Estudio de la proteína mitocondrial VDAC de Rhipicephalus microplus y su posible función durante la infección con Babesia 1Rodríguez
Hernández Elba, 2Mosqueda Gualito Juan Joel, 1Camacho Nuez Minerva*. 1Posgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Ciudad de México, México D.F.; 2Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Querétaro, México. *mcamachonuez@yahoo.com.mx
A
Resumen El vector Rhipicephalus microplus transmite parásitos del género Babesia a su hospedero bovino. El estudio de los eventos moleculares en la interacción garrapata-Babesia permitirá desarrollar nuevos métodos de control de la transmisión del parásito. Mediante herramientas proteómicas identificamos una proteína intestinal de la garrapata que interacciona con fases sexuales de Babesia bigemina. Esta proteína tiene un alto grado de identidad con el Canal de Aniones Dependiente de Voltaje (VDAC). En este trabajo se describe la caracterización molecular de esta proteína la cual podría estar participando en el proceso de infección de Babesia al intestino del vector.
Objetivo
B
Figura 1. Análisis bioinformático de la proteína VDAC. A) Alineamiento múltiple de los aminoácidos de la proteína VDAC; en asteriscos se muestran los aminoácidos determinantes para entrada de voltaje y en rectángulos se muestran los aminoácidos importantes para la Interface de dimerización. B) Predicción de la estructura terciaria de la proteína VDAC de R. microplus, mediante el programa Swiss Model.
Caracterizar la proteína VDAC del intestino de la garrapata que interacciona con el protozoario Babesia bigemina.
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B
Introducción Las garrapatas son ectoparásitos que se alimentan de sangre y transmiten enfermedades tanto a humanos como a animales; entre las enfermedades que transmiten se encuentran la anaplasmosis y la babesiosis bovina (1), esta última es una enfermedad causada por parásitos intraeritrocíticos del género Babesia, que son transmitidos a su hospedero bovino por garrapatas Rhipicephalus microplus (2). El ciclo biológico de Babesia es complejo e incluye fases asexuales y sexuales en el bovino y en la garrapata, respectivamente (3). La investigación sobre la interacción molecular entre los órganos de la garrapata y las fases infectantes de Babesia es importante para implementar estrategias que ayuden a controlar la transmisión del parásito, y por lo tanto erradicar la enfermedad. Sin embargo; hasta el momento no existen muchos reportes del estudio de la interacción a nivel molecular entre el vector y los patógenos que transmite. Recientemente identificamos una proteína (porina) del intestino de la garrapata que interacciona con fases sexuales de Babesia (4), la cual podría ser importante en el proceso de infección de Babesia al intestino del vector.
1
2
Peso molecular Organismo y No. de Punto isoeléctrico Cobertura de teórico (kDa) acceso teórico (pl) identificación (%) 30.5
5
6
Ixodes scapularis gi|241061134
8.70
33%
1
7
24 hrs I
A
vdac
B
Esterasa
2
3
4
5
6
7
48 hrs
72 hrs
NI
I
NI
2
3
4
I
NI
5
6
RT1
Resultados
Canal selectivo de aniones dependiente de voltaje (VDAC)
4
Figura 2. Inducción de la proteína recombinante VDAC. A) Extractos proteicos de E. coli inducidos con IPTG 1 mM, separados en un gel SDS-PAGE al 12%, teñidos con Azul de Coomassie, Carriles: 1 Marcadores de peso molecular (kDa); extractos proteícos de E. coli, Carriles: 2 y 3 pCold-vdac, 4 y 5 pCold vacío, 6 y 7 pCold-ChuA, control de inducción. B) Western blot de un gel espejo con los mismos extractos proteicos que A, la inmunodetección de VDACr usando anticuerpos anti tag-His. Las flechas indican la proteína VDACr de 25 kDa.
C
Proteína identificada
3
Figura 3. Expresión del gen vdac a diferentes tiempos en garrapatas infectadas y no infectadas. La RT-PCR mostró : A) Amplicón del gen vdac usando los oligonucleótidos específicos y el cDNA de garrapatas infectadas (I) y no infectadas (NI). Carriles 1 y 2, a las 24 hs post-repleción; 3 y 4, a las 48 hrs post-repleción; 5 y 6, a las 72 hrs post-repleción. B) Amplicón de pb del gen de la esterasa , control positivo de carga. C) RT- , Control Negativo.
Conclusiones La
Tabla 1. Resultado de la búsqueda en la base de datos MASCOT. La proteína se identificó por espectrometría de masas LC/MS/MS. Los péptidos obtenidos de la secuenciación tuvieron una cobertura de identidad del 33% con la secuencia VDAC de la garrapata Ixodes scapularis.
secuencia parcial del gen vdac de R. microplus fue reportado en la base de datos de genes (No. de acceso GU994210). La
proteína recombinante fue identificada mediante western blot usando anticuerpos contra tag de histidinas. El
Bibliografía
1. Snelson J.T. 1975. Animal ectoparasites and disease vector causing major reduction in world
food supplies. FAO Plant Protection Bulleton, 13: 103-114. 2. Purnell R. E. 1981. Babesiosis in various hosts. In “babesiosis”. Ristic, M and Kreir, J .P. Ed. New York U.S.A. Academic Press. 25-32. 3. Bock R., Jackson L., De Vos A., Jorgensen W. 2004. Babesiosis of cattle. Parasitol. 129: s247-s269. 4. Rodríguez Hernández Elba. 2009. Análisis e identificación de proteínas de las células de intestino de Rhipicephalus microplus que interaccionan específicamente con fases sexuales de Babesia bigemina; agente causal de babesiosis. Tesis de Maestría.
gen vdac disminuye su expresión a las 24 hrs post-repleción una con respecto al nivel de expresión a las 48 hrs; y a las 72 hrs post-repleción no se detecta transcrito en ninguna de las condiciones analizadas.
Agradecemos
al CONACYT (No. 7892) y a la UACM (No. 7D83023005) por el apoyo financiero otorgado a este proyecto.