55 łaniem układu odpornościowego człowieka w postaci otoczki bakteryjnej, która umożliwia wiązanie się komórki bakteryjnej z komórkami śródbłonka i monocytami. Oprócz otoczki, jednym z najbardziej znanych czynników powierzchniowych gronkowców, decydujących o ich patogenności jest białko A, które blokuje działanie immunoglobulin klasy IgG i przeciwdziała tym samym fagocytozie przez komórki układu odpornościowego. Czynnikami na powierzchni komórki bakteryjnej ułatwiającymi im powinowactwo do tkanek gospodarza są również białka adhezyjne mające zdolność łączenia się z białkami makroorganizmu. Do białek tych zalicza się m.in. białka wiążące fibrynogen - clumping factor oraz białka wiążące kolagen i elastynę. Jedna komórka bakteryjna może zawierać kilka różnych czynników adhezyjnych, a nie tylko jeden, co znacznie ułatwia jej zdolność łączenia się z białkami obecnymi w surowicy i zwiększa ich szanse na zakażenie. Gronkowce wytwarzają również wiele toksyn decydujących o ich zjadliwości. Są wśród nich cytotoksyny, które uszkadzają m.in. krwinki białe i czerwone. Do szczególnie niebezpiecznych należy toksyna TSST-1 (powoduje wstrząs toksyczny), toksyna alfa (tworzy pory w błonach lipidowych komórek, powodując ich lizę i martwicę), toksyna delta (powoduje rozpuszczanie błon lipidowych komórek), toksyna gamma (zwiększa przepuszczalność naczyń skóry i hamuje wchłanianie wody w jelicie), a także enterotoksyny gronkowcowe (powodują zatrucia pokarmowe) i toksyny epidermolityczne (powodują złuszczające pęcherzowe zapalenie skóry, głównie u niemowląt) [1, 2, 7]. Z uwagi na to, że S.aureus jest drobnoustrojem, który kolonizuje przede wszystkim skórę człowieka, zachodzi duże prawdopodobieństwo skażenia produktów kosmetycznych tym patogenem podczas ich stosowania. Z tego też powodu w normie PN - EN ISO 17516:2014 [5] ustalono limity mikrobiologiczne dla gronkowca złocistego. Zakładają one nieobecność S.aureus w 1 g lub 1 ml produktu specjalnego zastosowania dla dzieci poniżej 3 r.ż., w okolice oczu lub błon śluzowych oraz tzw. inne produkty [3,5]. Metodę wykrywania obecności S. aureus podaje norma PN-EN ISO 22718:2010 [6]. Podobnie jak w innych metodach znormalizowanych, można w niej wyodrębnić następujące etapy: namnażanie, posiew na pożywkę selektywną oraz identyfikację. Namnażanie przeprowadza się we wzbogaconej pożywce bulionowej zawierającej odpowiednie środki zobojętniające i/lub dyspergujące. Neutralizacja przeciwdrobno-
e-wydanie do pobrania na:
www.farmacom.com.pl
ustrojowych właściwości produktu powinna być zawsze sprawdzona za pomocą szczepu wzorcowego S. aureus ATCC 6538 (lub równoważnego z innych kolekcji) zgodnie z procedurą podaną w normie [6]. Następnie niewielką ilość próbki namnożonej w bulionie przesiewa się na selektywną pożywkę agarową Baird – Parkera celem izolacji kolonii [6]. Staphylococcus aureus rośnie na tej pożywce w postaci czarnych, błyszczących kolonii, otoczonych jasną obwódką o średnicy od 2 – 5 mm (zdjęcie 1).
Zdj. 1. Staphylococcus aureus ATCC® 6538 na pożywce agarowej Baird-Parkera.
Inną selektywną pożywką agarową do wyboru jest agar z solą i mannitolem (pożywka Chapmana) [6], na której drobnoustrój ten rośnie w postaci żółtych, błyszczących kolonii o średnicy 1-2 mm (zdjęcie 2).
rozkłada H2O2 do O2 i H2O. Produkcja katalazy jest uwidoczniona w badaniu poprzez natychmiastowe powstawanie pęcherzyków po dodaniu odczynnika H2O2 do zawiesiny kolonii drobnoustroju. Test z koagulazą również powinien dać wynik dodatni. Zgodnie z zaleceniami Normy [6], w celu wykonania testu, należy przenieść dobrze wyizolowane kolonie z powierzchni selektywnej pożywki do sterylnych probówek zawierających 0,5ml osocza np. króliczego, a następnie inkubować w temp. 37°C ± 2°C, prowadząc obserwację po 3, 4 i 6 godzinach. O wyniku dodatnim testu świadczy uformowany skrzep w probówce. W przypadku braku koagulacji po 6 godzinach należy przeprowadzić 24 godzinną inkubację lub postępować zgodnie z zaleceniami producenta testu [6]. Należy pamiętać o równoległym przeprowadzeniu kontroli dodatniej i ujemnej testu zgodnie z wytycznymi producenta. Analiza ryzyka wystąpienia zakażenia gronkowcami jest istotnym elementem w procesie projektowania i wytwarzania produktu. Skażenie produktów kosmetycznych gronkowcem złocistym jest realne również w trakcie późniejszego stosowania kosmetyku przez użytkownika końcowego. Wynika to z faktu, że S.aureus jest czynnikiem stanowiącym florę fizjologiczną człowieka, głównie powłok skórnych. Dlatego tez w działaniach mających na celu zapewnienie bezpieczeństwa stosowania produktu, S.aureus jest powszechnie stosowanym wskaźnikiem skuteczności substancji konserwujących, szczególnie tych pochodzenia roślinnego.
Literatura
Zdj. 2. Staphylococcus aureus ATCC® 6538 na pożywce agarowej z solą i mannitolem (agar Chapmana).
W przypadku wzrostu charakterystycznych kolonii na pożywce selektywnej przeprowadza się testy potwierdzające: barwienie metodą Grama, test na katalazę oraz test z koagulazą [6]. S.aureus jest Gram-dodatnim ziarniakiem (często w skupiskach) o granatowym wybarwieniu (intensywność zabarwienia jest uzależniona od czasu ekspozycji komórki bakteryjnej na barwnik). W teście na katalazę daje wynik dodatni. Katalaza jest enzymem, który
1/2015
1.
Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z. i wsp.: Mikrobiologia techniczna. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji Żywności. Wyd. Nauk. PWN. Warszawa, 2008.
2.
Młynarczyk G., Młynarczyk A.: Gronkowce (w) Wybrane zagadnienia z mikrobiologii jamy ustnej, red. Łuczak M., Kopeć – Swoboda E. Wyd. Czelej, Lublin, 2004, s. 191 – 203.
3.
Nowaczyk P., Merlak D.: Limity mikrobiologiczne drobnoustrojów w produktach kosmetycznych według normy ISO/DIS 17516. Świat Przemysłu Kosmetycznego, 1, 54-55, 2014.
4.
Obrębska K.B., Szczygła A., Matejczyk M.: Skażenia mikrobiologiczne surowców i produktów kosmetycznych. Post. Mikrobiol. 47, 65-71, 2008.
5.
PN-EN ISO 17516:2014 Kosmetyki. Mikrobiologia. Limity mikrobiologiczne.
6.
PN-EN ISO 22718:2010 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus.
7.
Szewczyk E.M.: Diagnostyka bakteriologiczna. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, 2009.
8.
Zaremba M. L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa, 1997.