Lezione 4 alloimmunizzazione eritrocitaria dic 2010

Richiamo delle puntate precedenti…..

1. Gli antigeni ABH sono composti da: a. Carboidrati

b. Proteine c. Lipidi 2. L’antigene H si ottiene:

a. Mediante l’aggiunta di uno zucchero all’antigene 0 b. Mediante l’aggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore c. Mediante la trasformazione dell’antigene A ad opera di una trasferasi

3. Il gene B codifica:

a. un enzima che aggiunge D-galattosio allo zucchero terminale della sostanza H b. Un polipetide transmembrana con un epitopo molto immunogeno c. un enzima che aggiunge N-acetilgalattosammina allo zucchero terminale della sostanza H

4. Il gene Se:

a. Codifica per la presenza degli antigeni A e B nella saliva b. Ăˆ presente sul cromosoma 9 e l’allele amorfo è se c. Codifica lo stato di secretore, ovvero la presenza di antigene H nelle secrezioni biologiche c

5. La progenie di genitori entrambi di genotipo A0: a. Può essere solo A0

b. Può essere A0, AA o 00 c. Sarà solo AA o A0 ma non 00

6. La quantità di sostanza H sulla superficie dei globuli rossi varia nel seguente modo: a. A2B >A1B > A1 > 0 >A2>B

b. B>A1>A1B>0> A2 >A2B c. 0>A2>B>A2B>A1>A1B

7. Il sistema Rh è particolarmente importante poichÊ: a. Tutti i soggetti D negativi presentano anticorpi anti-D

b. Gli antigeni D sono molto immunogeni c. Gli anticorpi anti-D sono la principale causa di emolisi intravascolare

8. I piĂš importanti antigeni del sistema Rh sono: a. Cw, Ew, e, CE

b. D, C, E, c, e c. D, d, C, c, E, e

9. Il sistema Rh e trapianti di organi solidi: a. Il sistema Rh non gioca un ruolo nei trapianti d’organo in quanto gli antigeni Rh sono espressi solo sui globuli rossi

b. Il sistema Rh gioca un ruolo nei trapianti di rene poiché l’antigene D è espresso sulle cellule endoteliali c. E’ sconsigliato trapiantare un organo solido in un ricevente con anti-D poiché è a maggior rischio di rigetto iper-acuto 10. Un donatore di sangue con espressione debole dell’antigene D: a. Va considerato come Du b. Va classificato come D positivo poiché è potenzialmente in grado di immunizzare un ricevente D negativo c. Va considerato come D negativo poiché non è in grado di immunizzare un ricevente D negativo

11. Un ricevente di sangue con la variante DVI: a. Non dovrebbe ricevere sangue da donatori D+ poiché potrebbe produrre anticorpi anti-D

b. Può ricevere sangue solo da soggetti D+ poiché altrimenti si immunizzerà contro gli antigeni d, c ed e c. Può ricevere sangue solo da donatori DVI 12. La compatibilità trasfusionale nell’ambito del sistema Rh: a. Prevede che nel modo più categorico NON si possa trasfondere globuli rossi di donatori D+ a pazienti Db. Va sempre garantita la trasfusione di sangue D- a donne D- in età fertile e ovviamente a tutti i soggetti con anticorpi anti-D c. Poiché non esistono anticorpi D ‘naturali’ si può tranquillamente trasfondere sangue D+ a tutti i soggetti D-

Risposte • a • b

• a • c • b • c

• b • b • a

• b • a • b

• La membrana dei globuli rossi (come altre membrane cellulari) è un insieme di molecole lipidiche e proteiche.

• I lipidi costituiscono circa il 50% della massa della membrana e sono suddivisi in fosfolipidi (60%), colesterolo (30%) e glicolipidi (10%).

• Le proteine presentano un differente livello di espressione. Infatti, a fianco di proteine espresse con 200.000 copie/GR vi sono altre espresse in misura molto inferiore (50.000 copie/GR).

• Le funzioni delle proteine presenti sulla membrana dei GR: recettori per le chemokine, molecole di adesione, proteine di trasporto, enzimi, controllo del complemento.

Membrana eritrocitaria

• Gli antigeni eritrocitari sono caratteristiche strutturali ereditate e polimorfiche, localizzate su proteine, glicoproteine e glicolipidi che si affacciano all’esterno della membrana dei globuli rossi.

• Per definizione gli antigeni sono immunogenici e possono portare alla produzione di allo-anticorpi specifici se introdotti nella circolazione di soggetti le cui cellule non presentano quel particolare antigene.

• Hanno importanza non solo nella trasfusione ma anche nell’ambito della compatibilità materno-fetale in quanto l’alloimmunizzazione verso antigeni presentati dalle cellule fetali può risultare nella malattia emolitica del neonato.

Antigeni eritrocitari

esterno

interno

• Quando una serie di antigeni presenti sulla superficie dei GR si eredita indipendentemente da un’altra serie, gli antigeni appartengono a diversi sistemi di gruppo sanguigno. • Ad oggi sono noti 29 sistemi di gruppo sanguigno codificati da 39 geni che presentano 1000 alleli • N. antigeni: 400

DISTRIBUZIONE DEGLI ANTIGENI (Ag) • Gli Ag che sono rappresentati nella quasi totalità degli individui sono indicati come ag ad alta frequenza

• Gli Ag presenti solo in poche persone sono definiti con il termine di Ag a bassa frequenza • L’incidenza di questi ag ad alta o a bassa frequenza può anche essere diversa dei differenti gruppi etnici • Gli Ag che descriveremo sono sono stati identificati, per la prima volta, dall’individuazione in un siero, del loro anticorpo specifico

A PROPOSITO DELLA DISTRIBUZIONE DISTRIBUZIONE DEGLI Ag IN DIVERSI GRUPPI ETNICI

• La glicoproteina Duffy è nota per essere un recettore per il parassita Plasmodium vivax, un agente patogeno della malaria

• Nell’Africa Occidentale dove la malaria è endemica, il fenotipo eritrocitario Fy(a-b-), che è estremamente raro tra i bianchi, presenta una frequenza > 80%

Antigeni eritrocitari

Carboidrati • AB0 •P • Le •H •I

Proteine • MNS • Rh • Lu •K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co • LW

• Kx • Ge • Cr • Kn • In • Ok • Raph • JMH • GIL

Principali antigeni eritrocitari rilevanti ai fini trasfusionali

Carboidrati • AB0 •P • Le •H •I

Proteine • MNS • Rh • Lu •K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co • LW

• Kx • Ge • Cr • Kn • In • Ok • Raph • JMH • GIL

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA MNSs ed U • Sistema complesso, costituito da oltre 40 Ag • Ag presenti su 2 molecole glicoproteiche • M, N, S, s, U sono gli Ag principali

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA MNSs ed U • I GR privi di S e s possono essere negativi per l’Ag ad alta frequenza U; i soggetti privi di U possono produrre l’anticorpo anti-U, quando esposti a emazie U+

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA Kell • Gli Ag del sistema Kell sono espressi con bassa densità sulla membrana eritrocitaria • Vengono indeboliti o completamente distrutti dal trattamento delle emazie con agenti riducenti o con acidi • Sono portati da una proteina e sono codificati da un singolo gene

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA Kell • Identificato il primo anti-K nel 1946, causa di una MEFN • L’allele responsabile di K è presente nel 9% dei soggetti caucasici e 2% dei soggetti di origine africana • Kpa espresso in modo predominante nei bianchi, Jsa nei neri

NULL Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA Duffy • Gli Ag Duffy sono codificati da un paio di alleli codominanti nel lcus Fy situato sul cromosoma 1 • Ci sono 4 fenotipi (di cui 1 assente nei caucasici) • La glicoproteina espressa dal gene Duffy è espressa anche in altri tessuti: cervello, rene, milza, cuore e polmone

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Antigeni eritrocitari

esterno

interno

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA Kidd • Gli Ag Jka e Jkb sono localizzati sulla proteina di trasporto dell’urea, codificata dal gene HUT1 (cromosoma 18) • il fenotipo Jk(a-b-) è estremamente raro

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

Antigeni eritrocitari

esterno

interno

• La rilevanza clinica di un sistema di gruppo sanguigno dipende: dalla frequenza con cui si osservano alloanticorpi dalla caratteristica degli alloanticorpi (classe Ig, se IgG sottoclasse, range termico, capacità di fissare il complemento, titolo)

determinano la capacità dell’anticorpo di distruggere i globuli rossi e di passare la placenta e causare MEN

Alloimmunizzazione eritrocitaria

antigeni

anticorpi

Risposta alloimmune innata

Risposta Alloimmune •alloimmunizzazione eritrocitaria • rigetto acuto trapianti di organi solidi • eventi sensibilizzanti: gravidanze, trasfusioni, trapianti

Risposta alloimmune umorale

Risposta alloimmune cellulare

Epitopi differenti

• Cellula effetrice: linfocita T citotossico • responsabile per rigetto acuto trapianti solidi, GVHD, GVL

Antigeni eritrocitari

Carboidrati • AB0 •P • Le •H •I

Proteine • MNS • Rh • Lu •K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co • LW

• Kx • Ge • Cr • Kn • In • Ok • Raph • JMH • GIL

Alloanticorpi eritrocitari

Naturali • prevalentemente IgM, ma possono essere in parte IgG (IgG2 e IgG4) • raramente solo IgG Definizione: anticorpi che si riscontrano in soggetti che non sono mai stati trasfusi, che non hanno avuto gravidanze o ai quali non siano mai stati iniettati GR con il relativo Ag. CROSSREATTIVITA’ (Ag batterici)

Immuni • prevalentemente IgG (IgG1 e IgG3) • possono essere IgM • a volte una miscela di IgG e IgM

Formazione alloanticorpi eritrocitari

Indipendente da linfociti T

Dipendente da linfociti T

• stimolazione dei linfociti B direttamente, senza l’aiuto di linfociti T

• antigeni proteici

• IgM anti-A o anti-B • solo IgM in quanto l’assenza dei linfociti T non consente lo switching isotipico

• anti-D è il principale esempio • RhD: è l’antigene più immunogeno (dopo AB0)

Antigeni del Sistema di Gruppo Sanguigno Rh Numero antigeni del sistema Rh

49. I più significativi: D,C,E,c,e

Molecole presentanti gli antigeni

Proteine RhD e RhCE attraversano la membrana cellulare a più riprese (transmembrane, multipass).

Funzione non nota (forse trasporto CO2 o NH4)

Base molecolare

2 geni: RHD e RHCE. Delezione del gene RHD è responsabile del fenotipo Rh negativo (d).

Frequenza degli antigeni Rh nei caucasici

D 85%, C68%, E 29%, c 80%, e 98%

Aplotipo Rh più frequente nei caucasici

DCe (42%)

Anticorpi prodotti contro gli antigeni del Sistema Rh Tipologia

Prevalentemente di tipo IgG (misura molto minore anche IgM)

Reattività

Provocano emolisi. Raramente attivano il complemento. Si legano ai GR ‘marcandoli’ per essere distrutti nella milza (emolisi extravascolare)

Reazioni trasfusionali

SI. Tipicamente reazioni ritardate, severe, extravascolari.

MEN

SI. Sono gli anticorpi più comunemente implicati.

Anti-D circa il 50% MEN Anti-D e anti-c forme severe Anti-C, E, e forme moderate o lievi

Meccanismo DIRETTO di riconoscimento

• Una percentuale di globuli rossi trasfusi non sarà vitale (in funzione dell’età dell’unità) • Queste cellule vecchie si frammentano mentre passano attraverso la milza, e molte proteine solubili di origine del donatore, vengono riversate nel sangue • I B-linfociti sorvegliano costantemente il sangue alla ricerca di proteine non-self, e quando incontrano proteine specifiche per il loro sito, si legano a loro.

• Il legame antigeneimmunoglobulina manda un segnale alla cellula per internalizzare il recettore Ig, mediante un processo chiamato endocitosi • Una volta all’interno del linfocita B, l’antigene viene degradato in piccoli peptidi, alcuni dei quali si legano alle molecole MHC di Classe II.

• Le molecole MHC II con il loro peptide specifico vengono quindi portate in superficie dove incontreranno il T-cell receptor specifico dei Linfociti CD4 Helper

• L’interazione MHC-peptide-co-receptor stimola la produzione di Il-1, Il-2, Il-4, che danno il segnale ai linfociti B di proliferare e differenziarsi in plasmacellule e produrre anticorpi specifici per l’antigene presentato ai CD4.

• La classe anticorpale prodotta inizialmente è IgM, ma eventualmente si verifica uno switching ed inizia ad essere prodotto Ab di classe IgG.

• Nei laboratori di immunoematologia, l’anticorpo viene evidenziato mediante lo screening anticorpale oppure tramite il crossmatch indicando che l’alloimmunizzazione post-trasfusionale è avvenuta.

Meccanismo INDIRETTO di riconoscimento • Il secondo meccanismo di alloimmunizzazione prevede che le vecchie cellule trasfuse siano fagocitate da macrofagi della milza o fegato.

• Una volta fagocitate, le proteine (alcune delle quali rappresentano gruppi sanguigni) vengono ‘digerite’ in molti diversi piccoli peptidi.

• I peptidi vengono trasportati sulla superficie delle cellule (APC) nell’ambito delle proteine MHC di classe II, pronti a essere presentati ai linfociti T helper (CD4)

• Il TCR in combinazione con le proteine CD4, riconosce le proteine ‘estranee’ e manda segnali all’interno della cellula affinché si producano e si secernano Il-2 e Il-4.

• queste citochine inviano segnali ai B-linfociti nelle vicinanze che abbiano riconosciuto lo stesso antigene, di proliferare e produrre anticorpi della medesima specificitĂ

Meccanismo DIRETTO vs. INDIRETTO • Il meccanismo DIRETTO entra in gioco principalmente quando il carico antigenico non è eccessivo, come ad esempio nell’alloimmunizzazione materno-fetale • Il meccanismo INDIRETTO invece, è implicato ad esempio in corso di trasfusione, quando lo stimolo antigenico è più rilevante

Alloimmunizzazione eritrocitaria: la dimensione del problema • Una analisi su 159.262 pazienti ha dimostrato che complessivamente, solo il 2,9% dei pazienti trasfusi ha sviluppato anticorpi (G Hoeltge Arch Pathol Lab Med 1995) • Uno studio piÚ piccolo, su 2940 pazienti trasfusi, evidenzia una % di immunizzati pari a 2,6% (NM Heddle, BJH 1995)

ricerca anticorpi 2003-2007 TS POS; 1948 (1,8%)

TS senza risultato 979 (0,9%)

Ospedale San Gerardo, Monza TS NEG 105960 (97,3%)

IDENTIFICAZIONI 2003-2007 PAN Coombs; 15; 1%

IMPILAMENTO; 10; 1%

AUTO-PAN Coombs; 35; 2% anti-H; 4; 0%

AUTO-PAN TL; 9; 1%

anti-A1; 8; 1%

ASPECIFICO; 86; 6%

anti-M; 72; 5% anti-N; 4; 0%

anti-I; 35; 2% anti-S; 21; 1%

anti-Jk b; 5; 0%

anti-P1; 15; 1%

anti-Jk a; 41; 3% anti-Fy a; 18; 1% anti-Fy b; 1; 0%

anti-C; 60; 4% anti-c; 64; 4%

anti-Kp a; 27; 2% anti-KEL; 220; 15% anti-Lu b; 1; 0% anti-Lu a; 24; 2%

anti-e; 12; 1% anti-D; 334; 23%

anti-Lewis b; 19; 1% anti-Lewis a; 58; 4%

anti-E; 196; 14% anti-Cw; 34; 2%

04-12-08

Caso B.D., ematologia adulti: probabile reazione emolitica ritardata da anti-Jka 36949* 27890 Jka+

9,5

E 9 m o g 8,5 l o b 8 i n a 7,5

7

CD IgG+ TS=neg

28395

37048

73015 Jka+

CD IgG+ TS=neg

28891 Jka+

28891 Jka30

CD IgG+, C3d++ TS=pos, anti Jka

CD IgG+, C3d++ TS=neg

25

20

Paziente di 68 anni affetto da Linfoma di Hodgkin, stadio IV, infiltrato midollare.

Recidivato in aprile ’08 dopo 5 anni

B i l i r u b i n a

15

- TAC no lesioni focali 6,5

- Eco addome: fango e calcoli biliari

10

- Epatite cronica attiva HBV correlata 6

- Coombs diretto da IgG e C3d nel 2000; eluato panagglutinante 5

Anamnesi trasfusionale positiva Hb

5,5

Bil 5

0 20-nov

22-nov

24-nov

25-nov

26-nov

27-nov

28-nov

30-nov

01-dic

02-dic

03-dic

04-dic

* Unità di sangue trasfuse: in nero, tipizzazione Jka non nota, in rosso unità JKa positive e in verde, unità JKa negative

20 pazienti, 200 controlli

Responder vs. non-responder

Quali caratteristiche dei pazienti sono predittive dell’alloimmunizzazione eritrocitaria?

Conoscere le condizioni cliniche che predispongono all’alloimmunizzazione è importante per 2 motivi: - consente una migliore gestione trasfusionale del paziente (ad esempio somministrare trasfusioni più compatibili) - migliora la conoscenza sulla eziologia di questa reazione trasfusionale

Disegno dello studio: la scelta dei pazienti e dei controlli

Alloimmunizzazione: riscontro di un NUOVO alloanticorpo contro Ag eritrocitari al di fuori del D e AB0. Solo le alloimmunizzazioni primarie sono prese in considerazione, e solo in seguito a trasfusioni. L’alloimmunizzazione è attribuita alla ultima trasfusione prima dell’evidenziazione del nuovo alloanticorpo.

Bauer et al. Transfusion 2007

Fattori predisponenti: sesso femminile, diabete mellito, neoplasia solida, precedente trapianto di CSE. • Le donne sono esposte ad alloantigeni durante la gravidanza ed il parto • Diabete: nessuna spiegazionje apparente • Neoplasia (nonostante chemioterapia): stato infiammatorio, attivazione del sistema immunitario (Hendrickson Transfusion 2006) • Trapianto CSE: stato infiammatorio Fattori protettivi: malattie linfoproliferative, aterosclerosi sintomatica • Malattie linfoproliferative: clone maligno può alterare la funzionalità dei T e B. Chemioterapia può provocare immunosoppressione • aterosclerosi: nessuna spiegazione

Bauer et al. Transfusion 2007

Il ruolo dell’infiammazione nell’alloimmunizzazione eritrocitaria The role of inflammation in alloimmunization to antigens on transfused blood cells J C Zimring, J E Hendrickson Curr. Opin Hematol 2008

• Un vaccino proteico è solo debolmente immunogenico se somministrato senza un adiuvante infiammatorio • La patologia di base del ricevente una trasfusione potrebbe influenzare la capacità di immunizzarsi • casi di pazienti affetti da artrite reumatoide che sviluppano multipli anticorpi dopo una singola trasfusione • pazienti affetti da drepanocitosi sviluppano anticorpi con maggiore frequenza rispetto ad altri pazienti: stato infiammatorio cronico?

• Uso di modelli animali: topi transgenici che esprimono antigeni eritrocitari umani • Induzione di uno stato infiammatorio (con un RNA a doppia elica) • Aumentata produzione di alloanticorpi correlata allo stato infiammatorio

• 98 pazienti D- hanno ricevuto in totale 445 unità D+ • 24 riceventi hanno formato 44 nuovi anticorpi di cui 22 (22%) anti-D • dati di precedenti lavori riferivano una percentuale molto più elevata (80%)

Transfusion 2003

• 8 pazienti affetti da AIDS RhD- hanno ricevuto unità di GRC D+, media per paziente 6,25 • Nessuno ha sviluppato anti-D • Nello stesso periodo dello studio, 6 pazienti D- affetti da altre patologie e trasfusi con GRC D+ hanno tutti sviluppato anti-D • Possibile spiegazione: riduzione dei linfociti T CD4+ tipica della patologia

• L’immunogenicità dei diversi antigeni dei gruppi sanguigni può essere stimata in base alla frequenza dei relativi anticorpi (Giblett 1961) • Obiettivo dello studio: identificare i fattori che incidono sulla frequenza e specificità dell’alloimmunizzazione • Disegno dello studio: retrospettivo, 19 ospedali, 5 anni • Sono stati considerati anticorpi contro: Rh, Kell, Duffy, Kidd, MSs • Esclusi: anti-D, anticorpi contro Ag a bassa o alta frequenza • Solo pazienti con storia trasfusionale nota sono stati considerati • Dati raccolti: età, sesso, storia trasfusionale, intervallo tra trasfusione e screening Ab

Potenza relativa degli antigeni, confrontati all’antigene K, è stata determinata con l’equazione di Giblett: N. Ab di interesse N. di Ab anti-K

X

Probabilità di esposizione all’Ag K Probabilità di esposizione all’Ag d’interesse

• 1778 pazienti, 2177 anticorpi

• 284 pazienti con specificità multiple (2-5) • Rapporto femmine: maschi=2.2 • Età media 64 anni

• Totale 12.379 trasfusioni, mediana 4 unità

• anti-C più frequente negli anziani, anti-M e anti-S più frequente nei giovani • anti-Jka predominano nei pazienti di sesso maschile e dopo poche sacche • anti-K più frequente nei politrasfusi

Anti-Jkb

Anti-Jka

Anti-Fya

Anti-c Anti-K Anti-E

• anti-E più frequente fino a 5 anni dall’evento sensibilizzante • anti-Jka e anti-Jkb riscontrati nei primi 3 mesi, poi si riducono

Intervallo dalla trasfusione • 0.3-0.4

% dei pazienti ha sviluppato anticorpi ENTRO 3 giorni dalla trasfusione • Implicazioni per la regola dei 3 giorni di validità della richiesta trasfusionale

• Potenza immunogena degli Ag relativa al K: anti-K 1.3 volte piÚ immonogeno del E, 3.5 volte Jka, 4.9 volte c, 11.6 volte il Fya • anti-Jka e anti-Jkb riscontrati nei primi 3 mesi, poi si riducono

Considerazioni conclusive • E’ importante conoscere i fondamenti immunobiologici dell’alloimmunizzazione anche per la pratica quotidiana • I grandi studi sull’alloimmunizzazione eritrocitaria ci danno indicazioni cliniche che potrebbero essere importanti per prevedere quali pazienti sono più a rischio di alloimmunizzazione

• L’alloimmunizzazione eritrocitaria è una complicanza trasfusionale sottovalutata e sottoriconosciuta

SHOT Cumulative data 1996 – 2007 (4335 cases)

Hemovigilance data from Friuli Venezia Giulia 2007-2009 Transfusion reactions

2007-2009

FNHTR

195

Allergy (urticaria)

140

TACO

20

Significant hypotension

14

Severe bronchial spasm

4

DHTR

6

Anaphylactic shock

6

TA-GVHD

1

Transfusion errors (acute hemolysis)

7 (2)

TRALI

2

Other

77

Total

472

Total N. transfused units

219,129

Frequency of transfusion reactions/transfused unit

0.22%