Immunocytochimie

13 mars 2017

Immunocytochimie

IMMUNOCYTOCHIMIE BERCIER PIERRE – CHAILLOT LAURA – MENNESSIER VALENTINETOURNEUR MARSILLE JULIEN

13/03/2017

Immunocytochimie

Table des matières 1.

Histoire ............................................................................................................................................ 3

2.

L’immunomarquage ........................................................................................................................ 4

3.

Fluorophore ..................................................................................................................................... 5

4.

Choix des fluorochromes ................................................................................................................. 7

5.

L’antigène (Ag)................................................................................................................................. 7

6.

Les anticorps (Ac) ............................................................................................................................ 8 6.1.

Les anticorps spécifiques sont polyclonaux ou monoclonaux .............................................. 10

6.2.

Deux méthodes de détection ................................................................................................ 11

6.3.

Amplification par le système biotine/streptavidine .............................................................. 13

7.

Les Conditions essentielles pour l’immunocytochimie ................................................................. 15 7.1.

Choix du fixateur de l’échantillon.......................................................................................... 15

7.2.

La Perméabilisation ............................................................................................................... 20

7.3.

La Saturation des sites non spécifiques................................................................................. 21

7.4.

Caractéristiques d’un bon anticorps ..................................................................................... 22

8.

Les différents types de microscope ............................................................................................... 23 8.1.

Les microscopes photoniques ............................................................................................... 23

8.1.1.

Le microscope à fond clair ............................................................................................. 23

8.1.2.

Le microscope à fluorescence ....................................................................................... 24

8.1.3.

Microscope confocal ..................................................................................................... 24

8.2.

9.

Les microscopes électroniques ............................................................................................. 24

8.2.1.

Le microscope électronique à transmission ou MET ..................................................... 25

8.2.2.

Le microscope électronique à balayage ou MEB........................................................... 25

Protocole type d’immunocytochimie ............................................................................................ 26 9.1.

Matériel nécessaire : ............................................................................................................. 26

9.2.

Protocole ............................................................................................................................... 26

10.

Résumé : .................................................................................................................................... 29

11.

Problèmes et solutions : ............................................................................................................ 30

12.

Informations utiles .................................................................................................................... 31

13.

Annexe ....................................................................................................................................... 32

13.1.

Les Immunoglobulines....................................................................................................... 32

13.2.

Listes de quelques fluorophores ....................................................................................... 33

13.2.1.

Alexa Fluor dyes (lié à un anticorps).............................................................................. 33

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13.2.2.

Cy Dyes (marqueurs synthétiques)................................................................................ 35

13.2.3.

Marqueurs des acides nucléiques (Nucléaire) .............................................................. 35

13.2.4.

Marqueurs de mitochondrie ......................................................................................... 36

13.2.5.

Marqueurs de membranes ............................................................................................ 36

13.2.6.

Marqueurs de viabilité/apoptose.................................................................................. 37

13.2.7.

Marqueurs de l’appareil de Golgi .................................................................................. 37

13.2.8.

Marqueurs de dépendance envers le pH ...................................................................... 38

13.2.1.

Marqueurs de dépendance envers le calcium .............................................................. 38

13.2.2.

Marqueurs de fonctions cellulaires ............................................................................... 38

13.2.3.

Protéines fluorescentes ................................................................................................. 39

13.2.4.

Fluorophores conjugués ................................................................................................ 43

14.

Bibliographie :............................................................................................................................ 45

Liste des figures Figure 1 : Diagramme de Jablonski Figure 2 : Diagramme simplifié de Perrin-Jablonski montrant la différence entre fluorescence et phosphorescence.

Figure 3 : Schéma représentative d’un antigène et de ces différents épitopes.

Figure 4 : Schéma d’un anticorps Figure 5 : Principe de création et obtention des anticorps polyclonaux et monoclonaux.

Figure 6 : Schéma de représentation de la méthode directe Figure 7 : Schéma de représentation de la méthode indirecte Figure 8 : Complexe Streptavidine – Biotine : SABC Figure 9 : Streptavidine conjuguée à l’enzyme – biotine (LSAB) Figure 10 : Schéma caractérisant les différents types de fixateurs.

Figure 11 : Effet de la dilution de l'antisérum (ou de l'anticorps) sur le marquage.

Figure 12 : schéma du fonctionnement du microscope à fond clair.

Figure 13 : Image représentative de contraste de phase et du contraste d’interférence Figure 14 : Schéma du fonctionnement du microscope a fluorescence Figure 15 : Schéma fonctionnement microscope confocal (gauche), représentation des différents plans d’un grain de pollen (milieux) et exemple de reconstruction tridimensionnelle (droite).

Figure 16 : Image représentative obtenu par un MET Figure 17 : Image représentative obtenu par un MEB Figure 18 : Représentation de différentes immunoglobulines (Source : http://biochimej.univ-angers.fr)

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1. Histoire Selon la légende, en 1603, un cordonnier de Bologne, Vincenzo Cascariolo, ramassait des pierres au cours de ses promenades dans la région du Monte Paterno. Il les calcinait chez lui avec du charbon, car, alchimiste à ses heures, il recherchait la pierre philosophale pouvant transformer les métaux communs en or ou en argent. Après calcination, il constata que certaines pierres exposées à la lumière du soleil continuaient de luire dans l'obscurité de son four ou de sa maison. On leur donna le nom de phosphore de Bologne (du grec phos, « la lumière », et phorein, « porter »). Bien d'autres substances possédant cette propriété étaient connues ou furent découvertes par la suite. On les dénomma phosphores et, plus tard, ce type d'émission de lumière fut appelé phosphorescence.

George Gabriel Stokes : En 1852, dans On the change of refrangibility of light, il explique le phénomène de la fluorescence en constatant que certains matériaux, tels que la fluorine (CaF2) et l'ouraline, émettent la lumière visible lorsqu'ils sont exposés au rayonnement ultraviolet, qui possède une longueur d'onde inférieure. L'augmentation de la longueur d'onde est dite le déplacement de Stokes.

Le terme photoluminescence réunit la fluorescence et la phosphorescence, deux phénomènes qui résultent d'une absorption préalable de lumière, mais dont la distinction ne sera précisée que dans les années 1920-1930, après plus de 300 ans d'observations et un siècle de discussions, grâce en particulier aux physiciens français Jean et Francis Perrin.

La technique des anticorps fluorescents a été élaborée en 1941 et 1942 par Albert H. Coons.

Avant la guerre, il avait réussi à coupler l'anthracène isocyanate (un fluorophore) aux anticorps anti-pneumocoques. Le produit obtenu conserve sa fonction immunologique et est capable d'agglutiner des bactéries pneumocoques. En outre, les organismes étaient fortement fluorescents et pouvaient être vus facilement avec un microscope équipé d'une source d’excitation de lumière ultraviolet.

Ensuite Avraméas et Uriel, en 1966, ont introduit des marquages avec des enzymes, d’abord avec la HRP puis la phosphatase alcaline (1978), la glucose oxydase (1979), la ß-DGalactosidase (1982).

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En 1979, Guesdon exploite l’interaction forte entre avidine et biotine.

Ces techniques ont ensuite été appliquées à de nombreux antigènes et anticorps en lançant les disciplines cliniques de microscopie à immunofluorescence, diagnostic pour la bactériologie et l'immunologie, l'immunocytologie et l'immunohistochimie en pathologie anatomique.

2. L’immunomarquage Avant tout, il faut savoir qu’il existe deux techniques d’immunomarquage : - L’immunohistochimie. Il tire son nom de la racine « immuno », en référence à l'anticorps utilisé dans la procédure, du mot « histologie » (=histo) qui évoque l'étude de tissus biologiques et du mot « chimie ». Cette méthode permet de détecter des protéines ou d'autres antigènes dans des sections de tissu.

- L’immunocytochimie. Il tire son nom de la racine « immuno », en référence à l'anticorps utilisé dans la procédure, du mot « cytologie » (=cyto) qui évoque l'étude des cellules, et du mot « chimie ». Cette méthode permet de détecter des protéines ou d'autres antigènes au sein d’une ou plusieurs cellules.

Ces techniques permettent de localiser des antigènes ou molécules d’intérêt dans un tissu, des cellules ou organites cellulaires grâce à l'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre l'antigène d'intérêt à détecter. Cette localisation est visualisée par plusieurs façons : - Soit l’anticorps est conjugué à une enzyme (tel que la peroxydase) qui peut catalyser une réaction permettant la production d’un produit coloré (ex. : coloration immunoperoxydase). (Non présenté dans ce document) - Soit l’anticorps peut être couplé avec des billes d’or microscopique. Ce qui permet d’obtenir un marquage et une localisation dans la cellule grâce à un microscope électronique. (Observation de points noirs dans la préparation). (Non présenté dans ce document) - Soit l’anticorps peut être marqués par un fluorophore qui émettra une lumière après avoir été excité (tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) qui émet dans le vert).

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Les molécules fluorescentes permettent la visualisation de la distribution de la cible dans l’échantillon sous un microscope à fluorescence (épifluorescence et microscopes confocaux, par exemple).

3. Fluorophore Un fluorochrome ou fluorophore est une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après avoir reçu une excitation.

En effet une molécule fluorescente possède la propriété d'absorber un rayonnement lumineux incident (excitation) et de restituer rapidement (en quelques nanosecondes) l'énergie absorbée sous forme d'émission de lumière (fluorescence). Elles émettent à une longueur d’onde supérieure à celle du faisceau incident.

Ce phénomène peut être schématisé grâce au diagramme simplifié de Perrin-Jablonski.

Figure 1 : Diagramme de Jablonski (Source : http://www.cnrs.fr et https://micro.magnet.fsu.edu)

- Etape 1 : Excitation Un photon d’énergie hEX (EX : correspond à la longueur d’onde d’excitation) produit par une source externe (lampe incandescente, laser) est absorbé par le fluorophore, créant un état électronique excité S1’ de niveau d’énergie supérieur.

- Etape 2 : Etat Excité L’état excité existe pendant une courte période (1-10 nanosecondes). Pendant ce temps, le fluorophore subit des changements conformationnels et réagit avec son environnement moléculaire. De ce fait, l’énergie S1’ est partiellement dissipée, procurant un état relaxé à partir duquel l’émission de fluorescence est produite. D’autre part, toutes les molécules initialement excitées au cours de l’étape 1 ne retournent pas à l’état de repos S0 après

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émission de fluorescence. D’autres processus ont lieu, comme, par exemple, le transfert résonant d’énergie de fluorescence (FRET).

- Etape 3 : Emission de fluorescence Quand le fluorophore retourne à son état d’origine, un photon d’énergie hEM (EM : correspond à la longueur d’onde d’émission) est émis. A cause de l’énergie dissipée pendant le temps de vie de l’état excité, l’énergie de ce photon est moins élevée (en conséquence, sa longueur d’onde est plus grande) que le photon « excitateur » (hEX). Cette différence d’énergie s’appelle la différence de Stokes (Stokes shift).

ATTENTION : Ne pas confondre avec la phosphorescence !!

S1 S2

S0 Figure 2 : Diagramme simplifié de Perrin-Jablonski montrant la différence entre fluorescence et phosphorescence. Les flèches grises représentent des transitions non radiatives.

(Source : http://www.futura-sciences.com)

La distinction est la suivante : - Dans le cas de la fluorescence, l'état excité atteint lors de l'absorption de lumière est l'état à partir duquel il y a émission de lumière - Dans le cas de la phosphorescence, les espèces passent de l'état excité initial - atteint lors de l'absorption - à un autre état excité, et c'est à partir de cet état intermédiaire (qui peut durer plusieurs heures) qu'elles retournent à l'état fondamental en émettant de la lumière. C'est pourquoi la phosphorescence est visible plus ou moins longtemps après interruption de l'illumination.

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4. Choix des fluorochromes Pour choisir ses molécules fluorescentes, il y a plusieurs paramètres à prendre en compte - Si on veut marquer une seule cible, il faudra : o Que le fluorochrome existe sur l’anticorps secondaire nécessaire pour le marquage. o Que le fluorochrome possède des longueurs d’onde d’excitation et d’émission compatibles avec le microscope utilisé, par ses filtres et son rayon d’excitation.

- Si on veut marquer plusieurs cibles dans les mêmes cellules, il faudra : o Que les fluorochromes aient des spectres d’excitation et d’émission qui ne se superposent pas. C’est-à-dire qu’il faut que l’on puisse exciter un fluorochrome sans l’exciter l’autre. De même qu’il faut pouvoir récupérer le signal d’émission d’un fluorochrome sans récupérer celui d’un autre. o Les fluorochromes doivent être couplés à des anticorps secondaires différents.

Il faut savoir si le fluorochrome voulu existe sur l’anticorps voulu.

Pour vous aider à choisir les différents fluorochromes existants, le site de ThermoFisher permet de visualiser le spectre de chaque fluorochrome. Ainsi, vous pouvez savoir si spectres d’absorption et d’émission de deux fluorochromes choisis se superposent.

Site fisher: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cell-analysis/labelingchemistry/fluorescence-spectraviewer.html?icid=fr-probe-4#

De plus, une liste regroupant les différents fluorochromes existants est présente en Annexe à la fin de ce document.

5. L’antigène (Ag) L’antigène est une molécule immunogène capable d’induire la production d’anticorps (Ac) chez un animal d’une espèce différente de celle de l’antigène.

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Un antigène comporte plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes (3 à 8 acides aminés) dont la configuration est complémentaire du site anticorps des immunoglobulines qui leur correspondent.

Figure 3 : Schéma représentative d’un antigène et de ces différents épitopes.

(Source : DES de pathologie, J. Audouin et S. Bain)

6. Les anticorps (Ac) Un anticorps est un complexe protéique. Ce sont des glycoprotéines de la famille des immunoglobulines, formées de 4 chaînes polypeptidiques : deux chaînes lourdes identiques (H pour heavy) et deux chaînes légères identiques (L pour light). Ils sont souvent représentés en Y, où les deux chaînes lourdes sont reliées entre elles par un pont disulfure au niveau de la tige du Y. Les deux chaînes légères sont associées aux chaînes lourdes au niveau des bras du Y, également par des ponts disulfures assurant une flexibilité de la molécule. Les anticorps contiennent des domaines constants (identiques pour tous les anticorps d'un même organisme) et des domaines variables (qui permettent la reconnaissance des corps étrangers) situés au bout des bras du Y. Les domaines variables constituent les paratopes de l'anticorps.

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Figure 4 : Schéma d’un anticorps

Leur rôle est de reconnaître un antigène étranger afin de le neutraliser. Ils peuvent y parvenir grâce à la grande spécificité de leur paratope, qui ne reconnaît qu'une partie très précise de l'antigène : l'épitope. Dès qu'un anticorps reconnaît un épitope, le lymphocyte B qui produit cet anticorps spécifique se multiplie et subit une maturation pour pouvoir synthétiser les mêmes anticorps, utiles, en grandes quantités.

Il existe cinq types différents d'anticorps : IgG, IgA, IgM, IgE, IgD (selon l'ordre de leurs quantités respectives dans l'organisme) qui possèdent des rôles différents.

(Si vous souhaitez en savoir plus sur les Immunoglobulines, un paragraphe se trouve en Annexe)

Le clivage enzymatique spécifique permet d'isoler différents fragments : - le fragment Fc (cristallisable) : Il est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément. Il est constitué des fragments constants des chaînes lourdes (CH2) au-delà de la région charnière. Il ne reconnaît pas l'antigène.

- le fragment Fv : C'est le plus petit fragment gardant les propriétés de l'anticorps que possède l'immunoglobuline. Il est constitué uniquement des régions variables VL et VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet et est monovalent (cible un seul type d’épitope).

- le fragment Fab : Il a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1). Il est monovalent.

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- le fragment F(ab')2 : Il correspond à l'association de deux fragments Fab reliés par un petit segment des parties constantes des chaînes lourdes, la région charnière. Il a la même affinité que l'anticorps pour l'antigène et est divalent.

6.1.

Les anticorps spécifiques sont polyclonaux ou

monoclonaux Les anticorps spécifiques peuvent être fabriqués en injectant à plusieurs reprises un échantillon de l’antigène (protéine à détecter) à un animal (le plus souvent, lapin ou chèvre), et en recueillant ensuite le sérum riche en anticorps (antisérum). Cet antisérum contient différents anticorps dits polyclonaux, produits par différents plasmocytes, reconnaissant divers antigènes et épitopes de la protéine d’intérêt.

Les avantages sont le faible coût, une facilité de production, une bonne affinité ainsi qu’une plus grande sensibilité du faite qu’ils reconnaissent plusieurs épitopes de l’antigène. Les inconvénients sont un risque d’apparition de bruit de fond plus élevé, la

(Source : DES de pathologie, J. Audouin et S. Bain)

reproductibilité dans le temps.

Un anticorps monoclonal correspond à une population d’anticorps identiques dirigés contre le même site antigénique d’une protéine. Ces anticorps sont produits en grande quantité en culture par un clone de lymphocytes B selon la technique des hybridomes : après avoir immunisé une souris contre un antigène donné, on prélève dans sa rate des lymphocytes B. Ceux-ci sont fusionnés avec des plasmocytes tumoraux immortalisés (=myélomes). Après sélection, les hybridomes ainsi obtenus sont une source permanente et stable d’un seul type d’anticorps monoclonal. La spécificité des anticorps monoclonaux est supérieure à celle des sérums polyclonaux, mais leur sensibilité peut être inférieure.

(Source : DES de pathologie, J. Audouin et S. Bain)

Les avantages sont la spécifité car il n’y a qu’un seul derminant (épitopes) antigénique, l’anticorps standardisés permet une nomenclature précise (CD, cytokératines,…), une production permanente, l’absence de variation qualitative.

Les inconvénients sont la nécessité d’anticorps présentant une grande affinité. Cette techniques a des limites : si l’épitope est détruit par la préparation, la réaction sera improductive. L’épitope peut être présent dans des molécules différentes (ex : glycoprotéine

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associé à la myéline). La même molécule peut être présente dans des cellules différentes (Ex : CD4 présentent dans lymphocyte T et histiocytes).

Figure 5 : Principe de création et obtention des anticorps polyclonaux et monoclonaux.

6.2.

Deux méthodes de détection

On parle de réaction directe quand le marqueur est directement couplé à l'anticorps primaire, et de réaction indirecte quand on utilise un anticorps secondaire (fabriqué chez l'espèce B) couplé au marqueur et dirigé contre l'anticorps primaire (fabriqué chez l'espèce A).

•

La méthode directe :

Cette méthode utilise uniquement un anticorps primaire qui est couplé avec un fluorophore par exemple et donc lie directement l’échantillon. Ceci permet d’observer la fluorescence sans l’utilisation d’anticorps secondaire.

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/Cellule Figure 6 : Schéma de représentation de la méthode directe (Source : « Introduction à l’immunocytochimie » par Pierre Gounon, faculté de Nice)

Avantages : o Immunoréaction la plus simple et la plus rapide (1 seule étape) o Distance minimale entre traceur et antigène : marquage le plus précis o Réactivité croisée entre espèce est réduite puisqu’il n’y a qu’un seul anticorps (anticorps primaire)

Inconvénients : o Nécessité, dans la plupart des cas, de marquer soi-même l'anticorps car peu présent dans le commerce o Cout plus élevé o Le signal obtenu peut être plus faible car il n’y a pas d’amplification du signal o Sensibilité réputée inférieure à celle des techniques "en plusieurs étapes" •

La méthode indirecte :

Cette méthode utilise deux types d’anticorps : les anticorps primaires qui vont se lier à l’antigène/la molécule cible et l’anticorps secondaire qui va lier l’anticorps primaire (dirigé vers la partie constante de l’anticorps primaire) et qui possèdera un fluorophore sur sa partie constante.

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/Cellule Figure 7 : Schéma de représentation de la méthode indirecte (source : « Introduction à l’immunocytochimie » par Pierre Gounon, faculté de Nice)

Avantages :

Amplification : plusieurs anticorps secondaires pour un anticorps primaire

o Le cout peut être plus faible, surtout pour les anticorps secondaires. o Un même anticorps secondaire peut être utilisé pour plusieurs anticorps primaires (même espèce animale).

Inconvénients : o Immunoréaction plus longue car l’utilisation d’anticorps secondaires demandent des étapes et temps supplémentaires. o Plus complexe, car il faut utiliser l’anticorps secondaire approprié. Cela est particulièrement vrai lors de l’utilisation de plusieurs anticorps primaires, chaque anticorps secondaire doit cibler un anticorps primaire spécifique pour ne pas marquer un autre anticorps primaire (espèce animale différent).

La détection de protéines de faible abondance peut être parfois difficile même avec des méthodes indirectes. Les anticorps biotinylés permettent une amplification accrue du signal.

6.3.

Amplification par le système biotine/streptavidine

Cette méthode utilise la grande affinité de la streptavidine pour la biotine.

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Deux composés : - Streptavidine (Streptomyces avidinii, pH7) : il possède 4 récepteurs pour la biotine. Elle peut être couplée aux enzymes ou aux fluorochromes.

- Biotine : vitamine de faible poids moléculaire. Elle peut être couplée aux anticorps et aux enzymes (enzymes biotinylé) ou aux fluorochromes.

Deux méthodes Streptavidine-Biotine sont fréquemment utilisées. Ces deux méthodes nécessitent un anticorps biotinylé comme anticorps de liaison.

1) Complexe SABC : complexe tridimensionnel comportant de l’avidine en excès et de la peroxydase biotinylée.

Figure 8 : Complexe Streptavidine – Biotine : SABC (Source : DES de pathologie, J. Audouin et S. Bain)

2) Complexe LSAB : streptavidine conjuguée-biotine -> la streptavidine est conjugué à l’enzyme.

Figure 9 : Streptavidine conjuguée à l’enzyme – biotine (LSAB) (Source : DES de pathologie, J. Audouin et S. Bain)

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L’avantage de ces amplifications est la forte sensibilité.

L’inconvénient est que la biotine est endogène dans de nombreux tissus tel que le foie et les reins et peut donc poser un problème en termes de bruit de fond.

7. Les Conditions essentielles pour l’immunocytochimie La préservation de l’antigène dans le contexte cellulaire ou tissulaire (fixation) est importante, afin de ne pas le perdre et ainsi avoir un faux négatif.

Le marquage spécifique et sensible avec absence de marquage non spécifique est également essentiel, afin d’éviter les faux positifs.

7.1.

Choix du fixateur de l’échantillon

La fixation chimique consiste à reconstituer artificiellement le gel protéique du vivant très hydraté (75% à 95% d'eau) afin de rendre les molécules d'un échantillon insolubles dans l'eau comme dans les solvants organiques, et ainsi bloquer les systèmes enzymatiques pour éviter toute modification structurelle ultérieure de l'échantillon et l’autolyse. En effet, l'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie électronique impose de conserver, sans modification, les structures correspondant à l'état vivant. De plus, la coloration est également augmentée, sublimée par la fixation. En effet, de façon générale, des cellules ou tissus non fixés seront plus faiblement colorés que des tissus ou cellules fixés.

JR. BAKER utilisait souvent cet exemple pour expliquer la fixation : quand une porte est ouverte, sa position peut être changée facilement mais si la porte est ouverte et fixée au sol, cela modifie un peu la porte, de sorte qu’elle est stabilisée et résistante au changement.

Donc permet : - La conservation des structures : Pontage des protéines - L’immobilisation rapide et homogène des antigènes d’intérêt (= Rendre l’antigène insoluble mais cependant disponible) - Le respect de la nature de l’échantillon : composants cellulaires, morphologie

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(= Réseaux tridimensionnels)

Figure 10 : Schéma caractérisant les différents types de fixateurs.

(Source : Préparation des échantillons pour l’immunofluorescence, Inserm, Caroline COLOMBEIX et Laurence DUBREIL)

Il existe différentes catégories d’agents fixateurs : - Les fixateurs coagulants (également appelés dénaturants ou précipitants) vont provoquer une dénaturation irréversible des protéines. Il s’agit d’une action brutale avec des altérations des protéines globulaires qui s’agencent pour former une trame fibreuse.

Une rupture de certaines liaisons protéiques et une apparition de groupements thiols (R–SH) (Éthanol, acétone, méthanol, acide picrique…) peuvent se produire.

- Les fixateurs non coagulants vont donner lieu à une combinaison chimique avec les protéines, à l’établissement de liaisons nouvelles entre protéines et à une solidification de la trame protéique de la cellule. Il n’y a pas de modification structurale de la cellule.

Ces fixateurs sont également appelés additifs (Aldéhyde : formaldéhyde, glyoxal, glutaraldéhyde…).

Caractéristiques de quelques fixateurs

(pour

immunocytochimie

et

immunohistochimie) : - Le Paraformaldéhyde (PFA) : C’est un monoaldéhyde (il s'agit en fait d'un polymère insoluble de formaldéhyde, qui donne des monomères de formaldéhyde quand il est dissous dans le tampon) de formule (CH2)n, est en revanche un fixateur de pénétration rapide (grâce aux petites molécules de HCHO), environ

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10 mm par heure. Le groupe aldéhyde -CHO se combine avec les atomes d'azote des protéines.

Il forme des ponts hydroxy-méthylène. Il met cependant plus de temps pour stabiliser les structures que le glutaraldéhyde. La fixation est donc moins efficace et l'ultrastructure moins bien préservée pour l'observation morphologique. Il doit être préparé fraîchement à 4% (à partir d’une solution mère de 37% dilué dans l’eau) et tamponné à pH 7,4. Si le PFA est utilisé à plus de 10%, cela donnera un aspect brulé aux tissus et cellules, ce qui doit être évité. Il est partiellement réversible par rinçage et traitement par NH4Cl. Ce fixateur agit différemment selon le temps, la concentration et la température.

- L’éthanol : Il préserve la majorité des pigments, il dissout les graisses et a un effet de rétractation très important ainsi qu’un durcissement des tissus. Il est souvent utilisé pour la préservation du glycogène. L’éthanol précipite les acides nucléiques et certaines protéines. Lorsque le temps d’exposition est court, les acides nucléiques ne sont pas précipités et restent solubles dans l’eau.

- Le méthanol : Cet agent est un excellent fixateur pour la cytologie, il peut également être utilisé pour les coupes tissulaires congelées. Comme l’éthanol, le méthanol extrait les lipides des tissus biologiques. Cependant les carbohydrates ne sont pas éliminés. Cet agent fixateur ne durcit pas les tissus de façon aussi intensive que l’éthanol.

- L’acétone : Il peut dénaturer les structures tissulaires. L’extraction des lipides est très importante mais les carbohydrates sont préservés. L’acétone est utilisée pour la fixation des frottis cellulaires et des coupes tissulaires congelées pour la préservation des antigènes leucocytaires de surface.

Ainsi, le fixateur le plus souvent utilisé est le paraformaldéhyde qui permet à la fois de conserver une structure 3D moyenne, ainsi qu’avoir une pénétration moyenne de l’immunomarquage, de la cellule ou du tissu.

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Quelques fixateurs pour la microscopie électronique : - Le glutaraldéhyde : (COH(CH2)3COH) : est surtout utilisé pour la microscopie électronique même s’il arrive de l’utiliser dans certains cas en microscopie optique.

C’est un dialdéhyde qui interagit rapidement avec les protéines. Il stabilise les structures en créant des ponts artificiels entre les protéines et des groupements aminés libres : avec deux groupes aldéhydes séparés par une chaîne flexible, HCO-(CH2)3-CHO, il possède un grand potentiel de création de ponts, qui peuvent apparaître grâce aux deux groupes et à des distances variables. Certaines substances telles le glycogène ou la matrice extracellulaire sont ainsi préservées. En microscopie électronique, il peut arriver que le glutaraldéhyde seul soit insuffisant. Il est alors nécessaire de réaliser une seconde fixation au tetroxide d'osmium pour éviter l'extraction de certains composants lors de la déshydratation (en particulier les lipides).

Cette étape doit cependant être limitée au minimum, car l'osmium peut entraîner l'extraction de certaines protéines. De plus cette technique n’est pas utilisée en microscopie optique.

Si le glutaraldéhyde agit rapidement, c'est un fixateur de pénétration assez lent, 1 mm par heure maximum (à cause de la taille encore relativement importante des oligomères). Pour certains tissus, notamment la peau, il est nécessaire de fixer deux heures des échantillons d'une épaisseur inférieure à 0,5mm.

Il est très important d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade" (EM = Electron Microscope), qui est composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement les tissus (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)

La fixation par le glutaraldéhyde peut entraîner certaines difficultés : - Il y a création de groupes aldéhydes libres (et qui ne peuvent pas être éliminés par les lavages) qui peuvent provoquer des fixations non spécifiques d'anticorps.

- Dans le cas d’immunohistochimie sur les tissus, les ponts induits par la glutaraldéhyde ne permettent pas la pénétration de la paraffine, il est obligatoire d'utiliser des polymères de plastiques, ou de la résine, pour réaliser l'inclusion.

- Cette fixation gêne considérablement les marquages immunologiques qui demandent le plus grand nombre possible de chaîne d'acides aminés intacts. La majorité des réactions enzymatiques sont aussi détruites, bien que certaines soient encore possibles après une fixation rapide.

- Il n’est pas réversible

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Immunocytochimie

Ainsi, le glutaraldéhyde est plutôt réservé pour l’immunocytochimie ultrastructurale (microscope électronique).

- Le Karnovsky : Le mélange le plus utilisé en microscopie électronique est associé au nom de Morris J. Karnovsky, la technique ayant été publiée d'abord dans un abstract non référencé (Karnovsky, 1965) : 2,5% glutaraldéhyde, 4% paraformaldéhyde en tampon cacodylate 0,1M. Un mélange des deux fixateurs (glutaraldéhyde et paraformaldéhyde) est la meilleure fixation dans certains cas : échantillons de grande taille (sachant que dans ce cas il y aura quand même une fixation de moins bonne qualité au centre de l'échantillon), échantillon très dense ou besoin d'un marquage immunologique ultérieur. Le paraformaldéhyde pénètre rapidement les tissus et stabilise légèrement les protéines qui sont ensuite fixées de façon permanente par le glutaraldéhyde.

Les facteurs influençant la fixation : - La vitesse de pénétration de l’agent fixant dans le tissu biologique est propre à chaque agent fixateur. En pénétrant dans le tissu, le fixateur va agir sur les cellules en provoquant des artéfacts tels un gonflement, une rétractation ou un durcissement des éléments tissulaires. Le taux de pénétration du fixateur à l’intérieur du tissu biologique peut-être mesuré et exprimé généralement en mm de pénétration par heure. Il est facile de mesurer un objet avant et après fixation pour en déduire le degré de rétractation ou de gonflement. Cependant les chiffres ainsi obtenus ne sont valables que pour un tissu bien défini. La vitesse de pénétration d’un même agent fixateur peut varier du simple au triple suivant selon le tissu biologique (foie, rate, rein ou cerveau). La même remarque est valable pour la rétractation et le gonflement. La vitesse de pénétration est influencée par la chaleur mais pas par la concentration de l’agent fixateur.

- La vitesse de réaction de fixation est un paramètre qui diffère de la vitesse de pénétration. La vitesse de réaction est plus difficile à déterminer puisque la réaction de fixation n’a pas lieu nécessairement dès que le tissu entre en contact avec l’agent fixateur. De façon générale, les fixateurs dénaturants (ou coagulants) fixent les pièces

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Immunocytochimie

aussi rapidement qu’ils les pénètrent. Concernant les fixateurs additifs, la fixation est progressive avec un temps de fixation des échantillons plus long, nécessaire à l’établissement de liaisons entre protéines.

- Le volume du liquide fixateur est un paramètre important : la quantité de fixateur correspond au minimum à 10 x le volume de la pièce. Il est nécessaire d’utiliser des récipients adaptés au volume de la pièce à fixer. Il est important de noter qu’à volume égal, une pièce avec une surface importante et une épaisseur réduite sera fixée plus rapidement qu’une pièce de forme cubique. Il est nécessaire de recouper les échantillons à des épaisseurs de 0,5 cm maximum pour favoriser la fixation lorsque cela est possible. Le temps de fixation des échantillons va dépendre de l’épaisseur des pièces mais également du type de fixateur utilisé (dénaturant ou additif).

- La consistance propre aux tissus est directement impliquée dans la fixation : plus un tissu est dense, plus il est difficile à l’agent fixateur de pénétrer. Un tissu dense (prostate, utérus…) est plus susceptible de durcir de façon excessive. Des difficultés à la coupe de ces tissus sont fréquentes.

- Le pH des solutions de fixation varie en fonction des mélanges d’agents fixateurs utilisés. (ex : Paraformaldéhyde = pH 7,4)

7.2.

La Perméabilisation

La membrane constitue une barrière hydrophobe délimitant la cellule. Cependant, elle ne doit pas être infranchissable. La création d’une ou de plusieurs structures de perméation transitoires permet de franchir cette barrière : la membrane est alors perméabilisée. La cellule possède de tels mécanismes (par elle – même ou en interaction avec d’autres partenaires) pour son fonctionnement, et il est possible d'en induire d'autres artificiellement.

Afin de perméabiliser les membranes modèles ou des cellules in vitro plusieurs méthodes physicochimiques peuvent être utilisées, comme les détergents (Triton, Tween), des peptides antimicrobiaux, l'électroporation ou la microinjection.

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- Les détergents La majorité des produits utilisés pour la perméabilisation en immunocytochimie tel que le Triton X100 ou le Tween 20 sont des détergents.

Les détergents, sont des molécules capables de solubiliser les membranes lipidiques. Cela est lié à leur caractère tensioactif (capacité de modifier la tension superficielle). En effet, en présence des détergents, des perturbations à la bicouche lipidique sont observées qui vont de simples modifications morphologiques jusqu'à la solubilisation rapide de la membrane. La solubilisation de la membrane implique plusieurs états intermédiaires. Le mécanisme de solubilisation dépend de la nature du détergent, de sa concentration et de la composition membranaire. Les intermédiaires qui peuvent être détectés ont des formes diverses : des micelles, des cylindres ou des fragments membranaires (Kragh-Hansen, le Maire et al. 1998).

De manière générale, la solubilisation fait passer la bicouche d’un état d’équilibre à un système biphasique de lipides, de tensioactifs et d’eau (Almgren 2000). À l’état final des micelles mixtes de détergents et de lipides sont présentes.

7.3.

La Saturation des sites non spécifiques

Le bruit de fond se traduit soit par un accrochage diffus, cellulaire et/ou intercellulaire, à caractère non granuleux, soit par un accrochage nucléaire en relation, le plus souvent, avec une surconcentration de l'anticorps primaire.

Les différentes modalités de blocage du bruit de fond présentées ci-dessous sont classées par efficacité croissante : - Gélatine 0,1 % à 1 % - Albumine bovine à 3 % - Sérum 15 à 30 % (décomplémenté dans un bain marie pendant 1 heure à 56 °C). En général, le sérum de l’espèce de l’anticorps secondaire.

- Blotto (75 g lait en poudre écrémé Gloria ; 7,5 g de sérum albumine bovine (BSA) ; 0,75 ml de Tween 20 ; 250 ml de PBS ; 0, l % d'azide de sodium). Le blotto peut cependant engendrer des faux négatifs par adsorption de certains anticorps.

Les coupes sont placées de 20 minutes à 2 heures dans ces solutions, puis incubées avec l'anticorps primaire, sans lavage intermédiaire.

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7.4.

Caractéristiques d’un bon anticorps

Un anticorps :

- Doit avoir une haute affinité pour son antigène, c’est-à-dire qu’il doit se lier parfaitement à son antigène sans confusion avec des antigènes voisins ou modifiés - Doit avoir une grande avidité (force de liaison), c’est-à-dire qu’il ne part pas de son site au cours de lavages par ex.

- Il doit être spécifique de sa cible (son antigène/épitope).

- La concentration de travail est classiquement entre 1 et 10 µg/ml.

Tester un anticorps (ou un antisérum) à différentes dilutions (4 ou 5 dilutions en cascade) permet de déterminer la dilution de travail de ce réactif. La différence entre l'intensité du marquage spécifique et l'intensité du bruit de fond est le contraste du marquage auquel l'œil de l'observateur est sensible. Plus cette valeur est élevée, plus le marquage est contrasté et la gamme de dilution utilisable étendue.

Figure 11 : Effet de la dilution de l'antisérum (ou de l'anticorps) sur le marquage.

(Source : « Introduction à l’immunocytochimie » par Pierre Gounon, faculté de Nice)

Bien que l'intensité du marquage spécifique soit identique dans les 2 cas, on a, à gauche, un réactif très médiocre et à droite, un excellent réactif : ceci est dû uniquement à une différence d'intensité du bruit de fond. Différents artifices permettent parfois d’atténuer le bruit de fond.

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8. Les différents types de microscope Le microscope assure deux fonctions : agrandir l’image de l’échantillon et créer des contrastes faisant ressortir les détails de l’image agrandie. Il permet l’observation des structures cellulaires et la détection de molécules dans ces cellules.

En immunocytochimie, les microscopes qu’il est possible d’utiliser sont les microscopes photoniques, puisqu’ils utilisent des photons pour éclairer l’échantillon et exciter les fluorochromes, ainsi que les microscopes électroniques utilisent des électrons qui peuvent interagir avec des anticorps couplés avec des billes d’or.

8.1.

Les microscopes photoniques

8.1.1. Le microscope à fond clair Le microscope à fond clair utilise la lumière naturelle (photons) qui traverse la cellule examinée ; en l’absence de coloration, le passage du faisceau lumineux à travers l’objet ne produit pas de contraste suffisant pour distinguer les principales structures cellulaires, aussi est-il nécessaire d’utiliser une coloration. Deux autres variantes de ce microscope sont capables de transformer les variations de densité ou d’épaisseur entre points voisins de la cellule en différence de contraste, sans recours à une coloration : ce sont le microscope à contraste de phase et le

Figure 12 : schéma du fonctionnement du microscope à fond clair.

(Source : www.stem.lps.u-psud.fr)

microscope à contraste d’interférence différentielle.

Cellules vivantes en culture observées au microscope à fond clair sans coloration (gauche) et à contraste de phase (à droite).

Cellules vivantes observée au microscope à contraste de phase (gauche) et à contraste d’interférence différentiel (à droite).

Figure 13 : Image représentative de contraste de phase et du contraste d’interférence (Source : techniques d'observation microscopiques - CEMP6)

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8.1.2. Le microscope à fluorescence Le microscope à fluorescence utilise des filtres et des miroirs dichroïques de réflexion sélective pour illuminer des échantillons fluorescents à leur longueur d’onde d’excitation ; un second filtre d’arrêt d’émission ne laisse passer que la lumière émise qui est de longueur d’onde plus élevée. Ce microscope permet la localisation dans la cellule de molécules naturellement fluorescentes, ou ayant fixé un fluorochrome, ou associées à une protéine fluorescente.

Figure 14 : Schéma du fonctionnement du microscope a fluorescence (Source : techniques d'observation microscopiques - CEMP6)

8.1.3. Microscope confocal

Le microscope confocal rend possible l’observation d’objets épais (< 500µm, ce qui n’est pas possible avec les microscopes présentés précédemment) et fluorescents. Un mince faisceau laser est focalisé sur un plan défini de l’échantillon dont on obtient une image bidimensionnelle. Le balayage de plusieurs plans successifs (appelés sections optiques) permet une reconstitution tridimensionnelle de l’objet après traitement numérique.

Figure 15 : Schéma fonctionnement microscope confocal (gauche), représentation des différents plans d’un grain de pollen (milieux) et exemple de reconstruction tridimensionnelle (droite).

Exemple de reconstruction tridimensionnelle d’un échantillon.

(Source : techniques d'observation microscopiques - CEMP6)

8.2.

Les microscopes électroniques

Les microscopes électroniques sont construits sur le même principe que le microscope photonique mais utilisent à la place des photons, des électrons émis dans une colonne sous vide poussé. Leur pouvoir de résolution est environ 103 supérieurs à celui du microscope photonique (0,2 nm au lieu de 0,2 μm).

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8.2.1. Le microscope électronique à transmission ou MET Son faisceau d’électrons traverse l’échantillon, dont l’épaisseur est inférieure à 0,1 μm, puis est focalisé sur un écran pour former une image. Les électrons qui heurtent des atomes lourds préalablement fixés sur l’échantillon sont réfractés. Les autres traversent et impressionnent un écran où se forme l’image finale des structures cellulaires. Les échantillons sont contrastés soit positivement par des sels de métaux accumulés sur les structures cellulaires, soit négativement par des sels déposés sur le film. Les cellules et les tissus peuvent aussi être traités par cryofracture pour être observés au MET. Par cette technique, l’utilisation de bille d’or sur les anticorps permet de diffracter les électrons et ainsi avoir des « taches » noirs sur l’image finale.

Figure 16 : Image représentative obtenu par un MET (Source : techniques d'observation microscopiques - CEMP6)

8.2.2. Le microscope électronique à balayage ou MEB Le faisceau d’électrons ne traverse pas l’échantillon mais balaie sa surface préalablement recouverte de métal. Les électrons diffractés sont capturés pour donner une image tridimensionnelle de la surface cellulaire.

Figure 17 : Image représentative obtenu par un MEB (Source : techniques d'observation microscopiques - CEMP6)

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9. Protocole type d’immunocytochimie 9.1.

Matériel nécessaire :

Matériaux : •

Anticorps primaires

•

Anticorps secondaires conjugués aux fluorophores

•

Cellules d’intérêts

•

Milieu de culture approprié pour les cellules (exemple : DMEM)

•

Plaques de culture à 4, 12 ou 24 puits (exemple : Fisher Scientific, www.fishersci.com, cat# 07-200-80) ou plaque à fond en verre (ex : plaque ibidi, pas besoin de lamelle)

•

Lame et lamelles en verre

•

Pinces à bords large

•

PBS, pH 7,4 (Na2HP04 8 mM, KH2P04 1,4 mM, NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, NaCl2S04, Ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH)

•

Triton® X-100 0,1% (v / v) (Invitrogen, www.invitrogen.com, cat # 16210-064)

•

Marqueur d'acide nucléique : DAPI, 1 mg / mL (marqueur nucléaire)

•

Support de montage

•

Vernis à ongles ou colle (par exemple Duco Cement)

•

PFA 4% réalisé le jour même à partir d’une solution mère de PFA 37%

Équipements : •

Microscope à fluorescence équipé de filtres appropriés.

9.2.

Protocole

A. Cellules adhérentes sur des plaques de culture de 4 ou 12 puits.

1. Stériliser les lamelles en verre en les immergeant dans de l'éthanol à 90% et en les séchant soigneusement sur une flamme pendant quelques secondes.

2. Placer chaque lamelle dans des plaques de culture à 4 ou 12 puits stériles.

3. Ajouter 1 à 2 ml de suspension de cellules sur chaque lamelle dans les plaques à 4 ou 12 puits.

4. Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur de CO2 humidifié jusqu'à ce qu'elles soient à 50-70% de confluence.

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Note : Le niveau de CO2 doit être ajusté en fonction du type de milieu utilisé pour la culture des cellules. Par exemple, les fibroblastes cultivés dans un milieu Eagle modifié de High Glucose Dulbecco avec 10-20% de sérum de veau fœtal sont maintenus à pH 7,4 dans un incubateur à 10% de CO2. Tandis que d’autres cellules tels que des Hela cultivés dans un milieu DMEM High glucose avec 10% sérum de vœu fœtal sont maintenus à PH 7,4 dans un incubateur avec 5% de CO2.

5. Aspirer le milieu de culture de chaque puits et rincer doucement les cellules deux fois dans du PBS à température ambiante. Ne laissez pas les cellules sécher, laissez donc le dernier lavage au PBS jusqu’à ce que la suite des manipulations soit prête.

B. Fixer les cellules 1. Fixer les cellules en les faisant incuber dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% (v/v) dans du PBS 1X pendant 20 minutes à température ambiante. (v/v = volume par volume, ainsi pour avoir 4% de PFA il faut : 4 grammes de PFA dans 100 ml de PBS 1X ou 10,8 ml de PFA 37% dans 89,2 ml de PBS 1X pour un volume final de 100ml).

Note : La fixation au PFA doit se réaliser sous hotte, étant donné le caractère toxique et volatile du PFA. 2. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1X. 3. Les cellules peuvent être stockées dans de l'azide de sodium à 0,02% (p/v) dans du PBS 1X à 4°C pendant plusieurs jours, si nécessaire. (p/v = poids par volume, donc ici correspond à 0,02 gramme d’azide de sodium dans 100 ml de PBS 1X).

Note : Certains des anticorps fonctionnent mieux si les cellules sont chauffées dans un tampon de récupération d'antigène.

C. Perméabiliser les cellules 1. Incuber les cellules dans 0,3% de Triton X-100 dans du PBS 1X pendant 15 minutes à température ambiante.

Note : Le Triton X-100 étant très visqueux, n’hésitez pas à bien le mélanger.

ATTENTION : Le triton mousse ! Veillez à ne pas le secouer énergiquement, et ne pas faire de bulle avec la pipette lors de l’homogénéisation.

2. Rincer les cellules 3 fois dans du PBS 1X.

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D. Blocage des sites non spécifiques 1. Incuber les cellules dans 10% de sérum X (= de l’espèce de l’anticorps secondaire) dans

du PBS 1X pendant 1 heure à température ambiante ou dans du PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé (poids/volume) pendant 30 minutes sous agitation.

E. Incuber les cellules dans les anticorps primaires 1. Diluer le ou les anticorps primaires à la concentration appropriée en utilisant 10% de sérum X (ou PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé); Le volume final doit être suffisant pour couvrir chaque lamelle (par exemple 0,5 ml-1 ml par lamelle).

Note : Les concentrations optimales d'anticorps primaire doivent être déterminées.

2. Incuber les cellules dans l'anticorps primaire à 4°C pendant toute la nuit ou à température ambiante pendant 2 heures.

Note : Les témoins décrits ci-dessous peuvent être inclus. Il existe une variabilité des anticorps secondaires disponibles sur le marché, notamment en ce qui concerne leur aptitude à réagir avec des anticorps monoclonaux de souris de tous les isotypes.

A. Effectuer le protocole ICC sans addition de l'anticorps primaire et ni de l'anticorps secondaire. Toute fluorescence observée est due à l'auto-fluorescence de l'échantillon.

B. Effectuer le protocole ICC sans ajouter l'anticorps primaire, seulement l’ajout de l’anticorps secondaires. Toute fluorescence observée est due à l'anticorps secondaire se liant de façon non spécifique à l'échantillon.

3. Rincer les cellules 3 fois dans du sérum X à 1% dans du PBS 1X (ou PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé), pendant 10 minutes.

F. Incuber les cellules dans les anticorps secondaires 1. Diluer les anticorps secondaires conjugués avec le fluorophore, à l'abri de la lumière, dans du sérum X à 10% (ou PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé). Assurezvous que l'anticorps secondaire utilisé est spécifique à l'isotype pour chaque anticorps monoclonal primaire utilisé.

Note : ex : Une concentration finale de 2-5 µg/ml d'anticorps secondaire est appropriée lors de l'analyse de fibroblastes avec des anticorps secondaires de MitoSciences.

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2. Incuber les cellules dans les anticorps secondaires conjugués au fluorophore pendant 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière.

3. Rincer les cellules dans 1% de sérum X (ou PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé) pendant 3x10 minutes, à l’abri de la lumière.

4. Diluer le DAPI à 300 ng/mL dans 1% de sérum X (ou PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait écrémé). Incuber les cellules pendant 10 minutes dans le DAPI dilué, à l’abri de la lumière.

Note : Le DAPI peut être mis en même temps que les anticorps secondaires.

G. Monter les lamelles et les visualiser sous le microscope 1. Étiqueter une lame de microscope pour chaque lamelle.

2. Ajouter une goutte de support de montage sur chaque lame. (par exemple Duco Cement) 3. Prenez chaque lamelle à l'aide d'une pince et placez-la sur le support de montage, le côté cellule face vers le bas (côté lame).

4. Appliquer un vernis à ongles ou de la colle le long des bords des lamelles pour les sceller aux glissières.

5. Visualiser les cellules à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés.

10. Résumé : Stériliser les lamelles et les placer dans les plaques 4 ou 12 puits Ensemencer les cellules sur les lamelles (50 à 70% de confluence) Rincer les cellules dans du PBS Fixer les cellules dans 4% de PFA Rincer les lamelles 3 fois au PBS. Perméabiliser les cellules dans 0,3% Triton X-100 pendant 15 minutes à température ambiante.

Rincer les lamelles 3 fois au PBS.

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Bloquer les sites non spécifiques dans 10% de sérum X pendant 1 heure à température ambiante.

Incuber les cellules dans les anticorps monoclonaux primaires dilués dans 10% de sérum X, pendant une nuit à 4°C ou pendant 2 heures à température ambiante.

Rincez les lamelles 3 fois dans du sérum X à 1%.

Incuber les cellules dans les anticorps secondaires conjugués au fluorophore dilués dans 10% de sérum X, pendant 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière.

Rincez les lamelles 3 fois dans 1% de sérum X, loin de la lumière.

Ajouter le DAPI (300 ng / ml) dans un lavage final (10 minutes) pour colorer les noyaux, si désiré Montez les lamelles sur des lames de microscope et observez la fluorescence

11. Problèmes et solutions : Problèmes

Haut niveau de bruit de fond

Origines

Peut avoir plusieurs origines : - L’anticorps primaire - Les anticorps secondaires marqués (fixation non spécifique à l’Ac primaire) - Des facteurs tissulaires (sites de liaisons non spécifiques, récepteurs Fc, protéines basiques).

Remèdes

- Diluer l’anticorps primaire - Déterminer l’origine du bruit de fond (tester l’anticorps secondaire et/ou tertiaire) Pour les facteurs autres que précédents, plusieurs possibilités : - Pour les facteurs tissulaires : o Augmenter la concentration des protéines de blocages (BSA/Sérum) o Ajouter des détergents (ex. tween 20 de 0,05% à 0,2%) o Augmenter NaCl (de 0,9% à 2,5% par étapes) o Augmenter le pH de la solution d’incubation (jusqu’à pH 9,0; faire des tampons Tris de 20 à 50 mM, éliminer le PBS)

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o Ajouter de la poly-L-lysine, protéine basique (PM 3000-6000) jusqu’à 2 mg/ml dans la solution d’anticorps primaire - Pour les aldéhydes laissés dans le tissu : o Laver les tissus o Ajouter un traitement par NH4Cl (de 10 à 100 mM) o Traiter par NaBH4 ou KBH4 dans 0,1M tampon phosphate (2-30 min, RT) 1) Méthode choisie peu - Méthode en 2-3 couches sensible pour la rareté de - Amplification enzymatique l’antigène Marquage faibles ou absents

- Récupération par traitement par des protéases (!)

- Récupération par la chaleur (!!)

2) L’antigène est masqué (sur-

fixation)

- Éviter les congélations-décongélations - Éviter les contaminations - Éviter les solutions trop diluées/concentrées

3) Détérioration de l’anticorps

4) Erreurs dans les solutions

- Recommencer (!!)

12. Informations utiles Stockage à 4°C : - Ajouter 0,1% NaN3 - Éviter de conserver des solutions diluées (sinon ajouter 0,1% BSA et 1% sérum qui diminuent le collage sur les parois du tube) - On peut aussi ajouter du glycérol (au moins 30% final, mais faire attention à la dilution finale) Conservation des anticorps Stockage à -20°C : - Faire des fractions aliquotes pour éviter la congélation – décongélation - Avec 30% glycérol mini, la solution ne congèle pas (mais attention à la dilution finale d’utilisation !)

Temps d’incubation

La vitesse de la réaction antigène anticorps est fonction de la température : - Rapide à T° ordinaire, mais bruit de fond - Plus spécifique à 4°C, mais plus lente.

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Important !

Les temps d’incubation sont toujours trop courts ! Une heure est le minimum, 2-3 h à T° labo est bien. OU MIEUX la nuit en chambre froide !

Attention: Bien faire la chambre humide

13. Annexe 13.1.

Les Immunoglobulines

Ce sont des protéines jouant un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre les agressions.

Elles appartiennent au groupe des gammaglobulines présentes non seulement dans le sang (plus spécifiquement le sérum : partie liquide du sang, plasma débarrassé de certains agents de la coagulation) mais également dans d'autres liquides de l'organisme.

Figure 18 : Représentation de différentes immunoglobulines (Source : http://biochimej.univ-angers.fr)

Il existe 5 classes d'immunoglobulines : - Les IgG sont les plus abondantes (75 à 80 % des anticorps circulants). Elles sont fabriquées lors d'un contact avec un antigène (corps étranger pour l'organisme). Elles protègent l'organisme contre les bactéries, les virus, et les toxines qui circulent dans le sang et la lymphe. D'autre part, elles fixent rapidement le complément (un des 32/45

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constituants du système immunitaire). Elles participent également à la réponse mémoire, base de l'immunité sur laquelle repose le mécanisme de la vaccination. Enfin, les immunoglobulines G. traversent le placenta et, de ce fait, entraînent une immunité passive chez le fœtus.

- Les IgA se trouvent essentiellement dans les sécrétions comme la salive, le suc intestinal, la sueur et le lait maternel. Le rôle essentiel des immunoglobulines A est d'empêcher les agents pathogènes de se lier à la cellule et plus spécifiquement aux cellules de recouvrement constituant les muqueuses et l'épiderme (couche superficielle de la peau).

- Les IgM sont des immunoglobulines sécrétées lors du premier contact de l'organisme avec un antigène. C'est la première classe d'immunoglobulines libérée par une variété de globules blancs : les plasmocytes. La présence d'IgM dans le sang indique une infection en cours.

- Les IgD sont une variété d'immunoglobulines le plus souvent attachées à la surface des lymphocytes B. où elles jouent un rôle de récepteurs des antigènes. Elles interviendraient dans la maturation des lymphocytes, c'est-à-dire dans le mécanisme permettant à ces globules blancs de devenir efficaces.

- Les IgE sont plus volumineuses que les immunoglobulines G. Elles sont sécrétées par une variété de globules blancs, les plasmocytes, dans la peau, les voies digestives, les amygdales (tonsiles) et les voies respiratoires. Cette variété d'immunoglobulines est reliée aux mastocytes et aux granulocytes basophiles (variétés de globule blanc) par une tige. Dès la capture d'un antigène, l'immunoglobuline déclenche la libération de produit participant à la réaction inflammatoire, et d'histamine entrant dans la réaction allergique. Les concentrations d'immunoglobulines augmentent en cas d'allergie grave, et en présence de parasites (parasitose) dans le tube digestif.

13.2.

Listes de quelques fluorophores

13.2.1.

Fluorophore

Alexa Fluor dyes (lié à un anticorps) λ excitation (nm)

λ émission (nm)

33/45

PM

Couleur

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Alexa Fluor 350

343

442

410

Bleu

Alexa Fluor 405

401

421

1028

Violet-bleu

Alexa Fluor 430

434

540

702

Jaune-Vert

Alexa Fluor 488

499

519

643

Vert

Alexa Fluor 514

517

542

714

Jaune-Vert

Alexa Fluor 532

530

555

724

Jaune

Alexa Fluor 546

561

572

1079

Orange

Alexa Fluor 555

553

568

1250

Jaune

Alexa Fluor 568

579

603

792

Orange-Rouge

Alexa Fluor 594

591

618

820

Rouge

Alexa Fluor 610

610

629

1285

Rouge

Alexa Fluor 633

632

648

1200

Rouge lointain

Alexa Fluor 647

652

668

1300

Rouge lointain

Alexa Fluor 660

663

691

1100

Rouge lointain

Alexa Fluor 680

680

702

1150

Rouge lointain

Alexa Fluor 700

696

719

1400

Rouge lointain

34/45

13/03/2017

Immunocytochimie

Alexa Fluor 750

13.2.2.

752

776

1300

Rouge très lointain

Cy Dyes (marqueurs synthétiques) λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Cy2

489

506

714

Vert

Cy3

(512);550

570;(615)

767

Jaune (orange)

Cy3B

558

572;(620)

658

Rouge lointain

Cy3.5

581

594;(640)

1102

Rouge lointain

(625);650

670

792

Rouge lointain

Cy5.5

675

694

1128

Rouge lointain

Cy7

743

767

818

Rouge très lointain

fluorophore

Cy5

13.2.3. fluorophore

Couleur

Marqueurs des acides nucléiques (Nucléaire) λ excitation (nm)

λ émission (nm)

Hoechst 33342

343

483

DAPI

345

455

35/45

PM

616

Notes

Se lie aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. (fluorescence bleue)

Se lie aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. (fluorescence bleue)

13/03/2017

Immunocytochimie

Hoechst 33258

345

478

624

Se lie aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. (fluorescence bleue)

SYTOX Blue

431

480

~400

DNA

Iodure de propidium

536

617

668.4

13.2.4.

Fluorophore

Marqueurs de mitochondrie λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Notes

Détection de la dépolarisation mitochondriale

TMRM

548

573

Rhodamine 123

505

530

380.83

Sonde du potentiel de membrane mitochondriale

DiOC6(3)

482

502

572.53

Lipophile qui s’insère dans les membranes des mitochondries

JC-1

514

529

652.23

Sonde du potentiel de membrane mitochondriale

MitoTracker Red CMXRos

579

600

531.52

Accumulation mitochondriale dépend du potentiel de la membrane

13.2.5.

Fluorophore

Marqueurs de membranes λ excitation (nm)

λ émission (nm)

36/45

PM

Notes

la

la

13/03/2017

Immunocytochimie

Styrenes FM1-43

472

580

611.55

S’insère dans le feuillet externe de la membrane cellulaire

FM4-64

515

640

607.51

Colore les membranes vacuolaires chez la levure

PKH26

551

567

Etiquette cellulaire

de

membrane

PKH67

490

502

Etiquette cellulaire

de

membrane

13.2.6.

Fluorophore

Marqueurs de viabilité/apoptose λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Forte affinité pour phosphatidylsérine

Annexine V

Alexa Fluo488

499

519

643

Iodure de propidium (exclusion)

493/535

636/617

668.4

13.2.7.

Fluorophore

GFP-taguée

Notes

la

Lié à l’ADN en s’intercalant entre les bases

Marqueurs de l’appareil de Golgi λ excitation (nm)

395/475

λ émission (nm)

504

37/45

PM

Notes

Taguée pour l’appareil de golgi

intégrer

13/03/2017

Immunocytochimie

NBD-C6-ceramide

466

536

575.747

Bodipy

500

510

292.0915

13.2.8.

Fluorophore

Sélectif de l’appareil de golgi et mécanismes de transport et métabolisme des sphingolipides

Marqueurs de dépendance envers le pH λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Notes

Carboxy-SNARF-1

550/575

586/641

453.4502

Mesurer les variations de pH entre pH 7 et pH 8

BCECF

490

535

808.7

Mesurer des changements dans le pH cytosolique de la plupart des cellules

13.2.1.

Fluorophore

Marqueurs de dépendance envers le calcium λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Notes

FuraRed

475/435

663/670

1089.0002

Mesure ratiométrique Ca2+ dans des cellules

Indo-1

330/347

400/482

1009.9268

Change de couleur selon la saturation de Ca2+

13.2.2.

Fluorophore

Marqueurs de fonctions cellulaires λ excitation (nm)

λ émission (nm)

38/45

PM

Notes

de

13/03/2017

Immunocytochimie

Indo-1

361/330

490/405

1010

AM ester. Low/High Ca++,

Fluo-3

506

526

855

AM ester. pH > 6

DCFH

505

535

529

2'7'Dichorodihydrofluorescei n, oxidized form

346

Dihydrorhodamine 123, oxidized form, light catalyzes oxidation

DHR

505

534

SNARF

548/579

587/635

13.2.3. fluorophore

pH 6/9

Protéines fluorescentes λexcitation (nm)

λémission (nm)

Notes

Y66H

360

442

Y66F

360

508

EBFP

380

440

monomère

EBFP2

383

448

monomère

Azurite

383

447

monomère

GFPuv

385

508

T-Sapphire

399

511

39/45

weak dimère

13/03/2017

Immunocytochimie

Cerulean

433

475

weak dimère

mCFP

433

475

monomère

ECFP

434

477

CyPet

435

477

Y66W

436

485

mKeima-Red

440

620

monomère (MBL)

TagCFP

458

480

dimère (Evrogen)

AmCyan1

458

489

tetramère; (Clontech)

mTFP1

462

492

dimère

S65A

471

504

Midoriishi Cyan

472

495

Wild Type GFP

396,475

508

S65C

479

507

TurboGFP

482

502

dimère; (Evrogen)

TagGFP

482

505

monomère (Evrogen)

40/45

weak dimère

dimère (MBL)

13/03/2017

Immunocytochimie

S65L

484

510

Emerald

487

509

S65T

488

511

EGFP

488

507

weak dimère; (Clontech)

Azami Green

492

505

monomère (MBL)

ZsGreen1

493

505

tetramère; (Clontech)

TagYFP

508

524

monomère (Evrogen)

EYFP

514

527

weak dimère; (Clontech)

Topaz

514

527

monomère

Venus

515

528

weak dimère

mCitrine

516

529

monomère

YPet

517

530

weak dimère

TurboYFP

525

538

dimère; (Evrogen)

ZsYellow1

529

539

tetramère; (Clontech)

Kusabira Orange

548

559

monomère (MBL)

41/45

weak dimère; (Invitrogen)

13/03/2017

Immunocytochimie

mOrange

548

562

monomère

mKO

548

559

monomère

TurboRFP

553

574

dimère; (Evrogen)

tdTomato

554

581

tandem dimère

TagRFP

555

584

monomère (Evrogen)

DsRed monomère

556

586

monomère; (Clontech)

DsRed2 ("RFP")

563

582

(Clontech)

mStrawberry

574

596

monomère

TurboFP602

574

602

dimère; (Evrogen)

AsRed2

576

592

tetramère; (Clontech)

mRFP1

584

607

monomère; (Tsien lab)

J-Red

584

610

dimère

mCherry

587

610

monomère

HcRed1

588

618

dimère; (Clontech)

Katusha

588

635

dimère

42/45

13/03/2017

Immunocytochimie

mKate (TagFP635)

588

635

monomère (Evrogen)

TurboFP635

588

635

dimère; (Evrogen)

mPlum

590

649

mRaspberry

598

625

13.2.4.

monomère; faster photobleach than mPlum

Fluorophores conjugués

fluorophore

λ excitation (nm)

λ émission (nm)

PM

Notes

Hydroxycoumarin

325

386

331

Succinimidyl ester

Aminocoumarin

350

445

330

Succinimidyl ester

Methoxycoumarin

360

410

317

Succinimidyl ester

Cascade Blue

(375);401

423

596

Hydrazide

Pacific Blue

403

455

406

Maleimide

Pacific Orange

403

551

Lucifer yellow

425

528

NBD

466

539

294

NBD-X

R-Phycoerythrin (PE)

480;565

578

240 k

43/45

13/03/2017

Immunocytochimie

aka Cychrome, R670, TriColor, Quantum Red

PE-Cy5 conjugates

480;565;650

670

PE-Cy7 conjugates

480;565;743

767

Red 613

480;565

613

PE-Texas Red

PerCP

490

675

Peridinin chlorphyll protein

TruRed

490,675

695

PerCP-Cy5.5 conjugate

FluorX

494

520

587

(GE Healthcare)

Fluorescéine

495

519

389

FITC; pH sensitive

BODIPY-FL

503

512

TRITC

547

572

444

TRITC

X-Rhodamine

570

576

548

XRITC

Lissamine Rhodamine 570 B

590

Texas Red

589

615

625

Sulfonyl chloride

Allophycocyanin (APC)

650

660

104 k

APC-Cy7 conjugates

650;755

767

44/45

PharRed

13/03/2017

Immunocytochimie

14. Bibliographie : - http://www.futura-sciences.com/sciences/dossiers/physique-luminescence-tousetats-1498/page/3/

- http://www.pourlascience.fr/ewb_pages/a/article-l-enigme-de-la-photoluminescence28309.php - http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/doscel/decouv/ximg/micros/fluo2.htm

- http://anabible.webethan.org/spip.php?article3694&lang=fr - https://www.ihcworld.com/

- BAKER JR. Principles of biological microtechnique. Methuen and Co, London, 1958

- Perméabilisation photocontrôlée de la membrane biologique : étude en systèmes modèles et en cellules, Dimitra Milioni, Thèse, 2012 - Maladies à virus des plantes ornementales Par Josette Albouy,Jean-Claude Devergne

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