Libro Actas, VII Congreso Ibérico Agroingeniería y Ciencias Hortícolas. SECH, Madrid, 2013 VII Parte

N mineralizado pelas leguminosas forrageiras: ensaio de campo Adelaide Perdigão 1, Henrique Trindade1, Nuno Moreira1 y João Coutinho2 1

CITAB – Centre for the Research and Technology of Agro – Environment and Biological Sciences, Department of Agronomy, Universidade de Trás – os – Montes e Alto Douro, 5001-801 Vila Real, Portugal – e-mail: aperdigao25@gmail.com 2 Chemistry Centre, Department of Soil Science, Universidade de Trás – os – Montes e Alto Douro, 5001-801 Vila Real, Portugal.

Resumo Para considerar os adubos verdes como uma fonte de azoto para a cultura principal, é necessário estimar o N mineralizado por essas plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em condições de campo, a quantidade de N mineralizado pelas culturas de inverno utilizadas como adubos verdes.

As culturas de inverno estudadas foram o trevo balansa (Trifolium michaelianum), a tremocilha (Lupinus luteus) e o azevém (Lolium multiflorum), que foram semeadas em duas datas diferentes (sementeira precoce e sementeira tardia). A cultura principal utilizada foi o milho. O ensaio de incubação foi iniciado no dia em que as plantas foram incorporadas no solo (Maio). Foram efetuados nove períodos de incubação sucessivos, num total de 16 semanas. O método consistiu em incubar amostras de solo no campo, efetuando a determinação do teor de N no início e final de cada período de incubação. As amostras de solo foram incubadas dentro de tubos de pvc envolvidos em sacos de plástico e enterradas no solo. As análises foram efetuadas separadamente para cada período de incubação.

Os resultados mostraram que a mineralização líquida apresentou diferenças significativas entre plantas no primeiro, terceiro e quarto período de incubação. A tremocilha foi a que registou o maior valor de N mineralizado. Em relação á data de sementeira, verificaram-se diferenças significativas no primeiro, terceiro e quarto período de incubação, com a data precoce a apresentar maiores valores de N mineralizado no terceiro e quarto período de incubação e a sementeira tardia com maiores valores de N mineralizado no primeiro período de incubação. Em todos os tratamentos (com exceção do trevo balansa em sementeira tardia), o maior valor de N mineralizado ocorreu no último período de incubação.

O N mineral do solo não apresenta diferenças significativas entre plantas exceto no penúltimo período de incubação, mas difere significativamente entre datas de sementeira até ao quinto período de incubação.

Palavras chave: adubos verdes, azoto, mineralização

N mineralization from green manures: a field study Abstract An estimate of N mineralization from green manures is important for evaluating these as a N source for the succeeding main crops. The objective of this research was to evaluate, under field conditions, the input of N mineralization by green manures.

Green manures studied were balansa clover (Trifolium michaelianum), yellow lupine (Lupinus luteus) and italian ryegrass (Lolium multiflorum), established in two different sowing dates (early and late sowing date). The succeeding main crop studied was maize. The incubation was initiated when cover crops were incorporated in the soil (May) and held in nine consecutive incubation periods, for a total of 16 weeks. The method consists of

2080

the in situ incubation of soil cores with N mineral measurements at the start and at the end of each incubation period. Soil cores incubated are restricted in pvc pipe into a plastic bag repositioned into the soil under ambient conditions. Analyses were performed separately for each sampling date.

Results showed that net N mineralization differ by plants in the first, third and fourth incubation period. The yellow lupine has the higher net N mineralization. The influence of sowing dates of cover crops in net N mineralization occurs in the first, third and fourth period, where cover crops from early sowing date had a high net N mineralization in the third and the fourth incubation and late sowing date in the first one. In all treatments, (except for late sowing balansa clover), the majority of net N mineralization occurred during the last measurement period.

The soil mineral N do not differ between cover crops, except in one case before the last sampling period, but differ statistically for sowing dates until the fifth period.

Keywords: Nitrogen, cover crops, green manures, mineralization

Introduction Nitrogen (N) is the nutrient most added in crops as fertilizer, because is the most limiting nutrient in crop development (Cordovil et al., 2005; Pereira et al., 2005; Wienhold, 2007; Davis et al., 2013).

Excessive use of synthetic fertilizers causes environmental and economic costs (Cordovil et al., 2005).

Use of organic residues is an important issue in sustainability agriculture (Thorup-Kristensen et al., 2003; Khalil et al., 2005). Forage legumes can be utilized like a good substitute to synthetic fertilizers (Bowen et al., 1988) to supply N to main crops with reduced environmental and economic disadvantages. To enhance the beneficial effects of green manures, it is needed to predict green manures N availability for plant nutrition, to be considered an effective N fertilizer supplying N synchronized with main crop demand (Bergtrรถm and Kirchman, 2004). It is important for economic and environmental reasons to quantify N mineralization (Abril et al., 2001; Schomberg et al., 2009), because it controls the supply of mineral N to plants (Yan et al., 2006) and determine how much mineralized N contribute to plant available N (Schomberg and Endale, 2004; Cordovil et al., 2005). N availability to plants is difficult to evaluate (Pereira et al., 2005), measuring and predicting N mineralization

can be made from N balance/ cropping data, laboratory determination of potential and field incubations (Jarvis et al., 1996). In literature references on dynamics of nitrogen mineralization on the field under different amendments is restricted (Logah et al., 2011).

In field incubation, N mineralization is estimated measuring temporal changes in mineral N content of soil samples incubated under ambient conditions (Monaco et al., 2010). The advantage of field incubation is reduced soil variability, simple to use and with no disturbance in ambient conditions (Jarvis et al., 1996). Buried bags technique allows to monitor N mineralization from decomposing green manures (Carsky et al., 1990), being a proper method for agronomic investigations, because is simple, cause moderate disturbance of the soil and allows investigation of N dynamics of surface soil layers (Monaco et al., 2010) and can be used during high rainfall periods without the occurrence of leaching losses (Carsky et al., 1990).

The objective of this work was to evaluate under field conditions the contribution of N mineralization by green manures on soil N availability.

Material and methods The experiment was conducted in 2012 from May 17 (day 0) to September 6 (day 98). The site was located in Viseu, North Portugal. Soil type is a loamy Distric Fluvissol. A randomized split plot with

2081

four replicates was used: sowing dates of cover crops as the main plot factor and cover crops as sub plots. The sub-plot size was 3X5 m. The soil was submitted to the same treatments in previous years.

The cover crops experienced were balansa clover (Trifolium michaelianum), Italian ryegrass (Lolium multiflorum) and yellow lupine (Lupinus luteus). These cover crops were sown in September 2011 (earlier sowing date - ESD) and October 2011 (late sowing date - LSD), and were incorporated in soil in May 17 (day 0 of field incubation). Maize (Zea mays) was the main crop and was sown in May 31.

During experience maize did not received mineral fertilizers, and weed control was performed manually.

Field net N mineralization (NNM) was measured using a pvc perforated pipes (15 cm length, 4 cm diameter), in nine sequential incubation periods (IP). At each interval 12 intact soil cores were collected from each sub plot at 0-15 cm depth. Six cores were mixed and sieved (2 mm). A sample was weigh and dried at 105ยบC for 24 h, for gravimetric moisture determination. Other sample was frozen for N mineral determination. The other six cores were enclosed in plastic bags, placed up in the subplots, and incubated for one week in the first two periods, and for two weeks for the other periods.

At the end of the incubation period, soil cores from the bags were mixed to produce one sample for each subplot and processed like pre - incubation cores.

The extractions of pre and post-incubated soil samples were analyzed for NH4-N and NO3-N with the method reported by Mulvaney (1996). The difference between the amount of inorganic N in post and pre-incubated soil was used to calculate net N mineralization during the period of incubation. The sum of net N mineralized, during each incubation provided the estimate of the total mineralized N. All data were analyzed using SPSS 17.0 software. Analysis was performed separately for each date of sampling.

Results and Discussion Daily average temperatures and rainfall during experiment are presented in Fig.1. Temperatures ranged from 9.5ยบC and 29.2ยบC. The environmental conditions may influence net N mineralization.

Low soil temperatures are associated a reduced mineralization or immobilization and high temperatures support mineralization rates (Monaco et al., 2010). In experiment with broiler litter N mineralization, Sistani et al., (2008) verified that soil moisture content not have influence in N mineralization rate.

The total N content present at the plant residues is shown at Table 1. N added by cover crops do not differ statistically by sowing dates, but differ significantly (p = 0.00) for cover crops.

Temperature (ยบC)

30

10

20 5

10 0 12.05.17

0 12.06.16 Rain (mm)

12.07.16 12.08.15 Temperature (ยบC)

Rain (mm)

15

40

Table 1. N added by cover crops

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Fig. 1. Daily average temperatures and rainfall

2082

Net N mineralization rates (NNM) occurred at the fifth incubation period. In the sixth and seventh incubation period occurred a net N immobilization. During the experiment we observed an initial N release, followed by a net immobilization and in the last period an increased net N mineralization. N immobilization occurred when there have been higher temperatures and lower water soil content. We find statistically significant differences at the first, third and fourth IP, for sowing dates (p = 0.022, p = 0.019 and p = 0.014 respectively) and for cover crops (p = 0.006, p = 0.041 and p = 0.010). For all cover crops the bigger NNM was measured at the last IP (Fig.2). Lesser NNM (or biggest N immobilization) was measured for all cover crops in the sixth IP, except for balansa clover which biggest N immobilization occurred at the seventh IP. In the sixth IP were recorded higher temperatures. Schomberg (1998) noted too smaller mineralization were occurred high temperatures.

Ryegrass of LSD was the only cover crops treatment without N immobilization. These values can be underestimates because enclosing soil in buried bags for 2 weeks excludes living roots and prevent plant N uptake during incubation (Abril et al., 2001; Monaco et al., 2010). Net soil N mineralization average was 0.58 mg kg-1 d-1 for balansa clover, 0.60 mg kg-1 d-1 for ryegrass and 0.71 mg kg-1 d-1 for yellow lupine. The value for balansa clover is similar to the value founded for crimson clover by Schomberg and Endale (2004) in Watkinsville, Georgia. +)))"

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R – Ryegrass; BC – Balansa Clover; YL – Yellow Lupine; ESD – Earlier Sowing Date; LSD – Late Sowing Date; IP – Incubation Period

Fig. 2. Net N Mineralization rate (μg N kg-1 d-1)

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Cumulative net soil N mineralized differ statistically by sowing dates in first and fourth incubation period (p = 0.022 and p = 0.048, respectively), being in the first IP biggest in late sowing date and in the fourth IP is biggest in earlier sowing date. Significantly differences in cover crops are achieved up to the sixth IP. Yellow lupine has de highest cumulative nitrogen mineralized in all periods. Is always significantly different of italian ryegrass, and in first, third, fourth and fifth period is also significantly different of balansa clover. Significantly difference between yellow lupine and ryegrass is expected, because in literature there are several references about small N mineralization by non legumes (Schomberg and Endale, 2004). Differences between legumes indicate that N mineralization is affected by legumes species (Nakhone and Ali Tabatabai, 2008). Major determinant for mineralization is plant material, but temperature and humidity also can influence mineralization (Thorup- Kristensen et al., 2003). Soil mineral N (SMN) was evaluated along the experiment (Table 2). Significantly differences were observed until 42 days after incorporation in sowing dates, with earlier sowing date bigger than late sowing date. Cover crops induced significantly differences at 83 days after incorporation and plots with yellow lupine are significantly different of ryegrass (36.6 mg N kg-1 and 15.00 mg N kg-1, respectively).

Table 2. Soil mineral nitrogen (mg N kg-1) Days after incorporation ryegrass ESD (Earlier balansa clover Sowing Date) yellow lupine LSD (Late Sowing Date)

0

7

14

28

42

56

70

83

98

7.4 7.6 10.5

10.8 14.1 17.7

12.9 16.9 21.1

25.5 30.0 33.6

30.9 41.2 39.8

32.9 32.6 51.5

46.0 50.5 65.5

16.9 32.6 45.2

14.1 10.7 9.8

ryegrass

4.3

5.4

7.2

12.6

13.6

20.4

31.0

13.1

7.6

balansa clover

5.9

7.8

10.0

17.5

22.2

28.5

44.3

17.2

12.5

yellow lupine

6.0

10.0

12.8

22.3

28.3

35.9

40.0

27.9

6.7

In all treatments soil mineral N increased to 70 days after incorporation of cover crops and decreased thenceforth. This decay in soil mineral N can be explains by major absorption of main crop. Between 83 and 98 days after cover crops incorporation a high rainfall occurred (12.5 mm in one day), maybe leached soil N mineral.

Conclusions Net N mineralization ranged between cover crops in the beginnings of experiment. Yellow lupine has a bigger average of net N mineralization. In last incubation period is where a highest net N mineralization occurred, except for balansa clover for late sowing date. Soil mineral N is higher in plots with legumes than plots of ryegrass, excepted in the end of experiment.

Although this technique can be considered a good indicator of soil net N mineralization dynamics, it is necessary to compare these field results with themes obtained in laboratory incubation, where all variables are controlled, and compare with the results obtained by the N balance /cropping data method, because some authors consider can be underestimate of total mineralized N .

Acknowledgements This work was financially supported with a grant to the first author (SFRH/BD/69105/2010) funded by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT/ MCTES, Portugal).

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Variabilidad en compuestos fenólicos del residuo hidrodestilado de Thymus mastichina M.C. Asensio-S.-Manzanera1, I. Méndez1, Y. Santiago1, H. Martín1 y B. Herrero2 1

Unidad de Cultivos Leñosos y Hortícolas, Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León, Ctra. de Burgos km 119, 47071 Valladolid, asesanmr@itacyl.es 2 Universidad de Valladolid, ETSIA, Avda. de Madrid, 57, 34004 Palencia

Resumen Gran parte de los antioxidantes que actualmente utiliza la industria son de origen sintético y su uso es actualmente controvertido, por lo que se buscan compuestos de origen natural que los sustituyan. En relación con esto, se ha estudiado la actividad antioxidante de extractos de especies de la familia Lamiaceae, incluido Thymus mastichina, sin embargo hay poca información disponible acerca de la composición fenólica de los extractos de dicha especie. El aceite esencial de T. mastichina es utilizado en la industria cosmética y perfumera, sin embargo el residuo hidrodestilado puede revalorizarse como fuente de compuestos antioxidantes. En el año 2008 se recogió material vegetal de 46 poblaciones silvestres de mejorana en las 9 provincias de Castilla y León. El material vegetal se hidrodestiló en Clevenger y el residuo hidrodestilado fue secado y molido. Los compuestos fenólicos fueron extraídos con metanol en un Soxlet, seguido de un rotavapor. Los contenidos de los extractos en flavonoides y ácidos fenólicos fueron determinados mediante un HPLC (High Performance Liquid Chromatograph) con detector DAD (Diodo Array Detector). La identificación de los compuestos se realizó comparando con patrones. Para estudiar la variabilidad entre las muestras analizadas así como la influencia de los diferentes compuestos en dicha variabilidad, se llevó a cabo un análisis cluster y un análisis de componentes principales.

La suma total de los compuestos fenólicos detectados se encontró en un rango de 272 (TM-10, Villamayor, Salamanca) y 1298 (TM-45, Salinas de Pisuerga, Palencia) mg/100 g de extracto seco. De los 18 compuestos evaluados, se detectaron 14, 5 de ellos aparecen en cantidades significativas: apigenina, kamferol, luteolina, ácido 3-metoxisalicilico y ácido rosmarínico. El compuesto fenólico detectado con mayor contenido fue el ácido rosmarínico (cuyo rango fue de 89-985 mg/100 g de extracto seco), seguido del ácido 3-metoxisalicílico (49-214 mg/100 g de extracto seco). Del análisis de componentes principales se deduce que kamferol, apigenina y luteolina aportaron más variabilidad al conjunto de las muestras analizadas que los compuestos más abundantes, ácido rosmarínico y ácido 3-metoxisalicílico. El análisis cluster muestra tres grupos de muestras. El grupo 1 se caracteriza por un bajo contenido en compuestos fenólicos y está formado por 16 poblaciones. El grupo 2, el más numeroso ya que agrupa 23 poblaciones, destaca por la alta cantidad de ácido rosmarínico y ácido 3metoxisalicílico. Finalmente, 7 poblaciones formaron el grupo 3, caracterizado por altos contenidos en apigenina, kanferol y luteolina.

Palabras clave: mejorana, polifenoles, revalorización de residuos

Phenolic compounds variability in hydrodistilled residue of Thymus mastichina Abstract Most of antioxidants used by industry are synthetic and their use is controversial, so it might be highly desirable to find out natural compounds with antioxidant activity. Owing to this, the antioxidant activity of extracts from several Lamiaceae species have been evaluated, including Thymus mastichina, but less information is available about the phenolic composition of extracts from this species. As essential oil of T. mastichina is used by perfume and cosmetic industry, the hydrodistilled residue could be revalued as source of antioxidant compounds. In 2008, samples of plant material from 46 wild populations of Spanish marjoram have been collected around the nine provinces of Castilla y León. After extracted the essential oil by hydrodistillation in Clevenger, the waste was

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dried and ground. Phenol compounds were extracted with methanol in a Soxlet apparatus and a rotary evaporator. The contents of dry extracts in flavonoids and organic acids were determined by a High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) with a Diode Array Detector (DAD). Compounds identification was done by comparing with pure standards. To study the variability among the samples analyzed and the compounds that influence in that variability, a cluster and principal component analysis have been calculated.

The total content of evaluated phenol compounds ranged from 272 (TM-10, Villamayor, Salamanca) to 1298 (TM-45, Salinas de Pisuerga, Palencia) mg/g of dry extract. Of the 18 evaluated compounds, 14 were detected, 5 in significant amounts: apigenin, kampherol, luteolin, and 3-metixisalicilic and rosmarinic acids. The main phenol component detected was rosmarinic acid (ranging between 89 and 985 mg/g of dry extract), followed by 3-metoxisalicilic acid (49-214 mg/g of dry extract). The principal component analysis reported that kampherol, apigenin and luteolin provide more variability to the set of samples evaluated, than the most abundant compounds, 3-metoxisalicilic and rosmarinic acids. The cluster analysis showed that samples could be distributed in three groups. Group 1 was characterized by a low content of total phenols and grouped 16 populations. Group 2, the largest one formed by 23 populations, was highlighted by the large amount of 3metoxisalicilic and rosmarinic acids. Finally, the 7 populations grouped in group 3 showed high content in apigenin, kampherol and luteolin.

Keywords: Spanish marjoram, polyphenols, waste valorization

Introducción Thymus mastichina L. es una especie endémica de la Península Ibérica, perteneciente a la familia Lamiaceae. Posee hojas simples y opuestas, flores blancas, bilabiadas, agrupadas en capítulos de forma esférica. El periodo de floración se extiende desde finales de mayo-principios de junio a finales de julio-principios de agosto. Crece sobre todo en terrenos arenosos y silíceos y está dividida en dos subespecies: T. mastichina subsp. mastichina que se distribuye por toda la Península aunque es menos abundante en la costa Noroeste española y en la costa Mediterránea, y T. mastichina subsp. donyanae que se encuentra únicamente en el suroeste de la Península (Morales, 2010).

Como otras especies del género, la mejorana se utiliza en perfumería, en la industria cosmética, como planta melífera, como especia, y también por sus propiedades medicinales. Entre las propiedades medicinales descritas, se incluyen propiedades antisépticas, digestivas, antirreumáticas y antitusivas.

Por sus propiedades antisépticas y antioxidantes podría ser utilizada como aditivo en la industria alimentaria. Gran parte de los antioxidantes que actualmente utiliza la industria son de origen sintético y su uso es actualmente controvertido, por lo que se buscan compuestos de origen natural que los sustituyan. Se ha estudiado ampliamente la actividad antioxidante del aceite esencial de especies de la familia Lamiaceae, incluido T. mastichina (Miguel et al., 2004; Miguel et al., 2005; Miguel et al., 2007) y de extractos de esta especie (Albano y Miguel, 2011; Asensio-S.-Manzanera et al., 2011), sin embargo hay poca información disponible acerca de la composición fenólica de los extractos de dicha especie. La extracción de antioxidantes del residuo hidrodestilado de T. mastichina y de otras especies relacionadas, puede revalorizar este subproducto como fuente de compuestos antioxidantes.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la variabilidad de la composición química del residuo hidrodestilado de poblaciones de mejorana española procedentes de la Meseta Norte.

Material y Métodos Se recogieron 46 muestras representativas de poblaciones silvestres de T. mastichina en el verano de 2008, en las provincias de Ávila (3 poblaciones), Burgos (5), León (9), Palencia (3), Salamanca (8),

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Segovia (6), Soria (6), Valladolid (1) y Zamora (5). Se recogió la parte aérea de al menos 25 plantas elegidas al azar de cada una de las poblaciones. Las muestras se recolectaron en estado de floración entre el 18 de junio y el 27 de julio. Todas las muestras fueron geo-referenciadas. Las poblaciones fueron recolectadas entre los 434 m (TM-25, Langa de Duero, Soria) y los 1210 m de altitud (TM-07, Béjar, Salamanca) (Tabla 1).

Tabla 1. Poblaciones recolectadas de Thymus mastichina.

Nº Fecha de muestra Recolección Provincia Localidad Latitud TM01 20080611 Zamora Toro 413122N TM02 20080611 Zamora Muelas del Pan 413128N TM03 20080611 Zamora Fermoselle 411743N TM04 20080611 Salamanca Vitigudino 410028N TM05 20080611 Salamanca Fuenteaguinaldo 402710N TM06 20080611 Salamanca Sequeros 403122N TM07 20080612 Salamanca Béjar 402309N TM08 20080612 Salamanca Valdemierque 404929N TM09 20080612 Salamanca Mozarbez 405049N TM10 20080612 Salamanca Villamayor 410246N TM11 20080612 Salamanca Golpejas 405926N TM12 20080612 Valladolid Tordesillas 412933N TM12A 20080618 León Villamañan 421911N TM13 20080618 León Carrizo 423520N TM14 20080618 León Truchas 421325N TM15 20080618 Zamora Riofrío de Aliste 414854N TM16 20080619 Soria Burgo de Osma-Ciudad de Osma 413419N TM17 20080619 Soria Almazán 412826N TM18 20080619 Soria Aldealpozo 414650N TM19 20080619 Soria Los Rábanos 414026N TM20 20080701 Burgos Oña 424459N TM21 20080704 Segovia San Ildefonso/La Granja 405437N TM22 20080704 Segovia Prádena 410728N TM23 20080704 Segovia Riaza 411527N TM24 20080704 Segovia Ayllón 412500N TM25 20080704 Soria Langa de Duero 413643N TM26 20080709 Segovia Coca 411148N TM27 20080709 Ávila Arévalo 410259N TM28 20080709 Ávila El Barraco 402804N TM29 20080709 Ávila Serranillos 402040N TM30 20080711 Zamora Benavente 420004N TM31 20080715 Burgos Villarcayo de Merindad de Castilla la Vieja 425601N TM32 20080715 Burgos Oña 424721N TM33 20080716 León Peranzanes 423407N TM34 20080716 León Vega de Espinareda 424309N TM35 20080716 León Páramo del Sil 424816N TM36 20080716 León Cabrillanes 425714N TM37 20080716 León Carrocera 424942N TM38 20080720 Segovia Villacastín 404622N TM39 20080723 Burgos Lerma 420248N TM40 20080723 Burgos Salas de los Infantes 420318N

Longitud Altitud 0052424W 704 0055825W 743 0062258W 607 0063001W 763 0063732W 843 0060034W 754 0054313W 1210 0053324W 932 0053830W 913 0055920W 830 0055548W 808 0050054W 675 0053534W 815 0055206W 884 0061512W 957 0061017W 820 0030040W 921 0023538W 933 0021258W 1061 0023313W 1078 0032437W 570 0040245W 687 0034209W 709 0032805W 814 0032156W 587 0032459W 434 0043053W 790 0044633W 823 0043751W 928 0045415W 1190 0054213W 718 0033309W 801 0032451W 550 0064604W 507 0063805W 737 0063125W 708 0061029W 926 0115213W 1029 0042253W 1056 0034752W 828 0032311W 947

2088

TM41 TM42 TM43 TM44 TM45

20080723 20080711 20080711 20080711 20080711

Soria Palencia León Palencia Palencia

Vinuesa Saldaña Boñar Guardo Salinas de Pisuerga

415345N 423158N 425143N 424613N 425021N

0024623W 0044326W 0051816W 0045148W 0041938W

1090 816 1017 1197 956

El contenido en flavonoides y ácidos fenólicos de los extractos fue determinado mediante HPLC (Agilent Technologies 1200 series) con un detector Diodo Array (DAD) y una columna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 mm x 4,6 mm d.i., 5 µm; Agilent Technologies). La columna operó a 25ºC y el volumen de inyección fue de 20 µL. La fase móvil estuvo compuesta por ácido acético al 2% (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). El caudal fue de 1,2 mL min-1. El gradiente de la fase móvil fue: 90% A + 10% B al inicio, 78% A + 22% B 10 min, 62% A + 38% B a 12 min, después la elución fue isocrática 17 min, y la proporción final fue de 0% A + 100% B 20 min. La identificación de compuestos se realizó comparando los patrones puros a longitudes de onda de 254, 280 y 360 nm dependiendo de la máxima absorción de cada compuesto. Las disoluciones para la curva de calibrado fueron preparadas en acetonitrilo/agua (1/1). Las concentraciones de cada compuesto en las disoluciones patrón fueron: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0 y 80,0 µg/mL. La concentración de cada compuesto se expresó en mg/100 g de extracto.

El análisis estadístico de los datos se realizó con SPSS (versión 19.0, IBM Corporation, New York, U.S.A.). Se realizó un análisis de componentes principales y un análisis cluster.

Resultados y Discusión La suma total de los compuestos fenólicos detectados se encontró en un rango de 272 (TM-10, Villamayor, Salamanca) y 1298 (TM-45, Salinas de Pisuerga, Palencia) mg/100 g de extracto seco, mostrando una gran variabilidad entre las muestras analizadas. Se analizaron 18 compuestos, de los cuales 4 no fueron detectados: ácido 3,5 dihidroxibenzoico, ácido cinámico, hesperidin y rutina. Ácido abscísico, ácido cafeico, ácido clorogénico, ácido cumárico, emodina, hesperetin, quercetina, ácido siríngico y xantona, fueron detectados pero en cantidades inferiores a 20 mg/ 100 g de extracto seco (Tabla 2).

De los 14 compuestos detectados, 5 de ellos están presentes en cantidades significativas: apigenina, kamferol, luteolina y ácido 3-metoxisalicílico y ácido rosmarínico (Tabla 2). Como ya ha sido reportado en la familia Lamiaceae y en otras especies de Thymus (Kulisic, Dragovic-Uzelac y Milos, 2006), el compuesto fenólico detectado en mayor cantidad fue el ácido rosmarínico (cuyo rango fue de 89-985 mg/100 g de extracto seco), seguido del ácido 3-metoxisalicílico (49-214 mg/100 g de extracto seco).

En el análisis de componentes principales realizado con los cinco compuestos más abundantes, los dos primeros ejes explican el 75,52 % de la variabilidad. Existe una alta correlación positiva entre apigenina, kanferol y luteolina; estas variables se sitúan en el eje 1 que explica el 52,16% de la variabilidad. En el eje 2, que explica el 23,36% de la variabilidad de estas muestras, está representado el ácido rosmarínico, el compuesto principal en todas las muestras analizadas. Del análisis de componentes principales se deduce que kamferol, apigenina y luteolina aportaron más variabilidad al conjunto de las muestras analizadas que los compuestos más abundantes, ácido rosmarínico y ácido 3metoxisalicílico.

2089

El análisis cluster presenta tres grupos de muestras (Figura 1). El grupo 1 se caracteriza por un bajo contenido en compuestos fenólicos y está formado por 16 poblaciones. El grupo 2, el más numeroso ya que agrupa 23 poblaciones, destaca por la alta cantidad de ácido rosmarínico y ácido 3metoxisalicílico. Finalmente, 7 poblaciones formaron el grupo 3, caracterizado por altos contenidos en apigenina, kanferol y luteolina.

Tabla 2. Promedios y rangos del contenido en los 14 compuestos fenólicos detectados en el residuo hidrodestilado de poblaciones de T. mastichina (mg/100 g de extracto seco).

Promedio Desv. estándar Máximo Mínimo Ácido 3-metoxisalicilico 115 40 214 49 Ácido abscísico 0 1 3 0 Apigenina 50 17 91 15 Ácido cafeico 5 3 15 0 Ácido clorogenico 1 2 5 0 Ácido cumarico 0 1 4 0 Emodina 0 1 2 0 Hesperetin 0 1 5 0 Kanferol 45 13 69 20 Luteolina 107 43 185 29 Quercetina 4 2 8 0 Ácido rosmarínico 466 214 985 89 Ácido siríngico 1 2 5 0 Xantona 0 0 2 0 Suma total 796 259 1298 272 TM01 TM27 TM19 TM37 TM02 TM33 TM03 TM34 TM39 TM04 TM42 TM05 TM45 TM12A TM35 TM43 TM44 TM36 TM21 TM22 TM24 TM23 TM32 TM06 TM12 TM15 TM28 TM26 TM29 TM31 TM16 TM07 TM10 TM20 TM11 TM25 TM40 TM18 TM38 TM08 TM13 TM09 TM41 TM30 TM14 TM17

0

10

20

30

40

50

60

70

Linkage Distance

Figura 1. Análisis cluster de 46 poblaciones de mejorana, basado en la composición fenólica de su residuo hidrodestilado.

2090

Conclusiones Existe una variabilidad importante en la capacidad antioxidante que muestran diferentes poblaciones de mejorana (Asensio-S.-Manzanera et al., 2011), corroborada en este trabajo por la elevada variabilidad observada en el contenido en compuestos fenólicos entre las poblaciones analizadas. Es previsible que esta variabilidad sea en parte ambiental, pero los resultados obtenidos permiten suponer que es posible realizar una selección de aquellas poblaciones con mayor contenido en compuestos fenólicos, y aumentar así el rendimiento de extracción de compuestos antioxidantes.

Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado con el proyecto RTA2009-00062-C03, financiado por el INIA y cofinanciado con Fondos FEDER.

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Tabla 1. Itinerario seguido por los limones con indicación de las distancias marinas en millas náuticas y la velocidad del barco en knudos.!

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Figura 1. Evolución temporal de la temperatura registrada por tres grupos de sensores y su ubicación en el interior del contenedor. Grupo 2 en azul oscuro, grupo 7 en azul claro y el grupo de 10 en negro. Las curvas elípticas indican los ciclos diarios de temperatura. LSS: transporte marítimo largo. SSS: transporte marítimo corto.

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Figura 2. Diagrama de fases de temperatura para 8$<?=@=la izquierda puntos calientes (sensores grupo 2 en azul oscuro), en el centro zona de estabilidad térmica (sensores grupo 10 en negro) y a la derecha puntos fríos del contenedor (sensores grupo 7 en azul claro). Se señala en rojo la envolvente seleccionada para el cómputo de áreas.

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Bibliografía L(&R,*!L#*!*%R(%S//"*!.#*!,,))(RR"%(*!.#*!*:SUU"*!/#*!+,..",*!G#*!,%!!0$%$&,RR"*!,#!N<L)KP#!*!$$T"$\!(%!*:."14((!!+S++)Z! LO,"%!Y.,/$,7")"RZ!7Z!0$,%&!(4!$.XG!Y$/O%()(:Z#!Food and Bioprocess Technology!6*!KdK1Kii#!

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Variedades tradicionales de tomates de Canarias L. Amador1, B. Santos2 y D. Ríos2 1 Cultivos y Tecnología Agraria de Tenerife (CULTESA). Ctra. Guajonye 68, 38350. Tacoronte. Santa Cruz de Tenerife. leonardoad@cultesa.com 2 Servicio Técnico de Agricultura y Desarrollo Rural. Cabildo Insular de Tenerife. C. Alcalde Mandillo Tejera 8, 38007. Santa Cruz de Tenerife.

Resumen En este trabajo se ha llevado a cabo, por primera vez en Canarias y durante dos años experimentales, la caracterización morfológica de 59 variedades tradicionales de tomates de Canarias, mediante la utilización de los descriptores internacionales para el tomate IPGRI. El exhaustivo estudio de caracterización morfológica ha permitido la elaboración de fichas varietales del tomate tradicional de Canarias. Como resultado de este trabajo, CULTESA ha editado el libro variedades tradicionales de tomates de Canarias.

Los resultados obtenidos en este estudio nos permiten ser optimistas a la hora de establecer el cultivo de las variedades tradicionales de tomate de Canarias como una alternativa para los agricultores. El presente trabajo pretende aportar resultados que puedan ayudar a promocionar y valorizar el consumo de hortalizas y en concreto del tomate tradicional de Canarias como símbolo de diversidad agrobiológica y patrimonio genético vegetal de Canarias.

Palabras clave: variedades tradicionales, Islas Canarias, tomate, IPGRI

Traditional varieties of tomato from Canary Islands Abstract In this project the morphologic characterization of 59 traditional varieties of tomatoes from the Canary Islands has been carried out for the first time in this place and for two experimental years. These varieties have been evaluated in a morphological way through the utilization of international descriptors for the tomato IPGRI. The exhaustive study of morphologic characterization has allowed the production of varietal cards of the traditional tomato of Canaries. As result of this work, CULTESA has edited the book traditional varieties of tomatoes from Canary Islands.

The results obtained in this analysis allow us to be optimistic at the moment of establishing the growing of the traditional varieties of the tomato from the Canary Islands as an alternative for the farmers. This project tries to show results which will help to promote and value the vegetable consumption and particularly of the traditional tomato from the Canary Islands as a symbol of the agrobiologic diversity and vegetal genetic heritage of this place.

Keywords: traditional varieties, Canary Islands, tomato, IPGRI

Introducción y/o Justificación La base genética de los cultivares tradicionales de tomate es el resultado de un largo proceso de selección. Durante este periodo, se desarrollaron cultivares adaptados a una estación cálida y con destino a mercados locales, existiendo hoy en día multitud de tipos con estas características. Estos cultivares presentan, en general, una excelente calidad organoléptica, aunque su aspecto y uniformidad sean a veces deficientes. Además, las variedades tradicionales pueden ocupar también un lugar preponderante dentro de la agricultura biológica. El consumidor de estos productos desea calidad y dichas variedades la ofrecen (Nuez, 1995).

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La agricultura actual europea muestra una tendencia hacia la búsqueda de la calidad frente a elevados niveles productivos. Los productos tradicionales se presentan como complemento a las variedades comerciales al poseer una serie de cualidades diferentes, por lo que resulta fundamental y necesario caracterizarlas y evaluarlas con el objetivo de detectar su potencial (Jiménez et al., 2010).

En base a estas consideraciones, las variedades tradicionales pueden ocupar un nicho de mercado al proporcionar un nivel de calidad superior. Del mismo modo, al ser productos para mercados más cercanos, se reduce la manipulación y transporte de los frutos entre los centros de producción y comercialización, llegando a destino con un estado de madurez óptimo (Barba, 2005). Cada vez más consumidores aceptan pagar un precio de venta superior con tal de reencontrar el verdadero sabor de los productos agrícolas que, en muchas ocasiones, brilla por su ausencia en las variedades modernas mejoradas (Cebolla-Cornejo, 2005).

Las variedades locales permiten contribuir al aumento de la diversidad biológica presente en los agrosistemas y muestran una mayor adaptabilidad a las condiciones de cultivo. Este hecho hace que muchas de estas variedades tengan un cierto grado de adaptación a las plagas y patógenos locales.

Asimismo, suponen una herencia cultural de gran importancia que no debe desaparecer, al igual que las culturas y saberes tradicionales a las que van ligadas, ya que son fruto de una coevolución con la naturaleza (Amador et al., 2012).

La importancia del cultivo de tomate en la estructura socioeconómica de las Islas Canarias, la disminución en la superficie cultivaba durante la última década y la búsqueda de productos diferenciados de alta calidad, entre otros factores, ha fomentado el interés para llevar a cabo, desde hace 4 años, una investigación de la colección de tomate tradicional de Canarias con la finalidad de detectar la idoneidad de este importante legado agrícola.

Cultivos y Tecnología Agraria de Tenerife (CULTESA), conjuntamente con el Centro de Conservación de la Biodiversidad Agrícola de Tenerife (CCBAT) y la Universidad de la Laguna (ULL), se embarcaron en una línea de investigación conjunta y pionera en el Archipiélago canario titulada “Selección y mejora de las variedades tradicionales de tomate de Canarias”.

Uno de los objetivos fundamentales de este estudio ha sido la recuperación de algunas de estas variedades para el consumo habitual, adaptándolas a los sistemas de cultivo actuales, con el fin de que se puedan descubrir o redescubrir sabores que ya casi estaban en el olvido. Dentro del grupo de 59 variedades tradicionales, muchas de ellas como el tomate de “manzana negra”, “moscatel”, “huevo de gallo”, “perita”, “martina”, “de caña morada”, etc, ocupan una especial relevancia, por ser grandes joyas agrícolas desconocidas y por ofrecer ante todo excelentes cualidades en cuanto a sabor.

Precisamente, el valor diferencial por el que sobresalen muchas de estas variedades es su excelente calidad organoléptica, como ha determinado el panel de expertos catadores del que dispone la Unidad de Valorización de Productos Agroalimentarios del Cabildo Insular de Tenerife. Este hecho, además, ha sido constatado in situ a través de diversas catas que se han llevado a cabo en diferentes mercados de Tenerife con más de 600 consumidores que han mostrado claramente su preferencia por las variedades locales frente a variedades comerciales (Amador et al., 2012).

Estas variedades resultan de una selección de semillas que realizaba el agricultor en función de sus propios criterios: desde un punto de vista agronómico, en el terreno y en la mesa. Hoy, la elección del agricultor prácticamente ha desaparecido. Ya no elige, sino que compra las semillas que las grandes casas comerciales le surten, más por su alta productividad que por su calidad organoléptica. En este escenario, las variedades locales estaban avocadas a una extinción segura de no ser por la salvaguarda de simientes por parte de los propios agricultores, la existencia de bancos de germoplasma y la ejecución de proyectos de investigación en los que se trabaja para su recuperación y valorización.

Que en un territorio alejado y fragmentado como Canarias se hayan podido recuperar, conservar y caracterizar 59 variedades locales de tomate, dice mucho de la riqueza fitogenética que se concentra en esta región, de la labor de protección desarrollada por los agricultores y los bancos de germoplasma

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durante décadas para evitar la pérdida de este material y de la posibilidad que se le abre al sector tomatero de poder ofertar los sabores añorados de esta hortaliza a un mercado cada vez más pujante que busca por encima de todo calidad organoléptica y respeto al medio ambiente. Esta colección de tomates locales ha quedado recogida en la obra que edita CULTESA y que se presenta en este congreso bajo el título de Variedades tradicionales de tomates de Canarias.

Material y Métodos La caracterización morfológica se realizó mediante el empleo de los descriptores para el tomate

del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI, 1996). Se analizaron un total de 55 descriptores correspondientes a la parte vegetativa, inflorescencia, fruto y semilla en 59 variedades locales de tomate procedentes del Centro de Conservación de la Biodiversidad Agrícola de Tenerife (CCBAT) y del Instituto Universitario de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV) (Tabla 1).

El diseño experimental se llevó a cabo en las campañas 2008-2009 y 2009-2010, en invernaderos de la zona sur de Tenerife (Arico). El ensayo se distribuyó en bloques al azar con tres repeticiones, evaluándose 20 plantas por parcela experimental.

Tabla 1. Variedades tradicionales de tomates de Canarias.

Isla Entrada Isla Entrada Tenerife CBT00388 La Gomera CBT01898 Tenerife CBT00519 La Gomera CBT01899 Tenerife CBT00897 La Gomera CBT01900 Tenerife CBT01205 La Gomera CBT02718 Tenerife CBT01879 El Hierro CBT01870 Tenerife CBT01880 El Hierro CBT01901 Tenerife CBT01881 El Hierro CBT01902 Tenerife CBT01882 Gran Canaria CBT01864 Tenerife CBT01883 Gran Canaria CBT01865 Tenerife CBT01884 Fuerteventura CBT01861 Tenerife CBT01905 Fuerteventura CBT01862 Tenerife CBT01906 Fuerteventura CBT01863 Tenerife CBT01907 Fuerteventura CBT01885 Tenerife CBT01908 Fuerteventura CBT01886 Tenerife CBT01909 Fuerteventura CBT01887 La Palma CBT01871 Fuerteventura CBT01888 La Palma CBT01872 Lanzarote CBT01394 La Palma CBT01873 Lanzarote CBT01517 La Palma CBT01874 Lanzarote CBT01518 La Palma CBT01875 Lanzarote CBT01889 La Palma CBT01876 Lanzarote CBT01890 La Palma CBT01877 Lanzarote CBT01891 La Palma CBT01878 Lanzarote CBT01892 La Palma CBT01903 Lanzarote CBT01893 La Palma CBT01904 Lanzarote CBT01894 La Gomera CBT01866 Lanzarote CBT01895 La Gomera CBT01867 Lanzarote CBT01896 La Gomera CBT01868 Lanzarote CBT02716 La Gomera CBT01869 Lanzarote CBT02717 La Gomera CBT01897 -

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Resultados y Discusión La obra variedades tradicionales de tomates de Canarias incluye un recorrido histórico por el origen y la domesticación del tomate, se indaga en la evolución que ha tenido este cultivo de exportación en la estructura socioeconómica del Archipiélago canario, los cambios experimentados tanto en las técnicas culturales como varietales, sin olvidar los aspectos botánicos y nutricionales que caracterizan a esta hortaliza. Aunque interesante, el verdadero peso de este estudio recae en la caracterización morfológica de cada una de estas 59 variedades locales para las que se han empleado descriptores morfológicos correspondientes a la parte vegetativa, inflorescencia, fruto y semilla. Esta caracterización ha permitido la elaboración de una serie de fichas descriptivas que constituyen la parte principal e inédita de esta publicación, donde se incluyen datos de procedencia, denominación, comportamiento en postcosecha y 300 imágenes originales de referencia (Figura 1).

Figura 1. Ejemplo de ficha varietal.

El libro recoge variedades de tomates de todas las Islas Canarias, la mayoría de ellas desconocidas y sorprendentes para los consumidores por su forma, color, tamaño y denominación como “manzana negra”, “moscatel”, “huevo de gallo”, “perita”, “Martina” o de “caña morada”. Los hay redondos, achatados, alargados, cordiforme (con forma de corazón), piriforme (con forma de pera) o elipsoide (con forma de ciruela). Algunos son verdes o amarillos, pero también se pueden encontrar bajo tonalidades naranjas, rojas, rosadas, etc. Asimismo, dentro de este estudio se encuentran representados los grupos varietales tipo marmande, vemone, cherry, cocktail aperado, cocktail redondo, canario o pimiento.

Pero su calidad organoléptica no es su único rasgo destacable. Desde un punto de vista agronómico, el potencial de estas variedades tradicionales de tomate, logradas gracias a la conservación de los agricultores, generación tras generación, y a un proceso de selección y mejora, reside en su adaptabilidad a las condiciones agroecológicas de Canarias, así como a su resistencia frente a las plagas y enfermedades y, por tanto, a su menor exigencia en insumos. Están pensadas, en su mayoría para mercado interior, aunque no se descarta su exportación, una vez que se haya evaluado su demanda y viabilidad. Además, al ser un producto de cercanía, recogido en el punto exacto de

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maduración, se reduce la manipulación y el transporte de los frutos entre los centros de producción y comercialización, por lo que su cultivo contribuye a la sostenibilidad y protección del medio ambiente.

Por otro lado, su composición química refuerza su peso agronómico. A las concentraciones de vitamina C y E, ácido fólico y ß-caroteno, se suma el contenido de licopeno, un potente anticancerígeno que en algunas de estas variedades presentan valores superiores a los existentes en las variedades comerciales.

A partir de los resultados obtenidos, se ha realizado una selección y mejora de aquellas que han resultado más interesantes con el fin de poder ofrecer las garantías suficientes para que en un futuro puedan convertirse en una oportunidad de negocio para los agricultores canarios y puedan estar más presentes en los supermercados, restaurantes y mercadillos.

Decir en su contra, que el aspecto y la uniformidad de estas variedades locales de tomate son a veces deficientes, lo que de entrada puede repercutir en su aceptación comercial. Si bien a primera vista, puede influir más la apariencia externa a la hora de elegir un tomate, es decir, decantarse por aquellos que presentan un forma más homogénea, a la larga es la calidad interna, en cuanto a sabor y propiedades nutricionales, la que se impone, y en este sentido, las variedades tradicionales tienen mucho que aportar, además de que su recuperación va ligada a la cultura canaria y a los saberes tradicionales.

Conclusiones La obra Variedades tradicionales de tomates de Canarias permitirá al lector conocer las características más singulares de este abanico de variedades “de siempre” que ya sólo perduran en el recuerdo de los agricultores de mayor edad y que son típicas de una determinada zona o región de las que en ocasiones reciben el nombre.

Esta obra es un manual indispensable para el estudio y el reconocimiento de los tomates tradicionales, tanto a nivel científico como popular. Con una cuidada edición para favorecer la clasificación de los contenidos, esta publicación se ha diseñado siguiendo una estructura racional y clara facilidad para acceder a la información, lo que hace de este libro no solo un volumen de un riguroso estudio científico sino también un manual de cariz divulgativo a nivel de cualquier usuario.

Con la tendencia actual hacia una agricultura de calidad, las variedades tradicionales de tomate pueden tener una salida importante en el mercado, siendo este aspecto el mejor aliciente para su estudio.

Agradecimientos CULTESA quiere agradecer a la Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información (ACIISI) la financiación concedida para la ejecución del proyecto de I+D+i de Selección y mejora de las variedades tradicionales de tomates de Canarias (IDT-TF08025).

Bibliografía Amador, L., Santos, B., y Ríos, D. (2012). Variedades tradicionales de tomates de Canarias. Tenerife. ISBN:97884-695-6681-7, 233 pp.

Barba, E., Valverde, E., Sánchez, A., y Madrid, R. (2005). Calidad de variedades de tomate para industria I. Parámetros químicos. Agrícola Vergel 276, 608-613.

Cebolla-Cornejo, J. (2005). Recuperación de variedades tradicionales de tomate y pimiento: caracterización y mejora genética. Proquest Information and Learning, Ann. Arbor, EE.UU. 276 pp.

IPGRI. Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos. (1996). Descriptores para el tomate (Lycopersicon spp.). Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos, Roma, Italia. 48 pp.

Jiménez, A., Castillo, J., y Ortiz, R. (2010). Caracterización productiva y morfológica de variedades autóctonas de tomate. Vida Rural 305, 64-68.Nuez, F. (1995). El cultivo del tomate. Ediciones Mundi-Prensa.

Madrid. 775 pp.

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La autocompatibilidad en el almendro (Prunus amygdalus Batsch): estructura genética del alelo Sf y modificaciones de su expresión Ángel Fernández i Martí1,2* , J. Manuel Alonso1 y Rafel Socias i Company1 1

Unidad de Fruticultura, CITA de Aragón. Avda Montañana 930, Zaragoza Área de Biología Molecular, Parque Científico Aula Dei, Avda Montañana 930, Zaragoza * afernandez@pctad.com

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Resumen La autocompatibilidad (AC) en el almendro es un carácter agronómico muy crítico para asegurar la producción. Los métodos que se han utilizado para determinar la AC en el almendro son la observación de los tubos polínicos y el cuajado de frutos después de polinizaciones controladas. Sin embargo, las nuevas técnicas moleculares se han ido aplicando cada vez más durante estas dos últimas décadas. La AC ha sido relacionada con la presencia del alelo Sf, el cual pertenece a la serie alélica S, y es dominante sobre los otros alelos de AI. En nuestro trabajo, sólo un 25% de los individuos procedentes del cruzamiento ‘Vivot’ ! ‘Blanquerna’ ha sido AC, mucho menos de lo esperado, un 50%. Las dos diferentes versiones del haplotipo Sf, una activa y AI (Sfa) y la otra inactiva y AC (Sfi) han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa del estilo de ‘Vivot’ ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de ‘Blanquerna’. Estos resultados sugieren la presencia de un locus modificador no ligado al locus S, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. En esta tesis se han identificado dos nuevos loci situados fuera del locus S, los cuales se encuentran en el grupo 6 y 8.

La construcción de un fósmido en ‘Vivot’ y ‘Blanquerna’ ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran idénticas, a pesar de tener dos expresiones distintas. Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población. Los ensayos con Bisulfito sugieren que el ADN metilado sería el responsable de la activación y/o inactivación del haplotipo Sf. De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de la SfRNasa es metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en una expresión AC, como es el caso de ‘Blanquerna’, mientras que si el ADN no es metilado, como en ‘Vivot’, la RNasa permanece activa y la planta será AI. Además, se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los alelos Sf, S23 y S8 mediante modelización 3D. La principal diferencia encontrada fue que en la estructura del Sf, había un lazo más largo que en las otras dos RNasas AI, sugiriendo que los lazos grandes son susceptibles a la degradación proteólica e inactivación de la RNasa.

Palabras clave: Almendro, mejora genética, auto compatibilidad, QTLs, metilacion

Self (in) compatibility in almond; Genetic structure of the Sf allele and modification of its expression Abstract Although self-incompatibility (SI) is an important trait in plants from the evolutionary point of view, self-compatibility (SC) is a critical agronomic trait in order to ensure the production of an economic crop. SC has been identified in several almond cultivars, although it happens rarely. Traditionally tests of pollen tube growth and fruit set after controlled pollinations have been carried out for determining SC cultivars in almond. However, molecular methods have been developed in the last two decades to speed up the genotype determination in cultivars and selections in order to facilitate orchard management and breeding processes. SC has been so far only related with the presence of the Sf allele, allelic with the S series of SI alleles and dominant over SI. As a consequence, SC/SI has always been considered as a qualitative trait, controlled by a single multi-allelic locus, called the S-locus.

The presence of SC of the seedling in the family ‘Vivot’ ! ‘Blanquerna’ has been 25%, much less than expected, 50%. The two different versions of the Sf haplotype, one active and being SI (Sfa) and the other inactive

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thus being SC (Sfi), have shown the recognition of the Sfi-pollen tubes of ‘Blanquerna’ by the Sfa-RNase of ‘Vivot’. These results suggest the presence of a modifier locus unlinked to the S-locus which would control the SI/SC recognition mechanism. The molecular nature of the S-locus has been widely studied in many species.

Two additional loci located outside the S-locus are here described for the first time in the rosaceous family.

Thus, we may suggest that SI is a quantitative trait rather than a qualitative one.

In addition, the construction of a fosmid library in ‘Vivot’ and ‘Blanquerna’ has allowed to confirm that the alignment of their Sf-RNases and SFBf were identical. As it was not possible to find any difference between both versions of the Sf haplotype, it was decided to further investigate about DNA methylation, which is involved in changes in phenotype or gene expression caused by mechanisms other than changes in the DNA sequence. Thus, our experiments have allowed suggesting that DNA methylation could be responsible of the activation/inactivation of the Sf haplotype. In fact, when the Sf-RNase sequence is methylated, an inhibition of the expression takes place, as it happens in ‘Blanquerna’. Thus, this inactivation would be traduced into selfcompatibility. In the case of Sf-RNase sequences with non-methylated cytosines, as it happens in ‘Vivot’, the RNase would remain active and, as a consequence, it would be self-incompatible. On the other hand, we have constructed the three-dimensional structures of the almond Sf, S23 and S8 RNases trough molecular modelling tools. The main structural difference found between all RNases was that the Sf structure showed an extended looping region. The amino acid residues forming this long loop could be prone to degradation and/or inactivation and as a consequence this Sf-RNase could be less stable and thus would allow its pollen tube growth through its own pistil.

Keywords: almond, self-incompatibility, plant breeding, methylation, QTLs

Introducción y/o Justificación La mejora genética del almendro persigue la obtención de cultivares autógamos y de floración tardía para resolver los problemas de producción de esta especie predominantemente AI. El sistema de incompatibilidad del almendro es de tipo gametofitico, controlado por una serie de alelos en un solo locus, el locus S. Este locus está compuesto por dos genes, uno de actividad en el polen y otro en el pistilo. Las proteínas estilares S se han identificado como glicoproteinas con actividad ribonucleasa (S-RNasas), pero los cultivares AC, poseedoras del alelo Sf, ca Q`QRS aQS Q ZS Z` T TaZaS UVW XW T S Q S Z]YZS [!!"#$% &' % ()*) % +),% ',)*-% ,,./.+' % genes F-box, se han determinado recientemente, se han caracterizado y ligado al gen del pistilo, la S-RNasa. Sin embargo el mecanismo de interacción entre ambos genes es aún incierto (Hanada et al., 2009). Aunque la AC ha sido identificada en algunas variedades de almendro, es muy poco frecuente (Socias i Company et al., 2010a). Al observar el crecimiento del tubo polínico después de la auto-polinización en un grupo de descendientes del cruzamiento de almendro ‘Vivot’ (S23 Sfi) x ‘Blanquerna’ (SfSfa), se encontró un inesperado fenotipo incompatible en la mayoría de los individuos. Por ello, el objetivo de este estudio ha sido determinar las causas de este extraño comportamiento usando técnicas moleculares (NEpGHE y PCR) y bioinformáticas (modelización en 3D).

Material y Métodos Se han estudiado 90 plantones de la familia ‘Blanquerna’ x. ‘Vivot’. ‘Blanquerna’ (parental femenino) procede de una polinización libre de ‘Genco’ y ‘Vivot’ (parental masculino) es un cultivar tradicional de Mallorca. Durante tres años consecutivos se realizó la observación microscópica del crecimiento de los tubos polínicos según Socias i Company (1979). Se estudió el cuajado mediante el embolsamiento de ramas con un mínimo de 100 yemas florales para determinar la autogamia de los individuos y de los parentales, mediante el conteo de frutos 3 meses después de la floración. La actividad ribonucelasa se estudió

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/)+0.* )% ,.% 1*01.% 23 453% 67' 8' 0 % ) % .,$-% 9997). El DNA genómico de los individuos fue amplificado por PCR usando cebadores específicos (SfF/SfR y S23F/S23R) y genéricos (PaConsIF/PaConsIIR y PaConsIF/EMPCRconsRD). Por otro lado un total de 102 SSR fueron testados en la población ‘V ! B’. Estos marcadores moleculares fueron seleccionados por su gran nivel de polimorfismo así como por su distribución por el genoma de Prunus.

Posteriormente se construyó un mapa genético para cada parental usando el software MapMaker/EXP 3.0 y MapChart v.2.1. Posteriormente se realizó un análisis de QTL usando los fenotipos previamente obtenidos de AC/AI mediante el software MapQTL 4.0.

Se construyó una librería genómica (fósmido) de ambos parentales para obtener la secuencia completa del gen de la S-RNase y el SFB. Igualmente se extrajo ARN de tres tejidos (pistilos, polen y hojas) para comprobar su nivel de expresión en esos órganos. Para ello se realizó una rt-PCR así como otros ensayos mediante real-time PCR. Estos experimentos quisieron ser corroborados mediante epigenética, ya que teníamos presagios de que la metilación del ADN podría estar implicada en la expresión de la AC. Por ello, decidimos realizar estos estudios de ADN en ‘Blanquerna’ y ‘Vivot’. Para ello se extrajo ADN tanto del pistilo como de las hojas y posteriormente fueron sometidos al tratamiento con Bisulfito. Una vez tratado el ADN, se diseñaron marcadores moleculares específicos para la metilación a fin de amplificar fragmentos máximos de 200 pares de bases. Las muestras fueron posteriormente secuenciadas usando el Big Dye Terminator kit (Applied Biosystems).

Por último, la estructura tridimensional de las SRNasas presentes en ambos parentales (Sf, S8 y S23) se obtuvo mediante modelización. Para ello, varios software fueron empleados, entre ellos MODELLER 9v5, PROSAIIv3 y PROCHECK. Resultados y Discusión En el transcurso de este trabajo, sólo un 25% de los individuos procedentes del cruzamiento ‘Vivot’ ! ‘Blanquerna’ ha sido AC, mucho menos de lo esperado, un 50%. Las dos diferentes versiones del haplotipo Sf, una activa y AI (Sfa) y la otra inactiva y AC (Sfi) han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa del estilo de ‘Vivot’ ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de ‘Blanquerna’. Estos resultados sugieren la presencia de un locus modificador no ligado al locus S, el cual sería responsable del control de la AI/AC en esta población (Fernández i Martí et al., 2009). Aunque últimamente se ha profundizado mucho en el estudio del locus S a nivel molecular, su mecanismo de acción sigue sin estar del todo determinado, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. En este trabajo se han localizado por primera vez en la familia de las rosáceas dos nuevos loci situados fuera del locus S, los cuales se encuentran en el grupo 6 y 8 (Fernández i Martí et al., 2011). Con estos resultados, podríamos sugerir que la AI es un carácter cuantitativo y no cualitativo, como se suponía hasta la fecha.

Por otro lado, la construcción de una librería genómica (fósmido) en ‘Vivot’ y ‘Blanquerna’ ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran completamente idénticas (Fernández i Martí et al., 2010), a pesar de tener dos expresiones tan distintas. Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población. La metilación puede producir cambios en los fenotipos o en la expresión de los genes sin alterar las secuencias del ADN. Los ensayos llevados a cabo en esta tesis sugieren que el ADN metilado sería el responsable de la activación y/o inactivación del haplotipo Sf. De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de la Sf-RNasa es metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en una expresión AC, como es el caso de ‘Blanquerna’. En

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el caso contrario, si la secuencia de ADN no es metilada, como es el caso de ‘Vivot’, la RNasa permanece activa y a consecuencia la planta será AI.

Figura 1. Mapa de ligamiento de Vivot’ ! ‘Blanquerna’, incluyendo la posición del locus S y de los 2 nuevos loci identificados en G6 y G8

Además, se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los alelos Sf, S23 y S8 mediante herramientas bioinformáticas. La principal diferencia encontrada fue que en la estructura del Sf, había un lazo más largo que en las otras dos RNasas AI (Fernández i Martí et al., 2012). En la bibliografía se ha descrito que los lazos grandes son susceptibles a la degradación proteólica, por lo que este mismo fenómeno podría estar pasando en estas RNasas.

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Figura 2: Representación en 3D de la estructura proteica de los alelos Sf, S23 y S8. A) pertenece al diagrama de Ribbon, y b) a la superficie de la estructura modelizada. La estructura en azul y rojo perteneces a los alelos S23 y S8 mientras que la morada pertenece al alelo Sf.

Conclusiones Todos estos resultados apuntan a que la AC en el almendro puede estar controlada por un complejo de loci con un diferente nivel de expresión. Probablemente el locus S sea el de mayor efecto, mientras que los otros modificarían en mayor o menor nivel su expresión. En este trabajo se ha avanzado por primera vez en una especie del género Prunus en aspectos como la metilación y la estructura tridimensional de las proteínas, campos en los que necesariamente se deberá profundizar.

Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por el proyecto AGL2007-65853-C02-02 de la CICYT. A. Fernández-Martí agradece la beca concedida por el MEC y el Fondo Social Europeo (FSE) bajo los proyectos AGL 2004-06674-C02-01 y BES-2006-12621.

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