bachelor agro- en biotechnologie - biotechniek - moleculaire biologie 1

moleculaire biologie 1

docent Jasmine Viaene studiegebied biotechnologie bachelor in de agro- en biotechnologie campus Roeselare

Inhoudsopgave

Inhoudsopgave Inhoudsopgave ..................................................................................................... 3 Moleculaire biologie I theorie Samenstelling van DNA en RNA ..................................................... 9 1

Algemene inleiding...................................................................................... 9

2

De stikstofhoudende heterocyclische basen ............................................... 11

3

De pentosen.............................................................................................. 12

4

De fosfaatgroep ........................................................................................ 13

5

Nomenclatuur ........................................................................................... 15 De Structuur van DNA.................................................................. 17

1

De primaire structuur van het DNA ............................................................ 17

2

De secundaire structuur van een DNA-keten : het Watson en Crick model .. 17

2.1

Dubbelhelix –structuur ...................................................................................... 20

2.2

DNA is gewonden rond basische eiwitten : de histonen................................... 20 22 Mitose en Meiose....................................................................... 24

1

De celcyclus .............................................................................................. 24

2

Stappen van de mitose .............................................................................. 25

3

Stappen van de Meiose ............................................................................. 28

3.1

Relevante opmerkingen bij het proces van de meiose ..................................... 31 Replicatie van DNA..................................................................... 34

1

Algemene inleiding.................................................................................... 34

2

DNA replicatie gebeurt door middel van DNA- polymerasen ....................... 34

3

Een groeivork heeft een continue en een discontinue streng ...................... 34

4

Overzicht van de voornaamste enzymen betrokken bij de DNA replicatie bij prokaryoten .............................................................................................. 36

1B

4.1

Topoisomerasen ................................................................................................ 36

4.2

De helicasen ...................................................................................................... 36

4.3

Enkelstrengig DNA bindende eiwitten (SSB proteinen) .................................... 36

4.4

Het Primase ....................................................................................................... 36

4.5

De DNA polymerasen ........................................................................................ 37

4.6

Het DNA ligase .................................................................................................. 39

5

Het mechanisme van DNA replicatie .......................................................... 39 3

Inhoudsopgave

6

Bidirectionle replicatie van genomisch en plasmide DNA bij prokaryoten ... 42

6.1

Theta replicatie bij plasmiden ........................................................................... 44

6.2

Rollende cirkel replicatie bij plasmiden............................................................. 45

7

Herstelmechanismen na DNA-replicatie bij prokaryoten ............................ 46

8

Replicatie van chromosomen bij eukaryoten .............................................. 48

8.1

DNA-polymerasen van eukaryoten ................................................................... 48

8.2

Het verkorten van chromosomen bij replicatie bij eukaryoten ........................ 49 De indeling en structuur van RNA ................................................ 51

1

Verschillende types van RNA ..................................................................... 51

2

De structuur van het RNA .......................................................................... 52 Synthese van RNA: Transcriptie .................................................. 53

1

Transcriptie bij prokaryoten ...................................................................... 53

1.1

Initiatie............................................................................................................... 54

1.2

Elongatie ............................................................................................................ 56

1.3

Terminatie ......................................................................................................... 59

2

Transcriptie bij eukaryoten ........................................................................ 61

3

Verschillen tussen transcriptie en replicatie ............................................... 66 Eigenschappen van het mRNA ................................................... 70

1

Algemene inleiding.................................................................................... 70

2

Polycistronische boodschappers bij prokaryoten ........................................ 70

3

Monocistronische boodschappers bij eukaryoten....................................... 71

3.1

Splicing van eukaryotisch mRNA ....................................................................... 73

4

Eigenschappen van prokaryotisch en eukaryotisch mRNA .......................... 76 Eigenschappen van rRNA en ribosomen .................................... 77

1

Algemene inleiding.................................................................................... 77

2

De ribosomen ........................................................................................... 77 De genetische code is gedegenereerd ......................................... 79

1

Initiatie- en teminatiecodons ..................................................................... 80

2

Nonsense, missense en silent mutaties ...................................................... 80

3

Universaliteit van de code ......................................................................... 81 Eigenschappen van het transferRNA ............................................ 82

1B

1

Algemene inleiding.................................................................................... 82

2

Het klaverbladstructuur............................................................................. 82 4

Inhoudsopgave

3

Koppeling van het aminozuur .................................................................... 83 De eiwitsynthese ........................................................................ 86

1

Algemene Inleiding ................................................................................... 86

2

Eiwitsynthese bij prokaryoten ................................................................... 87

2.1

Initiatie van de eiwitsynthese............................................................................ 87

2.2

Elongatie van de eiwitsynthese ......................................................................... 89

2.3

Terminatie van de eiwitsynthese ...................................................................... 92

3

Inhibitie van translatie door antibiotica ..................................................... 94

4

Eiwitsynthese bij eukaryoten ..................................................................... 96 Mutaties ................................................................................... 99

1

Algemene inleiding.................................................................................... 99

2

Soorten mutaties ...................................................................................... 99

2.1

Genmutaties ...................................................................................................... 99

2.2

Chromosoommutaties..................................................................................... 101

2.3

Genoommutaties............................................................................................. 102

2.4

Belangrijke begrippen die verband houden met mutaties ............................. 103 Cytogenetica ...........................................................................104

1

Inleidende begrippen ...............................................................................104

2

Karyotypering ..........................................................................................106

2.1

Doelstelling voor het maken van een karyogram ........................................... 109

3

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).....................................................109

3.1

Centromeerspecifieke probes ......................................................................... 110

3.2

Genspecifieke probes ...................................................................................... 110

3.3

Volledige chromosoomprobes ........................................................................ 111

Moleculaire biologie I practicum Oplossingen bereiden - vakjargon ...............................................114

1B

1

Oplossingen maken : berekeningen ..........................................................114

2

Extra rekenoefeningen (individueel berekenen) ........................................116

3

Buffers maken: praktische handelingen ....................................................117

4

Het begrip pH ...........................................................................................118

5

Hoe moet ik correct ( kleine) volumes pipetteren ? ...................................119

6

Oplossingen .............................................................................................119

7

Vakjargon ................................................................................................123

5

Inhoudsopgave

Bewaren en vermenigvuldigen van plasmiden in de gastheer E. coli 125 1

Inleiding ...................................................................................................125

2

Hoe kunnen we bacteriën bewaren, hoe groeien we ze op ?......................126 Scheiden van DNA volgens grootte in een agarosegel .................128

1

Principe van agarose gelelektroforese.......................................................128

2

De migratie van het DNA ..........................................................................134

2.1

De conformatie van ongeknipt plasmide DNA ................................................ 134

2.2

De grootte (lengte) van lineair DNA ................................................................ 136

2.3

De aangelegde spanning ................................................................................. 137

3

Scheiding van kleine fragmentjes ..............................................................138

4

Agarose-elektroforese van grote fragmenten ............................................140

5

Visualisatie ..............................................................................................143

6

Materiaal en methoden ............................................................................144 Het bereiden van plasmide DNA via een silica-gebaseerde kolom methode 147

1

Lyseren van cellen, een lysaat maken, een extract maken .........................147

2

Plasmide DNA isolatie via een Silica kolom................................................150

2.1

Principe van de technologie ............................................................................ 150

2.2

Materiaal en methoden .................................................................................. 155

2.3

Protocol Nucleospin Macherey-Nagel............................................................. 155 156 De concentratie bepalen van nucleïnezuren ................................159

1

De concentratie bepalen van DNA via spectrofotometrie ..........................159

1.1.1 De zuiverheid bepalen van nucleïnezuren ....................................................... 160 2

De concentratie bepalen van DNA via picogreen en een fluorimeter ..........161 Alternatieve methode voor het bereiden van zuiver DNA ...........162 Restrictie-enzym analyse ..........................................................163

1B

1

Inleiding restrictie-enzymen .....................................................................163

2

Opstellen van een digest ..........................................................................166

2.1

De hoeveelheid DNA ....................................................................................... 166

2.2

De hoeveelheid enzyme .................................................................................. 166

2.3

De buffer.......................................................................................................... 166

2.4

De temperatuur ............................................................................................... 166

6

Inhoudsopgave

2.5

De tijd .............................................................................................................. 166 167

3

Materiaal en methoden ............................................................................167

3.1

Protocol voor het knippen van plasmide DNA met restrictie-enzymen ......... 167

4

Oefeningen ..............................................................................................174 Voorbeelden van examenvragen .............................................179 Voorbereiding voor de practica ..................................................181

Auteur van deze cursus : Annick Keirsebilck

1B

7

Inhoudsopgave

Moleculaire Biologie I - Theorie

1B

8

Samenstelling van DNA en RNA

Samenstelling van DNA en RNA 1

Algemene inleiding

Watson en Crick ontrafelden in 1953 de DNAstructuur.

DNA wordt al in 1869 ontdekt, maar het zal nog tot 1952 duren voordat duidelijk is dat het molecuul de drager is van de erfelijke eigenschappen. Een jaar later ontrafelen James Watson en Francis Crick de chemische structuur van DNA. Onder meer op basis van röntgenanalyses postuleerden zij in 1953 het wenteltrapmodel, gebaseerd op de dubbele helixstructuur.

Sindsdien staat DNA bekend als het instructieboekje voor het leven. De link met tekst en taal is makkelijk gelegd, omdat de code waarin de instructies zijn geschreven uit vier letters bestaat : A, C, G en T. Deze letters staan voor de 4 basen (nucleotiden) waaruit DNA moleculen zijn opgebouwd. Woorden in de DNA taal bestaan uit combinaties van drie letters (de codons zie verder). Deze drieletterige woorden vormen zinnen, de genen die vertellen welke eiwitten een bepaalde cel moet produceren. Een gen codeert voor een eiwit.

Alle functies van een cel staan geschreven in het DNA. Wanneer ze moeten groeien, welke cellen een oog moeten vormen en welke kleur het oog moet hebben, welke cellen zorgen voor de vertering van onze voeding enzoverder.

Als de cel niet deelt dan komt het DNA voor als chromatinedraden. Bij een gewone lichaamscel van de mens bekomen we een lengte van 2 m als we al het DNA na elkaar plaatsen.

Het is echter niet één draad. De mens bezit 46 draden (23 paar). Als de cel gaat delen (meiose of mitose zie verder) dan komt het DNA voor onder de vorm van chromosomen. 23 paar dus in totaal. Niet alle chromosomen zijn even lang, maar in totaal tellen de 23 chromosomen van een mens 3 miljard basen (nucleotiden). Hierin bevinden zich ongeveer 25000 genen. Tussen de genen zit DNA waarvan we de functie nog niet goed kennen, dit wordt vaak “junk” (vuilbak) DNA genoemd. Een gen telt 1000den nucleotiden.

Bij prokaryoten (bacteriën) zit het DNA vrij in de cel. Bij eukaryoten (mens, dier, plant, gist, schimmel,.. ) zit het DNA in de nucleus (kern of karyon) en ook in een celorganel namelijk het mitochondrium (zie cursus cyto- histologie voor meer details hierover). In plantencellen bevatten ook de chloroplasten DNA.

1B

9

Samenstelling van DNA en RNA

minor groove

major groove

Figure 1: Het erfelijk materiaal (DNA) zit bij eukaryotische organismen in een celkern. Als de cel deelt is het DNA zichtbaar als chromosomen, tijdens de gewone werkingsfase van de cel is het DNA aanwezig als chromatinedraden. De draden zijn dubbelstrengige helixen. In de helix bevindt zich een smalle en een brede groeve.

Een gen is opgebouwd uit nucleotiden en maakt deel uit van een chromatinedraad (of chromosoom). De nucleïnezuren zijn de dragers van de genetische informatie in een levend organisme. De structuur van de nucleïnezuren bevat de informatie voor de biosynthese van eiwitten.

DNA (keten van nucleotiden) ⇒ ---------------------------of -----------------------------RNA (keten van nucleotiden) ⇒ --------------------------------of -------------------------eiwit (keten van aminozuren).

Er zijn twee soorten nucleïnezuren namelijk : de de(s)oxyribonucleïnezuren in het DNA en de ribonucleïnezuren in het RNA. Zowel DNA als RNA zijn opgebouwd uit 4 verschillende …………………………………

1B

10

Samenstelling van DNA en RNA

Een nucleotide is samengesteld uit drie elementen : • ………………………………………………………………..

• ………………………………………………………………..

• ………………………………………………………………..

Figure 2 : Een nucleotide is samengesteld uit drie elementen.

2

De stikstofhoudende heterocyclische basen De purines : adenine (A) en guanine (G).

De pyrimidines : thymine (T), cytosine (C) en uracil (U).

De purines zijn ……………………………… ringstructuren, de pyrimidines zijn ……………………………. ringstructuren. De aanwezigheid van stikstof zorgt ervoor dat de moleculen een basisch karakter krijgen.

Heterocyclische verbindingen zijn cyclische verbindingen die één of meer heteroatomen (atomen andere dan een koolstofatoom) in de ring bevatten.

In DNA komen de monomeren A, G, C, en ……….voor , RNA bevat de monomeren A, G, C en …………

1B

11

Samenstelling van DNA en RNA

Figure 3: Voorstelling van purines en pyrimidines.

3

De pentosen De pentose in een DNA keten is steeds……………………………………………………, in RNA …………………………………………… .

De suikercomponent vormt de verbinding tussen de fosfaatgroep en de base.

1B

12

Samenstelling van DNA en RNA

Figure 4 : De suikers die deel uitmaken van de nucleïnezuren

4

De fosfaatgroep In DNA en RNA is de hydroxylgroep van koolstof 5 van de pentose veresterd met een fosfaatgroep. Het zure karakter van DNA en RNA is te wijten aan de aanwezigheid van de fosfaatgroepen.

Figure 5 : Voorstelling van het AMP.

1B

13

Samenstelling van DNA en RNA

Figure 6 : Primaire structuur van een nucleïnezuur.

1B

14

Samenstelling van DNA en RNA

5

Nomenclatuur Een

base

en

een

suiker

Gecombineerd

met

een

samen

vormen

fosfaatgroep

een……………………………….. worden

ze

een

………………………………………..genoemd.

Nucleotiden met één, twee of drie fosfaatgroepen worden respectievelijk nucleosidemono-, di- of trifosfaten genoemd.

De vier nucleosiden in het RNA zijn adenosine, guanosine, cytidine en uridine.

De

vier

desoxynucleosiden

in

het

DNA

zijn

de(s)oxyadenosine,

de(s)oxyguanosine, de(s)oxycytidine en de(s)oxythymidine.

Figure 7: Voorstelling van een nucleoside versus nucleotide.

1B

15

Samenstelling van DNA en RNA

Figure 8 : Chemische structuur van de basen ; het nucleoside adenosine en de nucleotiden AMP en dCTP.

Figure 9 : Tabel met weergave van de nucleosiden en nucleotiden.

1B

16

De Structuur van DNA

De Structuur van DNA 1

De primaire structuur van het DNA Een DNA streng is een polynucleotideketen die gevormd wordt door 3’-5’ fosfodiësterbindingen tussen de nucleotiden (zie Fig. 6; 10).

2

De secundaire structuur van een DNA-keten : het Watson en Crick model Via X-straal diffractie werd door Watson en Crick reeds in 1953 de secundaire structuur van DNA opgehelderd.

De nucleïnezuren komen voor als een dubbele helix van 2 antiparallelle nucleïnezuurstrengen die samengehouden worden door waterstofbruggen en hydrofobe interacties. We bekijken hier enkel het B-model. Er bestaan nog andere modellen (onder andere het A en Z model).

1B

17

De Structuur van DNA

Figure 10 : Voorstelling van ds DNA. Er worden twee antiparallelle es strengen getoond.

1B

18

De Structuur van DNA

De baseparing in DNA gebeurt tussen : Guanine (G) en Cytosine (C) Adenine (A) en Thymine (T) De basepering in RNA gebeurt tussen : Guanine (G) en Cytosine (C) Adenine (A) en Uracyl (U) Het aantal waterstofbruggen tussen de basen varieert. Tussen A en T liggen twee H-bruggen; tussen C en G drie H-bruggen.

Dit zorgt ervoor dat een G-C binding sterker is dan een A-T binding.

In een T-G paar zou maar één H-brug voorkomen vandaar dat deze paarvorming minder gunstig is en niet voorkomt.

Het verbreken van de waterstofbruggen kan door temperatuurstijging of door chemische stoffen ( onder andere door formamide).

Figure 11 : Voorstelling van de waterstofbruggen tussen de basen.

1B

19

De Structuur van DNA

2.1 Dubbelhelix –structuur

Deze informatie is ter illustratie.

De basen paren in één vlak loodrecht op de lengterichting op die manier onstaat een stapelingseffect en wordt een dubbele helix gevormd met de volgende eigenschappen : •

de suiker-fosfaatskeletten van beide keten vormen rechtsdraaiende helices met constante helix dimensies en dezelfde as. De diameter van de helix is 20 Å.

•

de vlakken van twee naburige basenparen liggen 3.4 Å uit elkaar; voor elke omwenteling (360°) van de helix zijn 10 basenparen nodig wat betekent dat elk basepaar dus 36° gedraaid is tegenover de vorige en elke omwenteling is 34 Å lang.

•

rond de helix bevindt zich een watermantel van ongeveer 7 Å.

2.2 DNA is gewonden rond basische eiwitten : de histonen Om 2 m DNA in een eukaryotische celkern te krijgen van enkele µm diameter moet het DNA sterk worden opgewonden. Het DNA is gewonden rond eiwitten.

Als het DNA voorkomt onder de vorm van chromosomen moet het heel compact worden samengepakt. Enkel op die manier is het mogelijk om in beide dochtercellen evenveel DNA te krijgen. Er ontstaan nucleosomen en solenoïden.

Twee DNA omwentelingen gewonden rond een parelachtige structuur van 8 histon-eiwitten noemt men een nucleosoom (zie figuren hieronder). 147 basenparen zijn gedraaid rond 4x2 histoneiwitten.

1B

20

De Structuur van DNA

A

B

Figure 12 : A Voorstelling van DNA als chromatinedraad opgewonden tot nucleosoom (ook in B), verder tot solenoïde en uiteindelijk tot zusterchromatide.

Een ketting van 6 nucleosomen opgewonden tot een helix vormt een solenoïde.

1B

21

De Structuur van DNA

Figure 13: Stadia in de omzetting van een DNA chromatinedraad tot de chromatide van een chromosoom. A Lichte spiralisatie van de dubbele DNA-keten. B De keten windt zicht rond de histonen waardoor nucleosomen ontstaan. C De aldus gevormde chromatinedraad windt zich rond zichzelf op. D en E deze 30 nm dikke draad vormt lussen rond een eiwitkern; aldus ontstaat een soort kabel van 700 nm dik, die zich nog wat verder zal spiraliseren tot een chromatide. F De twee chromatiden van een delingschromosoom hangen samen ter hoogte van het centromeer. Slechts één derde van het chromosomaal gewicht bestaat uit nucleotiden. De rest is eiwit. Het DNA is ook rond histonen gedraaid als het voorkomt als chromatine draden.

1B

22

De Structuur van DNA

Leertips De samenstelling van nucleïnezuren kunnen geven; de structuur van nucleïnezuren kunnen geven; ….

Volgende begrippen goed kunnen uitleggen : histon, solenoïde, nucleosoom, nucleoside, nucleotide, purine, pyrimidine, base, pentose, fosfodiësterbinding, chromatine versus chromosoom versus chromatide, codon, gen, transcriptie, translatie, …..

1B

23

Mitose en Meiose

Mitose en Meiose 1

De celcyclus Bij zoogdieren duurt de celcyclus ongeveer 24 uur. De celcyclus bestaat uit een G0-fase, dit is een rustfase en is variabel in lengte. De cel is dan niet echt in rust want maakt heel wat eiwitten aan en voert zijn normale functie uit.

De G1-fase is de fase waarin de cel zich

voorbereidt op de DNA

vermenigvuldiging (replicatie). Hiertoe moeten heel wat eiwitten gemaakt worden, die fase duurt ongeveer 10 uur.

In de S-fase of synthesefase wordt het DNA vermenigvuldigd. Hoe dit juist gebeurt wordt besproken in het hoofdstuk replicatie. In de S fase worden ook de centriolen verdubbeld. Deze fase duurt ongeveer 9 uur.

In de G2-fase worden nog eiwitten aangemaakt die nodig zijn voor de eigenlijke celdeling (mitose). In deze fase wordt ook gekeken of er geen fouten zitten in het nieuw gesynthetiseerde DNA. Die fase duurt ongeveer 4 uur. De eigenlijke celdeling of mitose duurt slechts 1 uur. Vooraleer de cel in een andere fase overgaat spelen tal van eiwitten een rol. Er wordt gesproken over checkpoints.

De celcyclus bestaat dus uit een interfase (G0 (optioneel), G1, G2 en S fase) en de mitose. Na de mitose komt nog een cytokinese.

Figure 14: Weergave van de celcyclus.

1B

24