Western blot

13 mars 2017

Western-Blot

Western-Blot BERCIER PIERRE - CHAILLOT LAURA - MENNESSIER VALENTINE – TOURNEUR-MARSILLE JULIEN

13/03/2017

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Table des matières 1.

INTRODUCTION

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CHAPITRE 1: POURQUOI UTILISER UN WESTERN BLOT?

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CHAPITRE 2: ÉCHANTILLONS, GELS ET BUVARDAGE

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ELECTROPHORESE EN GEL LA PREPARATION DES ECHANTILLONS LYSATS CELLULAIRES : ÉCHANTILLONS DE TISSUS : EXTRAITS PURIFIES OU SEMI-PURIFIES : DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN PROTEINES : TAMPON DE CHARGEMENT : CONTROLES ET NORMES : SEPARATION DES PROTEINES A UN TRANSFERT PAR WESTERN BLOTTING DE LA MEMBRANE : MEMBRANES DE BLOTTING : CONFIGURATION DU TRANSFERT : TAILLE DE LA PROTEINE CIBLE : CONFIRMATION DU TRANSFERT :

7 8 8 9 10 10 10 11 11 13 13 13 14

CHAPITRE 3: IMMUNODETECTION

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IMMUNODETECTION: BLOCAGE ET INCUBATION D'ANTICORPS BLOCAGE : INCUBATION D'ANTICORPS : DETECTION INDIRECTE VS. DETECTION DIRECTE :

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CHAPITRE 4: ANALYSE DES DONNEES

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DONNEES QUANTIFICATION : NORMALISATION : DENSITOMETRES ET LOGICIELS D'ANALYSE :

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CHAPITRE 5: TAMPONS DE WESTERN BLOT

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TAMPONS : TAMPON DE LYSE : ÉLECTROPHORESE ET TAMPONS DE TRANSFERT : TAMPONS DE LAVAGE : TAMPON DE BLOCAGE :

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CHAPITRE 6 : PROTOCOLES

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LYSE DE CELLULES DE MAMMIFERES : ELECTROPHORESE EN GEL ET TRANSFERT DE PROTEINES :

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CHAPITRE 7 : WESTERN BLOT DEPANNAGE

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BANDES INHABITUELLES OU INATTENDUES

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1. Introduction Western blot, également connu sous le nom d’immunoblotting ou de transfert de protéines, est une technique de base en biologie cellulaire et moléculaire. Dans la plupart des manipulations de base, il est utilisé pour détecter la présence d'une protéine spécifique dans un mélange complexe extrait des cellules. Comme le montre la figure 1 ci-dessous, la procédure de Western-blot repose sur trois éléments clés : la séparation des protéines par taille en utilisant une électrophorèse sur gel ; Le transfert efficace de protéines séparées à un support solide ; Et la détection spécifique d'une protéine cible par des anticorps. Une fois détectée, la protéine cible sera visualisée sous la forme d'une bande sur une membrane de transfert, un film de rayons X ou un système d'imagerie.

Figure 1: Séparation des mélanges de protéines par électrophorèse; Transfert sur la membrane de buvardage; Et la détection de la protéine cible, qui ne devient visible dans l'étape finale que sous la forme d'une bande semblable à celle montrée dans la piste 3.

Piste 1: Marqueur de poids moléculaire ; Pistes 2 et 3: mélanges de protéines

Étant donné que la technique est rapide, en utilisant un équipement simple et des réactifs peu coûteux, c'est l'une des techniques de laboratoire les plus courantes. Les résultats obtenus sont également faciles à interpréter, uniques et sans ambiguïté.

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Chapitre 1: Pourquoi utiliser un Western Blot?

Le western blot est une technique extrêmement puissante, en dépit de sa simplicité générale, car elle fournit des informations supplémentaires qui ne sont pas facilement recueillies à partir d'autres techniques de laboratoire. Puisque les protéines sont séparées par la taille au cours de l'étape d'électrophorèse sur gel, puis détectées par un anticorps dirigé spécifiquement, la procédure confirme essentiellement l'identité d'une protéine cible.

En outre, lorsque les données ne correspondent pas aux attentes, il peut y avoir des indices quant à ce qui devrait être étudié pour déterminer la raison. Est-ce que la bande de poids moléculaire est inférieure ou supérieure à celle prévu? Y a t-il un seul groupe, ou y a t-il plusieurs groupes? Une bande plus petite que prévu pourrait indiquer que la protéine a été clivée ou est dégradée.

Inversement, lorsque les bandes sont révélées à des niveaux plus élevés que prévu, cela peut indiquer une augmentation réelle de masse due à la glycosylation ou à la formation de multimères.

L'épissage alterné peut également provoquer des variations de taille inattendues, tout comme la combinaison particulière d'acides aminés chargés présents dans la protéine.

Piste 1: Bande de protéine cible au poids moléculaire attendu. Pistes 2 et 3: modifications courantes qui modifient la masse moléculaire

Les Western blots sont largement utilisés dans un large éventail de disciplines scientifiques et cliniques. Leur capacité à montrer clairement la présence d'une protéine spécifique à la fois par la taille et par la liaison d'un anticorps les rend bien appropriés pour évaluer les niveaux d'expression des protéines dans les cellules et pour surveiller les fractions pendant la purification des protéines.

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De même, ils sont utiles pour comparer le niveau de production d'une protéine cible à partir de divers tissus, ou de voir comment une protéine particulière répond à une maladie ou un traitement médicamenteux. Dans de nombreux cas, les Western sont utilisés en combinaison avec d'autres techniques de détection basées sur des anticorps clés, telles que ELISA ou immunohistochimie.

Dans ces cas, les Western confirment les résultats de la recherche et des tests de diagnostic. Par exemple, avec le VIH et la maladie des prions, les Westerns sont utilisés comme un écran supplémentaire clé, car leurs résultats sont moins ambiguë, et plus rapide, que d'autres méthodes.

Dans l'avenir, les transferts de Western-blot continuent d'être utiles pour confirmer les résultats des matrices d'anticorps, ce qui les rend aptes à être utilisés dans la recherche sur la protéomique. Les résultats spécifiques et l'analyse des données seront traités plus en détail au chapitre 4.

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Chapitre 2: Échantillons, gels et buvardage Un Western-blot typique, ou immunoblot, repose sur un extrait purifié, semi-purifié ou brut de protéines cellulaires contenant une protéine cible qui peut être détectée par des anticorps. Plusieurs étapes clés sont nécessaires pour amener l'échantillon du point de départ cellulaire à une bande détectable sur une membrane de Western-blot.

Ce chapitre se concentre sur les étapes préparatoires qui sont accomplies avant l'immunodétection par des anticorps. Tout au long de ces processus, il est essentiel que la protéine cellulaire soit préparée et stockée avec soin, car cela aura un impact significatif sur les résultats expérimentaux.

Les trois étapes clés de la préparation sont les suivantes: 1. Production d'échantillons par lyse ou homogénéisation pour solubiliser et libérer les protéines.

2. Séparation des mélanges de protéines par électrophorèse sur gel.

3. Transfert de protéines séparées sur une membrane par buvardage qui peut être manipulée plus facilement qu'un gel.

Figure 5: Préparation des échantillons, électrophorèse et transfert

Les transferts de Western sont efficaces pour détecter des quantités de nanogrammes à faibles picogrammes de protéine cible, en fonction des anticorps utilisés et du substrat de détection choisi.

Si l'on suspecte que la cible est d'une abondance très faible, ou s'il n'y a pas de signal détectable sur l'empreinte, alors il peut être nécessaire de concentrer, d'immunoprécipiter ou de fractionner la matière de départ.

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Electrophorèse en gel

Après que les échantillons ont été préparés, ils sont séparés par taille en utilisant une electrophorèse en conditions SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium).

Puisque les échantillons ont été dénaturés dans un tampon de charge de gel contenant du détergent SDS, la protéine est chargée négativement uniformément et va maintenant migrer dans un champ électrique à travers le gel et vers l'électrode positive. Puisque le rapport charge / masse est égalisé par la liaison de SDS de manière cohérente le long de la longueur des protéines, et qu'une structure plus élevée a été éliminée, les protéines seront séparées principalement par la taille. La clé est d'effectuer une séparation telle que la protéine cible soit correctement résolue à partir des autres composants du mélange. Cela permet d'identifier clairement la protéine cible plus tard par immunodétection avec un anticorps spécifique.

Les gels de SDS-PAGE (commercialement fournis ou fabriqués en interne) sont habituellement constitués d'un gel principal qui est versé entre deux plaques de verre ou de plastique et qui est parfois surmonté d'un gel de concentration court. Les gels peuvent être fabriqués avec un pourcentage d'acrylamide uniforme ou avec un gradient variable en continu qui donne une résolution améliorée sur une gamme plus large de poids moléculaires. Voir le tableau ci-dessous pour certains pourcentages de gel courants et pour leurs intervalles de séparation.

Le tableau suivant décrit la résolution des gels de polyacrylamide en fonction de leur concentration en acylamide/bis-acrylamide : Acrylamide Concentration (%)

Plage de séparation (kDa)

5

60-210

7.5

35-95

10

15-70

15

4-45

4-12

5-200

4-20

4-200

10-20

3.5-110

Le pourcentage et l'épaisseur du gel affecteront le transfert des protéines hors du gel dans la phase de buvardage, de sorte qu'utiliser un gel plus mince, ou un pourcentage plus faible d'acrylamide, peut améliorer les résultats de transfert.

Un pourcentage en acrylamide plus faible rend cependant le gel bien plus mou et augmente les chances de cassures de ce dernier lors de son application sur la membrane.

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De petits volumes de protéine (5-20 ml) dissous dans un tampon de charge sont ajoutés à chaque puits individuellement. Le gel est ensuite connecté à une source électrique et laissée pendant quelques heures pour séparer les protéines. Si le gel est soumis à une tension trop élevée, il surchauffera et déformera les bandes. Le gel de séparation est coloré avec du bleu de Coomassie pour visualiser toutes les bandes de protéines séparées.

Figure 7: Lysats de cellules HeLa (LYS001) Séparés sur un gel de gradient de 4-12%

La préparation des échantillons

Lysats cellulaires : Les lysats cellulaires bruts sont la source directe la plus courante de matière de départ utilisée dans le Western Blot. Ils peuvent être préparés à partir de lignées cellulaires immortalisées connues pour exprimer la protéine cible, ou à partir de cellules transfectées portant un vecteur d'expression protéique. De nombreux types cellulaires différents (mammifères, insectes, levures ou bactéries) peuvent être utilisés pour fournir la protéine nécessaire avec de légères variations dans la procédure de préparation.

Dans la plupart des cas, les cellules sont récoltées, lavées avec une solution saline et lysées pour libérer la protéine cible. Pour de meilleurs résultats, toutes ces étapes doivent être effectuées dans une chambre froide, ou sur la glace. Ceci minimisera la protéolyse, la déphosphorylation et la dénaturation, puisque tout commence à se produire une fois que les cellules sont perturbées. Il est possible de simplement lyse des cellules directement dans le tampon de chargement de gel si une

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vérification rapide est tout ce qui est nécessaire. La sonication peut être nécessaire pour perturber l'ADN cellulaire hautement visqueux. Habituellement, 20 à 50 mg de lysat cellulaire sont chargés par puits pour l'électrophorèse sur gel.

Le choix du tampon de lyse approprié et la détermination d'un volume approprié est souvent un processus d'essai et d'erreur qui est affecté par le type de protéine isolée ainsi que les cellules particulières utilisées comme source. Les tampons de lyse varient de très doux sans détergent à des solutions plus dures telles que le tampon rIPA (radio Immuno Precipitation Assay), qui est dénaturant et contient de multiples détergents.

Typiquement, le tampon de lyse NP-40 (Nonidet P-40), avec un détergent non ionique plus doux, est utilisé pour l'isolement de protéines cytoplasmiques solubles. D'autres fois, le tampon rIPA est choisi parce que parfois des détergents multiples sont nécessaires pour libérer complètement des protéines liées à la membrane ou nucléaires.

Il faut également tenir compte de l'interaction anticorps-antigène qui peut être affectée par les changements de la protéine cible pendant la lyse.

La quantité de tampon de lyse est déterminée sur la base d'un nombre de cellules, ou bien elle est estimée sur la base de la taille du récipient de culture tissulaire.

Parfois, une perturbation mécanique, par exemple avec une sonication ou une homogénéisation douce, est nécessaire pour libérer complètement les protéines de certains échantillons de cellules et de tissus. La sonification est également utilisée pour décomposer l'ADN cellulaire qui peut interférer soit en raison de sa viscosité élevée, soit par liaison non spécifique. Après lyse et centrifugation, la quantité de protéine dans chaque lysat est mesurée.

Échantillons de tissus : Les échantillons de tissus présentent un degré de structure plus élevé que les cellules cultivées et peuvent donc nécessiter des niveaux d'intervention mécanique plus élevés pour libérer la protéine d'intérêt. Ils peuvent également contenir des types cellulaires multiples qui sont différentiellement sensibles au tampon de lyse choisi.

Des petits échantillons de tissus solides (jusqu'à 100 mg) sont placés dans un tampon d'extraction refroidi par de la glace et homogénéisés sur de la glace, habituellement avec sonication ou une tige de diffusion pour faciliter la rupture cellulaire.

En variante et plus souvent avec des échantillons de tissus plus gros, on utilise un mélangeur pour homogénéiser le tissu dans PBS, puis on ajoute un tampon de lyse cellulaire. Une fois que le tissu a été homogénéisé et lysé, les composants cellulaires solubilisés sont clarifiés par centrifugation et testés pour déterminer la concentration en protéines avant le chargement sur un gel.

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Extraits purifiés ou semi-purifiés : La source la plus simple de matière de départ pour le Western est des échantillons protéiques purifiés ou semi-purifiés qui sont produits au cours de la purification des protéines. Ces échantillons nécessitent rarement une manipulation supplémentaire et sont simplement mélangés avec un tampon de chargement d'électrophorèse sur gel (tampon d'échantillon Laemmli).

Lorsqu'on utilise une préparation de protéine purifiée ou semi-purifiée, il est possible de charger une quantité beaucoup plus petite de protéine totale sur le gel. Habituellement 0, 5-1 mg de protéine purifiée ou semi-purifiée est suffisante pour observer un signal fort. En cas de doute, les résultats peuvent être améliorés en chargeant plusieurs dilutions de l'échantillon.

Détermination de la concentration en protéines : Pour s'assurer que les échantillons sont dans la plage de détection appropriée pour le dosage, et qu'ils peuvent donc être comparés sur une base équivalente, il est important de connaître la concentration de protéine totale dans chaque échantillon. Il existe diverses méthodes pour déterminer la concentration en protéines en utilisant des kits et des réactifs fournis en interne ou commercialement.

La méthode la plus simple consiste à mesurer l'absorbance de la solution de lysat à 280 nm ou 205 nm. En variante, on dispose de plusieurs dosages de protéines qui reposent sur la réduction d'ions métalliques par la liaison peptidique, par exemple, Les analyses Lowry et BCA; Ou par liaison de colorant, comme avec le dosage de Bradford.

Dans tous les cas, un changement de couleur résulte proportionnel à la quantité de protéine dans l'échantillon. La concentration en protéines est déterminée par comparaison des échantillons cibles à un étalon connu, tel que BSA (Bovine Serum Albumin) diluée dans un tampon de lyse. Pour obtenir la mesure la plus précise de la concentration en protéines, il est conseillé de tester quelques dilutions de l'échantillon en s'assurant que les résultats se situent dans la plage linéaire du dosage de la protéine.

Tampon de charge : Une fois que la concentration de protéine a été déterminée, les échantillons sont dilués dans un tampon de chargement de gel, également appelé tampon d'échantillon Laemmli. Ce tampon contient du glycerol de sorte que les échantillons tombent facilement dans les puits du gel et un colorant de suivi (bleu de bromophénol) qui migre à travers le gel pour indiquer d'abord dans quelle mesure la séparation a progressé.

Pour la plupart des transferts de Western classiques, le SDS (dodécylsulfate de sodium) et un agent réducteur sont également présents dans le tampon de charge de gel / échantillon pour dénaturer complètement la protéine et éliminer toute structure d'ordre supérieur.

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Les échantillons sont chauffés pendant 5 minutes à 100 ° C ou 10 minutes à 70 ° C pour faciliter la dénaturation. À ce stade, les échantillons peuvent rester à température ambiante s'ils doivent être utilisés immédiatement ou être placés à 4 ° C ou -20 ° C pour une analyse ultérieure.

Contrôles et normes : Il peut être très utile d'inclure un contrôle positif et un contrôle négatif sur le gel avec les échantillons qui sont étudiés. Pour un témoin positif, il est typique d'utiliser une source connue de protéine cible, telle qu'une protéine purifiée ou un lysat témoin, dans des conditions où elle sera détectable par l'anticorps utilisé dans l'expérience.

Le témoin positif est important pour confirmer l'identité de la cible puisqu'il produira une bande de référence sur l'empreinte montrant la migration attendue de la protéine cible et confirmant l'activité des anticorps. Les contrôles positifs sont également utiles pour la comparaison des données entre les blots séparés.

Les lysats cellulaires et tissulaires Premade sont maintenant disponibles dans le commerce chez un certain nombre de fournisseurs et peuvent être utilisés comme un contrôle positif.

Si possible, il est également utile d'inclure un témoin d'échantillon négatif, tel qu'une lignée de cellules nulle connue, comme un moyen de confirmer que le signal est spécifique à la protéine souhaitée.

Transferpar Western Blotting de la membrane : Après électrophorèse sur gel, les mélanges protéiques séparés sont transférés sur un support solide pour une analyse ultérieure. Bien qu'il soit possible d'utiliser un transfert assisté par diffusion ou sous vide, l'électroblotage (Towbin et al., 1979) est la méthode utilisée dans la plupart des laboratoires, en raison de la vitesse et de l'efficacité du transfert.

Le champ électrique utilisé pour le transfert est orienté perpendiculairement à la surface du gel, provoquant la sortie des protéines du gel et sur la membrane de buvardage, qui repose entre la surface du gel et l'électrode positive. Le gel et la membrane de buvardage sont assemblés en sandwich avec plusieurs feuilles de papier filtre qui protègent le gel et la membrane de buvardage et aident à assurer un contact étroit entre leurs surfaces.

Il est impératif que la membrane soit placée entre le gel et l'électrode positive de sorte que les protéines négativement chargées migrent du gel sur la membrane. Le tampon de transfert utilisé pour l'électroblotage est similaire au tampon de migration avec l'addition de methanol qui aide les protéines à se lier au transfert. Le transfert électrophorétique peut être réalisé dans des conditions humides ou semi-sèches. Dans un transfert par voie humide, le sandwich gel / papier buvard / papier filtre est placé dans une cassette avec des tampons de fibres protectrices. La cassette est ensuite immergée dans un réservoir tampon et soumise à un champ électrique.

Avec un transfert semi-sec, le sandwich papier / papier filtre / filtre est assemblé sur de grandes plaques d'électrodes qui génèrent le champ électrique, et le tampon est confiné dans un empilement de papiers filtrants humides.

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Les temps de transfert varient de 1 heure (transfert semi-sec) à plusieurs heures ou pendant la nuit (transfert humide). Le transfert humide est généralement considéré comme plus fiable car il est moins susceptible de dessécher le gel et est souvent préféré pour les protéines de plus grande taille.

Puisqu'il y aura une variation importante dans le système de transfert choisi, il est préférable de consulter le fabricant de l'équipement utilisé pour des instructions spécifiques.

Figure 8 : Schéma du montage de transfert du Western-Blot

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Membranes de Blotting : Le support solide sur lequel les protéines séparées sont transférées est habituellement de deux types, la membrane de nitrocellulose ou de fluorure de polyvinylidène (PVDF), qui tous deux se lient aux protéines avec une affinité élevée.

La nitrocellulose est utilisée depuis longtemps et est parfois préférée en raison de ses excellentes capacités de fixation et de rétention des protéines. Cependant, la nitrocellulose est fragile et, par conséquent, elle est généralement moins efficace lorsque les transferts doivent être réutilisés.

Le PVDF démontre une résistance mécanique supérieure le rendant approprié pour le stripping / reprobing et pour d'autres techniques de caractérisation de protéines, telles que le séquençage et la protéolyse. Parfois, une coloration de fond plus élevée est observée avec les membranes PVDF, et des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter que cela ne se produise.

Configuration du transfert : Tandis que le gel s'équilibre dans le tampon de transfert, la membrane de transfert est préparée.

Souvent, la membrane de buvardage est fournie précoupée à la taille, ou bien elle est découpée avec précision pour correspondre à la taille du gel. Comme les huiles présentes sur les mains interfèrent avec le signal sur la membrane de buvardage, il est conseillé de porter des gants lors de la manipulation de la membrane de buvardage. Habituellement, un angle est marqué pour une orientation ultérieure, bien que cela ne soit pas nécessaire lorsque l'on utilise des marqueurs de poids moléculaire pré-tachés dans une des voies latérales.

Avant l'assemblage dans l'appareil de transfert, la membrane de buvardage est pré-humidifiée. La nitrocellulose est pré-humidifiée par flottation, puis immergée dans du H20 ou un tampon de transfert, et le PVDF est pré-humidifié dans du methanol. Les deux types de membrane sont ensuite trempés dans un tampon de transfert et appliqués directement sur la surface du gel. Il est extrêmement important qu'aucune bulle d'air ne soit laissée entre la surface du gel et la membrane de buvardage, étant donné que les bulles d'air vont perturber le transfert de toutes les protéines dans cette zone faussant les résultats.

Les bulles d'air peuvent être facilement retirées en poussant doucement sur la surface avec une spatule. Il est sage de vérifier l'orientation du gel et de la membrane buvardée par rapport à l'électrode positive de sorte que les protéines migrent dans la bonne direction.

Taille de la protéine cible : La taille de la protéine cible doit être prise en compte lors du choix des conditions de transfert.

Généralement, des protéines plus petites se transféreront hors du gel plus rapidement, et peuvent effectivement se transférer à travers la membrane de buvardage dans les papiers filtrants au-delà.

Des membranes de transfert avec une taille de pores plus petite peuvent être utilisées pour de petites protéines et peptides, et la SDS peut être réduite ou éliminée du tampon de transfert pour améliorer la liaison à la membrane.

Si l'on soupçonne que la protéine est transférée à travers la membrane, une deuxième membrane peut être incluse derrière la première pour capturer les protéines qui migrent à travers. En revanche, de grandes protéines peuvent être plus lentes à éluer et peuvent être retenues dans le gel, de sorte que le transfert par voie humide pendant la nuit est habituellement préféré. Bolt et al. ont développé

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des tampon qui améliorent l'efficacité du transfert dans une gamme de tailles de protéines, y compris de très grandes protéines.

Confirmation du transfert : Une fois l'étape de buvardage terminée, l'appareil est soigneusement démonté et le succès du transfert est évalué. La méthode la plus simple de confirmer le transfert consiste à noter l'apparition de marqueurs préservés sur le transfert par rapport au gel.

Une méthode plus fiable pour confirmer le transfert est l'utilisation d'une tache réversible qui identifie la présence de bandes de protéines directement sur la membrane. Ponceau S, une tâche rouge appliquée dans une solution acide, est généralement utilisé à cette fin parce qu'il est compatible avec tous les types d'étiquettes d'immunodétection et de substrats.

La procédure est très simple à utiliser et donne des résultats en environ 10 minutes. Lorsqu'on utilise des étalons moléculaires non marqués, il est nécessaire de marquer directement la position des étalons de poids moléculaire sur la tache lorsqu'ils deviennent visibles avec le colorant Ponceau S puisqu'ils seront nécessaires pour référence ultérieure.

Figure 9: Blot Western Bloc coloré de Ponceau S de lysats cellulaires HeLa (LYS001) Il existe plusieurs méthodes alternatives qui peuvent être utilisées à la place de Ponceau S coloration.

Une option est d'utiliser une tache d'ion métallique, comme le cuivre, ou la tache de chélate de métal. Une autre option est de tacher l'empreinte à l'encre de l'Inde, qui est très sensible, peu

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coûteux et fiable. Cependant, comme l'encre d'Inde crée un enregistrement permanent, elle obscurcit le signal provenant des réactifs de détection colorimétrique.

La coloration de bleu de Coomassie n'est pas typiquement utilisée directement sur un transfert de Western avant l'immunodétection; Au contraire, il est parfois utilisé pour tacher le gel après le transfert afin d'identifier ce qui reste derrière.

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Chapitre 3: Immunodetection Après le buvardage, la protéine cible est détectée en utilisant des anticorps appropriés appariés et marqués. L'étape typique d'immunodétection implique quelques étapes de base: Blocage - Le transfert contenant les bandes de protéines transférées est incubé avec une protéine ou une solution détergente qui recouvre toute la surface de sorte que les anticorps ne se lient pas spécifiquement à la membrane.

Incubation d'anticorps - L'anticorps marqué se lie à la bande de protéine cible présente sur le transfert dans une procédure en une étape ou en deux étapes.

Détection avec le substrat - L'étiquette fixée à l'anticorps, habituellement une enzyme telle que HrP (peroxydase de raifort), est détectée en utilisant un substrat qui produit un signal visible correspondant à la position de la protéine cible.

Figure 10: Vue d'ensemble de l'immunodétection. Le transfert de Western est bloqué, incubé avec des anticorps et traité avec un substrat pour rendre visible la protéine cible. Des étapes de lavage sont réalisées entre les incubations pour éliminer l'excès de matériau non lié et pour minimiser le signal non spécifique sur l'immunoblot.

Immunodetection: Blocage et Incubation en présence d’anticorps Blocage : Le blocage est une étape très importante dans la phase d'immunodétection du Western blot car il empêche la liaison non spécifique d'anticorps à la membrane de buvardage. Les solutions de blocage les plus couramment utilisées contiennent 3 à 5% de BSA ou de lait séché non gras (également appelé Blotto ou BLOTTO) dans une solution de PBS (solution saline tamponnée au phosphate) ou TBS (solution saline tampon tris). Souvent, une petite quantité de détergent Tween®20 est ajoutée aux solutions de blocage et de lavage pour réduire la coloration de fond, et le tampon est connu sous le nom de PBST ou TBST. Lorsqu'on choisit entre ces tampons, il est important de noter que le TBS / TBST est préféré avec des anticorps marqués à l'AP (Alkaline Phosphatase), car le PBS interfère avec le signal AP.

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Le lait en poudre non gras est considéré comme un bon point de départ lors du choix d'une solution de blocage car il est peu coûteux et très utilisé. Cependant, les protéines du lait ne sont pas compatibles avec toutes les étiquettes de détection, il faut donc prendre soin de choisir la solution de blocage appropriée pour les anticorps, les tampons et les réactifs de détection. Par exemple, des solutions de blocage contenant de la BSA sont préférées avec des marqueurs d'anticorps de biotine et d'AP, et des anticorps anti-phosphoprotéine.

C'est parce que les solutions de lait contiennent de la caséine, qui est elle-même une phosphoprotéine, et la biotine, ainsi il interférera avec les résultats d'essai. Des solutions de blocage fournies commercialement, telles que l'anticorps Block Ace (BUF029) de Bio-Rad, sont très commodes à utiliser et peuvent améliorer la cohérence des résultats, en particulier lorsqu'un signal de fond non spécifique est un problème.

Après le blocage, la membrane est rincé dans du tampon de lavage, habituellement TBST, avec agitation douce et en volume suffisant pour maintenir le transfert immergé. Veuillez consulter le chapitre 5 pour des protocoles détaillés.

Incubation d'anticorps : Après le blocage et le lavage, la membrane est incubé dans une solution diluée d'anticorps, habituellement pendant quelques heures à température ambiante ou toute une nuit à 4 ° C. L'anticorps est dilué dans un tampon de lavage (PBST ou TBST) ou une solution de blocage diluée, le choix dépend de l'anticorps.

Par exemple, les anticorps purifiés sont habituellement dilués à une concentration finale de 1-10 mg / ml. La fiche technique du fabricant doit fournir des recommandations de dilution pour une préparation particulière. Cependant, il est préférable de tester une gamme de dilutions avec chaque nouvel anticorps, en optimisant les conditions pour les échantillons considérés. On peut utiliser des ponctuations, des traces de fentes ou des taches de test (voir la fin de ce chapitre) pour contrôler diverses concentrations d'anticorps.

Il est essentiel que toutes les étapes d'immunodétection (blocage, incubation d'anticorps, incubation du substrat et tous les lavages intermédiaires) aient un volume suffisant et une agitation douce pour maintenir le buvard uniformément exposé aux réactifs sans sécher pendant tout le processus.

Détection indirecte vs. détection directe : La détection d'anticorps de la protéine cible est réalisée en utilisant un protocole en une ou deux étapes. La procédure en une étape, la détection directe, repose sur un seul anticorps qui a été lié de manière covalente à une molécule d'étiquette facilement détectée (biotine, une enzyme ou un colorant fluorescent). Il est possible d'étiqueter directement un anticorps en utilisant un kit d'étiquetage fourni commercialement.

Avec détection indirecte, deux anticorps différents sont utilisés en séquence pour l'étape de détection. Tout d'abord, la membrane est incubée avec un anticorps primaire non marqué dirigé contre la protéine cible. Après lavage, un anticorps secondaire marqué est utilisé pour détecter la présence de l'anticorps primaire, et donc de la protéine cible. L'anticorps secondaire marqué est

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typiquement dirigé contre la classe ou la sous-classe d'immunoglobuline des espèces de l'anticorps primaire. Les anticorps primaires biotinylés nécessitent également une procédure de détection en deux étapes; Cependant, la seconde étape implique une incubation avec de la streptavidine, une protéine bactérienne, conjuguée à HrP (ou AP), plutôt qu'avec un anticorps marqué.

Figure 11 : Schématisation de la détection directe vs indirecte Les étiquettes fluorescentes, par exemple, nécessitent simplement le bon équipement pour observer et enregistrer le signal fluorescent. Sur la figure 12, un transfert de Western est sondé avec un anticorps primaire anti-tubuline et un anticorps secondaire DyLight® 800 (STAr117D800). Il est alors détecté à l'aide du système d'imagerie infrarouge Odyssey LI-COr®.

On notera ici que les standards de poids moléculaire à l'extrême gauche sont étiquetés pour produire un signal rouge leur permettant de se distinguer facilement des échantillons. Cela met en évidence un des avantages des marqueurs fluorescents, qui est que plusieurs étiquettes peuvent être vues sur la même membrane dans la même expérience.

Figure 12 : Détection de la tubuline avec l’anticorps secondaire DyLight® 800 Le marqueur d'anticorps le plus commun utilisé dans les transferts de Western est HrP, une petite enzyme stable avec une spécificité élevée et un roulement rapide. HrP est désactivé par l'azide de

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sodium, il est donc impératif qu'aucun azide ne soit présent dans les solutions de blocage, de dilution ou de lavage.

L'étiquette HrP est détectée lorsqu'elle est exposée à une solution de substrat dans l'étape finale de la procédure d'immunodétection. Les solutions de substrat pour le transfert de Western sont des réactifs chimiques sur lesquels l'enzyme agit pour donner un signal qui peut être facilement mesuré.

Le marqueur HrP est typiquement détecté avec des substrats colorimétriques ou chimioluminescents.

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Chapitre 4: Analyse des données Les données produites avec un Western blot sont généralement assez faciles à interpréter. Dans la majorité des cas, des bandes correspondant à la protéine cible deviendront visibles lors du traitement de l'empreinte avec le substrat. Leur identité est confirmée par comparaison avec des marqueurs de poids moléculaire (pour la taille) et un témoin positif (taille et signal).

Dans certains cas, les données peuvent être plus complexes, présenter des tailles inattendues, des bandes multiples ou une altération des bandes suivant un traitement particulier. L'objet de ce chapitre est l'analyse et, en tant que tel, les données elles-mêmes seront discutées avec des

Données Quantification : Il est très important d'être conscient que les données produites avec un Western-blot sont généralement considérées comme semi-quantitatives. C'est-à-dire qu'il fournit une comparaison relative des niveaux de protéines, mais pas une mesure absolue de la quantité d'une protéine cible spécifique dans une expérience particulière.

La raison en est double: premièrement, il y aura des variations dans les taux de chargement et de transfert entre les échantillons dans des voies séparées et sur des transferts séparés qui devront être normalisés avant qu'une comparaison plus précise puisse être effectuée; Deuxièmement, le signal généré ne sera pas linéaire sur la plage de concentration des échantillons en raison de la disponibilité du substrat et de la réactivité linéaire du procédé de détection.

Comme le signal produit n'est pas linéaire, il ne doit pas être utilisé pour fixer une concentration précise à un échantillon particulier. Les dosages ELISA sont plus appropriés à cet effet et généralement plus sensibles.

Normalisation : Afin de comparer les niveaux d'expression de la protéine cible entre plusieurs échantillons différents sur la même membrane, il est nécessaire d'utiliser un contrôle de chargement pour normaliser les données.

Ils ne sont pas requis pour chaque gel qui est exécuté, mais sont nécessaires pour le travail de qualité de publication, et lorsque le niveau de signal réel entre les échantillons est comparé. Typiquement, l'empreinte est sondée avec un anticorps dirigé contre une protéine de ménage bien caractérisée qui est utilisée comme mesure générale des taux d'expression des protéines dans les cellules utilisées comme source pour un échantillon particulier.

Le sondage avec l'anticorps de gène ménager peut être effectué avec l'anticorps cible, séparément par découpage d'un buvard entre les emplacements de bande attendus, ou plus tard après que le transfert ait été retiré des anticorps précédemment liés. Des contrôles de chargement communs mesurent les niveaux de GAPDH, bêta-actine, tubuline et histones. Ces protéines varient en poids

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moléculaire et doivent être soigneusement choisies en fonction de la protéine cible et des conditions expérimentales, car il peut y avoir une certaine variation dans leur signal.

Dans le Western blot ci-dessous, l'expression de Lnk (protéine adaptatrice de lymphocyte) est comparée à des cellules non infectées et à une protéine non liée comme témoin négatif. La section sondée anti-tubuline appariée de l'empreinte démontre qu'une quantité équivalente d'échantillon a été chargée dans chaque voie.

Figure 15: Expression de Lnk dans des cellules endotheliales après traitement avec TNF a. Le transfert de Western a été sondé d'abord avec l'anticorps anti-Lnk (AHP1003), montrant une augmentation de l'expression de Lnk au cours du temps dans les bandes 3-5. Il a ensuite été débarrassé et reprové avec un anticorps anti-tubuline pour confirmer l'équivalence de charge. Voie 1: Cellules non infectées. Voie 2: contrôle de transfection négatif-AdGFP. Pistes 3-5: 1, 2 et 3 heures après le traitement par TNF

Densitomètres et logiciels d'analyse : Pour réaliser un enregistrement permanent ou pour obtenir une mesure objective du signal généré sur un transfert Western, on utilise un densitomètre pour balayer le transfert ou le film. Un logiciel d'imagerie est ensuite utilisé pour comparer le signal généré par les bandes détectées sur le Western blot.

Le signal ECL peut également être détecté avec des caméras CCD, qui ont généralement une meilleure plage linéaire que le film et le logiciel d'analyse associé. Consultez le manuel du densitomètre ou du système d'imagerie utilisé pour des instructions spécifiques.

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Chapitre 5: Tampons de Western Blot Tampons : PBS : ✓ 8 .0 g NaCl ✓ 0 .2 g KCl ✓ 1 .15 g Na2HPO4 ✓ 0 .2 g KH2PO4 Dissoudre dans 800 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,4, puis ajouter de l’eau distillée à un volume final de 1 litre. Stériliser en autoclave et conserver à température ambiante (RT).

TBS ✓ 8 .0 g NaCl ✓ 0 .2 g KCl ✓ 3 .0 g Tris base

Dissoudre dans 800 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 8,0 avec HCl 1 M, puis ajouter plus de dH20 à un volume final de 1 litre. Stériliser par autoclavage et stocker à TA.

10x TBS Stock: ✓ 500 mM Tris-HCl, pH 7 .4 ✓ 1 .5 M NaCl

Tampon de lyse : Tampon de lyse : ✓ 50 mM Tris, pH 8 .0 ✓ 150 mM NaCl ✓ 1% NP-40 (ou Triton® X-100) Tampon RIPA : ✓ 50 mM Tris, pH 8 .0 ✓ 150 mM NaCl ✓ 1% NP-40 (or Triton® X-100)

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✓ 0 .5% Sodium deoxycholate ✓ 0 .1% SDS

Électrophorèse et tampons de transfert : Laemmli 2x Sample Buffer : ✓ 4% SDS ✓ 20% de glycérol 125 mM Tris, pH 6,8 ✓ 0,02% de bleu de Bromophénol 200 mM de DTT ou 10% de ßME Pour obtenir les meilleurs résultats, ajouter Dithiothréitol ou ß-mercapto-éthanol frais juste avant l'utilisation.

Tampon de migration d'électrophorèse en gel : ✓ 25 mM Tris base ✓ 190 mM de glycine ✓ 0,1% SDS ✓ Tampon de transfert : ✓ 50 mM Tris base ✓ 380 mM de glycine ✓ 0,1% SDS ✓ 20% de methanol ✓ Ponceau S Stock Solution : ✓ 2% Ponceau S ✓ 30% d'acide trichloracétique ✓ 30% Acide sulfosalicylique Diluer 10 fois dans de l'eau distillée avant utilisation.

Tampons de lavage : PBST : ✓ PBS avec 0, 1% de Tween® 20 ✓ TBST : ✓ TBS avec 0, 1% de Tween® 20 ✓ Block Ace Wash Buffer (BUF029) Reconstituer chaque flacon de 4 g dans 100 ml d'eau distillée. Diluer 10 fois la solution reconstituée et ajouter Tween® 20 à une concentration finale de 0,05-0,2% v / v.

Tampon de blocage : Utiliser BSA ou Block Ace (BUF029) pour bloquer lors du sondage avec des anticorps antiphosphoprotéine, ou pour des anticorps primaires biotinylés détectés avec un anti-biotine secondaire.

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✓ 5% de lait séché non gras en PBST ou TBST (Blotto / BLOTTO) ✓ Ajouter 5 g de poudre de lait en poudre non grasse à 100 ml de PBST ou TBST. Dissoudre avec agitation douce. Conserver à 4 ° C.

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Chapitre 6 : Protocoles Lyse de cellules de mammifères : Cellules adhérentes: ✓ Laver les cellules directement dans le flacon de culture de tissu ou un plat en ajoutant du PBS froid et en basculant doucement. Aspirer PBS et répéter. Garder le plat de culture de tissu sur la glace tout au long. ✓ Ajouter un tampon de lyse glacé de volume approprié (avec des inhibiteurs de protéase frais), dans le flacon, environ 1 ml pour un plat de culture tissulaire de 100 mm. (En variante, les cellules peuvent être retirées du flacon avec de la trypsine-EDTA puis préparées en utilisant les instructions de la cellule de suspension ci-dessous). ✓ Incuber pendant 20 minutes sur de la glace, puis gratter les cellules de la surface à l'aide d'une spatule en caoutchouc. ✓ Transférer dans un tube de microcentrifugeuse et clarifier le lysat par filage pendant 10 minutes à 12 000 rPM, à 4 ° C. ✓ Transférer le surnageant dans un tube neuf et le stocker sur de la glace ou le congeler à -20 ° C ou -80 ° C. Cellules de suspension: ✓ Pipeter les cellules dans un tube conique frais et placer sur la glace. ✓ Faire tourner les cellules à faible vitesse à 4 ° C, et aspirer les médias. ✓ Ajouter 10 ml de PBS glacé, et doucement inverser le tube pour laver les cellules. ✓ Faire tourner les cellules à faible vitesse et aspirer le surnageant. ✓ Répéter le lavage et l'aspiration. Remettre les cellules en suspension dans 5 ml de PBS glacé. ✓ Compter les cellules et centrifuger à basse vitesse à 4 ° C pour former un culot cellulaire.

Aspirer hors du liquide. ✓ Remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans un tampon de lyse de cellules glacées (avec des inhibiteurs de protéase frais), utiliser 1 ml de tampon pour 107 cellules. ✓ Incuber les cellules pendant 30 minutes sur de la glace. Si nécessaire, sonique les lysats sur la glace pendant 15-30 secondes pour perturber l'ADN génomique et les composants cellulaires. ✓ Transférer dans un tube de microcentrifugation et clarifier le lysat par filage à 4 ° C, pendant 10 minutes à 12 000 tr / min. ✓ Décanter le surnageant dans un tube frais et jeter le culot cellulaire. Stocker sur la glace pour une utilisation immédiate, ou à -20 ° C ou -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. ✓ Mesurer la concentration en protéines avec des dosages BCA, Lowry ou Bradford, ou par absorption, avant le chargement sur un gel. Échantillons de tissus : ✓ Les échantillons de tissus sont rincés dans du PBS froid et placés dans un tube sur de la glace immédiatement après la dissection. ✓ Pour les petits échantillons (100 mg), découpez-les en morceaux avec des instruments de dissection propres. Ajouter du tissu et 1-2 ml de tampon de lyse glacé à la glace à l'homogénéisateur dounce, ou soniquer dans un petit tube. Homogénéiser ou soniquer sur la glace.

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✓ Clarifier le lysat avec une centrifugation à grande vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C, pendant 10 minutes à 12 000 rPM. ✓ Transférer le surnageant dans un tube frais et jeter le culot cellulaire. Stocker sur la glace pour une utilisation immédiate, ou à -20 ° C ou -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. ✓ Mesurer la concentration en protéines avec des dosages BCA, Lowry ou Bradford, ou par absorption, avant le chargement sur un gel.

Electrophorèse en gel et transfert de protéines :

✓ Pour les conditions standard de dénaturation et de réduction, mélanger l'échantillon 1: 1 en volume avec du tampon d'échantillon Laemmli 2x. ✓ Chauffer à 100C pendant 5 minutes ou 70C pendant 10 minutes. ✓ Charger de 20 à 50 μg d'échantillon par puits, avec des témoins positifs et négatifs appropriés. ✓ Faire fonctionner le gel et le transférer au PVDF ou à la membrane de nitrocellulose conformément aux instructions du fabricant concernant l'équipement et les matériaux utilisés. ✓ Confirmer le transfert de protéine par coloration pendant 1 minute avec Ponceau S, suivi d'un bain complet dans de l'eau distillée. ✓ Indiquer la position des poids moléculaires s'ils ne sont pas marqués.

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Chapitre 7 : Western Blot Dépannage Bandes inhabituelles ou inattendues Différences observées

Causes possibles La protéine cible a été clivée ou digérée Des variantes d'épissage Bande (s) à poids moléculaire existent inférieur à celui prévu Une autre protéine portant l'épitope identique / similaire a été détectée par l'anticorps

Solution Utiliser un échantillon frais qui a été conservé sur de la glace Ajouter des inhibiteurs de protease frais au tampon de lyse Essayez d'autres anticorps

Utiliser des enzymes pour éliminer la modification suspecte en renvoyant le Bande (s) à un poids La protéine peut être poids moléculaire plus moléculaire légèrement plus glycosylée ou autrement proche des valeurs élevé que prévu et peut être modifiée en un ou plusieurs attendues floue résidus d'acides aminés Vérifier la séquence des acides aminés et la documentation Des dimères, des multimères ou des interactions protéineBande (s) à poids moléculaire protéine peuvent se produire significativement plus élevé car les échantillons n'ont pas que prévu été entièrement réduits et dénaturés.

Ajouter de la DTT fraîche ou bME aux échantillons et réchauffer avant de répéter l'expérience Préparer de nouveaux échantillons avec un tampon de chargement frais

La concentration d'anticorps primaire peut être trop Bandes multiples à différents élevée, ou poids moléculaires Est une réactivité croisée avec des epitopes similaires sur d'autres protéines

Utiliser un anticorps primaire purifié par affinité Optimiser la concentration d'anticorps primaires Essayez un autre anticorps Vérifier la spécificité de l'anticorps avec le peptide bloquant

Les bandes sont floues

Le gel a été soumis à une tension trop élevée Composition du tampon de course incorrecte Présence d'une bulle d'air piégée pendant le transfert

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Répéter le gel à basse tension Préparer un nouveau tampon de course Enlever soigneusement les bulles d'air entre le gel et la membrane avant le transfert de protéines

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Des bandes blanches (négatives) sur le film lors de Trop de protéines ont été Charger moins d'échantillon l'utilisation de la détection chargées ECL Vérifier et optimiser les Les bandes sont en forme de Les conditions de course conditions d'électrophorèse sourire, pas plates étaient trop rapides sur gel

Pas de bandes sur le Blot

Anticorps secondaire inapproprié utilisé

Relatif aux anticorps

Mauvaise concentration d'anticorps ou faible affinité pour la protéine cible

Anticorps non approprié pour Western blot

Relatif à la technique

Pas assez d’antigènes chargé dans le gel

Transfert n'a pas fonctionné correctement

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Reprendre les étapes pour vérifier la compatibilité entre les anticorps primaires et secondaires Reprobez avec un badigeage secondaire ou de bande correct et reprobe si nécessaire Répéter l'expérience avec la bonne combinaison d'anticorps Augmenter la concentration d'anticorps 2-4 fois plus haut que initialement recommandé Augmenter la durée d'incubation Essai / optimisation de l'anticorps contre les taches Essayez un autre anticorps Consulter la fiche technique pour connaître les conditions recommandées Essai / optimisation de l'anticorps contre les taches Essayez d'autres anticorps Vérifier la concentration de l'échantillon Augmenter la quantité de matériel source Immunoprécipiter, fractionner ou concentrer l'échantillon Confirmer le transfert de protéines par coloration de la membrane avec Ponceau S et / ou le gel avec du colorant Coomassie.

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Western-Blot Noter que tous les marqueurs de poids moléculaire préservés ont été transférés sur le transfert Optimiser / vérifier les conditions de transfert et de mise en place (en particulier l'orientation des électrodes) Répéter l'utilisation de deux membranes dans le cas où la protéine a transféré par le premier Essayez une concentration L'agent de blocage interfère plus faible avec le signal Essayez un autre agent de blocage

Relatif aux tampons

Utiliser des tampons sans azide Les tampons peuvent Le peroxyde peut être une contenir de l'azide de sodium activité réductrice inactive de qui inactive HRP peroxydase Ajouter du peroxyde frais au tampon de substrat

Signal de fond élevé sur le Blot

Relatif aux AC

Concentration des Anticorps secondaire élevé

Réduire / optimiser les concentrations d'anticorps Réduire / optimiser les temps trop d'incubation Utiliser des anticorps purifiés par affinité

Des liaisons primaires et / ou Utiliser une autre solution de secondaires avec l'agent de blocage blocage

Relatif à la technique

L'anticorps a une activité Utiliser une aliquote fraîche réduite en raison d'un d'anticorps qui a été stockée à stockage à long terme ou -20 ° C ou moins inapproprié L'anticorps phospho-spécifique a réagi avec de la caséine (une Utiliser une autre solution de phosphoprotéine) dans un blocage - BSA ou Block Ace agent bloquant le lait non gras

Relatif aux tampons

L'anticorps secondaire se lie à Essayez

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un

autre

agent

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Western-Blot l'agent bloquant

Taches ou marques sur le Blot L'anticorps secondaire lié à HRP Relatif aux anticorps a agrégé

Relatif à la technique

Relatif aux tampons

bloquant Réduire la concentration en protéines de l'agent bloquant Test d'anticorps secondaire seul sur blot

Filtrer l’anticorps secondaire pour enlever les agrégats

Solution insuffisante utilisée pendant l'incubation et / ou le lavage

Assurez-vous que la membrane est complètement immergée et agitée tout au long des incubations

Bulles d'air piégées

Enlever soigneusement les bulles d'air entre le gel et la membrane avant le transfert de protéines

Agitation inégale pendant l'incubation

Utiliser un agitateur pour toutes les incubations

Les anticorps liés au tampon se lient à l'agent bloquant

Technique liée Filtrer l'agent de blocage Essayez un autre agent bloquant

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