docentJasmineViaene
studiegebiedbiotechnologie
bachelorindeagro-enbiotechnologie
campusRoeselare
AEC 3-amino-9-ethylcarbazole
APAAP alkalischfosfatase/anti-alkalischfosfatase
1BB eerstejaarbiotechnologie
BCIG 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -galactopyranoside
BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfaat
bv. bijvoorbeeld
°C gradenCelsius
CISH chromogeneinsituhybridisatie
CLEM
CLSM confocalelaserscanningfluorescentiemicroscoop
4CN 4-chloro-1-naphtol
DAB diaminobenzidine
DAPI -diamidino-2-phenylindol
DEAE-dextraan diëthylaminoëthyl-dextraan
demiwater gedemineraliseerdwater
DMEM
DMSO dimethylsulfoxide
d.m.v. doormiddelvan
DNA deoxyribonucleïnezuur
d.w.z. ditwilzeggen
ECM extracellulairematrix
EDTA ethyleendiaminetetraacetaat
ELISA -
enz. enzovoort
ER endoplasmatischreticulum
FCS foetaalkalfserum
FISH fluorescenteinsituhybridisatie
FITC fluoresceïneisothiocyanaat g gram
HCl zoutzuur H
waterstofperoxide I oplossendvermogen
ISH insituhybridisatie
IVF invitrofertilisatie golflengte
m.a.w. metanderewoorden
metbehulpvan
mRNA
n brekingsindexvanhettussenmedium
N2 stikstof
NA numeriekeapertuur
NaCl natriumchloride
NBT
nm nanometer
o.a. onderandere
PAP peroxidase/anti-peroxidase
PAS
PBS -gebufferdezoutoplossing
PCR
PIPAAm poly(N-isopropylacrylamide)
% procent
RNA ribonucleïnezuur
SISH
SPIM
T transmissie
Tris tris(hydroxy-methyl)aminomethaan
TRITC tetramethylrhodamineisothiocyanaat
veranderen tijdens de kweek door het optreden van genetische instabiliteit (zie sectie 1.4). Het is daarom aan te raden om regelmatig de kweek te herstartenuitgaandevanstockculturen.
1.6 Technieken voor celkweek
1.6.1 Uitzaaien van cellen (= uitsplitsen van cellen = subcultiveren)
Wanneer adherente cellen (bijna) wanneer ze met andere woorden subconfluent tot confluent zitten, moeten ze uitgezaaid (uitgesplitst of gesubcultiveerd) worden. Dit geldt ook voor suspensiecellen van zodra een verzadigde celconcentratie is bereikt. Eukaryote cellen in cultuur sterven snel af bij verzadiging indien ze niet worden uitgezaaid. Cellen in suspensie groeien sneller en kunnen in hoge celdensiteitgroeien.
Tijdens het uitzaaien wordt een deel van de cellen overgebracht naar een nieuwkweekrecipiënt,datgevuldismetversmedium.Vervolgenswordtdeze nieuwe celcultuur onder optimale omstandigheden verder gekweekt tot er opnieuw verzadiging wordt bereikt. Op dit moment moet de celcultuur weer worden uitgesplitst. Op deze manier kan een celcultuur gedurende lange tijd in stand worden gehouden. Iedere uitsplitsing wordt een passage genoemd. De ouderdom van een celcultuur wordt meestal uitgedrukt in het aantal passages die het reeds heeft ondergaan. Na iedere uitzaaiing wordt één passage bijgeteld bij het vorige passagenummer. Het passagenummer wordt steeds op de kweekfles genoteerd. Het aantal passages komt niet overeen methetaantaldelingendiedecellenreedshebbenondergaan.
Om adherente cellen te kunnen uitzaaien, moeten deze eerst worden losgemaakt van de drager. Hiervoor zijn een aantal verschillende technieken voorhanden,waaronder:
- de mechanische methode m.b.v. de celkrabber of celschraper
Figuur 6) waarmee de cellen van de drager worden losgewreven. Hierbij worden geen afzonderlijke cellen, maarclustersvancellenbekomen.Omdecellentochvanelkaar los te krijgen, wordt trituratie toegepast. Dit is het op en neer pipetteren van de celsuspensie waarbij de celklompjes door de kleine pipetpunt worden geduwd. Deze methode is niet bruikbaar voor gevoelige cellen.Zowel de celkrabberals de trituratie isvrijdrastisch.
- de ECM-specifieke enzymatische methode waarbij enzymes worden gebruikt die specifiek inwerken op eiwitten van de extracellulaire matrix. Bijvoorbeeld collagenase dat het collageen van de extracellulaire matrix afbreekt waardoor de cellen van elkaar loskomen. Hierbij worden de cellen zelf niet beschadigd.
- de niet-specifieke enzymatische methode, met als voorbeeld de trypsine/EDTA behandeling.
- detemperatuurgevoelige PIPAAm methode(zieverder).
Detrypsine/EDTAbehandelingiseencouranttoegepastetechniekwaarbijaan de celcultuur terzelfdertijd trypsine en EDTA worden toegediend. Trypsine is een protease dat bij een korte behandeling niet alleen de eiwitten van de ECM afbreekt, maar ook de eiwitten aan het celoppervlak. Deze eiwitten spelen ondermeer een rol bij de adhesie (adhesie-eiwitten). EDTA (ethyleendiaminetetraacetaat) cheleert calcium- en magnesiumionen, wat interfereert metzoweldeintercellulaireadhesiealsmetdecel-substraat-binding.Bivalentekationenzijnimmersvanbelang voordefunctievan veeladhesie-eiwitten. ZoisbijvoorbeeldCa2+ onderanderebelangrijkvoordefunctionaliteitvanhet cel-cel adhesie-eiwit E-cadherine. Samenvattend: door de EDTA-behandeling worden de adhesie-eiwitten in hun functie geblokkeerd en door het trypsine worden deze adhesie-eiwitten afgebroken. Tijdens deze trypsine-behandeling worden de cellen aan hun oppervlak beschadigd. Het is dan ook van groot belang de trypsine/EDTA behandeling onmiddellijk te stoppen van zodra de cellenloskomen,teneindezoweinigmogelijkcelschadeoptelopen.
Tijdenshetpracticumcyto-enhistologiegebeurthetlosmakenvanadherente cellendoordetrypsine/EDTAbehandelingopdevolgendemanier:
1. afzuigenvanhetmediumindefalcon
2. trypsine/EDTAtoevoegen(1mlvoorcelcultureninFK falcons;3 mlvoorFG falcons)
3. trypsine/EDTA onmiddellijk weer afzuigen en nieuwe trypsine/ EDTAtoevoegen
4. kortstondigincuberenbij37°CindeCO2-oventotdat decellen loskomen van de drager. Dit proces kan onder de microscoop wordenwaargenomen.
5. vers medium toevoegen (4 ml voor FK falcons; 7 ml voor FG falcons)
Indienslechtséénmaaltrypsine/EDTAwordttoegediend,dankomendecellen moeilijk tot zelfs helemaal niet los. Sporen resterend oud medium veroorzaken enerzijds een uitverdunning van het trypsine/EDTA en anderzijds bevat het resterende medium bepaalde componenten (afkomstig van het serum) die het trypsine inhiberen. Om dezelfde redenen wordt door de toediening vanversmediumindelaatstestapdewerkingvanhettrypsinestilgelegd.
Alternatief voor de dubbele toediening van trypsine/EDTA is het gebruik van PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing). De trypsine/EDTA behandeling verlooptdanalsvolgt:
1. afzuigenvanhetmediumindefalcon
2. PBS (met penicilline/streptomycine) toevoegen (5 ml voor celcultureninFK-falcon)
3. 5à10minutenincuberenbij37°CinCO2-oven
4. PBSafzuigen
5. trypsine/EDTAtoevoegen(3mlvoorFK-falcon)
6. kortstondig incuberen in deCO2-oven bij37 °Ctotdatde cellen loskomen van de drager. Dit proces kan onder de microscoop wordenwaargenomen.
7. versmediumtoevoegen(7mlvoorFK falcons)
DePIPAAm-methodeiseenzachtetechniekomadherentecellenlostemaken van de drager. Hierbij wordt gebruik het groeisubstraat, met name poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm), gecombineerd met een temperatuursdaling. PIPAAm vormt een mooie, dunne laag van covalent geïmmobiliseerd polymeer op het groeisubstraat. Deze film is licht hydrofoob bij37 °C en laat binding en groei van de cellen toe. Echter bij temperaturen onder 32 °C bindt PIPAAm water en zwelt hierdoor sterk op
waardoor de adherente cellen loskomen. Dit wordt schematisch voorgesteld inFiguur7.
VoordelenvandePIPAAm-methode:
- zeer eenvoudig. Enkel de falcon laten afkoelen en de cellen komenvanzelflosvanhetsubstraat.
- nietagressief, zelfs zeerzacht.De methode maakt geen gebruik van mechanische krachten, noch van proteasen, waardoor de adhesie-eiwittenendeECM-eiwittenintactblijven.
NadelenvandePIPAAm-methode:
- De cellen komen wel los van de kweekfles, maar niet altijd los vanelkaar.DeECMtussendecellenisimmersnogintact.
- Als de cellen enkel dienen gewassen te worden, terwijl ze intussen vastgehecht moeten blijven aan het substraat, dan moet hetmedium goedvoorverwarmdworden ende kweekfles steeds op een verwarmde plaat gezet, anders bestaat de kans datdecellenongewenstloskomentijdensdewasbeurt.
Na het losmaken van de adherente cellen (ongeacht de gebruikte methode) moeten deze naar een nieuw kweekrecipiënt worden overgebracht. De hoeveelheid over te brengen cellen hangt af van de gewenste verdunning en van het oppervlak van het nieuwe recipiënt. De vers aangelegde culturen wordenvervolgensbij37°CindeCO2-ovenverdergekweekt.
Het uitzaaien van cellen kan reeds door gespecialiseerde robots op grote schaalwordenuitgevoerd(=geautomatiseerdecelkweek).
Dierlijke cellen zijn extreem gevoelig voor veranderingen in hun omgeving. Het is dan ook van belang om zoveel mogelijk de condities constant te houden, niet alleen tijdens de kweek, maar ook tijdens het uitvoeren van diverse experimenten op deze cellen (waaronder het uitsplitsen van celculturen). Om aan die behoefte te voorzien werd het aëroob werkstation ontworpen (zie Figuur 8). Dit werkstation is een soort werkkabinet met twee ofmeerderearmpoorten,waardoordiversehandelingenopdecellenmogelijk is. Deze werkbank regelt het O2- en het CO2-gehalte, de luchtvochtigheid en de temperatuur. Dit stelt de onderzoeker in staat zijn cellen geconditioneerd tebewarenenteonderzoeken.
1.6.2 Invriezen van cellen
Omdeauthenticiteitvandecellenineencelcultuurtegaranderen,wordende originele cellen bewaard in vloeibare stikstof bij -196 °C. Het uitsplitsen van celculturen over meerdere generaties (passages)vergroot immersde kans op contaminatie met micro-organismen of met vreemde cellen afkomstig van andere celculturen. Bovendien kunnen na verloop van tijd ook genotypische afwijkingenoptreden.Vandaarishetvanbelangopregelmatigetijdstippen de celculturenheroptestartenuitgaandevandeoriginelecellen.
Ook cellen van celculturen waar bepaalde experimenten werden op uitgevoerd, kunnen over een lange periode worden bewaard door deze in te vriezen.
Het invriezen van cellen gebeurt in aanwezigheid van een cryoprotectans, zoalsglycerolof DMSO (dimethylsulfoxide).DMSOblijkthetmeesteffectiefte zijn omdat het beter in staat is de celmembraan te penetreren. DMSO zorgt voor een verlaging van het vriespunt, waardoor er meer dehydratatie en minder ijskristalvormingin de cel kan plaatsvinden. Kristallen kunnen immers de cellendoorboren, wat lekkagevanhetcytoplasma tot gevolgheeft. DMSO wordtmeestaltoegevoegd ineenconcentratievan5à10%.Dezeconcentratie is vaak toxisch voor de cellen of kan celdifferentiatie induceren. Vandaar dat de cellen na toediening van DMSO zo snel mogelijk moeten worden ingevroren. Bovendien mogen de cellen zo weinig mogelijk gepipetteerd en gecentrifugeerdworden - komen.
Voorhetinvriezenvancellenwordtalsvolgttewerkgegaan:
1. Adherente cellen (subconfluent gegroeid) worden losgemaakt van dedragerbijvoorbeeldmettrypsine/EDTA.
2. De cellen (suspensiecellen of losgemaakte adherente cellen) worden gedurende 10 minuten afgecentrifugeerd bij een laag toerenaantal. Geen hoog toerenaantal, anders springen de cellen open.
3. Ondertussen wordt een mengsel gemaakt bestaande uit DMSO (dimethylsulfoxide) en FCS (foetaal kalf serum) dat nadien op ijs wordtbewaard.
4. Bij de afgecentrifugeerde celpellet wordt vers cultuurmedium toegevoegd en het mengsel van DMSO en FCS. Nu moet snel worden gewerktwant DMSOisbij kamertemperatuur toxischvoor de cellen. Cellen lijken het vries/dooiproces het best te doorstaan alszeineenhogecelconcentratiewordeningevroren.
5. kleine, plastieken buisjes die bestendig zijn tegen zeer lage een speciale invriesdoos geplaatst. Deze doos wordt in een diepvriesop-80°Cgeïncubeerd.Deinvriesdoosiszogeconcipieerd
minuut zakt. Hiertoe is de invriesdoos gevuld met isopropanol ofwelisdedoosgemaaktuitpolyethyleenschuimmeteenspeciale, warmtegeleidende kern, die de warmtetransfer reguleert (zie Figuur9).Eeninvriessnelheidvan1°C/minuutisvanbelangomdat hetinvriezenniettetraagmagverlopenomdatdecellenanderste veel dehydrateren en de cellen te lang in contact komen met het toxischecryoprotectans.Alshetinvriezentesnelgebeurt,daniser teweinigdehydratatieindecellenwaardoorerinterneijskristallen ontstaan.
6. gebracht vanuit de -80°Cdiepvries naareenvatgevuld met vloeibare N2 (-196 °C). Als alternatief voor vloeibare stikstof kan eventueel ook een diepvriesop-135tot-150°Cwordengebruikt.
Voor de bewaring van de ingevroren cellen worden grote bewaarvaten gebruikt, die gevuld zijn met vloeibare stikstof. De ampullen of buisjes ckeerd in doosjes op speciale rekken die in de vaten hangen. Figuur 11 toont enkele types van bewaarvaten, evenals het stockagesysteem. Het is van belang dat deorganismen (schimmels en bacteriën) die de lage temperatuur van de vloeibarestikstofkunnenoverleven.
Voor grote collecties van allerlei diverse celtypes, m.a.w. voor het aanleggen
waarin een chip is ingebouwd (zie Figuur 10). De chip bevat alle informatie over de cellen aanwezig in de cryovial. Met behulp van de juiste software
a) gevuld met isopropanol
b) zonder isopropanol
a) diverse types bewaarvaten gevuld met vloeibare stikstof
b) rekken met doosjes voor he met ingevroren cellen
c) ophangsysteem van de rekken in het bewaarvat
Celstocks worden commercieel verkocht of in wetenschappelijke samenwerkingsverbanden uitgewisseld. Het opslaan en verdelen van deze celstocks gebeurt d
opslagvaneenbepaaldtypecellen,bijvoorbeeldcellen vannavelstrengbloed, bekendecelbankenzijn:
- AmericanTypeCultureCollection(ATCC)
- EuropeanCollectionofCellCultures(ECACC)
- GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures
- UKStemCellBank
1.6.3 Ontdooien van cellen
Omde
stikstof zo snel mogelijk in een warmwaterbad op 37°C worden geplaatst gedurende ± 2,5 min om enerzijds ijskristalvorming te voorkomen en anderzijdseengoederehydratatievandecellentebekomenzonderdatdezekapot springen door osmose. Daarna wordt er vers groeimedium aan de cellen toegevoegd om het toxische cryoprotectans uit te verdunnen. Daarna kan er metdecellenwordenverdergewerkt.
Om het ontdooiproces beter te standardiseren en de kans op contaminatie metmogelijksaanwezigemicro-organismeninhetwaterbadteminimaliseren, kanergebruikwordengemaaktvaneengeautomatiseerdcelontdooisysteem, die een zeer soepel en buigzaam raakvlak bezit om het contact met de wand
warmtegeleidend, vergelijkbaar met de warmtegeleiding in een warmwaterbad. De buigzame en sterke warmtegeleidende wand zorgt ervoor dat het -
ontdooien 2 tot 3 maal langer duurt. De temp in de ThawSTAR gemonitord en viade software wordt de overgang van vaste fase naar vloeistoffase gedetecteerd. Door de compacte afmetingen van de ThawSTAR kan deze in een veiligheidskabinet worden geplaatst, wat de snelheidvanhetverderwerkenmetdeontdooidecellenbevordert.
vloeibaar N2 te transporteren naar het labo waar de ThawSTAR staat, wordt gebruik gemaakt van de ThawSTAR transporter. Dit is een transportbox gevuld met droog ijs die de -70°Ckanstockeren.
1.6.4 Tellen van cellen
Voorbepaaldetoepassingen (bijvoorbeeldbijtransfecties)kanhetvanbelang zijn dat de celconcentratie van de celcultuur gekend is. Om deze te bepalen, kan gebruik worden gemaakt van een Bürker-telkamer en een microscoop. Voorhetprincipeendeuitvoeringvandezetechniekwordtverwezennaarde cursusvanhetpracticummicrobiologie(1BB).
Bovendienkandoor kleuring met trypaanblauw terzelfdertijd het percentage
le en wordt alleen door dode cellen opgenomen. Dode cellen vertonen kleine openingen langs waar het trypaanblauw binnenkomt, waardoor deze cellen blauw gekleurd worden. Levende cellen daarentegen zijn intact en blijven
kleurloos. Trypaanblauw is kankerverwekkend, waardoor het gebruik van handschoenen vereist is. Om de cellen te kleuren wordt een 1/1 volumeverhoudingcellen/trypaanblauw-oplossinggenomen.
Trypaanblauw-oplossing: 5 g/l trypaanblauw in fosfaat-gebufferde zoutoplossing(PBS).Bewaringbij4°C.
Het tellen van cellen kan ook geautomatiseerd verlopen, bijvoorbeeld met een mini (handformaat) geautomatiseerde celteller (zie Figuur 12). Hierbij wordt de celsuspensie in een wegwerpcassette overgebracht, die vervolgens in de celteller wordt ingebracht. De celteller bepaalt de celafmetingen, de celconcentratie en geeft een indicatie van levend/dood. Afhankelijk van het type celteller worden er hiervoor al dan niet kleurstoffen gebruikt. In het gevalvankleurstoffenwordendedatabekomend.m.v.analysevanmicroscopische beelden. Indien geen kleurstoffen worden gebruikt, dan wordt het Coulter-principetoegepast.Hierbijwordthetverschilinelektrischeweerstand tussen dode en levende cellen gemeten. Iedere cel afzonderlijk bereikt een smalle doorgang met een elektrische stroom en bij passage zal de cel deze stroom onderbreken. Hoe groter de cel, hoe meer weerstand ze zal bieden. Dodecellenzijnkleinerenzulleneenlagereweerstandhebben.
