Crispr cas9 outil révolutionnaire d'édition du génome

Table des matières 1.

2.

Introduction :....................................................................................................................................4 1.1.

Un peu d’histoire : ....................................................................................................................4

1.2.

Le système CRISPR-Cas9 : un système immunitaire d’origine procaryote ...............................6

1.3.

Vidéo détaillant le fonctionnement du système CRISPR-Cas9 : ...............................................7

1.4.

Quelques précisions : ...............................................................................................................7

Le système CRISPR-Cas9 adapté à l’édition du génome : ................................................................9 2.1.

Le principe de cette technique repose sur la création de cassures double-brin de l’ADN : ..10

2.2.

Génération de mutants knock-out par la méthode d’édition du génome CRISPR-Cas9 :......11

2.3. Réalisation de modifications précises du génome utilisant le mécanisme de recombinaison homologue : .......................................................................................................................................13

3.

4.

2.4.

Activation et répression de gènes : ........................................................................................14

2.5.

Diminution des effets « off-target » :.....................................................................................15

2.6.

Développement de systèmes CRISPR-Cas9 inductibles : .......................................................16

2.7.

Exemples de cellules et d’organismes ayant été modifiés par CRISPR-Cas9 .........................17

2.8.

Le système CRISPR-Cas9, outil révolutionnaire de génie génétique :....................................17

Découvertes réalisées avec le système CRISPR-Cas9 : ...................................................................19 3.1.

Tyrosinémie de type I : ...........................................................................................................19

3.2.

Myopathie de Duchenne : ......................................................................................................19

3.3.

Rétinite pigmentaire :.............................................................................................................19

3.4.

« Gene drive » également appelé « gène transmissible » : ...................................................20

Débats de Bio-Ethique : ..................................................................................................................20 4.1.

Les OGM : ...............................................................................................................................20

4.2.

Création d’animaux génétiquement modifiés à des fins non scientifiques : .........................21

4.3. Modification de porcs pour produire des organes potentiellement implantables chez l’Homme : ...........................................................................................................................................21

5.

4.4.

Expériences chez le singe : .....................................................................................................22

4.5.

Expériences chez l’Homme : ..................................................................................................22

4.6.

Les avancées promises par CRISPR-Cas9 : ..............................................................................22

4.7.

Conclusion sur le système CRISPR-Cas9 : ...............................................................................23

Annexe 1 : .......................................................................................................................................24

Table des illustrations Figure 1 : Identification des motifs répétés (locus CRISPR), (source : www.nature.com) .......................5 Figure 2 : Identification des séquences de bactériophages entre les séquences CRISPR (source : www.nature.com) ....................................................................................................................................5 Figure 3 : La séquence PAM a toujours une séquence de type NGG .......................................................6 Figure 4 : Mécanisme général induisant le clivage de l'ADN du bactériophage par le système CRISPRCas9 (source : http://www.origene.com) ................................................................................................7 Figure 5 : Schéma décrivant le fonctionnement canonique de CRISPR-Cas9 (crRNA=gRNA) (source : www.nature.com) ....................................................................................................................................8 Figure 6 : Modèle présentant la méthodologie de génération d'une coupure double-brin par la méthode CRISPR-Cas9 (source : www.sigmaaldrich.com) .......................................................................9 Figure 7 : Exemple de plasmide utilisé pour induire l'expression du système CRISPR-Cas9 dans des cellules eucaryotes (source: www.scbt.com).........................................................................................10 Figure 8 : Schéma représentant les mécanismes de réparation de l'ADN impliqués dans l'édition du génome par le système CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com) ........................................................10 Figure 9 : Génération de mutants KO en utilisant la méthode d'édition du génome CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com) ................................................................................................................................12 Figure 10 : Schéma décrivant la modification précise du génome par la technologie CRISPR-Cas9, utilisant le phénomène de recombinaison homologue (source : www.nature.com) ............................13 Figure 11 : Schéma détaillant l’activation ou la répression transcriptionnelle des gènes par la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com) ..........................................................................14 Figure 12 : Système CRISPR-Cas9 inductible par la rapamycine (source : www.nature.com) ...............16 Figure 13 : Exemples publiés de types cellulaires et d’organismes modifiés par la méthodologie CRISPRCas9 (source : www.nature.com) ...........................................................................................................17 Figure 14 : Développement d'un nouveau modèle cellulaire avec la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com) ..................................................................................................................................18 Figure 15 : Développement d'un nouveau modèle animal avec la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com) ..................................................................................................................................19 Figure 16 : Lévrier sain (à gauche) et lévrier souffrant d'une mutation naturelle de la myostatine (à droite) .....................................................................................................................................................21 Figure 17 : Schéma résumant les études menées chez le porc dans le but de réaliser des transplantations chez le primate (source : www.nature.com) ..............................................................22

Classiquement, la modification du génome ne permet pas de modification endogène de l’ADN des cellules. Fréquemment, les modifications se font en deux étapes. Tout d’abord les cellules sont transfectées avec un plasmide via du calcium phosphate, des liposomes artificiels, l’électroporation, des particules virales (ADN, ARN). Le plasmide peut être intégré ou non à l’ADN. Dans le cas où il est intégré à l’ADN, l’expression du gène d’intérêt est stable et peut être transmises aux cellules filles lors de la mitose. Il faut alors exercer une pression de sélection afin de sélectionner les cellules ayant incorporé le plasmide. Dans le cas où le plasmide n’est pas intégré dans le génome de la cellule, l’expression est transitoire et dure 2 à 3 jours. Ces stratégies permettent l’expression de protéines mutées ou de protéines de fusion. Il est également possible d’utiliser ces stratégies pour inhiber l’expression d’une protéine endogène via des siRNA ou shRNA. Ces stratégies ont conduit à la mise au point de centaines de plasmides différents, présentant des milliers de constructions. Les clonages sont plus ou moins difficiles selon l’insert.

Le système CRISPR-Cas9 constitue une révolution dans le secteur car il permet de réaliser une multitude de modifications du génome des cellules conduisant à une modification du gène endogène.

De plus, ce système est particulièrement simple d’utilisation.

-

Agir sur les protéines endogènes

-

Les modifications sont réalisables sur tous les types de cellules (poissons, mammifères, plantes, insectes)

-

Il est possible de tagger les protéines

-

Il est possible d’éteindre l’expression des protéines

-

Il est possible de programmer l’expression (inductible)

-

La localisation d’un gène peut être étudiée

1.1. Un peu d’histoire : 1987 : Atsuo Nakata découvre le locus « CRISPR-Cas9 » dans la bactérie E. Coli. Il observe la présence de séquences répétées qu’il identifie (LCTR : Long Clusters of Tandem Repeats, SPIDR : Spacer Interspaced Direct Repeats …). Il n’identifie aucune fonction de ce locus.

Figure 1 : Identification des motifs répétés (locus CRISPR), (source : www.nature.com)

2002 : Il faut attendre 15 ans et les travaux de Léo Shouls aux Pays-Bas pour que l’on identifie les séquences répétées sous le nom de CRISPR (Clustered Regularly interspaced Palindromic Repeats, courtes répétitions en palindrome regroupées et régulièrement espacées).

2005 : Trois équipes découvrent en même temps que le site CRISPR possède des morceaux de bactériophages. Cependant, rien ne permet de déterminer quelles sont les fonctions de ces séquences

Figure 2 : Identification des séquences de bactériophages entre les séquences CRISPR (source : www.nature.com)

2007-2010 : Philippe Horvath et Rodolphe Barrangou travaillant pour la société Danisco que le système CRISPR-Cas9 constitue le système immunitaire de la bactérie.

2012 : Les Dr Doudna de l’Université de Berkeley et Charpentier travaillant maintenant à l’institut Max Planck à Berlin, publient un article relatant la mise au point d’une nouvelle technique de génie génétique : CRISPR/Cas9.

Environ 10 virus peuvent être associés à chaque cellule vivante présente sur Terre. Les virus sont des facteurs clés de l’écologie et de l’évolution des organismes en assumant le rôle de prédateurs et de facilitateur de l’échange génétique. Il en va de même pour certaines bactéries. Chez les organismes procaryotes, il existe un système complexe de défense contre les pathogènes basé sur la présence de régions d’ADN appelées Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ou CRIPR regions.

Les séquences CRIPR sont des séquences courtes, répétées sur l’ADN et séparées par des séquences appelées « spacers ». Ces séquences spacers proviennent de fragments d’ADN de virus et de plasmides incorporées par l’organisme après la reconnaissance d’un pathogène. Ces spacers sont utilisés par les procaryotes pour reconnaître et détruire les virus. En effet, lorsque le procaryote est à nouveau attaqué par un pathogène, l’ADN du pathogène est reconnue par les séquences CRISPR. Cela active l’expression de gènes CRISPR associated (Cas) qui sont généralement adjacents aux séquences CRISPR et d’un ARN guide composé d’un crRNA (CRISPR RNA) et d’un tacrRNA (ARN trans-activateur du crRNA).

Le crRNA et le tracrRNA s’associent en dimère et forment un « guide » (gRNA) qui vient s’intégrer dans la Cas9. Les Cas9 sont des nucléases clivant l’ADN et générant uniquement des cassures doubles brins.

La Cas9 produite reconnait alors la séquence ADN du bactériophage, non pas au moyen du guide gRNA, mais d’un domaine de reconnaissance de sites particuliers de l’ADN de pathogène qu’elle porte à sa surface. Ces séquences ont une taille de 2-6 nucléotides et sont appelés séquences PAM (Protospacer Adjacent Motif). La Cas9 reconnait la séquence PAM sur l’ADN du bactériophage et s’y fixe.

La séquence PAM a une séquence de type NGG. Chez l’Homme, ce type de motif a une fréquence de 5,21%, soit 161 284 793 sites NGG dans le génome. Il n’est donc pas difficile d’imaginer que la fixation de la Cas9 sur la séquence PAM suffise à elle seule à définir un site de clivage de l’ADN.

Il faut en effet que le dimère crRNA-tracrRNA s’hybride sur l’ADN du

Figure 3 : La séquence PAM a toujours une séquence de type NGG

bactériophage, identifiant clairement la cible, pour que la Cas9 génère une coupure double-brin. Cette coupure double-brin est toujours générée 3 nucléotides en amont de la séquence PAM. Il est à noter que l’ARN guide ne contient pas de séquence reconnaissant le PAM.

Figure 4 : Mécanisme général induisant le clivage de l'ADN du bactériophage par le système CRISPR-Cas9 (source : http://www.origene.com)

Le système CRISPR-Cas9 est au premier abord relativement complexe. De nombreuses animations ont été créées afin de l’expliquer d’une manière visuelle. Cependant, la plupart de ces vidéos ne sont que partiellement vraies, omettant dans la plupart des cas le rôle prépondérant des séquences PAM dans le processus. Ci-dessous est indiqué le titre et le lien d’une vidéo disponible sur YouTube et détaillant d’une manière précise le mécanisme.

Genome Editing with CRISPR-Cas9 (à partir de 2 :08) https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8 https://www.youtube.com/watch?v=MnYppmstxIs

Afin de comprendre comment fonctionne le système d’édition du génome CRISPR-Cas9 utilisé en laboratoire ainsi que les améliorations qui lui ont été apportées, il est nécessaire d’apporter quelques précisions quant à son fonctionnement précis.

La Cas9 n’est pas la seule nucléase liée aux domaines CRISPR et impliquée dans le système immunitaire des bactéries. Il existe en effet plusieurs types de Cas. Ces nucléases peuvent n’être composées que d’une seule protéine (monoprotéiques) ou nécessiter la formation de complexes (multiprotéiques).

Elles peuvent également générer des coupures simples brins ou doubles-brins, avoir la capacité d’intégrer seules le gRNA ou non … Les Cas sont ainsi réparties en deux classes (monoprotéiques ou multiprotéiques), 5 types et 16 sous-types selon leurs caractéristiques. Parmi cette famille, seule la Cas9 a la propriété d’être monoprotéique, de pouvoir intégrer le gRNA et de générer une cassure double brin.

Il faut également noter que le système CRISPR-Cas9 appartient au système immunitaire bactérien de type 2, l’un des trois grands types de systèmes immunitaires bactériens basés sur la destruction de l’ADN du bactériophage.

Dans le système de type II, contrairement aux autres systèmes, seule la Cas9 peut cliver les séquences d’acides nucléiques. Dans ce-dernier, la Cas9 participe à la maturation du crRNA et est responsable de la destruction de l’ADN cible. L’activité enzymatique de la Cas9 est basée sur la présence de deux domaines nucléase : RuvV-like nuclease domain localisé au niveau de sa partie N-terminale, et le HNHlike nuclease domaine qui est basé au niveau de la partie centrale de la protéine.

Figure 5 : Schéma décrivant le fonctionnement canonique de CRISPR-Cas9 (crRNA=gRNA) (source : www.nature.com)

Pour permettre à la Cas9 de cliver, le crRNA ainsi qu’un ARN trans-activateur et partiellement complémentaire du crRNA sont nécessaires. Le tracrRNA (= ARN trans-activateur) est essentiel pour la maturation du transcrit primaire du crRNA en pré-crRNA multiples. Cela se produit en présence de la RNaseIII et de la Cas9.

Lors de la destruction de l’ADN cible, les domaines HNH et RuvC de la Cas9 clivent chacun un des brins de l’ADN, générant une cassure double brin au niveau d’un site cible de 20 nucléotides associé au crRNA. Il est à noter que le domaine HNH clive le brin complémentaire du crRNA alors que le domaine RuvC clive le brin non-complémentaire.

Ce système a été adapté pour induire des cassures doubles-brins séquences-spécifiques. Ce système requière deux composants : la cas9 et un ARN guide (gRNA) issu de la fusion entre le crRNA et le tracrRNA. Le guide n’est plus constitué d’un dimère crRNA-tracrRNA mais d’un gRNA produit in vitro et possédant à la fois les caractéristiques du crRNA et du tracrRNA.

Figure 6 : Modèle présentant la méthodologie de génération d'une coupure double-brin par la méthode CRISPR-Cas9 (source : www.sigmaaldrich.com)

La séquence « spacer » du gRNA est complémentaire de la séquence de l’ADN cible. Dans le système le plus répandu, dérivé de la bactérie S. pyrogenes, la Cas9 induit une coupure double-brin de l’ADN

sur les 20 nucléotides situés en 5’ du gRNA. Il est important de noter une différence fondamentale entre le système bactérien et le système utilisé couramment en laboratoire. Les bactéries répondent à l’agression par des bactériophages, c’est-à-dire à la présence d’ADN étranger dans leur cytoplasme. Les bactéries ne possédant pas de noyau, les Cas9 sont produites directement dans le cytoplasme par les plasmides. Dans les systèmes utilisés pour l’édition du génome de cellules eucaryotes, les Cas9 portent un domaine NLS qui leur permettent d’accéder à l’ADN au sein du noyau.

La Cas9 et l’ARN guide sont produits dans la cellule via un plasmide, comme celui représenté cidessous. Il est possible d’implémenter de nombreux gènes (GFP, LoxP, RFP …) afin de modifier le système pour qu’il réponde au mieux au protocole expérimental.

Figure 7 : Exemple de plasmide utilisé pour induire l'expression du système CRISPR-Cas9 dans des cellules eucaryotes (source: www.scbt.com)

Une étape cruciale de cette technique est la création de cassures doubles-brins de l’ADN matrice au niveau du locus que l’on souhaite modifier. Cette cassure double brin est alors réparée par recombinaison

homologue

(HDR

:

homology-directed repair) ou par nonhomologous end-joining (NHEJ). Ces phénomènes modifier

permettent

le

transcriptionnel

cadre d’une

de

alors

de

lecture séquence

Figure 8 : Schéma représentant les mécanismes de réparation de l'ADN impliqués dans l'édition du génome par le système CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

codante ou de sites de fixation d’éléments trans-régulateurs au niveau de séquences régulatrices ou promotrices. La HDR peut être utilisée pour introduire des mutations ponctuelles spécifiques ou pour insérer des séquences d’intérêt via la recombinaison du locus cible à partir d’ADN exogène ou de fragments d’ADN d’intérêt placés dans le milieu réactionnel par le manipulateur. En utilisant des nucléases spécifiques, l’efficacité de la HDR est supérieure à 1% et peut dans certains cas excéder 50%, permettant une vérification de la présence de la mutation par simple screening, sans l’utilisation de marqueurs de résistance à une drogue permettant la sélection.

Les premières expériences de génération de cassures doubles-brins utilisaient des technologies basées sur des protéines dont il était possible de modifier le site de fixation à l’ADN comme des méganucléases, des nucléases à doigt de zinc et des transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Chacune de ces technologies a permis des avancées majeures, mais chacune présente ses propres avantages et inconvénients (annexe 1). Dans le système CRISPR/Cas9 la plus répandue, la CRISPR-associated protein 9 nuclease (Cas9) de Streptococcus pyogenes est utilisée. Il s’agit d’une nucléase guidée par l’ARN, ce qui signifie qu’elles reconnaissent la séquence PAM et l’appariement entre un ARN synthétisé in vitro et l’ADN cible, contrairement aux ZFN et TALEN qui sont basées sur l’interaction ADN-protéine.

Afin de générer un KO (comme toute autre mutation), il faut veiller à ce que : -

Le gRNA ait une séquence unique, non redondante avec le reste du génome

-

La séquence cible soit présente immédiatement en amont du PAM

Une fois exprimées, la Cas9 et le gRNA s’associent en un complexe riboprotéique. La structure en « épingle à cheveux » (« scaffold » sur le schéma) du gRNA s’associe à la structure chargée positivement de la Cas9. La Cas9 change alors de conformation autour du gRNA, permettant à la Cas9 de passer d’une forme inactive ne pouvant pas lier l’ADN, à une forme active pouvant se lier à l’ADN cible. Le gRNA se lie alors à l’ADN cible via son PAM (également appelé spacer, notamment sur la figure 6). En fonction de sa complémentarité avec l’ADN cible, le gRNA va pouvoir s’associer ou non avec l’ADN cible, dans le sens 3’  5’.

La Cas9 ne va cliver l’ADN que si le gRNA est suffisamment complémentaire de la séquence cible. Afin de cliver l’ADN, la Cas9 modifie une nouvelle fois sa conformation afin que ses deux

Figure 9 : Génération de mutants KO en utilisant la méthode d'édition du génome CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

sous-unités (HNH et RuvC) puissent générer chacune une cassure simple brin, respectivement sur le brin complémentaire et non-complémentaire. La Cas9 peut alors générer une cassure double-brin.

Le NHEJ est le mécanisme de réparation le plus actif, capable de réparer rapidement les cassures de l’ADN. Cependant, cela résulte fréquemment en l’insertion ou la délétion de quelques nucléotides au niveau du site de cassure double brin. Le caractère aléatoire du NHEJ est très important en pratique car une cellule exprimant la Cas9 et le gRNA va générer une multitude de mutations différentes. Dans la plupart des cas, le NHEJ crée de petites délétions, créant au sein de l’ORF du gène cible une modification du cadre de lecture, l’apparition d’un codon stop prématuré… Idéalement, le résultat final est une perte de fonction du gène cible. Cependant, expérimentalement, la puissance du KO sera déterminée par la capacité résiduelle du gène à avoir une fonction au sein du modèle.

Alors que le NHEJ est un mécanisme de réparation imparfait et occasionne souvent des modifications du cadre de lecture, la recombinaison homologue permet de générer des changements nucléotidesspécifiques, que ce soit pour un seul nucléotide ou de grands fragments.

Afin d’utiliser la recombinaison homologue, il faut fournir à la cellule, en plus du gRNA et de la Cas9, une séquence d’ADN matrice. La matrice ADN doit contenir, en plus de la séquence que l’on souhaite insérer, des séquences directement en amont et en aval de la cible (nommés « left & right homology arms »). La taille et la position du site de fixation à l’ADN de chaque bras dépend de la taille de la séquence que l’on souhaite modifier. La matrice peut être un ADN simple brin, un ADN double brin, ou un ADN double brin

plasmidique,

en

fonction

de

l’application. Il est à noter que la séquence que l’on souhaite insérer ne doit pas contenir de séquence PAM contenue dans l’ADN génomique, sinon, la matrice que l’on souhaite insérer peut devenir une cible de la Cas9.

Figure 10 : Schéma décrivant la modification précise du génome par la technologie CRISPR-Cas9, utilisant le phénomène de recombinaison homologue (source : www.nature.com)

L’efficacité de la HDR est généralement faible (<10% d’allèles modifiés), même si ces cellules expriment la Cas9, le gRNA et la matrice ADN que l’on souhaite insérer. Pour cette raison, de nombreux laboratoires essaient de synchroniser le cycle cellulaire des modèles avec la phase où la HDR est la plus active ou encore d’inhiber le NHEJ chimiquement ou génétiquement.

La faible efficacité de la HDR pose de problème expérimentalement. Puisque l’efficacité de clivage par la Cas9 est relativement haute et celle de la HDR relativement basse, une grande partie des cassures doubles-brins induites par la Cas9 seront réparées par NHEJ. En d’autres termes, la population de cellules que l’on souhaite modifier contiendra des cellules non modifiées, des cellules dont l’ADN aura été réparé par NHEJ et/ou des cellules dont l’ADN aura incorporé la séquence désirée par HDR. Il est

important de confirmer la modification de l’ADN sur la population et si nécessaire, isoler les clones qui ont la modification d’intérêt.

L’outil CRISPR-Cas9 permet l’édition du génome de manière remarquablement flexible. La Cas9 a la capacité de lier l’ADN cible dans une conformation particulière et de changer de conformation pour le cliver. Il est possible d’empêcher la Cas9 de réaliser son activité nucléase en effectuant des mutations ponctuelles au niveau des domaines RuvC et HNH. Cette Cas9 sans activité nucléase ou « dead Cas9 » (dCas9) conserve tout de même la capacité à se lier à l’ADN via le gRNA. Il est possible d’utiliser la dCas9 et les gRNA pour cibler les sites d’initiation de la transcription permettant ainsi de réprimer l’expression de gènes en bloquant l’initiation de la transcription.

Il est également possible de marquer la dCas9 avec des facteurs de transcription activateurs ou répresseurs et de cibler des régions promotrices, résultant en une augmentation importante de l’activation ou de la répression transcriptionnelle des gènes. La forme la plus simple de dCas9 consiste en une dCas9 fusionnée avec des

Figure 11 : Schéma détaillant l’activation ou la répression transcriptionnelle des gènes par la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

activateurs transcriptionnels (figure 8 A) ou des répresseurs transcriptionnels (R). Des formes plus élaborées ont également été développées. Cela inclut des dCas9 marquées avec des épitopes particuliers, reconnus par des anticorps activateurs (figure 8 B), des dCas9 fusionnées avec plusieurs domaines activateurs en série (figure 8 C) ou encore des dCas9 co-exprimées avec VP6 et un gRNA dont la structure en épingle à cheveux a été modifiée ainsi que des éléments se liant à l’ARN et aidant l’activation de la transcription (figure 8 D).

Il est également possible d’étudier la localisation d’une séquence sur un génome en fusionnant la dCas9 à une molécule comme la GFP. Le signal émis par la molécule fluorescente permet alors de déterminer les sites où a séquence est présente, comme lors d’expériences de chromosome painting.

L’utilisation de dCas9 présente également l’intérêt d’être une modification réversible, puisque la Cas9 est privée de son activité nucléase et ne peut donc pas occasionner de dommages à l’ADN.

Même si le fonctionnement du système CRISPR-Cas9 n’est pas encore totalement élucidé, de nombreux chercheurs ont commencé à explorer diverses approches dans le but de limiter les effets « off-target ». Il est à noter que les logiciels permettant de déterminer la séquence des gRNA indiquent le pourcentage théorique de off-target qui sera obtenu sur le modèle étudié.

Le système CRISPR-Cas9 est très spécifique lorsque les gRNA sont synthétisés correctement, mais cela pose de plus grands problèmes lorsque la méthode est utilisée en clinique. La spécificité de la méthode provient en majorité de la spécificité des gRNA pour la séquence cible. En théorie, le gRNA doit avoir une séquence parfaitement homologue à la cible et aucune homologie avec le reste du génome.

Cependant, en pratique, il est très fréquent qu’un ARN guide présente des homologies de séquence ailleurs dans le génome.

Une première approche consiste à diminuer les concentrations en gRNA et en Cas9. Plusieurs équipes ont obtenu des résultats différents. Une première équipe a observé une diminution des effets offtarget bien plus importante que celle des effets on-target (Hsu, P.D. et al., 2013) alors qu’une autre équipe a observé une diminution comparable des effets on et off target (Fu, Y. et al., 2013). L’utilisation de gRNA tronquées au niveau de leur extrémité 3’ ou présentant deux guanines supplémentaires en 5’ ont permis de diminuer l’effet off-target mais l’efficacité de l’expérience en était également affectée.

Une autre approche a consisté à modifier la Cas9 elle-même. Comme il l’a été évoqué précédemment, la Cas9 génère des cassures doubles-brins de l’ADN via l’activité de deux domaines à activité nucléase : RuvC et HNH. Les acides aminés présents au niveau de chaque domaine nucléase sont connus, et il a été possible de générer des Cas9 modifiées au sein desquelles un seul domaine à activité nucléase est actif. Ces Cas9 sont appelées « Cas9 nickases ». Les Cas9 nickases sont donc capables de se lier à l’ADN et de réaliser une cassure simple brin grâce au gRNA (cassures appelées « nick » en anglais, ou entaille en français). Les cassures simples brins sont rapidement résorbées par HDR en utilisant le brin complémentaire comme matrice. Cependant, la technique CRISPR-Cas9 est basée sur des cassures doubles-brins. Deux Cas9 nickases différentes sont donc utilisées pour générer des cassures doublesbrins, chacune mutée soit sur la sous-unité RuvC, soit sur la sous-unité HNH. Cela augmente très grandement la spécificité de la méthode car pour générer un effet off-target il faudra que Cas9 nickases génèrent un effet off-target suffisamment proche pour générer des dommages à l’ADN repérés par la machinerie de réparation de la cellule comme étant une cassure double-brin. Ainsi, si la spécificité de

la coupure ainsi que la réduction des effets off-target sont cruciaux, il faut considérer l’utilisation de Cas9 nickases.

Il est à noter que l’utilisation d’une Cas9 nickase unique peut être combinée avec l’édition du génome médiée par HDR citée précédemment afin de réaliser une édition hautement spécifique d’un gène cible.

Le système CRISPR-Cas9 peut être modifié dans le but d’en faire un système inductible. Il existe par exemple des systèmes inductibles à la rapamycine comme présenté ci-dessous. Il suffit pour cela de modifier le promoteur du système CRISPR-Cas9.

Figure 12 : Système CRISPR-Cas9 inductible par la rapamycine (source : www.nature.com)

Cette méthode d’édition du génome a permis de modifier de nombreuses cellules et organismes, comme le présente la liste non-exhaustive ci-dessous.

Figure 13 : Exemples publiés de types cellulaires et d’organismes modifiés par la méthodologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

L’outil CRISPR-Cas9 constitue une révolution dans le domaine de la biologie car il est : -

Peu coûteux comparé aux méthodes traditionnelles

-

Fiable, et présente un pourcentage de off-target modéré

-

Simple d’utilisation et de production

-

Présente un impact phénoménal sur la société

Pour être plus concret, il est possible de présenter l’impact de ce système sur la génération de modèles cellulaires ou animaux.

Le développement d’un modèle cellulaire peut nécessiter plusieurs mois de travail pour un résultat parfois partiellement biaisé du fait des limites des technologies. Avec le système CRISPR-Cas9, de nombreux modèles cellulaires peuvent être développés en un temps record, comme en atteste la figure ci-dessous.

Figure 14 : Développement d'un nouveau modèle cellulaire avec la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

Dans le cas des modèles animaux, le système CRIPR-Cas9 permet de générer des modèles de mutants en un temps largement inférieur à celui nécessité par les stratégies classiques. En effet, comme en atteste le panneau ci-dessous, cette technologie permet de diminuer le temps nécessaire à la création d’un mutant de 6 mois-1 an à 6-8 semaines. Cela a notamment conduit à une explosion du nombre de mutants créés avec cet outil au cours des quatre dernières années.

Figure 15 : Développement d'un nouveau modèle animal avec la technologie CRISPR-Cas9 (source : www.nature.com)

La tyrosinémie de type I est une affection sévère du rein due à une mutation de la fuamrylacétoacétate-hydrolase. Les chercheurs ont injecté le système CRISPR-Cas9 avec des copies saines du gène FAH. Après une seule injection, 6% des hépatocytes ne portaient plus la mutation FAH, prouvant l’efficacité du système.

La myopathie de Duchenne est due à une mutation dans l’exon 23 du gène codant pour la dystrophine, introduisant un codon STOP et entraînant une disparition de la protéine. Cela induit une perte du renforcement et de la protection des fibres musculaires.

Les chercheurs ont utilisé la Cas9, deux gRNA flanquants l’exon 23 et un gène donneur réparant le cadre de lecture dans des cellules satellites (cellules souches du muscle strié squelettique). Ces cellules modifiées ont été injectées en intramusculaire dans des souris. Les chercheurs ont observé un retour du tonus musculaire après 24h.

La rétinite pigmentaire est une affection sévère de l’œil entraînant une perte progressive de la vue.

Elle est due à une mutation du gène de la rhodopsine qui conduit à la dégradation des cônes et des bâtonnets. Les chercheurs ont utilisé la Cas9 avec le gRNA dirigé contre la zone mutée et le gène

donneur de la séquence WT. L’injection sous-rétinienne a conduit à un retour de la fonction visuelle des souris.

Il est à noter que l’œil est un modèle particulièrement intéressant pour la thérapie génique. En effet, l’œil est faiblement vascularisé, limitant les éventuels effets off-target découlant d’un passage des vecteurs dans le sang. De plus, le système immunitaire est peu abondant dans l’œil, limitant les réactions inflammatoires et les rejets.

Le gene drive est une stratégie permettant en théorie de lutter contre la transmission de pathogènes.

Ainsi, des moustiques, vecteurs de la malaria, ont été modifiés par le système CRISPR-Cas9 pour produire naturellement un antiparasite. Les moustiques deviennent donc résistants aux parasites et transmettent cette résistance à la descendance.

Les avancées sur le système CRISPR-Cas9 ouvrent de grandes possibilités en matière de recherche et développement. Cependant, les lois bioéthiques ne règlementent pas encore strictement les études menées avec ce système et la législation n’a pas encore évolué depuis les premières avancées réalisées avec ce système. De nombreux laboratoires profitent des imprécisions de la législation et cela crée de nombreux débats en matière de bioéthique.

Selon la législation, un OGM est un organisme (animal, végétal, bactérie) dont on a modifié le matériel génétique (ensemble de gènes) par une technique dite de « génie génétique » pour lui conférer une caractéristique nouvelle. Les trente dernières années ont vu se développer des techniques modernes de « génie génétique », consistant à introduire un ou plusieurs gènes dans le patrimoine génétique d’un organisme et de construire des organismes sites « génétiquement modifiés » (…)

Un organisme est donc considéré comme OGM s’il découle de l’insertion dans son génome d’ADN étranger. Cependant, les mutants obtenus par CRISPR-Cas9 ne possèdent pas d’ADN étranger dans leur génome, les cellules ayant intégré les gènes d’intérêt. Techniquement, les organismes obtenus par le système CRISPR-Cas9 ne sont donc pas différenciables de mutants naturels ou d’une variété traditionnelle. De nombreuse sociétés, dont Monsato, utilisent cette imprécision dans la législation pour essayer de mettre sur le marché des OGM non considérés comme des organismes génétiquement

modifiés. C’est ainsi que des champignons génétiquement modifiés sont commercialisés aux Etats-Unis sans que quoique ce soit n’indique qu’ils sont issus de modifications génétiques.

Des équipes chinoises ont développé des chiens de chasse dont le gène de la myostatine a été muté.

Ce facteur de croissance limite la croissance des tissus musculaires. Cette mutation est retrouvée naturellement chez certains lévriers qui développent alors une masse musculaire 50% supérieure à la normale (figure 15). En utilisant la technique d’édition du génome CRISPR-Cas9, une équipe du Key Laboratory of Regenerative Biology Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health (GIBH) ont produit des lévriers dont la masse musculaire est deux fois supérieure à la normale.

Figure 16 : Lévrier sain (à gauche) et lévrier souffrant d'une mutation naturelle de la myostatine (à droite)

Plusieurs équipes cherchent actuellement à modifier génétiquement des porcs afin que leurs organes soient utilisables pour des transplantations chez l’Homme. Plusieurs études ont déjà démontré que des organes de porcs génétiquement modifiés pouvaient survivre plusieurs mois voire plusieurs années lorsqu’ils étaient implantés chez des primates.

Figure 17 : Schéma résumant les études menées chez le porc dans le but de réaliser des transplantations chez le primate (source : www.nature.com)

Des singes génétiquement modifiés sur les gènes codant pour le facteur de transcription PPARet le gène RAG1 permettant la recombinaison des gènes d’immunoglobuline ont été générés. Les embryons ont été mutés par le système CRISPR-Cas9. Sur les 86 embryons, 71 ont survécu et 28 singes ont été génétiquement modifiés.

Deux études ont été menées en Chine sur des embryons humains non viable, l’une en 2014 et l’autre en 2016. Les expériences ont été stoppées au stade 8-10 cellules, considéré comme le premier stade auquel les embryons sont considérés comme « humains ». Les embryons ont été mutées sur le récepteur CCR6 aux chémokines, impliqué dans le système immunitaire. Parmi les embryons mutés, 4 avaient la mutation sans aucun effet off-target.

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Optimiser les gènes d’un individu, notamment humain

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Soigner de nombreuses maladies

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Eradiquer les espèces nuisibles

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Corriger le patrimoine génétique de toute la descendance

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Produire des OGM sans ADN étranger

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Inventer de nouveaux animaux

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Immuniser les vecteurs contre des maladies

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Ressusciter des animaux disparus (une équipe de l’université d’Harvard essaie notamment de faire muter des éléphants d’Asie pour leur donner des caractéristiques les rapprochant du mammouth)

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Sauver des espèces en danger

L’article rédigé par les équipes des professeurs Doudna et Charpentier ont été un véritable coup de tonnerre dans le monde scientifique. Au-delà de la mise au point d’un nouvel outil de mutagenèse, la méthode CRISPR-Cas9 permet une édition du génome rapide, précise et présentant une efficacité supérieure aux méthodes plus classiques, reléguant un grand nombre de techniques au second plan et permettant la mise au point de nombreux nouveaux modèles d’étude.

Cette technique est aujourd’hui utilisée pour détecter l’activité de certains gènes (Cas9 couplée à des fluorophores, également appelée « tiling »), purifier des fragments d’ADN, réaliser une édition du génome multiplexe, faire des criblages de banques …

Même si les applications qui en sont faites sont extrêmement variées et frisent parfois les limites éthiques, occasionnant un réel débat au sein de la communauté scientifique, CRISPR-Cas9 n’en demeure pas moins l’une des avancées majeures du début du 21e siècle.

Meganucleases, ZFNs and TALENs have been used extensively for genome editing in a variety of different cell types and organisms. Meganucleases are engineered versions of naturally occurring restriction enzymes that typically have extended DNA recognition sequences (e.g., 14â&#x20AC;&#x201C;40 bp). ZFNs and TALENs are artificial fusion proteins composed of an engineered DNA binding domain fused to a nonspecific nuclease domain from the FokI restriction enzyme. Zinc finger and TALE repeat domains with customized specificities can be joined together into arrays that bind to extended DNA sequences.

The engineering of meganucleases has been challenging for most academic researchers because the DNA recognition and cleavage functions of these enzymes are intertwined in a single domain. By contrast, the DNA binding domains of ZFNs and TALENs are distinct from the FokI cleavage domain, thereby making it more straightforward to modify the DNA-binding specificities of these nucleases.

However, robust construction of engineered zinc finger arrays has also proven to be difficult for many laboratories because of the need to account for context-dependent effects between individual finger domains in an array. Despite the availability of various publicly available methods designed to simplify the challenge of creating ZFNs, these nucleases have not been engineered by a wide range of laboratories.

In contrast to zinc fingers, TALE repeat domains seem to have fewer context-dependent effects and can be assembled robustly in a modular fashion to recognize virtually any DNA sequence (J.K.J. and colleagues), using a simple one-to-one code between individual repeats and the four possible DNA nucleotides. Although TALE repeat domains are much simpler to design than meganucleases or ZFNs, the assembly of DNA molecules encoding large numbers of highly conserved TALE repeats can require the use of nonstandard molecular biology cloning methods. Many user-friendly methods for making such assemblies have been described in the literature (J.K.J. and colleagues) but the highly repetitive nature of TALEN-coding sequences also creates barriers to their delivery using certain viral vectors, such as lentiviruses. Nonetheless, the greater simplicity of TALENs relative to meganucleases and ZFNs has led to their adoption over the past several years by a broad range of scientists. The question of whether to utilize these platforms for a given application must be considered on a case-by-case basis, and we refer the reader to recent reviews on these different technologies for additional information.

12 mars 2017

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https://www.neb.com

Fu, Y., Foden, J.A., Khayter, C., Maeder, M.L., Reyon, D., Joung, J.K., and Sander, J.D. (2013). Highfrequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology 31, 822–826.

Hsu, P.D., Scott, D.A., Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E.J., Wu, X., Shalem, O., et al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology 31, 827–832.

Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., and Lundgren, M. (2015). The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochimie 117, 119–128.

Sander, J.D., and Joung, J.K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.

Nature Biotechnology 32, 347–355.

Reardon, S. (2015). New life for pig-to-human transplants. Nature 527, 152–154.