Presencia de 31 micotoxinas en piensos para cerdos en España

PRESENCIA DE 31 MICOTOXINAS EN PIENSOS PARA CERDOS EN ESPAÑA

L. Gámiz-Gracia1, N. Arroyo-Manzanares2, V. Rodríguez-Estévez3 y A.M. García-Campaña1 Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada.

1

Departamento de Química Analítica, Facultad de Química, Universidad de Murcia.

2

Departamento de Producción Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba.

3

1

Las micotoxinas son toxinas fúngicas

Según la Organización de las Naciones Unidas

producidas por varios centenares de especies

para la Alimentación y la Agricultura (FAO),

de mohos que pueden crecer sobre las

se estima que el 25% de la producción de

cosechas o alimentos en determinadas

cereales y el 20% de la de plantas a nivel

condiciones. Las más importantes son

mundial están afectadas por micotoxinas,

las producidas por mohos de los géneros

aunque recientes estudios consideran que

Aspergillus, Fusarium y Penicillium.

esta cifra podría estar subestimada2.

Además, los efectos del cambio climático hacen prever un aumento de la producción Las micotoxinas se han convertido en uno

de hongos toxigénicos en

de los contaminantes más reportados a

los próximos años3.

nivel mundial, hecho que aparece reflejado en los últimos informes del Sistema de Alertas Rápidas de la UE (Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF)1.

Cabe destacar que, a pesar de los conocimientos actuales y de las mejoras en las prácticas de producción y almacenamiento, no se ha podido erradicar el desarrollo de los hongos y mohos, por tanto, se encuentran micotoxinas en gran cantidad de alimentos.

2

A pesar de la gran variedad de micotoxinas conocidas con diversos efectos toxicológicos, la UE ha fijado niveles máximos permitidos o recomendaciones únicamente para 14 de

Entre los animales de granja, el

ellas (aflatoxinas B1, B2, G1, G2 y M1, ocratoxina

cerdo es considerado como una

A, patulina, deoxinivalenol, zearalenona,

de las especies más vulnerables a

fumonisinas B1 y B2, toxinas T-2 y HT-2,

los efectos de las micotoxinas.

citrinina), así como para los esclerocios de cornezuelo de centeno, en diversos alimentos destinados para consumo humano4,5.

Dichos efectos pueden abarcar cambios En el caso de alimentación animal, el número de micotoxinas con niveles máximos permitidos o recomendados es aún menor, limitándose a la aflatoxina B1,

en la respuesta inmunitaria (dando como resultado una reducción en la eficacia de la vacunación), pérdida de apetito, abortos, agalactia, etc.

ocratoxina A, deoxinivalenol, zearalenona, fumonisinas B1 y B2, toxinas T-2 y HT-2, y los esclerocios de cornezuelo de centeno6,7.

Micotoxinas con niveles máximos permitidos fijados o recomendaciones en alimentos destinados a consumo humano en la UE Aflatoxinas B1, B2, G1, G2 y M1 Ocratoxina A Patulina Deoxinivalenol Zearalenona Fumonisinas B1 y B2 Toxinas T-2 y HT-2 Citrinina

Micotoxinas con niveles máximos permitidos fijados o recomendaciones en alimentos destinados a alimentación animal en la UE Aflatoxina B1 Ocratoxina A Deoxinivalenol Zearalenona Fumonisinas B1 y B2 Toxinas T-2 y HT-2

3

En la Tabla 1 se presenta un resumen de las micotoxinas reguladas en la legislación europea en alimentos para cerdos, sus límites permitidos o recomendados, así como sus efectos en la salud más comunes.

Tabla 1. Valores máximos permitidos o recomendados en alimentación para ganado porcino.

Micotoxina

AFB1 a

ZEN b

OTA

Producto Materias primas para piensos

0,02

Aspergillus flavus

Piensos compuestos para porcinos (excepto lechones)

0,02

Piensos compuestos para lechones

0,005

Fusarium graminearum Fusarium culmorum

DON b

Fusarium graminearum

Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Aspergillus carbonarius

b

FB1 + FB2

b

T-2 + HT-2 b

Cornezuelo de centeno a

Contenido máximo o recomendado (mg/kg)c

Principales hongos productores

Fusarium verticillioides Fusarium proliferatum

Materias primas para piensos: Cereales y productos a base de cereales, con excepción de los subproductos de maíz

Claviceps purpurea

Bajo rendimiento, daño hepático, inmunosupresión, neoplasia

8

Subproductos de maíz

12

Piensos compuestos para cerdos

0,9

Materias primas para piensos: Cereales y productos a base de cereales, con excepción de los subproductos de maíz

2

Subproductos de maíz

3

Piensos compuestos para lechones y cerdas nulíparas

0,1

Piensos compuestos para cerdas y cerdos de engorde

0,25

Materias primas para piensos: cereales y productos a base de cereales

0,25

Piensos compuestos para cerdos

0,05

Materias primas para piensos: maíz y productos a base de maíz

60

Piensos compuestos para cerdos

5

Productos de la molienda de avena (cáscaras)

2

Fusarium sporotrichioides Otros productos a base de cereales Fusarium langsethiae

Efectos comunes descritos en cerdos 8,9,10

Pérdida de apetito, vómitos, bajo rendimiento

Bajo rendimiento, infertilidad, prolapso, abortos

Bajo rendimiento, daño hepático y del riñón

0,5

Piensos compuestos

0,25

Materias primas para piensos y piensos compuestos que contienen cereales no molidos.

1.000

Edema pulmonar, inmunosupresión, trastornos intestinales, pérdida de peso Anorexia, pérdida de peso, lesiones en la boca y esófago, leucopenia, problemas en la reproducción

Micotoxinas con contenidos máximos permitidos 6 Micotoxinas con valores orientativos 7 c Contenido máximo en mg/kg en piensos calculado sobre la base de un contenido de humedad del 12%

a

b

4

Los alcaloides ergóticos, conocidos desde la antigüedad por sus efectos tóxicos, no están incluidos en legislación (únicamente hay un contenido máximo para el cornezuelo de centeno, recogido en la Tabla 1), aunque también suponen un riesgo para el ganado y se prevé que en un futuro próximo se establezcan contenidos máximos para estos compuestos.

La mirada puesta en las micotoxinas emergentes Además de las micotoxinas incluidas en la Tabla 1, existen otras micotoxinas que actualmente se encuentran bajo estudio por ser potencialmente tóxicas y para las que aún no se han establecido niveles máximos permitidos.

Son las llamadas “micotoxinas emergentes”, entre las que se incluyen algunas producidas por hongos del género Fusarium, como eniatinas y beauvericina, que colonizan sobre todo cereales y que se pueden acumular en el grano11.

En los siguientes apartados se profundiza sobre estos grupos de micotoxinas.

5

ALCALOIDES ERGÓTICOS Los alcaloides ergóticos, o alcaloides

Esta enfermedad puede generar síntomas distintos

del cornezuelo del centeno, llamados

que dependen de la especie en cuestión. Así, en

así por el espolón o “cuerno” que

los cerdos los alcaloides ergóticos pueden provocar

produce el hongo en el grano al

bajo rendimiento, pérdida de apetito, agalactia,

crecer, son producidos por diferentes

problemas reproductivos, mortalidad neonatal, daños

hongos de los órdenes Hypocreales y

en el hígado y gangrena13-16. Esta gran variedad de

Eurotiales, siendo Claviceps purpurea

síntomas dificulta la identificación del problema.

el más extendido en Europa.

Este hongo infecta a granos de diversos cereales como centeno, trigo, cebada, mijo y avena, frecuentemente empleados en alimentación animal.

La toxicidad de los alcaloides ergóticos se conoce desde la Edad Media, ya que generó las epidemias conocidas

Alcoides ergóticos

Rendimiento Pérdida de apetito Problemas reproductivos Mortalidad neonatal Daño hepático Gangrena

como “fuego de San Antonio” o ergotismo y, aunque se considera una enfermedad erradicada en humanos, en las últimas décadas se han descrito brotes esporádicos de ergotismo en ganado12,13.

6

Hasta la fecha se han descrito más de 50 alcaloides ergóticos diferentes que presentan como estructura común el anillo de ergolina (Figura 1).

Figura 1. Anillo de ergolina de la estructura básica de los alcaloides ergóticos

Se recomienda la monitorización de seis alcaloides ergóticos por ser los más comunes (ergometrina, ergotamina, ergosina, ergocristina, ergocriptina, ergocornina) y sus correspondientes epímeros (ergometrinina, ergotaminina, ergosinina, ergocristinina, ergocriptinina, ergocorninina).

Principales alcaloides ergóticos monitorizados Ergometrina Ergotamina Ergosina Ergocristina Ergocriptina Ergocornina

Epímeros

Ergometrinina Ergotaminina Ergosinina Ergocristinina Ergocriptinina Ergocorninina

Mientras que los isómeros C8-(R) son biológicamente activos, los epímeros C8-(S) se consideran con escasa o nula actividad.

Sin embargo, al ser la conversión entre isómeros rápida, las muestras contaminadas suelen presentar ambas formas, por lo que a la hora de determinar la concentración de alcaloides ergóticos en una muestra hay que considerarlos de forma conjunta17,18,19.

7

Actualmente los niveles máximos permitidos para los alcaloides ergóticos están bajo estudio, aunque la industria recomienda niveles máximos en piensos para cerdos entre 0,2-0,5 mg/kg20.

No obstante, algunos estudios sugieren que valores inferiores consumidos durante periodos prolongados de tiempo podrían provocar daños intestinales y hepáticos21.

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha señalado recientemente la necesidad de recopilar más información sobre la presencia de estos alcaloides y de desarrollar métodos analíticos para su control.

Mientras tanto, basándose en los datos disponibles y para evitar los efectos vasoconstrictores de los alcaloides ergóticos en el ganado, se ha estimado una dosis de referencia aguda de 1 µg/kg de peso corporal y una ingesta diaria tolerable (TDI) de 0,6 µg/kg de peso corporal por día22. Además, y como medida de precaución, la UE ha establecido un nivel máximo para los esclerocios del cornezuelo del centeno en cereales de 1.000 mg/kg6.

Dosis de referencia aguda:

1 µg/kg de peso corporal Ingesta diaria tolerable (TDI):

Alcaloides ergóticos en piensos para cerdos

0,6 µg/kg de peso corporal por día

0,2-0,5 mg/kg

Esclerocios del cornezuelo del centeno en cereales:

1.000 mg/kg

8

ENIATINAS

ENIATINAS Y BEAUVERICINA

Las eniatinas son producidas por hongos del género

La estructura de las principales eniatinas y de

Fusarium, como F. avenaceum, F. oxysporum, F. poae o F. tricinctum, y presentan estructura de hexadepsipeptidos cíclicos que alternan ácidos D-α- hidroxiisovaléricos y N- metil-L-aminoácidos.

la beauvericina se muestra en la Figura 2.

a)

b)

Los residuos de aminoácidos de las eniatinas de tipo A y B, son N-metil-valina alifática o N-metilisoleucina, o mezclas de estos aminoácidos.

Se conocen hasta 29 eniatinas diferentes, siendo las eniatinas A, A1, B y B1 las más estudiadas,

BEAUVERICINA

especialmente en cereales y productos derivados.

La beauvericina es producida por Fusarium

proliferatum, F. subglutinanos, F. verticillioides y F. oxysporum, y presenta una estructura relacionada con la de las eniatinas, aunque a diferencia de estas, los tres residuos de aminoácidos son N-metil-fenilalaninas aromáticas.

R1

R2

R3

ENNA

Sec-but

Sec-but

Sec-but

ENNA1

i-pr

Sec-but

Sec-but

ENNB

i-pr

i-pr

i-pr

ENNB1

i-pr

i-pr

Sec-but

Figura 2. Estructura química de las principales eniatinas (ENN) (a) y beauvericina (b).

9

Así, la beauvericina tiene

Las eniatinas actúan como inhibidores del enzima acil-CoA .

11,23

y colesterol acil transferasa

propiedades insecticidas capaces de inducir apoptosis en células de mamíferos. Además, presenta actividad antiviral, citotóxica

Al igual que las eniatinas, la

e inmunosupresora23-25.

beauvericina facilita el transporte de cationes mono o divalentes a través de la membrana celular, alterando las concentraciones fisiológicas normales de estos iones.

Eniatinas Inhibición del acil-CoA y colesterol acil transferasa

Beauvericina Actividad insecticida, antiviral, citotóxica e inmunosupresora

A pesar de que los estudios in vitro han evidenciado la toxicidad de estas micotoxinas (mostrando sus posibles efectos genotóxicos y sobre el sistema reproductivo), aún no existen suficientes evidencias de su toxicidad in vivo26.

Por ello, la EFSA emitió una opinión científica sobre la necesidad de recolectar más datos toxicológicos producidos por la exposición crónica a estos compuestos, concluyendo además que es necesario contar con más datos sobre la presencia simultánea de eniatinas y beauvericina con otras toxinas de Fusarium, así como estudiar sus posibles efectos combinados27.

Algunos estudios recientes han demostrado la citotoxicidad de estos compuestos en estudios in vitro, empleando la línea celular epitelial intestinal porcina IPEC-J2, siendo la beauvericina la micotoxina con una mayor biodisponibilidad28.

La presencia de eniatinas y beauvericina en cereales ha sido ampliamente documentada a través de diversos estudios que han revelado la gran incidencia de estos compuestos, en ocasiones en concentraciones del orden de los mg/kg29-32.

10

Caso de estudio Presencia de 31 micotoxinas en alimentos para cerdos Nuestro grupo de investigación llevó a cabo el análisis de 228 muestras de alimento para cerdos para determinar

Las muestras (2 muestras de maíz en grano

la presencia de 31 micotoxinas:

y 226 muestras de pienso, de las cuales 183 eran harinas y 43 pellet) fueron obtenidas

Micotoxinas con límites

en granjas y fábricas de toda España entre

permitidos o recomendados:

febrero y agosto de 2017 e incluían:

aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, ocratoxina A, deoxinivalenol, zearalenona, fumonisinas B1 y B2, y toxinas T-2 y HT-2

71 piensos y 2 muestras de maíz destinados a cerdos de engorde 42 piensos destinados a cerdas 111 piensos destinados a lechones

Eniatinas (B, B1, A y A1) Beauvericina Las micotoxinas fueron extraídas de la 12 alcaloides ergóticos

matriz mediante extracción sólido-líquido,

más comunes

mientras que para el análisis se empleó la cromatografía de líquidos con un detector de

Otras micotoxinas consideradas

fluorescencia (LC-FLD) para las aflatoxinas,

de interés: citrinina, fusarenon

y cromatografía de líquidos acoplada a

X y esterigmatocistina

espectrometría de masas en tándem (LC-MS/ MS) para el resto de micotoxinas.

Los resultados fueron publicados en dos artículos de investigación33,34.

Cabe mencionar que la LC-MS/ MS permite la determinación de un número elevado de compuestos con buena sensibilidad, selectividad y un poder de confirmación que la han convertido en una herramienta imprescindible para la determinación multi-micotoxinas35.

11

En la Figura 3 y la Tabla 2 se presenta un resumen de los datos obtenidos.

Las micotoxinas más frecuentes fueron: Eniatina B (100% de las muestras) Eniatina B1 (83,3% de las muestras) Eniatina A1 (73,2% de las muestras)

Todas las muestras cumplían con los requisitos sobre niveles máximos permitidos o recomendados para la aflatoxina B1, ocratoxina A, fumonisinas B1+B2, toxinas T-2 y HT-2, deoxinivalenol y suma de los doce alcaloides ergóticos.

Beauvericina (98,2% de las muestras) Fumonisina B1 (66,2% de las muestras) Por el contrario, la aflatoxina G2 y los alcaloides ergóticos: ergotaminina, ergocorninina, ergocristina, ergocriptina y ergocriptinina no fueron detectados en ninguna muestra.

En cuanto a los niveles encontrados, las concentraciones más altas se

Sin embargo, algunas muestras (3,1%) presentaron concentraciones de zearalenona por encima del nivel recomendado: 1 muestra de maíz (7.681 µg/kg) 5 muestras de pienso para lechones (concentraciones entre 125 y 956 µg/kg)

registraron para la zearalenona (7.681 µg/kg), fumonisina B1 (3.959 µg/ kg) y eniatina B (1.222 µg/kg).

1 pienso para cerdos de engorde (290 µg/kg)

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 20% 0% AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 FB1 FB2 ZEN OTA CIT T-2 HT-2 DON F-X STE ENNA ENNA1 ENNB ENNB1 BEA Em Emn Et Etn Es Esn Eco Econ Ecr Ecrn Ekr Ekrn

Porcentaje de muestras positivas*

Figura 3. Incidencia de las micotoxinas encontradas en 228 muestras de alimento para cerdos.

*considerando las muestras con concentraciones superiores al límite de detección del método empleado AFB1: aflatoxina B1; AFB2: aflatoxina B2; AFG1: aflatoxina G1; AFG2: aflatoxina G2; FB1: fumonisina B1; FB2: fumonisina B2; ZEN: zearalenona; OTA: ocratoxina A; CIT: citrinina; T-2: Toxina T-2; HT-2: Toxina HT-2; DON: deoxinivalenol; F-X: fusarenon X; STE: esterigmatocistina; ENNA: eniatina A; ENNA1: eniatina A1; ENNB: eniatina B; ENNB1: eniatina B1; BEA: beauvericina; Em: ergometrina; Emn: ergometrinina; Et: ergotamina; Etn: ergotaminina; Es: ergosina; Esn: ergosinina; Eco: ergocornina; Econ: ergocorninina; Ecr: ergocristina; Ecrn: ergocristinina; Ekr: ergocriptina; Ekrn: ergocriptinina.

12

Tabla 2. Resumen de los resultados obtenidos en la determinación de 31 micotoxinas en 228 muestras de alimento para cerdos.

Rango de concentración (µg/kg) *

Cuartil 0,25 (µg/kg) *

Cuartil 0,50 Cuartil 0,75 (µg/kg) * (µg/kg) *

89,9

0,29-2,91

0,46

0,57

0,95

0,60

55,0

0,28-1,06

0,38

0,47

0,77

0,9

0,33

33,3

0,22-0,44

0,28

0,33

0,39

0

0,0

---

---

---

---

---

---

FB1

151

66,2

403

132,6

4,09-3.959

106

209

536

FB2

96

42,1

184

101,0

3,63-961

63,0

133

219

ZEN

31

13,6

741

244,0

101-7.681

127

137

463

OTA

2

0,9

---

---

---

---

---

---

CIT

43

18,9

147

80,3

10,7-512

73,0

109

196

T-2

17

7,5

31,9

12,4

28,0-35,9

29,9

31,9

33,9

HT-2

6

2,6

117

4,8

112-123

115

117

120

DON

35

15,4

237

50,6

153-555

165

182

229

F-X

21

9,2

291

82,5

65,1-821

111

212

343

STE

7

3,1

104

115,4

11,2-308

11,4

12,8

179

ENNA

87

38,2

9,82

170,3

3,29-65,0

3,61

3,93

6,46

Concentración %CV * media (µg/kg) *

Nº muestras positivas

Incidencia (%)

AFB1

7

3,1

0,94

AFB2

3

1,3

AFG1

2

AFG2

ENNA1

167

73,2

19,0

127,5

4,54-140

6,69

10,5

20,4

ENNB

228

100

118

137,2

2,01-1.222

14,9

54,3

164

ENNB1

190

83,3

34,3

141,3

2,58-247

6,55

15,1

37,2

BEA

224

98,2

20,7

270,2

1,71-747

4,94

8,73

19,2

Em

18

7,9

59,1

73,8

18,6-145

31,2

37,3

65,8

Emn

5

2,2

---

---

---

---

---

---

Et

8

3,5

9,47

37,5

6,32-16,0

6,58

7,42

12,8

Etn

0

0,0

---

---

---

---

---

---

Es

9

3,9

5,72

50,9

3,41-10,1

3,63

3,85

8,14

Esn

11

4,8

10,7

30,7

5,87-17,5

8,16

10,84

13,16

Eco

1

0,4

---

---

---

---

---

---

Econ

0

0,0

---

---

---

---

---

---

Ecr

5

2,2

12,2

14,0

10,2-14,9

10,5

12,5

12,6

Ecrn

0

0,0

---

---

---

---

---

---

Ekr

0

0,0

---

---

---

---

---

---

Ekrn

0

0,0

---

---

---

---

---

---

*considerando sólo las muestras con concentraciones superiores al límite de cuantificación del método empleado AFB1: aflatoxina B1; AFB2: aflatoxina B2; AFG1: aflatoxina G1; AFG2: aflatoxina G2; FB1: fumonisina B1; FB2: fumonisina B2; ZEN: zearalenona; OTA: ocratoxina A; CIT: citrinina; T-2: Toxina T-2; HT-2: Toxina HT-2; DON: deoxinivalenol; F-X: fusarenon X; STE: esterigmatocistina; ENNA: eniatina A; ENNA1: eniatina A1; ENNB: eniatina B; ENNB1: eniatina B1; BEA: beauvericina; Em: ergometrina; Emn: ergometrinina; Et: ergotamina; Etn: ergotaminina; Es: ergosina; Esn: ergosinina; Eco: ergocornina; Econ: ergocorninina; Ecr: ergocristina; Ecrn: ergocristinina; Ekr: ergocriptina; Ekrn: ergocriptinina.

13

CO-OCURRENCIA DE MICOTOXINAS En cuanto a la presencia de varias micotoxinas en la misma muestra

Figura 4. Presencia de varias micotoxinas en una misma muestra de alimento para cerdos.

(considerando únicamente aquellas micotoxinas presentes a concentraciones

12 micotoxinas 0,44%

superiores al límite de detección del método), se puede resumir en:

11 micotoxinas 0,44%

13 micotoxinas 0,44%

10 micotoxinas 3,51% 2-3 micotoxinas: 9,2% 4 micotoxinas: 16,7%

9 micotoxinas 4,39% 3 micotoxinas 7,46%

5 micotoxinas: 16,7% 6 micotoxinas: 16,2% 7 micotoxinas: 18,9%

2 micotoxinas 1,75%

8 micotoxinas 13,16%

4 micotoxinas 16,67%

8 micotoxinas: 13,2% 9-13 micotoxinas: 9,2% En la Figura 4 se representan los resultados obtenidos.

7 micotoxinas 18,86% 6 micotoxinas 16,23%

5 micotoxinas 16,67%

14

CONCLUSIONES De las 228 muestras analizadas, sólo 7 presentaron niveles por encima de los permitidos para zearalenona.

Igualmente, hay que destacar la baja incidencia de alcaloides ergóticos, que podría explicarse por estar muchos de los piensos elaborados a base de maíz, cereal poco susceptible a la contaminación por Claviceps purpurea.

Por otro lado, también hay que destacar la elevada incidencia de micotoxinas emergentes, en particular de eniatina B (100% de las muestras), eniatina B1 (83,3%), eniatina A1 (73,2%) y beauvericina (98,2%), no incluidas en la legislación actualmente, pero con evidencias de toxicidad para cerdos.

Un aspecto importante a tener en cuenta es la presencia simultánea de distintas micotoxinas en una misma muestra (hasta 13 micotoxinas), dada la posible interrelación entre las distintas micotoxinas consumidas conjuntamente, que pueden presentar efectos aditivos, sinérgicos, potenciados o antagonistas sobre la salud.

Estos efectos no se pueden predecir a partir de los efectos individuales de las micotoxinas. Además, hay dependencia de la dosis, especie y toxina, e incluso de los propios factores ligados a la metodología experimental empleada en su estudio.

No obstante, dada la importancia de este tema y, teniendo en cuenta que, en el análisis de riesgos, los niveles máximos permitidos o recomendados y TDI se fijan de acuerdo a los efectos individuales de cada micotoxina, estos valores deberían revisarse teniendo en cuenta estos posibles efectos y el riesgo potencial a una exposición crónica a múltiples micotoxinas, incluso si se encuentran a niveles inferiores a los permitidos36,37,38.

15

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