PROTEÍNAS Llamadas biomoléculas, biopolímeros o poliamidas de elevado peso molecular que por hidrólisis dan unidades llamadas alfa aminoácidos.
Los α-aminoácidos se encuentran enlazados en cadenas largas a través del grupo amino básico y el grupo carboxilo ácido mediante enlaces peptídico.
Las proteínas se hallan presente en todo organismo viviente y desempeñan notables importancias en las estructuras y funciones de las células: – Estructurales.- piel, pelo, uñas y tendones (queratina, colágeno). – Enzimática.- replicación y reparación del ADN (ADN polimerasa). – Transporte.- transporte de oxígeno a las células (hemoglobina). – Contractiles.- contracción de los músculos (miocina, actina). – Protectoras.- compleja las proteínas extrañas (anticuerpos). – Hormonales.- regula el metabolismo de la glucosa (insulina). – Toxinas.- incapacita a las presas (veneno de las serpientes)
Las cadenas con menos de 50 αaminoácidos se denominan péptidos y las proteínas propiamente dichas presentan cadenas más largas, de allí su elevado peso molecular
Péptido
Proteína
Estructura y estereoquímica de los αamoniácidos Todos los aminoácidos de las proteínas son ácidos α-aminocaboxílicos que contienen un grupo ácido y un grupo amino.
Al estado sólido, cristalino y seco existen como iones dipolares o zwitterión o ion zwitter (del alemán “ión dipolar”, “híbrido”). En esta forma el grupo carboxilo está presente como ión carboxilato (COO-) y el grupo amino como ión amonio (NH3+).
H3 O +
-
OH
Son anfóteros, dependiendo de la solución acuosa ácida o de la solución acuosa básica en que se encuentren, reaccionando como ácidos o bases. Así en solución acuosa ácida, el ión dipolar de un aminoácido es una base que acepta un protón para formar la parte catiónica y en solución acuosa básica, el ión dipolar de un aminoácido es un ácido que pierde un protón para formar la parte aniónica. En solución ácida
H3N+ - CH - COO- + H3O + R
En solución básica
H3N+ - CH - COO- + -OH R
H3N+ - CH - COOH + H2O R H2N - CH - COO- + H2O R
Poseen puntos de fusión altos y constantes dieléctricas elevadas. Predominan dentro de las células a pH 7.3 Con excepción de la glicina, todos los α-aminoácidos son quirales, de configuración (S) en el carbono alfa y pertenecen a la serie (L), teniendo la misma configuración relativa que el L(-) gliceraldehído, con el grupo amino a la izquierda en la proyección de Fischer. Por su estereoquímica similar a la del L(-)gliceraldehído, a los (S)-aminoácidos naturales se les clasifica como L-aminoácidos. La nomenclatura (D) y (L) , como la del sistema (R) y (S), se refieren a la configuración del átomo de carbono asimétrico. El signo de la rotación óptica (+) o (-) se determina experimentalmente.
COOH
CHO
COOH
C
C
C
H2N
CH3 H
HO
COOH H
H2N CH3
(S)- alanina (L-alanina)
CH2OH H
H2N
H
COOH
CHO HO
R
H CH2OH
L-(-)-gliceraldehído
H
H2N R
L-aminoácido configuración (S)
Por poseer el grupo ácido y el grupo amino, tienen propiedades químicas semejantes a los ácidos carboxílicos y las aminas. Poseen cadenas laterales (simbolizadas por R) sustituidas en el átomo de carbono alfa. Existen 20 aminoácidos diferentes que forman parte de las proteínas y son alfa-aminoácidos que constan de un grupo amino, un grupo carboxilo, un hidrógeno y un grupo R, unidos a un mismo carbono denominado carbono-alfa. El carbono-alfa recibe este nombre por ser el carbono adyacente al carbono del grupo carboxilo, y el grupo diferenciador de los distintos aminoácidos (R) se denomina cadena lateral.
CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS Aminoácidos con cadena lateral alifática:
Aminoรกcidos con cadena lateral aromรกtica:
Prolina, Pro, P
En la prolina la cadena lateral estรก unida tanto al carbono alfa como al nitrรณgeno del grupo amino.
Aminoรกcidos con presencia de รกtomos de azufre:
Cisteina, Cys, C
Metionina, Met, M
Aminoรกcidos hidroxiladas:
Serina, Ser, S
con
cadenas
alifรกticas
Treonina, Thr, T
Aminoรกcidos bรกsicos:
Lisina, Lys, K
Arginina, Arg, R
Histidina, His, H
Aminoácidos ácidos y sus amidas:
Ácido aspártico, Asp, D
Ácido glutámico, Glu, E
Asparagina, Asn, N
Glutamina, Gln, Q
Los derivados correspondientes del ácido aspártico y del ácido glutámico son la asparagina y la glutamina que contienen un grupo amida terminal en lugar del carboxilo libre.
Los aminoácidos son designados por abreviaturas, así: glilcina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp), etc. Los aminoácidos que no pueden ser sintetizados por el ser humano son llamados aminoácidos esenciales y ellos son: arginina, treonina, lisina, valina, fenilalanina, triptofano, metionina, histidina, leucina e isoleucina. Las proteínas completas proporcionan los aminoácidos esenciales y se hallan en la carne, el pescado, la leche y los huevos. Las proteínas de las plantas generalmente son incompletas; el arroz, el maíz y el trigo son deficientes en lisina. El arroz carece de treonina y el maíz de triptofano. Los vegetarianos superan este inconveniente con una ingesta de diferentes tipos de plantas.
Separación de aminoácidos por cromatografía Una vez hidrolizada la proteína para separarla en su respectivos aminoácidos se procede al uso de la cromatografía en capa fina mono o bidimensional; utilizando como revelador solución de ninhidrina 0.1% en alcohol absoluto o el reactivo policromático que consta de dos soluciones: Solución A.Ninhidrina 0.1g Colidina 2mL Ácido acético glacial 10mL Alcohol absoluto 50mL Solución B.-
Nitrato cúprico 0.5g Alcohol absoluto 50mL
Ambas soluciones se preparan en proporción de 50:3. Después con un spray se agrega el reactivo y luego se somete al calor en estufa a 110º C por cuatro minutos.
PUNTO ISOELÉCTRICO Y ELECTROFORESIS Punto isoeléctrico (pI) Es el pH en el cual el aminoácido no lleva carga iónica neta. Es decir que se refiere al pH en el que la concentración del ión dipolar, está en su punto máximo y las concentraciones de las formas aniónica y catiónica son idénticas. Esto depende de la basicidad del grupo amino o de la acidez del grupo carboxilo. En soluciones ácidas los aminoácidos presentan carga positiva (pH bajo) y en soluciones básicas carga negativa (pH alto). El pH intermedio de las dos formas de aminoácidos se hallan en la misma proporción como ión dipolar con una carga neta de cero, conocida como punto isoeléctrico.
El punto isoeléctrico depende de la estructura del aminoácido. H2N - CH - COOR pH alto (aniónico en medio básico)
H+ -OH
H3N - CH - COOR pH isoeléctrico (neutro)
H+ -OH
H3N+ - CH - COOH R pH bajo (catiónico en medio ácido)
Electroforesis Es una técnica analítica utilizada para separar mezclas de aminoácidos utilizando, las diferencias de sus puntos isoeléctricos. El equipo utiliza una capa de gel de acrilamida o papel de filtro humedecido con una solución tampón. En el centro de la capa de gel o del papel de filtro se coloca una línea de una mezcla de aminoácidos y en los extremos se colocan dos electrodos, al que se aplica un voltaje. Así, si se quiere separar una mezcla de aminoácidos de alanina, lisina y ácido aspártico a pH = 6 , la alanina no se mueve, la lisina se mueve hacia el cátodo y el ácido aspártico hacia el ánodo. Los aminoácidos se separan después de un tiempo y luego se raspa las bandas de gel o se corta el papel. El gel o el papel se tratan con ninhidrina para visualizar el color e identificarlos comparando sus posiciones con los valores estándar.
Las proteínas por ser macromoléculas, su peso molecular va desde miles a millones. Así el virus de la influenza (gripe) está formado por proteínas de un peso molecular de 5` 000, 000 cada una de las moléculas.
Factores que demuestran que las proteínas son poliamidas: Poseen escasas funciones aminas y carboxílicas libres titulables. El resto de funciones están comprometidas con enlaces peptídicos. 2. Los espectros de infrarrojo y ultravioleta, demuestran la ausencia de vibraciones características de la absorción de grupos amino y carboxílo libres. 3. Hay enzimas de actividad específica que han demostrado este tipo de unión peptídica. Ejemplo: peptidasa, polipeptidasa, etc. 1.
Productos intermedios hidrólisis de una proteína
liberados
Proteína desnaturalizada Metaproteína Proteosas Peptonas Polipéptidos Dipéptidos Aminoácidos
durante
la
Hidrólisis de proteínas Para verificar la hidrólisis ácida o alcalina de una proteína hasta aminoácidos se debe realizar la prueba de Biuret, si la hidrólisis no es completa, las proteínas dan color violeta púrpura o azul que se atribuye a la presencia de enlaces peptídicos múltiples en la molécula; si no da coloración, indica que la hidrólisis es total.
El proceso de hidrólisis de una proteína, se puede representar como la ruptura de una cadena polipeptídica
H
R
O
H
R`
O
H
R`` O
N
C
C
N
C
C
N
C
n
H
n`
H
HIDRÓLISIS
C
H
n``
H
cadena polipeptídica R H2N
C
R` COOH
H aminoácido
+ n
H2N
C
R`` COOH
H aminoácido
+ n`
H2N
C
COOH
H aminoácido
n``
+
Tipos de hidrólisis de las proteínas Hidrólisis ácida.- Utiliza ácido clorhídrico o ácido sulfúrico de concentración o normalidad conocida. Hidrólisis alcalina.- Utiliza hidróxido de sodio o hidróxido de bario de concentración o normalidad conocida. Hidrólisis enzimática.- Utiliza compuestos biológicos de naturaleza protéica: enzimas.
Reacciones de la proteínas 1.
Reacciones de coloración: Reacción de Biuret (violeta púrpura) Reacción xantoprotéica (amarillo a anaranjado) Reacción de Millón (rojo) Reacción de ninhidrina (violeta o púrpura)
2.
Reacciones de precipitación (con sales metálicas dan precipitados): Nitrato de plata, sulfato de cobre, cloruro de bario, bicloruro de mercurio, acetato de plomo.
3.
Reacciones de coagulación Con el calor: solución protéica más ácido acético más calor Con el alcohol etílico. Reacción del anillo de Heller: 5mL HNO3 más 5mL de proteína agregado en zona, da un anillo blanco en la zona de contacto.
SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS 1. La reacción de Hell – Volhard – Zelinsky, es una reacción de sustitución (por desprotonación) que se da en el átomo de carbono adyacente al grupo carbonilo (aldehídos y cetonas), es utilizada para la halogenación en la posición alfa de un ácido carboxílico. El ácido alfa halogenado carboxílico tratado con exceso de amoníaco (amonólisis) genera un alfa aminoácido racémico.
Aminación de α-halo ácidos Hell-Volhard-Zelinsky Es la forma más inmediata de introducir un grupo amino en a a un ácido carboxílico
R 3 CH H C H COOH
R 3 CH
Br2 + PBr3
H C H Br
Válido para: glicina, alanina, serina, treonina, valina, leucina, nor leucina, fenilalanina
Br
80%
COOH
Rendimientos 25ºC NH 3 2 relativamente (SN ) 4 dias bajos H O 2
H Br
R 3 CH H C
NH3
56%
COO
(R,S) – α - aminoácido
CH3
CH 3
O
CH3CHCH 2CH2COH
1. Br 2 PBr3 2. H 2O
O
CH3
CH3CHCH2CHCOH
NH3
CH3CHCH2CHCOH
exceso
Br
Ph
CH2
CH2
NH2
ácido 2-bromo-4-metilpentanóico
ácido 4-metilpentanóico
COOH
1. Br2 PBr 3 2. H 2O
Ph
O
CH2
(R,S)-leucina (45%)
CH
COOH
Br
ácido 3-fenilpropanóico
NH3 exceso
NH2 Ph
CH2
CH
COO- +NH4
(D,L)-fenilalanina (sal) (30 - 50%)
2. Síntesis de Strecker.- Es un método que consiste en obtener un alfa aminoácido a través de dos etapas: a) Tratando un aldehído con solución acuosa de amoníaco en presencia de HCN ó KCN / NaCN. b) El producto que se obtiene es un alfaaminonitrilo intermediario, que por hidrólisis da el alfa aminoácido racémico. +
NH2 R
CHO + NH3 + HCN
R
C
NH3 C
H aldehído
alfa-aminonitrilo
N
H+ H2O
R
C
COO -
H (R,S)-alfa-aminoácido
O CH3
+
NH2 H2O
H + NH3 + HCN
C
acetaldehído
R
C
C
C
N
H3O +
CH3
C
H
COOH
alfa-aminopropionitrilo
O
(R,S)-alanina (60%)
NH
CH2CH
CH2CH
NH3 + HCN
H2O
fenilacetaldehído
NH3 + HCN
imina
O CH2CHC NH2
alfa-aminonitrilo
NH3
N
CH2CHCOH H3O+
NH2
(R,S)-fenilalanina (53%)
H 2O
3. Síntesis de Gabriel y Malónica.- La síntesis malónica es una reacción de alquilación del malonato de dietilo, con posterior hidrólisis y descarboxilación, generando un ácido acético alquilado. COOEt H
C
H
COOEt
éster malónico
COOH
COOEt -OEt
RX
H
C
R
COOEt
alquilado
H3 O+ , calor
H
C
R
+ CO2
H
ácido acético alquilado
Para adaptar esta síntesis en la obtención de aminoácidos, se emplea el éster Nftalimidomalónico que proviene de la reacción alfa-bromomalonato de dietilo con la ftalimida potásica; el que tratado con –OEt / RX genera el éster alquilado. En este caso el grupo amino está protegido en forma de amida, el grupo ácido está protegido como éster etílico y la posición alfa está activada por el grupo éster temporal del malonato de dietilo. Todo esto se representa como si fuera la molécula de la glicina:
grupo amino protegido
O H H2N
C
COOEt COOH
N
H
C
COOEt
H O
glicina
grupo éster temporal del malonato de dietilo
éster del N-ftalimidomalónico
ácido protegido
La síntesis de Gabriel y Malónica, es un método general para la síntesis de aminoácidos, que combina la síntesis de Gabriel de aminas con la síntesis malónica de ácidos carboxílicos alquilados. Ambas síntesis comienzan con el éster N-ftalimidomalónico, que sirve de base para la síntesis de α-aminoácidos. El éster es alquilado y luego hidrolizado, así el grupo ftalimido se hidroliza junto con los grupo éster. El producto final es un ácido aminomalónico alquilado que por descarboxilación da el αaminoácido racémico.
Vía síntesis de Gabriel 2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potásica O
OEt
O
OEt
C
CO
C
CO
N
H C Br
K
K Br
N
CO
C
85%
OEt
O ftalimida potásica
C H
C
CO
O
OEt
EtONa
O
OEt
C
CO N
C
RX
O
OEt
C
CO N
R
C
CO
O
OEt
derivado N-ftalimida
X
Na
Cd
C
CO
O
OEt
Na
Vía síntesis de Gabriel O
OEt
C
CO N
H2O
O
OH
C
CO
C RR
C
CO
O
OEt
N
H 3O
C R
C
CO
O
OH
Válido para muchos aminoácidos.
∆ CO2
derivado N-ftalimida
O
O
C OH C O
OH
H H3N
H2O
C
H 3O
C
CO
O
OH
N
C R CO O
Glicina (R=H)85%
H C R
O
O CO OEt N
CO OEt ( 1) base
CH
N
( 2) R-X
C
CO OEt
H 3O+
R
O
éster del N-ftalimidomalónico
alquilado
C
1 . Na
N
OE t
2 . BrCH 2CO2Et
CO2Et
EtOCCH2
CH 3 C
H
C
H 3O
C
R
+
α−aminoácido
O
+
HO CCH 2CHCOH
Ca lor
CH 3
NH2
C O
Acetamidomalónico dietílico
O
Ácido (R,S)-aspártico (55%)
O CO OEt N
CH
CO OEt ( 1) NaOE t
N
( 2) Cl - CH 2CH2SCH 3
CO OEt O
H 3N
COO H
O
CO2Et
N H
O
+
calor
R
hidrolizado
O
CO2Et
C
COO H
+ -
H
H
+
H 3N
CO OEt
O
CO 2E t
COO H
O
C
CH2CH 2S CH 3
CO OEt
H H 3O
+
calor
+
H 3N
C
CH 2CH 2SCH 3
COO H ( D,L ) metionina (50%)
CO2
Resolución de aminoácidos (R) (S) La síntesis de Gabriel y Malónica, como la síntesis de Strecker, realizada a partir de sustancias aquirales, producen mezclas racémicas de α-aminoácidos (mezcla de partes iguales de compuestos (S) y (R). La resolución de aminoácidos es factible transformándolos en diasteroisómeros y posteriormente en sus enantiómeros correspondientes. También de manera selectiva se pueden separar por métodos biológicos.
O RCHCOH N
O RCHCOH NH 2
mezcla R,S
(CH 3CO)2O
H
O
H2O carboxipeptidasa
O
mezcla R,S
O
C
CH 3 C
OH
H2N
C
H
R
aminoรกcidos S
+
H
OH C
O
C
NHCCH 3
R
aminoรกcidos R
Biosíntesis de aminoácidos A partir de amoniaco y carbohidratos (a-cetoácidos) se sintetizan en el organismo en presencia de enzimas reductoras
Síntesis de glutámico Aminoácidos esenciales: Arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano y valina.
O
O C
O
C O O
NH 3 L-glutamato deshidrogenasa
α-cetoglutarato
H H3N
O C
O
C O O
Ac. glutámico
COO
Síntesis de aminoácidos
C R
H
NH 3
L-aminoácido
transaminasa
COO R C O α-cetoácido
REACCIONES DE AMINOﾃ，IDOS 1. H3N
Por el grupo amino.- Ante un agente acilante transforma el grupo amino en una amida. CH3
CH COO CH2
CH3
NH
C O C CH 3 O
O
Histidina
O
100ﾂｺC
CH3
C
N-acetilhistidina
O COOH
+
CH3
C
H Br
NH2
CH3
C NH2
+
COOH C
CH3
O alanina
N
80%
anhidrido acﾃｩtico H
CH 2 NH
2h
N
C HN CH COOH
bromuro de acetilo
N-acetilalanina
HBr
2.
Por el grupo carboxilo.- Al igual que los ácidos carboxílicos monofuncionales, con exceso de alcohol y HCl gaseoso como catalizador, generan ésteres que actúan como derivados protectores; siendo los más importantes los ésteres metílicos, etílicos y bencílicos y se les aisla por cristalización como clorhidratos. El grupo amino protonado (-NH3+) del aminoácido no interfiere en la reacción. Así mismo, el éster en un medio ácido regenera al aminoácido libre.
CH2 CH
COO
NH3 Fenilalanina
CH3OH HCl
CH2 CH
90%
CO OCH3
NH3
Cl
Éster metílico de la fenilalanina
Cl-
O +
H 2N
CH
H2C
+
O-
C CH2
H 2N Ph - CH 2 - OH HCl
O
CH2Ph
CH2
éster bencílico de la prolina (90%)
COOH
O CH
C
CH2
prolina
H3N
CH
H2C
CH2
+
O
C
OCH2CH3
CH2 - Ph éster etílico de la fenilalanina
H 3O +
O +
H3N
CH
C
CH2 - Ph fenilalanina
OH
+ CH3CH2 - OH