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Biomanufacturing

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LLL Spezial

Biologics/Biosimilars: Schneller und besser produzieren Getrieben von Kostendruck lagern immer mehr Arzneimittelentwickler ihre Biologics-Produktion an Spezialisten aus. Gefragt dabei sind Qualität und Schnelligkeit. Dass mit neuer Ausrüstung und Techno-

Bild: © Michael Tieck - Fotolia.com

logie viel möglich ist, zeigt die erste EMA-Empfehlung eines biosimilaren monoklonalen Antikörpers.

Was modernes Biomanufacturing leisten kann, haben die südkoreanische Celltrion und ihr Partner Hospira unlängst vorgeführt. Ende Juni zeigten sie, dass die Herstellung so komplexer Biologika wie die eines Biosimilar-Antikörpers möglich ist. Von der EMA erhielt ihr Remicade-Biosimilar Infliximab die Empfehlung zur Marktzulassung. Während Celltrion den TNFa-Blocker mit 30% Preisabschlag auf die Originalarznei unter dem Namen Remsima vermarkten wird, will sich Hospira mit der Marke Inflectra eine dicke Scheibe des europäischen Marktkuchens abschneiden. Das Votum ist indes ein Novum. Markiert es doch, dass eine Zulassung biosimilarer monolonaler Antikörper (mAbs) nicht nur in Südkorea oder anderen „emerging markets“, sondern auch in hochregulierten Märkten möglich ist. „Jeder hat darauf gewartet, ob das CHMP ein so komplexes und hochgradig glykosyliertes Produkt wie einen biosimilaren monoklonalen Antikörper zulassen wird“, so Paul Greenland, Vizepräsident Biologics der Hospira UK Ltd. gegenüber |transkript. Denn erst die globale Vermarktungsmöglichkeit mache das Biosimilar-Businessmodell „ökonomisch nachhaltig“. Doch die Entscheidung des EU-Ärztekomitees bedeutet mehr. „Wichtiger noch war die Frage, ob es möglich sein wird, eine Zulassung auf Basis extrapolierter Indikationen zu bekommen“, so Greenland.

Was das bedeutet, erschließt sich einfach, wenn man die klinischen Studien mit den Zulassungsindikationen vergleicht. Celltrion hatte sowohl die Zulassung in Südkorea als auch die CHMP-Empfehlung auf Basis von Phase I-Studien sowie einer Phase IIIStudie mit 617 -Rheumapatienten erhalten, die die Vergleichbarkeit zu Johnson & Johnsons/Merck &Co.7,6 Mrd. US-$-Blockbuster belegte. Die EMA empfiehlt indes eine Marktzulassung in allen Indikationen, in denen auch Remicade zugelassen wurde: Neben Arthritis sind dies Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Psoriasis-Arthritis und ankylosierende Spondylitis – eine seltene Entzündung der Wirbelkörper.

Glauben oder nicht glauben Während Lonza unlängst sein Joint Venture mit dem israelischen Generika-Giganten TEVA aus Kostengründen beendete, das auf die Entwicklung eines Rituximab-Biosimilars abzielte, sehen Pharmahersteller wie Amgen eine große Zukunft für die Antikörper-Blaupausen. „Wir glauben daran, dass hochqualitative und zuverlässig hergestellte Biosimilars zusätzliche Wahlmöglichkeiten für bestimmte Patientengruppen bieten“, heißt es etwa aus Amgens US-Zentrale, die derzeit an Humira-, Remicade-, Herceptin-, Avastin-, Erbitux- und

Mabthera/Rituxan-Bio­similars arbeitet. „Die Einsparungen durch biosimilare mABs können gewaltig sein“, meint auch Hospira-VP Greenland. In den hochregulierten Märkten sei dies sehr interessant für die Kostenträger. In aufstrebenden Pharmamärkten sieht er andere Wachstumschancen: Immer mehr Menschen dort bekämen Zugang zu den neuen, bisher zu teuren Behandlungen. Genau wie Hospira und die meisten anderen Biosimilar-Hersteller setzt der Biotech-Pio­ nier Amgen auf Risikominimierung, also auf die Biosimilarentwicklung in Partnerschaften. Laut Amgen ist die Entwicklung biosimilarer mAbs ein „kapitalintensiver und wissenschaftlich herausfordernder Prozess“, der nur erfolgreich sein könne, wenn ihm „ein kompromissloses Bekenntnis zur Patientensicherheit“ zugrundeliege. Dies sei durch die strikten Regeln für biosimilare mAbs in den hochregulierten Märkten bereits gut umgesetzt.

Weniger Kosten und optimierte Ausbeuten Auch angesichts verbesserter, zum Beispiel glykooptimierter Antikörper wie Roches CD20-Blocker Obinutuzumab (GA101) sind Biosimilar-Entwickler wie Greenland von der künftigen Marktpenetranz der Biosimilars überzeugt. Denn die entscheidende Frage sei nicht nur, ob eine Arznei wirksamer sei, sondern auch billiger angeboten werden könne. Hierbei gilt für Biosimilars wie ihre Vorbilder das Gleiche: Die Herstellungs- und Entwicklungskosten müssen minimiert, etwa durch Auslagerung an CMOs, die das Upund Downstreamprocessing, die Zelllinienund Assayentwicklung sowie posttranslationale Produktmodifikationen so weit optimiert haben, dass ein maximaler Zeitgewinn und Kosteneinsparung bei hoher Qualität die Folge sind. L t.gabrielczyk@biocom.de

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 AUFTRAGSHERSTELLUNG

Flexiblere und schnellere Produktion von Biologika Konzepte zur raschen Herstellung qualitativ hochwertiger Biopharmazeutika stehen hoch im Kurs. Optimierte Zelllinien und flexible Anlagen können helfen. Von Dr. Alexander Faude, Bernd Rehberger,

Peter Rogge, Dr. Stefan Schmidt, Dr. Birgit Schwab, Rentschler Biotechnologie GmbH, Laupheim Die biopharmazeutische Industrie steht durch eine steigende Anzahl von Patentabläufen und zunehmendem Kostendruck vor großen Herausforderungen. Lösungsansätze liegen unter anderem in der Fokussierung auf Kernkompetenzen und der Etablierung von möglichst breiten Entwicklungspipelines. Damit verbunden ist ein verstärkter Trend zum Outsourcing. So setzen, Studien von BioPlan Associates zufolge, bis zu 70% aller Biopharmazeutikahersteller für ihre Manufacturing-Aktivitäten auf Outsourcing [1]. Dabei spielt eine wichtige Rolle, dass die Auslagerung der Produktion auch zu Kostensenkungen führt. Basis dafür ist der Kompetenzgewinn von Auftragsherstellern (Contract Manufacturing Organisations, CMOs) durch die Einführung von neuen Technologien zur Expression von Biologika, den Einsatz von Single-Use-Equipment und differenzierten Prozess-Services. Die damit verbundene Flexibilität und mögliche Senkung der Durchlaufzeiten führen zu deutlichen Kosteneinsparungen [2].

TurboScreen™-Technologie Bereits bei der Produktion von ScreeningMaterial und der Entwicklung von Produktionszelllinien spielen Zeitgewinn, Qualität und Kosten eine kritische Rolle. Daher sind innovative Lösungen auch schon in diesen frühen Entwicklungsphasen von hohem Interesse. Das von Rentschler entwickelte TurboScreen™-System kommt diesen Bedürfnissen entgegen. TurboScreen™ ist ein auf Kassettenaustausch (RMCE) basierendes Verfahren zur schnellen Generierung hochstabiler rekombinanter CHO-Zelllinien. Ausgangspunkt ist eine vorselektierte CHOK1-Wirtszelle klonalen Ursprungs. Der Kassettenaustausch ermöglicht die exakte Integration des Zielgens (Gene of Interest, GOI) an einer vordefinierten expressionsstabilen Stelle. Über eine spezielle Kennzeichnung der Zellen lässt sich anschließend mittels Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) ein Pool genetisch sehr homogener Zellen abtrennen.

Basierend auf diesem Pool kann bereits nach sechs Wochen erstes Material des gewünschten rekombinanten Proteins zur Verfügung gestellt werden. Ein Vorteil ist, dass sich der Pool und später daraus abgeleitete Klone aufgrund ihrer genetischen Homogenität in Produktivität und Produktqualität nur wenig unterscheiden. Auf diese Weise können sehr früh sichere Entscheidungen über die Auswahl geeigneter Wirkstoffkandidaten getroffen werden. Material aus stabilen klonalen Zelllinien steht nach 12 Wochen zur Verfügung. Die Vorhersagbarkeit des TurboScreen™Systems ist nicht nur mit einem Zeitgewinn, sondern auch mit einem Kostenvorteil verbunden. Dieser wirkt sich besonders dann aus, wenn mehrere Produktkandidaten gleichzeitig getestet werden sollen. Momentan liegt die Kapazität bei 20 Wirkstoffkandidaten pro Projekt. Nach Auswahl des besten Moleküls kann direkt mit der Materialproduktion für frühe klinische Phasen begonnen werden, da die entwickelte klonale Zelllinie alle regulatorischen Anforderungen erfüllt.

Produktion mit 1000 Liter-EinwegBioreaktortechnologie

Abb. 1: Schema der TurboScreenTM-Technologie. (1) Der erfolgreiche Austausch des Grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gegen das Zielgen kann überwacht werden. (2) Die Zellen mit Zielgen können per FACS abgetrennt und (3) Produktionsklone schnell etabliert werden.

Auch im Upstream- (USP) und DownstreamProcessing (DSP) werden Flexibilität und Schnelligkeit immer bedeutender und führen zu einem verstärkten Einsatz von Einmal- oder „Single-Use“-Materialien. BioPlan Associates zufolge nutzen aktuell 81% aller befragten Biopharmazeutikahersteller Single-Use-Bioreaktoren für die Produktion von Klinikmustern. Für den kommerziellen Bedarf sind es 53% und damit bereits doppelt so viel wie im Vorjahr [3]. Voll-Disposable-Prozesse für größere Maßstäbe sind im Upstream Processing bereits Realität. Seit einiger Zeit fokussiert die Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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FROM THE GENE TO THE DRUG FROM TO THE DRUG Over 30THE YearsGENE of Experience in GMP Over 30 Years of Experience in GMP

Cell Line Development & Glycooptimization Cell Line Development & Long track record in developGlycooptimization ing serum-free mammalian Long track record in developcell lines ing serum-free mammalian Proprietary human glycocell lines engineered serum-free cell Proprietary human glycolines for production of glycoengineered serum-free cell optimized biotherapeutics lines for production of glycooptimized biotherapeutics

GMP Production of Glycoproteins GMP Production USP/DSP development of Glycoproteins Cell banking USP/DSP development 5 independent suites Cell banking Fed batch & perfusion 5 independent suites fermentation in up to Fed batch & perfusion 1.000 L bioreactor fermentation in up to (13.000 L cell harvest) 1.000 L bioreactor (13.000 L cell harvest)

Quality Control & Analytics Quality Control Characterization of & Analytics biotherapeutics Characterization of GlycoAnalytics biotherapeutics GMP-compliant QC GlycoAnalytics Host cell DNA assay GMP-compliant QC Host cell protein assays Host cell DNA assay Cell-based bioactivity assays Host cell protein assays Cell-based bioactivity assays

Fill & Finish of Drug Products Fill & Finish Sterile filling & labeling of of Drug Products aqueous products Sterile filling & labeling of Capacity of 700 vials / aqueous products 0.15 L - 14 L /day Capacity of 700 vials / Large batch processing possible 0.15 L - 14 L /day Release acc. to FDA/EMEA Large batch processing possible through own Qualified Persons Release acc. to FDA/EMEA through own Qualified Persons

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en. Auch alle weiteren produktberührenden Bauteile wie Pumpenköpfe, Leitungen und Sensoren sind Einwegartikel, die nach einer Produktionskampagne schnell entsorgt werden können.

Generisches Puffer-Konzept

Flexibles Downstream Processing: Rührkessel mit Bag-Einsätzen zur Vorbereitung der Filtration Branche auch auf kosteneffektive SingleUse-Innovationen im Downstream Processing [4]. Optimal ist die Umsetzung eines durchgängigen Disposable-Konzepts, das den kompletten Produktionsprozess von Upstream bis Downstream umfasst. Dieses Ziel hatte sich Rentschler gesetzt, nachdem man bereits 2010 erste Erfahrungen mit einer 1000 L-Single-Use-Bioreaktor-Anlage gesammelt hatte. Ende 2011 erfolgte eine Erweiterung durch eine 1000 LProduktionsanlage, die sowohl im USP als auch im DSP auf 100% Einwegtechnologie basiert. Dafür wurde 2012 der Facility of the Year Award (FOYA) der International Society for Pharmaceutical Engineering (ISPE) in der Kategorie “Equipment Innovation“ verliehen. Diese Anlage wurde sowohl im Hinblick auf Produktionskosten als auch auf Produktzykluszeiten optimiert. Sie hat eine jährliche Kapazität von bis zu 24 Batches im 1000 L-Maßstab. Die Anlage beinhaltet ein außergewöhnlich flexibles Raumkonzept mit vier unabhängigen und konfigurierbaren Reinräumen. Durch die Nutzung von mobilen Single-Use-Geräten konnte auf Steamingin-Place (SIP) und Cleaning-in-Place (CIP) verzichtet werden. Das erlaubt den Ausschluss der Dampf- und Wasserversorgung aus den Suiten und führt zu Kostenvorteilen bei der Qualitätsüberwachung. Eingesetzt werden in dieser Anlage Bioreaktoren der Firma Xcellerex im Maßstab 50 L, 200 L

und 1000 L. Erweiterungen auf 2 x 1000 L oder 2000 L sind technisch ohne weiteres möglich.

Zellabtrennung und Aufreinigung mit Disposable-Technologien Ein weiterer Ansatzpunkt für flexible und schnelle Lösungen ist die Zellabtrennung bei Hochleistungsprozessen. Dabei wird erfolgreich mit namhaften Filterherstellern zusammengearbeitet, um robuste und GMP-konforme Lösungen zu finden. Auf dem Gebiet der Single-Use-Separatoren-Technik gibt es ebenfalls erste Kooperationen, um die Einführung und Optimierung solcher Systeme mit Hilfe von Rentschler-Know-how voranzutreiben. Bislang werden in den 1000 L-Disposable-Produktionslinien Sedimentations- und Tiefenfiltrationsprozesse verwendet. Auch bei den weiteren Schritten werden Single-Use-Materialien eingesetzt. Der etablierte dreistufige Plattformprozess für die Aufreinigung von Antikörpern enthält zwei fertiggepackte Säulen. Im Polishing-Schritt wird meist ein gebrauchsfertiger Ionenaustausch-Membran-Adsorber im Durchflussmodus genutzt. Zu den Vorteilen zählen Zeit- und Materialersparnis beim Packen, Reinigen und Validieren der stationären Phasen. Darüber hinaus setzt Rentschler im Bereich der Ultra- und Virusfiltration konsequent auf Einwegmateriali-

Ein wichtiger Bestandteil des Plattformprozesses zur Aufreinigung von Antikörpern ist das Konzept der generischen Puffer. Die Vielzahl von Pufferlösungen für verschiedene Prozesse ist ein wesentlicher Kostenfaktor. Durch den Einsatz von generischen Puffern konnte die Anzahl der unterschiedlichen Puffer um 40% reduziert werden. Dabei werden Antikörper in einem pH-Wert-geführten Prozess über die etablierten Chromatographie-Schritte gereinigt. Die dazu nötigen pH-Bedingungen werden durch die gezielte Mischung zweier Stammlösungen mit gradientenfähigen Chromatographie-Anlagen umgesetzt. Zum Konzept gehören auch innovative Entwicklungen im Hinblick auf die Präzision der Gradientenmischung, die Rückdurchmischung von Produktfraktion und Puffern sowie die Fortsetzung von Prozessschritten bei potentiellen Unterbrechungen. Die mit den beschriebenen Techno­logien möglichen Zeit- und Kosteneinsparungen hat Rentschler bereits in zahlreichen Kundenprojekten erfolgreich umgesetzt. Dabei wurde in den vergangenen drei Jahren besonders im Bereich Single-Use-Manufacturing, in dem Rentschler zu den führenden Anbietern im CMO-Markt gehört, umfassende Expertise aufgebaut. Auch die TurboScreen™-Technologie, die im Frühjahr 2013 eingeführt wurde, ist bereits in mehreren Kundenprojekten im Einsatz. L

Referenzen [1] E.S. Langer: Outsourcing’s Modest Role as a Cost-Containment Strategy, BioPharm May 1, 2013 [2] E.S. Langer: Emerging Outsourcing Trends in 2013, BioPharm March 2, 2013 [3] E.S. Langer: Disposable Applications Penetrate Biomanufacturing Market, Pharmamanufacturing.com June 13, 2013 [4] E.S. Langer: Ten Years Later: Innovation Driving Single Use Technology Advances, BioPharm International, April 2, 2013

Kontakt Dr. Marion Schrader Senior Director Marketing Tel.: +49-(0)7392-701-0 info@rentschler.de www.rentschler.de Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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LLL GlycoExpress TM

Plattform für glykooptimierte Biotherapeutika GlycoExpress ermöglicht die Produktion funktionell optimierter humaner therapeutischer Proteine.

Von Dr. Franzpeter Bracht, Dr. Steffen Goletz und Dr. Antje Danielczyk, Glycotope GmbH, Berlin Mit der aktuell in der Entwicklung befindlichen nächsten Generation von therapeutischen Proteinen werden große Anstrengungen unternommen, die Wirksamkeit und das Nebenwirkungsprofil zu verbessern. Eine erhöhte Wirksamkeit – gegebenenfalls verbunden mit einer verlängerten Halbwertszeit und verringerten Nebenwirkungen – verändern die Kosten-Nutzen-Betrachtung grundlegend. Die 2001 von Dr. Steffen Goletz gegründete Glycotope GmbH ist hier mit einem ihrer Geschäftsbereiche GlycoExpressTM (GEXTM) an vorderster Front dabei (vgl. Abb. 1). Verbunden mit der außerordentlich hohen Produkti-

vität der auf humanen Zelllinien basierenden Technologie kann GlycoExpressTM die „Costs of goods“ senken. Hierzu trägt auch die extrem hohe Reproduzierbarkeit der Produktqualität – insbesondere der Glykosylierung im Rahmen der Produktion – bei, die so von anderen Produktionssystemen bisher nicht gezeigt wurde. Daher ist die GlycoExpressTM-Technologie ein Instrument, das exakt in die aktuellen Bestrebungen der Gesundheitsmärkte passt. Die GlycoExpressTM-Technologie basiert auf humanen Zelllinien, die durch eigens dafür entwickelte GlykoEngineering-Technologien in ihren Möglichkeiten der Protein-Gly-

kosylierung verändert und optimiert wurden. Inzwischen steht Glycotope ein Portfolio von „glyko­engineerten“ Zelllinien zur Verfügung, in denen verschiedene Parameter der Glykosylierung verändert werden können, so dass das gleiche Protein in unterschiedlichen Glykoformen hergestellt werden kann. Durch die Möglichkeit, nicht nur die Sialylierung zu maximieren oder sogar graduell einzustellen, sondern auch andere Zuckerstrukturen, wie die Fukosylierung, die Galaktosylierung und das Branching in einer voll humanen Form zu optimieren, steht der Glycotope hier eine Technologie zur Verfügung, mit der sich nahezu al-

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le glykosylierten Proteine optimieren lassen (s. Abb. 2). Im Rahmen der Glykooptimierung werden bei Glycotope verschiedene Glykoformen hergestellt, die anschließend in einem produktspezifischen, ganz auf die humane Glykosylierung abgestellten Programm mit Hilfe von speziellen humanen Assaysystemen getestet werden. Dabei werden die verschiedenen Varianten auf therapeutisch relevante Charakteristika getestet, wie zum Beispiel die Aktivität, die Halbwertszeit, Immunogenizität oder die Stabilität des Produktes, um festzustellen, welche Variante die optimalen Verbesserungen aufweist. Dies ist ein wesentliches Charakteristikum der GlycoExpressTMTechnologie, da im Rahmen von früheren Entwicklungen klar gezeigt werden konnte, dass auf nicht-humanen Zellen basierende Assays die zusätzlichen, durch die vollständig humane Glykosylierung entstehenden Optimierungen nicht zeigen können. Mit Hilfe der GlycoExpressTM-Technologie ist es erstmals möglich, in einem breiteren Kontext Proteine mit einer menschlichen Glykosylierung zu versehen und damit voll humane Glykoproteine herzustellen und zu optimieren. Dies ist deshalb so wichtig, weil die Glykosylierung eine Schlüsselrolle im Hinblick auf Aktivität, Bioverfügbarkeit, Immunogenizität und Anwendungsbreite spielt. Die Glykosylierung kommt durch eine hochkomplexe Maschinerie von mehreren hundert Enzymen zustande, zum Großteil Species-spezifisch, was auch für die resultierenden Zuckerstrukturen in hohem Maße gilt. Daher ist eine voll humane Glykosylierung und eine Optimierung pharmazeutischer Proteine nur durch ein menschliches Optimierungs- und Produktionssystem wie GlycoExpressTM möglich. Mehr als 15 therapeutische Proteine konnten bereits unter Verwendung der GlycoExpressTM-Technologie in Hinblick auf Bioaktivität, Bioverfügbarkeit, Immunogenizität,

Abb. 1: Kerntechnologien von Glycotope Nebenwirkungsprofil und/oder Indikationsbreite erfolgreich optimiert werden. Hieraus rekrutiert sich unter anderem die erfolgreiche aktuelle Pipeline von Glycotope, die bisher vier klinische Produkte umfasst, von denen sich drei in Phase II-Entwicklung befinden, eines davon bereits an deren Ende. Es handelt sich um drei monoklonale Antikörper für die Onkologie und ein Proteinhormon, das im Rahmen der Behandlung des unerfüllten Kinderwunsches eingesetzt wird.

Produktpipeline Für das Peptidhormon-Projekt FSH-GEX TM, bei dem es sich um das glycooptimierte vollhumane Follikel-stimulierende Hormon handelt, wurde gerade die „in life“-Phase der randomisierten Phase II mit rund 250 Patientinnen abgeschlossen.

Abb. 2: Vorteile der GlycoExpress-Technologie

Von den drei in der klinischen Prüfung befindlichen Antikörpern entstammt einer, PankoMab-GEX TM, der GlycoBodyTM-Technologie von Glycotope. Die beiden anderen sind ein glykooptimierter EGFR- (CetuGEX TM) und ein ebenfalls glykooptimierter HER2-Antikörper (TrasGEX TM). Letzterer befindet sich derzeit am Ende einer erweiterten Phase I/IIa-Studie, während für PankoMabGEX TM und CetuGEX TM zulassungsrelevante Phase IIb-Studien bereits begonnen haben oder kurz vor dem Beginn stehen. Für diese Produkte bestätigt sich auch in den bisherigen klinischen Untersuchungen die höhere Aktivität und Verträglichkeit, auch bei Patienten, bei denen die nicht GEX-optimierten Proteine nicht oder nur schlecht wirken oder vertragen werden. PankoMab-GEXTM ist ein Antikörper gegen ein neues proprietäres, nur auf Tumoren vorkommendes Epitop eines Glycoproteins, das tumorspezifische TA-MUC1, das bei sehr vielen Tumorentitäten hoch exprimiert wird. Alle Antikörper zeigten in der Phase I ein hervorragendes Sicherheitsprofil sowie vielversprechende Anzeichen von Antitumoraktivität, bis hin zu mehreren „Complete Responses“, also dem vollständigen Verschwinden des Tumors, Partial Responses und eine langanhaltende klinische Wirkung. Während für CetuGEXTM die entsprechenden Daten bereits auf dem diesjährigen amerikanischen Onkologenkongress ASCO vorgestellt wurden, werden die Daten von PankomabGEXTM erst am 1. Oktober 2013 im Rahmen des europäischen Onkologenkongresses ECCO veröffentlicht. Die Daten zu dem gykooptimierten FSHGEX TM zeigten in den Phase I/Ib-Studien neben einer guten Verträglichkeit auch eine verbesserte Aktivität, was auf der voll humanen Glykosylierung beruht, die dem natürlichen menschlichen FSH nachempfunden ist. Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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Diese Beispiele belegen die hervorragenden Eigenschaften und die Breite der GlycoExpressTM-Technologie. GlycoExpressTM erlaubt zudem die schnelle Entwicklung erster Klone für die Produktion geringer Proteinmengen für erste Tests sowie die schnelle Herstellung von HochexpressionsKlonen für die weitere Produktion. Um die optimale Produktion der glykooptimierten Moleküle zu gewährleisten, wird bei der Heidelberger Tochter Glycotope Biotechnology GmbH unter GMP-Bedingungen vor allem die Perfusionstechnologie angewandt. Dies ist ein kontinuierlicher Prozess, bei dem durch kurze Produktverweilzeiten im Fermenter die hohe Qualität jedes glykooptimierten Proteins erhalten bleibt. Umfangreiche Analysen über den gesamten Upscale-Prozess zeigen ein gleichbleibendes und hochreproduzierbares Glykosylierungsmuster für alle GlycoExpressTM-Produkte. Durch die stark erweiterten Kapazitäten können Perfusionen in Reaktoren mit Volumina von 10 L bis in den 1.000 L durchgeführt werden. Pro Jahr können derzeit bis zu etwa 15 kg glykooptimierter Antikörper unter GMP-Bedingungen produziert werden, eine Erweiterung der Produktionskapazitäten ist derzeit in der Planung. Unter den etablierten Bedingungen werden derzeit für die Antikörper Produktausbeuten von 2 bis zu

die konstante Produktqualität während des Prozesses sicherstellen.

Zusammenfassung

Abb. 3: Fermenter zur Anwendung des Perfusionsprozesses 12 g je Liter Fermentervolumen im Standardlauf erreicht, an der weiteren Optimierung wird gearbeitet. Komplettiert wird der Produktionsprozess durch die Abfüllung in der hauseigenen Fill & Finish-Abteilung und die Prozess-begleitenden zellbasierten Bioaktivitäts-Assays sowievon detaillierten Produktuntersuchungen wie der Produktglykosylierung, die

Plasmid & Minicircle DNA Service

Die GlycoExpressTM-Technologie ist eine der weltweit führenden, durch klinische Studien validierten Glykooptimierungstechnologien, die durch die Breite ihrer Optimierungsmöglichkeiten definitiv einzgartig ist. Mit ihrer Tochter in Heidelberg, der Glycotope Biotechnologie GmbH, verfügt Glycotope zudem über die Möglichkeit, im Fedbatch- oder Perfusionsprozess in einem Maßstab bis zu 1.000 L Fermentervolumen die optimierten Produkte unter GMP-Bedingungen zu produzieren und abzufüllen (Abb. 3). Glycotope wendet die Technologie auf in-house-Entwicklungen, aber auch auf Proteine an, die sich bei anderen Unternehmen in der Entwicklung befinden, und produziert diese auch für präklinische und klinische Studien. 

Kontakt Dr. Franzpeter Bracht Glycotope GmbH Robert-Rössle-Str. 10 13125 Berlin

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 ZELLBASIERTE

ASSAYS

Analyse von Biosimilar-mAbs Mit der ersten EU-Zulassungsempfehlung ist der Weg für Biosimilar-Antikörper nach Europa frei. Wichtig: Zellbasierte Assays für den Nachweis der Vergleichbarkeit des Biosimilars und seines Originators. Von Carsten Lindemann, EUFETS GmbH, Idar-Oberstein Die Vergleichbarkeitsanalyse (comparability exercise) von Biosimilars erfordert die funktionelle Charakterisierung durch Bioassays. Für monoklonale Antikörper mit Fc-Teil beinhaltet dies komplexe immunologische Assays wie ADCC (antibody dependent cytotoxicity) und CDC (complement dependent cytotoxicity), mit denen Analysen mehrerer Chargen von Biosimilar und Originatoren parallel durchgeführt werden müssen. Die Methoden müssen für den Nachweis der Vergleichbarkeit qualifiziert sein und sollen kleine Unterschiede in der biologischen Aktivität feststellen können. Um diese hohen Anforderungen auch bei zellbasierten Testverfahren zu ermöglichen, ist der Einsatz optimaler zellulärer Tools für diese Methoden wichtig. Diese beinhalten zum einen die Target-Zellen für ADCC- und CDC-Assays sowie zusätzlich die EffektorZellen für ADCC-Tests. Als Target-Zellen für CDC und ADCC können geeignete Zelllinien zunächst auf-

grund phänotypischer Merkmale aus einer Reihe von Kandidaten selektiert werden.

Optimale Target-Zelllinien für ADCC- und CDC-Assays Hierbei ist vor allem eine hohe Expression des Antigens entscheidend, da ADCC und vor allem CDC nur bei hoher Antigendichte effektiv ablaufen. In zweiter Linie müssen geeignete Zielzellen aufgrund ihrer funktionellen Eigenschaften selektiert werden. Hierbei sind zellspezifische Eigenschaften wie Wachstum, Adhärenz und Viabilität im Assay zu berücksichtigen. Sind geeignete Zelllinien mit natürlicher oder unzureichender Expression nicht vorhanden, können diese durch genetische Modifikation generiert werden. Unter Verwendung retroviraler Vektoren ist eine stabile genetische Modifikation mit hoher Transgenexpression möglich.

Effektor-Zelllinie für ADCC-Testverfahren

Grundzüge einer Methoden-Qualifizierung am Beispiel eines Anti-TNFα -ADCC Assays

Mit Hilfe des retroviralen Gentransfers hat EUFETS eine stabile NK-Zelllinie entwickelt, die standardisier t für Freigabeanalytik unter GMP und in Vergleichbarkeitsstudien eingesetzt wird. Diese Effektor-Zelllinie wurde mit funktionaler CD16 (Fcγ-Rezeptor)-Expression ausgestattet. Zwei Varianten stehen zur Verfügung, die entweder Valin (hochaffine Variante der Zelllinie) oder Phenylalanin (niedrigaffine Variante) an Position 158 des CD16-Proteins exprimiert. Die beiden Varianten repräsentieren damit einen klinisch relevanten Polymorphismus des FcγRezeptors. So lässt sich beispielsweise in vitro untersuchen, ob verschiedene Antikörper in ihrer Wirkung mehr oder weniger stark von diesem Polymorphismus abhängig sind. Ein Beispiel für ein Testsystem mit von EUFETS generierten Zelllinien ist ein AD-

CC-Assay für die Anti-TNFα-Antikörper Infliximab und Adalimumab. Für Biosimilarkandidaten dieser Antikörper sind Analysen in ADCC- und CDC-Assays gegen Zellen erforderlich, die membrangebundenes TNFα exprimieren. Von geläufigen Zelllinien wird die membrangebundene Form von TNFα nur schwach exprimiert, da lösliches TNFα permanent durch enzymatische Aktivität abgespalten wird. Die transgene Expression von membrangebundenem TNFα ohne die Bindungsstelle für abspaltende Enzyme ist hierfür eine Lösung. So wird eine hohe Expression von TNFα an der Zelloberfläche erreicht und die Freisetzung von TNFα verhindert. Für den ADCC-Assay wurde zudem die hochaffine Variante der eigenen NK-Zelllinie als Effektor-Zelllinie verwendet.

Qualifizierung von Assays für Vergleichbarkeitsanalysen Die Qualifizierung einer Methode für Vergleichbarkeitsanalysen von Biosimilar und Originatoren erfolgt weitgehend analog einer Validierung, ohne jedoch formale Akzeptanzkriterien im Voraus zu stellen. So wurden für einen TNFα-ADCC-Assay Daten zur Genauigkeit, Linearität und Präzision gewonnen und um eingeschränkte Untersuchungen zu Spezifität und Robustheit der Methode ergänzt. Die Qualifizierung einer solchen Methode kann bei EUFETS alternativ auch unter GLP durchgeführt werden. 

Kontakt Dr. Carsten Lindemann EUFETS GmbH Vollmersbachstr. 66 55743 Idar-Oberstein Tel.: +49-(0)6781-9855-257 Fax: +49-(0)6781-9855-237 Carsten.Lindemann@eufets.com www.eufets.com Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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NUKLEINSÄURE-MANUFACTURING

Minicircle – neues Werkzeug zum sicheren Gentransfer Minicircle verbessern die Genexpression und gelten als Mittel der Wahl in DNA-basierten Therapeutika. Von Martin Schleef und Marco Schmeer, PlasmidFactory GmbH & Co. KG, Bielefeld Strategien zur nicht-viralen Gen- und Zelltherapie sowie zur DNA-Vakzinierung verwenden bislang vorwiegend Plasmid-DNA oder deren lineare Derivate. Konventionelle Plasmide enthalten große Anteile mit Sequenzabschnitten, die zum Beispiel deren bakterielle Replikation (ori) oder Selektion erlauben und bis zu 50% der gesamten Sequenz ausmachen. In diesem Bereich kodieren sie etwa für Antibiotikaresistenzen (ABR) zur Selektion und enthalten zahlreiche CpGMotive, die wegen ihrer immunstimulatorischen Wirkung mit einer verringerten Effizienz der Genexpression assoziiert sind. Da diese somit für die angestrebte Funktion in der Zielzelle nicht nur überflüssig sind, sondern im Fall der ABR aus pharmazeutischer Sicht ein Sicherheitsrisiko darstellen, hat die PlasmidFactory ihre patentierte Technologieplattform zur Herstellung sogenannter Minicircle entwickelt. Dabei wird durch die innermolekulare Rekombination zweier Sequenzen gezielt und vollständig der unerwünschte Sequenzabschnitt eines Plasmids (inkl. ori und ABR) entfernt, und es entstehen zwei DNA-Ringe[1]. Einer ist das Restplasmid (auch Miniplasmid genannt) mit den unerwünschten Sequenzen und der andere der Minicircle, welcher praktisch ausschließlich aus der zirkulären Sequenz der darauf enthaltenen Expressionskassette (im hier gezeigten Beispiel GFP oder Luciferase (luc)) besteht (Abb. 1a). Die Trennung der beiden Ringe erfolgt über ein spezielles Chromatographieverfahren, bei dem ausschließlich der Minicircle aufgereinigt wird.

Effektivere Transfektion In Transfektionsversuchen mit ReportergenMinicircle DNA im Vergleich zu korrespondierenden Standardplasmiden, die an der Charité, Berlin (Prof. Dr. W. Walther) durchgeführt wurden, zeigen die Minicircle signifikant höhere Transfektionsraten (Abb. 1b). Minicircle sind zum Teil kleiner als das kleins-

Schema zur Herstellung von Minicircle-DNA: (a) Das Parentalplasmid wird durch Induktion der intramolekularen Rekombination in ein Miniplasmid und einen Minicircle geteilt. (b) Vergleichende Transfektionsexperimente zwischen StandardPlasmid-DNA und Minicircle-DNA. Grün der Vergleich mit Reportergen GFP (großer Ring = Plasmid, kleiner Ring = Minicircle), Gelb der Vergleich mit Reportergen luc (großer Ring = Plasmid, kleiner Ring = Minicircle). Unten jeweils die Reportergenaktivität bei Verwendung der Minicircle-DNA im Vergleich zu der auf 1 normierten Aktivität der Plasmid-DNA. In Kooperation mit der Charité, Berlin (Prof. Dr. W. Walther). te bisher vorgestellte Plasmid, was ihre Transfektionseigenschaften deutlich verbessert. Darüber hinaus sind sie superspiralisiert (ccc-Form) und damit stark kondensiert. Außerdem haben die von PlasmidFactory hergestellten Minicircle die Eigenschaft, ausschließlich eine Form aufzuweisen: Es sind reine, superspiralisierte Monomere, was eine Voraussetzung für ihren pharmazeutischen Einsatz darstellt. Inzwischen ist ein starkes Interesse an dem neuen Vektorsystem bemerkbar und PlasmidFactory bietet sowohl versandfertige Minicircle-DNA mit diversen Reportergenen als auch die Herstellung individueller Minicircle mit Kundensequenzen an. Derzeit wird neben zahlreichen MC für die Bereiche Transfektion, Gentherapie und Pflanzengenetik eine DNA-Vakzine auf Minicircle-Basis gegen Hepatitis-B Viren produziert. Ein Überblick zum Thema Minicircle und Mini-

plasmid inkl. Anwendungsbeispielen ist soeben erschienen[2]. 

Literatur [1] Schleef, M., Blaesen, M., Schmeer, M., Baier, R., Marie, C., Dickson, G., and Scherman, D. (2010) Production on Non Viral DNA Vectors, Curr. Gene Terapy 10, 487-507. [2] Schleef, M. (Ed.) Minicircle and Miniplasmid DNA vectors – the future of non-viral and viral gene transfer; 2013, Wiley-Blackwell, Weinheim.

Kontakt Martin Schleef, Marco Schmeer PlasmidFactory GmbH & Co. KG Meisenstr. 96, 33607 Bielefeld martin.schleef@plasmidfactory.com Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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LL Pichia Pastoris

Herstellungskosten senken durch optimierte Expressionssysteme Cost of Goods ist ein Schlagwort, das in der Bioproduktion einen immer größeren Stellenwert bekommt. Für die Produktion rekombinanter Proteine ist die Produktivität eines Expressionssystems ein wichtiger Faktor, der die Herstellungskosten wesentlich beeinflusst. Expressionstiter von mehr als 10 g/L sind sicherlich nicht Industriestandard, Berichte über Ergebnisse in dieser Größenordnung finden sich aber vermehrt. Das Team von VTU Technology hat mit der unternehmenseigenen Pichia pastoris-Expressionsplattform bei der Produktion von humanem Serumalbumin (HSA) und HSA-Fusionsproteinen Titer von 15 bis 20 g/L erreicht. Bemerkenswert ist dabei nicht nur die enorme Produktivität, sondern auch die Tatsache, dass die Zielproteine in den Kulturüberstand sekretiert werden und die Rohprodukte vor dem ersten Reinigungsschritt bereits eine Reinheit von rund 80% aufweisen. Die VTU-eigene Bibliothek synthetischer Promotorvarianten ermöglicht durch ihre

einzigartige Vielfalt an Charakteristiken hinsichtlich Stärke und metabolischer Regulation eine auf das Zielprotein und gegebenenfalls auf ein oder mehrere Helferpro­teine optimal abgestimmte Proteinexpression. Methanol-induzierbare Varianten der ersten Generation sowie neuartige Methanolunabhängige AOX1-Promotorvarianten der zweiten Generation bilden die Kerntechnologie von VTU. Neben der vereinfachten Implementierbarkeit in größerem Maßstab gewährleisten auch die Methanol-unabhängigen AOX1-Promotoren von VTU wirtschaftlich attraktive Produktionsprozesse, da im Vergleich zu alternativen Pichia-Promotoren wie pGAP sehr hohe Produktausbeuten (bis zu 15 g/L sekretiert) erreicht werden können. In der Entwicklung der Expressionsstämme werden die verschiedenen Promotorvarianten unter strikter Vermeidung jeglicher Materialien tierischer Herkunft in einem kombinatorischen Ansatz evaluiert. Das dafür etablierte Hochdurchsatzscreening er-

laubt die simultane, reproduzierbare Analyse von mehreren tausend Kolonien in Minimalzeit und den direkten Transfer des produktivsten Klons in den Bioreaktor zur Produktion des jeweiligen Zielproteins.  L

Kontakt Dr. Thomas Purkarthofer VTU Technology GmbH Parkring 18 8074 Grambach, Austria Tel.: +43-(0)316-4009-4017 Fax: +43-(0)316-4009-4010 thomas.purkarthofer@vtu.com www.vtu-technology.com

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LLL Richter-Helm

Produktionsanlagen erhalten FDA-Zulassung Unlängst hat Richter-Helm die FDA-Zulassung für die kommerzielle Produktion eines rekombinant hergestellten Proteins erhalten. Die Entscheidung öffnet das Tor zum attraktiven US-Markt. Von Dr. Kai Pohlmeyer, Richter-Helm Biotec GmbH & Co. KG, Hamburg lung und der GMP-konformen Produktion von rekombinanten Proteinen, PlasmidDNA und von mikrobiellen Impfstoffen. Mit mehr als 145 Beschäftigten an drei Standorten (Bovenau, Hamburg und Hannover) bietet das Unternehmen maßgeschneiderte Lösungen für biopharmazeutische Projekte und Produktionsleistungen auf dem neuesten Stand der Technik.

Neue Prozess-Technologien und professionelles Projekt-Management

Produktionsstätte in Bovenau Als full-service CDMO (Contract Development and Manufacturing Organisation) bietet Richter-Helm ein maßgeschneidertes Service-Portfolio. Es spannt den Bogen von der Entwicklung der Produktionsstämme bis hin zur GMP-gerechten Produktion biopharmazeutischer Wirkstoffe für die Verwendung in klinischen Prüfungen (Phase I bis III) und zur Produktion im kommerziellen Maßstab einschließlich aller erforderlichen Prozessvalidierungen. Mitte dieses Jahres wurden die RichterHelm-Produktionsstätten in Hamburg und Bovenau durch die amerikanische Bundesbehörde FDA (Food and Drug Administration) erfolgreich inspiziert, so dass die jetzt hier hergestellten rekombinanten Proteine für den Export in die USA zugelassen sind. Die FDA-Zulassung ist für das Unternehmen ein wichtiger Meilenstein und do-

kumentiert das Engagement der multidisziplinären Richter-Helm-Teams, die die Entwicklung von „Bench to Market“ begleitet haben. Die Mehrzweck-Produktionsanlagen zählen zu den modernsten Zentren für mikrobielle Produktion in Europa. Sie wurden streng nach den Anforderungen von FDA und EMA konstruiert. Hochqualifizierte Produktionsteams gewährleisten einen reibungslosen Technologietransfer der Prozesse in die Richter-Helm-Produktionsstätten wie auch entsprechende Skalierungen in größere Produktionsmaßstäbe. Richter-Helm ist ein Joint-Venture von Gedeon-Richter und Helm AG zum Zweck der weltweiten gemeinsamen Entwicklung und Vermarktung von biopharmazeutischen Produkten. Das Unternehmen hat mehr als 25 Jahre Erfahrung in der Entwick-

Richter-Helm hat in den vergangenen Jahren stark in neue Produktionstechnologien zur Optimierung der Ausbeutemengen bei gleichzeitiger Steigerung der Qualität und Robustheit von Prozessschritten investiert. So gelang es dem Unternehmen, durch neue Expressionssysteme mit optimierten Fermentationsverfahren die Ausbeute von E. coli-­Fermentationen bis in den zweistelligen Gramm-Bereich zu erhöhen. Für die Herstellung komplexerer Proteine (zum Beispiel Enzyme, Antikörperfragmente) steht Kunden nun auch die Verwendung von Hefebasierten Systemen, zum Beispiel Pichia ­pastoris, zur Verfügung. Die durch die Nutzung neuer Expressionssysteme erzielten höheren Ausbeuten müssen in den nachfolgenden Aufreinigungsprozessen gehandhabt werden. So wurde neben der Hochskalierung der Chromatographiesysteme eine Optimierung des Downstream-Processings (DSP) erforderlich. Das Unternehmen konnte etwa zeigen, dass durch die Einführung der Expanded Bed Adsorption-Chromatographie (EBATechnologie) die Prozesskosten um bis zu 50% gesenkt werden können. Weitere neue Chromatographie-Technologien werden laufend evaluiert. Richter-Helm trägt dem anhaltenden Trend zur kovalenten Modifizierung von ProItranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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teinen durch chemische oder enzymatische Vernetzung (z. B. PEGylierung, HESylierung, Polysialierung) Rechnung und verfügt über langjährige Erfahrungen in der Anwendung verschiedener Technologien. Darüber hinaus bietet Richter-Helm Dienstleistungen in drei unterschiedlichen Produktionsmaßstäben an (Labor, Pilot, kommerzielle Chargen/Batchgrößen), um die Kundenaufträge dort zu implementieren, wo Batchkosten und Batchanzahl sich optimal kombinieren lassen. Neben den technischen Fähigkeiten eines CDMO ist ein professionelles Projektmanagement ein wesentlicher Erfolgsfaktor, um auch die zukünftigen Bedürfnisse des Kunden zu erfüllen. Ein CDMO muss auf die unterschiedlichen Interessen von kleinen Start-up-Firmen und großen Pharmaunternehmen vorbereitet sein. Die Herangehensweise und der Umfang eines Projektes, zum Beispiel hinsichtlich der erforderlichen regulatorischen Beratung, können sehr stark variieren. Ein Projektmanagement, das diese Anforderungen in enger Zusammenarbeit koordiniert und die planmäßige Durchführung sicherstellt, wird zunehmend wichtiger und ist bei Richter-Helm bereits seit Jahren etabliert. Der schon seit längerem zu beobachtende Trend zu längeren Partnerschaften und strategischen Allianzen zwischen den

Entwicklern und Herstellern bestätigt die Bedeutung dieses Faktors.

Biosimilars Biosimilars sind einer der großen globalen Trends in der biopharmazeutischen Industrie. Aufgrund der hohen Komplexität dieser Wirkstoffe folgt dieser Markt jedoch anderen Gesetzen als der klassische Generikamarkt: Deutlich höhere Entwicklungskosten und längere Entwicklungszeiten sind typisch für die Biosimilar-Entwicklung. Ein breites Fachwissen mit großer Detailtiefe sowie engster Kontakt mit nationalen und internationalen Zulassungsbehörden sind erforderlich, um den Herausforderungen an die Entwicklung, Prüfung und Zulassung dieser Biopharmazeutika mit ihren unterschiedlichen und sich kontinuierlich ändernden Rahmenbedingungen gerecht zu werden. Richter-Helm arbeitet seit vielen Jahren im Kundenauftrag an der Entwicklung von Biosimilars, aber auch an eigenen Entwicklungen und hat in dieser Zeit weitreichende Erfahrungen über die Herstellung und Charakterisierung von Biosimiliars gewonnen. Die eigenen Entwicklungen werden voll­s tändig bis hin zum Fertigarzneimittel in house produziert. Daneben konnte auch

Fermenter am Standort Bovenau eine breite Expertise für die Präklinik und Klinik bis hin zur Zulassung aufgebaut werden. Hinsichtlich der bisher entwickelten Prozesse und Produkte ist Richter-Helm

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nologische Produkte in Debrecen, Ungarn, komplette Abfüll- und Verpackungslösungen für parenterale Darreichungsformen an. Produktionskapazitäten für klinische oder kommerzielle Chargen stehen vor Ort den Partnern von Richter-Helm zur Verfügung. Gedeon Richter, eines der Eignerunternehmen, investierte hier in einen Produktionsstandort zur Fertigung von Produkten in flüssigen Darreichungsformen. Die Dienstleistungspalette am Standort umfasst: –         Entwicklung von neuen oder verbesserten Produkten bis hin zur Marktreife, –        Weites Spektrum von Batch-Größen vom Labor bis hin zu großtechnischen Produktionsmengen begleitet durch das Prozessoptimierungs-Know-how im Unternehmen, –        Abfüllung, Lyophilisierung und Verpackung von biotechnologischen Produkten und anderen parenteralen Darreichungsformen. L

Herstellung von rekombinanten Proteinen –        Entwicklung von Produktionsstämmen (E. coli) –        Optimierung von Ausbeuten und Qualitäten –        Herstellung von Zellbänken –        Entwicklung von Fermentations- (1 bis 1.500 l) und Downstream-Prozessen –        Entwicklung von analytischen Methoden inkl. Bioassays –        Validierung von analytischen Methoden –        GMP-Produktion für klinische Phasen I bis III –        GMP-Produktion von Marktware –        Prozessvalidierung –        In-House-Qualitätskontrolle –        Stabilitätsstudien nach ICH-Richtlinien Produktion von Plasmid-DNA –        Entwicklung von Produktionsstämmen –        Herstellung von Zellbänken –        Entwicklung von Fermentations- (1 bis 1.500 l) und Downstream-Prozessen –        Entwicklung von analytischen Methoden –        GMP-Produktion für klinische Phasen I bis III –        GMP-Produktion von Marktware –        In-House-Qualitätskontrolle Produktion von Impfstoffen –        Richter-Helm hat eine langjährige Erfahrung in der Entwicklung und Produktion von bakteriellen Impfstoffen Fill & Finish –        Abfüllung von biotechnologischen Produkten und anderen parenteralen Darreichungsformen

Kongresse Richter-Helm ist auf folgenden Kongressen und Messen vertreten: – BioTalk Biological Manufacturing Excellence, Berlin, 26.-27. September 2013 – CPhI/ICSE, Frankfurt, 22.-24. Oktober 2013, Stand: #31D46 – BioEurope, Wien, 04.-06. November 2013, Stand: #44

Dienstleistungen auf einen Blick offen für Entwicklungs- und Vertriebskooperationen, das heißt neben der gemeinsamen Entwicklung und Vermarktung der Biosimilars sind auch reine Vertriebsvereinbarungen denkbar. Dabei sind Gespräche mit Lizenznehmern möglich und gern gesehen, für die eine Investition in die von Richter-Helm entwickelten Prozesse und

Produkte im Biosimilar-Geschäfts­s egment attraktiv ist.

Fill & Finish Services Richter-Helm bietet mit der gerade fertiggestellten modernen Abfüllanlage für biotech-

Kontakt Dr. Kai Pohlmeyer Richter-Helm Biotec GmbH & Co. KG Hamburg Tel.: +49-(0)40-55 290 430 k.pohlmeyer@richter-helm-biotec.eu www.richter-helm.eu

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Leipzig, Germany

Register now: www.wcrm-leipzig.com/registration.php

Co-organized by Committee for Advanced Therapies (CAT) of the European Medicines Agency

Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM) Leipzig of the Leipzig University

The workshop is embedded in the World Conference on Regenerative Medicine (WRM) Leipzig 2013: www.wcrm-leipzig.com

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PRODUKTION

Moderne Herstellprozesse für Impfstoffe Ein neu etabliertes zellbasiertes Verfahren zur Produktion vektorbasierter Lebendimpfstoffe bietet eine wirtschaftliche Alternative zur Herstellung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine in Hühnereiern. Von Verena Lohr und Ingo Jordan, ProBioGen AG, Berlin Infektionskrankheiten stellen weltweit ein erhebliches Gesundheitsproblem dar. Zwar sind gegen einige davon wirksame Impfstoffe verfügbar, dennoch führen insbesondere in den Entwicklungsländern Infektionen nach wie vor zu einer hohen Morbidität und Mortalität, zum Beispiel durch Masernoder Rotaviren. Gegen andere gefährliche Erkrankungen wie Tuberkulose (TBC), Malaria, AIDS, Hepatitis C oder pandemische Influenza sind noch keine dauerhaft wirksamen Impfstoffe verfügbar. Dank verbesserter Hygiene, erfolgreicher Impfkampagnen in der Vergangenheit und der Verfügbarkeit neuer Therapeutika ist in den Industrieländern ein trügerisches Sicherheitsgefühl entstanden. Das hat dazu geführt, dass Infektionen nicht mehr als ernste Gefährdung wahrgenommen werden und die Impfmüdigkeit zunimmt. Durch den hierdurch bedingten Rückgang der Immunität in der Bevölkerung können Erreger wieder Fuß fassen, die längst als besiegt galten.

Virale Impfstoffe und Vektorimpfstoffe Prophylaktische und therapeutische Impfungen gehören zu den erfolgreichsten und kostengünstigsten medizinischen Maßnahmen. Die Produktion von Impfstoffen ist daher auch aus gesundheitsökonomischen Gründen ein zunehmend wichtiger Bereich der medizinischen Biotechnologie. Durch neue wissenschaftliche Erkenntnisse wächst nicht nur die Vielfalt der für eine Immunisierung geeigneten Zielstrukturen, sondern es ergeben sich auch neue Optionen für die Entwicklung wirksamer Impfstoffe. Dabei kann die deutlich höhere Komplexität von Impfstoffen im Vergleich zu therapeutischen Proteinen durch moderne Methoden zunehmend besser kontrolliert werden.

Besondere Herausforderungen für die Impfstoffentwicklung und -produktion bilden die bereits erwähnten chronischen und komplexen Infektionskrankheiten wie TBC, Malaria, AIDS oder Hepatitis C. Eine Hoffnung für neue Therapieansätze liegt in vektoriellen Impfstoffen. Hierfür wird ein gut charakterisiertes und stark abgeschwächtes Virus mit Fremdgenen des Erregers ausgestattet, gegen die im Impfling eine Immunreaktion ausgelöst werden soll. Da es sich bei vektoriellen Impfstoffen um eine Lebendimpfung handelt, ist die Impfreaktion immunologisch sehr vielfältig und einer Impfung mit Totimpfstoff überlegen. Hohe Sicherheit wird dadurch erreicht, dass sich die modernen Vektoren auch in Menschen mit geschwächtem Immunsystem nicht – oder in nur sehr geringem Maße – vermehren können. Allerdings entstehen im Zuge dessen neue technologische Herausforderungen: Für die Produktion der vektorbasierten Impfstoffe werden spezielle Zelllinien benö-

tigt. Auch muss die Ausbeute sehr hoch sein, um die eingeschränkte Replikationsfähigkeit im Empfänger durch eine höhere Impfdosis kompensieren und den Impfstoff zu ökonomisch vertretbaren Kosten herstellen zu können. Dabei eröffnet sich für die neuen Impfstoffe ein großes Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten, das von der Prävention von Infektionskrankheiten bis zur Therapie bestimmter Tumorerkrankungen reicht. Aufgrund dieser Vielfalt wird es keine universale technologische Lösung geben. Mit der Entwicklung einer eigenen Plattformtechnologie, basierend auf der Zelllinie AGE1.CR.pIX® und einem attenuierten Pockenvirus als Impfvektor, ist der ProBioGen AG jedoch in den vergangenen Jahren ein großer Schritt zur Unterstützung moderner Impfstoffentwicklung gelungen. Das attenuierte Pockenvirus Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) ist eines der möglichen und bereits mehrfach geteste-

Die Autoren Verena Lohr hat für ihre Promotion am Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme in Magdeburg biochemische und biotechnologische Aspekte bei der Herstellung von Impfstoffen in Zellkultur charakterisiert. Seit 2013 ist die Biotechnologin bei der ProBioGen AG für die Prozessentwicklung viraler Impfstoffe verantwortlich. Ingo Jordan ist Virologe und Biochemiker. Für die Promotion in Deutschland und als Post-Doc in den USA hat er die Replikation komplexer Retroviren und verschiedener RNA-Viren erforscht. Bei der ProBioGen AG ist er Bereichsleiter für die Entwicklung neuer Wege zur Produktion und Bereitstellung von Impfstoffen. ProBioGen ist ein Spezialist für die Entwicklung von Produktionszelllinien, Verfahrenstechnik und die GMP-Herstellung rekombinanter Proteine aus Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen.

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Mit der aviären, für MVA hoch-permissiven Zelllinie AGE1.CR.pIX® hingegen stellt die ProBioGen einen vielversprechenden Lösungsansatz für die Herstellung von Impfstoffen auf MVA-Basis zur Verfügung. So ist in Verbindung mit der Entwicklung von chemisch-definierten Medien, die Suspensionswachstum und hohe Virusausbeuten erlauben, ein moderner industrieller Prozess zur Herstellung verschiedenster veterinärer und humaner Impfstoffe etabliert worden, der bei Bedarf ohne großen logistischen Aufwand in jede Region transferierbar ist. ProBioGen lizenziert die Zelllinie aus und bietet unterstützend Prozessentwicklungsdienstleistungen an. Die erste Marktzulassung für ein mit der AGE1.CR.pIX ® produziertes Impfprodukt wird für 2014 erwartet.

AGE1.CR.pIX® -Plattform AGE1.CR.pIX®-Suspensionskultur in chemisch definiertem Medium, infiziert mit einem MVA-Vektor. Die Virusreplikation lässt sich gut verfolgen, weil der Vektor ein rotfluoreszierendes Reportergen exprimiert. An vielen Virus-positiven Zellen lässt sich der typische zytopathische Effekt beobachten. ten Trägerviren. Vielversprechende Studien belegen, dass MVA eine umfassende Immunreaktion auslöst. Die Replikationsfähigkeit von MVA ist auf Vogelzellen beschränkt, so dass in dieser Hinsicht kein Risiko für den Menschen besteht. Damit besitzt MVA hervorragende Eigenschaften als Trägervirus für den Einsatz in prophylaktischen oder therapeutischen Anwendungen. Die breiten Anwendungsmöglichkeiten von MVA werfen jedoch die Frage auf, wie eine ausreichende Menge dieser Vektoren zu vertretbaren Herstellungskosten bereitgestellt werden kann.

Der Wirt macht den Unterschied Bisherige Plattformprozesse für die Impfstoffproduktion basieren auf zwei Zellsubstratvarianten – aviären Primärzellkulturen (Hühnerembryofibroblasten oder bebrüteten Hühnereiern) und kontinuierlichen Säugetierzelllinien (zum Beispiel MDCK- oder Vero-Zellen). Ein Vorteil der ersten Variante ist die hohe Suszeptibilität aviärer Wirtszellen gegenüber einer Vielzahl von Viren, darunter auch MVA. Primärkulturprozesse sind jedoch mit erheblichen Problemen verbunden, wie etwa unerwünschten Variationen beim Primärzellmaterial, der Abhängigkeit von gesunden Spender-Tierbeständen und einem hohen logistischen Aufwand. Damit eignen sich diese Prozesse nur bedingt für den Transfer in Regionen, in denen zwar der

Bedarf an Impfstoffen besonders hoch ist, in denen aber Produktionsausfälle besonders prekäre Folgen haben. Solche Versorgungsschwierigkeiten sind für Impfstoffe gegen Influenza, Tollwut und pädiatrische Krankheiten wie Masern beschrieben worden. Zudem können Hühnerzellen eine bestimmte Form retroviraler Partikel in so großer Zahl freisetzen, dass manche damit produzierte Impfstoffchargen keine Freigabe erhalten. Um dieses Risiko auszuschließen, hat die ProBioGen AG Primärzellen der Moschusente (Cairina moschata) in kontinuierliche Zelllinien umgewandelt. Von der Auswahl der Spendertiere, der Isolation des Primärzellmaterials, der gezielten Methode der Zellimmortalisierung, der Selektion MVA-permissiver Zellklone bis zur Herstellung und umfassenden Charakterisierung von Zellbanken wurden alle regulatorischen Anforderungen und GMP-Vorschriften eingehalten. Dadurch steht mit der AGE1. CR.pIX ® eine pharmazeutisch nutzbare, neuartige Zelllinie für die Impfstoffproduktion zur Verfügung. In den vergangenen Jahren wurden auch andere kontinuierliche Zelllinien als Substrate für die Herstellung humaner und veterinärer Vakzine zugelassen. Da diese Zelllinien aber von Säugern abgeleitet sind und MVA auf diesen nicht repliziert, können MVA oder MVA-basierte Impfstoffe mit dieser Technologie nicht produziert werden.

In einer Vielzahl von Projekten wurden die hohe Produktivität der Zelllinie und ihre Eignung für den biotechnologischen Einsatz belegt. Weil die Kultivierung in Microcarrier-freier Suspension erfolgt, sind Prozesse mit der AGE1.CR.pIX® in verschiedene Reaktorsysteme übertragbar. Kulturmedien für die AGE1.CR.pIX® sind chemisch definiert, frei von tierischen Zusätzen und mikrobiellen oder pflanzlichen Hydrolysaten. Die endgültige Formulierung der Medien ist ein Entwicklungsergebnis der ProBioGen und bietet eine hohe Flexibilität durch Unabhängigkeit von der Katalogware kommerzieller Mediumhersteller. Sowohl klassische Systeme wie Schüttelkolben oder Glasreaktoren, als auch Einweg-Technologien wie Wave- oder SUBSysteme wurden evaluiert und bis in den industriellen Maßstab (200 L) erfolgreich skaliert. Verschiedene Prozessvarianten sind durchführbar, von Batch oder FedBatch bis hin zu kontinuierlicher Kultivierung und Perfusion. In sich geschlossene Produktionsstrecken vom Kryovial bis in industrielle Produktionsmaßstäbe sind somit für die Produktion von MVA und andere Impfstämme realisierbar. 

Kontakt Dr. Gabriele Schneider VP Business Development ProBioGen AG Goethestr. 54 13086 Berlin Tel.: +49-(0)30 924006-0 cmo@probiogen.de www.probiogen.de Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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Biomanufacturing

LLL Prozessentwicklung

Stammscreening unter Fed-Batch-Bedingungen Neue Mikrotiterplatten (MTPs) ermöglichen ein realitätsnahes Screening. Von Kristina Bruellhoff, PS Biotech GmbH, Aachen Beim Screening nach effizienteren und produktiveren Stämmen sieht sich die Biotechnologiebranche regelmäßig mit einem bislang unlösbaren Problem konfrontiert: Der überwiegende Teil des Screenings nach dem optimalen biotechnologischen Prozess wird meist unter Batch-Bedingungen durchgeführt, eine Fütterungsstrategie, bei der zu Beginn alle Nährstoffe im Überschuss zugegeben werden. In Produktionsprozessen hingegen wird vorzugsweise die Fed-Batch-Betriebsweise gewählt – eine limitierende und kontrollierte Betriebsweise –, um unerwünschte Effekte wie die Katabolitrepression zu vermeiden sowie höhere Biomasse- und somit auch Produktausbeuten zu erreichen. Aus der Literatur ist bereits seit Jahren bekannt, dass die unterschiedlichen Nährstoffsituationen in Screening und Produktion die Identifikation des am besten geeigneten Stammes erheblich erschweren. Vergleichsversuche, bei denen Screeningversuche mit Hansenula polymorpha in Batch- und Fed-batch-Betriebsweise durchgeführt wurden, zeigten am Beispiel von Glukose deutliche Vorteile der limitierenden Bedingungen. Die Fed-Batch-Fütterung konnte durch die kontrollierte Glukosefreisetzung aus Polymerdisks erreicht werden, die im Schüttelkolben

zum Einsatz kamen. Der Bedarf an solchen Fütterungssystemen ist groß. Jährlich werden in Biotechnologie-Firmen hunderttausende Klone für geplante Produktionen getestet.

Fed-Batch-Fütterung in MTPs Falschinformationen über die Produktivität der Klone, die durch die unkontrollierbaren Nährstoffbedingungen im Screening bedingt sind, führen zu kostenintensiven Wiederholungen der Experimente. Das hohe Probenaufkommen und die hohen Zahlen an Klonen, die im Screening differenziert werden müssen, sowie die immer weiter fortschreitende Automatisierung solcher Prozesse macht eine Überführung des Screenings in ein Format attraktiv, das mit Standardlaborausrüstung genutzt werden kann und gut handhabbar ist. Mikrotiterplatten bieten genau diese Vorteile. Kürzlich wurde eine Fed-Batch-Fütterung im Mikrolitermaßstab in Form einer Mikrotiterplatte vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass unter Fed-Batch-Bedingungen die besseren Stämme für die Produktion ausgewählt wurden. Die Platten können darüber hinaus zum Angleichen des Stoffwechsels

Neue Mikrotiterplatten ermöglichen Processscreening unter Fed-Batch-Bedingungen.

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unterschiedlicher Klone genutzt werden. Dies hat zur Folge, dass die Klone ausgehend von den gleichen Bedingungen gescreent werden. Die Anpassung der Nährstoffsituationen im Screening an die späteren Produktionsbedingungen ermöglicht es, sehr präzise Aussagen über die tatsächliche Produktivität eines Klons zu treffen. Die im Mai aus einer Kooperation der Bioverfahrenstechnik der RWTH Aachen und dem DWI an der RWTH Aachen gegründete PS Biotech GmbH wird künftig solche FedBatch-Fütterungssysteme in Mikrotiterplatten anbieten. Die Platten enthalten eine spezielle, am Boden der Wells fixierte, nährstoffgefüllte Polymermatrix, welche in Kontakt mit dem Kultivierungsmedium eine kontrollierte Freisetzung des Substrates ermöglicht. Im Vergleich zu heutigen Standardmethoden wie Mikrobioreaktorsystemen oder enzymatischen Freisetzungssystemen bieten die nährstoffgefüllten Mikrotiterplatten neben der hohen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse eine einfache und vor allem kostengünstige Alternative. Das 96-Well-Format ermöglicht darüber hinaus das Arbeiten im Hochdurchsatz. Im Gegensatz zu Systemen, die auf enzymatischen Freisetzungsmechanismen basieren, sind diese Freisetzungen aus der polymeren Matrix nicht in der Wahl des Nährstoffes beschränkt. Mögliche mikrobielle Ausscheidungsprodukte wie Amylasen oder Proteasen stören das System nicht. Die Platten können ohne größere Anpassungen in bestehende Kultivierungsprotokolle integriert und mit Standardlaborequipment betrieben werden. In enger Zusammenarbeit mit den Universitätspartnern gelang dem Team der PS Biotech GmbH 2012 der Umstieg von manueller Produktion auf automatisierte Kleinserienproduktion, was den ausschlaggebenden Anstoß zur Gründung des Start-ups lieferte. Mittels einer Finanzierung durch den High Tech Gründerfonds II werden die Fütterungssysteme von Herbst 2013 an auf dem deutschen Markt verfügbar sein. L kristina.bruellhoff@psbiotech.com

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Biomanufacturing

LLL Prozesskontrolle

Mikrobielle Sicherheitsaspekte in der Biotechnologie Die Sicherheit und Reinheit rekombinanter therapeutischer Proteine und monoklonaler Antikörper im Hinblick auf mikrobielle Kontaminationen wird über ein mehrstufiges Sicherheitskonzept gewährleistet. Von Olaf Stamm und Kerstin Brack, Charles River BPS GmbH, Erkrath Im Gegensatz zu chemisch synthetisierten Wirkstoffen bieten biotechnische Herstellprozesse mit ihren pro- und eukaryontischen Zellen, den reichhaltigen Medien und kon­ trollierten Kultivierungstemperaturen ideale Vermehrungsbedingungen für Bakterien, Pilze und Viren. Zugleich erfordert die reduzierte Stabilität der produzierten Proteine schonende Methoden für deren Aufreinigung. Trotz dieser, aus der Sicherheitsperspektive eher unglücklichen Kombination, zeigen rekombinante Proteine und monoklonale Antikörper ein bisher tadelloses Sicherheitsprofil, und es ist keinerlei Übertragung von Infektionskrankheiten durch biopharmazeutische Arzneimittel beschrieben. Der Grund hierfür ist ein mehrstufiges Sicherheitskonzept, das den gesamten Herstellungsprozess umfasst.

Bei der Verwendung von tierischen oder humanen Expressionssystemen liegt ein Hauptaugenmerk auf der Kontamination durch Viren, da diese im Gegenzug zu Bakterien oder Pilzen noch schwerer analytisch nachzuweisen sind und nicht durch gängige 0,1 µmSterilfilter abgetrennt werden können.

Ausgangsmaterialien Im Sinne der Guten Herstellungspraxis (GMP) ist eine sorgfältige Auswahl geeigneter Rohstoffe und Ausgangsmaterialien für die Produktion erforderlich, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden – insbesondere dann, wenn es sich hierbei um pflanzliche oder tierische Komponenten handelt. Diese Materialien werden einer umfangreichen Eingangsprüfung mit Hilfe von zellbasierten, immunologischen und molekularbiologischen Verfahren unterzogen. Unter Umständen werden sie zusätzlich durch Inaktivierungsschritte beziehungsweise Filtrationen konditioniert.

Charakterisierung von Zellsubstraten und Prozess-Intermediaten

Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle mit Retroviren (V)

Die nachhaltige Qualität eines von tierischen oder humanen Zellen produzierten Wirkstoffs hängt entscheidend von den eingesetzten Startmaterialien ab. Die zur Produktion verwendete modifizierte Zelllinie wird unter definierten Bedingungen (GMP) amplifiziert, aliquotiert und als Master-Zell-Bank (MCB) kryokonserviert und gelagert. Aus Teilen der MCB wird in der Regel eine sogenannte Arbeits (Working)-Zellbank (WCB) generiert, deren Zellen dann für die Produktion verwendet werden. Ein repräsentativer Anteil jeder Zellbank wird einer umfangreichen Charakterisierung unterzogen. Speziell zur Demon­stration der Abwesenheit mikrobieller

Kontaminationen werden klassische mikrobiologische Anzuchtsverfahren, In-vitro- und In-vivo-Virusnachweise sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen und spezifische PCR-Tests durchgeführt. Darüber hinaus wird eine Probe jeder Fermenter-Ernte (Bulk Harvest oder Un-Processed Bulk) ebenfalls einem reduzierten Testprogramm unterzogen.

Validierung von Prozessschritten Für den Fall, dass Viren die vorgeschalteten analytischen Sicherheitsbarrieren unbemerkt passiert haben sollten, muss der auf die Fermentation folgende Aufreinigungsprozess in der Lage sein, Viren zu inaktivieren und/ oder von der Produktfraktion zu separieren. Die diesbezügliche Abreicherungskapazität einzelner Prozessschritte wird in Validierungsstudien ermittelt. Hierfür werden die entsprechenden Aufreinigungsschritte im kleinen Maßstab im Labor nachgebaut und mit hochtitrigen Virussuspensionen künstlich belastet. Die Virusmenge wird in definierten Fraktionen bestimmt und im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Virusmenge betrachtet. Daraus errechnet sich ein Reduktionsfaktor für die potentielle Virusbelastung, der in logarithmischer Form (logarithmischer Reduktionsfaktor, LRF) angegeben wird. Die kumulierten LRF der einzelnen Prozessschritte werden dem Risiko und der tatsächlichen Belastung der Ausgangsmaterialien gegenübergestellt und abschließend bewertet. L

Kontakt Dr. Olaf Stamm, Dr. Kerstin Brack Charles River Biopharmaceutical Services GmbH Max-Planck-Straße 15a, 40699 Erkrath Tel. : +49(0)-211-9255-323 olaf.stamm@crl.com, www.criver.com Itranskript I Nr. 8-9 I 19. Jahrgang 2013

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22.08.2013 14:56:14 Uhr


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