratas, o que me atraia bastante naquela época. Assim, logo após o Pos Doc na Holanda com Keulemans, quando surgiu uma oportunidade de emprego na área industrial eu estava preparado para ela.

3. Como foi esta experiência na área industrial, após uma excelente formação acadêmica? Na América Latina sempre existiu forte crítica por parte da Academia para com aqueles que desenvolvem trabalhos em colaboração com a indústria. Como você vê esta dicotomia, tão forte na América Latina, onde os países supostamente poderiam se beneficiar da interação academia-indústria?

O laboratório liderado por Keulemans na Universidade de Eindhoven, Holanda, tinha muita interação com a indústria e durante o Pos Doc aprendi que manter uma interface com a indústria seria benéfico para ambas as partes. Por um lado você ajuda as empresas a resolverem problemas que para eles são complexos e, em retorno, ela ajuda seu grupo de pesquisa com instrumentação, manutenção, insumos e outras facilidades. As duas partes ganham. Eu sempre 132

Prof. Harold M. McNair

incentivei muito meus alunos a trabalharem no verão em indústrias, até mesmo para poderem definir se preferem continuar a vida em um ambiente acadêmico ou de indústria. Nos Estados Unidos, é bastante comum os alunos de pós graduação obterem empregos em uma temporada como, por exemplo, durante o verão. Passado o período retornam a suas teses, geralmente com uma visao mais prática e diferente da que tinham antes, além de um ritmo de trabalho usualmente maior.

4. Destaque alguns aspectos da sua trajetória na área industrial Ainda durante minha formação na pós graduação, tive a oportunidade de trabalhar durante quatro verões em companhias americanas de grande reputação; Amoco Refinery em Chicago, ILL; Philips Petroleum Company em Bartlesville, OH; Du Pont em Wilmington, DW; e American Cyanamid em Stamford, CT. Após o período de Pos Doc na Holanda, retornei para os Estados Unidos e no final de 1960 iniciei a carreira como pesquisador na Esso (posteriormente Exxon) trabalhando com colunas capilares em cromatografia gasosa, havendo contado com a ajuda de Marcel Golay, o inventor da técnica. Cerca de um ano depois, passei a trabalhar na empresa F&M Scientific (a qual posteriormente passou a ser chamada de HewlettPackard e, atualmente, Agilent) como Diretor Técnico para operações na Europa. Posteriormente, mudei para a empresa Wilkens Instruments (posteriormente Varian Aerograph, e atualmente dividada em várias empresas) onde fui o Diretor de operações internacionais, Depois de quatro anos na Europa, retornei em 1966 para Walnut Creek, CA, Estados Unidos, como Diretor Geral de Marketing da Varian.

5. Como foi o retorno da área industrial para a acadêmica (oposto ao que a maioria faz) até chegar a Professor Emérito da Virginia Polytechnique Institue and State University Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136

Fernando M. Lanças

Dois anos depois do meu retorno para a California, com a morte de Steven Dal Nogare em 1968, tomei uma decisão profissional difícil e retornei para a área acadêmica na Virginia Polytechnic Institute and State University (Virgina Tech ou VPI&SU), na pequena cidade de Blacksburg, VA. Na verdade, quando me mudei para a Virginia Tech meus planos eram de ficar dois a tres anos e retornar à indústria na área de marketing internacional, de preferência na Europa (minha esposa Marjike é holandesa). Entretanto, depois de dois anos já estava totalmente tomado pelo ambiente acadêmico, com a possibilidade de decidir minha própria linha de pesquisa, ensinar os estudantes, e jogar tênis sempre que queria. Em 1971, tres anos depois, eu já era Professor Titular, havendo sido Chefe do Departamento de Química (1990-1992) e atualmente Professor Emérito.

6. No início de sua carreira científica, você começou uma série de cursos de curta duração (“short courses”) com a American Chemical Society, os quais foram muito populares nos Estados Unidos e em outros países. Na verdade, esses cursos ainda são um tremendo sucesso. Você também escreveu o livro “Gas Chromatography” o qual foi o livro mais vendido na área de Cromatografia de todos os tempos, com tradução em vários idiomas. Como surgiram as idéias dos cursos e do livro?

Quando vivi em Amsterdam (1962-1964) percebi que os europeus tinham grande interesse em seminários, cursos experimentais de treinamento, livretos e qualquer coisa que os auxiliasse a aprender cromatografia gasosa.

Com exceção dos ingêses e holandeses, a maior parte da Europa sabia muito pouco a respeito da cromatografia gasosa. O livro sobre GC, por exemplo, nasceu de um curso ministrado na Universidade de Atenas, Grécia, em 1963, quando trabalhava na empresa F&M Scientific.

O material preparado para o curso de quarto dias serviu como primeiro rascunho do que seria depois o livro. Quando em 1965 mudei para a Varian, criei um curso de treinamento em GC com experimentos. O curso foi oferecido nos Estados Unidos, Canadá, Austrália e

Prof. Harold M. McNair

México, com grande sucesso. Quando mudei finalmente para o Virginia Tech, levei comigo o modelo dos cursos e livros sobre GC. Isto facilitou o treinamento dos meus alunos, assim como ajudava a recrutar novos alunos e as empresas fabricantes de equipamentos tinham interesse em que empregássemos seus intrumentos nos cursos, como forma de divulgação. Vários deles acabavam sendo doados para o laboratório e os alunos de pós graduação passavam a usá-los nas teses. Ou seja, todos ganhavam.

7.

Você foi um dos fundadores do COLACRO, Congresso LatinoAmericano de Cromatografia, juntamente com os professores Lanças (Brasil), Cramers (Holanda) e Sandra (Bélgica). Considerando sua forte interação com muitos cientistas da América Latina, vários dos quais foram seus alunos no Virgina Tech, assim como suas inúmeras viagens a este continente, como você vê o papel da Cromatografia na América Latina?

A Cromatografia tem hoje um papel relevante em praticamente todas as áreas das ciências modernas, e não poderia ser diferente na América Latina. Vi, com enorme satisfação, o surgimento do COLACRO como uma entidade capaz de congregar os pesquisadores da área até então espalhados na América Latina. Desde o primeiro evento, realizado no Rio de Janeiro em 1986, percebi a qualidade dos trabalhos apresentados e o potencial da técnica para ajudar a alavancar vários aspectos das pesquisas acadêmicas e industriais nesta região. Logo depois do primeiro COLACRO, juntamente com Lanças, Cramers e Sandra fomos para a Bahia onde ministramos vários cursos no polo petroquímica de Camaçari, então iniciando suas atividades.

Participamos de vários debates com os funcionários das indústrias, ocasião na qual pudemos ajudá-los a melhorar o controle de qualidade do polo, e orientamos pessoas locais para duplicar os treinamentos depois de nossa partida. Foi uma experiência muito interessante, além de havermos conhecido melhor um pouco do país.

Nos próximos eventos pude acompanhar o crescimento

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Fernando M. Lanças

qualitativo e quantitativo dos trabalhos apresentados e das discussões durante o evento. Além de contribuir na formação de inúmeros pesquisadores da América Latina, o COLACRO permitiu iniciar-se uma colaboração mais intensa entre pesquisadores da América Latina com outros países, notadamente dos Estados Unidos e Europa. Isto ampliou muito as publicações científicas da América Latina em periódicos de qualidade na área de Cromatografia. Mais de 200 pesquisadores, dentre os mais importantes na área (Giddings, Huber, Kaiser, Schomburg, Bertch, Sandra, Cramers, Horvath, Novotny, Lee, Jinno Fenselau, MacLafferty, para mencionar apenas alguns) participaram dessa série de eventos, trazendo o estado-da-arte na área de Cromatografia para a América Latina. Hoje existem vários grupos que se destacam atuando nesta área na América Latina, com um crescimento importante na produção mundial de conhecimento na área de cromatografia e técnicas relacionadas.

8. Você orientou vários alunos no Doutorado e supervisionou vários pesquisadores em programa de Pos Doc. Muitos deles hoje trabalham em indústrias, enquanto que outros são renomados docentes em universidades. Você ainda mantém um bom contato com a maior parte deles, inclusive com encontros periódicos. Qual seu sentimento a respeito dessa interação após tantos anos?

Essa interação com os estudantes foi o principal fator que me manteve na área acadêmica todos esses (50) anos todos. A eterna curiosidade dos mesmos, a vontade de aprender, a troca de experiências sempre me fascinaram muito. Sempre procurei estimular o contato com meus ex-alunos, de maneira a mantermos esse relacionamento vivo. Praticamente todos os anos marco um jantar com meus ex-alunos durante a PittCon (USA); a cada dois anos faço o mesmo em relação ao Congresso de Riva (na Itália). É uma oportunidade para atualizarmos nossos conhecimentos, saber mais a respeito da carreira de cada um, e contarmos boas piadas regadas a boa comida e um bom vinho.

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Prof. Harold M. McNair

9. Qual o principal legado que você acredita ter deixado para seus ex-alunos?

Quando penso nos especialistas com os quais trabalhei, incluindo premios Nobel e outros pioneiros da área, noto que todos tinham uma caracterísica em comum: a vontade de dividir suas idéias com todos os interessados. Eu era fascinado por todos eles, e sabia que eram mais espertos do que eu; eles me “colocaram” na cromatografia gasosa, minha grande paixão científica por toda a carreira. Assim, o que eu espero é que de alguma forma eu tenha conseguido passar esse entusiasmos a meus colegas, estudantes de pós graduação e os pesquisadores Pos Doc. Uma vez perguntaram a um de meus ex-alunos se ele havia aprendido bastante química comigo. Ele respondeu que a química ele aprendeu facilmente. Além disso, aprenderam como beber cerveja, como viajar ao redor do mundo, como ficar acordado até tarde entretendo pessoas e no dia seguinte apresentar uma palestra às oito horas da manhã. Nós aprendemos do Professor McNair como viver e aproveitar a vida.

10. Você poderia enviar uma mensagem final aos leitores do Scientia Chromatographica?

Sim. Como disse meu bom amigo e padrinho de casamento Carl Cramers a respeito de nós dois e da cromatografia, “nós estávamos no lugar certo, no momento certo”. Aproveitem as oportunidades e vivam a vida.

Resumo do Curriculo Vitae do Professor Harold McNair Harold Monroe McNair was born in Miami, Arizona (USA). He studied at the University of Arizona, Tucson, graduating with a BS degree (Magna cum Laude) in Chemistry in 1955. Shortly after, in 1957, he received his M.S. degree (with a thesis in electrochemistry), and in 1959 his Ph.D. degree (with a thesis on gas chromatography), both degrees in Analytical Chemistry from Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA. Shortly after, he spent one Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136

Fernando M. Lanças

year as a Fulbright Postdoctoral Fellow at the Eindhoven Technical University, Eindhoven, The Netherlands, in the laboratories of Professor A. I. M. Keulemans. In this place he first met Marjike, the laboratory secretary that became his wife for the whole life.

Returning from Eindhoven, Harold was hired at Esso Research & Engineering, in December 1960; in 1961 he joined F & M (later Hewlett- Packard Division in Wilmington, USA, now Agilent Technologies) and in 1963, moved to Wilkens Instruments (later Varian Aerograph and now fragmented in different companies).

In 1968, after the death of Steven Dal Nogare, Harold returned to the academia environment by joining Virginia Polytechnique Institute and State University (VPI&SU), in Blacksburg, VA, USA. He became Professor of Chemistry in 1971 and served as the head of the Chemistry Department between 1990 and 1992 were he is now an Emeritus Professor since 2002.

In spite of being the author or coauthor of over 100 scientific and technical papers, 14 book chapters and six books (two in Spanish), probably his most important activities are those of a teacher, both at VPI and outside.

At VPI, over 50 students have completed MS and Ph.D. theses under his supervision, being his graduates much sought by research institutions and industrial laboratories. A large number of Pos Docs supervised by him, are now leaders in the separation sciences in several countries around the world, giving continuity to him work

Prof. Harold M. McNair

initiated at the Virginia Tech almost half century ago. He has being also actively engaged in giving short courses on various aspects of chromatography for the American Chemical Society (ACS) and other organizations. He participated in 1967 in the first ACS Short Course ever offered (on GC); since then, he has taught at more than 180 courses [1-3]. As teaching aids, he prepared several educational movies and audio-visual programs on gas and liquid chromatography. A most representative moment of his professional carrier would have to include his main scientific passion: how to explain to a novice the importance of chromatography, as in the Chromedia video course on Gas Chromatography [3] .

A summary of Dr. McNair’s awards during his professional carrier would include the IR-100 Award as the co- inventor of the CIRA GC/IR system (1975); the VPI Alumni Teaching Award (1983); the Eastern Analytical Symposium’s Award in Chromatography (1989); the K.P. Dimick Award (1991); the Tswett Medal (1993); the Dal Nogare Award (2001); the Horvath Medal (2003) and the LCGC Lifetime Achievement Award (2009); amongst others. In 1986 he received the first COLACRO Medal for Contributions to Chromatography in Latin America.

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136 135

Fernando M. Lanças

Prof. Harold M. McNair

Referências [1] Kevin Schug, “Icons of Chromatography: Harold McNair”, LCGC North America, Vol. 30, Issue 2, pp. 134-141 (2012).

[2] Fernando M. Lanças, recorded interview with Professor Harold McNair, 2013.

[3] http://www.youtube.com/watch?v=ljz43nJNLFs, accessed November 14, 2013.

[4] Harold M. McNair, A History of Gas Chromatography: My Early Experiences. LCGC North America, vol.28 (2) 138-144, 2010.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3):129-136

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):138-149 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.009 ISSN 1984-4433

HRGC

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography Abhijit Ghosh Milton L. Lee* Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, Provo, UT, 84602 USA *milton_lee@byu.edu

Abstract

Although silicon-glass hybrid systems have been most commonly used to fabricate microchip columns for miniaturized gas chromatography (GC), a variety of other materials have been investigated. These include all-glass microchips, various polymers alone or in combination, and different metal substrates. This review gives an overview of the different substrates used in making microchip GC columns, and provides a discussion of their advantages and disadvantages for use in microchip fabrication and separation performance.

Keywords: Gas Chromatography, Microship, Microfabrication, Substrate, Miniaturized GC.

1. Introduction

The widespread applicability of gas chromatography (GC) has generated significant recent interest in development of miniaturized and handportable systems. Such instruments are advantageous over bench-top instruments for applications in which it is desirable to move the instrument around the laboratory, place it in close proximity to other instruments, position it next to a process stream or batch manufacturing system for monitoring, or take it out of the laboratory for on-site or point-of-care analysis[1]. As is well known, the most critical component of the GC is the column in which the separation takes place.

Since 1979, with the introduction of the first silicon microchip column by Terry et al.[2], there has been tremendous interest among researchers in fabricating microchip GC columns in planar substrates[3] in contrast to using fused silica open tubular capillary columns, which, interestingly, were also first reported[4] in the same year (i.e., 1979). The first attempt to fabricate a 138

microchip GC column in a substrate other than silicon was reported by Noh et al.[5] in 2002, for which they used parylene C [poly(monochloro-p-xylene)]. The popular GC stationary phase polymer, polydimethylsiloxane or PDMS, was investigated as a microchip GC substrate several years later by Malainou et al.[6]. Another polymeric material that was investigated for use as a disposable microchip column substrate was silane-doped epoxy[7].

A substantially monolithic structure formed from greensheet ceramic layers sintered together was proposed by Briscoe et al.[8] without showing any results; however, in 2013, Darko produced several ceramic columns as part of his master’s thesis[9] and analyzed mixtures of normal hydrocarbons and BTEX. Subsequently, in the same year, he coauthored a report[10] on the novelty of the ceramic platform in microchip GC. The viability of using metal as a substrate for microchip GC was first investigated by Bhushan et al.[11] in 2004. The reasons that prompted such investigation Scientia Chromatographica 2018; 10(3)

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

Ghosh A and Lee ML

included column (i.e., microchip) robustness and ability to accommodate high temperatures[12,13]. While Bhushan et al. used nickel as substrate, other metals, such as stainless steel[14,15] and titanium[16] were investigated by other researchers. It is worth mentioning here that the vast majority of microchip columns that have been reported have been etched in silicon and anodically bonded to a top glass cover[3]. An all-glass microchip GC column was first reported by Halliday et al.[17] in 2010 and later explored to a limited extent by other researchers[18].

Although remarkable progress has been made in micromachining that has allowed the etching of channels in a variety of planar substrates[3,19], the search for an ideal substrate still continues among researchers.

There are several reasons and motivations behind this; for instance, silicon may seem to be ideal because of its established micromaching technology and its similarity to fused silica capillary columns in terms of surface chemistry. However, the currently used method of connecting the microchip to inlet and outlet capillary leads for interfacing to injector and detector, i.e., using adhesives, is prone to leakage and cannot be exposed to high temperatures[20,21]. All-glass substrates are seldom used because the active surface leads to peak tailing for polar analytes, similar to what was experienced years ago with glass open tubular columns, and glass exhibits poor heat conductivity[3].

Unfortunately, there is no perfect material identified to date to use as substrate for microchip GC. This review explores the different substrates that have been reported for microchip GC column technology, and emphasizes their advantages and disadvantages.

2. Substrate Materials 2.1. Silicon

Silicon has the distinction of being the substrate used for the first ever microfabricated analytical device[22], which just happened to be a microchip GC column. It was fabricated by Terry et al.[2] in 1979 (Figure 1). The motivation was to create a lightweight, rugged, portable GC system for the exploration of

Figure 1. Photograph of the first microfabricated silicon column on a 5Â cm silicon wafer with other integrated components[22]. Reproduced with permission from the Royal Society of Chemistry.

Mars by NASA[23]. Since then, silicon continues to be the most popular substrate[3] in which to micromachine channels for microchip GC columns. Figure 2 shows the dominance of silicon in comparison to other substrates.

There are many advantages of silicon substrates: (1) They can be fabricated precisely in batches using already established semiconductor micromachining technology[24].

(2) Silicon is mechanically stable and resistant to most chemicals and organic solvents.

(3) There are various bonding techniques available to cover etched silicon microchannels with silicon or glass plates to form a hermetically sealed device[25].

(4) The well-established silanol (Si-OH) surface chemistry that is key to fabrication of highperformance capillary GC columns can be easily modified and implemented for silicon microchannels[3].

(5) Silicon also provides low thermal mass, uniform thermal distribution, and high thermal conductivity[26]. These thermal features are extremely attractive because temperature is the most important programming variable in GC.

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Figure 2. Comparison of substrate materials used in microchip fabrication. Recreated from Ref. 3.

Fabrication of silicon microchip GC columns follows the well-established procedures of wet and dry etching[19]. Etching is the process by which material is chemically removed from its surface. By using etching techniques, channels with different column geometries and holes can be produced in the silicon wafers. Wet etching is the simplest type of etching and has been used in semiconductor processing since the early 1950’s, and essentially consists of immersing the substrate in a liquid chemical or mixture of chemicals which eat away any exposed surfaces to form soluble by-products.There are two main options for wet etching of silicon: isotropic and anisotropic. In isotropic etching, hydrofluoric (HF), nitric (HNO3) and acetic acids (CH3COOH) are used, and etching occurs in all crystallographic directions at the same rate to remove exposed substrate material and some material under the mask[26]. In anisotropic or orientation dependent etching, a chemical such as KOH attacks silicon preferentially in a plane, producing a characteristic anisotropic V-etch[27]. Other anisotropic wet etchants include ethylene diamine pyrocatechol and tetramethylammonium hydroxide[28]. The residue deposition from KOH etching of Si is typically regarded as a disadvantage of this technology[29].

As an alternative to wet etching, channels in silicon wafers can also be created by dry etching, which does not involve liquid chemicals. It is a widely used process since it is easier to control and is capable of 140

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

defining precise features smaller than 100 nm. However, the main purpose of dry etching is to generate anisotropic etch profiles. In the dry etch process, material is removed by reactive gases or plasmas, physical sputtering and ion beam-induced etching, or by a combination (reactive ion etching). The most popular dry etching process used in GC microchip fabrication is deep reactive-ion etching (DRIE). This method usually consists of two alternating cycles: etching and passivating. During etching, shallow isotropic trenches are formed in the silicon substrate with SF6. However, during passivation, a Teflon-like protective fluorocarbon film is deposited on the trench walls using C4H8 gas. In the subsequent etching cycle, ion bombardment promotes the preferential removal of the film from all horizontal surfaces, creating highly anisotropic features[30].

The etched silicon wafer is bonded to another plate (typically silicon or glass) to create a sealed GC column. Surface properties and cleanliness significantly influence the process. The presence of any particles on the bonding surface usually leads to bonding failure.

The most common bonding procedure used for silicon microfabricated GC columns is silicon/glass anodic bonding, in which a Pyrex glass top is placed on top of the silicon wafer, enclosing the microchannel[3]. Since both glass and silicon remain rigid during the process, it is possible to bond glass to a silicon surface without affecting the features[31]. In this process, the two wafers are held together on a hot plate (300–450°C) and a high DC voltage (400–1000 V) is applied to the pair such that the glass becomes negative with respect to the silicon. During the process, alkali cations in the glass are depleted from the vicinity of the anode and transported toward the cathode. For most glasses used for anodic bonding, conduction is primarily realized by Na+ ions and, to a lesser extent, by K+ ions. As the Na+ and K+ions are displaced toward the cathode, they leave an alkalidepleted region near the anode with negative (O2−) space charge at the interface. This depletion region generates a large electric field between the silicon and Pyrex wafers, and they are pulled together where oxygen combines Scientia Chromatographica 2018; 10(3):138-149

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

with silicon to form irreversible Si-O-Si bonds (SiO2 film) between the silicon and glass substrates[32,33].

Other than anodic bonding, silicon microchip fabrication can also utilize various fusion bonding techniques. Yu[34] first used this in fabricating an allsilicon 5.6 m column in a 3-in. silicon wafer. In fusion bonding of silicon, two oxidized silicon wafers are first weak bonded at room temperature, followed by annealing at 1,100 °C. Wang et al.[21] reported siliconto-silicon fusion bonding to produce columns up to 2.7 m long. Ghosh et al.[20] also reported a 5.9 m long microchip column that was fusion bonded. In addition to silicon-to-silicon fusion bonding, glass covers could also be bonded to silicon[35]. Gold diffusion bonding was used

by Radadia et al. for fabricating an all-silicon microchip GC column[36]. In this process, a bonding layer of eutectic alloy such as gold (Au) was formed at the interface at a specific temperature[37]. Navaei et al.[38] used eutectic fusion bonding of silicon to silicon in fabricating a 3 m microchip column. Eutectic diffusion bonding is much more forgiving to surface flatness, deformities and contamination compared to direct fusion bonding of silicon to silicon[39].

The demerits of silicon-glass microchips arise from the fact that when a glass cover is bonded to an etched silicon wafer, there can be mismatch of thermal properties of the two materials, resulting in uneven heating and expansion. This can be avoided by fabricating all-silicon microchips. Another problem that limits the applicability of both silicon-glass and all-silicon microchips is the adhesive-based interfacing that is typically used to connect capillary tubes to the chip for sample introduction and detection. As most of the adhesives are unstable at high temperature and have significantly different coefficients of thermal expansion (CTE) compared to silicon and glass, leakage tends to develop after thermal cycling[20]. Although there are reports of compression-based interfacing[20,40] that overcomes this problem to some extent, most interfacing continues to utilize adhesives[3]. Furthermore, it is very

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difficult to minimize dead volumes at the interfacing when using adhesives. Another characteristic that is often overlooked is that silicon microchips are brittle at high temperature, which is disadvantageous for portable instrumentation. On the positive side, because of the similarities between an oxidized silicon surface and a fused silica capillary surface, a well-deactivated and coated silicon microchip is expected to provide comparable analytical performance. Although there are encouraging reports, nonetheless, the full potential of silicon microchip GC columns is yet to be realized due to issues related to interfacing, dead volumes and uniform coating.

2.2. Glass

In contrast to silicon, which is opaque and conductive, glass is optically transparent and electrically insulating. Quartz and borosilicate glass (Pyrex) wafers have found acceptance in CE and LC microchip technology[41,42]. However, in GC, their use has been limited[3]. As discussed in the previous section, the major exception is that glass is used extensively in silicon-glass hybrid columns where the channel is etched into the silicon surface, followed by anodic bonding of a glass cover plate. As a material, glass can be advantageous[3,43] for the following reasons: (1) The use of glass is economical.

(2) Glass is chemically resistant to many chemicals and solvents.

(3) Glass has silanol surface chemistry similar to silica.

(4) Glass is not permeable to the carrier gas.

(5) Micromachining of glass is similar to the wellestablished technology for silicon.

However, fewer examples exist for glass fabrication than for silica most likely because glass dopants and metal oxide impurities lead to analyte adsorption and peak tailing. The poor heat conductivity of glass is also a disadvantage in microchip GC. Other

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disadvantages include lower fabrication yield, often due to unpredictable surface conditions, and irreproducible bonding quality[3]. The first microchip GC column in glass was reported by Lewis et al.[44]. Usually, glass is patterned with methods coming from the semiconductor industry using photolithography. During fabrication, polished glass surfaces are coated with an adhesion layer of titanium or chromium before application of a photoresist with the desired pattern. The light-sensitive photoresist is exposed to light to uncover the glass surface for etching. Common isotropic etchants for glass are hydrofluoric acid alone or in buffered form (HF/ NH4F)[45]. On the other hand, dry etching techniques can generate an anisotropic profile on glass, using a variety of etchants: C3F8, CHF3, CF4/CHF3, SF6/Ar, SF6, CF4/O2 and CF4/Ar[46].

Microchip columns fabricated by Lewis et al.[44] used two glass (Schott B270) wafers (one 0.5 mm thick, the second 2.5 mm thick) with a channel chemically etched (HF) in the thicker wafer, and the thinner wafer bonded on top to form an enclosed column. A cold bonding technique that relies on the flatness/smoothness of the surface and van der Walls forces was used to hermetically seal the chip. Chips fabricated in this manner could withstand pressures up to 50 bar. Figure 3 shows a microchip column fabricated in glass[47].

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

Qin and Gianchandani[18,48] reported several borosilicate glass microchip columns for integrated systems that were fabricated using micro abrasive jet machining (sand blasting). Sand blasting is known to be an economical way of microfabricating substrates such as glass or silicon. In this process, a mask containing patterned holes for the desired geometry is placed over the substrate. Next, a beam of compressed air containing fine grains of silicon carbide is directed towards the mask, which removes material from the exposed surface[45]. The sand blasted features typically have a 22° taper and a corner radius of 125 µm. In this study[18], the channels were enclosed using an adhesive bonding technique. Adhesive bonding is a simple, robust, low-cost bonding procedure used to bring two surfaces together with the help of an intermediate layer.

Polymers, glass, photoresists and polyimides are some of the materials suitable for intermediate bonding layers[26].

An epoxy photoresist, SU-8, was spin-coated over the microfabricated separation channel, which smoothed the sand blasted surface and also served as an adhesion layer.

An adhesion promoter was used for better sealing. Once the two parts were aligned and compressed together, a series of soft baking steps at 150 °C and 95 °C were followed by exposure to UV radiation and hard baking at 150 °C. Sun et al.[49] fabricated a silicon/glass packed column where channels were etched into both the silicon and glass plates using a laser. During laser etching, a photochemical reaction occurred within the glass that created a high density of nanocrystals within the critically exposed volume. However, burrs were created on the edges due to laser ablation that caused difficulties in bonding. This was overcome by polishing the etched substrates before bonding.

Figure 3. A 100 mm x 100 mm glass microchip with fluidic connector[47].

Reproduced with permission from Dolomite Microfluidics, UK. 142

Despite their similarities to silicon, few studies of glass microcolumns have been reported in the literature.

While wet etching and sand blasting are simple methods for glass micromachining, wet etching is not precise due to isotropic etching behavior and sand blasting is limited Scientia Chromatographica 2018; 10(3):138-149

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

due to difficulty in creating small patterns because of low dry film resist resolution and large powder particle size[50]. On the other hand, properly deactivated fused silica/glass columns should produce column efficiencies comparable to fused silica open tubular columns, and the transparent nature of the glass can be helpful in tracking the solvent meniscus during static coating.

2.3. Ceramic

Low temperature co-fired ceramic (LTCC) is an aluminum oxide-based material that is processed in layers, assembled together, and then fired at elevated temperature[42]. This substrate has been recently used for microfabrication of lab-on-a-chip devices such as for capillary electrophoresis and liquid chromatography[51,52].

Some properties of ceramics that can be advantages in microchip GC fabrication include[10,45]: (1) Ceramics possess high thermal and chemical stabilities.

(2) Ceramic microchips are suitable for applications in harsh environments (robustness).

(3) Fabrication of ceramic microchips can be low cost and rapid without the need for a clean room environment.

(4) The ceramic monolithic design eliminates the need for sealing.

The concept of a ceramic column in microchip GC was first introduced by Briscoe et al.[8] (US Patent US 6527890 B1) in 2004. However, it was not supported by any analytical data. In 2010, Adkins and Lewis[53] (US 2011/0226040 A1) also mentioned ceramic as a possible substrate among others in describing a “folded passage column” design that was formed by joining a first channel in a surface through a slot to a second channel in a second surface. However, the first ceramic microchip GC columns were fabricated by Darko[9] in 2013 using low temperature co-fired ceramic tiles and reported in his master’s thesis. Microchips with various column lengths ranging from 0.1 m packed to 15 m open tubular were fabricated with C18 particles and PDMS

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coatings, respectively, as stationary phases. Although the possibility of using such substrates was demonstrated, chromatograms produced using the resultant microchip columns were not very impressive. For instance, a C8-C20 n-alkane mixture suffered from baseline rise even with moderate temperature programming (i.e., 45-210 °C at 5 °C/min), while a mixture containing compounds with various functional groups resulted in chromatograms exhibiting uneven baseline and poor peak shapes. The poor results were justified by claiming that such diminished chromatographic behavior was a result of poor coating procedure. For instance, when stationary phase was deposited onto the ceramic surface, it was speculated that much of the reactive oxide surface was left exposed, which would be eliminated with multiple layers of coating. Another disadvantage that can be anticipated with ceramic substrates is their high porosity and channel roughness, which may lead to cavitation during static coating.

Fabrication of ceramic microchips involves a four-step process: texturing, stacking, laminating and co-firing. Texturing can be done by various methods such as punching, embossing, laser cutting, etc. Darko et al.[10] patterned a 115 µm x 12.7 cm x 12.7 cm green unfired ceramic tile using an ultraviolet laser to machine the channel. A channel layer tape was then sandwiched between two capping tape layers of 250 µm thickness.

The top layer had 100 µm through-holes that could be aligned with the inlet and outlet of the channel. The assembly was then laminated in a uniaxial press at 70°C to seal the layers together. The sealed unit was then placed in a box furnace for sintering at a temperature of 850 °C. Figure 4 shows a microchip GC column fabricated within a low-temperature cofired ceramic.

2.4. Metal

Capillary columns made from stainless steel, nickel and to a lesser extent copper have been in use for many years[54]. However, in the area of microchip GC, the use of metal substrates was initially investigated

by Bhusan et al.[11]. They were concerned that the early

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Figure 4. A 15 m long and 100 μm wide microchip column fabricated in a ceramic substrate[10]. Reproduced with permission from the American Chemical Society.

silicon-glass hybrid columns were limited primarily to isothermal operation because of high thermal capacitance that prevented them from being used with rapid temperature programming. Such column salso suffered from thermal expansion mismatch during temperature program cycling. They initially briefly reported the fabrication of nickel columns in 2004 using a combination of micromachining and electroplating.

Other column materials were investigated in subsequent studies[14-16]. Metal columns are attractive primarily because of two reasons: their robustness and high temperature compatibility.

A unique microfabricated GC column using stacked nickel substrates was reported by Lewis and Wheeler[55] (US 7273517 B1) in 2005. Each planar substrate had a machined serpentine channel and a through-hole at the end of the channel, which connected to the channel in the following substrate, except for the top substrate that only had an inlet hole. In this design, a continuous channel (i.e., column) was formed from the inlet (i.e., top of the stack) to the outlet (i.e., bottom of the stack). A related design, called a “folded passage column” was put forward by Adkins and Lewis[53] (US 2011/0226040 A1) in 2010, for which metal was listed as a possible substrate. A metal microchip column based on this design is used in the portable gas chromatograph recently commercialized by Defiant Technologies[56].

The desire to make a rugged microchip column led to the investigation of stainless-steel as a substrate by Iwaya et al.[15]. In 2012, they reported the fabrication of columns approximately 3 m in length fabricated in stainless144

Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography

steel. Thurbide and co-workers[9,16] investigated the use of titanium tiles as a substrate material for microchip GC columns. They fabricated 0.1 m packed and 5 to 15.0 m open channels in 2013 and 2017. Even though one of the primary goals of the metal microchip columns was to separate nonvolatile analytes that required high temperature, it wasn’t until 2018 that Ghosh et al.[14] and Lee et al.[57] first reported the use of a 10 m long statically coated stainless-steel microchip column for the separation of semi-volatile compounds at temperatures up to 350 °C. Figure 5 shows a 10 m x 120 µm x 60 µm stainless steel metal microchip column[14].

The LIGA technique was used by Bhushan et al.[12,13] for fabricating metal microchip columns. LIGA is a German acronym consisting of LI (lithographie for lithography), G (galvanik for electroplating) and A (abfonnung for replication technique, such as molding).The LIGA technique reported by the authors was based on X-ray lithography using synchrotron radiation. The mask consisted of a 2 µm thick silicon nitride membrane with approximately 10 µm thick gold absorber. X-ray sensitive polymethylmethacrylate was used as a resist material. To produce 0.5 and 2 m long nickel columns, silicon wafers were used as sacrificial substrate on which a layer of titanium was grown. Next, a polymethylmethacrylate wafer was bonded to it and exposed to X-rays. The exposure caused bonds to break in exposed areas of the polymethylmethacrylate, but remain intact in unexposed areas under the mask. When placed

Figure 5. A 10 m x 120 μm x 60 μm stainless steel microchip column[14].

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in a chemical developer, the exposed areas were washed away, creating a pattern in the polymethymethacrylate.

Next, Nickel was electrodeposited on the top of the polymethylmethacrylate mold, and then overplated and polished. Then the silicon wafer was completely wet-etched from the bottom and sealed with another layer of electrodeposited nickel. Finally, the polymethylmethacrylate was removed by heat to create a high aspect ratio channel. LIGA was also used by Lewis and Wheeler[55] for fabrication of microchip GC columns by connecting an array of vertical channels in planar nickel substrates.

Fabrication of stainless-steel columns by Iwaya et al. involved 0.5 mm thick stainless-steel plates that were wet-etched to generate a semi-circular cross section. Then, the two plates were bonded together by diffusion. A proprietary method was used to etch channels in stainless steel substrates as reported by Ghosh et al.[14], that involved stacked layers that were also diffusion bonded to create a hermetically sealed microchip. Electrochemically etched titanium tiles were first evaluated as substrates for microchip columns (0.1 to 15 m) by Darko[9] in 2013. In 2017, Raut and Thurbide[16] also investigated the potential use of titanium tiles by reporting a 7.5 cm x 15 cm rectangular monolithic device that contained 5 m x 100 µm wide channels. In both cases, diffusion bonding at elevated temperature was used.

[15]

The demerits of metal columns arise from the fact that, compared to other substrates, fabrication in metal is cumbersome and can be very expensive. Metal surfaces also require additional deactivation, such as vapor deposition of silicon, to mask the reactive sites.

2.5. Polymeric Organic polymers have been extensively investigated for microfluids in the last two decades.

The availability of different polymeric materials with diverse properties, such as mechanical stability, thermal characteristics, surface chemistry, etc., make them

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attractive for fabrication of microchip devices. They are advantageous because of the following reasons[25,42]: (1) Fabrication of microchips from polymers is inexpensive.

(2) Microchips from polymers are amenable to mass production (hot embossing, molding, etc.).

(3) Polymeric microchips can be designed such that they do not absorb water.

The first polymeric microfabricated GC columns were reported by Noh et al.[5] in 2002. In their work, 100 µm wide x 350 µm deep microchannels were etched into silicon wafers. A 5 µm thick parylene layer was deposited over the channels, followed by sputtering a 1 µm thick platinum layer over the parylene layer.

Finally, another layer of parylene was deposited over the top of the platinum layer. The metal film was added for two reasons: (1) to reduce gas permeability of the parylene in order to prevent oxidation of the stationary phase and (2) to aid uniform distribution of heat. A parylene-coated Pyrex glass plate was compression bonded to seal the column hermetically. After bonding, the silicon wafer was wet-etched, leaving a free-standing parylene column.

Malainou et al.[6] reported the fabrication of a microchip GC column made from poly(dimethylsiloxane), i.e., PDMS, by casting in a mold. The mold was formed from a photosensitive SU-8 resist, which was spun on a silicon wafer and patterned. A solution of PDMS was cast over the mold and thermally cured to produce the elastomer substrate. Finally, a PMMA plate covered with liquid PDMS was used for sealing. MacNaughton et al.[58,59] also reported an on-chip gas analysis system using a PDMS microchip column for both structural and functional purposes, which the authors believed would be advantageous (Figure 6) because it eliminated the tedious process of coating the microchip channels. The channels were formed by standard micro molding with SU-8 photoresist on a silicon wafer and sealed with a glass wafer. Before sealing, both the glass wafer and

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Figure 6. Microchip column on a PDMS substrate (by permission of the authors, Ref. 59).

micro molded PDMS channels were modified using an oxygen plasma to facilitate irreversible covalent bonding.

Rankin and Suslick[7] reported a disposable GC microchip column fabricated by polymer replication from a reusable mold. The polymer was a combination of an organosilane mixed with epoxy. The reusable mold was made out of polychlorotrifluoroethylene with negative relief. The microchip columns were produced by casting a thermoset prepolymer into the mold, degassing under vacuum and curing. After curing, the imprinted pieces were removed from the mold, sealed with a bottom layer of partially cured thermostat polymer and cured again. The authors suggested that an ideal polymer microcolumn could be made out of a polymer that self-segregates into permeable and impermeable surfaces. Therefore, 10 wt% diethoxydimethylsilane was doped with epoxy to create phase separation and surface segregation upon curing. The authors proposed that the siloxane-rich domain acted as a stationary phase and the epoxy polymer served as a structural material.

146

Although various possibilities for fabrication of microchip columns out of polymers have been reported, the chromatographic performance of such columns has not been impressive. Again, polymers like PDMS are permeable to gas, which can lead to stationary phase degradation by oxygen in the air. The major limitation of PDMS for GC is its relatively low upper temperature limit (usually below 200 °C).

3. Conclusions

Microchip columns fabricated from various substrates have certainly offered an alternative to fused silica capillary columns; however, the performance of such columns generally do not match the high performance of conventional open tubular capillary columns. A careful choice of substrate, along with improvements in interfacing, dead volume reduction and uniform stationary phase deposition will be important for further advancement and ultimate adoption of this technology.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.010 ISSN 1984-4433

HPLC

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT) em cromatografia líquida miniaturizada Open tubular columns internally coated with a porous layer (PLOT) in miniaturized liquid chromatography Juliana Soares da Silva Burato, Fernando Mauro Lanças* Instituto de Química de São Carlos – USP, São Carlos, Brasil Universidade de São Paulo, Avenida Trabalhador São-carlense, 400, CEP 13566-590, São Carlos - SP - Brasil *flancas@iqsc.usp.br

Resumo

A cromatografia líquida está evoluindo para a miniaturização a fim de alcançar melhores níveis de eficiência, seguindo os passos da cromatografia gasosa. O principal aspecto da miniaturização é a diminuição do diâmetro interno das colunas analíticas. As principais vantagens são a possibilidade de analisar amostras com pequenos volumes, aumento da eficiência de separação, e menor gasto de fase móvel e estacionária, de acordo com os princípios da Química Verde. Dentre as colunas miniaturizadas, as tubulares abertas do tipo PLOT (OT-PLOT-LC) se destacam devido à sua reduzida capacidade de carga, maior permeabilidade e eficiência de separação. No entanto, para uma melhor eficiência há a restrição de possuírem diâmetros internos iguais ou menores a 10 µm. Essa característica impõe limitações instrumentais, como a necessidade de um sistema especial de introdução de amostras e detectores com células de detecção de baixo volume, fatores responsáveis por retardar sua difusão comercial e estudo. Entretanto, o desenvolvimento de equipamentos capazes de operar em escala nano, com baixo fluxo e reduzido volume de fase móvel, tornaram-se propícios para a hifenização com espectrometria de massas, utilizando como forma de ionização impacto de elétrons ou eletrospray (PLOT-LC(ESI)MS E PLOT-LC(EI)-MS). O objetivo deste trabalho é relatar e discutir alguns dos principais pontos relacionados a miniaturização das colunas analíticas em cromatografia líquida, com destaque para as colunas tubulares abertas do tipo PLOT. Palavras chaves: Cromatografia Líquida miniaturizada, OT-PLOT-LC, PLOT-LC(ESI)MS E PLOT-LC(EI)-MS.

Abstract

Liquid chromatography is evolving to miniaturization in order to achieve better levels of efficiency, following the steps of gas chromatography. The main aspect of miniaturization is the reduction of the internal diameter of the analytical columns.

The main advantages are the possibility of analyzing samples with small volumes, increased separation efficiency, and lower mobile and stationary phase expenditure, according to the principles of Green Chemistry. Among the miniaturized, the porous layer open tubular column (PLOT) (OT-PLOT-LC) stands out due to their reduced load capacity, higher permeability and separation efficiency. However, 150

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for better efficiency there is a restriction of having internal diameters equal to or less than 10 µm. This feature imposes instrumental limitations, such as the need for a special system for introducing samples and detectors with low-volume detection cells, which are responsible for delaying their commercial diffusion and study. However, the development of equipment capable of operating at a nano scale, with low flow and low mobile phase volume, has become suitable for hyphenation with mass spectrometry, using as an ionization form electron impact or electrospray (PLOT-LC(ESI)-MS and PLOT-LC (EI)-MS). The objective of this work is to report and discuss some of the main points related to the miniaturization of analytical columns in liquid chromatography, with emphasis on open tubular columns of the PLOT type.

Keywords: Miniaturized Liquid Chromatography, OT-PLOT-LC, PLOT-LC(ESI)MS E PLOT-LC(EI)-MS.

1. Introdução

Com os avanços tecnológicos ocorridos na miniaturização da cromatografia líquida, e a disponibilidade comercial de instrumentação mais adequada, tornou-se possível explorar o uso de colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT (Porous Layer Open Tubular), inclusive o acoplamento com a técnica de detecção de espectrometria de massas usando como fonte de ionização nanospray (nano ESI) ou ionização com elétrons (EI). Problemas como dispositivos de injeção inadequados, conexões com grandes volumes mortos, altas pressões, bombas inadequadas, acoplamentos com detector e volumes extra coluna já foram, pelo menos parcialmente, resolvidos ou considerados.[1]

Embora essas colunas tenham sido reintroduzidas somente recentemente em cromatografia líquida, após um longo tempo sem novidades neste nicho, estudos têm demonstrado a sua aplicabilidade em proteômica e metabolômica, áreas nas quais as quantidades disponíveis de amostras são, com frequência, ínfimas.[2,3] Na década passada, Karger e colaboradores reintroduziram o uso de colunas tubulares abertas do tipo PLOT em cromatografia líquida.[2] A partir deste trabalho, colunas PLOT com fase estacionária de PSDVB (poli(estireno-co-divinilbenzeno)) e diâmetros internos iguais ou inferiores à 10 μm têm sido amplamente

aplicadas para a separação de proteínas. Os grupos de pesquisa liderados por Lundanes, Karger e Brett têm desenvolvido diferentes aplicações em sistemas online empregando colunas analíticas do tipo PLOT com colunas monolíticas como pré-colunas.[4,5] Atualmente o foco dos principais grupos de pesquisa que trabalham nesta área é no preparo de colunas PLOT com fase estacionária de PS-DVB; o que difere entre esses grupos é a forma do preparo. A preparação dessas colunas baseia-se em uma reação de polimerização in situ que pode ser iniciada por aquecimento ou por luz UV. Vale ressaltar que em todos os trabalhos publicados as colunas obtidas são reprodutíveis, e a grande diferença no preparo das mesmas consiste no uso de diferentes proporções dos reagentes, o que resulta em filmes de diferentes espessuras, usualmente entre 0,75 e 10 μm.

A miniaturização da cromatografia líquida apresenta diversas vantagens em relação a cromatografia líquida convencional, enquanto a cromatografia líquida miniaturizada utilizando colunas tubulares abertas apresenta ainda mais vantagens teóricas frente as colunas de diâmetro reduzido empacotadas. Destaca-se o menor consumo da fase móvel e da fase estacionária, compatibilidade com a espectrometria de massas, eficiência de separação, e possibilidade de análise de amostras com volumes escassos, vantagens essas ressonantes com os princípios da Química Verde. Além disso, as colunas PLOT preparadas em capilares de

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sílica fundida não exigem conexões e frits especiais, facilitando sua conexão em sistemas comerciais para nano-LC e micro-LC. Esta revisão relata e discute alguns dos principais pontos relacionados a miniaturização das colunas analíticas em cromatografia líquida, com destaque para as colunas tubulares abertas do tipo PLOT.

2. Breve histórico da miniaturização das colunas analíticas em LC A cromatografia líquida é uma técnica analítica de caráter físico-química, de separação versátil e abrangente. Quando acoplada a um detector de espectrometria de massas, cria uma ferramenta de análises químicas eficiente, apresentando exatidão nos resultados e permitindo a identificação e/ou quantificação dos compostos presentes em uma amostra com confiabilidade.

A invenção da cromatografia é creditada ao botânico russo Mikhail Tswett, quando, em 1900, realizou a separação de pigmentos de folhas de plantas utilizando um tubo de vidro preenchido com carbonato de cálcio.[6,7] Ao longo do século XX diversos cientistas colaboraram no desenvolvimento da cromatografia, e em 1952 Martin desenvolveu a cromatografia com fase móvel gasosa.[7,8] A cromatografia gasosa obteve seu ápice de eficiência vinte anos após criada, por meio da miniaturização da técnica e ao acoplamento com o detector de espectrometria de massas. A miniaturização da cromatografia gasosa sobreveio da introdução das colunas analíticas capilares tubulares abertas, por meio do trabalho pioneiro realizado por Marcel J. E. Golay em 1957.[9] Intrigado pela matemática envolvida nas separações, e na busca de uma coluna mais simples, os estudos de Golay o conduziram à separação de uma 152

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mistura de hidrocarbonetos utilizando uma coluna de 1,37 mm de diâmetro interno, recoberta internamente com um filme fino de polietileno glicol, diferentemente das colunas empacotadas usadas até então.[9] Esta coluna desenvolvida por Golay foi a primeira de uma nova classe, as denominadas colunas tubulares abertas, caracterizada pela presença de uma fase estacionária recobrindo apenas a parede interna do tubo e pelo aumento da eficiência como consequência à redução do diâmetro interno.

Apesar da cromatografia líquida ter sido desenvolvida 50 anos antes que a gasosa não obteve os mesmos níveis de desenvolvimento no mesmo espaço de tempo, e ainda hoje segue em aprimoramento, caminhando em direção à miniaturização da técnica.

Isto é devido às limitações instrumentais que eram incapazes de suprir as exigências necessárias para se operar em altas pressões, fluxos baixos e pequenos volumes, e à dificuldade de acoplamento com o detector de espectrometria de massas.[10-12] No entanto, alguns pesquisadores realizaram trabalhos pioneiros construindo os pilares para a miniaturização das colunas analíticas em cromatografia líquida.

O trabalho realizado Czaba Horvath em 1967 é considerado pioneiro na miniaturização de colunas analíticas em cromatografia líquida. Nele foi comparado o desempenho de separação de ribonucleotídeos utilizando uma coluna tubular aberta de 0,28 mm de diâmetro interno e 5 metros de comprimento, sem fase estacionária, com uma coluna empacotada de 1 mm de diâmetro interno e 2 m de comprimento empacotada com partículas de 50 µm recobertas com uma fase estacionária de troca iônica. Posteriormente tais colunas foram denominadas de “microbore”.[13,14] Outro importante estudo em busca da miniaturização da cromatografia líquida foi realizado por Ishii e colaboradores, em 1973, quando realizaram pela primeira vez uma separação empregando cromatografia líquida em escala micro, concebendo o termo “microLC”. Neste trabalho foram separados hidrocarbonetos Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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aromáticos polinucleares (PAHs), utilizando uma coluna de 0,5 mm de diâmetro interno e 15 cm de comprimento, empacotada com partículas de 30 µm recobertas com uma fase estacionária de politetrafluoretileno (PTFE).

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que os tubo de vidro e aço inox que eram anteriormente utilizados. Isso permitiu o desenvolvimento de colunas com diâmetros internos ainda menores, e a introdução de novas fases estacionárias.

[15,16]

Os avanços tecnológicos propostos por Ishii abriram espaço para mais estudos sobre colunas empacotadas com diâmetros internos cada vez menores, como o realizado por Scott e Kucera, em 1976, no qual foram separados alquil-benzenos utilizando uma coluna de 1mm de diâmetro interno e 10 m de comprimento empacotada com partículas de 40 µm.[17-19] Dois anos depois, em 1978, Tsuda e Novotny avaliaram a relação entre o diâmetro interno da coluna analítica (50-200 µm) com o tamanho da partícula de empacotamento (10-100 µm). Neste trabalho, concluiram que as colunas de 70 µm de diâmetro interno e as empacotadas com partículas de 30 µm obtiveram as melhores relações de eficiência.

[20,21]

Dada a crescente variação nos tipos de colunas, avaliá-las e compará-las se tornou um desafio até que, em 1977, Bristow e Knox desenvolveram um novo procedimento para análise de colunas, cunhando um novo termo: a impedância (E). Este parâmetro relaciona uma série de fatores intrínsecos de uma coluna em uma corrida cromatográfica específica, como tempo de retenção, variação de pressão, viscosidade do eluente dentre outros, possibilitando, por meio de um único valor, estimar o desempenho da coluna e compará-la frente a outras. De acordo com a equação proposta pelos autores, menores valores de E, resultam em colunas de melhor desempenho.[22] Em seguida, no ano de 1979, Dandeneau e Zerenner contribuíram para a miniaturização da cromatografia líquida ao incorporarem a utilização de tubos capilares de sílica fundida à produção das colunas analíticas, o que se tornou um padrão para o preparo de colunas capilares e nano.[23] Isto se deve ao fato que os tubos do material sílica fundida apresentam maior resistência mecânica, flexibilidade, e são mais inertes

A resistência mecânica das colunas capilares de sílica fundida advém do recobrimento externo de poliimida. Estudos demonstram que uma ranhura de 1 µm em um capilar de sílica fundida causa sua quebra, por isso a importância do recobrimento que, além de resistência mecânica, protege as colunas da exposição atmosférica.[24] Nas décadas seguintes outros trabalhos miniaturizando colunas analíticas para cromatografia líquida foram realizados; no entanto, foi a partir do ano de 1997, com o desenvolvimento da cromatografia liquida de alta pressão (HPLC), que as limitações instrumentais ao uso das colunas miniaturizadas foram parcialmente contornadas. Consequentemente, o estudo e desenvolvimento destas colunas passou mais uma vez a ser assunto de destaque na área.[25]

3. Classificação das colunas miniaturizadas em LC

Como consequência aos estudos de colunas com os mais variados diâmetros internos, feitas dos mais distintos materiais, ao longo da miniaturização da cromatografia líquida, vários autores preocuparamse em classificar as colunas, buscando simplificar e sistematizar o estudo. Inicialmente, as colunas foram classificadas por Ishii, em 1988, de acordo com o diâmetro interno. [26] Concomitantemente, Barth também se baseava nesta classificação simplificada. [27] Por outro lado, Verzele e Dewaele sugeriram que na classificação também deveriam levar em consideração o material do qual o tubo da coluna era composto, que poderia ser de vidro, metal ou sílica fundida.[28] Quase uma década depois, em 1996, Chevert e colaboradores e também Vissers estabeleceram uma

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Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

nomenclatura que se respaldava no diâmetro interno da coluna analítica e na faixa de fluxo da fase móvel.[29, 30] Todas as classificações mencionadas diferem em relação a alguns fatores, no entanto concernem que colunas para cromatografia líquida convencional possuem o diâmetro interno sempre maior que 1 mm.

Foi então que Saito, em 2004, propôs a classificação de colunas para cromatografia líquida mais completa e aceita até o presente trabalho, ao incorporar e distinguir as subdivisões de colunas analíticas com diâmetro interno inferior a 1mm, como pode ser observado na Tabela 1.[14] A partir desta nova nomenclatura, novos termos foram estabelecidos no que tange a cromatografia líquida miniaturizada, os quais incluem nano-LC, LC capilar e micro-LC. Sendo assim, pode-se considerar que a cromatografia líquida miniaturizada acontece quando se usa colunas analíticas em escala capilar e nano.

Tabela 1. Classificação de colunas miniaturizadas usadas em cromatografia líquida baseada na proposta de Saito et al.[14]

Diametro interno da coluna (mm) 3,0 - 5,0 <2 0,5 - 1 0,1 - 0,5 0,01 - 0,1 0,005 - 0,05

Classificação HPLC Narrow-bore HPLC Micro-LC cLC Nano-LC LC Tubular aberta

As colunas capilares possuem diâmetro interno entre 0,15 e 0,5 mm (150 a 500 µm) e são compatíveis com fluxos abaixo de 10 µL/min, enquanto que as colunas nano possuem diâmetro interno inferior a 0,15 mm e operam com fluxos de 10 a 1000 nL/min.[11] As colunas analíticas miniaturizadas para cromatografia líquida também podem ser classificadas de acordo com o tipo de preenchimento. Elas se dividem 154

em dois grupos: as com o tubo preenchido e as tubulares abertas, como pode ser observado na Figura 1.[31]

Figura 1. Tipos de colunas analíticas miniaturizadas utilizadas em cromatografia líquida.

As colunas com o tubo completamente preenchido são divididas em empacotadas e monolíticas. As colunas empacotadas são integralmente preenchidas com partículas, enquanto que as monolíticas por um sólido poroso. Essas colunas foram empregadas nos primeiros sistemas instrumentais para cromatografia líquida, e até hoje são as mais utilizadas. Já, as colunas tubulares abertas, as quais possuem fase estacionária aderida somente à parede interna do tubo, são divididas em WCOT (Wall Coated Open Tubular) e PLOT (Porous Layer Open Tubular). O que as diferencia é o caráter da fase estacionária: nas colunas WCOT é não porosa, e na PLOT é porosa.[30-34] O uso de colunas tubulares abertas em cromatografia líquida é vantajoso, frente ao uso de colunas totalmente preenchidas. Como o tubo é preenchido somente em sua superfície interna, é possível utilizar fluxos maiores sem aumento significativo da pressão na coluna. Tais colunas possuem diâmetro interno, menor e comprimento maior, o que aumenta sua eficiência, pois aumenta o número de pratos. Também, devido ao menor diâmetro interno o volume de injeção é Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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menor o que reduz o consumo de reagentes e a geração de resíduos.[30-34]

diminuídos.[16] Tal fato é evidenciado pelas equações de Giddings, que serão explanadas adiante.

4. Colunas tubulares abertas em LC

Para os cálculos de eficiência em colunas tubulares abertas Hibbi e colaboradores adaptaram a equação de Van Deemter. Nesta adaptação os termos A e B foram desconsiderados. O termo A é desconsiderado porque as colunas tubulares abertas possuem a fase estacionaria aderida somente a parede interna da coluna, desta forma não há a existência de um leito de partículas e os analitos não percorrem múltiplos caminhos até o detector.[16]

As colunas tubulares abertas, em inglês “open tubular column” (OT), são caracterizadas por possuírem fase estacionária aderida somente à parede interna do tubo, mantendo o centro vazio. É padrão possuírem o diâmetro interno em escala capilar, por isso são confeccionadas em tubos capilares de sílica fundida. Essas colunas foram desenvolvidas por Golay, em 1957, para cromatografia gasosa. A elas é atribuído o rápido desenvolvimento da cromatografia gasosa quando comparada com a líquida, devido ao fato de proporcionarem uma grande eficiência de separação.[9,16]

As colunas tubulares abertas são separadas em dois subgrupos: WCOT (Wall Coated Open Tubular) e PLOT (Porous Layer Open Tubular), que diferem entre si pelas características do filme de revestimento, como porosidade e espessura. As colunas PLOT são conhecidas por apresentarem filmes mais espessos e porosos, e as colunas do tipo WCOT são caracterizadas pelos filmes mais finos e não porosos, a base polímeros do tipo goma, como os silicones.[31] As colunas do tipo PLOT são mais utilizadas que as WCOT em cromatografia líquida devido terem maior capacidade de carga.

Pretorius e Smuts, em 1966, sugeriram pela primeira vez o uso de colunas tubulares abertas em cromatografia líquida. Eles propuseram que fossem utilizados fluxos turbulentos neste tipo de separação, já que a difusão dos analitos em líquido é menor do que em gás.[35] Sendo assim, quando as colunas tubulares abertas são utilizadas em cromatografia líquida em decorrência do estado físico da fase móvel, há uma diminuição nos coeficientes de difusão dos analitos, comparando-se com cromatografia gasosa. De modo que, para apresentarem eficiência equivalente àquela apresentada quando usadas para cromatografia líquida, devem ter o diâmetro interno do tubo e a espessura do filme consideravelmente

Já, o termo B é desconsiderado porque a difusão molecular dos analitos é mínima quando o volume da fase móvel líquida é muito pequeno. Portanto, para o cálculo de eficiência em colunas tubulares abertas somente o termo C é considerado.

A equação (1), a seguir, descreve o equilíbrio do analito com a fase estacionária. A incógnita d refere-se à espessura da fase estacionária, R ao fator de retenção, e Ds é a difusão dos analitos nesta fase. A equação (2) descreve a transferência de massa na fase móvel, onde rc refere-se ao raio da coluna capilar e Dm relaciona-se com o coeficiente de difusão do analito.

(1) (2)

A substituição das equações 1 e 2 na equação de Van Deemter, é conhecida como equação de Giddings para colunas tubulares abertas (equação 3).

(3)

Pela equação de Giddings é possível observar que a altura equivalente a um prato (H, fator proporcional a eficiência) é diretamente proporcional a velocidade

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linear da fase móvel. Já os coeficientes de difusão, Dm e Ds, são inversamente proporcionais a este parâmetro.

Tanto a espessura no filme da fase estacionária, quanto o raio da coluna, são fatores significantes na eficiência de separação.[36] Anos depois da primeira tentativa de se adaptar colunas tubulares abertas à cromatografia líquida, em 1979, Knox e Gilbert publicaram um trabalho no qual verificaram que as colunas com diâmetro interno entre 1030 µm efetuavam separações cromatografia equivalentes a colunas empacotas.[37] Outro trabalho de destaque foi a explanação matemática de Jorgenson e Guthrie. Neste trabalho, publicado em 1983, os autores previram que as colunas tubulares abertas em cromatografia líquida poderiam alcançar seu ápice de eficiência chegando em até 106 pratos sendo que, para isso, deveriam ter 2 µm de diâmetro interno e 2 m de comprimento.[38] Mesmo com a ausência de instrumentação adequada para miniaturizar um cromatógrafo líquido, e a impossibilidade de se fazer colunas analíticas tubulares abertas com diâmetros tão pequenos, alguns cientistas realizaram trabalhos pioneiros e colaboraram com o avanço dessa parte da ciência. Um desses pesquisadores, Ishii, realizou diversos trabalhos na área durante das décadas de 70 e 80. Em 1988, apresentou um trabalho no qual comparou a separação realizada por colunas tubulares abertas com diâmetro interno de 50-150 µm e fase estacionária de SE-30 com colunas empacotadas, e constatou que as colunas tubulares abertas obtiveram resultado de separação mais eficiente.[20] Segundo simulações matemáticas, as colunas analíticas mais adequadas para cromatografia líquida miniaturizada são as tubulares abertas.[37] Isso é enfatizado pelo cálculo de resistência ao fluxo (Ø), parâmetro adimensional correspondente a uma medida de permeabilidade da coluna. A resistência ao fluxo equivale a 32 para as colunas tubulares abertas e a 800 para as colunas empacotadas. Essa diferença se dá pelo fato das colunas tubulares abertas, assim como diz o nome, possuírem o centro vazio.[38] 156

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

Outro parâmetro que privilegia o uso das colunas tubulares abertas em cromatografia líquida é a impedância de separação, que é uma forma de comparar a eficiência de colunas diferentes. Ao aplicala, teoricamente, tem-se que as colunas tubulares abertas quando comparadas a colunas empacotadas devem apresentar uma redução de 100 vezes no tempo de análise e aumento em 10 vezes de resolução.[38] No entanto, para obter tamanha eficiência, é necessário utilizar colunas com diâmetro interno extremante reduzidos, menores que 5 µm, o que é dificultoso e muitas vezes inviável para muito pesquisadores, principalmente nas décadas passadas quando não existiam instrumentação e tecnologia suficiente para a produção de tais colunas. Por isso, alguns pesquisadores fizeram experimentos com colunas tubulares abertas com diâmetros internos maiores, 25-50 µm, e empregavam temperaturas elevadas a fim de diminuir a viscosidade da fase móvel para, consequentemente, aumentar a difusão dos analitos.[39,40] Atualmente, devido aos avanços tecnológicos, problemas como dispositivos de injeção inadequados, altas pressões, bombas incapazes de bombear pequenos fluxos, dificuldade de acoplamento com detectores mais sensíveis, conexões com grandes volumes mortos já foram parcialmente contornados. Sendo assim, tornou-se mais fácil e possível explorar a utilização das colunas tubulares abertas em cromatografia liquida miniaturizada.

5. Efeito das variáveis físicas na eficiência e desempenho das colunas OT-LC 5.1. Material do tubo Os primeiros tubos para colunas cromatográficas eram de cobre e aço inoxidável. O cobre, por ser muito reativo era, portanto, recomendado apenas para amostras Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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não polares. Já o aço inox, tornou-se o mais utilizado, porque apresentava vantagens, como ductilidade, boa condutividade, fácil conexão aos equipamentos e possibilidade de produzir tubos de diversos diâmetros internos e externos. Porém, apresenta como desvantagem a maior reatividade frente a moléculas polares.[41] Outros metais como alumínio, níquel e ouro também foram avaliados. No entanto, o alumínio apesar de fornecer um recobrimento estável, favorecia a formação de óxidos que provocavam o alargamento das bandas de separação. O níquel, mesmo sendo o metal mais indicado para este propósito, dificilmente era encontrado nas dimensões adequadas. Já, o ouro, exibia um desempenho excelente, mas seu custo impedia o uso em ensaios de rotina.[36] Por isso o vidro foi um dos materiais mais difundidos para elaboração de colunas cromatográficas pois, apesar de não ser totalmente inerte, é mais adequado que os tubos de metal. As colunas de vidro apresentam como desvantagem a fragilidade e o volume morto elevado, que é consequência das conexões com os equipamentos do cromatógrafo. Além disso, contam com a difícil “molhabilidade” do material, o que dificulta a formação de um filme fino uniforme. Esta última complicação foi minimizada pelo desenvolvimento de tratamentos da superfície interna do tubo.[42,43] Por fim, foram desenvolvidos tubos capilares de sílica fundida, que passou a ser a preferência para a produção de colunas. A sílica fundida além de apresentar maior “molhabilidade”, o que facilita a deposição do filme de fase estacionária, é um material resistente e que permite a investigação de colunas com diâmetros internos cada vez menores, além de possibilitar análises on-line.[41,43]

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

tem relação direta com a espessura da fase estacionária que determina a capacidade amostral. A relação entre eficiência e diâmetro interno pode ser verificada por meio da equação de Giddings (Equação 3) exibida anteriormente.[16] Nela observa-se que a eficiência varia proporcionalmente com o quadrado do raio do tubo.

Por outro lado, a relação de fases (β), que consiste na razão entre volume da fase móvel e da fase estacionária, relaciona-se com o diâmetro interno do tubo por meio da Equação (4), na qual rc é o raio do tubo e df é a espessura do filme de fase estacionária.

(4)

Assim, quanto maior o raio do tubo e, consequentemente, seu diâmetro, maior será a relação de fase, ou seja, maior será o volume de fase móvel em relação ao volume de fase estacionária. A priori, esta relação pode não ter grande significado, porém, quando relacionada ao fator de capacidade e à constante de partição, conduz à Equação (5), na qual K é a constante de partição e k é o fator de capacidade.

(5)

Esta equação expressa que colunas com tubos de raios maiores apresentam fatores de capacidade menores.

Isso ocorre pois, em tubos com raios maiores e filme menos espessos, o volume de fase móvel será maior que o volume de fase estacionária, dificultando a interação dos analitos e prejudicando a separação.

5.3. Comprimento da coluna 5.2. Diâmetro interno do tubo

O diâmetro interno do tubo é uma variável física que desempenha impacto na eficiência da coluna, pois

As colunas tubulares abertas têm menor resistência ao fluxo que as colunas empacotadas, permitindo o uso de colunas mais longas, aumentando

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eficiência de separação, uma vez que em colunas de maior comprimento há maior número de pratos.

[43] Assim, a teoria cromatográfica prevê que colunas tubulares abertas com diâmetros reduzidos, menores que 10 μm, apresentam resolução e velocidade semelhante, ou até mesmo superiores à colunas empacotadas.[44] Desse modo, a menor resistência ao fluxo, ocasiona menor pressão dentro da coluna, permitindo o uso de colunas mais longas e, consequentemente, com um maior número de pratos.

5.4. Espessura da fase estacionária Pela equação de Giddings (Equação 3) o quadrado da espessura do filme é diretamente proporcional ao termo CL que, por sua vez, corresponde à resistência à transferência de massa na fase líquida. O fato demonstra a relevância da espessura do filme para o desempenho da coluna. De acordo com as Equações (4) e (5), quanto mais fino o filme, maior será a relação de fase e, consequentemente, menor será o fator de capacidade da coluna. Por outro lado, quanto mais espesso, menor a relação de fase e maior o fator de capacidade, porém o filme será mais instável e estará sujeito a “sangramentos”.

Sendo assim, é necessária uma pré-avaliação de qual espessura de fase estacionária será utilizada antes de se produzir uma coluna tubular aberta.

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

alcançada poucos anos após ter sido desenvolvida. A cromatografia líquida ainda não atingiu este estágio de desenvolvimento, mas caminha em sua direção por meio de diversos trabalhos que visam miniaturizar a técnica.

As colunas tubulares abertas do tipo PLOT (Figura 2) possuem natureza mais favorável a aplicação em cromatografia líquida do que as colunas do tipo WCOT. A natureza porosa da fase móvel possibilita uma maior área superficial de contato o que promove uma maior interação da fase estacionária com os analitos e, consequentemente, aumenta o fator de retenção o que faz com que a separação cromatográfica seja mais eficiente.

Figura 2. MEV de uma coluna PLOT de fase estacionária de PS-(DVB).

Como já foi definido, as colunas tubulares abertas foram desenvolvidas por Golay em 1957 com a finalidade de contornar limitações das colunas empacotadas e melhorar a eficiência de separação por cromatografia gasosa.

Em cromatografia líquida miniaturizada as colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT nem sempre apresentam um elevado número de pratos o que, neste caso em especifico, pode não ser relevante para a eficiência da coluna. Em uma coluna PLOT a retenção dos analitos é baseado principalmente nos processos de adsorção e rápida transferência de massa proporcionada pela alta permeabilidade da coluna.[31]

O uso das colunas capilares mais o acoplamento com a técnica de detecção de espectrometria de massas são os responsáveis pelo apogeu da cromatografia gasosa,

Nas colunas PLOT a eficiência está relacionada com a altura e não com a quantidade dos pratos. Quanto menor a espessura da fase estacionária e o diâmetro

6. Colunas PLOT-LC

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interno do capilar menor será o valor da altura do prato e, portando, mais eficiente será a separação.

Causon e colaboradores comprovaram essa relação ao relacionarem a curva de Van Deemter para colunas PLOT com diferentes espessuras de fases porosa, como pode ser observado na Figura 3.[45]

Figura 4. Curva de eficiência cinética comparando colunas tubulares abertas do tipo PLOT com colunas empacotadas.[45]

Figura 3. Curva de Van Deemter para colunas do tipo PLOT com diferentes taxas de recobrimento de filme poroso, sendo: (a) 0,001; (b) 0,05; (c) 0,125; (d) 0,25; (e) 0,5; (f) 1,0; (g) 2,0 µm.[45]

O uso de colunas tubulares abertas em cromatografia líquida é vantajoso, frente ao uso de colunas totalmente preenchidas. Como o tubo é preenchido somente em sua superfície interna, é possível utilizar fluxos maiores sem aumento significativo da pressão na coluna. Tais colunas possuem diâmetro interno menor e comprimento maior, o que aumenta sua eficiência de separação. Também, devido ao menor diâmetro interno, o volume de injeção é menor o que reduz o consumo de reagentes e de resíduos.[46] A Figura 4, desenvolvida por Desmet e colaboradores, demonstra a eficiência cinética de colunas do tipo PLOT comparando-as com colunas empacotadas, sendo possível concluir que para qualquer tempo de retenção (tR), as colunas tubulares abertas apresentam no mínimo dez vezes mais pratos teóricos.[45]

Alguns grupos de pesquisa realizaram trabalhos nos quais eram utilizadas colunas analíticas PLOT em cromatografia líquida. No entanto, devido às limitações instrumentais da época esta parte da ciência ficou temporariamente esquecida. Foi em 2007, que Karger e colaboradores reintroduziram essa ideia.

Eles desenvolveram uma coluna PLOT de diâmetro interno de 10 μm e fase estacionária de PS-DVB para separar peptídeos demonstrando, experimentalmente, que a utilização destas colunas é possível e vantajosa, despertando o interesse de demais pesquisadores.[47] Na presente década, alguns grupos de pesquisas estão se dedicando ao estudo e desenvolvimento de colunas tubulares abertas do tipo PLOT para cromatografia líquida miniaturizada, desenvolvendo fases estacionárias, metodologias de preparo, e formas de avaliação da eficiência de separação, que estão brevemente descritos nos demais subitens deste artigo.

7. Fases estacionárias empregadas em colunas PLOT-LC A fase estacionária de uma coluna analítica tubular aberta do tipo PLOT proporciona a área superficial na qual ocorrem as interações com os analitos

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que, através de processos de partição e adsorção, são separados. O material poroso que constitui esta fase pode ter caráter orgânico ou inorgânico e também pode ser desenvolvido a partir de novos materiais como fases híbridas.

7.1. Fase estacionária de polímero orgânico Dentre as fases estacionárias empregadas em colunas PLOT as constituídas de polímeros orgânicos são as mais utilizadas em cromatografia líquida miniaturizada.

Isto se dá pelo fato desse tipo de fase estacionária ter sido a primeira a ser desenvolvida, e, portanto, ter sido a mais reproduzida, até o presente momento, possuindo uma metodologia de preparo melhor estabelecida. [16] Outro fator importante é o fato dessas fases, principalmente a de poli(estireno-co-divinilbenzeno) (PS-DVB), serem compatíveis para realizar separações de moléculas grandes, como proteínas.

As principais vantagens relacionadas a utilização de fases estacionárias de polímeros orgânicos são a simplicidade da síntese, controle de porosidade do material, estabilidade frente a condições extremas de pH, elevada estabilidade térmica, e a possibilidade de realizar modificações em sua superfície com diversos grupos ativos. Como desvantagem destaca-se a baixa resistência mecânica.[45] O principal método de obtenção deste tipo de fase estacionária utiliza uma reação de polimerização via radical-livre, podendo ser iniciada termicamente ou através de radiação eletromagnética. Independentemente do modo de iniciação, a síntese ocorre pela exposição de uma solução de polimerização composta de um monômero funcional, um iniciador, que é um radical livre, e um agente porogênico, que normalmente é um solvente, submetidos à uma fonte de energia. A taxa de reação de polimerização é governada principalmente pela taxa de iniciação do radical-livre, o qual tem seu tempo 160

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

de meia vida inversamente proporcional a quantidade de energia aplicada. Sendo assim, deve-se controlar a energia aplicada a fim de promover uma boa reação de iniciação do radical.[46] Outro fator que influencia a qualidade de uma coluna PLOT com fase estacionária de polímero orgânico é o tempo de polimerização, pois reações mais longas geram fases porosas com macro poros que podem entupir a coluna capilar transformando uma coluna tubular aberta do tipo PLOT em uma coluna do tipo monolítica.[40] Como exemplo de aplicação deste tipo de coluna em cromatografia líquida miniaturizada pode ser citado o trabalho publicado por Roserberg e colaboradores, no ano de 2013, no qual desenvolveram uma coluna tubular aberta do tipo PLOT com fase estacionária de poli(estireno-co-divinilbenzeno) (OS-DVB) para separar proteínas. Os autores utilizaram um sistema multidimensional SPE-PLOT-nano-LC-MS e obtiveram bons resultados de separação.[48]

7.2. Fase estacionária de polímero inorgânico As colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT para cromatografia líquida com fase estacionária de caráter inorgânico em sua grande maioria são formados por polímeros baseados em sílica. Este tipo de fase estacionária possui maior área superficial e resistência mecânica que a as fases de polímero orgânico.

A maior área superficial promove uma melhor interação com os analitos, gerando separações mais eficientes. Já, a resistência mecânica da coluna relaciona-se com a inibição dos fenômenos de contração e dilatação da fase estacionária, os quais são consequência da interação com a fase móvel. No entanto, como desvantagem destaca-se o fato dos polímeros inorgânicos serem pouco resistes às mudanças de acidez Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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do meio, respondendo com eficiência apenas a uma faixa restrita de pH.[40] Assim como as colunas PLOT com fase estacionária de polímero orgânico, a metodologia de preparo para as colunas de polímero inorgânico não é bem definida e ainda encontra-se em desenvolvimento. Na literatura encontram-se métodos distintos de preparação de tais colunas sendo este um fator limitante para que as colunas PLOT de polímero inorgânico sejam usadas na mesma proporção que as de polímero orgânico.

Alguns trabalhos relatam a obtenção deste tipo de coluna através de processos envolvendo precipitação de politoxi-silano, poli condensação hidrolitica de tetraetoxi-silicato e também a síntese da fase via processo sol-gel. Neste caso o processo sol-gel é bastante promissor já que é amplamente utilizado para obtenção de fases estacionárias em cromatografia líquida tradicional.[40]

7.3. Fase estacionária à base de novos materiais A inclusão de novos materiais é um campo em constante desenvolvimento em Química Analítica.

No caso das colunas miniaturizadas tubulares abertas, estes são aplicados com a finalidade de desenvolver novas fases estacionárias que sejam mais seletivas e reprodutíveis.

Materiais compostos por óxidos metálicos como, por exemplo, óxidos de titânio, alumínio e zircônio, assim como materiais porosos a base de cadeias carbônicas, como o grafeno, têm atraído elevado interesse pois apresentam alta estabilidade química e física em cromatografia líquida. Os principais novos materiais empregados, até o momento, para o preparo de colunas PLOT são: os óxidos metálicos, materiais que proporcionam troca iônica, polímeros molecularmente impressos e materiais híbridos, que são materiais que possuem tanto caráter orgânico como inorgânico.[5]

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

Como exemplo de aplicação de novos materiais aplicados à fases estacionárias pode ser citado o artigo publicado por Huang e colaboradores, no ano de 2011, no qual foi desenvolvido uma coluna PLOT para troca iônica a partir de uma mistura polimérica de quitosana e glutaraldeído obtendo um bom resultado ao separar proteínas.[49]

8. Avaliação de colunas PLOT-LC Para avaliar colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT em cromatografia líquida utiliza-se critérios físicos, químicos e cromatográficos.

8.1. Análises físicas A microscopia de varredura (MEV) é uma das principias ferramentas na avaliação do estado físico das colunas. A foto fornecida por MEV permite a análise da uniformidade e espessura do filme poroso, e se este está devidamente aderido à parede capilar. A fim de avaliar a porosidade da fase estacionária, pode ser utilizado o método BET de adsorção de gases. Este método fornece informações sobre a área superficial da fase, o diâmetro médio e a distribuição dos poros. É importante ressaltar que os parâmetros físicos de uma coluna são imprescindíveis para sua qualidade; no entanto, poucos trabalhos os exploram.

8.2. Análises químicas

A análise química tem como objetivo verificar a seletividade da coluna desenvolvida. Essa análise é realizada pela comparação entre os cromatogramas resultantes das separações de padrões analíticos injetados em uma coluna convencional com os obtidos pela coluna PLOT. A construção de gráficos do tipo Radar é um método gráfico que possibilita a visualização de múltiplas variáveis de forma bidimensional, enquanto

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Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

que a utilização de grĂĄficos cinĂŠticos â&#x20AC;&#x153;Kinetic Plotsâ&#x20AC;?, facilitam esse tipo de anĂĄlise pois permitem uma rĂĄpida visualização dos resultados obtidos.[45]

8.3. AnĂĄlises cromatogrĂĄficas

e o comprimento da coluna cromatogrĂĄfica (L). Por fim, a impedância de separação (E) relaciona o tempo morto (tm), a variação de pressĂŁo (Î&#x201D;P), o nĂşmero de pratos teĂłricos (N), a viscosidade da fase mĂłvel (Ρ) e o fator de retenção (k).

As anĂĄlises cromatogrĂĄficas empregadas na avaliação de coluna sĂŁo realizadas aplicando parâmetros adimensionais ou reduzidos como a impedância (E), altura reduzida (h), resistĂŞncia ao fluxo (Ă&#x2DC;) e velocidade reduzida (v). Por meio destes parâmetros ĂŠ possĂ­vel efetuar comparaçþes entre colunas com caracterĂ­sticas dimensionais e constitucionais diferentes. AlĂŠm disso, ĂŠ possĂ­vel comparar a eficiĂŞncia de separaçþes com eluentes de diferentes viscosidades e solutos com diferentes coeficientes de difusĂŁo. Tais parâmetros estĂŁo descritos na Tabela 2.

Outro parâmetro teórico utilizado para aferir a eficiência de uma coluna Ê a eficiência cinÊtica. A eficiência cinÊtica Ê definida como o tempo mínimo necessårio para que uma coluna analítica obtenha certo número de pratos teóricos. Como as colunas tubulares abertas, tanto a WCOT quanto a PLOT, não possuem seu interior completamente preenchido, apresentam maior permeabilidade em comparação com as colunas analíticas com o interior completamente preenchido.

Desta forma, teoricamente alcançam maior número de pratos em menos tempo.

Tabela 2. Parâmetros cromatogråficos para colunas tubulares abertas em cromatografia líquida.

9. Instrumentação båsica para colunas PLOTLC

Parâmetro

Equaçþes para OT-LC

Altura reduzida

h = L / Ndc

Velocidade reduzida

v = Âľdc / Dm

resistĂŞncia ao fluxo

Ă&#x2DC; = Î&#x201D;Ptmdc2 / ΡL2

Impedâcia

E = tmÎ&#x201D;P / N2Ρ(1+ k)

As expressĂľes reduzidas de altura (â&#x201E;&#x17D;) e velocidade (đ?&#x2018;Ł), originalmente propostas por Knox e Parcher, sĂŁo utilizadas para avaliar os efeitos do fluxo na eficiĂŞncia cromatogrĂĄfica. Esses parâmetros se baseiam no diâmetro interno da coluna (dc); no coeficiente de difusĂŁo do analito na fase mĂłvel; no comprimento da coluna (L); no nĂşmero de pratos teĂłricos (N) e na velocidade linear (đ?&#x153;&#x2021;). JĂĄ, a resistĂŞncia de fluxo (Ă&#x2DC;) relaciona a variação de pressĂŁo (Î&#x201D;P), o diâmetro interno da coluna (dc) e o tempo morto (tm) com a viscosidade da fase mĂłvel (Ρ) 162

Para se utilizar cromatografia líquida miniaturizada Ê necessårio adaptar alguns elementos de um cromatógrafo líquido convencional, como a bomba, o modulo de injeção, os conectores e o sistema de detecção. Todos os componentes instrumentais devem ser dimensionados, para que não haja efeitos negativos sobre os parâmetros cromatogråficos que podem comprometer a eficiência da separação.

O sistema de bombeamento deve ser capaz de gerar fluxos da ordem de nanolitros ou microlitros por minuto. Para vazþes da ordem de 50 a 150 ¾mL min-1 estão disponíveis comercialmente bombas do tipo seringa e do tipo duplo pistão reciprocante, sendo este segundo o responsåvel pelo melhor desempenho devido à rapidez em atingir o equilíbrio de vazão, facilidade na criação de gradientes e boa compensação da pressão da coluna,[50] alÊm de possibilitarem a formação de gradientes binårios, terciårios e quaternårios. Mas, quando os fluxos são da ordem de nanolitros por minuto, para colunas com Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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diâmetro interno inferior a 500 μm, torna-se necessário o uso de splitters ou divisores, que atuam no sistema dividindo o fluxo. Essa técnica possibilita o uso de equipamentos de HPLC convencionais; contudo não há diminuição no gasto de fase móvel e os fluxos obtidos são pouco reprodutíveis.[42] As conexões são responsáveis pelos volumes mortos pré e pós-coluna, que contribuem para o alargamento das bandas. Idealmente, a coluna deveria ser diretamente conectada ao injetor e ao detector, contudo esse processo é difícil e acaba exigindo alguns tubos e conexões. Os materiais mais utilizados para as conexões são de aço inoxidável e de poli-éter-éter-cetona (PEEK), e as peças usadas para conectar os componentes instrumentais devem apresentar dimensões adequadas à coluna em uso.[50] Também, é importante ressaltar que a injeção de volumes muito baixos é prejudicial à sensibilidade do detector, e a injeção de volumes elevados, ocasiona a sobrecarga da coluna e o alargamento de bandas.

[51] Por isso, o volume injetado deve ser preciso e, no caso da cromatografia líquida miniaturizada, o volume de amostra injetado deve ser proporcional ao quadrado do diâmetro interno da coluna. Assim, o volume a ser injetado é consideravelmente inferior àquele de injetores convencionais de HPLC, normalmente até 100 μL, de modo que estes são frequentemente adaptados para injetar nanolitros de amostra. Para evitar o uso de adaptações, válvulas posicionadas entre o injetor e a coluna podem ser utilizadas.[21] Com respeito aos sistemas de detecção, a cromatografia líquida miniaturizada permite o uso da maioria dos detectores usados em HPLC; porém as celas de detecção devem ser projetadas para atender aos requisitos de menor volume (ordem de micro e nanolitros) e baixo fluxo, visando manter a sensibilidade de detecção.

Um dos detectores mais comuns é o de absorbância no ultravioleta, onde a cela de detecção deve

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ter um volume máximo de algumas dezenas de nanolitros para que não haja alargamentos significativos das bandas.

A melhor maneira de evitar que estes alargamentos ocorram é efetuar a detecção on-column, em que uma parte da própria coluna (sem o filme de poliimida e a fase estacionária) atua como cela de detecção. Porém, como os tubos de sílica fornecem caminhos ópticos muito reduzidos, a detectabilidade nesse tipo de análise é muito baixa. Alternativamente, a detecção pode ser realizada em um capilar conectado à saída da coluna. Várias tentativas foram feitas para prolongar o caminho óptico, desde celas do tipo bolha até celas multirefletoras.[44] Outra opção é a detecção por fluorescência que é considerada uma técnica de detecção muito sensível, mas exige que o analito seja fluorescente, ou seja derivatizado para que se torne fluorescente e então seja detectado. Além disso, detectores eletroquímicos e por condutividade, além de espectrometria no infravermelho com transformada de Fourier, também podem ser usados.

[44]

No entanto, o acoplamento com a espectrometria de massas, que é a técnica universal de detecção mais sensível, até o momento, é o mais adequado para as colunas tubulares abertas em cromatografia líquida pois como elas tem pequenos fluxos e pressões de saída tornam-se compatíveis com esse tipo detector.

10. Acoplamento com Espectrometria de Massas As colunas tubulares abertas do tipo PLOT, quando usadas em cromatografia líquida miniaturizada, possuem velocidade linear ótima cerca de 3 vezes menor que a de colunas convencionais, ou seja, fornecem fluxos mais lentos e, consequentemente, geram menos pressão de saída permitindo o acoplamento direto com o sistema de detecção de espectrometria de massas.

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Tal acoplamento é bastante promissor pois a espectrometria de massas é uma das técnicas de detecção mais eficientes da atualidade. No entanto, como a espectrometria de massas é compatível com amostras gasosas, é necessário o uso de interfaces e ionizadores entre a saída da coluna miniaturizada com o detector de espectrometria de massas. Na presente revisão serão discutidas a fonte de ionização do tipo de eletrospray (ESI) e a fonte de ionização por ionização por elétrons (EI).

10.1. Acoplamento entre c-LC(PLOT) e MS empregando ESI 10.1.1. Histórico da ESI Na década de 1980 houve um grande empenho científico em medir com precisão a massa molecular de macromoléculas biologicamente importantes, principalmente proteínas. No entanto, as proteínas apresentam características que não são compatíveis com os métodos de ionização por elétrons e ionização química, os quais eram os únicos métodos de ionização robustos disponíveis na época.[52] Por serem moléculas polares, não voláteis e termicamente lábeis quando ionizadas com elétrons ou por ionização química, as estruturas das proteínas eram completamente destruídas e, consequentemente, os resultados gerados não eram eficientes. Como alternativa passou-se a usar a técnica de ionização de bombardeamento com átomos rápidos (FAB), técnica esta que produz íons individualmente carregados do analito.[53] No entanto, a técnica FAB não é adequada para a ionização de moléculas grandes e, somado ao fato dos analisadores de massa da época não conseguirem medir com precisão a valor carga-massa das proteínas, não era possível analisar tais moléculas. Sendo assim, a única maneira de analizar esse tipo de amostra era através da 164

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

digestão das amostras antes da análise, resultando muitas vezes na descaracterização delas.[52] Este problema foi contornado em 1982 por Dole e colaboradores, através do desenvolvimento do método de ionização por electrospray (ESI). Os autores descreveram um dispositivo capaz de transformar gotículas de água em íons no estado de vapor; eles geraram macro íons, a partir de soluções diluídas de espécies poliméricas em pressão atmosférica.[53] No entanto, a técnica de ionização por electrospray só foi acoplada à Espectrometria de Massas em 1984 quando Fenn e Yamashita demonstraram a aplicabilidade desta como método de ionização branda ao transferirem moléculas grandes, proteínas, para íons em forma gasosa. O acoplamento rendeu a Fenn o prêmio Nobel de Química em 2002.[54] Desde então, a interface electrospray tornou-se confiável para a ionização de macromoléculas biologicamente importantes, e a ESIMS tornou-se uma ferramenta eficaz para a confirmação estrutural tridimensional de moléculas.

Essa interface é ideal para ionizar compostos que apresentam desde média até alta polaridade, e alta massa molecular. A utilização da interface electrospray no acoplamentos de cromatografia líquida capilar utilizando colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT com espectrometria de massas já foi realizada algumas vezes e tende a crescer nesta área de pesquisa substituindo os analisadores do tipo UV-Vis que atualmente são os mais utilizados.

Como exemplo bem-sucedido deste acoplamento pode ser citado um artigo publicado por Karger e colaboradores. Os autores desenvolveram uma coluna tubular aperta do tipo PLOT de fase estacionária de poli(estireno-co-divinilbenzeno) (OS-DVB) com a finalidade de analisar células de câncer de útero, obtendo como resultado uma eficiente separação de 1071 peptídeos associados a 536 proteínas.[47]

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10.1.2. Instrumentação utilizando ESI O electrospray é uma técnica de ionização em que íons são produzidos através de um spray gerado por uma tensão aplicada a um líquido criando um aerossol.

A ESI ou eletropulverização é uma técnica de ionização muito aplicada, pois permite a criação de íons à pressão atmosférica ao invés de à vácuo. A Figura 5 ilustra em diagrama um espectrômetro de massas que utiliza ESI como ionizador, enfatizando o fato deste ser uma interface que opera em pressão atmosférica.

Figura 5. Montagem das principais partes de um espectrômetro de massas típico, ilustrando a fonte de íons fora do sistema de alto vácuo. Neste caso, a ionização ocorre à pressão atmosférica (API).

Adaptado da referência [54].

Na ESI utiliza-se a energia elétrica para auxiliar a transferência de íons da solução para a fase gasosa, antes de serem submetidos à análise por espectrometria de massas. Logo, as espécies iônicas em solução são analisadas com sensibilidade aumentada por meio de ESI-MS. Além disso, os compostos neutros também podem ser convertidos para a forma iônica, em solução ou em fase gasosa, por protonação ou cationização. A transferência de espécies iônicas da solução para a fase gasosa envolve três etapas: a dispersão da solução por meio de pulverização, seguida pela evaporação do solvente e, por último, a formação de íons a partir das gotículas altamente carregadas.

Nesse tipo de ionização a amostra é dissolvida em um solvente polar, tipicamente menos volátil do que os utilizados em cromatografia gasosa e, em seguida, é bombeada através de um capilar de aço inoxidável

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

no qual corre uma corrente elétrica que flutua de 2000 a 4000 V. O eluente é então nebulizado para uma câmara na presença de um campo eletrostático forte e de um gás de secagem aquecido. O campo eletrostático provoca a dissociação dos analitos, enquanto que o gás de secagem aquecido evapora o solvente. À medida que as gotículas encolhem, a concentração de carga nelas aumenta. Eventualmente, as forças repulsivas entre íons com cargas semelhantes excedem as forças coesivas e os íons são ejetados para a fase gasosa. Por fim, estes íons são atraídos e passam para o espectrômetro de massas, induzidos pelos efeitos combinados da atração eletrostática e vácuo.

A fonte de ionização ESI é simples, quando comparada com outras fontes para espectrometria de massas. É necessária apenas uma fonte de alta tensão (1000 a 7000 V) que esteja em contato com a solução contendo os analitos. Tipicamente, esta solução é bombeada através de um capilar com diâmetro interno de 50 a 100 μm com fluxo inferior a 10 μL min-1. No caso das colunas PLOT para cromatografia líquida os fluxos são menores que 1 μL min-1, devido ao diâmetro interno inferior a 50 μm, e o processo de ionização passa a ser chamado de nanoelectrospray (nanoESI).

10.1.3. Íons formados por ESI Durante a ionização por ESI pode ocorrer a formação de três tipos de íons: moleculares, moléculas protonadas/desprotonadas, ou moléculas cationizadas ou anionizadas A extensão com a qual cada um destes íons é formado pode ser compreendida em termos do balanço entre três processos essencialmente distintos, que ocorrem no interior do capilar.

As reações redox de oxidação e redução produzem íons moleculares (M+•) ou (M– •). Já, as reações ácido/base que proporcionam respectivamente protonação e desprotonação geram moléculas protonadas,

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[M+H]+, ou desprotonadas, [M-H]–. Por último, as reações de coordenação com cátions, geralmente os da família 1A, ou ânions, principalmente cloretos, levam à formação de moléculas cationizadas [M+Na]+, ou anionizadas [M+Cl]–.

10.1.4. Vantagens e desvantagens da ionização por ESI Dentre as vantagens da ESI, destaca-se a sua aplicabilidade à uma vasta gama de analitos, incluindo biomoléculas de elevada massa molecular, tais como proteínas e ácidos nucleicos. Esta técnica de ionização é considerada relativamente suave/branda, sendo eficaz na análise de compostos não voláteis e termicamente lábeis.

Além disso, é uma técnica que permite o controle sobre a fragmentação, é prontamente acoplada a cromatografia líquida miniaturizada, capaz de produzir complexos intactos não covalentes, e permite a formação de múltiplas cargas no analito de interesse.

Algumas limitações ao uso desta técnica de ionização são a pouca fragmentação dos analitos, sendo necessário realizar análises em tandem para a obtenção de informações estruturais, dificuldade em criar bibliotecas espectrais já que a fragmentação não é uniforme, e efeito de supressão dos íons formados. Destacam-se também o fato da ionização por electrospray operar com maior eficiência em cromatografia em fase reversa, sendo muitas vezes necessárias reações pós coluna para adequar a fase, e a necessidade do analito ser polar e o solvente volátil.

166

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

10.2. Acoplamento entre c-LC(PLOT) e MS empregando EI 10.2.1. Histórico EI A ionização por elétrons foi desenvolvida por Dempster em 1918, sendo o primeiro modo de ionização a ser acoplado a um espectrômetro de massas. Em 1929, Bleakney e Nier aperfeiçoaram o equipamento. A utilização dessa forma de ionização acoplada a espectrometria de massas com um detector de uma separação cromatográfica, realizada por uma coluna tubular aberta, conferiu o ápice de eficiência à cromatografia gasosa.[55] Esse tipo de ionização acontece em vácuo, ou em baixas pressões, e é caracterizada por realizar uma fragmentação intensa, gerando íons moleculares. Sendo assim, é idealmente utilizada para análise de moléculas pequenas, pois quando uma molécula grande é ionizada desta maneira é muito fragmentada ao ponto de ser difícil identifica-la.

Em cromatografia líquida miniaturizada as colunas analíticas tubulares abertas apresentam baixa pressão de saída, o que torna promissor o acoplamento com um espectrômetro de massas utilizando como fonte de ionização a ionização por elétrons, uma vez que este opera em baixas pressões. No entanto, até o momento não existem publicações que relatem o acoplamento. c-(PLOT)LC-(EI)MS; apenas o acoplamento com colunas empacotadas foram exploradas.

Em 1996 Cappiello e colaboradores realizaram um trabalho pioneiro ao acoplarem c- LC-(EI)MS através de uma micro versão da interface Particle Beam (PB). O grupo de Cappiello aprimorou a instrumentação e, até o momento, é um dos poucos centros de pesquisa mundiais que trabalham na área, realizando o acoplamento direto, sem interface, da coluna miniaturizada à fonte de impacto por elétrons. Os pontos fortes do acoplamento direto são Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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a mitigação do efeito de matriz, a alta tolerância a sais e outros solventes não voláteis, e a relativa simplicidade instrumental.[56]

10.2.2. Instrumentação utilizando EI Em um espectrômetro de massas que usa como fonte de ionização o impacto por elétrons, depois de separada pela coluna analítica, a amostra é introduzida em uma interface para o vácuo para que a pressão do eluente torne-se compatível com a fonte de ionização.

Em seguida o eluente é ionizado na fonte de íons, e passa para um analisador de íons do espectrômetro de massas, aonde a razão massa-carga (m/z) das espécies produzidas pela fonte de íons é medida. Por fim, esses dados são transmitidos para um detector que irá converte-los em um cromatograma. A Figura 6 ilustra em diagrama de blocos um espectrômetro de massas que utiliza EI como fonte de ionização.

Figura 6. Montagem das principais partes de um espectrômetro de massas típico, ilustrando a fonte de íons dentro de um sistema submetido a alto vácuo. Adaptado da referência [54].

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

um anodo positivamente carregado atua como receptor do feixe de elétrons, de forma a manter o mesmo devidamente focalizado.[55] Em seguida, a entrada da amostra ocorre em outra fenda do bloco, sendo carreada por um gás; os elétrons descrevem trajetórias helicoidais na câmara, visando aumentar a chance de ionização.

Os íons formados na fonte são atraídos para uma outra fenda, a qual dá acesso ao analisador de massas, e são acelerados por eletrodos. Em geral, essa câmara é aquecida em torno de 300º C para prevenir a condensação dos íons formados.

10.2.3. Íons formados por EI Geralmente são formados 100 vezes mais íons radiacalares positivos do que íons negativos, sendo que para que esse processo ocorra, a energia cinética de bombardeamento deve superar a energia de ionização da molécula alvo.[55] Ao interagir com a molécula neutra do analito (M), pode ocorrer a ejeção ou adição de um elétron à molécula, que passará a apresentar um número ímpar de elétrons, configurando um íon radicalar, conforme equações (6) e (7).

(6) (7)

A ionização por elétrons, também denominada impacto eletrônico, é uma técnica que consiste em direcionar um feixe de elétrons de energia definida sobre uma amostra, em fase gasosa, sob baixa pressão.

No processo de ionização o feixe de elétrons é gerado pelo aquecimento de um filamento catódico, comumente constituído de rênio, e é direcionado para a câmara de ionização, mantida a baixa pressão por uma bomba de vácuo, através de uma fenda. Um potencial elétrico, geralmente 70 V, é aplicado para acelerar o feixe de elétrons através da fenda. No lado oposto da câmara,

Nesse contexto, a maioria dos equipamentos que trabalham com feixes de elétrons de energia fixa, opera com 70 eV de energia. O excedente energético da energia de ionização é responsável pela fragmentação da molécula, e cria diferentes padrões de fragmentação que são usados para identificar e quantificar os compostos que estão sendo analisados.

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10.2.4. Vantagens e desvantagens da ionização por EI As principais vantagens em utilizar uma fonte de ionização por elétrons são relacionadas a sua grande reprodutibilidade, fornecimento de informações estruturais, instrumentação bem estabelecida e simples, a existência de bibliotecas virtuais de espectros, e aplicabilidade à uma vasta gama de compostos.

Como desvantagem destacam-se o fato do analito de interesse necessariamente ser volátil e termicamente estável, limitando a aplicação para uma diversa gama de compostos e a impossibilidade de ionizar compostos de alta massa molecular devido a intensa ionização que promove uma alta fragmentação da estrutura molecular, descaracterizando a amostra. O acoplamento c-(PLOT) LC-(EI)MS requer o desenvolvimento de estratégias capazes de contornar a problemática das diferenças de pressão, já que a ionização por elétrons opera em vácuo e a cromatografia líquida miniaturizada não; assim como o fato dessa forma de ionização ser mais efetiva em moléculas em fase gasosa.

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

Outra vantagem é o menor consumo da fase móvel, coincidindo com princípios da Química Verde.

Isso ocorre em função da separação cromatográfica não ser dependente do fluxo volumétrico de fase móvel, mas sim de sua velocidade linear média. Sendo assim, a mesma separação é atingida em duas colunas semelhantes, porém, de diferentes diâmetros internos, se a velocidade linear da fase móvel for a mesma. Isto possibilita o uso de fases móveis mais caras e mais tóxicas, sem apresentar ameaça ambiental, pois o volume de resíduo gerado após uma separação é bastante limitado (2-5 ml).[57,58] Também é possível observar o aumento da sensibilidade quando são utilizados detectores sensíveis a concentração como, por exemplo, UV-Vis e fluorescência.

Isto é consequência direta da miniaturização do diâmetro interno da coluna, uma vez que o processo de diluição dentro de uma coluna cromatográfica é inversamente proporcional ao quadrado do diâmetro interno. Por possuírem um espaço não preenchido em seu interior, as colunas do tipo PLOT apresentam também a vantagem de serem mais permeáveis quando comparadas com as colunas empacotadas. Este fenômeno faz com que estas colunas apresentem menor pressão de saída, o que facilita o acoplamento com a espectrometria de massas.

[40]

11. Vantagens e limitações das colunas PLOT-LC 11.1. Vantagens Existem diversas vantagens em se utilizar colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT em cromatografia líquida. Como exemplo, o menor consumo da fase estacionária devido à redução do diâmetro interno das colunas analíticas. Como nas colunas PLOT a fase estacionária encontra-se aderida apenas a parede interna do capilar o consumo é ainda menor, permitindo a utilização de fases mais raras e caras.

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Outra consequência relacionada a fase estacionária é a possibilidade de analisar amostras que tenham pequeno volume como, por exemplo, amostras biológicas. Como a fase estacionária é pequena, não é possível a injeção de uma grande quantidade de amostra para não sobrecarrega-la. Desta forma, amostras consideradas “raras” que não podem ser separadas em análises convencional, por terem um volume muito pequeno, podem ser separadas cromatograficamente por essas colunas.[45] Há também vantagens relacionadas ao uso dos tubos capilares de sílica fundida como a possibilidade da fabricação de colunas mais longas, a aplicabilidade de programação de temperatura, e a facilidade de manutenção, além de ser um material com preço muito Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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menor que o aço inox comumente utilizado como tubo nas colunas convencionais.

Por último, deve-se considerar que o uso de colunas tubulares abertas do tipo PLOT em cromatografia líquida caminha em direção à cromatografia unificada isto se deve ao fato de as colunas PLOT já serem amplamente utilizadas, com sucesso, em cromatografia gasosa. Se a mesma eficiência cromatográfica for alcançada no uso dessas colunas em cromatografia líquida, em princípio será possível o desenvolvimento de um cromatógrafo com apenas uma coluna PLOT capaz de realizar análises em fase gasosa, líquida, e com fluídos supercríticos, princípio da cromatografia unificada.[54]

11.2. Limitações Como desvantagem, vale salientar que a cromatografia líquida miniaturizada ainda não atingiu alta popularidade devido a alguns desafios a serem superados, incluindo a indisponibilidade de uma ampla variedade de equipamentos capazes de trabalhar com fluxos baixos com precisão, além do elevado custo destes.

No entanto, grandes empresas da área estão investindo neste tipo de tecnologia, já existindo cromatógrafos líquidos comerciais que operam em sua totalidade nas escalas micro e nano.

Outra complicação é a produção das colunas. Como ainda não existem colunas PLOT para cromatografia líquida comercialmente disponíveis, precisam ser preparadas em laboratórios de pesquisa isso é um obstáculo adicional pois, devido ao diâmetro interno reduzido podem acontecer entupimentos e as colunas produzidas em diferentes laboratórios apresentarem características distintas. Isso ocorre devido a ausência de metodologias consolidadas para o preparo das colunas.

Por fim, destaque-se a baixa capacidade amostral. Mas, a fim de contornar essa limitação, alguns grupos de pesquisa veem desenvolvido colunas analíticas tubulares

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

abertas do tipo PLOT para cromatografia líquida de multicanais, possibilitando a injeção de maior quantidade de amostra.[59]

12.

Aplicações

As colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT têm diversas aplicações em cromatografia líquida miniaturizada. As aplicações nas áreas de proteômica, metabolômica e ambiental são as mais exploradas até o presente. O diâmetro interno reduzido, ao redor de 10 µm, reduz a capacidade de carga da coluna, pois limita o volume interno e a quantidade de fase estacionária.

Sendo assim, usualmente utiliza-se esse tipo de coluna para separar amostras de disponibilidade limitada.

A maioria dos trabalhos relatam o desenvolvimento de colunas PLOT com fase estacionária de PS-DVB que, por adsorção, separam moléculas com maior massa molecular e alta polaridade, o que faz com que a área de proteômica seja a mais explora, até o presente momento.

Como já foi anteriormente destacado, o primeiro trabalho a reintroduzir o uso de colunas PLOT em cromatografia líquida envolveu a separação de proteínas.[47] A partir deste trabalho outros foram realizados com essa mesma finalidade, como os citados a seguir. Lundanes e colaboradores, separaram proteínas intactas do leite desnatado acoplando a cromatografia líquida miniaturizada com a espectrometria de massas, no qual foi obtido baixo carry-over e boa repetibilidade.

[60] Outro trabalho bastante interessante, realizado pelo mesmo grupo de pesquisa, foi a separação de proteínas pequenas encontradas em células de câncer e mama, no qual obtiveram boa eficiência e repetibilidade com o uso de outra fase estacionária além da PS-(DVB): a OSDOT.[61] Wang e colaboradores prepararam uma coluna PLOT de 25 µm de diâmetro interno, e fase estacionária

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de PS-(DVB), através de uma reação de polimerização in situ. Os autores estudaram os efeitos da concentração do precursor polimérico e do tempo de reação na variação da espessura do filme de fase estacionária e encontraram que em menores concentrações e menor tempo de reação o filme tende a ficar mais fino. As colunas desenvolvidas foram utilizadas na análise dos produtos provenientes da digestão proteica de fígado de camundongos. Os resultados comparando uma coluna PLOT e uma coluna empacotada de 75 µm de diâmetro interno, mostraram uma capacidade de pico relativamente similar, o que reforça a boa aplicabilidade das colunas PLOT em cromatografia líquida miniaturizada.

A fim de solucionar a limitação da baixa capacidade de volume de amostra, principalmente quando se visa análises ambientais, alguns grupos de pesquisa desenvolveram colunas PLOT de multicanais. Kazarian e colaboradores desenvolveram uma coluna contendo 126 capilares internos, cada um de 4 µm de diâmetro interno e 0,26 µm de espessura. A coluna PLOT desenvolvida foi aplicada inicialmente na etapa de microextração de amostras ambientais de água contendo hidrocarbonetos poli aromáticos. Em condições otimizadas de análise, relataram recuperações dentro da faixa de 77% - 103%.

A utilização dessa coluna na separação analítica de proteína citocromo C em modo isocrático foi investigada relatando reprodutibilidades abaixo de 1%, evidenciando o potencial dessas colunas na etapa de separação analítica.[5] Outra coluna multicanais bastante similar a esta foi desenvolvida Silva e colaboradores.[59] Por fim, na tentativa desenvolver novas fases estacionárias para as colunas tubulares abertas do tipo PLOT para cromatografia líquida Al-Hussin e colaboradores desenvolveram uma coluna PLOT de cloreto de aminoproprildimetilamônio entrecruzado com divinilbenzeno (APAT-DVD) contendo um seletor quiral baseado em β-ciclodextrina (HSβCD) para aplicar em eletrocromatografia. Os autores destacam a elevada reprodutibilidade na faixa de 1,01 - 4,69% para a coluna

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PLOT separar isômeros de tirosina, ácido aspártico e lisina.[5]

13.

Conclusões e perspectivas futuras

A cromatografia líquida capilar com colunas analíticas tubulares abertas do tipo PLOT ainda não atingiu sua eficiência máxima e grande popularidade devido à alguns desafios a serem superados, como a baixa capacidade amostral, e as limitações instrumentais.

No entanto, as colunas do tipo PLOT se encontram em desenvolvimento e as aplicações relatam resultados satisfatórios. A possibilidade da redução do diâmetro interno da coluna para níveis sub 10 μm representa a possibilidade de atingir elevados níveis de eficiência necessários em análises complexas.

Destaca-se também a possibilidade de acoplamento com a técnica de detecção de espectrometria de massas. As fontes de ionização por electrospray e por ionização por elétrons representam ideais extremos de análise. O electrospray ioniza com precisão moléculas polares e de alta massa molecular, enquanto a ionização por elétrons é ideal para moléculas não polares e de baixa massa molecular. A ionização por elétrons é uma técnica que gera alta fragmentação, possibilitando a obtenção de espectros de massas contendo informações estruturais usando apenas um estágio de massas. Já, a ionização por electrospray é branda e para que os compostos sejam identificados é necessário a aplicação de espectrometria de massas sequencial ou tandem (MS/MS).

Apesar da utilização de colunas PLOT para separações em cromatografia líquida ser um campo muito promissor, atualmente, as aplicações deste tipo de coluna ainda estão quase que exclusivamente voltadas às análises proteômicas e metabolômicas. A maioria dos trabalhos mostram o desenvolvimento de colunas PLOT com fase a base de PS-DVB, sendo que muitos autores entram em conflito sobre a melhor metodologia Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173

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para este processo. Sendo assim, nota-se uma lacuna no desenvolvimento de colunas PLOT com outras fases estacionárias que não sejam a base de PS-DVB. O desenvolvimento de novas fases estacionárias tornaria possível ampliar o potencial de utilização deste tipo de coluna na separação de compostos de menor massa molecular e maior polaridade, características distintas das moléculas estudadas atualmente empregando PSDVB. Desta forma, o cenário mostra-se promissor, já que diversos grupos de pesquisa têm exercido atividades ligadas a miniaturização da cromatografia líquida desde a síntese de fases estacionárias, novos procedimentos para o preparo das colunas, até a melhora no acoplamento com

Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT)

sistemas de detecção. Sendo assim, espera-se que a partir do panorama atual, nos próximos anos, a cromatografia líquida capilar utilizando colunas analíticas do tipo PLOT possa se consolidar como uma alternativa aos meios tradicionais de separação e identificação.

Agradecimentos Os autores agradecem a FAPESP (Proc. N° 2017/02147-0), CNPq (Proc. Nº 140277/2018-8 e Proc.

N° 307293/2014-9) e a CAPES code 001 pelo apoio financeiro.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3):150-173 173

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.011 ISSN 1984-4433

SAMPLE PREPARATION

Sample preparation techniques for biological samples Maria Eugênia Costa Queiroz* Israel Donizeti de Souza Departamento de Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil * Maria Eugênia C. Queiroz, Av. Bandeirantes, 3900 - CEP 14040901, Ribeirão Preto - SP – Brasil. mariaeqn@ffclrp.usp.br Tel.: + 55 16 33159172

Abstract

It is essential to determine drugs and their metabolites or biomarmarkers in biological samples (e.g., serum, plasma, breast milk, cerebrospinal fluid, and urine) quantitatively for clinical studies including therapeutic drug monitoring, drug metabolism investigation, and diagnostic or prognostic purposes. Because biological samples are extremely complex matrices, direct injection of complex samples into conventional chromatographic systems is not convenient. A sample preparation step is usually necessary to eliminate the majority of endogenous compounds and to concentrate the analytes that often exist at traces levels. In this context, this review presents an overview of how our research group has contributed to the development of innovative microextraction methods (solid-phase microextraction, in-tube solid-phase microextraction, stir bar sorptive extraction, microextraction by packed sorbent, and disposable pipette extraction) for bioanalysis. The theoretical fundamentals, extraction configurations, and current technology used for the synthesis of selective sorbents for microextractions, such as (i) polypyrrole, (ii) restricted-access materials, (iii) immunosorbents, (iv) molecular imprinting polymers, (v) monolithic polymers, (vi) ionic liquids, and (vii) bi-functional materials are also discussed, as well as future trends in sample preparation techniques.

Keywords: microextraction techniques, biological samples, selective sorbents for microextractions, online coupling techniques, and LC-MS/MS.

1. Introduction

Biological fluids, such as plasma, serum, cerebrospinal fluid, and urine, are complex samples that contain proteins, phospholipids, inorganic salts, and organic compounds. Thus, chromatographic instruments cannot handle these matrixes directly.

Chromatographic analysis of biological samples includes sampling, sample preparation, chromatographic separation, detection, and data handling. Among all 174

these steps, sample preparation is both the most errorprone part of the process and the most tedious procedure and typically takes 60-80% of the total analysis time.

During the sample preparation step, most endogenous compounds are excluded from the biological matrixes (to decrease the matrix effects), and the target analytes (which are present in trace amounts in the matrix) are isolated and concentrated (enrichment) to suitable concentration levels for detection. Therefore, the sample preparation step has been regarded as a bottleneck in Scientia Chromatographica 2018; 10(3)

Queiroz M. E. C., Souza I. D.

the development of sensitive, selective, and precise analytical methods.

Conventional biological sample preparation techniques, including protein precipitation (PP), 1â&#x20AC;&#x201C;3 liquid-liquid extraction (LLE), 4,5 and solid-phase extraction (SPE), 6,7 involve well-established and welloptimized techniques. PP and LLE are simple, fast sample treatments that do not require special equipment.

However, PP is poorly selective, which might compromise the sensitivity of the method and cause serious matrix effects. Conventional LLE demands a large volume of biological sample and organic solvents.

Consequently, the organic solvent needs to be evaporated and the extracted analyte(s) must be reconstituted in an adequate solvent after the process, to provide a preconcentrated sample that is compatible for injection into the chromatographic system. In turn, manual SPE is a selective technique that requires smaller volume of organic solvents as compared to conventional LLE. Nevertheless, it is quite a time-consuming, multistep procedure. In some cases, when higher levels of analytes are present in the sample and the complexity of the matrix does not affect the results, classic sample preparation techniques are the first choice for sample treatment. Table 1 lists some successful applications of these classic sample preparation techniques developed in our research laboratory for bioanalysis of various compounds.

Over the last decades, works regarding sample preparation techniques have focused on analytical system miniaturization, online coupling techniques, environmentally friendly approaches, and development of selective stationary phases.

To achieve these goals, our research group has been developing new miniaturized or online sample preparation methods for chromatographic bioanalysis since 2003. We have applied most of these methods to determine drugs, their metabolites, and biomarkers in biological samples for studies about neuropsychiatric disorders. This review describes theoretical fundamentals,

Sample preparation techniques for biological samples

extraction configurations, experimental parameters, new selective capillary coatings, applications, and current and future challenges of these innovative sample preparation techniques.

2. Solid-phase microextraction (SPME)

SPME is based on the sorption equilibrium of analytes between the sample matrix and the stationary phase. It is a non-exhaustive process; that is, it extracts only a small fraction of the initial amount of analyte.

This technique combines extraction and concentration of the analyte in a single step, thereby reducing the time required for sample preparation.

A SPME device (Figure 1) consists of a fiber assembly containing a built-in extraction fiber inside a needle and an assembly holder. The SPME fiber itself is a 1- or 2-cm-long thin fused-silica optical fiber coated with a thin polymer film or solid sorbent (stationary phase).

SPME was introduced by Arthur and Pawliszyn in 1990. 8 It initially gained wide acceptance for the analysis of volatile and semi-volatile organic compounds in environmental samples by gas chromatography (GC) because it easily combined solvent-free SPME headspace extraction with thermal desorption in the GC injection port.

The first challenge faced by our research group was to evaluate the SPME technique to extract drugs (weakly volatile compounds) by directly immersing the SPME fiber into human plasma (complex sample) and then conducting liquid desorption and high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis.

Since then, our research group has successfully developed and validated different SPME/HPLCUV methods to determine anticonvulsants (phenylethylmalonamide, phenobarbital, primidone, carbamazepine, phenytoin, and lamotrigine) 9 and antidepressants (selective serotonin reuptake inhibitors, or SSRIs) 9â&#x20AC;&#x201C;12 in human plasma for therapeutic drug monitoring (TDM), Table 2.

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194 175

176

Plasma (200)

Plasma (1000)

5 antipsychotics, 7 antidepressants, 2 anticonvulsants, and 2 anxiolytics

Antidepressants

Extraction with hexane/isoamyl alcohol 99:1 (v/v) mixture

Extraction (MIP): pre-treated sample (300 µL).

Clean-up: water. Desorption: methanol

Plasma (200)

Parabens

UHLC-MS/MS

UHLC-MS/MS

DAD: diode array detector, FD: fluorescence detector, MIP: molecularly imprinted polymer, NACE: non-aqueous capillary electrophoresis

Extraction (MIP): pre-treated sample (300 µL). Clean-up: acetic acid 0.1% followed by methanol solution (10%). Desorption: MeOH.

Plasma (200)

Venlafaxine, o-desmethylvenlafaxine, and n-desmethylvenlafaxine

Solid-phase extraction

NACE-DAD UHLC-MS/MS

Liquid-liquid extraction

HPLC-MS/MS

HPLC-MS/MS

Sample/acetonitrile 1:2 (v/v) followed by ultra-filtration with Amicon Ultra-4 (Millipore, Bedford, MA, USA) device Sample/acetonitrile 1:2 (v/v)

HPLC-FD

Sample/acetonitrile 1:3 (v/v)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Fused silica capillary (400 × 0.75 mm)

XSelect CSH C18 XP column (2.1 × 100 mm, 2.5 μm)

Ascentis Express HILIC column (4.6 × 100 mm, 2.7 µm)

Chiralcel OD-R (250 × 4.6 mm, 10 µm)

Chromatographic system Chromatographic column

Protein preciptation

Sample preparation procedure

Cerebrospinal fluid Protein precipitation with acetone followed (200) by extraction with toluene

Plasma (50)

Amino acids and Neurotransmitters

Anandamide and 2-AG

Plasma (100)

Matrix (sample volume, µL)

Fluoxetine and norfluoxetine

Analytes

Table 1. Classic sample preparation techniques for biological samples

1-50

3-700

0.5-50

15-30

0.2-40.5

4.5-65600

30-1000

7

6

5

4

3

2

1

Linear range Reference (ng mL-1)

Queiroz M. E. C., Souza I. D. Sample preparation techniques for biological samples

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

Queiroz M. E. C., Souza I. D.

Sample preparation techniques for biological samples

Figure 1. Commercial SPME device

Table 2. SPME/HPLC methods to determine drugs in plasma samples for therapeutic drug monitoring

Stationary phase

Linear range Reference (ng mL-1)

Analytes

Matrix, (volume, µL)

Phenylethylmalonamide, phenobarbital, primidone, carbamazepine, and carbamazepine-epoxide

Plasma (1000)

Carbowax

Imipramine, amitriptyline, desipramine, and nortriptyline

Plasma (1000)

PDMS/DVB

Extraction: 40 min at 65 °C. Desorption: 10 min in sodium acetate buffer solution/ace- 75-500 tonitrile 50:50 (v/v) mixture.

9

Mirtazapine, citalopram, paroxetine, duloxetine, fluoxetine, and sertraline

Plasma (250)

Extraction: 40 min at 25 °C. Poly(pyrrole) Desorption: 15 min at 25 °C in phosphate buffer solution/ 16-1200 acetonitrile 57:43 (v/v) mixture.

10

Fluoxetine, sertraline, paroxetine, and citalopram

Plasma (250)

Extraction: 40 min at 25 °C. Polythiophene Desorption: 15 min at 25 °C in phosphate buffer solution/ 200-4000 methanol 40:60 (v/v) mixture.

11

Mirtazapine, citalopram, paroxetine, fluoxetine, and sertraline

Plasma (1000)

PDMS/DVB

Extraction procedure

Extraction: 30 min at 30 °C. Desorption: 10 min in phosphate buffer solution/acetoni500-12000 trile/ methanol 65:18:17 (v/v/v) mixture.

Extraction: 45 min at 60 °C. Desorption: 15 min at 60 °C in acetonitrile.

25-500

9

12

Chromatographic column: RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm) Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194 177

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Our group has observed that the SPME extraction efficiency depends on the relative affinity of the analyte for the fiber stationary phase (coating) and its thickness.

A thicker coating increases the sorption capacity of the fiber, but it also demands a longer equilibration time.

Our group has evaluated commercial fibers, including polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/ DVB, 65-μm film thickness), polyacrylate (PA, 85-μm film thickness), and the carbowax-templated resin (CW/ TPR-100, 50-μm film thickness), as well as lab-made fibers like polyurethane, octadecylsilane (5-μm dp), polypyrrole (PPY), and polythiophene (PTh) for drug analysis. 9–12 Conductive polymers, such as polyaniline (PPY) and PTh, are promising extraction phases for analysis of ionizable drugs. These polymers display excellent permeability (porous structure) and multifunctional properties, which result in ion exchange and intermolecular interactions, including acid-base, TTTT, dipole–dipole, hydrophobic, and hydrogen bonding, between the polymer and the analytes. 13

Sample preparation techniques for biological samples

Our group has prepared PPY and PTh phases on a stainless-steel wire for SPME by electrochemical deposition (cyclic voltammetry) and has evaluated how the electrolyte solution (lithium perchlorate or tetrabutylammonium perchlorate) and the number of cycles (50, 100, or 200) applied during the polymerization process affect the SPME performance.

10,11 Figure 2 shows that 100 cycles provides the best results for both electrolyte solutions. Meanwhile, lithium perchlorate leads to better efficiency for most of the antidepressants. Film thickness increases with increasing number of polymerization coating cycles, which allows a higher amount of analytes to be extracted. This happens because, in the case of thicker porous coatings like PPY, increasing coating thickness increases not only the total coating volume, but also the total surface area. 14 Some articles by our group have discussed important factors that impact SPME efficiency, such as fiber coating, extraction time, sample pH, sample ionic strength, influence of plasma proteins, and liquid desorption conditions. 9–12,15

Figure 2. Effect of the number of cycles during PPY electrochemical polymerization (SPME fiber) at 50 mVs−1 on SPME performance. Electrolyte solution: (A) Lithium perchlorate solution; (B) tetrabutylammonium perchlorate solution (reimprinted from reference 10 with permission).

178

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

Queiroz M. E. C., Souza I. D.

Sample preparation techniques for biological samples

3. In-tube solid-phase microextraction (intube SPME) In 1997, Eisert and Pawliszyn introduced the in-tube SPME technique 16 to overcome the limitations of SPME fibers (first generation) related to (a) low extraction efficiency for weakly volatile or thermally labile compounds not amenable to GC or GC-MS, and (b) stability against solvents used in HPLC. 17 Our group has further developed in-tube SPME by coupling the SPME technique directly with HPLC systems. In-tube SPME uses an open tubular fused-silica

capillary column as the SPME device instead of SPME fiber. Hence, it can be considered an online automated sample preparation technique. 18 Column switching intube SPME can be carried out in two configurations: the draw/eject and the flow-through extraction systems.

The first in-tube SPME system configuration used in our laboratory, the draw/eject system, consists in fixing the open tubular fused-silica capillary in the HPLC autosampler injection loop. 19 MicroTight sleeves at each end of the capillary facilitate the capillary connections.

Figure 3 illustrates a schematic diagram of the automated in-tube SPME-HPLC-UV system.

Figure 3. Schematic representation of the in-tube SPME-LC configuration.

After the plasma samples are pre-treated (protein precipitation and reconstitution of the dried extract with buffer solution), the drugs are directly extracted and concentrated into the stationary phase of the capillary column by repeated draw/eject cycles of the sample solution from the vial (autosampler), under computer control, until the partition equilibrium is reached. Next, the extracted analytes are directly desorbed from the capillary coating by the mobile phase flow after the six-port valve is switched from the load to the inject

position. The desorbed analytes are transported to the HPLC column for separation and later detection (UV or fluorescence detector).

Pre-treatment of the biological samples could minimize the matrix effect on the in-tube SPME procedure, thereby increasing the extraction efficiency.

During our studies, we have optimized in-tube SPME variables like capillary coating selectivity, sample volume, sample pH, sample flow-rate, number of draw/

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194 179

Queiroz M. E. C., Souza I. D.

eject cycles (only draw/eject mode), and desorption conditions. This optimization not only improved method selectivity and sensitivity, but also reduced analysis time. 17,18,20,21 In-tube SPME capillary coating Initially, our research group used this classic intube SPME-HPLC system with photometric detectors to evaluate open tubular fused-silica capillary columns (a short piece of commercial GC column) such as OV-1701 (14% cyanopropylphenyl methylpolysiloxane, 100 cm × 250 µm i.d., 0.05 µm) and polyethylene glycol (60 cm × 0.32 mm i.d., 0.05µm) for analysis of antidepressants (OV-1701) 19, lidocaine and its metabolites (OV-1701) 22 , and rifampicin (polyethylene glycol) 23 in plasma samples.

To improve in-tube SPME efficiency and selectivity, we synthesized alternative stationary phases, including: (a) an open tubular fused-silica capillary with PPY coating (oxidative polymerization - positively charged) for enantioselective analysis of fluoxetine and norfluoxetine in plasma samples. 24 (b) open tubular fused-silica capillaries with immunosorbent (molecular recognition, covalently

Sample preparation techniques for biological samples

bonded polyclonal antibodies) for analysis of fluoxetine 25 and monoclonal antibodies for interferon alpha 2a analysis 26 in plasma samples. (c) a packed capillary (polyether ether ketone, PEEK tube) with molecularly imprinted polymers (MIP, nanocavities with specific shape and defined arrangement of the functional group synthesized by twostep sol–gel procedure) for analysis of interferon alpha 2a in plasma samples. 27 (d) a packed capillary (PEEK tube) with restricted-access materials (RAM, C18-BSA) for analysis of interferon alpha 2a in plasma samples and RAM (SCX particles with the outer surface covered with BSA) for analysis of sulfonamides in milk samples. 28 RAM phases exclude macromolecules by means of a chemical diffusion barrier created by a protein network (e.g., BSA covering the outer silica surface).

Figure 4 depicts the in-tube PPY-coated SPME/ HPLC chromatograms for enantioselective analysis of fluoxetine and norfluoxetine in plasma samples for therapeutic drug monitoring. 24 Directly packing adsorbent particles into the PEEK tube improves the extraction capacity, but the high column pressure resulting from tightly packed micrometric particles limits the sample loading speed.

Figure 4. In-tube PPY-coated SPME-HPLC chromatograms. (A) Blank plasma sample. (B) Blank plasma sample spiked with FLX and NFLX resulting in 300 ng/mL (retention times: S-NFLX 15.252 min, R-NFLX 16.735 min, S-FLX 18.834 min, R-FLX 20.618 min). (C) Plasma sample from elderly depressed patient receveing therapeutic dosage. (reimprinted from reference 24 with permission).

180

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

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After the bidimensional UHPLC coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) was purchased, our research group evaluated the flow-through in-tube SPME-LC/MS/MS system with two pumps and one sixport valve. In this system, the quaternary pump (QSM) is connected to the capillary column (first dimension – for enrichment with trace analytes), and the binary pump (BSM) is connected to the analytical column (second dimension – for chromatographic separation) (Figure 5). The use of two binary pumps allows application of different flow rates to extract and to separate the analytes.

During chromatographic separation (second dimension), the capillary column (first dimension) is re-equilibrated for the next injection (parallel column regeneration).

Sample preparation techniques for biological samples

packed phases. Incorporation of the cyano groups into the monolith increases selectivity for the target drugs. (b) a wall-coated open tubular capillary column with polymeric ionic liquids (PILs) to determine anandamide (AEA) and 2-arachidonoyl glycerol (2AG) in plasma samples from patients with Parkinson’s disease.

Selective PILs were synthetized from the [VC6IM][Cl], [VC16IM][Br], and [(VIM)2C10]2[Br] ionic liquids by in-situ thermally initiated polymerization in a fused silica capillary column. 30

By using this flow-through in-tube SPME-LC/ MS/MS system with innovative capillary coating (first dimension), our group has developed methods for bioanalysis, including:

(c) an organic poly(butyl methacrylate-coethylene glycol dimethacrylate) monolithic capillary to determine antipsychotics (chlopromazine, clozapine, quetiapine, and olanzapine) and their metabolites (desmethyl chlorpromazine, 7-hydroxy-chlorpromazine, N-desmethyl clozapine, N-desmethyl olanzapine, and norquetiapine) in plasma samples from schizophrenic patient. 31

(a) an organic-inorganic hybrid monolithic capillary column functionalized with cyano groups to determine sixteen drugs (antidepressants, anticonvulsants, anxiolytics, and antipsychotics) in plasma samples from schizophrenic patients for TDM. 29 The properties of the monolithic phases – low backpressure, high mass transfer rate, and high permeability – make the innovative hybrid monolith more attractive than conventional particulate-

By means of offline in-tube SPME followed by UHPLC-MS/MS analysis, our group has determined parabens in breast milk samples. 32 For this new approach, a MIP (for selective interaction) modified with restricted access material (a non-adsorptive network hydrophilic external layer – for exclusion of endogenous compounds) (MIP-RAM) was synthesized by in situ polymerization in an open fused silica capillary, Fig 7b.

Figure 5. (a) Graphic diagrams of in-tube SPME configurations: flow-through mode with two pumps and (b) labmade device for offline in-tube SPME (adaptated from reference 17 and 32).

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In our research group, a column switching technique that uses in the first dimension a “capillary column” as extraction device is called “in-tube SPMELC system”, but a column switching technique that uses a “commercial HPLC cartridge” is called a “column switching LC system”.

Our group has used a column switching UHPLCMS/MS system with a commercial RAM column (RP-8 ADS) in the first dimension (for enrichment with trace analytes while endogenous interference is excluded) and a reverse phase (RP18) in the second dimension (for chromatographic separation) to determine (a) antipsychotics, antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics in plasma samples from

182

Sample preparation techniques for biological samples

schizophrenic patients, 33 and (b) anandamide (AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in plasma samples 34 and in cerebrospinal fluid 5 from patients with Alzheimer’s disease. 34 Our group has evaluated how the recently introduced RP18 superficially porous columns and RP18 fully porous columns with different particle sizes perform during chromatographic separation of drugs in plasma samples by MS/MS detection. 35 On the basis of this study, we have selected which analytical column (best performance) to use in the second dimension of the column switching system for drug analysis. 33

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

Matrix, (volume, µL)

Plasma (500)

Plasma (500)

Plasma (500)

Plasma (200)

Serum (160)

Plasma (250)

Plasma (50)

Analytes

Nontricyclic antidepressants

Lidocaine

Rifampicin

Fluoxetine and norfluoxetine enantiomers

Fluoxetine

Interferonalpha

Interferonalpha 2a

MIP (PEEK tube: 50 × 0.50 mm)

Antibody (fused silica capillary: 600 × 0.25 mm)

Antibody (fused silica capillary: 700 × 0.25 mm)

Extraction: draw-eject mode (20 × 50 µL).

Desorption: 0.1% trifluoroacetic acid solution/acetonitrile 86:14 (v/v).

Extraction: draw-eject mode (20 × 250 µL).

Desorption: trifluoroacetic acid solution, 0.1% pH 2.5) acetonitrile 86:14 (v/v).

Extraction: draw-eject mode (20 × 34 µL).

Desorption: ammonium acetate solution with 0.1% formic acid/acetonitrile with 1% of acetic acid) 40:60 (v/v).

Extraction: draw-eject mode (20 × 100 µL).

Desorption: 1 × 60 µL of methanol

Extraction: draw-eject mode (10 × 200 µL).

Desorption: phosphate buffer solution/ acetonitrile 60:40 (v/v).

PEG (800 × 0.25 mm, 0.05-µm film thickness)

Polypyrrole (600 × 0.25 mm, 0.2-µm film thickness)

Extraction: draw-eject mode (5 × 200 µL).

Desorption: (phosphate buffer solution with 0.16% of triethylamine)/acetonitrile 60:40 (v/v).

Extraction: draw-eject mode (15 × 100 µL).

Desorption: phosphate buffer solution/acetonitrile 57:43 (v/v) mixture

in-tube SPME-LC

Extraction procedure

OV-1701 (1000 × 0.25 mm, 0.05-µm film thickness)

OV-1701 (800 × 0.25 mm, 0.05-µm film thickness)

Stationary phase

Table 3. Automated column switching LC-MS//MS and in-tube SPME-LC methods for bioanalysis

C18 (150 × 3.9 mm, 5 µm)

Chiralcel OD-R (250 × 4.6mm, 10 µm)

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

RP18 LichroCART® (250 × 4 mm, 5 µm)

FD [8-300]

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

FD [0.006-3.0 MIU/ RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm) mL]

MS [5-50]

FD [10-700]

FD [100-100000]

UV [50-5000]

UV [20-50]

27

26

25

24

23

22

19

Detection system [Linear range (ng Chromatographic Reference mL-1)]* column

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184

poly(BMA-co-EGDMA) (1000 × 0.25 mm)

MIP-RAM (0.53 mm ID, 5.0 cm, 0.12-µm film thickness)

Plasma (200)

Plasma (300)

Breast milk (200)

Plasma (250)

AEA and 2-AG

Chlopromazine, clozapine, quetiapine, olanzapine, and their metabolites

Parabens

Interferonalpha

C18-BSA (peek tube: 50 × 0.50 mm, 45-µm particle size)

MS/MS [10-400]

MS/MS [10-700]

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Acquity CSH C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

X Select CSH C18 XP (2.1 × 100mm, 2.5 µm)

C18 ChromSep (250 x 3.0 mm, 5 µm)

Extraction: flow-through mode (1 × 500).

Clean-up: water.

FD RP18 LichroCART® Desorption: 0.1% trifluoroacetic acid solution/ace- [0.06-3.0 MIU/mL] (125 × 4 mm, 5 µm) tonitrile 86:14 (v/v).

Extraction: draw-eject mode (3 × 200 µL). Cleanup: 1 × 100 µL of water.

Desorption: 1 × 100 µL of methanol/ethanol solution 1:1 (v/v).

Extraction: flow-through mode (1 × 10 µL). Cleanup: water.

Desorption: ammonium acetate solution with 0.1% formic acid/acetonitrile 80:20 (v/v).

MS/MS [0.05-100]

Extraction: flow-through mode (8 × 10 µL). CleanPolymeric ionic liquid (fused silica capillary: 110 × 0.53 up: water. mm, 1.7-µm film thickness) Desorption: water with 0.5% formic acid/ acetonitrile with 0.5% formic acid 30:70 (v/v).

UV [30-150]

MS/MS [0.06-10500]

Extraction: draw-eject mode (20 × 50 µL).

Desorption: (acetonitrile/methanol 60:40, v/v)/ (water 10:90 (v/v).

Extraction: flow-through mode (1 × 5 µL).

Clean-up: water.

Desorption: water with 0.1% formic acid/acetonitrile 70:30 (v/v).

Hybrid silica-cyanopropyl monolith (45 × 0.53 mm)

Plasma (200)

Antidepressants, anticonvulsants, anxiolytics, and antipsychotics drugs

SAX-BSA (PEEK tube: 50 × 0.50 mm, 45-µm particle size)

Milk (500)

Sulfonamides

Table 3. (continuation)

36

32

31

30

29

28

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Plasma (250)

AEA and 2-AG

MS/MS [0.025-50]

MS/MS [0.04-0.12]

Extraction: flow-through mode (10 × 10 µL).

Clean-up: water/acetonitrile 60:40, v/v.

Desorption: water with 0.5% formic acid/ acetonitrile 30:70 (v/v).

C8-ADS (25 × 4 mm, 25- μm particle size) first dimension

MS/MS [0.5-50]

Extraction: flow-through mode (1 × 5 µL).

Clean-up: water.

Desorption: ammonium acetate with formic acid 0.1%/ acetonitrile 63:37 (v/v).

Extraction: flow-through mode (10 × 10 µL).

Clean-up: water/acetonitrile 60:40, v/v.

Desorption: water with 0.5% formic acid/ acetonitrile 30:70 (v/v).

C8-ADS (25 × 4 mm, 25- μm particle size) first dimension

C8-ADS (25 × 4 mm, 25- μm particle size) first dimension

column switching LC-MS/MS

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm)

34

33

5

* Linear range of the method; Abbreviations: AEA: anandamide, 2-AG: 2-arachidonoylglycerol, BSA: bovine serum albumin, FD: Fluorescence detection, LLE: liquid-liquid extraction, MIP: molecularly imprinted polymer, MP: mobile phase, poly(BMA-co-EGDMA), Poly(Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Glycol Dimethacrylate), NACE: nonaqueous capillary electrophoresis, PDMS: polydimethylsiloxane, PEG: polyethylene glycol, RAM: restricted access media, TDM: therapeutic drug monitoring.

Plasma (200)

Antidepressants, anticonvulsants, anxiolytics, and antipsychotics drugs

Cerebrospinal AEA and 2-AG fluid (200)

Table 3. (continuation)

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4. Stir bar sorptive extraction

Stir bar sorptive extraction (SBSE) was introduced

by Baltussen et al. 37 in 1999. SBSE is also based on partitioning of a solute between the aqueous sample and the stationary phase. The analytes are dissolved in the coating and diffuse into the bulk of said coating during the extraction process, which is conducted under agitation.

Stir bars (10-20 mm) coated with polydimethylsiloxane (PDMS, 25-125 µL) have higher surface area, and consequently higher sorption capacity, than SPME fibers (0.5 µL for 100-µm film thickness). 38–40 A magnetic rod is usually encapsulated in a glass jacket on which a PDMS coating is placed (Figure 6). Thermal (GC special thermal desorption unit) or liquid (GC or LC analysis) desorption can be used after the extraction. 38–40

Sample preparation techniques for biological samples

Table 4 details the development of the SBSE methods. We have optimized the SBSE parameters, including pH, extraction time, and desorption conditions (solvents, magnetic or ultrasonic stirring, stirring time, and number of steps). 38–46 The extraction time (typically 30–240 min), which is kinetically controlled, is directly related to the sample volume, stirring rate, and stir bar dimensions.

The sensitivity of the SBSE/HPLC-UV method can be improved by diluting the biological samples with buffer solution, where the drugs are partially in the nonionic form. This enables the drugs to be extracted by the PDMS phase. Sample dilution also favors the stirring SBSE process.

Our group has also developed a new polymeric coating consisting of a dual-phase, polydimethylsiloxane (PDMS) and polypyrrole (PPY), to conduct SBSE of antidepressants from plasma samples, followed by LC analysis (SBSE/LC-UV). Extractions are based on both adsorption (PPY) and sorption (PDMS) mechanisms. 46

5. Microextraction by packed sorbent Figure 6. Stir bar sorptive extraction device.

Our research group has developed and validated SBSE methods with liquid desorption (polar solvents) followed by LC–UV analysis to determine antidepressants [selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) and an antagonist of central 2-adrenergic autoreceptors], 41 antiepileptics, 42 and rifampicin, 43 in plasma samples, as well as parabens in different cosmetic products. 44 We have also analyzed SSRI drugs by SBSE followed by non-aqueous capillary electrophoresis (NACE) with spectrophotometric detection. 45 In the case of plasma samples, we have been able to reuse the stir bars twenty times after liquid desorption.

186

Microextraction by packed sorbent (MEPS) is based on miniaturization of the conventional solid phase extraction (SPE) device. In MEPS, the sorbent material (1 or 2 mg) is inserted between the syringe barrel and the injection needle as a cartridge. The primary factor of this technique is that the solvent volume employed to elute the analytes during the extraction process must be of a suitable order of magnitude to allow the analytes to be directly injected into an LC or GC system. 47,48 Commercial sorbents include silica-based sorbents, mixed mode (C8 with SCX with sulfonic acid bonded silica), polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB), and porous graphitic carbon. 48 The MEPS procedure steps involve conditioning, loading, washing, and analyte elution/introduction into Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

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Sample preparation techniques for biological samples

the analytical instrument. Figure 7 displays the schematic diagram for the MEPS procedure.

Our research group has successfully applied the MEPS technique in combination with different

Figure 7. Schematic diagram for the MEPS procedure (translated from reference 49).

chromatographic methods and several sample matrixes: (a) MEPS (C8/SCX)/LCâ&#x20AC;&#x201C;UV to determine newgeneration antidepressants in human plasma samples for TDM, 50 (b) MEPS (C8)/LC-DAD to determine sulfonamides in egg samples51 and in poultry litter wastewater samples, 52 (c) MEPS (C8/SCX)/GC-MS for

multi-residue analysis of 22 pesticides in honey samples, 53 and (d) MEPS/UHPLCâ&#x20AC;&#x201C;MS/MS to determine parabens in urine samples from 30 postpartum volunteers, to assess human exposure to these compounds. 54 Our group has used an innovative hybrid silica monolith functionalized with cyano group (sol-

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gel procedure) as sorbent for MEPS to accomplish selective isolation of sixteen drugs (antipsychotics, antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics) from plasma samples for further LC–MS/MS analysis. 55 The developed method should constitute a valuable tool for TDM in schizophrenic patients.

After the SBSE procedure, sample pretreatment, including dilution (to reduce sample viscosity), protein precipitation, and pH adjustment (weak acids and bases) are necessary for complex samples, such as biological fluids, 50,54,55 honey, 53 eggs, 51 and poultry litter wastewater. 52 Our group has optimized the MEPS variables, including sample volume, pH, number of extraction cycles (draw–eject), and desorption conditions (solvent and solvent volume of elution), to reach high extraction recovery rates. In general, the MEPS analyses require small sample volumes and a short period (3 min) (Table 4).

On the basis of our results, to reduce the possibility of carry over, the SBSE bar has to be washed with elution solution at least four times between extractions.

MEPS sorbents can be reused more than 40, 50, 100, and 60 times in the case of honey (M1: C8-SCX), 53 plasma, 50 urine, 54 and egg 51 samples, respectively, demonstrating the robustness of the phases. According to MEPS analysis results, all the commercial cartridges employed in our studies show adequate accuracy and precision values. The synthesized cyanopropyl hybrid silica monolith also has good robustness, as judged from its reuse over 90 times without significant sensitivity loss. 55

Sample preparation techniques for biological samples

amount of stationary phase is loosely placed (dispersive extraction) inside this tip and mixed with the sample through the air inlet leading into the tip. This turbulent air bubble mixing creates a sorbent suspension in the sample, ensuring an optimal contact and highly efficient extraction. DPX tips containing a variety of stationary phases are commercially available (e.g., reverse-phase, strong cation exchanger, weak anion exchanger, and graphitized carbon). 56 Our group has synthesized innovative stationary phases for disposable pipette extraction, such as (a) phases based on composites of polyaniline and a styrene–divinylbenzene copolymer for analysis of fluoxetine and norfluoxetine in plasma samples by DPX-LC with fluorescence detector, 57 (b) a dummy MIP (sol–gel methodology) for analysis of bisphenol A in urine samples by DPX/GC-MS. 58 The dummy MIP (tetrabromobisphenol A as template) minimizes interference from leaked template, 58 (c) a RAM phase (C18-BSA) for TDM of drugs (antipsychotics, antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics) in plasma samples. 59 The C18-BSA particles used as the stationary phase for the DPX technique have proven effective for simultaneous trace enrichment with psychotropic drugs and exclusion of plasma macromolecules. Table 4 summarizes the main optimized parameters of our published methods.

6. Disposable pipette extraction (DPX)

DPX entails fast (rapid sorption equilibrium) dynamic extraction in the tip of a standard pipette (either 1 or 5 mL) fitted with a filter at the narrow bottom end of the tip and with a barrier near the top, Fig 8. A small 188

Figure 8. Disposable pipette extraction device.

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Plasma (1000)

Plasma (400)

Sertraline, mirtazapine, fluoxetine, citalopram, and paroxetine

Plasma (800)

Cosmetic formulations (30 mg)

Plasma (200) Biological analysis

Plasma (1000)

Plasma (1000)

Matrix, (volume, µL)

Mirtazapine, citalopram, paroxetine, duloxetine, fluoxetine, and sertraline

Fluoxetine, sertraline, citalopram, and paroxetine

Parabens

Rifampicin

Carbamazepine, carbamazepine-10,11-epoxide, phenytoin, and phenobarbital

Sertraline, mirtazapine, fluoxetine, citalopram, paroxetine, imipramine, nortriptyline, amitriptyne, and desipramine

Analytes

C8-SCX

PDMS/pyrrole

PDMS

PDMS

PDMS

PDMS

PDMS

Stationary phase

Table 4. Offline microextraction methods for different classes of compounds

Extraction: 3 × 250 μL).

Clean-up: 1 × 50 μL of water/methanol, 95:5 (v/v).

Desorption: 1 × 150 µL of phosphate buffer solution/ methanol 55:45 (v/v) mixture.

MEPS

Extraction for 40 min at 30 °C. Desorption for 20 min at 25 °C in water/methanol 70:30 (v/v) mixture.

Extraction for 45 min at 50 °C. Desorption for 15 min at 50 °C in acetonitrile.

Extraction for 40 min at 40 °C. Desorption for 15 min at 25 °C in phosphate buffer solution/acetonitrile 53:47 (v/v).

Extraction for 50 min at 38 °C. Desorption for 20 min in acetonitrile.

Extraction for 50 min at 50 °C. Desorption for 50 min at 50 °C in acetonitrile.

Extraction for 45 min at 50 °C. Desorption for 50 min at 50 °C in acetonitrile.

SBSE

Extraction procedure

HPLC-UV [10-1000]

HPLC-UV [20-500]

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

NACE-DAD Fused silica capillary (400 × 0.75 [10-500] mm)

HPLC-UV RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, [30-2000 ng/mg] 5 µm)

HPLC-UV RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, [125-50000] 5 µm)

HPLC-UV RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, [80-40000] 5 µm)

HPLC-UV RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, [10-10000] 5 µm)

Chromatoraphic system [Linear range Chromatographic column (ng mL-1)]*

50

46

45

44

43

42

41

Reference

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Eggs (0.5 g)

Urine (500)

C18 ChromSep HPLC (250 x 3.0 mm, 5 µm)

C18 ChromSep HPLC (250 x 3.0 mm, 5 µm)

MIP (150 mg)

Polyaniline

Extraction: 3 × 200 µL. Clean-up: -.

Desorption: 1 × 200 µL of acetonitrile.

Extraction: 1 × 500 µL (1 min).

Clean-up: 1 × 250 µL of acetic acid 0.1% followed by 1 × 250 µL of 5%) methanol solution.

Desorption: 1 × 500 µL of methanol.

DPX

GC-MS [50-500]

HPLC-FD [10-1000]

HP5MS column (30 m × 0.25 mm; 0.25-μm film thickness)

RP18 LichroCART® (125 × 4 mm, 5 µm)

58

57

55

54

53

52

51

Antidepressants, anticonvulsants, anxiolytics, and antipsychotics

Plasma (200)

Extraction: 1 × 200 µL (4 min).

Clean-up: 1 × 250 µL of acetic acid 0.1% followed by HPLC-MS/MS X Select CSH C18 XP (2.1 × 100 C18-BSA 59 water.

[0.5-32.5] mm, 2.5 µm) Desorption: 1 × 500 µL of methanol. * Linear range of the method; Abbreviations: AEA: anandamide, 2-AG: 2-arachidonoylglycerol, BSA: bovine serum albumin, FD: Fluorescence detection, LLE: liquid-liquid extraction, MIP: molecularly imprinted polymer, MP: mobile phase, NACE: nonaqueous capillary electrophoresis, PDMS: polydimethylsiloxane, RAM: restricted access media, SCX: strong cation exchange, TDM: therapeutic drug monitoring.

Bisphenol A

Plasma (200)

Plasma (200)

Antidepressants, anticonvulsants, anxiolytics, and antipsychotics

Fluoxetine and norfluoxetine

C18

Urine (200)

Parabens

HPLC-DAD [5-200]

HPLC-DAD [30-300]

Extraction: 4 × 100 μL. Hybrid silica-cyanopro-Clean-up: 1 × 150 μL of water.

HPLC-MS/MS X Select CSH C18 XP (2.1 × 100 pyl monolith Desorption: 1 × 100 μL of methanol/acetonitrile 50:50 [0.05-40.5] mm, 2.5 µm) (v/v) mixture.

C8-SCX

C8

22 pesticide

Extraction: 4 × 250 μL. Clean-up: -.

Desorption: 1 × 100 μL of 90:10 (v/v) water/(acetonitrile/methanol 60:40, v/v) mixture.

C8-SCX

5% phenyl dimethylpolysiloxExtraction: 4 × 250 μL. GC-MS ane analytical column (30 m × Clean-up: 1 × 100 μL of methanol.

[2-75] 0.25 mm,0.25 mM) Desorption: 1 × 20 mL of ethyl acetate Extraction: 4 × 100 μL. Clean-up: 1 × 250 µL of 0.1% acetic acid aqueous solution.

UHLC-MS/MS Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, Desorption: 1 × 50 µL of methanol/water solution, [0.5-50] 1.7 µm) 80:20 (v/v) mixture.

Extraction: 4 × 250 μL. Clean-up: -.

Desorption: 1 × 100 μL of 90:10 (v/v) water/(acetonitrile/methanol 60:40, v/v) mixture.

Honey (3 g)

sulfacetamide, sulfadiazine, sulfathiazole, sulfametha- Poultry litter waste zine, sulfamethoxypyridawater zine, and sulfamethoxazole (5000)

sulfacetamide, sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamethoxypiridazine, and sulfamethoxazole

Table 4. (continuation)

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7. Direct online coupling of sample preparation technique with MS/MS system

Recently, the in-tube SPME system with an organic-silica hybrid monolithic capillary containing bifunctional groups (amino and cyano) has been directly coupled to MS/MS online to determine amino acids and

Sample preparation techniques for biological samples

neurotransmitters (alanine, serine, isoleucine, leucine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, methionine, tyrosine, and tryptophan) in plasma samples from schizophrenic patients. This method offers several beneficial characteristics, including high extraction efficiency and high analytical frequency (Figure 9).

Figure 9. Schematic diagram direct online coupling of sample preparation technique with MS/MS system

Conclusion and future challenges

The main advantages of the miniaturized techniques are related not only to the small volumes of organic solvent and biological samples that these techniques require, but also to the high degree of sample cleanup and selective analyte pre-concentration.

Moreover, online coupling of the microextraction techniques to chromatographic systems, the so-called automated system, enhances accuracy, precision, and high-throughput analysis.

The main disadvantage of the automated column switching systems, such as in-tube SPME technique, is the need to pre-treat the samples, which prevents coupling of the capillary column and flow lines.

However, if monolithic and RAMIP capillaries are used as coatings that serve as a physical barrier to exclude large molecules, the need for biological sample pretreatment (protein precipitation) is dismissed.

Finally, we would like to emphasize the diversity of the innovative stationary phases (polypyrrole, polythiophene, polydimethylsiloxane, C8/strong cation

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exchange, C8-ADS, C18-BSA, and hybrid silica monolith) evaluated by our group and their capacity to improve the performance of microextraction techniques, especially in terms of selectivity and sorption capacity.

Future trends in sample preparation should be oriented toward directly coupling of the microextraction techniques with miniaturized chromatographic systems (CapLC and NanoLC) or direct coupling of these coatings to MS/MS or NanoESI-MS systems. In tube SPME-NanoLC/NanoESI-MS could be a very promising system to enhance analytical sensitivity and to minimize suppression of co-eluting analyte ionization.

Sample preparation techniques for biological samples

received a PhD in Analytical Chemistry (IQSC-USP).

In 2007, she worked several months at the University of Waterloo (Canada) during her international PhD project. Her research focuses on development of selective stationary phases (polypyrrole, restrictedaccess materials, immunosorbents, molecular imprinting polymers, monolithic polymers, ionic liquids, and bi-functional materials), innovative microextraction techniques and on-line chromatographic techniques (intube SPME-LC-MS/MS, column-switching LC-MS/ MS) in combination with tandem mass spectrometry to determine drugs and biomarkers in biological samples for neurological studies.

Acknowledgments

The authors would like to acknowledge FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, process 2017/02147-0 and 2016/01082-9) and INCT-TM (465458/2014-9) (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Translacional em Medicina).

Prof. Dr. Maria Eugênia Costa Queiroz is Associate Professor at the Departamento de Química da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP), Brasil. In 2000, she

192

Israel D Souza received his BS and MS degree at University of Sao Paulo (Brazil) in 2013 and 2015, respectively. He is currently a PhD student at University of Sao Paulo under the supervision of Dr Maria Eugênia Costa Queiroz. In 2018, he worked at Iowa State University (EUA) during his international Postgraduation course. His research direction has always been developing new sorbents phases and applied them in miniaturazed sample preparation techniques, specially capillaries ones. He has worked with monolithic phases, MIP, RAM, and polymeric ionic liquids phases.

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Queiroz M. E. C., Souza I. D.

Sample preparation techniques for biological samples

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194 193

Queiroz M. E. C., Souza I. D.

Sample preparation techniques for biological samples

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[43] Balbão, M. S.; Bertucci, C.; Bergamaschi, M. M.; Queiroz, R. H. C.; Malfará, W. R.; Dreossi, S. A. C.; de Paula Mello, L.; Queiroz, M. E. C. ;J. Pharm. Biomed. Anal. 2010, 51, 1078.

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[52] Salami, F. H.; Queiroz, M. E. C. ;J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2014, 37, 2377.

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[54] Cristina Jardim, V.; de Paula Melo, L.; Soares Domingues, D.; Queiroz, M. E. ;J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2015, 974, 35.

[55] De Souza, I. D.; Domingues, D. S.; Queiroz, M. E. C. ;Talanta 2015, 140, 166.

[56] Pinto, M. A. L.; Queiroz, M. E. C. ;Sci. Chromatogr. 2015, 7, 101.

[57] Chaves, A. R.; Moura, B. H. F.; Caris, J. A.; Rabelo, D.; Queiroz, M. E. C. ;J. Chromatogr. A 2015, 1399, 1.

[58] Brigante, T. A. V.; Miranda, L. F. C.; de Souza, I. D.; Acquaro Junior, V. R.; Queiroz, M. E. C. ;J. Chromatogr. B Anal. Technol.

Biomed. Life Sci. 2017, 1067, 25.

[59] Pinto, M. A. L.; de Souza, I. D.; Queiroz, M. E. C. ;J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 139, 116.

194

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):174-194

International Calendar: Chromatography and Related Techniques The 48th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (HPLC 2019) 16â&#x20AC;&#x201C;20 June 2019 at the Milano-Bicocca University, in Milan, Italy The HPLC symposium series is the largest, most recognized international forum on high performance liquid chromatography (HPLC) and related techniques. It is the ideal location for industrial and academic researchers to exchange information with other colleagues from all over the world. Both fundamental and practical aspects of separation science will be covered during the conference, with the main focus being on new, highly relevant trends emerging in this field, cutting edge applications, and innovation in the technology.

E-mail: hplc2019@effetti.it Website: www.hplc2019-milan.org

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International Calendar

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International Calendar

30th International Symposium on Pharmaceutical & Biomedical Analysis September 15, 2019 - September 19, 2019 | Tel Aviv, More details can be found on the conference website: www.pba2019.org Date: September 15-19, 2019 Location: Tel Aviv, Israel Venue: The David Intercontinental Hotel

16th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis (CECE 2019) September 24, 2019 - September 26, 2019 | Gdańsk, Date: September 24-26, 2019 Location: Gdańsk, Poland Venue: Hotel Mercure Gdańsk Stare Miasto The CECE conference has started in 2004 as a friendly meeting of colleagues from Prague, Vienna, Bratislava and Brno (http://www.ce-ce.org), based on...

195-206 197

International Calendar

Contact: Ray Mcclain, Green Chemistry Group info@greenchemistrygroup.org Date: September 29 - October 01, 2019 Location: Philadelphia, PA, United States Venue: Philadelphia Marriott Downtown

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International Calendar

Gulf Coast Conference 2019

October 15, 2019 - October 16, 2019 | Galveston, Texas Come see the latest analytical technology and services available to the Petrochemical and Refining industries!

Please join us at the 2019 Gulf Coast Conference... website at www.gulfcoastconference.com Date: October 15-16, 2019 Location: Galveston, Texas Venue: Moody Gardens Convention Center

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International Calendar

202 195-206

International Calendar

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International Calendar

204 195-206

International Calendar

https://chromatography.pharmaceuticalconferences.com/

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International Calendar

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Cursos 2018

IIC Calendário anual de atividades Visite www.iicweb.org

Entre no site e faça já sua inscrição: www.iicweb.org CÓDIGO

MÊS

DATA

DISCIPLINA

HORAS

LC-01

Março

14 a 16

Cromatografia Líquida Básica

24

LC-02

Abril

18 a 20

Cromatografia Líquida Moderna

24

GC-02

Maio

08 a 10

Cromatografia Gasosa Moderna (inclui GC-MS)

24

LC-MS-01

Junho

03 a 06

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-02

Agosto

22 a 24

Cromatografia Líquida Moderna

24

SP-01

Setembro

19 a 21

Técnicas Modernas para o Preparo de Amostras

24

LC-MS-01

Novembro

27 a 30

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-03

Dezembro

05 a 07

Cromatografia Líquida Avançada

24

Scientia Chromatographica 2018; 10(3) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3)

Scientia Chromatographica 2018; 10(3) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

Scientia Chromatographica 2018; 10(3) 209

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):210-211 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos ­co-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(3)

Scientia Chromatographica 2018; 10(3):210-211 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Publicação disponível na internet:

www.scientiachromatographica.com

2018

Volume 10 | Número 3 129 Prof. Harold M. McNair 85 years old Fernando Mauro Lanças

138 Substrate Materials Used in Microchip Gas Chromatography Abhijit Ghosh, Milton L. Lee

150 Colunas tubulares abertas recobertas internamente com uma camada porosa (PLOT) em cromatografia líquida miniaturizada Juliana Soares da Silva Burato, Fernando Mauro Lanças

174 Sample preparation techniques for biological samples Maria Eugênia Costa Queiroz, Israel Donizeti de Souza

Instituto Internacional de Cromatografia IIC

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org