P R zedmowa do wydania
olskiego
R zedmowa
Rozdział 1. g enomy, t R ansk Ry P tomy i PR oteomy
Łączenie się zasad w pary i asocjacja warstwowa stabilizują podwójną helisę 8 Podwójna helisa jest strukturą elastyczną 9
1.2. RNA i t RAN sk Ryptom 11 RNA jest drugim rodzajem polinukleotydu 11
Rodzaje RNA w komórce 12
Wiele RNA jest syntetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe 13
Różne definicje transkryptomu 15
Cztery hierarchiczne poziomy struktury białka 16
Różnorodność białek wynika z różnorodności aminokwasów 17
Powiązanie transkryptomu z proteomem 19 Kod genetyczny nie jest uniwersalny 20
Powiązanie proteomu z biochemią komórki 21
Sposób działania
Endonukleazy restrykcyjne umożliwiają cięcie cząsteczek DNA w ściśle określonych
Do analizy wyników trawienia restrykcyjnego wykorzystuje się elektroforezę w żelu
ilości produktu
klonowanie jest
Mapy genomowe to nie tylko pomoc przy sekwencjonowniu 51
3.2. mAR ke Ry D o m A powAN i A ge N etycz N ego 51
Pierwszymi stosowanymi markerami były geny 52
RFLP i SSLP są przykładami markerów DNA 53
Polimorfizmy punktowe są najbardziej użytecznymi markerami DNA 55
3.3. p o D stAwy m A powAN i A ge N etycz N ego 57
Podstawy dziedziczenia i odkrycie sprzężenia 57
Częściowe sprzężenie można wyjaśnić zachowaniem chromosomów w czasie mejozy 58
Od częściowego sprzężenia do mapowania genetycznego 61
3.4. pR zep R owAD z AN ie ANA lizy sp R zężeń w R óż Nych typAch o R g AN izmów
Analiza sprzężeń, gdy możliwe są planowane eksperymenty hodowlane 63
Mapowanie genów przez analizę rodowodów u człowieka 64
Mapowanie genetyczne u bakterii 66
Ograniczenia analizy sprzężeń 67
3.5. mA powAN ie fizycz N e p R zez B ezpoś R e DN ie BADAN ie cząsteczek DNA 68
Konwencjonalne mapowanie restrykcyjne można stosować tylko do małych cząsteczek DNA 68
Mapowanie optyczne pozwala na lokalizację miejsc restrykcyjnych w dłuższych
cząsteczkach DNA
Mapowanie optyczne z sondami fluorescencyjnymi 72
Dalsze innowacje poszerzają zakres mapowania optycznego 73
3.6. mA powAN ie fizycz N e p R zez p R zypisywAN ie m AR ke R ów D o f RAgme N tów DNA 74
Każda unikalna sekwencja może być STS 75
Fragmenty DNA do mapowania STS można uzyskać jako hybrydy radiacyjne 76
Jako odczynnika do mapowania można także użyć biblioteki klonów
4.1. m eto Dy sekwe N cjo N owAN i A DNA 81
Sekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha produktów reakcji PCR 82
Sekwencjonowanie w technologii Illumina jest najbardziej powszechną metodą sekwencjonowania krótkich odczytów 85
Opracowano różne metody sekwencjonowania krótkich odczytów 87
Metoda sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym umożliwia otrzymanie odczytów o długości do 200 kb 89
Obecnie najdłuższe odczyty pozwala uzyskać metoda sekwencjonowania w technologii Nanopore 90
4.2. jA k zsekwe N cjo N owAć ge N om 92 Możliwości strategii shotgun udowodniono, sekwencjonując genom Haemophilus influenzae 92 Strategię shotgun wykorzystano do zsekwencjonowania wielu genomów prokariotycznych 94
Sekwencjonowanie genomów eukariotycznych strategią shotgun wymaga zastosowania zaawansowanych programów do składania 94 Od kontigów do rusztowań 96 Czym jest sekwencja genomu i czy zawsze jej potrzebujemy? 99
4.3. s ekwe N cjo N owAN ie ge N omu człowiek A 101
Projekt Poznania Genomu Człowieka – sekwencjonowanie genomu w czasach heroicznych 101
Genom człowieka – sekwencjonowanie genomów współcześnie 103
Genom neandertalczyka: poznanie genomu wymarłego gatunku z wykorzystaniem genomu człowieka jako sekwencji odniesienia
105
Genom człowieka – nowe wyzwania 107 p o D sumowAN ie 108
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A
Rozdział 5. a notacja genomu 113
5.1. lok A lizowAN ie ge N ów w sekwe N cj Ach DNA p R zez
kompute R ową ANA lizę sekwe N cji 113
Obszary kodujące genów są otwartymi ramkami odczytu 113
Proste skanowania ORF są mniej wydajne dla większych DNA eukariotycznych 114
Szukanie genów niekodujących RNA 116
Poszukiwanie homologii i genomika porównawcza nadają śledzeniu sekwencji nowy wymiar 117
5.2. A N otAcj A ge N omu p R zez ANA lizę t RAN sk Ryptów ge N ów 118
Test hybrydyzacyjny pozwala ustalić, czy fragment zawiera sekwencję ulegającą ekspresji 119
Istnieją metody dokładnego mapowania końców transkryptów
Granice ekson–intron można dokładnie zlokalizować
5.3. ANotAcjA pRzez cAłogeNomowe mApowANie
Mikromacierze dachówkowe umożliwiają mapowanie transkryptów na chromosomach lub całych genomach
Sekwencje transkryptów można zmapować bezpośrednio w genomie
Uzyskiwanie sekwencji transkryptu metodami SAGE i CAGE
5.4. pR zeglą DAR ki ge N omów
p o D sumowAN ie
l ite
Rozdział 6. u stalanie funkcji genu 131
6.1. kompute R owA ANA liz A fu N kcji ge N u 131
Homologia odzwierciedla związki ewolucyjne 131
Analiza homologii może dostarczyć informacji o funkcji całego genu lub jego segmentów 132
Identyfikacja domen białkowych może pomóc przypisać funkcję nieznanemu genowi 133
Przypisywanie funkcji genom wymaga jednolitej terminologii 134
6.2. pR zypisywAN ie fu N kcji p R zez i NA ktywAcję i NAD eksp R esję ge N u 135
Analiza funkcjonalna przez inaktywację genu 135
Inaktywacja genów poprzez edycję genomu 136 Geny można inaktywować przez rekombinację homologiczną 137
Inaktywacja genu poprzez znakowanie transpozonem i interferencję RNA 138 Do określania funkcji można także wykorzystać nadekspresję genu
Fenotypowy efekt inaktywacji jest czasem trudny do zaobserwowania
6.3. zR ozumie N ie fu N kcji ge N u p R zez BADAN i A wzo R u eksp R esji i p R o D uktu B i A łkowego
139
140
142 Do wprowadzania określonych zmian w genie i kodowanym przez niego białku można wykorzystać
Inne metody ukierunkowanej mutagenezy
6.4. w yko R zystAN ie ko N we N cjo NA l N ej ANA lizy ge N etycz N ej D o i D e N tyfik Acji fu N kcji ge N u
Identyfikacja ludzkich genów związanych z chorobami dziedzicznymi
Całogenomowe badania asocjacyjne także pozwalają na identyfikację genów związanych z chorobami i innymi cechami 149
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A
Rozdział 7. e uka R iotyczne genomy jąd R owe 153
7.1. g e N omy ją DR owe z NA j D ują się w ch R omosom Ach 153
Chromosomy są zbudowane z DNA i białek
Specyficzne właściwości chromosomów metafazowych
Centromery i telomery zawierają charakterystyczne sekwencje DNA
7.2. c echy ge N etycz N e ge N omów ją DR owych 158 Liczby genów mogą być mylące 158
Geny nie są rozmieszczone równomiernie w obrębie genomu
Odcinek genomu człowieka
Genom drożdży jest bardzo zwarty
Organizacja genów u innych eukariontów
Rodziny genów
Pseudogeny i inne relikty ewolucyjne
7.3. zAwAR tość powtAR z A jącego się
DNA w euk AR iotycz Nych
ge N om Ach ją DR owych
DNA powtórzony tandemowo znajduje się w centromerach i innych miejscach w chromosomach eukariotycznych
Minisatelity i mikrosatelity
Powtórzenia rozproszone
p o D sumowAN ie
pytAN
Rozdział 8. g enomy PR oka R iontów i o R ganelli euka R iotycznych 175
8.1. w ł A ściwości fizycz N e ge N omów p R ok AR iotycz Nych 175
Tradycyjny obraz chromosomu prokariotycznego 175 Niektóre bakterie mają genomy liniowe lub wieloczęściowe 177
8.2. w ł A ściwości ge N etycz N e ge N omów p R ok AR iotycz Nych 180
Organizacja genów w genomie E. coli K12 180 Operony są cechą charakterystyczną genomów prokariotycznych 182
Rozmiary genomów i liczba genów u prokariontów różnią się w zależności od złożoności biologicznej 183
Rozmiary genomów i liczba genów różnią się w obrębie poszczególnych gatunków 185
Rozróżnienie między gatunkami prokariotycznymi rozmywa się jeszcze bardziej za sprawą poziomego transferu genów 186 Metagenomy opisują członków społeczności 188
8.3. e uk AR iotycz N e ge N omy o R g AN ell ARN e 189
Teoria endosymbiozy wyjaśnia pochodzenie genomów organellarnych 189
Fizyczne i genetyczne cechy genomów organellarnych 191
p o D sumowAN
Rozdział 9. g enomy wi R usów i R uchome elementy genetyczne 199
9.1. g e N omy BA kte R iofAgów i wi R usów euk AR iotycz Nych 199
Genomy bakteriofagów mają zróżnicowane struktury i organizację 199 Strategie replikacji genomów bakteriofagowych
Struktury i strategie replikacji eukariotycznych genomów wirusowych 202 Niektóre retrowirusy powodują nowotwory
9.2. Ruchome eleme N ty ge N etycz N e 206 Transpozony RNA z długimi
Niektóre transpozony RNA nie mają LTR
Transpozony DNA występują powszechnie w genomach prokariotycznych 209
Transpozony DNA są mniej powszechne w genomach eukariotycznych
Rozdział 10. d ostę P ność genomu
10.1. w ew N ąt R z ją DRA 215
Jądro ma uporządkowaną strukturę wewnętrzną 216
Chromosomowy DNA wykazuje różne stopnie upakowania 217
Macierz jądrowa jest strukturą dynamiczną 218
Każdy chromosom zajmuje w jądrze swoje własne terytorium 220
Każdy chromosom zawiera grupy domen powiązanych topologicznie 221
Izolatory zapobiegają przekazywaniu informacji pomiędzy segmentami chromosomowego DNA 223
10.2. m o Dyfik Acje N ukleosomów A eksp R esj A ge N omu 225
Acetylacja histonów wpływa na wiele funkcji jądrowych, łącznie z ekspresją genomu 225
Deacetylacja histonów prowadzi do zablokowania aktywnych rejonów genomu 227
Acetylacja nie jest jedynym rodzajem modyfikacji histonów 228
Remodelowanie nukleosomów również wpływa na ekspresję genomu 230
10.3. m o Dyfik Acje DNA A eksp R esj A ge N omu 231
Wyciszanie genomu przez metylację DNA 231
Metylacja wiąże się z piętnowaniem genomowym i inaktywacją chromosomu X 232
11.3. oDD zi A ływAN ie mię D zy DNA A wiążącymi je B i A łk A mi 250
Oddziaływania między DNA a białkami 250
Rozdział 11.
Rola białek wiążących dna w eks PR esji genomu 239
11.1. m eto Dy BADAN i A B i A łek wiążących DNA i ich miejsc wiąz AN i A 239
Krystalografia rentgenowska dostarcza danych dotyczących struktury dla każdego białka, które uda się skrystalizować
Spektroskopia NMR jest wykorzystywana do badania struktury małych białek 241
Badanie spowolnienia migracji w żelu pozwala zidentyfikować fragmenty DNA wiążące białka 242
Testy ochrony przed modyfikacją precyzyjniej określają położenie miejsc wiążących białko 242
Nukleotydy bezpośrednio oddziałujące z białkiem można zidentyfikować, stosując test zakłócania modyfikacji 244
Wyszukiwanie w całym genomie miejsc wiążących białka 245
11.2. s pecyficz N e cechy B i A łek wiążących DNA 246
Domena typu helisa–skręt–helisa występuje w białkach prokariotycznych i eukariotycznych 247 W białkach eukariotycznych często występują palce cynkowe
Inne rodzaje domen wiążących kwasy nukleinowe
248
249
Bezpośredni odczyt informacji zawartej w sekwencji nukleotydów 251 Konformacja helisy wpływa na oddziaływania z białkami
p o D sumowAN ie
251
253 kR ótkie pytAN i A otwAR te 253
pytAN i A p R o B lemowe 254
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A 254
Rozdział 12. tR ansk Ry P tomy
12.1. s kł ADN iki t RAN sk Ryptomu 257 mRNA jest mało liczną, ale za to złożoną częścią transkryptomu
Krótkie niekodujące RNA mają różne funkcje
Długie niekodujące RNA są zagadkowymi transkryptami
12.2. tRAN sk Ryptomik A – czyli k AtA logowAN ie t RAN sk Ryptomów komó R ek i tk AN ek
Do badania zawartości transkryptomów wykorzystuje się analizy na mikromacierzach i sekwencjonowanie RNA
Analiza pojedynczych komórek rozszerza możliwości transkryptomiki
Transkryptomika przestrzenna umożliwia mapowanie transkryptów bezpośrednio w tkankach i komórkach
12.3. s yN tez A skł ADN ików t RAN sk Ryptomu
Polimerazy RNA są maszynami molekularnymi do wytwarzania RNA
257
259
260
262
262
264
267
269
269
Miejsca rozpoczęcia transkrypcji są wskazywane przez sekwencje promotorowe 271
Synteza RNA bakteryjnych jest regulowana przez białka represorowe i aktywatorowe 274
Synteza bakteryjnego RNA jest również regulowana przez kontrolowanie terminacji transkrypcji
Synteza eukariotycznego RNA jest regulowana głównie przez białka aktywatorowe
12.4. w pływ skł ADAN i A RNA
277
279
NA z AwAR tość t RAN sk Ryptomu 281 Szlak wycinania intronów z eukariotycznych pre-mRNA
Proces składania RNA musi mieć wysoki stopień precyzji
282
285
Elementy wzmacniaczy i wyciszaczy determinują szlaki alternatywnego składania RNA 286 Kolisty RNA powstaje w wyniku wstecznego składania RNA 288
12.5. w pływ mo Dyfik Acji chemicz Nych NA skł AD t RAN sk Ryptomu 289
Redagowanie RNA zmienia właściwości kodujące niektórych transkryptów 289
Modyfikacje chemiczne, które nie zmieniają sekwencji mRNA 291
12.6. Deg RADAcj A skł ADN ików t RAN sk Ryptomu 293
Znanych jest kilka procesów nieswoistego rozkładu RNA 293
Wyciszanie RNA zidentyfikowano po raz pierwszy jako sposób niszczenia inwazyjnego wirusowego RNA 294
MikroRNA regulują ekspresję genomu, powodując degradację konkretnych docelowych mRNA 295 p
pytAN i A p R o B lemowe
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A 298
Rozdział 13. P R oteomy 301
13.1. B ADAN ie skł AD u p R oteomu 301
Etap rozdziału białek w analizie profili białkowych 302
Etap identyfikacji białek w analizie profili białkowych 304
Porównywanie składu dwóch proteomów 307
Analityczne mikromacierze białkowe są alternatywną metodą w analizie profili białkowych 308
13.2. iD e N tyfik Acj A B i A łek, któ R e o DD zi A łują ze so B ą 309
Identyfikacja par oddziałujących ze sobą białek 310
Identyfikacja składników kompleksów zbudowanych z wielu białek 312
Identyfikacja interakcji funkcjonalnych 313
Mapy interakcji białko–białko pokazują oddziaływania w proteomie 314
13.3. s yN tez A i D eg RADAcj A skł ADN ików p R oteomu 317
Rybosomy są molekularnymi maszynami do produkcji białek 317
Bakterie w czasie stresu inaktywują rybosomy, by zredukować swój proteom 319 Czynniki inicjacyjne pośredniczą w przebudowie proteomu eukariotycznego na dużą skalę 320
Translacja poszczególnych mRNA może być również regulowana specyficznie 321
Degradacja składników proteomu
13.4. w pływ p R ocesów D oj R zewAN i A
322
B i A łek NA skł AD p R oteomu 323
Sekwencja aminokwasowa białka zawiera instrukcję jego fałdowania 323
Niektóre białka podlegają cięciu proteolitycznemu
326
Istotne zmiany w aktywności białka mogą wynikać z modyfikacji chemicznych 328
13.5. w yjść poz A p R oteom
329
Metabolom jest kompletnym zbiorem metabolitów występujących w komórce 329
Biologia systemów umożliwia opisanie aktywności komórki w sposób zintegrowany
Rozdział 14. eksPResja genomu w kontekście komó R ek i o R ganizmów 337
14.1. oD powie D ź ge N omu
NA syg NA ły zew N ęt R z N e 337
Przesyłanie sygnału przez import zewnątrzkomórkowego związku sygnalizującego 338
Białka receptorowe przenoszą sygnały przez błony komórkowe 339
Niektóre szlaki przekazywania sygnału mają tylko kilka etapów między receptorem a genomem 340
Niektóre szlaki przekazywania sygnału mają wiele etapów między receptorem a genomem 342
Niektóre szlaki przekazywania sygnału działają za pośrednictwem przekaźników wtórnych 343
14.2. z mi ANy w A ktyw N ości ge N omu p R owAD zące D o R óż N icowAN i A komó R kowego 343
Niektóre procesy różnicowania obejmują zmiany w strukturze chromatyny 344
Typy płciowe drożdży są determinowane przez konwersję genu 345
Rearanżacje genomu są odpowiedzialne za różnorodność immunoglobulin i receptorów komórek T 346
14.3. z mi ANy w A ktyw N ości ge N omu leżące u po D stAw R ozwoju 348
Bakteriofag λ: przełącznik genetyczny umożliwia dokonanie wyboru między alternatywnymi szlakami rozwojowymi 349
Sporulacja u Bacillus: koordynacja aktywności dwóch odrębnych typów komórek 350 Caenorhabditis elegans: podstawa genetyczna informacji pozycyjnej i określania losu komórek 353
Muszka owocowa: przekształcenie informacji pozycyjnej w plan segmentacji ciała 355 Udział genów homeotycznych jest uniwersalną cechą rozwoju wyższych eukariontów 357
Geny homeotyczne leżą również u podstaw rozwoju u roślin 359
15.4. t e R mi NAcj A R eplik Acji ge N omu 379
Terminacja replikacji genomu E. coli zachodzi w ściśle określonym obszarze 379 Zakończenie procesu replikacji genomu 382 W niektórych komórkach to telomeraza kończy replikację cząsteczek chromosomowego DNA 383 Wpływ długości telomerów na procesy starzenia komórkowego i nowotworzenia 386 Unikalne rozwiązanie problemu skracania telomerów w komórkach Drosophila 387
15.5. Regul Acj A R eplik Acji ge N omu euk AR iotycz N ego 388
Replikacja genomu wymaga synchronizacji z cyklem komórkowym 388 Warunkiem przejścia punktu kontrolnego G1-S jest udzielenie miejscom inicjacji „licencji na replikację”
389 Nie wszystkie miejsca inicjacji replikacji są wykorzystywane jednocześnie
390 Komórka ma różne opcje na wypadek uszkodzenia genomu
15.1. topologi A R eplik Acji ge N omu 363
Struktura podwójnej helisy utrudnia proces replikacji 364
Doświadczenie Meselsona–Stahla dowiodło semikonserwatywności replikacji 365
Odkrycie topoizomeraz DNA pozwoliło na rozwiązanie problemu topologicznego 367
Wariacje na temat replikacji semikonserwatywnej 369
15.2. fA z A i N icj Acji R eplik Acji ge N omu 371
Inicjacja replikacji DNA w komórkach E. coli 371
Obszary inicjacji replikacji DNA w komórkach drożdży są równie dobrze poznane 372
Identyfikacja miejsc inicjacji replikacji DNA w komórkach wyższych eukariontów okazała się znacznie trudniejsza 373
15.3. z j Awisk A z Acho D zące w o BR ę B ie wi D ełek R eplik Acyj Nych 374
Polimerazy DNA to maszyny molekularne produkujące (i degradujące) DNA 375
Ograniczenia polimeraz DNA utrudniające replikacje genomu 376
Do ukończenia replikacji nici opóźnionej konieczne jest połączenie fragmentów Okazaki 377
16.1. Rekom B i NAcj A homologicz NA 398
Modele rekombinacji homologicznej Hollidaya i Meselsona–Raddinga
Model pęknięć dwuniciowych w rekombinacji homologicznej
RecBCD jest najważniejszym szlakiem rekombinacji homologicznej u bakterii
398
400
401 E. coli może także przeprowadzać rekombinację homologiczną za pomocą alternatywnych szlaków
402 Szlaki rekombinacji homologicznej u eukariontów 403
16.2. Rekom B i NAcj A umiejscowio NA 404 Bakteriofag λ wykorzystuje rekombinację umiejscowioną podczas cyklu lizogennego infekcji
Rekombinacja umiejscowiona jest pomocnym narzędziem w konstruowaniu roślin modyfikowanych genetycznie
404
405
16.3. tRAN spozycj A 406
Transpozycja replikatywna i konserwatywna transpozonów DNA 406
Retroelementy podlegają transpozycji replikatywnej za pośrednictwem kopii RNA 407
p o D sumowAN ie 409
kR ótkie pytAN i A otwAR te 409
pytAN i A p R o B lemowe 410
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A 410
Rozdział 17. m utacje i na PR awa dna 413
17.1. pR zyczyNy mutAcji 413
Błędy w replikacji są źródłem mutacji punktowych 414
Błędy w replikacji mogą też doprowadzić do mutacji typu insercji i delecji 415
Mutacje są również wywoływane przez mutageny chemiczne i fizyczne 418
17.2. N A p RAwA mutAcji i i NNych typów uszko D zeń DNA 422
Systemy naprawy bezpośredniej wypełniają pęknięcia i korygują niektóre rodzaje modyfikacji nukleotydów 422
Wycinanie zasad naprawia wiele rodzajów uszkodzonych nukleotydów 423
Naprawa przez wycinanie nukleotydów koryguje bardziej rozległe uszkodzenia 425 Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów poprawia błędy replikacji 426
Pęknięcia jedno- i dwuniciowe mogą być naprawiane 428
Niektóre uszkodzenia DNA mogą być naprawiane przez rekombinację homologiczną 429
Uszkodzenia DNA mogą być pomijane podczas replikacji genomu 430
Defekty w naprawie DNA stanowią podłoże chorób człowieka, w tym nowotworów 431 p o
Rozdział 18. dR ogi ewolucji genomów
18.1. g e N omy: pie R wszych
10 mili ARD ów l At 435
Pierwsze systemy biochemiczne opierały się na RNA 435
Pierwsze genomy zbudowane z DNA 437 W jakim stopniu życie jest niepowtarzalne? 438
18.2. e wolucj A co RA z BARD ziej złożo Nych ge N omów 440
Sekwencje genomów kryją wiele śladów
dawnych duplikacji genów 440
Duplikacja genu może zajść na skutek wielu
różnych procesów 443
Możliwa jest też duplikacja całego genomu 444 W różnych genomach, w tym w genomie człowieka, można odnaleźć też ślady mniejszych duplikacji 446
Prokarionty i eukarionty mogą nabywać geny od innych gatunków 448 W ewolucji genomu następują również rearanżacje sekwencji istniejących genów 449
Konkurencyjne hipotezy wyjaśniają pochodzenie intronów 452 Ewolucja epigenomu 453
18.3. g e N omy: ostAt N ich 6 milio N ów l At 454
Genomy człowieka i szympansa są bardzo do siebie podobne 454
Paleogenomika pomaga zrozumieć niedawną ewolucję genomu człowieka 457
18.4. g e N omy D ziś: z R óż N icowAN ie popul Acji 458
Pochodzenie HIV i AIDS 458 Pierwsze migracje ludzi z Afryki 460 Różnorodność genomów ułatwia uprawę roślin 462 p o D sumowAN ie
kR ótkie pytAN i A otwAR te 464 pytAN i A p R o B lemowe
l ite RAtu RA uzupeł N i A jąc A
i ndeks
brakujące wiązanie fosfodiestrowe
synteza brakującego wiązania przez ligazę DNA
(B) Łączenie in vitro
dwa wiązania syntetyzowane przez ligazę DNA
(C) Łączenie lepkich końców jest bardziej wydajne
Ligazę o najszerszym zastosowaniu otrzymuje się z komórek E. coli infekowanych bakteriofagiem T4. Enzym ten bierze udział w replikacji fagowego DNA i jest kodowany przez genom T4. Jego naturalną rolą jest synteza wiązań fosfodiestrowych między niepołączonymi nukleotydami obecnymi w jednym polinukleotydzie cząsteczki dwuniciowej (rys. 2.15A). Aby połączyć dwa fragmenty restrykcyjne, ligaza musi zsyntetyzować dwa wiązania fosfodiestrowe, po jednym na każdej nici (rys. 2.15B). Nie jest to oczywiście poza zasięgiem możliwości enzymu, ale reakcja może zajść wyłącznie wówczas, gdy końce, które mają zostać połączone, przypadkiem znajdą się wystarczająco blisko siebie; ligaza nie ma zdolności trzymania ich i przybliżenia ich do siebie. Jeśli dwie cząsteczki mają komplementarne lepkie końce i te końce zbliżą się dzięki losowej dyfuzji w mieszaninie ligacyjnej, mogą utworzyć się przejściowo pary zasad między dwoma lepkimi końcami. Takie pary zasad nie są szczególnie stabilne, ale mogą przetrwać przez czas wystarczający, aby ligaza przyłączyła się do przerwy i zsyntetyzowała wiązania fosfodiestrowe łączące ze sobą końce (rys. 2.15C). Jeśli cząsteczki mają tępe końce, nie mogą tworzyć ze sobą par zasad nawet przejściowo i ligacja jest procesem znacznie mniej wydajnym, nawet gdy stężenie DNA jest duże i pary końców są stosunkowo blisko siebie.
Większa wydajność ligacji lepkich końców stymulowała rozwój metod zamieniających tępe końce w lepkie. W jednej z metod do tępych końców przyłącza się krótkie dwuniciowe cząsteczki zwane łącznikami lub adaptorami. Łącznik i adaptor działają w nieco różny sposób, ale oba zawierają sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną i dlatego dają lepkie końce po traktowaniu odpowiednim enzymem (rys. 2.16). Innym sposobem stworzenia lepkiego końca jest dodawanie ogonów homopolimerowych polegające na dodawaniu nukleotydów jeden po drugim do tępego końca 3’ (rys. 2.17). Enzym biorący udział w tym procesie nazywa się terminalną transferazą deoksyrybonukleotydową i zapoznamy się z nim w następnej sekcji. Jeśli mieszanina reakcyjna
cząsteczka DNA o tępych końcach
nietrwałe parowanie zasad między lepkimi końcami
dwa wiązania syntetyzowane przez ligazę DNA
Rys. 2.15. Łączenie cząsteczek DNA przez ligazę DNA (ligacja).
BamHI
łączniki
3‘ GGATCC CCTAGG CCTAG G
5‘ 3‘ 3‘
sekwencja rozpoznawana przez BamHI
łączniki przyczepione na końcach cząsteczki DNA lepki koniec BamHI
(A) W żywych komórkach ligaza DNA syntetyzuje brakujące wiązanie fosfodiestrowe na jednej nici dwuniciowego DNA. (B) By połączyć dwie cząsteczki DNA in vitro, ligaza DNA musi utworzyć dwa wiązania fosfodiestrowe – na obu niciach. (C) Ligacja in vitro jest wydajniejsza, jeśli cząsteczki mają komplementarne lepkie końce, bo nietrwałe tworzenie par między tymi końcami utrzymuje cząsteczki razem, ułatwiając przyczepienie się ligazy i syntezę nowych wiązań fosfodiestrowych Rys. 2.16. Łączniki stosuje się do tworzenia lepkich końców na tępo zakończonej cząsteczce. W tym przykładzie każdy łącznik zawiera sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną BamHI. Ligaza DNA przyczepia łączniki na końcach tępo zakończonej cząsteczki w reakcji zachodzącej dość wydajnie, bo łączniki są obecne w dużym stężeniu. Następnie dodaje się enzym restrykcyjny, aby przeciąć łączniki, dając lepkie końce. Zauważ, że ligaza łączy łączniki ze sobą tak, że ich seria (konkatamer) jest przyłączana na każdym końcu tępo zakończonej cząsteczki. Dodany enzym restrykcyjny tnie konkatamery łączników na segmenty, a połówki najbardziej wewnętrznych pozostają związane z cząsteczką DNA. Adaptory są podobne do łączników, ale każdy ma jeden koniec tępy i jeden lepki. Tępo zakończony DNA dostaje lepki koniec przez ligację z adaptorami: nie trzeba przeprowadzać trawienia enzymem restrykcyjnym
2.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) 35
zawiera DNA i tylko jeden z czterech nukleotydów, to nowy tworzony ciąg jednoniciowego DNA składa się w całości z tego jednego nukleotydu. Może to być na przykład ogon poli(G), który umożliwi cząsteczce tworzenie par z inną cząsteczką zawierającą ogon poli(C), stworzony w ten sam sposób, ale z dCTP (a nie dGTP) w mieszaninie reakcyjnej.
Enzymy modyfikujące końce
Terminalna transferaza deoksyrybonukleotydowa (rys. 2.17), otrzymywana z grasic cielęcych, jest przykładem enzymów modyfikujących końce. W rzeczywistości jest to polimeraza DNA niezależna od matrycy, ponieważ ma zdolność wydłużania polinukleotydu DNA bez tworzenia par zasad przez nukleotydy włączane do istniejącej nici DNA lub RNA. Jej główną rolą w technologii rekombinacji DNA jest, jak napisano wyżej, dodawanie ogonów homopolimerowych. Często stosowane są również dwa kolejne enzymy modyfikujące końce – fosfataza alkaliczna i kinaza polinukleotydowa T4, których działanie się uzupełnia. Fosfataza alkaliczna, otrzymywana z wielu źródeł, na przykład z E. coli, tkanek jelita cielęcego oraz z krewetki północnej, usuwa grupy fosforanowe z końca 5’ cząsteczek DNA, co zapobiega ligacji tych cząsteczek ze sobą. Dwa końce zawierające na końcu 5’ fosforany mogą zostać ze sobą połączone, a koniec pozbawiony reszty fosforanowej może zostać połączony przez ligazę z końcem posiadającym resztę fosforanową, ale nie może zostać stworzone połączenie między parą końców, z których żaden nie zawiera fosforanu na końcu 5’ . Rozsądnie stosując alkaliczną fosfatazę, można zatem kierować działaniem ligazy DNA w zaplanowany sposób, tak że otrzymuje się tylko żądane produkty ligacji. Kinaza polinukleotydowa T4, otrzymywana z komórek E. coli infekowanych bakteriofagiem T4, przeprowadza reakcję odwrotną do fosfatazy alkalicznej, dodając fosforan na końcach 5’ . Tak jak fosfatazę alkaliczną, enzym ten wykorzystuje się w czasie skomplikowanych eksperymentów ligacyjnych, ale jego głównym zastosowaniem jest znakowanie końców cząsteczek DNA.
2.2. REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY (PCR)
Chociaż metody dające podobne efekty proponowano już w roku 1971, wynalezienie techniki PCR jest obecnie przypisywanie Kary’emu Mullisowi, który opisuje swój przebłysk pewnego wieczora na początku roku 1983, gdy jechał wzdłuż wybrzeża Pacyfiku w Kalifornii drogą stanową numer 128 z Berkeley do Mendocino. W natchnieniu wymyślił prostą technikę pozwalającą na kopiowanie wybranego fragmentu dłuższej cząsteczki DNA. Technika jest tak prosta, że czasem studentom stykającym się z nią po raz pierwszy trudno pojąć, dlaczego jest aż tak ważna we współczesnej biologii. Najpierw przyjrzymy się samej technice, a potem zagłębimy się w jej liczne zastosowania.
Przeprowadzanie PCR
PCR prowadzi do wielokrotnego kopiowania wybranego obszaru cząsteczki DNA, czyli do jego amplifikacji (powielania, dosł. wzmocnienia) (rys. 2.2). Reakcja przeprowadzana jest przez oczyszczoną termostabilną polimerazę DNA z T. aquaticus (sekcja 2.1). Dlaczego potrzebny jest termostabilny enzym, stanie się jasne, gdy dokładniej przyjrzymy się zdarzeniom zachodzącym w trakcie PCR. Aby przeprowadzić PCR, matrycowy DNA miesza się z polimerazą Taq, parą starterów oligonukleotydowych i dużym nadmiarem nukleotydów. Ilość matrycowego DNA może być bardzo mała, ponieważ PCR jest niezmiernie czułą reakcją i będzie działać nawet z pojedynczą cząsteczką początkową. Startery są potrzebne do rozpoczęcia reakcji syntezy DNA, którą będzie przeprowadzać polimeraza Taq (rys. 2.6). Muszą przyczepić się do matrycowego DNA na obu końcach segmentu, który ma zostać skopiowany: sekwencje tych miejsc przyłączenia się muszą zatem być znane, aby można było zsyntetyzować startery o odpowiednich sekwencjach.
Reakcję rozpoczyna się przez podgrzanie mieszaniny do 94 °C. W tej temperaturze wiązania wodorowe utrzymujące ze sobą dwa polinukleotydy podwójnej
cząsteczka DNA o tępych końcach
terminalna transferaza deoksynukleotydów + dGTP
ogon poli(G)
Rys. 2.17. Dodawanie ogonów homopolimerowych. W tym przykładzie ogon poli(G) jest syntetyzowany na każdym końcu tępo zakończonej cząsteczki DNA. Ogony składające się z innych nukleotydów są syntetyzowane przez włączanie odpowiedniego dNTP do mieszaniny reakcyjnej
region do amplifikacji matrycowy DNA
startery denaturacja 94 °C schłodzenie 50–60 °C „długie” produkty
Rys. 2.18. Pierwszy etap reakcji PCR
chromosom – znajduje się w nukleoidzie, niesie niezbędne geny
chromid – wykorzystuje plazmidowy system rozdziału, niesie niezbędne geny
plazmid – wykorzystuje plazmidowy system rozdziału, niesie geny nieistotne
Rys. 8.7. Różnice między prokariotycznymi chromosomami, chromidami i plazmidami
Komplikacje związane z bakteriami, takimi jak Vibrio i Deinococcus, skłoniły genetyków zajmujących się drobnoustrojami do wprowadzenia nowego terminu – chromid – dla opisania plazmidu, który niesie istotne geny. Oznacza to, że obecnie rozróżniamy trzy, a nie tylko dwa rodzaje cząsteczek DNA, które mogą znajdować się w bakterii (rys. 8.7): jeden lub więcej chromosomów bakteryjnych, niosących geny niezbędne i znajdujących się w nukleoidach, plazmidy właściwe, które różnią się od chromosomu bakteryjnego specjalnym systemem rozdziału plazmidów i których geny nie są niezbędne dla bakterii, chromidy, które wykorzystują plazmidowy system rozdziału, ale przenoszą geny niezbędne do przeżycia bakterii.
Zgodnie z tą nomenklaturą Vibrio cholerae ma jeden chromosom i jeden chromid, a Deinococcus radiodurans ma dwa chromosomy i dwa chromidy.
8.2. WŁ AŚCIWOŚCI GENETYCZNE GENOMÓW
PROKARIOTYCZNYCH
Identyfikacja genów w genomach poprzez analizę sekwencji jest dużo łatwiejsza u prokariontów niż u eukariontów (sekcja 5.1) i dla większości genomów prokariotycznych, które zostały już zsekwencjonowane, mamy dość dokładnie oszacowaną liczbę genów i obszerną listę funkcji genów. Wyniki tych badań są zaskakujące i zmusiły mikrobiologów do rewizji znaczenia „gatunku” w odniesieniu do prokariontów. Będziemy analizować te zagadnienia ewolucyjne dalej w tym rozdziale. Najpierw jednak musimy przyjrzeć się sposobowi organizacji genów w genomie prokariotycznym.
Organizacja genów w genomie E. coli K12 Wiemy już, że genomy bakteryjne mają zwartą organizację genetyczną z bardzo małymi odstępami między genami, było to ważną częścią naszej dyskusji dotyczącej mocnych i słabych stron poszukiwania otwartych ramek odczytu (ORF) jako sposobów identyfikowania genów w sekwencji genomowej (rys. 5.3). Aby jeszcze raz zwrócić na to uwagę, na rys. 8.8 pokazano kolistą mapę całego genomu E. coli K12. DNA międzygenowy stanowi tu zaledwie 11 % całości i jest rozrzucony po całym genomie w małych odcinkach, których nie widać na mapie genomu w tej skali. Pod tym względem E. coli jest typowa dla wszystkich prokariontów, których genomy dotychczas zsekwencjonowano – w genomach prokariotycznych jest bardzo mało niewykorzystanej przestrzeni. Istnieje teoria, że taka zwarta organizacja jest korzystna dla prokariontów, umożliwiając na przykład genomowi stosunkowo szybką replikację, ale hipotezy tej nigdy nie poparto rzetelnymi danymi doświadczalnymi.
Przyjrzyjmy się bliżej genomowi E. coli K12. Typowy 50-kb odcinek pokazano na rys. 8.9. Kiedy porównuje się ten odcinek z typowym fragmentem genomu człowieka ( rys. 7.12 ), widać wyraźnie, że u E. coli na tym odcinku znajduje się więcej genów i mniej przestrzeni międzygenowych – 43 geny zajmują aż 85,9 % tego odcinka. Pomiędzy niektórymi genami prawie nie ma odstępu: na przykład thrA i thrB są oddzielone pojedynczym nukleotydem, a thrC zaczyna się od nukleotydu następującego bezpośrednio po ostatnim nukleotydzie thrB. Ogólnie, geny prokariotyczne są krótsze niż ich odpowiedniki eukariotyczne –średnia długość genu bakteryjnego stanowi ok. ⅔ genu eukariotycznego, nawet po usunięciu z tego ostatniego intronów. Geny bakterii wydają się nieco dłuższe niż geny archeonów.
Na rys. 8.9 można zaobserwować dwie inne cechy genomów prokariotycznych. Pierwszą z nich jest mała częstość występowania sekwencji powtarzających się. Większość genomów prokariotycznych nie ma żadnego odpowiednika rodzin powtarzających się sekwencji rozproszonych w genomie, obecnych w genomach eukariotycznych w dużej liczbie kopii. Zawierają jednakże pewne sekwencje, które
początek replikacji
mogą być powtórzone w innych miejscach genomu. Przykładami są sekwencje insercyjne IS1 i IS186, które można dostrzec w 50-kb odcinku przedstawionym na rys. 8.9. Są to przykłady elementów ulegających transpozycji – sekwencji, które mają zdolność do przemieszczania się w genomie i w przypadku elementów insercyjnych przenoszenia się z jednego organizmu do drugiego – czasem nawet dwóch odrębnych gatunków. Pozycje elementów IS1 i IS186, pokazane na rys. 8.9, dotyczą jednego konkretnego izolatu E. coli, z którego otrzymano tę sekwencję; gdybyśmy badali inny izolat, sekwencje IS mogłyby znajdować się w innych pozycjach genomu albo w ogóle być nieobecne. W genomach prokariotycznych znanych jest kilka rodzin elementów podlegających transpozycji, a my przeanalizujemy ich strukturę, gdy będziemy badać mobilne elementy genetyczne bardziej szczegółowo w sekcji 9.2. Wiele genomów prokariotycznych zawiera również co najmniej kilka sekwencji powtórzeń niepodlegających transpozycji, przynależących do różnych klas. Dwie najważniejsze klasy przedstawiono poniżej.
1. Powtarzające się pozagenowe sekwencje palindromowe (sekwencje REP, ang. repetitive extragenic palindromic), z których większość ma długość 20–50 bp i występuje pojedynczo lub w zgrupowaniach. Jeśli poniżej genu jest zlokalizowana jedna lub więcej sekwencji REP, mogą być one transkrybowane jako przedłużenie mRNA zwijające się w złożone struktury łodyżki-pętli i odgrywać rolę w regulacji genów. W genomie E. coli K12 jest ok. 600 sekwencji REP, w innych bakteriach zaś, takich jak Pseudomonas, kilka tysięcy.
2. Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromowe (CRISPR, ang. clustered regularly interspaced short palindromic
Rys. 8.8. Genom Escherichia coli K12. Mapa jest pokazana tak, że początek replikacji znajduje się na górze. Geny po zewnętrznej stronie koła ulegają transkrypcji w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, a położone wewnątrz – w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (dzięki uprzejmości dr Federicka Blattnera, University of Wisconsin-Madison)
HIV-1O
18. Drogi ewolucji genomów
koczkodan tumbili
koczkodan czarnosiwy ZR59
mangaba rudoczelna
HIV-1M szympans mandryl
HIV-2
Rys. 18.33. Drzewo filogenetyczne skonstruowane na podstawie sekwencji genomów SIV i HIV. Za epidemię HIV/AIDS jest odpowiedzialny typ HIV-1M wirusa niedoboru odporności. Znacznie rzadszy typ HIV-1N (nieprzedstawiony na drzewie) jest blisko spokrewniony z HIV-1M i prawdopodobnie również przeniósł się od szympansów. Zarówno odpowiadający za 2 % przypadków w Kamerunie HIV-1O, jak i wyizolowany tylko od jednej osoby HIV-1P (nieprzedstawiony), są spokrewnione z SIV goryla, nie wiadomo jednak, czy przeniosły się od goryli do ludzi, czy może goryle i ludzie zarazili się nimi od szympansów
Pierwsze migracje ludzi z Afryki
Kolejny przykład ilustrujący wykorzystanie wewnątrzgatunkowego zróżnicowania genomu w badaniach naukowych dotyczy prehistorycznych migracji, które doprowadziły do ekspansji Homo sapiens z naszej ewolucyjnej ojczyzny w Afryce do współczesnego rozmieszczenia na całej Ziemi. W paleoantropologii nasz gatunek nazywa się człowiekiem współczesnym (AMH, ang. anatomically modern humans), pomijając dyskusje dotyczące szczegółów naszych relacji z wymarłymi przodkami. Pośrednie skamieniałości wykazujące zarówno cechy współczesne, jak i pierwotne, pochodzące sprzed 315 000 lat odnaleziono w Dżabal Ighud w Maroko, a sprzed 259 000 lat w Florisbad w RPA. Inne wczesne skamieniałości człowieka współczesnego sprzed 160 000 lat odnaleziono w Etiopii w Herto, sprzed 120 000 lat w Laetoli w Tanzanii, a sprzed 110 000 lat w Border Cave w RPA. Po powstaniu człowieka współczesnego w Afryce nasz gatunek rozpoczął migracje, które doprowadziły go do zasiedlenia Azji, Europy, obu Ameryk, Australazji i Oceanii.
Początkowo do śledzenia wczesnych migracji człowieka z Afryki za pomocą danych genomowych wykorzystywano mitochondrialny DNA. U ssaków, w tym u człowieka, zegar molekularny DNA mitochondrialnego jest szybszy od zegara DNA jądrowego. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że w mitochondriach brak części systemów naprawy DNA działających dla genów jądrowych, co umożliwia utrwalenie większej części zachodzących mutacji, które prowadzą do podstawień, czyli trwałych zmian w sekwencji nukleotydowej. Oznacza to, że w populacji człowieka występują różne sekwencje mitochondrialnego DNA, które na podstawie wspólnych podstawień można podzielić na różne haplogrupy. Każdą haplogrupę można podzielić na haplotypy, które mają podstawienia charakterystyczne dla haplogrupy oraz warianty prywatne, odróżniające je od innych haplotypów (rys. 18.35). To, kiedy powstała dana haplogrupa, można oszacować na podstawie czasu koalescencji. Im większe jest zróżnicowanie haplotypów, tym więcej zaszło podstawień, a zatem tym dłuższy jest czas koalescencji.
Analiza DNA mitochondrialnego sugeruje, że pierwsi migranci z Afryki wyruszyli z Etiopii, na południe od dzisiejszego Suezu, który łączy Afrykę z Azją. Do sformułowania tej hipotezy doprowadziły następujące przesłanki: wszystkie haplogrupy występujące we współczesnych populacjach człowieka można połączyć w sieć filogenetyczną obrazującą pokrewieństwo ich sekwencji;
wszystkie haplogrupy występujące powszechnie w dzisiejszej Afryce skupiają się w tej sieci razem, a z pozostałymi łączą je tylko dwie gałęzie, wiążące haplogrupę L3 po stronie Afryki z haplogrupami M i N po stronie przeciwnej (rys. 18.36).
Rys. 18.34. Położenie geograficzne miejsc, w których odkryto szczątki wczesnego Homo sapiens w Afryce
Analizy koalescencji sugerują, że haplogrupy M i N powstały 60 000–70 000 lat temu. Wśród współczesnych mieszkańców Afryki największe podobieństwo DNA mitochondrialnego haplogrupy L3 do haplogrup M i N występuje u tych, którzy zamieszkują okolice dzisiejszej Etiopii, uważamy zatem, że to stamtąd rozpoczęły się migracje. Najbardziej bezpośrednia droga z Etiopii do Azji prowadzi przez cieśninę Bab al-Mandab, przy wejściu w Morze Czerwone, do południowej części Półwyspu Arabskiego (rys. 18.37). Na tej podstawie wnioskujemy, że
Wspólne podstawienia – charakterystyczne dla haplogrupy
Rys. 18.35. Haplogrupy i haplotypy. Każda haplogrupa charakteryzuje się zestawem podstawień nukleotydowych, które odróżniają ją od innych haplogrup. Haplotypy mają dodatkowe prywatne podstawienia
haplogrupa
prywatne podstawienia – definiują każdy haplotyp haplotypy
18.4. Genomy dziś: zróżnicowanie
początkowa migracja z Afryki odbyła się drogą prowadzącą z Etiopii na południe Półwyspu Arabskiego ok. 60 000–70 000 lat temu.
Taki obraz pierwszych migracji człowieka z Afryki wyłania się z badań DNA mitochondrialnego, na ile jednak odzwierciedla on prawdę o naszej przeszłości?
Genom mitochondrialny stanowi tylko niewielką część DNA człowieka, a jego ewolucja przebiega nietypowo, gdyż dziedziczony jest wyłącznie w linii matczynej i nie rekombinuje z DNA ojcowskim podczas rozmnażania. Hipotezy oparte na badaniach DNA mitochondrialnego krytykowano za to, że niekoniecznie mogą odzwierciedlać prawdziwą historię ewolucyjną gatunku lub populacji. Czy badania całego genomu człowieka potwierdzają, czy zaprzeczają modelowi opartemu na analizach DNA mitochondrialnego? Ta dziedzina nauki rozwija się obecnie bardzo dynamicznie dzięki gromadzeniu coraz większej liczby sekwencji genomów osób zamieszkujących różne strony świata i opracowywaniu coraz bardziej wyrafinowanych metod ich analizy. Różne projekty niekiedy dają sprzeczne wyniki, czego nie da się uniknąć, gdy zbiory danych i metody analizy nie osiągnęły jeszcze dojrzałości. Powszechnie przyjmuje się jednak, że wnioski wynikające z badań nad mitochondrialnym DNA są zasadniczo prawidłowe. Model migracji ok. 70 000 lat temu wspierany jest także przez badania wykorzystujące sekwencje chromosomu Y, a także zmienność powtórzeń mikrosatelitarnych i SNP w całym genomie. Przykładowo, w jednym z projektów porównano ponad 4 miliony SNP w genomach mieszkańców Australii, Afryki, Europy i Azji Wschodniej. Dane pochodzące z sekwencjonowania genomów innych naczelnych pomogły zidentyfikować allele pierwotne i allele wtórne dla każdego SNP. Oparto się na tym, że allel znajdowany w odpowiedniej pozycji w genomach innych niż człowiek przedstawicieli naczelnych musi być allelem pierwotnym. Dla każdego SNP obliczono częstość allelu wtórnego, a zebrane dla wszystkich SNP dane porównano w różnych populacjach, uwzględniając też sekwencje genomów neandertalczyków i denisowian. Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że ludzie mieszkający poza Afryką pochodzą od jednej populacji, która opuściła Afrykę ok. 72 000 lat temu. Linie Aborygenów australijskich i mieszkańców Eurazji rozdzieliły się następnie ok. 59 000 lat temu, a Europejczycy oddzielili się od mieszkańców Azji Wschodniej 42 000 lat temu (rys. 18.38).
Badania genomiki człowieka dostarczają kolejnych dowodów na to, że fala migracji z Afryki miała miejsce ok. 70 000 lat temu. Nie ma jednak pewności co do tego, czy migracja odbyła się poprzez cieśninę Bab al-Mandeb, jak sugerują to badania DNA mitochondrialnego, czy połączeniem lądowym w rejonie dzisiejszego Suezu, czy też może równocześnie obiema tymi drogami. Liczne przesłanki archeologiczne sugerują jednak, że albo czas migracji został błędnie ustalony w analizach genomowych, albo doszło do wcześniejszej migracji, która nie pozostawiła śladów w zbadanych genomach. Wskazują na to między innymi szczątki człowieka współczesnego odnalezione w jaskiniach Qafzeh i Skhul w pobliżu Nazaretu, na terenach współczesnego Izraela, których wiek oszacowano na 90 000–100 000 lat. Później te same jaskinie zajęli neandertalczycy, a człowiek współczesny z nich na jakiś czas zniknął. Ludzie z Qafzeh i Skhul mogli zatem zdaniem niektórych badaczy być częścią nieudanej próby migracji albo stanowili najdalej wysuniętą część populacji afrykańskiej, która w czasie ocieplenia dotarła do Azji. Można w ten sposób wyjaśniać znaleziska z Qafzeh i Skhul, pojawia się jednak coraz więcej dowodów na obecność człowieka współczesnego w Azji Wschodniej w tym samym czasie. Skamieniałości człowieka współczesnego z tego obszaru liczą ponad 70 000 lat, a najstarsze sięgają ponad 100 000 lat. Do najciekawszych znalezisk należą kamienne narzędzia o cechach typowych dla wytworów człowieka współczesnego odnalezione w dolinie rzeki Jurreru na południu Indii. Pokryte są warstwą popiołu pochodzącego z erupcji wulkanu Toba na północy Sumatry, której datę z dużą pewnością ustalono na 74 000 lat temu. Oznacza to, że człowiek współczesny musiał wtedy zajmować znaczny obszar południowej i wschodniej Azji, a znaleziska archeologiczne sugerują znaczną migrację z Afryki ok. 100 000 lat temu. Metody stosowane do analizy danych genomowych są zatem weryfikowane i testuje się nowe bardziej wyrafinowane techniki obliczania czasu, który upłynął od rozejścia się populacji.
Afryka
L3
Wszystkie pozostałe haplogrupy afrykańskie
M N
Wszystkie pozostałe haplogrupy nieafrykańskie Poza Afryką
Haplogrupa afrykańska Haplogrupa nieafrykańska
Rys. 18.36. Badania DNA mitochondrialnego ujawniają pierwszą migrację człowieka z Afryki. Pomiędzy afrykańską i nieafrykańską częścią sieci haplogrup DNA mitochondrialnego człowieka są tylko dwa połączenia: pomiędzy haplogrupą L3 po stronie Afryki, a M i N po stronie nieafrykańskiej
Rys. 18.37. Droga z Etiopii na południe Półwyspu Arabskiego przez cieśninę Bab al-Mandeb. Badanie haplotypów DNA mitochondrialnego współczesnych mieszkańców Afryki i Azji sugeruje, że była to trasa pierwszej migracji Homo sapiens z Afryki