Muestreo, Diagnóstico, Interpretación y Nuevas

Adriano O. Mallmann Director Téc. de Pegasus Science adriano.mallmann@pegasusscience.com

Denize Tyska Directora de Investigación y Dessarollo de Pegasus Science denize.tyska@pegasusscience.com

Muestreo, Diagnóstico, Interpretación y Nuevas Tendencias en el Análisis de Micotoxinas

Conceptos generales sobre muestreo

La determinación exacta de la concentración a determinación exacta de la concentración de micotoxinas dentro de un lote es bastante difícil de ser realizada en función de la distribución heterogénea de estas en la masa de granos. El muestreo es una etapa muy importante, pues se necesita de una muestra representativa que ofrezca un resultado de análisis confiable. Infelizmente no es posible colectar una muestra con 100% de confiabilidad. Además, se tienen errores inherentes a todo el proceso de cuantificación de micotoxinas, que se divide básicamente en tres etapas: toma de muestras, preparación de muestras y análisis de muestras (Figura 1)

La etapa de muestreo es la que contribuye con el mayor error. De esa forma, deben ser tomados algunos cuidados para la minimización de los errores en esa fase. El muestreo consiste en retirar varias muestras elementales del lote de granos, subproductos o alimento. La suma de las muestras elementales se llama muestra compuesta. Si las muestras elementales son granos enteros, es recomendado moler toda la muestra compuesta con una zaranda de 2 o 3 mm para aumentar el número de partículas y por consiguiente dispersar las micotoxinas de una forma más homogénea. En seguida, la muestra compuesta se homogeneiza y se reduce para for

mar la muestra de laboratorio para ser analizada (Figura 2).

Figura 1 - Errores involucrados en el procedimiento de cuantificación de micotoxinas.

Figura 2 - Muestreo para el análisis de micotoxinas.

empresas. El uso de muestreadores automáticos y otros sistemas mucho más simples, como la colecta de muestras elementales ya trituradas por intermedio de perforaciones efectuadas en las tubulaciones, especialmente los transportadores de tornillo sin fin, facilitan significativamente el procedimiento de muestreo y resultan en muestras altamente representativas (Figura 4). Sin embargo, si no hay la posibilidad de recolectar granos molidos, en el caso de molienda conjunta con otros ingredientes (torta de soya, salvado de trigo, etc.), se puede recoger durante el movimiento de los granos enteros previamente a la molienda.

Figura 4 - Muestreo automático en flujo continuo aplicado en el transporte interno de la materia prima en la fábrica de alimentos.

Básicamente, el muestreo puede ser estático o dinámico:

Muestreo estático: Realizado cuando el lote está "parado". En cargas a granel, puede ser efectuado con caladores graneleros manuales o neumáticos, siguiendo las recomendaciones del reglamento EC 401/2006 (Figura 3).

Figura 3 - Muestreo estático. 1 - Vista lateral: Las flechas (A y B) indican el flujo de los granos molidos o enteros en transportador de tornillo sin fin. Las muestras elementales son colectadas a través del tubo C y almacenadas en el recipiente D (muestra compuesta). 2 – Corte transversal: Las muestras elementales salen por el orificio E (con 8 a 15mm de diámetro para granos molidos, dependiendo del tornillo), lo calizado en un ángulo de 45° a partir de la base del lado derecho de la tubulación externa del transportador, teniendo en consideración el sentido del flujo de la materia prima.

• Si el muestreo se realiza en granos molidos, sólo es necesario reducir el tamaño de la muestra compuesta para 500 a 1000g para enviar para análisis al NIR (y moler a 1 mm para leer en el NIR). • Si el muestreo se realiza en granos enteros, es necesario moler toda la muestra compuesta con zaranda de 2 o 3mm antes de reducir el tamaño para 500 a 1000 g para enviar para análisis al NIR (y moler a 1 mm para leer en el NIR). En el muestreo dinámico (Figura 5) durante el transporte de la materia prima, la cantidad de muestra compuesta debe calcularse siguiendo la fórmula:

Figura 5 - Muestreo dinámico para el análisis de micotoxinas.

Muestreo dinámico: Realizado cuando el lote está siendo transportado de un local para otro. Las colectas de las muestras son realizadas con un sistema automático o manual. El muestro automático es muy práctico y eficiente, por eso su empleo está ampliamente difundido en diversas

*Muestra compuesta: si el muestreo se realiza en granos enteros, es necesario moler toda la muestra compuesta antes de reducir el tamaño para 500 a 1000 g para enviar al NIR (y moler a 1 mm para leer en el NIR).

Nuevas tendencias en el análisis de Micotoxinas Ya son consagrados los conceptos técnicos que envuelven los prejuicios causados por las micotoxinas en las especies animales, especialmente las de valor económico. El correcto moni-

34 POST-COSECHA LATINOAMERICANA toreo de las micotoxinas va más allá del análisis propiamente dicho. El control de las materias primas es realizado a través de la interpretación de los datos analíticos a lo largo del tiempo y de una serie de factores biológicos complejos, que generan el “Riesgo Micotoxinas”. Sin embargo, uno de los factores hasta entonces limitantes en el proceso era la agilidad en la toma de decisiones, lo que solamente es posible con acceso a las herramientas de diagnóstico rápido. Recientemente fue creada la tecnología de diagnóstico de micotoxinas rápida, fácil y de bajo costo, que utiliza la espectroscopia del infrarrojo cercano – NIR (Near-Infrared Spectroscopy).

Utilización de la tecnología NIR para análisis de micotoxinas

La NIR es una herramienta altamente precisa que emite radiación electromagnética. La absorción de energía es resultante de los compuestos orgánicos presentes en la muestra y puede ser empleada para obtener una estimativa directa o indirecta de la concentración de una sustancia. La técnica comprende la integración de una base de datos obtenidos a partir de análisis por metodologías tradicionales (vía húmeda) y de las evaluaciones espectrales. Esas informaciones son sometidas a métodos quimiométricos, resultando en las ecuaciones de predicción.

Las ventajas del uso de la tecnología NIR para el control y monitoreo en relación a otros métodos son la facilidad en la preparación y análisis de la muestra. No son utilizados reactivos, pipetajes, ni extracciones, tan solamente la molienda y la lectura de los espectros en el equipamiento NIR, con agilidad en el retorno del resultado. Eso torna esa tecnología única para la toma de decisiones rápidas. Sin embargo, el éxito en la elaboración de ecuaciones de predicciones se basa toxinas de mayor prevalencia en los principales ingredientes de raciones para animales y alimentación humana (Figura 6). Esas ecuaciones de predicción de micotoxinas por NIR, fueron desarrolladas utilizándose como referencia la técnica de análisis actualmente más sensible para micotoxinas, la Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en Secuencia (LC-MS/MS). Para la interpretación de las informaciones es necesaria una plataforma digital con interface de fácil interpretación, con un sistema de análisis online disponible las 24 horas y con resultados en pocos minutos. El usuario necesita apenas tener en su planta de producción un instrumento NIR y un moledor para la preparación de la muestra. El proceso es extremadamente simple y rápido: consiste en colectar la muestra del lote de granos, molerla, homogenizarla, colocar una alícuota de la muestra en la célula de lectura del espectro por el NIR y cargar el archivo con el espectro en el sistema de interpretación instantáneo (Figura 7). en la precisión de los métodos de referencia, visto que, por la complejidad en la determinación de micotoxinas, la técnica analítica primaria debe obligatoriamente basarse en métodos certificados por la ISO 17.025 (acreditadas por órganos oficiales). Además, es preciso utilizar conjuntos de muestras con concentraciones de micotoxinas que representen la realidad del campo, proceso que necesita de un banco de datos con centenas de muestras seleccionadas por un largo periodo.

Actualmente están disponibles predicciones con el uso de la tecnología NIR para las micoFigura 06 - Micotoxinas en ingredientes analizados por NIR. Figura 07 - Etapas de operación del diagnóstico de micotoxinas por NIR

36 POST-COSECHA LATINOAMERICANA Cómo funciona el muestreo, diagnóstico e la interpretación en la práctica

Para monitorear la materia prima en la recepción:

Se puede calificar proveedores. Recoger muestras por el método de muestreo estático (calador granelero manual o sonda neumática). Recoger dos muestras compuestas de aproximadamente 5 kg cada por camión. La concentración de micotoxinas en la carga es dada por el promedio de las dos muestras (Figura 8).

Figura 08 - Etapas de operación del diagnóstico de micotoxinas por NIR

trenes y silos. El número de muestras analizadas es sustancialmente mayor que en otras metodo logías convencionales, lo que aumenta la seguridad de los resultados y minimiza la dificultad en determinar correctamente la concentración de las micotoxinas que se distribuyen de forma heterogénea en la masa de granos (Figura 9).

Figura 09 - Estadística de contaminación de micotoxinas por silo.

La posibilidad de analizar carga a carga todas las materias primas que llegan a la fábrica de raciones o industria de alimentos permite la segregación por silo y/o destino adecuado conforme a la clasificación en cuanto al riesgo micotoxicológico. Por ser una metodología ultrarrápida, también se aplica en la carga/descarga de buques,

Para monitorear la materia prima utilizada para fabricar alimentos:

Monitoreo del Riesgo Micotoxinas. El Riesgo Micotoxinas es indicado de acuerdo con el historial del monitoreo de cada micotoxina

y con factores como la susceptibilidad de cada especie animal, edad y sexo. Indica, en tiempo real, el nivel de presión micotoxicológica al que los animales han sido y están sometidos. Esta información es primordial para la toma de decisiones, ya que ayuda a determinar el destino adecuado del producto final, así como el uso o no de un aditivo antimicotoxinas específico para una o más micotoxinas.

Un método muy simple y representativo es el muestreo automático en flujo continuo aplicado en el momento del transporte interno de la materia prima en la fábrica de alimentos (Figura 10). Para eso se deben seguir algunas recomendaciones: • Recoger al menos dos muestras compuestas/día (una por la mañana y otra por la tarde); • Recoger una muestra compuesta cada 250 toneladas de maíz que se utilizan; • El volumen (kg) de la suma de las muestras diarias es igual a:

Figura 10 - Muestreo automático en flujo continuo. *Molienda: no es necesario si el muestreo se aplica en granos molidos..

38 POST-COSECHA LATINOAMERICANA Ejemplo 1: Empresa que produce 280 toneladas de ración por día, con un 60% de inclusión de maíz.

Consumo de 168 toneladas de maíz al día. 168t ÷ 250t = menos de 1, pero para hacer el gerenciamiento del riesgo es necesario por lo menos dos muestras compuestas por día.

Recoger al menos 2 muestras compuestas al día. Peso de las 2 muestras (kg) = = = 58 kg. Resumen: Recoger 2 muestras compuestas de maíz por día con 29 kg cada una.

Ejemplo 2: Empresa que produce 1200 toneladas de ración por día, con un 60% de inclusión de maíz. Consumo de 720 toneladas de maíz al día. 720t ÷ 250t = 3 muestras compuestas al día. Peso de las 3 muestras (kg) = = 120 kg. Resumen: Recoger 3 muestras compuestas de maíz por día con 40 kg cada una.

Este procedimiento puede ser adoptado para todas las materias primas que tienen riesgo de contaminación por micotoxinas y que se utilizan en la planta de raciones.

El Riesgo Micotoxinas se calcula en la plata forma Olimpo, que es la plataforma online de la Pegasus Science. Se debe seleccionar la especie animal, sexo y fase de producción e informar el porcentaje de inclusión de cada ingrediente en el respectivo alimento para visualizar los gráficos de riesgo para cada micotoxina.

Para calificar proveedores y acompañar las tendencias de contaminación:

Inmediatamente el sistema presenta los resultados, además de gráficos estadísticos que auxilian en la obtención de informaciones para la toma de decisiones. En los gráficos se visualiza la prevalencia y media de concentración de micotoxinas de las muestras en relación a las muestras que componen los principales bancos involucrados en el proceso (Figura 11).

Figura 11 - Promedio de concentración y positividad de fumonisinas (B1+B2) en muestras del cliente en relación al mercado (general)

La distribución de las micotoxinas en un lote de granos es heterogénea y, por lo tanto, el mues treo para análisis en cereales es más complejo que un muestreo para análisis de proteínas, por ejemplo. Esta característica dificulta la obtención de una muestra representativa, determinando equívocos en la interpretación de los resultados y en el diagnóstico. El correcto muestreo permite verificar la verdadera presencia de micotoxinas en las materias primas.

La tecnología NIR para análisis de micotoxinas presenta innumerables ventajas técnicas, además de posibilitar el gerenciamiento y control de stocks en tiempo real por un costo-beneficio insuperable por cualquier otra tecnología.

La adopción de un programa continuo de monitoreo de las materias primas es imprescindible, pues detectará cuál es el riesgo basado en todos los lotes de granos muestreados, proporcionando subsidios para tomas de decisiones más seguras en relación a las micotoxinas. La presentación del Riesgo Micotoxinas en forma actual pasa a ser, se guramente, el state of art en el complejo sistema de gerenciamiento de micotoxinas.