Tecnologías reproductivas para la conservación y mejora de la perdiz roja

1Departamento de Reproducción Animal. INIA-CSIC. Madrid.

2Dpto. Mejora Genética Animal, INIA-CSIC, Madrid.

3Animal Breeding and Genomics, Wageningen University & Research (Países Bajos).

La perdiz roja común (Alectoris rufa) es una especie endémica de países mediterráneos. Su uso como recurso cinegético representa unas de las actividades más rentables de España. Su demanda para la caza unido a una disminución de sus poblaciones naturales ha determinado el establecimiento de su producción en granjas. Sin embrago, la intensificación ha originado, en muchos casos, una alteración de parámetros biológicos, como la disminución a la respuesta de huida y el comportamiento antipredatorio. Las tecnologías reproductivas en perdices incluyen, principalmente, la criopreservación de semen y la inseminación artificial. Los bancos de germoplasma representan un elemento clave en la conservación en pureza de la perdiz roja autóctona. Por otro lado, la inseminación artificial puede tener un papel relevante como instrumento de mejora de los caracteres de interés en la práctica cinegética (instinto anti-predatorio o el comportamiento de cloquez) para la repoblación de cotos de caza.

Palabras clave: bancos de germoplasma, criopreservación, inseminación artificial, perdiz chukar, perdiz roja, semen

The red-legged partridge (Alectoris rufa) is an endemic specie from Mediterranean countries. Its use as a hunting resource represents one of the most profitable activities in Spain. The demand for hunting together with a decrease of the natural populations has determined the production on farms. However, the intensification has originated, in many cases, an alteration of biological parameters, such as the decrease in the flight response and antipredatory behavior. Reproductive technologies in partridges mainly include semen cryopreservation and artificial insemination. Germplasm banks represent a key element in the preservation of the purity of the native red partridge. On the other hand, artificial insemination can play a relevant role as an instrument to improve the characteristics of interest in hunting practice (anti-predatory instinct or brooding behavior) for the repopulation of hunting grounds.

Keywords: germplasm banks, cryopreservation, artificial insemination, chukar partridge, red partridge, semen

La perdiz roja común (Alectoris rufa) (figura 1), también denominada perdiz patirroja, es endémica de España, Portugal, Francia e Italia. Representa una de las 7 especies que existen del género Alectoris: Alectoris chukar (perdiz turca o perdiz chukar), Alectoris graeca (perdiz griega o de roca), Alectoris magna (perdiz de Prze- valski), Alectoris melanocephala (perdiz de Arabia), Alectoris barbara (perdiz moruna) y Alectoris philbyi.

La actividad de la caza de la perdiz supone una de las actividades cinegéticas más rentables, habiendo polarizado, junto a la caza mayor, la mayor demanda de turismo cinegético en España. Su importancia socioeconómica se refleja en su capaci- dad como elemento de desarrollo de la renta agraria, principalmente en las áreas más deprimidas, contribuyendo a fijar la población y a elevar su nivel de vida. Su correcto desarrollo, en el concepto de caza sostenible, implica la participación de diferentes actores que incluye a las explotaciones de ganadería alternativa, que permite dar respuesta a la demanda de animales mediante una intensificación de su producción a través de granjas cinegéticas de repoblación, y la adecuada gestión de los cotos y espacios naturales que permitan la sostenibilidad de los mismos, favoreciendo ecosistemas saludables que administren acertadamente el patrimonio natural.

Para conocer la evolución histórica del sector hay que remitirse a la década de los cincuenta, en donde la labor de repoblación se inicia, en una primera instancia, por el Servicio Nacional de Pesca Fluvial y Caza (SNPFC), a través de los denominados entonces “Granjas y Centros de Aclimatación y Cría” que incluía el de Lugar Nuevo (Jaén), Quintos de Mora (Toledo), y Dodro (La Coruña). Posteriormente, a partir de 1970, el Instituto Nacional de la Conservación de la Naturaleza (ICONA) asume la ordenación cinegética en España impulsando los diferentes programas de reproducción en cautividad, en donde el Centro de Lugar Nuevo, junto a Quintos de Mora y Dodro, adquiere un protagonismo relevante en la producción y suelta de perdices en diferentes puntos geográficos. La labor del ICONA empieza a verse eclipsada con la aparición de gran cantidad de criaderos privados dispersados por toda la geografía española, incluso en zonas no adecuadas para la perdiz, desde el punto de vista geográfico y climatológico. Este hecho se va haciendo más notorio según se va produciendo la profunda transformación de los sistemas de producción agraria, siguiendo las directrices marcadas por la política agraria común (PAC), favoreciéndose la diversificación y consolidación de tipos de producciones alternativas. A partir de los años ochenta y hasta los noventa, la disminución de las poblaciones silvestres de perdiz roja adquiere niveles históricos (Sánchez et al., 2009). Entre las causas de la merma de sus poblaciones se han apuntado el cambio e intensificación de las prácticas agrícolas, el uso de plaguicidas y pesticidas, la presión cinegética, y la presión por altas densidades de depredadores oportunistas (ej. zorros, algunos córvidos). Esta disminución de la especie ha ido estimulando y consolidando una producción industrial cinegética. De los 5 millones de perdices que se cazan cada año en España, más de 4 millones son criadas en granjas (Alonso et al., 2005). La producción anual rondaría entre los 3-5 millones de ejemplares (Sánchez et al., 2009) que son liberados para la repoblación de los cotos de caza, generalmente en otoño con 5-6 meses de edad (Alonso et al., 2005).

El sistema de cría tradicional ha consistido en el emparejamiento forzado del macho y la hembra, mediante su disposición en jaulas de cría (figura 2), con el fin de producir huevos fecundados que son retirados diariamente para incrementar el periodo de puesta, al retirar el estímulo visual y táctil producido por la presencia del huevo. Las consecuencias de esta intensificación han determinado, en muchos casos, una alteración de parámetros biológicos, como la disminución a la respuesta de huida y el comportamiento antipredatorio. Esta rémora en el establecimiento de una industria cinegética de calidad, se ha visto agravada por la hibridación de la especie autóctona con la perdiz chukar, con el fin de incrementar la rentabilidad de las explotaciones, lo que ha repercutido negativamente en la conservación de nuestra especie autóctona. La perdiz chukar, a diferencia de la autóctona, se caracteriza porque un macho puede convivir con cuatro hembras de esta especie sin problemas de agresiones entre las hembras. Esta característica favoreció un sistema de manejo basado en un macho autóctono con cuatro hembras chukar, con una buena tasa de fertilidad. Unido a la ventaja de requerirse un menor número de machos en la explotación, la puesta de las perdices chukar era muy superior que en las autóctonas. En definitiva, se ha asistido a la producción y selección de animales con periodos reproductivos más amplios, a costa de una inhibición de la cloquez (Gaudioso et al., 2002) y modificaciones etológicas, como una escasa capacidad de huida, determinando serias dificultades para sobrevivir en medios donde existen depredadores naturales, restándose, en definitiva, alicientes al acto de la caza per se, y repercutiendo notablemente en su ciclo reproductivo.

La hibridación y la producción intensiva de la perdiz han inducido considerables cambios en comportamiento y fisiología, especialmente en comportamiento antipredador que interfiere con una adecuada repoblación (Alonso et al., 2005). Estos cambios se deben a tres causas fundamentales: habituación al hombre, aislamiento del predador y cría sin progenitores.

La duración de la inmovilidad muscular inducida (figura 3) es un eficaz indicador de miedo, considerado un carácter de comportamiento antipredador pasivo. Por otro lado, también se han empleado dos indicadores de estrés, para analizar las diferencias entre poblaciones híbridas y puras: el cociente de leucocitos (figura 4) y la asimetría fluctuante (figura 5). El cociente de leucocitos se utiliza como indicador del estrés fisiológico (Gross y Sieguel 1983) y la asimetría fluctuante es una medida de las pequeñas desviaciones al azar que ocurren entre el lado izquierdo y derecho de rasgos bilateralmente simétricos (Van Valen, 1962); el uso de la asimetría fluctuante nos da una medida de la inestabilidad en el desarrollo. En las perdices puras, la duración de inmovilidad muscular y el cociente de leucocitos es superior que en los animales híbridos. También se detectan diferencias significativas entre híbridos y puros en la asimetría fluctuante de la longitud de dedo y en el valor combinado de asimetría de tres caracteres (longitud de ala, longitud y anchura de pata). Por lo tanto, la perdiz pura es más miedosa y asimétrica, y es más estresable que la perdiz híbrida. Los resultados nos muestran que los indicadores de miedo y estrés han sido modificados en la perdiz híbrida debido a la introgresión genética y a la selección. Los mayores tiempos de inmovilidad muscular inducida reflejarían una mayor respuesta ante la presencia de un predador aéreo, lo que le confiere ventajas de supervivencia, en condiciones silvestres, respecto a las híbri- das (Campo et al., 2015). A diferencia del “comportamiento antipredador pasivo” descrito, no se han detectado diferencias asociadas al genotipo respecto al “comportamiento antipredador activo” (ej. salir huyendo ante la presencia un predador terrestre) (Dávila et al., 2019) lo que pone de manifiesto que la merma o abolición de este tipo de comportamiento está más relacionado con las condiciones de cría en cautividad. Finalmente, hay que destacar que en los sistemas actuales de producción se ha ido desarrollando una selección de animales con periodos reproductivos más amplios, a costa de una inhibición de la cloquez, que es el comportamiento que se caracteriza por la permanencia de la hembra en el nido para la incubación, el erizado de las plumas y por el aumento de la agresividad ante algo o alguien extraño que se acerca al nido. La alteración de este instinto tiene un coste singular cuando se realizan repoblaciones de cotos con animales de granja, ya que su desaparición o merma determina que el éxito de la reproducción de estas aves en la naturaleza sea muy bajo. En el INIA-CSIC se han estudiado posibles marcadores endocrinos y genéticos de este comportamiento que estarían relacionados con la síntesis y niveles de secreción de la prolactina (hormona hipofisiaria que presenta altos niveles durante la incubación) y que podrían ser de gran interés en la selección de animales que mantuviesen este comportamiento, principalmente en escenarios en los que se repueblan cotos de caza sociales con perdices de granja.

La perdiz roja es una especie de reproducción estacional cuyo periodo reproductivo se encuadra en los meses de marzo a junio. En estado silvestre, el periodo de puesta suele tener una duración de 4-5 semanas (Green, 1984); la incubación (de 23-24 días) se establece una vez terminada la puesta, que suele constar de 7 a 20 huevos. En condiciones de cautividad, los parámetros reproductivos están sensiblemente modificados, tanto por las condiciones de alimentación y manejo como por el hecho de que, frecuentemente, hay cierta hibridación con especies con mayor producción de huevos.

Estudios comparativos entre perdices puras genéticamente certificadas y perdices con presencia de introgresión genética con perdiz chukar, mantenidas en las mis- mas condiciones medioambientales controladas, han puesto de manifiesto que la hibridación afecta significativamente en diferentes parámetros morfométricos y de funcionalidad espermática. Se detecta un mayor tamaño de la cabeza del espermatozoide (longitud de la cabeza: 15,0 ± 0,1µm frente a 14,4 ± 0,2µm), así como una mayor velocidad de trayectoria lineal (27,3 ± 1,5 µm/s frente a 19,8 ± 2,1 µm/s) en los espermatozoides en las perdices híbridas que en las puras (Santiago-Moreno et al., 2015). Esta característica está en consonancia con una mayor promiscuidad en la perdiz chukar, en la que la poliandria es una característica más marcada que en las puras. El mayor tamaño de la cabeza del espermatozoide, unido a una mayor velocidad de la trayectoria lineal, confieren a los ejemplares híbridos una ventaja en escenarios de competencia espermática poscoital. Hay que tener en cuenta que recientes estudios refieren que la perdiz (una especie tradicionalmente considerada como monógama estricta) presenta hasta un 61 % de paternidades fuera de la pareja. En los machos, el comienzo de la pubertad (incremento de los niveles de testosterona y presencia de actividad espermatogénica) acontece a partir de los 8 meses de edad en ejemplares híbridos, mientras que en los puros se retrasa hasta los 10 meses. En su segunda estación reproductiva (2 años de edad) se aprecia una marcada estacionalidad en la actividad espermatogénica, tanto en perdices puras como en híbridas. En ambas se inicia en el mes de enero. En las puras la mayor actividad espermatogénica se aprecia en marzo y mayo, mientras que en las perdices híbridas la máxima actividad espermatogénica se observa desde abril a mayo. Tanto en los núcleos puros como híbridos, la producción espermática disminuye en el mes de junio, con ausencia de actividad espermatogénica desde septiembre a diciembre en ejemplares puros, y de agosto a diciembre en híbridos. La concentración espermática, tanto en puras como híbridas, es máxima en primavera. Los híbridos siempre tienen concentraciones superiores que los puros (1359,0 ± 80,7 x 106 espermatozoides/ml frente a 722,1 ± 123,9 x 106 espermatozoides/ml) (Santiago-Moreno et al., 2015). Con relación al volumen de semen eyaculado, no existen diferencias significativas, oscilando en medias de 17 a 20 µL.

El perfil anual de secreción de testosterona es similar en perdices puras y en híbridas con chukar. Las concentraciones plasmáticas de testosterona se mantienen a niveles basales en otoño y principios de invierno, alcanzándose los máximos valores en primavera. No obstante, en los ejemplares puros las concentraciones de testosterona caen antes a niveles basales que en las híbridas (figura 6) (ToledanoDíaz et al., 2017).

Una vez producida la cópula, los espermatozoides se almacenan en unas estructuras ubicadas en la unión útero-vaginal denominadas túbulos de almacenamiento espermático. En dichos túbulos, los espermatozoides pueden permanecer viables hasta 21 días (Abouelezz et al., 2015). Durante este periodo, se van liberando para progresar a través de oviducto hasta el infundíbulo, donde alcanzarían el huevo para su fecundación.

Estudios comparativos entre perdices genéticamente certificadas y con presencia de introgresión genética de chukar han puesto de manifiesto que la hibridación altera los parámetros productivos. Estudios previos ya apuntaron que el periodo de puesta en la perdiz roja genéticamente pura se veía alterado en condiciones de cautividad, pasando de 4-5 semanas a 6-10 semanas, debido a las condiciones de manejo. Este periodo se ve aún más ampliado en las perdices con introgresión genética de chukar respecto a las perdices más puras. Estudios recientes muestran que la duración media del periodo de puesta en perdices híbridas es de 120 días, mientras que en las puras es de 54 días (Toledano-Díaz et al., 2017). Esta diferencia se debe, principalmente, por el adelanto y retraso del inicio y finalización del periodo de puesta, respectivamente, en las híbridas, lo cual es más marcado en su primera y segunda estación reproductiva (figura 7). La puesta de huevos comienza a finales de marzo en perdices híbridas, mientras que en las puras se retrasa hasta finales de abril. El final del periodo de puesta ocurre en las híbridas a finales de julio, mientras en que en las puras acontece a finales de junio. Tanto las perdices con introgresión genética como las puras son fértiles en su primer año de vida, aunque en la puras el periodo de puesta varía con la edad, pasando de 45 días el primer año a 48 y 71 a los dos y tres años, respectivamente. En las híbridas no existen diferencias entre los tres primeros años de edad (Toledano-Díaz et al., 2017). Este incremento en el periodo de puesta condiciona un aumento en el número de huevos puestos por hembra. En el caso de las perdices puras, la media de huevos por periodo de puesta es 17, 18 y 24 en los tres primeros años de vida, mientras que en las hembras híbridas alcanza una media de 52 huevos sin diferencias en los tres primeros años.

En relación con la fertilidad y la incubabilidad de los huevos entre las dos variantes genéticas, los datos demuestran que la introgresión genética con chukar no altera ninguno de los dos parámetros, aunque los porcentajes son algo mejores en las híbridas. El porcentaje de fertilidad en las perdices puras se sitúa entre el 54-60 % y es levemente superior en las híbridas, 6370 %. Respecto a la incubabilidad, oscila entre 27-37 % en las perdices puras y 35-50 % en las híbridas (Toledano-Díaz et al., 2017). Claramente, se observa que la producción por hembra y temporada depende de la duración de la puesta. (ej. 17 huevos en 45 días en las puras frente a 55 huevos en 120 días para las híbridas). Otro dato para considerar en este estudio fue que el 100 % de las parejas de perdices con introgresión genética pusieron huevos. En el grupo de perdices puras, el porcentaje de parejas con puesta aumentaba con la edad: del 40 % el primer año a 94 % el tercero.

En conclusión, ya desde el primer año de vida y durante los años siguientes, la introgresión genética altera los parámetros productivos en la perdiz roja. El mayor periodo de puesta determina una mayor producción de huevos y perdigones en las perdices híbridas. No obstante, la fertilidad de las hembras no está afectada por la hibridación.

La aplicación de unas tecnologías reproductivas asentadas en el conocimiento de los parámetros etológicos óptimos para la sostenibilidad de las poblaciones, pueden ser un instrumento a considerar para paliar los efectos deletéreos originados con la intensificación de los últimos años:

■ Riesgos sanitarios. El uso de la inseminación artificial disminuye los riesgos al evitar el traslado entre granjas de animales vivos no controlados sanitariamente.

■ Introgresión genética. La utilización de dosis seminales de machos de pureza genética comprobada (provenientes, en una primera instancia, de granjas certificadas y Estaciones de Referencia oficiales) ayudaría a la difusión de la especie autóctona.

■ Baja supervivencia y calidad de la actividad cinegética. La selección basada en el comportamiento anti-predatorio y comportamiento de cloquez fomentaría una caza de calidad y favorecería una cierta sostenibilidad de las poblaciones reintroducidas en cotos de caza.

La IA en perdices solo se ha desarrollado de una manera experimental, pero los estudios realizados por el INIA-CSIC han puesto de manifiesto su eficacia y viabilidad como instrumento de conservación y de mejora de caracteres de interés cinegético. La obtención del material seminal se basa en la realización de un masaje dorsolumbar y abdominal combinado con una ligera presión a nivel de la cloaca. El semen es obtenido mediante un capilar de hematocrito (figura 8).

La inseminación artificial, propiamente dicha, consiste en la aplicación de un volumen de 20 µL de semen, conteniendo 15 millones de espermatozoides, intraoviductalmente, para lo cual se requiere de una ligera presión abdominal que permita la exposición de la vagina; la inseminación se hace con una pipeta Gilson (figura 9). El semen mantiene su capacidad fecundante hasta 20 días después de la inseminación. En la primera semana, tras la inseminación, se obtienen una fertilidad del 54 %. La fertilidad va disminuyendo en las semanas siguientes: 27,5 % de huevos fecundados en la segunda semana, y 10 % de huevos fecundados a la tercera semana después de la inseminación artificial (Abouelezz et al.,

2015). La IA debe realizarse un mínimo de 3 horas antes o después de la puesta, para evitar su expulsión por peristalsis. La frecuencia habitualmente utilizada consiste en realizar las inseminaciones cada 3-4 días. Se ha apuntado que la proporción de huevos que eclosionan tras la inseminación artificial es de alrededor de un 40 % (figura 10). Para el mantenimiento del semen en condiciones de refrigeración (5 °C) durante periodos que oscilan de 1-24 h se recomienda el diluyente seminal L&R-84, el cual está compuesto de glutamato de sodio, glucosa, magnesio acetato, acetato de potasio y polivinilpirrolidona. Dicho diluyente preserva mejor las variables cinéticas espermáticas (ej. velocidad de trayectoria lineal, velocidad curvilínea) y ofrece mejores resultados de fertilidad que el medio Lake 7.1, compuesto por glutamato de sodio, glucosa, acetato de magnesio, citrato de potasio, y N,Nbis(2-hidroxietil)taurina (BES). Además, el número medio de espermatozoides que alcanzan y penetran la membrana perivitelina es superior con el diluyente L&R-84 (Santiago-Moreno et al., 2017). El uso de la yema de huevo como aditivo en el diluyente no confiere ninguna ventaja evidente para la preservación en condiciones de refrigeración. El uso de otros aditivos, como el antioxidante catalasa (200 UI/ml), parecen tener buenos resultados en muestras que se mantienen refrigeradas durante periodos superiores a las 5 horas.

Los espermatozoides de perdices tienen una forma filiforme con un bajo contenido citoplasmático y un flagelo muy largo. Esta característica los hace altamente susceptibles a daños celulares durante la congelación y descongelación. Por este motivo, los protocolos de criopreservación deben incluir diluyentes y crioprotectores que ayuden a preservar la viabilidad y el potencial fecundante posdescongelación de los espermatozoides. El diluyente L&R-84 ha demostrado mantener una tasa de fertilidad mayor del semen de perdiz roja refrigerado en comparación con otros diluyentes como el Lake 7.1 (SantiagoMoreno et al., 2017), por lo que ha sido utilizado en protocolos de congelación de esta especie. En cuanto al crioprotector, el grupo de Fisiología y Tecnologías Reproductivas del INIA-CSIC ha obtenido resultados alentadores de viabilidad y motilidad espermática posdescongelación (40 % ± 4,2 y 20,6 ± 4,4, respectivamente) mediante el uso de glicerol al 8 %. Como primer paso, el semen de perdiz roja es diluido 1:1 (v:v) a temperatura ambiente con el diluyente L&R84 y refrigerado a 5 °C. Una vez a esta temperatura, el semen es diluido nuevamente con L&R84 y la cantidad correspondiente de glicerol para obtener una concentración espermática final de 1.200 millones/ml y concentración final de glicerol del 8 %. Si la concentración espermática inicial no permite alcanzar esta concentración final, tras la dilución inicial 1:1 con L&R84 se adicionaría exclusivamente el glicerol para obtener una concentración final del 8 %. Después de 15 min de equilibrado a 5 °C, las muestras son envasadas en pajuelas de 0,25 ml y congeladas, mediante vapores de nitrógeno, en dos pasos (de 5 °C a -35 °C a 7 °C/min, y después de -35 °C a -140 °C a 60 °C/min, Santiago-Moreno et al., 2011). Las pajuelas son entonces sumergidas en nitrógeno líquido y almacenadas. Estudios en otras especies han demostrado un efecto positivo de la presencia de antioxidantes en el diluyente de congelación (Partyka y Nïzanski 2021), mostrando una mejora en la calidad espermática posdescongelación. Sin embargo, la adición de catalasa (200 UI) o superóxido dismutasa (100 UI) en el diluyente de perdiz roja, no mostró ninguna mejora espermática posdescongelación (datos no publicados). Para el uso de las dosis seminales criopreservadas para inseminación artificial, las pajuelas se descongelan a 5 °C durante tres minutos.

Las técnicas de reproducción asistida en perdices son un instrumento de gran valor para la optimización de sus producciones como recurso cinegético, así como para la conservación de poblaciones genéticamente puras. Estas técnicas pueden ser un elemento clave para la selección de caracteres de cloquez y de comportamiento antipredatorio pasivo, favoreciendo la tasa de supervivencia tras repoblaciones y mejorando la calidad de la actividad cinegética. El establecimiento de bancos de germoplasma como el desarrollado en el INIA-CSIC supone un garante de seguridad para la conservación en pureza de la perdiz roja.

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