HOGENT-biomedische laboratoriumtechnologie - microbiologie

Pagina 2 van 154

INHOUDSOPGAVE Inhoud 1

INLEIDING ................................................................................................................................. 7

1.1

DEFINIËRING MICROBIOLOGIE ...................................................................................... 7

1.2

DOELSTELLINGEN VAN DIT HOOFDSTUK .................................................................. 8

1.3

PLAATS VAN HET MICRO-ORGANISME IN DE NATUUR ......................................... 9

1.3.1

PROTISTA ......................................................................................................................... 9

1.3.2

3-RIJKENSYSTEEM .......................................................................................................... 9

1.3.3

2 DOMEINEN .................................................................................................................. 10

1.3.3.1 Wieren ....................................................................................................................... 10 1.3.3.2 Protozoa .................................................................................................................... 11 1.3.3.3 Schimmels en gisten: Mycologie ........................................................................... 11 1.3.3.4 Slijmzwammen ......................................................................................................... 11 1.3.3.5 Eubacteriën: Bacteriologie ..................................................................................... 11 1.3.3.6 Archaebacteriën ....................................................................................................... 11 1.3.3.7 Virussen: Virologie .................................................................................................. 12 1.3.4

5-RIJKENSYSTEEM VOLGENS WHITTAKER ................................................................... 12

1.3.5

3 DOMEINEN .................................................................................................................. 12

1.4

DOEL VAN DEZE SYLLABUS ......................................................................................... 13

1.5

NOMENCLATUUR, TAXONOMIE EN IDENTIFICATIECRITERIA ............................ 14

1.5.1 BINOMINALE NOMENCLATUUR VOOR SCHIMMELS EN BACTERIËN (VOLGENS LINNAEUS)...................................................................................................................................... 14 1.5.2

TAXONOMIE .................................................................................................................... 15

1.5.3

IDENTIFICATIECRITERIA ................................................................................................. 16

1.6

GESCHIEDENIS VAN DE MICROBIOLOGIE ............................................................... 18

1.7

DRIE BACTERIËN GEÏSOLEERD DOOR KOCH ......................................................... 22

1.7.1

BACILLUS ANTHRACIS .................................................................................................... 22

1.7.2

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ................................................................................ 24

1.7.3

Vibrio cholerae............................................................................................................. 26

1.8

HET BELANG VAN MICRO-ORGANISMEN ................................................................. 26

1.8.1

NEGATIEVE ROL ............................................................................................................. 26

1.8.2

POSITIEVE ROL .............................................................................................................. 27

2

MYCOLOGIE ........................................................................................................................... 29

2.1

DOELSTELLINGEN VAN DIT HOOFDSTUK ................................................................ 29

2.2

ALGEMENE KENMERKEN .............................................................................................. 29

2.2.1

DE 4 KLASSEN................................................................................................................ 31

2.2.2

WAAROM IS MYCOLOGIE BELANGRIJK? ........................................................................ 32 Microbiologie Theorie

Pagina 3 van 154

2.3

CYTOLOGIE OF CELLEER BIJ FUNGI ......................................................................... 33

2.3.1

DE CELWAND ................................................................................................................. 33

2.3.2

DE CELMEMBRAAN......................................................................................................... 34

2.3.3

HET CYTOPLASMA ......................................................................................................... 34

2.3.4

DE CELORGANELLEN ..................................................................................................... 34

2.4

STRUCTUUR – MORFOLOGIE ....................................................................................... 35

2.4.1

MORFOLOGIE VAN GISTEN EN SCHIMMELS................................................................... 35

2.4.2

DIMORFISME .................................................................................................................. 37

2.5

VERMENIGVULDIGING BIJ FUNGI ............................................................................... 39

2.5.1

DE ONGESLACHTELIJKE SPORULATIE ........................................................................... 40

2.5.1.1 De gisten ................................................................................................................... 40 2.5.1.2 De schimmels ........................................................................................................... 42 2.5.2

DE GESLACHTELIJKE SPORULATIE ................................................................................ 49

2.5.2.1 De gisten ................................................................................................................... 49 2.5.2.2 De schimmels ........................................................................................................... 51 2.5.3 2.6

OVERZICHT SPORENVORMING ............................................................................ 58

PATHOGENE FUNGI ......................................................................................................... 58

2.6.1

SOORTEN MYCOSEN ...................................................................................................... 59

2.6.1.1 Dermatomycosen (tinea) ........................................................................................ 59 2.6.1.2 Levurosen ................................................................................................................. 62 2.6.1.3 Aspergillose .............................................................................................................. 64 2.6.1.4 Uitheemse mycosen ................................................................................................ 64 2.6.2 3

MYCOTOXICOSEN .......................................................................................................... 64

BACTERIOLOGIE .................................................................................................................. 65

3.1

DOELSTELLINGEN VAN DIT HOOFDSTUK ................................................................ 65

3.2

INLEIDING............................................................................................................................ 66

3.2.1

ALGEMENE KENMERKEN................................................................................................ 66

3.2.2

WAAROM IS BACTERIOLOGIE BELANGRIJK? ................................................................. 67

3.2.3

LABODIAGNOSTIEK ........................................................................................................ 68

3.2.3.1 Het routine diagnostisch labo ................................................................................ 68 3.2.3.2 Het research-lab ...................................................................................................... 69 3.3

STRUCTUUR - MORFOLOGIE ........................................................................................ 70

3.3.1

BOLVORMIGE CELLEN OF KOKKEN ................................................................................ 70

3.3.2

CILINDRISCHE CELLEN................................................................................................... 73

3.4

CYTOLOGIE (BACTERIOLOGIE) ................................................................................... 75

3.4.1

ALGEMENE STRUCTUUR ................................................................................................ 75

3.4.1.1 De celmembraan ..................................................................................................... 75 3.4.1.2 Celwand .................................................................................................................... 76 Microbiologie Theorie

Pagina 4 van 154

3.4.1.3 Mesosomen .............................................................................................................. 84 3.4.1.4 Ribosomen................................................................................................................ 84 3.4.1.5 Kernstreken .............................................................................................................. 84 3.4.1.6 Het cytoplasma ........................................................................................................ 88 3.4.1.7 Insluitsels .................................................................................................................. 88 3.4.2

SPECIFIEKE STRUCTUUR ............................................................................................... 92

3.4.2.1 Flagella: zweepdraden............................................................................................ 92 3.4.2.2 Endosporen .............................................................................................................. 95 3.4.2.3 Kapsels...................................................................................................................... 97 3.4.2.4 Pili of fimbriae ........................................................................................................... 98 3.5

VOORTPLANTING EN GROEICURVE........................................................................... 99

3.5.1

VOEDING ........................................................................................................................ 99

3.5.1.1 Belang ....................................................................................................................... 99 3.5.1.2 De op te nemen elementen.................................................................................... 99 3.5.1.3 Indeling op basis van voedingsvereisten ........................................................... 100 3.5.1.4 Metabolisme ........................................................................................................... 101 3.5.1.5 Voedingsbodems ................................................................................................... 101 3.5.2

GROEIBEHOEFTEN ....................................................................................................... 102

3.5.2.1 pH............................................................................................................................. 102 3.5.2.2 Temperatuur ........................................................................................................... 103 3.5.2.3 Osmotische waarde van het voedingsmilieu ..................................................... 105 3.5.2.4 O2 ............................................................................................................................. 106 3.5.3

DELING EN GROEICURVE ............................................................................................. 107

3.5.3.1 Deling ...................................................................................................................... 107 3.5.3.2 Het verloop van de bacteriëngroei: de groeicurve............................................ 109 3.5.4

HET TELLEN VAN BACTERIËLE CELLEN ....................................................................... 112

3.5.4.1 De plaattelmethode: totaal plaatgetal ................................................................. 113 3.5.4.2 De Most Probable Number methode .................................................................. 115 3.5.4.3 De telkamer ............................................................................................................ 115 3.5.4.4 De membraanfiltratiemethode: totaal leefbaar kiemgetal................................ 116 3.5.4.5 Turbidimetrie: totaal kiemgetal ............................................................................ 116 3.5.4.6 Coulter counter ...................................................................................................... 117 3.5.4.7 qPCR ....................................................................................................................... 118 3.6

METABOLISME ................................................................................................................ 118

3.7

VARIATIES EN MUTATIES ............................................................................................ 121

3.7.1

MUTATIES..................................................................................................................... 121

3.7.2

VARIATIES .................................................................................................................... 121

3.8

UITWISSELING VAN GENETISCHE INFORMATIE .................................................. 123 Microbiologie Theorie

Pagina 5 van 154

3.8.1

CONJUGATIE ................................................................................................................ 125

3.8.2

TRANSFORMATIE ......................................................................................................... 127

3.8.2.1 Natuurlijke transformatie (in vivo) ....................................................................... 127 3.8.2.2 Experiment (Griffith, 1928) ................................................................................... 128 3.8.2.3 Transformatie in het labo (in vitro) ...................................................................... 129 3.8.3

TRANSDUCTIE .............................................................................................................. 130

3.8.3.1 Algemene transductie ........................................................................................... 131 3.8.3.2 Specifieke transductie ........................................................................................... 132 3.8.4 3.9

TRANSPOSITIE ............................................................................................................. 133

GENETIC ENGINEERING ............................................................................................... 134

3.9.1

BIJ HET BEREIDEN VAN GENEESMIDDELEN................................................................. 134

3.9.1.1 Insuline .................................................................................................................... 134 3.9.1.2 Menselijk groeihormoon ....................................................................................... 135 3.9.1.3 Hepatitis B Virus Vaccin ....................................................................................... 135 3.9.1.4 Tissue plasminogen activator (tPA) .................................................................... 135 3.9.2 4

TER TRANSFORMATIE VAN PLANTEN .......................................................................... 136

VIROLOGIE ........................................................................................................................... 137

4.1

DOELSTELLINGEN VAN DIT HOOFDSTUK .............................................................. 137

4.2

INLEIDING.......................................................................................................................... 137

4.2.1

GESCHIEDENIS ............................................................................................................ 137

4.2.2

WAT IS EEN VIRUS? ..................................................................................................... 138

4.3

MORFOLOGIE – STRUCTUUR ..................................................................................... 139

4.3.1

MORFOLOGIE ............................................................................................................... 139

4.3.1.1 Algemeen ................................................................................................................ 141 4.3.1.2 Typevoorbeelden: .................................................................................................. 141 4.4

NOMENCLATUUR............................................................................................................ 145

4.5

INFECTIE............................................................................................................................ 146

5

4.5.1

BACTERIOFAGEN VAN HET T-TYPE ............................................................................. 146

4.5.2

DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN FAGEN .................................................................. 149

4.5.3

DIERLIJKE VIRUSSEN ................................................................................................... 150

4.5.4

DETECTIE VAN VIRALE INFECTIES BIJ DE MENS.......................................................... 153

4.5.5

ANTIVIRALE GENEESMIDDELEN ................................................................................... 153

BRONNEN ............................................................................................................................. 154

Microbiologie Theorie

Pagina 6 van 154

VOORWOORD Het opleidingsonderdeel ‘Microbiologie’ heeft als doel de student kennis te laten maken met verschillende groepen van micro-organismen. In deze cursus zullen de fungi, de bacteriën en de virussen aan bod komen in het algemeen. Het is belangrijk dat de student deze groepen uit elkaar kan houden en ook leert hoe veilig om te gaan met deze micro-organismen in het labo. De morfologie en de vermenigvuldiging wordt bestudeerd, vnl. in functie van de labodiagnostiek.

Aandacht wordt ook besteed aan uitwisseling van genetische informatie tussen micro-organismen onderling en ook aan genetische recombinatie in het algemeen, als voorbereiding op opleidingsonderdelen zoals ‘Biotechnologie’. Op de hoofstukken i.v.m. bacteriologie wordt verder gebouwd in de opleidingsonderdelen ‘Bacteriologie’ en ‘Medische Bacteriologie’. De hoofdstukken i.v.m. ‘Mycologie’ en ‘Virologie’ worden verder uitgediept in het opleidingsonderdeel ‘Mycologie, parasitologie en virologie’.

Deze tekst dient gecombineerd te worden met de Powerpointpresentaties die beschikbaar zijn op de electronische leeromgeving Chamilo en die tijdens de hoorcolleges worden aangewend. Op deze manier kan de student de les vlot volgen. In de Powerpoint-presentaties zijn ook kleurfiguren en foto’s beschikbaar, die de materie aanschouwelijker maken. Het doornemen van de syllabus ‘Microbiologie practica’ (I. De Pauw en A. Leroy) en de bijhorende verslagen, is zeker hulpzaam bij het instuderen van de leerstof.

De student is verplicht de meest recente ECTS-fiche van dit opleidingsonderdeel door te nemen, die geraadpleegd kan worden via de website van Hogent of via Chamilo.

Microbiologie Theorie

Pagina 7 van 154

1

INLEIDING

1.1

DEFINIËRING MICROBIOLOGIE

De ‘Microbiologie’ is het deel van de biologie die micro-organismen bestudeert.

Micro-organismen zijn met het blote oog meestal niet waarneembaar: het zijn levende wezentjes van microscopische afmetingen.

Vele van deze wezentjes samen zijn wel zichtbaar vb. onder de vorm van een kolonie of een smeer op een vaste voedingsbodem. Dit is dan het macroscopisch uitzicht. Een troebele bouillon (broth) kan ook wijzen op de aanwezigheid van micro-organismen. Soms kan een opmerkelijke geur wijzen op de aanwezigheid van bacteriële groei.

Figuur 1: Bacteriële kolonies op voedingsbodem in petriplaat, www-micro.msb.le.ac.uk

In het laboratorium werkt men soms met gekende aangekochte stammen van micro-organismen (uit de American Type Culture Collection, zie verder). Soms isoleert men een wild-type stam uit een waterstaal, een voedselstaal, een klinisch staal (urine, etter, faeces, sputum e.a. afkomstig van een patiënt) … op een vaste voedingsbodem. Er zijn dan ook verschillende disciplines te onderscheiden in de microbiologie: vb.

-

In de klinische microbiologie wenst men een pathogeen micro-organisme aan te tonen in een patiëntenstaal (identificeren) en de gevoeligheid ervan t.o.v. anti-microbiële middelen te bepalen.

-

In de milieumicrobiologie kan men de kwaliteit van het water controleren op aanwezigheid van micro-organismen. E. coli en enterokokken wijzen op faecale verontreiniging.

-

In de voedingsmicrobiologie kan men voedingswaren testen op aanwezigheid van micro-organismen die verantwoordelijk kunnen zijn voor infecties en voedselvergiftigingen.

-

In onderzoekslabo’s in het terrein van de microbiologie en biotechnologie werkt men soms met micro-organismen om deze al dan niet genetisch te manipuleren of te typeren.

Microbiologie Theorie

Pagina 8 van 154

In de microbiologie bestudeert men verschillende soorten m.o.: bacteriën, schimmels, gisten, virussen, parasieten. deelgroep

Bacteriën

Fungi (schimmels + gisten) Virussen

Parasieten (protozoa + metazoa)

studiegebied

bacteriologie

mycologie

virologie

parasitologie

Een aantal hiervan zijn echter zichtbaar met het blote oog vb. paddenstoelen (fungi: schimmels), lint- en spoelwormen (parasieten: metazoa).

Schimmels worden dus ook beschouwd als vertegenwoordigers van de groep van de m.o., maar zijn macroscopisch zichtbaar onder de vorm van een schimmeldek (mycelium). Dit is vaak herkenbaar als een harige massa of fluweelachtig dek.

Figuur 2: Sporothrix schenkii op voedingsbodem, pathmicro.med.sc.edu/mycology

1.2

DOELSTELLINGEN VAN DIT HOOFDSTUK

─

De student weet wat microbiologie is.

─

De student kan de groep van de micro-organismen situeren in de natuur.

─

De student kan de verschillende groepen van micro-organismen van elkaar onderscheiden en ook de karakteristieke eigenschappen formuleren.

─

De student kan het opleidingsonderdeel ‘Microbiologie’ plaatsen binnen de opleiding ‘Biomedische Laboratoriumtechnologie’ en het doel ervan inzien.

Microbiologie Theorie

Pagina 9 van 154

─

De student weet hoe de naamgeving van micro-organismen in elkaar zit.

─

De student weet wat een reincultuur is en hoe een reincultuur kan bekomen worden.

─

De student kent de begrippen: cultuur, stam, ATCC, biotypes, serotypes.

─

De student kan de postulaten van Koch interpreteren.

─

De student kent het belang van micro-organismen in het algemeen.

1.3

PLAATS VAN HET MICRO - ORGANISME IN DE NATUUR

1.3.1

Protista

In de natuur maakt men een afzonderlijke groep voor de m.o.: Protista: het zijn ééncellige of meercellige organismen, zonder gedifferentieerde weefsels.

Protista = m.o.

De basis van een m.o. is de cel en bevat DNA, RNA, proteïnen, lipiden.

1.3.2

3-Rijkensysteem

In het 3-rijkensysteem onderscheiden we dan ook 3 rijken en dit onderscheid was mogelijk onder andere op basis van lichtmicroscopie en macroscopisch uitzicht.

1. Planten

2. Dieren

Fotosynthese

Intestinale tractus

Grote uitwendige oppervlakte

Grote inwendige oppervlakte

Celwand

Geen celwand

Geen actieve beweging

Actieve beweging

3. Protista: m.o.

Bacteriën Gisten (en schimmels) Wieren Eéncellige dieren (protozoa) Hier wordt naast het plantenrijk en het dierenrijk ook een rijk voor de microorganismen voorzien: het rijk der protisten. De protista bezitten geen Microbiologie Theorie

Pagina 10 van 154

gedifferentieerde weefsels in tegenstelling tot dieren en planten. De VIRUSSEN hebben geen plaats binnen deze indeling.

1.3.3

2 Domeinen

Dankzij de electronenmicroscopie was het ook mogelijk om 2 types van cellen te onderscheiden: de prokaryote cel: - oudste cel in de biologische evolutie - primitief - geen celkern (het DNA is naakt) - geen celorganellen (wel ribosomen) - voortplanting door amitose (dwarse deling) de eukaryote cel: - bezit een celkern met daarin chromosomen - bezit celorganellen: mitochondriën, chloroplasten - voortplanting door mitose of meiose De verdere indeling van de Protista of m.o. gebeurt op basis van dit celtype.

Hogere Protista

Lagere Protista

Eukaryote celtype

Prokaryote celtype

Wieren (Algae)

Eubacteriën*

Protozoa

Archaebacteriën

Schimmels, gisten (Fungi)* Slijmzwammen Virussen* - m.o., doch niet cellulair - vermenigvuldiging in gastheercel *

: in deze cursus behandeld

1.3.3.1

Wieren

- bevatten meestal chlorofyl en doen aan fotosynthese - kunnen meercellig of 1-cellig zijn - bezitten een celwand Microbiologie Theorie

Pagina 11 van 154

1.3.3.2

Protozoa

- zijn 1-cellig - wordt beschouwd als primitiefste vorm van dierlijk leven? (‘diertjes’) - vereisen een vochtige omgeving - parasieten vb.

Amoeben (plankton) Trypanosoma (in speeksel van tsé-tsé vlieg: slaapziekte) Plasmodium: malaria

1.3.3.3

Schimmels en gisten: Mycologie

- doen niet aan fotosynthese - schimmels zijn echter meercellig - gisten zijn ééncellig - zijn zeer verspreid in de natuur - sommige zijn pathogeen - worden aangewend in de industrie ter produktie van antibiotica

1.3.3.4

Slijmzwammen

Myxomyceten. Hebben in hun levenscyclus een ‘amoebe’-stadium met multinucleair cytoplasma

1.3.3.5

Eubacteriën: Bacteriologie

Indeling volgens ‘Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology’ (30-tal secties op basis van verwantschap) - Bacteriën zijn 1-cellig - opgebouwd uit de prokaryote cel - bezitten meestal een typische celwand met muraminezuur - Verschillende groepen kunnen onderscheiden worden: Gram-negatieve bacteriën, Gram-positieve bacteriën, Cyanobacteriën, Mycoplasma’s, Rickettsiae, Chlamydiae.

1.3.3.6

Archaebacteriën

- zijn 1-cellig - opgebouwd uit de prokaryote cel Microbiologie Theorie

Pagina 12 van 154

- bezitten een typische celwand: hier is echter geen muraminezuur aanwezig en er is een andere lipidensamenstelling - komen voor in o.a. heetwaterbronnen, S-bronnen, …: extreme omstandigheden omtrent temp., druk en chemische samenstelling.

1.3.3.7

Virussen: Virologie

- bezitten of DNA of RNA - bezitten een proteïnemantel (capside) - vereisen een gastheercel voor de vermenigvuldiging - niet opgenomen binnen de protista

1.3.4

5-Rijkensysteem volgens Whittaker

In 1969 werd door WHITTAKER een 5-rijkensysteem voorgesteld: de Monera, de Protista, de Fungi, de Planten en de Dieren. De Monera kwamen overeen met de prokaryoten. De Protista zijn hier een uiteenlopende groep van meestal ééncellige dierlijke of plantaardige organismen. De fungi zijn de gisten en de schimmels. Deze indeling is gebaseerd op vergelijking van een aantal eigenschappen zoals celtype, morfologie, celopbouw, voedingswijze.

Een autotroof organisme kan zelf voedsel (suikers) aanmaken m.b.v. zonlicht en een CO2. Een heterotroof organisme is afhankelijk van andere organismen om voedingsstoffen en organisch celmateriaal aan te maken.

1.3.5

3 Domeinen

Sinds 1977 werd de wereld van de levende organismen door Carl WOESE anders ingedeeld in 3 domeinen: -

De Archae : de Archaebacteriën : prokaryoot De Eubacteria : echte bacteriën : prokaryoot De Eucarya : protista, planten, dieren, fungi: eukaryoot

Deze indeling is gebaseerd op de gelijkenis van de sequenties tussen 16S en 18S ribosomaal RNA van de organismen. De fylogenetische indeling steunt dus op de evolutieve verwantschap tussen de organismen en maakt hierbij gebruik van (biochemische en) genetische eigenschappen. De 3 domeinen kunnen worden voorgesteld in een fylogenetische boom waarin een knooppunt de recentste gemeenschappelijk voorouder voorstelt.

Microbiologie Theorie

Pagina 13 van 154

Figuur 3 : Fylogenetische boom van organismen volgens Woese

1.4

DOEL VAN DEZE SYLLABUS

Deze cursus bereidt de student voor op de cursussen van het 2e en 3e jaar MLT/FBT (in een modeltraject): ─ ─ ─ ─

(medische) bacteriologie medische mycologie virologie parasitologie

 waar de DIAGNOSE, THERAPIE en EPIDEMIOLOGIE centraal staan.

Bij de diagnose toont men de aanwezigheid van een pathogeen micro-organisme aan in een klinische staal. Dit wijst dan op een infectie. Men identificeert het microorganisme (welk m.o.? naam). In sommige gevallen zal men het geïsoleerde m.o. ook typeren, waarbij men uitzoekt over welke stam/variant het precies gaat.

Bij de therapie gebruikt men een geneesmiddel, in dit geval een antimicrobieel middel, om de infectie te bestrijden. Veelal voert men een gevoeligheidsbepaling uit om na te gaan of er resistentie is t.o.v. gebruikelijke antibiotica.

De epidemiologie is de wetenschappelijke studie van het voorkomen en het verspreiden van een (infectie)ziekten binnen een bevolking. Het Wetenschappelijk Instituut WIV-Sciensano is een wetenschappelijke instelling opgericht door de federale Belgische staat. De hoofdopdracht bestaat uit het wetenschappelijk onderzoek met het oog op het onderbouwen van het gezondsbeleid. De voornaamste activiteiten betreffen de surveillance van overdraagbare en nietoverdraagbare aandoeningen, controle van eetwaren en geneesmiddelen, risicoMicrobiologie Theorie

Pagina 14 van 154

evaluaties van chemicaliën en genetisch gemodificeerde organismen, beheer van een biologisch patrimonium (verzamelingen van stammen van m.o.)…

Referentielaboratoria beschikken over de meeste expertise om een welbepaalde pathogeen op te sporen en verder te typeren. Andere labo’s kunnen stalen doorsturen naar referentielabo’s bij vermoeden van aanwezigheid van de betreffende kiem.

De biomedisch geörienteerde laboratoriumtechnoloog kan later geconfronteerd worden met verschillende aspecten van de microbiologie in het werkveld en kan dus actief zijn: -

aan universiteiten (researchlaboratoria, epidemiologie (eventueel uitbraken)) onderzoekscentra (vb. WIV-Sciensano, Tropisch Instituut voor geneeskunde) in laboratoria voor genetic engineering (industrie, universiteit) in industriële laboratoria (vb. voedingsindustrie, farmaceutische industrie) voor het federaal agentschap van volksgezondheid, van veiligheid van de voedselketen en van leefmilieu. in ziekenhuizen (medische laboratoria)

1.5

NOMENCLATUUR , TAXONOMIE EN IDENTIFICATIECRITERIA

1.5.1

Binominale nomenclatuur voor schimmels en bacteriën (volgens Linnaeus)

In de biologie en microbiologie wordt een binominaal systeem gebruikt bij de naamgeving. Een naam bestaat dus uit 2 delen:

Soort:

Speciës. Kleinste groep m.o. met identieke karakteristieken (metabolische eigenschappen, morfologie)

Geslacht:

Genus. Groepering van enkele soorten

Naam = Geslacht + soort

Vb.

Penicillium notatum Penicillium glaucum Escherichia coli

Microbiologie Theorie

Pagina 15 van 154

Opmerking: Een wetenschappelijke naam wordt steeds in ‘italic’ geplaatst. De geslachtsnaam (eerste deel) begint met een hoofdletter en de soortnaam (tweede deel) begint met een kleine letter.

Op basis van de biochemische eigenschappen wordt een bacterie toegekend aan een species.

De naamgeving van virussen is anders t.o.v. eukaryote en prokaryote organismen.

Virussen worden aangeduid met afkortingen en krijgen een code.

1.5.2

Taxonomie

Taxonomie is de wetenschap van de classificatie van organismen. Het is de leer van de biologische systematiek: hoe worden m.o. in groepen geördend?

De indeling gebeurt meestal op basis van fylogenie (= evolutieve verwantschap).

Criteria waarop men zich baseert voor een classificatie kunnen verschillen: ─

op basis van gemakkelijk te herkennen eigenschappen (gramkleuring, vorm…). Deze eigenschappen zijn genetisch stabiel en zijn goede indicaties van fylogenetische verwantschap.

─

Op basis van een biochemisch classificatiesysteem. Men gaat na over welke enzymes een species beschikt. Een dergelijke fylogenetische indeling voor bacteriën is terug te vinden in ‘Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology’. Dit werk bestaat uit een 30-tal secties, waar de namen en de beschrijving van de micro-organismen en ook tabellen en schema’s ter identificatie aan bod komen. Dit referentiewerk wordt in het labo vooral gebruikt ter identificatie van een onbekend isolaat.

─

Op basis van moleculaire eigenschappen. « Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology » geeft de fylogenetische indeling voor bacteriën volgens een moleculair classificatiesysteem. Dit werk (2nd edition) bestaat uit 5 volumes.

Men spoort verwantschap tussen organismen op met technieken die sequentiehomologie onderzoeken zoals DNA-DNA-hybridisatie, DNA-RNAhybrididatie, 16S rRNA sequentiebepaling, eiwitsequentiebepaling, eiwitelectroforese, vergelijking van nucleïnebasen (G-C gehalte en smelttemperatuur Tm: variatie binnen de soort bedraagt ˂ 10% en variatie tussen de genera ligt tussen 25 en 80%) Dit is het standaard referentiewerk voor bacteriologische classificatie.

Er is ook een digitale versie: ‘Bergey’s Manual of Systematics of Archae and Bacteria’. Hierdoor was het mogelijk om regelmatig updates toe te voegen.

Microbiologie Theorie

Pagina 16 van 154

1.5.3

Rang

Voorbeeld

Domein

Bacteriën

Phylum

Protobacteria

Klasse

Gamma-Protobacteria

Orde

Enterobacteriales

Familie

Enterobacteriaceae

Genus

Escherichia

Species

coli

Identificatiecriteria

Een identificatie kan pas gebeuren indien men beschikt over een reincultuur.

Reincultuur of kloon: culturen die volledig afstammen van 1 enkele cel. Er is maar 1 speciës aanwezig. Alle individuen zijn genetisch identiek.

Een reincultuur in een vloeibare voedingsbodem noemen we een broth. Een reincultuur op een vaste bodem in een petriplaat noemen we een kolonie.

In het labo kan men een reincultuur verkrijgen uit een staal via de aseptische overentingstechniek naar een vaste voedingsbodem, met behulp van de juiste uitstrijktechniek (een streepenting of zigzag-enting). Het doel is een maximaal aantal goed geïsoleerde kolonies te bekomen. Zie ook practicum microbiologie.

Meestal zal men d.m.v. een oognaald of een wisser het inoculum op ongeveer ¼ van het oppervlak (kwadrant) van de bodem uitwrijven. Dit is de felgeënte zone.

Door hieruit, en volgens een bepaald patroon, een aantal streepjes te trekken, wordt het inoculum steeds meer en meer verdund. Hoe meer streepjes, hoe meer geïsoleerde bacteriën men bekomt. Na incubatie groeit uit 1 geïsoleerde bacteriële cel een kolonie door mitose-delingen.

Figuur 4: Streepenting en zigzag-enting om geïsoleerde kolonies te verkrijgen.

Microbiologie Theorie

Pagina 17 van 154

Stam: culturen van een species primair geïsoleerd uit hun natuurlijke omgeving en die geen onderling verband kennen, noemt men stammen. Het is de kleinste eenheid die we binnen een soort kunnen onderscheiden. Een stam krijgt naast de naam dan ook soms een code.

Vb.

2 verschillende pathogene E. coli stammen: E. coli O157:H7 en E. coli O26:H11

Vb.

10 culturen Salmonella typhi afgezonderd op 10 verschillende plaatsen geven 10 onafhankelijke stammen

Vb.

2 verschillende patiënten waarbij men bij patiënt 1 uit ziekenhuis 1 uit een etterstaal en bij patiënt 2 uit ziekenhuis 2 uit een bloedstaal een Staphylococcus aureus isoleert. Hier zal het ook om 2 verschillende stammen gaan.

→ verschillende stammen met een zelfde naam krijgen een verschillend nummer.

Er is hier dan een ‘klein’ biochemisch of antigenisch verschil.

Een stam die aan het grootste aantal eigenschappen van een soort beantwoordt, wordt als type cultuur gekozen en in internationale collecties opgenomen zoals in de ATCC: American Type Culture Collection.

De stam krijgt hier een « ATCC nummer ».  uitgebreide catalogus met stammen van bacteriën, gisten, virussen

Stammen met dezelfde naam kunnen dus variëren: -

Biotypisch: verschillen in sommige biochemische reacties, maar behoren toch tot éénzelfde soort

-

Serotypisch: zijn enkel antigenisch verschillend. Vb. serotypering van Salmonella typhimurium.

Microbiologie Theorie

Pagina 18 van 154

1.6

G ESCHIEDENIS

VAN DE MICROBIOLOGIE

De microbiologie is ontstaan in de 17e eeuw.

1610 :

Galilei ontwikkelt een 3m lang toestel om kleine dieren en planten te observeren

1665 :

Robert Hooke publiceert « Micrographie » i.v.m. scheikunde en het gebruik van de voorloper van de microscoop. Kurk werd beschreven als bestaande uit compartimenten of “cellen”.

1674 :

Eerste beschrijving van m.o. door Antonie Van Leeuwenhoek. Hij ontwikkelt de enkelvoudige microscoop (300x). Hij ziet voor het eerst bacteriën en protozoa. Hij sprak over ‘kleijne diertgens’.

Figuur 5: Enkelvoudige microscoop van ‘Van Leeuwenhoek’ http://www.museumboerhaave.nl

De allereerste microbiologische onderzoekers hielden zich bezig met de vraag naar het ontstaan van de kleine organismen op aarde en deze in een bouillon.

1675-1864 :

Controverse omtrent het ontstaan van m.o. in bouillon, blootgesteld aan de lucht:

Als men een bouillon een tijdlang aan de lucht blootstelt, wordt hij troebel. Een microscopisch onderzoek wijst op de aanwezigheid van m.o.

Microbiologie Theorie

Pagina 19 van 154

spontaan: ontstaan uit levenloze materie: “Generatio spontanea” ↕ m.o. afkomstig van de lucht

Zo geloofden de aanhangers van de theorie van de spontane generatie ook dat vliegen konden ontstaan uit kadavers van rundvee en dat in vochtige kelders, in potten gevuld met graan, spontaan muizen gevormd werden.

1864 :

Einde aan de controverse door Louis Pasteur: experiment met zwanenhalskolf

Na koken van een bouillon (suiker + gistextract + urine …) in een zwanenhalskolf, kan de lucht vrij naar binnen, de microben uit de lucht blijven steken in de bocht (als de kolf recht blijft, blijft de bouillon helder, dus kiemvrij). Als de kolf zwenkt, komt de bouillon in de bocht en binnen enkele uren is de bouillon troebel.

Figuur 6: Moderne versie van Pasteurs zwanenhalskolf, Lab microbiologie Stanford University

Conclusie: geen spontane generatie!

Pasteur is uiteraard eveneens de grondlegger van de ‘pasteurisatie’. Pasteurisatie is het vernietigen van schadelijke micro-organismen in voedingsmiddelen d.m.v. hitte. Pasteur is een chemicus en ontdekt dat m.o. instaan voor chemische omzettingen in bouillons en vruchtensappen en ook voedselbederf kunnen veroorzaken.

Pasteur doet verder ook pionierswerk omtrent het vaccin tegen rabiës.

Een vaccin kan bestaan uit een verzwakt pathogeen micro-organisme. Bij injectie Microbiologie Theorie

Pagina 20 van 154

hiervan bij de mens, treedt het immuunsysteem in gang en worden er uiteindelijk gepaste antilichamen aangemaakt door de plasmacellen. Bij een volgend contact met de pathogeen zijn de antilichamen snel beschikbaar. Aangezien het lichaam zelf de antilichamen aanmaakt spreekt men hier van ‘actieve immunisatie’, zoals bij het griepvaccin (influenza-virus). Dit is ook het geval wanneer een oppervlakte-eiwit (antigen) zoals bij het hepatitis B vaccin of een geneutraliseerd toxine zoals bij het tetanusvaccin wordt toegediend (toxine van Clostridium tetani bacterie). Vaccinatie tegen het SARS-CoV-2-virus gebeurt m.b.v. mRNA dat codeert voor een spike-eiwit (vb. Pfizer, Moderna) of m.b.v. genetisch gemanipuleerde adenovirussen die informatie bevatten voor het spike-eiwit (vb. Astra Zenica, Johnson & Johnson).

Men spreekt van passieve immunisatie echter wanneer men een antiserum bevattende specifieke antilichamen toedient aan de patiënt die op dat moment een risico loopt op een infectie. Het immuunsysteem moet op dat moment niet reageren op de mogelijke pathogeen die het lichaam binnendrong. Passieve immunisatie wordt wel eens uitgevoerd bij patiënten met een risico op tetanus of botulisme.

1870 :

Lister is de grondlegger van de desinfectie. (ontsmetting van operatiewonden)

1877 :

Tyndall constateert dat thermoresistente sporen bestand zijn tegen het koken (Bacillus en Clostridium – geslachten)

1880 :

Koch ontwikkelt vaste voedingsbodems voor bacteriën. Dit vormt de basis voor isolatietechnieken en de kweek van reinculturen. Kolonies worden nu getrokken op gelatinebodems.

Koch formuleert postulaten die aangeven wanneer een causaal verband gelegd mag worden tussen een ziekte en een verwekker.

1. De verwekker moet bij ieder geval van de ziekte aantoonbaar zijn 2. De verwekker moet kunnen worden geïsoleerd en in reincultuur worden gekweekt 3. De reincultuur moet bij elk dier dezelfde ziekte teweegbrengen 4. De verwekker moet waarneembaar zijn in ieder experimenteel ziek gemaakt dier en bij sectie uit dat dier kunnen worden geïsoleerd

Microbiologie Theorie

Pagina 21 van 154

Figuur 7: Illustratie van de Postulaten van Koch, Pearson Education

Koch ontdekt 3 pathogene bacteriën: -

Bacillus anthracis: miltvuur Mycobacterium tuberculosis: tbc Vibrio cholerae: cholera

1928 :

Fleming ontdekt penicilline, afkomstig van de schimmel Penicillium en blijkt werkzaam tegen Staphylococcus aureus.

1937 :

Chatton voert de term ‘prokaryoot’ in om cellen aan te duiden zonder zichtbare kern.

1939 :

Met behulp van de electronenmicroscoop zijn virussen voor het eerst zichtbaar.

Microbiologie Theorie

Pagina 22 van 154

1969 : Whittaker: 5-rijkensysteem

─ ─ ─ ─ ─

de Monera (prok) de Protista (euk) de Fungi (euk) de Plantae (euk) de Animalia (euk)

Virussen

1978 : Woese: 3 domeinen i.p.v. 2

─ ─ ─

de Eubacteriën de Archaeobacteriën de Eukaryoten : Protista, Fungi, Plantae, Animalia

Virussen

1.7

DRIE

1.7.1

Bacillus anthracis

B A C T E R I Ë N G EÏ S O L E E R D D O O R

KOCH

Sinds 11 september 2001 is anthrax heel bekend bij het publiek. Er werden brieven geadresseerd aan o.a. Tom Brokow van NBC News en editor van de ‘New York Post’, met de tekst: This is next Take Penicillin Now Death to America

In de omslagen zat een poeder met endosporen van Bacillus anthracis. De V.S. werden bedreigd door een biologische aanval van de anthrax bacterie.

Bacillus anthracis is de verwekker van miltvuur (anthrax), een ziekte voor mens en dier. Het is een aërobe, gram-positieve staafvormige bacterie (paars, Gramkleuring) die in ongunstige omstandigheden endosporen (bacterie: rood; endospore: groen, endosporekleuring) vormt. (cfr. practicum microbiologie)

Microbiologie Theorie

Pagina 23 van 154

Figuur 8: Endosporekleuring, uitstrijkje, Bacillus sp., www.microbelibrary.org

Dieren (vee, schapen, geiten) worden besmet ─ ─ ─

wanneer sporen van op de grond in wonden (huid, mond) terechtkomen wanneer sporen in het gastro-intestinaal stelsel terechtkomen bij het grazen door het eten van miltvuurkadavers

Mensen worden besmet bij uitgebreid contact met besmet vlees of dierlijke produkten (slachthuispersoneel, wolbewerkers, leerlooiers, eters van onvoldoende verwarmd besmet vlees)

Bacillus anthracis veroorzaakt: ─

─ ─ ─

Een cutane vorm met vorming van pustula maligna, een pijnloze pustel met centrale zwarte korst en errond roodheid en oedeem. Dit komt vaak voor op de handen en armen van slachthuispersoneel door contact met besmet vlees.

Een pulmonaire vorm door inademing van sporen (leerlooiers, wolbewerkers, poeders met sporen) Een gastro-intestinale vorm door eten van zwaar besmet en onvoldoende verwarmd vlees.

Wanneer de bacterie in de bloedbaan terecht komt (bacteriëmie), kan deze verschillende organen bereiken en aantasten: hoge koorts, koude rillingen, sterke moeheid, anorexia, bloedingen, degeneratieve orgaanverschijnselen.

De bacterie is virulent wegens de aanwezigheid van een kapsel waardoor fagocytose wordt verhinderd. Bacillus produceert ook toxines. De infectie kan aangetoond worden na afname van bloedculturen, gevolgd door kweek en microscopie. In een serumstaal kan men via immunologische technieken (ELISA) antigenen aantonen.

De preventie van deze ziekte  

bestaat in het vernietigen van besmette kadavers (sporen) en het afbranden van de weide.

Vaccin (verzwakte stam) Microbiologie Theorie

Pagina 24 van 154

De behandeling bestaat uit de toediening van antibiotica (penicilline).

1.7.2

Mycobacterium tuberculosis

De bacil van Koch is een zuurvaste, strikt aërobe, grampositieve staafvormige bacterie. De celwand bevat een laag vetachtig, wasachtig materiaal waardoor de bacterie zeer resistent is tegen omgevingsfluctuaties. De bacterie wordt microscopisch aangetoond in sputumstalen na een zuurvaste kleuring (= ZiehlNeelsen-kleuring). De kweek op voedingsbodems vergt een aantal weken. PCR wordt dan ook vaak aangewend voor een snelle diagnose.

Figuur 9: Mycobacterium tuberculosis na Ziehl-Neelsen kleuring; 1000X. phil.cdc.gov

Figuur 10: Lowenstein-Jensen plaat met Mycobacterium spp.

Mycobacterium is de verwekker van tuberculose.

De besmetting gebeurt door inademing van besmette stofdeeltjes of speekseldruppeltjes (praten, hoesten, lachen).

Na inhalatie komen de bacillen van Koch in de longalveoli terecht, waar ze door macrofagen worden gefagocyteerd. Vervolgens gaan ze zich in de macrofagen Microbiologie Theorie