M. Y. Sreenivasa - Afrontando el desafío global de las micotoxinas

M. Y. Sreenivasa Afrontando el desafío global de las micotoxinas Dr. M. Y. Sreenivasa - Profesor, Doctor en Microbiología (Universidad de Mysore, India)

El Dr. M. Y. Sreenivasa, profesor del Departamento de Microbiología de la Universidad de Mysore (India), tiene 16 años de experiencia en la enseñanza a nivel de postgrado. Tras haber participado en numerosos proyectos de investigación y haber recibido muchos premios, el Dr. Sreenivasa tiene amplios conocimientos en el campo de la micología y la producción de micotoxinas.

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La micología es un campo de investigación fascinante. ¿Qué hace a estos microorganismos tan interesantes y por qué es importante entenderlos y estudiarlos?

Evidentemente, la micología es un campo de investigación fascinante, ya que los hongos están ampliamente distribuidos, son omnipresentes y también desempeñan una función positiva y negativa en el medio ambiente como organismos saprófitos, simbiontes, patógenos, contaminantes y beneficiosos.

Esta versatilidad de los hongos les permite asociarse con humanos, animales, plantas y muchos más. Para desentrañar los misterios de muchos hongos económicamente importantes, es interesante estudiar su biología y fisiología.

Parte de su investigación se ha centrado en el Fusarium y el Aspergillus. Cuál es la situación actual de estos dos hongos en la India? ¿Son un problema para los agricultores?

Aspergillus y el Fusarium son hongos deteriorantes que se encuentran presentes simultáneamente en los productos alimenticios/ piensos almacenados, lo que plantea una gran amenaza para las industrias alimentaria y ganadera en la India y en todo el mundo.

Estos géneros son infamemente conocidos por ser hongos asociados al almacenamiento, ya que predominan en los productos alimenticios almacenados.

Muchos productos alimenticios exportados desde la India han sido rechazados debido a la contaminación por aflatoxinas/hongos.

Alrededor del 72% de las muestras de alimentos/piensos analizadas a nivel mundial se han contaminado con estas micotoxinas, lo que entraña un gran riesgo para la salud de los seres humanos y los animales debido a las enfermedades e intoxicaciones crónicas asociadas a los alimentos (Schatzmayr y Streit, 2013; Oliveria et al., 2017).

Los agricultores de la India se enfrentan a un gran problema con estos hongos, ya que son multi-fitopatógenos y también productores potenciales de micotoxinas.

Las condiciones de almacenamiento y los factores ambientales también favorecen su colonización en la India y en muchos otros países en desarrollo.

Fusarium también es un hongo de campo conocido por colonizar varios tipos de cosechas, lo que se traduce en un bajo rendimiento.

Algunos ejemplos son la marchitez por Fusarium en las cucurbitáceas, la fusariosis de la espiga y las manchas en los cereales, etc. En mi opinión, siempre son un problema para los agricultores de todo el mundo.

¿Cuáles son las principales medidas de control utilizadas actualmente para mitigar los efectos de las micotoxinas en el ganado? ¿Son suficientes o es necesario encontrar nuevas estrategias?

Las medidas de control se aplican ampliamente para mitigar la contaminación fúngica en los alimentos o los piensos. Se llevan a cabo en tres etapas -antes de la cosecha (precosecha), durante la cosecha y después de la cosecha (postcosecha)- y consisten en:

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Desarrollo de cultivos resistentes a los hongos Utilización de fungicidas y/o conservantes Control de las infestaciones de insectos Reducción del contenido de humedad de las semillas antes y después de la cosecha

Sin embargo, todas estas estrategias no hacen que el sistema esté completamente libre de micotoxinas y a veces también suponen una amenaza para las actividades metabólicas en curso. Por tanto, hay una necesidad de contar con estrategias nuevas y seguras.

Almacenamiento de productos básicos a baja temperatura Eliminación periódica y destrucción completa de los productos contaminados Evitar el estrés nutricional Evitar el secado del campo No retrasar la cosecha Tras el secado adecuado, la trilla, el desgrane y el aventamiento del producto después de la cosecha, almacenamiento de forma limpia e higiénica

Medidas de control

En cuanto a Fusarium y Aspergillus, también ha llevado a cabo investigaciones para descubrir genes diana y desarrollar métodos moleculares para mejorar su detección. ¿Ha habido algún desarrollo interesante en este sentido?

Los métodos moleculares para la detección de micotoxinas desempeñan un papel fundamental, ya que las industrias exigen resultados inmediatos/rápidos, lo cual es una petición imposible de satisfacer con los métodos convencionales de los taxonomistas.

La identificación de especies toxigénicas basada en métodos convencionales según sus características morfológicas y de fertilidad cruzada no permite identificar con precisión las diferentes especies.

Detoxificación Además, estas medidas de control se combinan con estrategias que permiten la detoxificación del organismo del animal, incluyendo: Adsorbentes de micotoxinas (carbón activado, HSCAS u otras mezclas de metabolitos vegetales) para la absorción de toxinas en el tracto intestinal Degradación enzimática de micotoxinas

Requiere de conocimientos de taxonomía y fisiología, y además es un proceso laborioso que requiere mucho tiempo.

Los métodos moleculares efectivos para la detección temprana de ciertas micotoxinas son la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus variantes como nPCR, mPCR, Rt-PCR, Microarrays, métodos acoplados a PCR, PCR de nueva generación, AFLP, RFLP, RAPD, LC-MS y muchos más.

Biotransformación de micotoxinas Agentes antioxidantes

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Ventajas de las técnicas de PCR para la detección de hongos y micotoxinas Taxonomía de los hongos

Dado que la detección de las especies de Fusarium y Aspergillus es en sí misma un paso crítico, se ha comprobado que la predicción de los niveles de micotoxinas en las muestras es más grave, por lo que es importante poder hacer una detección precisa y temprana de las especies productoras de micotoxinas con métodos rápidos, sensibles y fiables.

¿Cómo se utilizan estos métodos moleculares?

Hace dos décadas, como herramienta complementaria que permitiera un diagnóstico rápido, sensible y fiable, se desarrolló la PCR para la detección de hongos productores de micotoxinas.

Actualmente se vienen utilizando rutinariamente variantes de la PCR y métodos avanzados basados en la PCR para la detección de micotoxinas y sus especies.

En comparación con los métodos convencionales, el uso de la PCR para la identificación de F. verticillioides es más rápido, preciso y sensible.

Los enfoques basados en la PCR se utilizan ampliamente en la taxonomía de los hongos y, más recientemente, se han utilizado para la detección de patógenos fúngicos en tejidos vegetales y también son útiles en los análisis epidemiológicos.

Lo que es más importante, se pueden utilizar métodos moleculares incluso cuando no se observan síntomas visibles y con bajas concentraciones de esporas fúngicas viables.

Los métodos moleculares también pueden utilizarse para detectar los organismos en las distintas partes de las plantas, lo que resulta difícil con los métodos convencionales.

Detección de hongos micotoxigénicos

Detección de patógenos fúngicos en los tejidos de las plantas Análisis epidemiológico

¿Deben considerarse estos métodos moleculares complementarios a otros análisis utilizados para detectar la presencia de micotoxinas o podrían ser útiles como un método de detección precoz de los hongos antes de que empiecen a producir micotoxinas? ¡Una pregunta muy interesante! Los métodos moleculares, como la PCR, son importantes porque son capaces de detectar hongos incluso si están muertos, lo que es una ventaja.

Se puede aislar el ADN del organismo, ya sea directamente del cultivo o introduciendo el aislado en muestras de cereales o partes de plantas de cereales.

Posteriormente, las muestras pueden someterse a una serie de diferentes procedimientos de PCR. Por último, en comparación con los métodos convencionales, los métodos moleculares desempeñan un papel fundamental en el proceso de detección temprana de las especies productoras de micotoxinas como un método más rápido, preciso y sensible.

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Una de sus actuales líneas de investigación se centra en la tecnología antifúngica de amplio espectro basada en probióticos y aplicada al control de especies de hongos micotoxigénicos, como Fusarium. ¿Podría explicar la base de esta línea de investigación?

Las bacterias probióticas ácido lácticas (BAL) tienen el estatus GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro, del inglés, Generally Recognized As Safe) y tienen una influencia positiva en el tracto gastrointestinal de los humanos y animales de abasto.

Las BAL con potenciales atributos probióticos tienen un efecto beneficioso para el hospedador sobre el que se aplican y un beneficio adicional, como las propiedades antimicóticas y/o la degradación de micotoxinas, es un valor añadido.

Efectos beneficiosos de las BAL probióticas Degradación de micotoxinas

Compuestos bioactivos como alternativa a: Conservantes químicos para alimentos

Propiedades antifúngicas

Influencia positiva en el tracto gastrointestinal

Aditivos para la alimentación Antibióticos

Los compuestos bioactivos producidos por las BAL se desarrollan como una alternativa a los conservantes químicos para alimentos, los aditivos para piensos y los antibióticos de uso común.

Los nuevos metabolitos secundarios bioactivos extraídos y purificados de la especie probiótica Lactobacillus pueden encapsularse y utilizarse comercialmente en sustitución de los aglutinantes químicos de micotoxinas.

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Nuestro grupo de investigación ha examinado numerosos productos alimenticios tradicionalmente fermentados para detectar especies de BAL probióticas de diferentes partes de la India.

Los aislados se han caracterizado en base a sus atributos probióticos y se han identificado mediante PCR y análisis BLAST. Las especies probióticas incluyen: Cepas de Lactobacillus plantarum Cepas de Enterococcus faecium

Lactobacillus brevis,

Los productos se analizan mediante métodos convencionales en condiciones estériles.

Los cultivos probióticos de las colonias visibles y discretas son aislados en el medio de cultivo Man Rogosa Sharpe, y subcultivados y mantenidos en glicerol al 40% para estudios posteriores.

Además, los cultivos probióticos se liofilizan y se almacenan a -20°C para crear una biblioteca.

Enterococcus durans Leuconostoc lactis Enterococcus lactis

¿Cómo se utilizan los probióticos y cuándo se deben aplicar?

Lactobacillus casei Pediococcus Lactobacillus fermentum y muchos más Todos estos aislados han sido testados como importantes agentes antifúngicos in vitro.

Además, las cepas de Lactobacillus plantarum y Enterococcus faecium se han utilizado con éxito en los estudios in vivo en broilers y ratones frente a fumonisinas y aflatoxinas.

Los probióticos ejercen su actividad de dos maneras, ya sea como célula o a través de la biosíntesis de metabolitos secundarios antimicrobianos.

La aplicación de los probióticos depende del producto alimenticio y también de la etapa en la que se requiere la actividad.

En el caso de los cultivos/plantas, los probióticos pueden aplicarse en la etapa previa a la cosecha, recubriendo las semillas con probióticos y luego sembrándolas, o en las etapas posteriores a la cosecha, como durante el almacenamiento.

¿Cómo se obtienen/procesan estos probióticos?

Aplicación de los probióticos en cultivos/plantas Todos los cultivos probióticos almacenados en nuestro laboratorio se han aislado a partir de los productos alimenticios tradicionalmente fermentados, recogidos en su mayoría en el sur de la India.

Semillas recubiertas de probióticos

Adición de probióticos

Siembra Pre-cosecha

Almacenamiento Cosecha

Post-cosecha

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En el caso de la fabricación de piensos, los probióticos pueden mezclarse con los ingredientes y luego peletizarse o pueden utilizarse en forma de polvo. Las células probióticas pueden liofilizarse y administrarse en forma de polvo en diferentes etapas.

Aplicación de los probióticos en la fabricación de piensos Probióticos liofilizados

Adición de probióticos a los ingredientes del pienso y peletización Lo siguiente es con respecto a nuestros estudios. Para los estudios antifúngicos, se utilizaron sobrenadantes y pellets de células recién preparados.

Los sobrenadantes libres de células fueron filtrados usando el disco filtrante Whatman No. 1 seguido de una filtración con jeringa usando filtros de membrana de nylon de 0,45 µm de tamaño de poro.

Los pellets de células fueron lavados 3-4 veces en PBS y luego se llevaron hasta un volumen conocido usando 0,1M de PBS. Para los estudios in vivo, una concentración conocida de sobrenadante libre de células y pellets de células en PBS se administraron oralmente a los animales de experimentación.

¿Cuál es el mecanismo que explica sus propiedades antifúngicas?

Las especies de Lactobacillus son antagonistas biológicos naturales y también actúan como agentes conservantes para evitar el deterioro asociado a los hongos, ayudando a prolongar la vida útil de los alimentos y los piensos.

Los posibles mecanismos implican: Producción de metabolitos antifúngicos como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, compuestos proteínicos, ácidos grasos hidroxílicos y compuestos fenólicos.

La producción de sustancias similares a la bacteriocina y otros péptidos antimicrobianos que han demostrado tener propiedades antifúngicas.

Competencia por los nutrientes y producción de compuestos antagonistas.

Agotamiento de los nutrientes, bajo pH, y producción de metabolitos secundarios de bajo peso molecular estables al calor.

Posible unión de cadenas de ácido tricarbálico de moléculas de fumonisina y peptidoglicanos BAL. ¿Ha obtenido resultados interesantes en esta línea de investigación que podrían aplicarse a nivel comercial/industrial?

Sí, hemos obtenido resultados significativos en relación con las propiedades antifúngicas de las BAL probióticas frente a fumonisinas y a latoxinas, tanto in vitro como in vivo (Deepthi et al. 2016, 2017; Poornachandra rao et al., 2015, 2017; Rakesh et al., 2019).

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Las cepas probióticas, concretamente, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus brevis, Enterococcus durans y Leuconostoc lactis, han mostrado un fuerte potencial antifúngico (tanto sobrenadante sin células, como con células enteras).

Las cepas de Lactobacillus plantarum y Enterococcus faecium han demostrado de manera significativa la mitigación de la toxicidad inducida por la fumonisina y la aflatoxina, el estrés oxidativo y los daños a órganos vitales en pollos y ratones.

Estos hallazgos claramente allanan el camino para emplear las cepas de BAL a nivel comercial en la fabricación de piensos para seguir desarrollando los piensos probióticos funcionales.

¿Ha visto algún efecto notable en la salud de los animales y/o en los parámetros productivos?

Sí, nuestros estudios han mostrado importantes efectos mejorantes asociados a Lactobacillus plantarum MYS6 frente la toxicidad inducida por fumonisinas y el estrés oxidativo en los broilers (Deepthi et al., 2017).

El tratamiento con L. plantarum MYS6 mejoró eficazmente la ingesta de pienso, el peso corporal y la conversión alimentaria en broilers intoxicados con fumonisinas.

La cepa probiótica mitigó la alteración de los parámetros hematológicos como el recuento de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito, recuento de glóbulos blancos y recuento de plaquetas.

Los parámetros séricos, como la SGOT, SGPT, creatinina, colesterol, triglicéridos y albúmina se restablecieron significativamente en los broilers alimentados con una dieta contaminada con fumonisinas.

El probiótico también atenuó los niveles de marcadores de estrés oxidativo (ROS, H2O2, peroxidación de lípidos, contenido de carbonilo proteico) en suero y tejido hepático homogeneizado y documentó su eficacia protectora.

Los datos histopatológicos de los tejidos hepáticos y renales corroboraron aún más la protección general proporcionada por L. plantarum MYS6 frente a la toxicidad celular inducida por fumonisinas y el daño a los órganos en los broilers.

Además, nuestro estudio también demostró que la utilización de probióticos es una estrategia de control de toxinas mejor que los adsorbentes de toxinas disponibles en el mercado.

Nuestros resultados también indicaron que la administración simultánea de un probiótico y el adsorbente de toxinas tenía un mejor efecto de desintoxicación en comparación con la precolonización con probióticos en los pollos de engorde.

En otra línea de investigación, ha explorado las propiedades antimicóticas de los aceites esenciales. ¿Han sido capaces de demostrar las aplicaciones potenciales de cualquiera de estos compuestos en particular?

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Sí, tratamos de hacer aprovechar los aceites esenciales para el control de hongos micotoxigénicos como Aspergillus y Fusarium.

Pudimos controlar el crecimiento de estos hongos utilizando clavo y otros aceites esenciales, pero no pudimos llevarlo al siguiente nivel debido a la falta de financiación. ¿Cuál es su mecanismo de acción y cómo/cuándo se aplicarían?

Hemos tratado de demostrar el posible mecanismo de acción del aceite de clavo sobre el Aspergillus en uno de nuestros estudios.

El análisis SEM y TEM reveló la destrucción de hifas, vesículas, conidios y tubos germinales de los conidios, así como daños irreversibles en la pared celular, la membrana celular y los orgánulos celulares de A. flavus tratado con aceite de clavo.

Como ya he mencionado, no pudimos hacer más estudios.

En su opinión, ¿cuáles son los principales desafíos que afrontaremos en el futuro en relación con los hongos micotoxigénicos y micotoxinas? ¿Están preparados nuestros actuales sistemas agrícolas y ganaderos? ¿Qué cree que debe cambiar?

Es realmente una pregunta muy necesaria en este momento. Los países en desarrollo y subdesarrollados realmente no están preparados para este grave problema.

Nuestros sistemas agrícolas y ganaderos actuales no están preparados por muchas razones, como la falta de instalaciones de almacenamiento, prácticas agrícolas basadas en evidencias científicas, condiciones ambientales, etc.

La contaminación de los productos alimenticios de origen agrícola y piensos con hongos y micotoxinas antes, durante y tras la cosecha tiene un efecto directo en la salud y la productividad de los animales y también en la seguridad alimentaria y la salud pública, especialmente cuando los hongos adquieren resistencia a muchos conservantes químicos de uso habitual.

La utilización eficiente de los productos alimenticios/piensos por los consumidores depende, en gran medida, de la calidad de los productos, es decir, de que estén libres de colonización fúngica y contaminación por micotoxinas. ¿Cuál sería su mensaje principal para nuestros lectores en relación con el control de micotoxinas?

La desintoxicación de las micotoxinas no puede lograrse plenamente, ya que su producción está influenciada por factores ambientales.

Se ha demostrado que la mayoría de las estrategias físicas y químicas seguidas para reducir la contaminación por micotoxinas son bastante ineficaces o difíciles de aplicar en el proceso de producción.

Además, se ha generalizado la resistencia a los tratamientos químicos contra los hongos.

El método de detoxificación más utilizado en la industria avícola/de piensos es el uso de adsorbentes de micotoxinas en los piensos, pero éstos son adsorbentes de aflatoxinas y tienen muy poca afinidad con las fumonisinas u otras micotoxinas. Por lo tanto, es necesario contar con métodos alternativos eficientes para el manejo de las micotoxinas.

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