PERÚ: PAÍS MARÍTIMO, ANDINO, AMAZÓNICO, BIOCEÁNICO Y CON PRESENCIA EN LA ANTÁRTIDA
SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
Dr. Américo Castro
Métodos de síntesis 1.Método en solución, consiste en añadir reactivos a soluciones de cadenas peptídicas en crecimiento. Esta síntesis es adecuada para sintetizar péptidos pequeños, el rendimiento es bajo por la purificación del proceso. 2.Método en fase sólida, consiste en añadir reactivos en cadenas peptídicas en crecimiento enlazadas a un soporte sólido. Es más apto para sintetizar péptidos y proteínas grandes.
Síntesis de péptidos en solución, considerando la estructura del tripéptido alanil-valil-fenilalanina: * Se empieza con el extremo N-terminal y termina en el C-terminal o va de izquierda a derecha en la forma en la que se simboliza el péptido. * Consiste en emparejar el grupo carboxilo de la alanina con el grupo amino de la valina para evitar reacciones colaterales se protege el grupo amino de la alanina como amida, para hacerlo no nucleofílico. 1.
* Tratando el aminoĂĄcido libre con cloroformiato de bencilo se obtiene un uretano que es eliminado al final de la sĂntesis. * Éste grupo protector se le denomina como grupo bencilocarbonilo, grupo carbobezoxi (Cbz) o grupo Z
Paso preliminar: protecci贸n del grupo amino con Z, obteni茅ndose ZAla. O CH2 - O - C - Cl
O + H2N - CH - C - OH CH3
cloroformiato de bencilo Z - Cl
alanina Ala
grupo Z O
O
CH2 - O - C - NH - CH - C - OH + HCl CH3 benciloxicarbonil-alanina Z - Ala
Luego se activa el grupo carboxilo con cloroformiato de etilo para obtener un anhidrido mixto del aminoácido y ácido carbónico fuertemente activado frente a un ataque nucleofílico. Paso 1. Activación del grupo caboxilo : Al tratar la alanina protegida y activada con la valina, el grupo amino nucleofílico de la valina ataca al carbonilo activado de la alanina, desplazando al anhidrido y formando el enlace peptídico
O
O
Z - NHCH - C - OH + Cl - C - OCH2CH3 CH3 alanina protegida
cloroformiato de etilo
anhídrído del ácido carbónico
O
O
Z - NHCH - C - O - C - OCH2CH3 + HCl CH3 anhídrido mixto
Paso 2. Apareamiento con la valina: Para tener protegido el N del dipéptido Z-AlVal. La activación del grupo carboxilo de la valina, con la adición de la fenilalanina, da el tripéptido protegido Z-Ala-Val-Phe. Si se quiere alargar esta cadena, se activa el extremo C-terminal y se le hace reaccionar con cloroformiato de etilo; y posteriormente se le aparea con el aminoácido que se desea adicionar.
Apareamiento con la valina O
O
O
Z - NHCH - C - O - C - OCH2CH3 + H2N - CH - C - OH CH(CH3) 2
CH3 alanina, protegida y activada
O
valina
O
Z - NHCH - C - NH - CH - C - OH + CH3CH2OH + CO 2 CH3
CH(CH3)2 Z-Ala-Val
Paso 1: Activaci贸n del gr upo car boxilo O
O
O
Z - NHCHCNHCH - C - OH CH3
+
O
Cl - C - OEt
O
Z - NHCHCNHCH - C - O - C - OEt + HCl CH3 CH(CH3)2
CH(CH3)2
Paso 2: Apareamient o con la f enilalani na O
O
O
Z - Ala - NHCH - C - O - C - OEt + H2N - CH - C - OH CH(CH3)2
CH2 - Ph fenilalanina
O
O
Z - Ala - NHCH - C - NH - CH - C - OH + CO2 H3C - CH - CH3 Z-Ala-Val-Phe
O
CH2 - Ph
+ EtOH
•
•
•
•
La reacción final de esta síntesis consiste en desproteger el extremo N-terminal del tripéptido. Se rompe el enlace amido del N-terminal, sin romper ninguno de los enlaces peptídico del péptido. El grupo bencilocarbonilo por ser parte de amida y parte de éster del bencilo, por hidrogenólisis de éste (H2. Pd) y en condiciones suaves se evita que no se rompan los enlaces peptídicos. Por este motivo el grupo bencilocarbonilo o grupo Z se utiliza para proteger el N-terminal.
O
O
CH2 - O - C - NHCHC - Val - Phe CH3 Z-Ala-Val-Phe H2,Pd O H2NCHC - Val - Phe + CO2 CH3 Ala-Val-Phe
+
CH3
DCC = N, N`- diciclohexilcarbonildiimida: acopla a los aminoĂĄcidos a travĂŠs del grupo amino y el grupo carboxilo formando amidas La DCC, sale al final como DCU (N, N` -diciclohexilurea) como un buen grupo saliente.
N=C=N DCC (N,N`- diciclohexilcarbodiimida)
H
O
H
N=C=N DCU (N,N`- diciclohexilurea)
Síntesis de péptidos en fase sólida de Merrifield. * Desarrollo un método para sintetizar péptidos sin tener que purificar los intermedios. * Unió las cadenas de péptidos en su alargamiento con poliestireno sólido, preparado de modo que por cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo (-CH2Cl). Éste polímero se obtiene copolimerizándo estireno con p. (clorometil) estireno y se llama resina de Merrifield. 2.
P
- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH -
= CH 2Cl
CH2Cl Poliestireno clorometilado
CH2Cl forma abreviada
* Después de añadir cada aminoácido, se eliminan los reactivos en exceso con un disolvente. * En este método se utiliza como grupo éster protector a una partícula sólida de polímero. * La automatización de este método permite añadir varios aminoácidos. * La máquina que Merrifield construyó, le permitió sintetiza ribonucleasa (124 aminoácidos) en solo seis semanas, obteniendo un rendimiento de 17%. * Merrifield, por éste trabajo de síntesis de péptidos en fase sólida, obtuvo el premio Nóbel de química en 1984.
Ribonucleasa
Utilización del grupo butiloxicarbonilo (BOC)
protector
terc-
El BOC es un grupo protector similar al grupo Z que tiene grupo terc-butilo en lugar del grupo bencilo y se elimina fácilmente en condiciones ácidas. El cloruro de ácido del grupo BOC es inestable, por lo que se utiliza el anhidrido, dicarbonato de di-tercbutilo para enlazar el grupo protector BOC al aminóácido. Los grupos amino de los aminoácidos se protegen como derivados del BOC y se introducen por medio del anhidrido dicarbonato de di- terc-butilo para enlazar el grupo protector BOC al aminoácido. Los aminoácidos-BOC, los venden en casas comerciales.
Protección del grupo amino del aminoácido como derivado BOC: CH3 CH3
C
O O
CH3
O
C
O
C
O
C
CH3
CH
H 2N
CH3
CH3 dicarbonato de di-ter c-butil o
CH 3 CH3
+
C
R
aminoácido
CH3
O O
C
COOH
NH
CH 3
BOC-aminoácido
CH R
COOH
+ CO 2
+
CH3
C CH3
OH
Los derivados BOC en presencia de trifluoracético generan el aminoácido libre CH3
CH3
C CH3
ácido
O O
C
NH
COOH
CH R
CF3COOH BOC-aminoácido
CH3 H 3N +
CH
COOH + CO 2
R aminoácido libre
+ CH2 = C CH3 isobutileno
BOC = grupo protector terc-butiloxicarbonilo
CH3
O
O
CH3
H3C - C - O - C - O - C - O - C -CH3 CH3
CH3
Anhidrido dicarbonato de di-terc-butilo
ETAPAS EN LAS SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE SÓLIDA Se da en cuatro etapas. Paso 1 Un aminoácido BOC protegido se enlaza covalentemente de poliestireno mediante la formación de una unión éster (reacción Sn2).
O BOC - NHCHCOH + ClCH2 -
Polímero Polímero
R Base O BOC - NHCHCOHCH2 -
Polímero
R Paso 2 El aminoácido unido al polímero se lava para liberarlo del exceso de reactivo y en seguida se trata con ácido trifluoracético para eliminar el grupo BOC.
1. Lavar 2. CF 3 COOH O H2NCHCOCH2 R
Polímero
O Paso 3 Un segundo aminoácido protegido por BOC se acopla al primero debido a la reacción con DCC. El exceso de reactivo se elimina lavándolo del polímero insoluble
1. DCC, BOC - NHCHCOH 2. Lavar O
O
BOC - NHCHC - NHCHCOCH2 El ciclo de desprotección, acoplamiento y lavado se repite tantas veces como se desee para añadir unidades de aminoácidos a la cadena en crecimiento.
R`
R
Polímero
R El ciclo se r epit e muchas veces
O
O
O
BOC - NHCHC - ( NHCHC )n NHCHCOCH2 R´´
R`
R
Polímero
Paso 4 Después de que se forma el péptido deseado, el tratamiento con HFanhídro elimina el grupo BOC final y rompe el enlace éster con el polímero; esto produce el péptido libre.
HF
O
O
O
H2NCHC ( NHCHC ) n NHCHCOH + HOCH2 R´´
R`
R
Polímero Polímero
Síntesis de péptidos en fase sólida Síntesis de Ala-Val-Phe (tripéptido) 1. La síntesis empieza con la unión del aminoácido del extremo C-terminal con el N protegido (BOC-fenilalanina) al polímero.
O
O
Me3C - O - C - NH - CH - C - O - + CH2 - Cl 2 Boc
Ph - CH2
Boc - Phe
P
O
O
Me3C - O - C - NH - CH - C - O - CH2 Boc
Ph - CH2
Boc - Phe
P
P
2. El ácido trifluoracético (TFA) libera el grupo protector BOC de la fenilalanina para que su grupo amino se pueda aclopar con el aminoácido siguiente O
O
Me3C - O - C - NH - CH - C - O - CH2 Boc
Ph - CH2
Boc - Phe
P
O
(TFA) CF3 COOH
+
H3N - CH - C - O - CH2 Ph - CH2
P
Phe
P
P
3.
El segundo amino谩cido (valina) protegido por BOC se acopla al primero con la adici贸n de DCC. O
O +
Boc NH - CH - C - O- + H3N - CH - C - O - CH2 (CH3)2CH
Ph - CH2
Boc - Val Phe
P
P
DCC
O
O
Boc NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH 2 + DCU (CH3)2CH
Boc - Val - Phe
Ph - CH2
P
P
Para acoplar la alanina, se desprotege la cadena tratándola con TFA y luego se añade BOC-alanina y DCC. Paso 1: Desprotección O
O
Boc NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 (CH3)2CH
Ph - CH2
Boc - Val - Phe
P
P
(TFA) CF3 COOH
O
O
CH3
+
H3N - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 + CH3 - C = CH3 + CO 2 (CH3)2CH
Val - Phe
Ph - CH2
P
P
Paso 2: acoplamiento O Boc NH - CH - C - OO
O CH 3
+
H 3N - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 (CH3)2CH
Val - Phe
DCC
Ph - CH2
P
P
O
O
O
Boc NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH 2 + DCU CH3
(CH 3) 2CH
Boc - Ala - Val - Phe
Ph - CH2
P
P
Si se estuviera sintetizando un péptido más largo, la adición de cada aminoácido sucesivo requeriría la repetición de dos pasos: 1. Utilización de ácido trifluoracético (TFA) para desproteger el grupo amino del final de la cadena en crecimiento. 2. La adición del siguiente BOC-aminoácido, utilizando DCC como agente de acoplamiento. Una vez que se ha completado el péptido, se ha de eliminar el grupo protector BOC final y se ha de separar el péptido del polímero. El HF anhidro rompe la unión éster que enlaza el péptido al polímero y también elimina el grupo protector BOC, Tal como lo veremos continuando con la síntesis:
O
O
O
Boc NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH 2 CH3
(CH3)2CH
Ph - CH 2
P
Boc - Ala - Val - Phe
P
HF
O
O
O
+
CH3
H 3N - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - OH + CO 2 + CH3 - C = CH2 + P CH3
(CH 3) 2CH
Ph - CH 2
Ala - Val - Phe
CH 2F