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BIOCHIMICA CLINICA 1 I° ANNO

II° SEMESTRE

SCIENZE TECNICHE DI MEDICINA DI LABORATORIO NELL'ORGANIZZAZIONE DEL LABORATORIO ANALISI

IL LABORATORIO : Attività, Personale, Contesto Aziendale / Dipartimentale, Normativa vigente. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

Sistema sanitario (OMS 2000) Legislazione Nazionale Governance Dipartimento Regione Piemonte, riorganizzazione delle Aziende Sanitarie

DAL QUESITO CLINICO ALLA DIAGNOSI DI LABORATORIO

LABORATORIO ANALISI BIOCHIMICA CLINICA : Urgenze, Routine, Specialistica, Automazione, Test analitici x Area 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

VARIABILITÀ PRE / POST ANALITICA, METODI, VALORI NORMALI ed ERRORI 4.1 4.2 4.3 4.4

Variabilità Pre-analitica (legata al paziente) Variabilità Pre-analitica (legata al prelievo) Variabilità Analitica Variabilità Post-analitica

TIPOLOGIA DI PROVETTE e ANTICOAGULANTI (sangue intero, plasma, siero, diluizioni) 5.1 5.2 5.3 5.4

Progetto Laboratorio Logico Unico Esami Urgenti AREA PLASMA AREA SIERO SPECIALISTICA

Provette ed Anticoagulanti Provetta Errata Diluizioni manuali e automatizzate Concentrazioni

TECNICHE, METODOLOGIE, CALIBRAZIONI e CONTROLLI DI QUALITA' in Chimica Clinica 6.1 6.2 6.3

Tecniche Spettroscopiche La curva di taratura Controlli di Qualità (cenni di Accreditamento e Certificazione)

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6.4

Tecniche ottiche 6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.4.4

6.5

Tecniche immuno-analitiche 6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.5.4

6.6

Elettroforesi su acetato di cellulosa Elettroforesi Capillare (CE) IsoElettroFocusing (IFE)

Cromatografia 6.9.1 6.9.2 6.9.3 6.9.4 6.9.5 6.9.6

6.10 6.11 6.12 6.13

ICMA (chemiluminescent microparticle immunoassay) ECLIA (elettro chemi luminescenza)

Tecniche Elettroforetiche 6.8.1 6.8.2 6.8.3

6.9

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) FEIA (fluorescence enzyme immunoassay) ACMIA (antibody conjugated magnetic immunoassay) EMIT (enzyme multiplied immunoassy technique)

Tecniche Immuno-luminescenza (LIA) 6.7.1 6.7.2

6.8

RIA (Radio Immuno Assay) IRMA (Immuno-Radiometric-Assay) Western Blot IF (Immuno-fluorescenza)

Tecniche Immuno-enzimatiche (EIA) 6.6.1 6.6.2 6.6.3 6.6.4

6.7

FOTOMETRI E SPETTROFOTOMETRI FLUORIMETRIA TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA FOTOMETRIA D'EMISSIONE

Cromatografia a scambio ionico Cromatografia per gel filtrazione Cromatografia per affinità Cromatografia a fase inversa HPLC (High Performance Liquid Chromatography) UPLC LC-MS/MS (spettrometria tandem-massa ultra performante)

Emogasanalisi Coagulazione Esame Emocromocitometrico Esame Urine (chimico, fisico, sedimento)

INTERVALLI DI LETTURA, VALORI DI PANICO e VALIDAZIONE TECNICA / CLINICA DI UN RISULTATO STRUMENTALE

VALIDITA' DIAGNOSTICA DEI TEST DI LABORATORIO 8.1 8.2 8.3

Screening (es. Sangue Occulto feci) Validità del test Teorema di Bayes

RISORSE e COSTI DI LABORATORIO NELL'ATTUALE SCENARIO ECONOMICO

Dott. Martinelli Francesco fmartinelli@cittadellasalute.to.it 011 6336375

328 00 43 454

Laboratorio Biochimica Clinica “Baldi & Riberi” , settore Tossicologia P.O. Molinette, Azienda Ospedaliero-Universitaria Città della Salute e della Scienza di Torino Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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IL LABORATORIO : Attività, Personale, Contesto Aziendale / Dipartimentale, Normativa vigente.

Come si diventa Tecnico Sanitario di Laboratorio Biomedico : Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico, Classe delle lauree in professioni sanitarie tecniche (SNT/3). Decreto MURST 03 novembre 1999, n.509 (Ministero dell’Università e della ricerca scientifica e tecnologica): “Regolamento recante norme concernenti l’autonomia didattica degli atenei”. Ha imposto la graduale trasformazione dei Diplomi Universitari dell’area sanitaria in Lauree triennali di primo livello. Legge 10 agosto 2000, n. 251. Recante: “Disciplina delle Professioni Sanitarie Infermieristiche, tecniche della Riabilitazione, della Prevenzione nonché della professione Ostetrica”. Ha determinato nei sui primi 4 articoli, la struttura generale attualmente utilizzata per la classificazioni delle professioni sanitarie, individuando le professioni sanitarie infermieristiche e la professione sanitaria ostetrica (art.1), le professioni sanitarie riabilitative (art.2), le professioni tecnico-sanitarie a loro volta distinte in un’area tecnicodiagnostica e un’area tecnico-assistenziale (art.3) e, infine, le professioni tecniche della prevenzione (art.4); Decreto Ministeriale 29 marzo 2001, n. 118. “Definizione delle figure professionali di cui all’art. 6, comma 3, del decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 502, e successive modificazioni, da includere nelle fattispecie previste dagli articoli1, 2, 3 e 4 della legge 10 agosto 2000, n. 251". Successivamente con Decreto 2 aprile 2001 del Ministro dell’Università e della Ricerca scientifica e tecnologica, il primo dei quali adottato di concerto con il Ministro della Sanità, sono stati definite le classi dei corsi di laurea e di laurea specialistica (ora “magistrale”) per le professioni sanitarie. Si tratta in particolare di quattro classi delle lauree ed altrettante classi delle lauree specialistiche: 1 professioni sanitarie infermieristiche e professione sanitaria ostetrica; 2 professioni sanitarie della riabilitazione; 3 professioni sanitarie tecniche; 4 professioni sanitarie della prevenzione. " Nell'ambito della professione sanitaria del tecnico di laboratorio biomedico, i laureati sono operatori sanitari cui competono le attribuzioni previste dal D.M Ministero della sanità 26 settembre 1994, n. 745 e successive modificazioni ed integrazioni; ovvero sono responsabili degli atti di loro competenza, svolgono attività di laboratorio di analisi e di ricerca relative ad analisi biomediche e biotecnologiche ed in particolare di biochimica, di microbiologia e virologia, di farmacotossicologia, di immunologia, di patologia clinica, di ematologia, di citologia e di istopatologia. I laureati in tecniche diagnostiche di laboratorio biomedico svolgono con autonomia tecnico professionale le loro prestazioni lavorative in diretta collaborazione con il personale laureato di laboratorio preposto alle diverse responsabilità operative di appartenenza; sono responsabili, nelle strutture di laboratorio, del corretto adempimento delle procedure analitiche e del loro operato, nell'ambito delle loro funzioni in applicazione dei protocolli di lavoro definiti dai dirigenti responsabili; verificano la corrispondenza delle prestazioni erogate agli indicatori e standard predefiniti dal responsabile della struttura; controllano e verificano il corretto funzionamento delle apparecchiature utilizzate, provvedono alla manutenzione ordinaria ed alla eventuale eliminazione di piccoli inconvenienti; partecipano alla programmazione e organizzazione del lavoro nell'ambito della struttura in cui operano; svolgono la loro attività in strutture di laboratorio pubbliche e private, autorizzate secondo la normativa vigente, in rapporto di dipendenza o libero-professionale; contribuiscono alla formazione del personale di supporto e concorrono direttamente all'aggiornamento relativo al loro profilo professionale e alla ricerca." Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Pubblico

Privato

Ricerca

Industrie Diagnostica / Farmaceutica Istituto Zooprofilattico Farmacia Ospedaliera Citologia Anatomia Patologica Microbiologia Virologia Genetica Immunologia dei Trapianti Medicina del Lavoro Servizio di Prevenzione e Protezione Aziendale Tossicologia Centro Antidoping

Biochimica Clinica : Area-plasma (Ematologia, Coagulazione), Urine, Feci Area-siero (Biochimica, Immunometria, Proteine, Farmaci ) Specialistica (RIA, Allergologia, Autoimmunità, Hplc, Assorbimento-Atomico, LC-ms/ms, Biologia molecolare) Chi ? :

Medici

Quando ? :

Biologi sempre !

CTF

Chimici

24/24h

CT-TSLB (coordinatore)

7/7gg

TSLB

Oss

365gg/aa

“Non temerai i terrori della notte, nè la freccia che vola di giorno, la peste che vaga nelle tenebre, lo sterminio che devasta a mezzogiorno. Mille cadranno al tuo fianco, diecimila alla tua destra; ma nulla ti potrà colpire”. (H.B. Salmi, 90) Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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1.1

Sistema sanitario (OMS 2000).

L’insieme delle organizzazioni, delle istituzioni, delle risorse che sono dedicate alla produzione di azioni sanitarie. Azione sanitaria: ogni attività, sia nell’assistenza alle persone, sia di sanità pubblica, o attraverso iniziative intersettoriali, il cui scopo primario è quello di migliorare la salute Finanziamento PRIVATO : non prevede obbligo di tasse  Volontario caritativo (CRI)  Out of pocket (pagamento diretto a prestazione)  Assicurativo (contributi volontari/ premi annuali da parte del cittadino verso una assicurazione. USA o BRA) PUBBLICO :  Mutualistico: contributi sanitari pagati in % rispetto al reddito dei lavoratori. (SPA, GER, FRA)  Pubblico (ITA, UK) : fiscalità generale tramite imposte (generali allo stato- IRPEF) o Tasse (tributo specifico per sanità- bollo auto). Il Ticket è diverso perchè sono versamenti diretti del cittadino all' ASL / ASO (contributi-deterrente)

1.2

Legislazione Nazionale

La Costituzione (art. 32) attribuisce alla Repubblica il compito di tutelare la salute "come fondamentale DIRITTO dell'individuo e interesse della collettività" con prestazioni sanitarie gratuite o a bassi costi. L´assunzione e la gestione del Servizio pubblico sanitario rappresentano adempimento di un dovere costituzionale cui il legislatore ha provveduto, in modo organico e compiuto, a partire dalla Legge n. 833/78 che ha istituito il Servizio Sanitario Nazionale: pubblico, universalistico, solidaristico, finanziato attraverso la fiscalità generale (Sistema Welfariano = decisioni e azioni per raggiungere finalità in tempi futuri). Il Governo, su proposta del Ministro della Salute, programma il Piano Sanitario che in Parlamento viene approvato senza legge. Il Decreto Legislativo 502/92, nel confermare la tutela del diritto alla salute delineato dalla 833/78, disegna un modello organizzativo di aziende sanitarie "dinamico" attraverso la flessibilità funzionale e la impostazione per obiettivi, di rispondere pienamente, in termini quantitativi e qualitativi, alla domanda sanitaria. Le principali innovazioni riguardano la deparlamentarizzazione ovvero la regionalizzazione del Servizio Sanitario Nazionale (che viene ad essere costituito dai Servizi Sanitari Regionali), l’attribuzione alle Aziende sanitarie della personalità giuridica pubblica, il finanziamento per quota capitaria, l’accreditamento e il finanziamento a tariffa delle strutture. Il Decreto Legislativo n. 229/99 (Bindi) "Norme per la razionalizzazione del Servizio Sanitario Nazionale” ha portato a compimento il processo di regionalizzazione del sistema e aziendalizzazione delle strutture. Le norme sanitarie vengono varate con LeggiFinanziarie. Il Governo deve consultare prima le Commissioni + Sindacati. Focalizzata l´attenzione sulla qualità, appropriatezza ed efficacia delle prestazioni. Con il Decreto Legislativo n. 56/2000 si afferma l’evoluzione in senso federalista del sistema di tutela della salute, recante il nuovo sistema di finanziamento regionale dei servizi, e con la riforma generale apportata con la revisione del Titolo V, parte II, della Costituzione, attuata con la Legge n. 3/2001, che contiene i presupposti per la futura Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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approvazione di nuove e distinte discipline regionali della sanità pubblica. Sempre del 2001 è la Legge n. 405/2001 la quale, con il titolo "Interventi urgenti in materia di spesa sanitaria", detta importanti disposizioni riguardanti non solo il regime di finanziamento dei servizi, ma anche i presupposti per una diversa regolamentazione nelle Regioni degli ospedali pubblici, delle forme di collaborazione tra pubblico e privato e dell’organizzazione dell’assistenza farmaceutica. Con il decreto del presidente del Consiglio dei ministri del 29 novembre 2001 sono stati definiti i servizi che rientrano tra i Livelli Essenziali di Assistenza ( LEA ), vale a dire quei servizi che devono essere garantiti a tutti, a carico del Servizio sanitario nazionale. Dunque dal 2001.... FAMIGLIE : Ticket, Irpef, accise-benzina, IVA + IMPRESE : Irap ==> soldi vanno alla REGIONE che riconosce QUOTA CAPITARIA x ASL (responsabilità territorio) e TARIFFE x ASO (ospedale) ASL e ASO sono Aziende e non Imprese IMPRESE : input, materie prime, costi di produzione ==> output, prodotti da vendere, ricavi. Il profitto = differenza fra costi e ricavi. Dove posso agire? : - costi = + efficienza del personale, riduzione del personale + ricavi = + efficacia del prodotto venduto, posso aumentare i prezzi AZIENDE : input, personale, strumenti ==> output = soddisfare i bisogni di salute delle persone attraverso prestazioni sanitarie, non posso decidere il prezzo perchè devo sottostare alle tariffe imposte dalla Regione, manca la concorrenza, manca il timore del fallimento, difficile contenere sprechi e costi. Il Decreto Legislativo n.150/2009 (Brunetta) traduce in norme giuridiche vincolanti i principi contenuti nella legge delega 4 marzo 2009 n. 15, che ha impostato una profonda revisione di tutti gli aspetti della disciplina del lavoro presso la pubblica amministrazione. Riassumendo, il Decreto prevede una serie di adempimenti per le pubbliche amministrazioni, che possiamo suddividere in 3 categorie principali: 1. Valutazione della performance: Le amministrazioni dovranno adottare un "Sistema di misurazione e valutazione della performance" in base alle linee guide definite dalla Commissione. Le amministrazioni, in coerenza con il "Sistema di misurazione e valutazione della performance" dovranno adottare un "Piano triennale della performance" nel quale saranno indicati gli obiettivi, le risorse correlate, nonché gli indicatori di rendimento, secondo metodologie predisposte dalla Commissione per la valutazione, la trasparenza e l’integrità delle amministrazioni pubbliche (CIVIT). Le amministrazioni dovranno dotarsi di un Organismo indipendente di valutazione, che certifica il sistema di misurazione e di valutazione e funge da garante sulla corretta applicazione del sistema. Ogni anno le amministrazioni dovranno redigere e pubblicare on-line la loro "Relazione sulla performance". Alla fine di ogni esercizio di valutazione, le amministrazioni sono responsabili dell’assegnazione del bonus delle eccellenze nonché del premio annuale per l’innovazione, due nuovi strumenti previsti dal decreto per diversificare il riconoscimento del merito 2. Obblighi di trasparenza: Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Le amministrazioni adottano un "Programma triennale" specifico per promuovere la trasparenza e l'integrità. Il Piano contiene le azioni che l’amministrazione intende svolgere per assicurare un livello adeguato di trasparenza. Le amministrazioni pubblicano sul proprio sito internet, in una apposita sezione, il "Programma triennale per la trasparenza e l’integrità". Le amministrazioni presentano il proprio Piano e la propria Relazione sulla performance nell’ambito di apposite giornate della trasparenza, al fine di confrontarsi con i cittadini e gli stakeholders. Le amministrazioni pubblicano sul proprio sito internet il monitoraggio dei costi dei servizi erogati agli utenti finali e intermedi, al fine di contenerne la spesa promuovendo soluzioni innovative. 3. Contrattazione collettiva: I contratti integrativi si devono adeguare al decreto legislativo 150/2009 entro il 31 dicembre 2010. Dal 1°Gennaio 2011 i contratti non adeguati non saranno più validi.

1.3

Governance

Per governance nella sanità s’intende la modalità con cui sono gestite le aziende sanitarie sia sotto il profilo economico sia sotto il profilo clinico. La governance spetta a chi prende le decisioni ad ogni livello aziendale: direttore generale, direttore di presidio, dirigenti di struttura complessa e semplice, ai coordinatori infermieristici. Con il termine di clinical governance s’identifica l’Evidence Based Medicine, l’appropriatezza, la qualità delle cure, la professionalità dei medici. Con il termine corporate governance s’identifica in quale misura la spesa sanitaria sia sufficiente a garantire i livelli essenziali di assistenza e soprattutto per gestire in modo appropriato ed efficiente le risorse economiche disponibili (a livello nazionale, regionale, nell’ambito delle aziende sanitarie locali e ospedaliere).

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1.4

Dipartimento

Il Dipartimento è costituito da Unità Operative omogenee, affini o complementari, che perseguono comuni finalità e sono quindi interdipendenti, pur mantenendo la propria autonomia e responsabilità professionale. Le Unità Operative costituenti il Dipartimento sono aggregate in una specifica tipologia organizzativa e gestionale, volta a dare risposte unitarie, tempestive, razionali e complete rispetto ai compiti assegnati, a tal fine adottano regole condivise di comportamento assistenziale, didattico, di ricerca, etico, medico-legale ed economico.

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1.5

Regione Piemonte, riorganizzazione delle Aziende Sanitarie

REGIONE PIEMONTE BU6 11/02/2016 Deliberazione della Giunta Regionale 29 dicembre 2015, n. 42-2743 Riorganizzazione della Rete regionale di Terapia del Dolore, a parziale modifica della D.G.R. n. 29-4854 del 31.10.2012 di recepimento ed iniziale attuazione dell'Intesa del 25.07.2012, di cui all'art. 5 della Legge 15 marzo 2010, n. 38. Tre centri hub e sedici centri spoke sul territorio regionale. Appropriatezza ed integrazione con le cure primarie. Una riorganizzazione della rete regionale di terapia del dolore all’insegna dell’appropriatezza delle cure e della competenza clinica: lo ha deciso la Giunta regionale, su proposta dell’assessore alla Sanità. La rete regionale di terapia del dolore si basa sul modello organizzativo delle reti cliniche integrate e prevede il raggruppamento della casistica più complessa in un numero ristretto di centri ospedalieri di eccellenza (centri hub), preposti ad erogare gli interventi diagnostici e terapeutici ad alta complessità, supportati dalla rete dei centri diffusi sul territorio ed integrati con le cure primarie (centri spoke). “Lo sviluppo dei centri hub e dei centri spoke di terapia del dolore necessita ora di un ulteriore rafforzamento e strutturazione all’interno delle logiche di rete e di sistema della Regione Piemonte” afferma l’assessore. Il provvedimento consente anche la razionalizzazione della spesa, come previsto dalla normativa nazionale ed in coerenza con i provvedimenti adottati dalla Regione per rispettare il “piano di rientro”. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Il nuovo assetto prevede 3 hub sul territorio, identificati nelle Aziende Ospedaliere, sedi di DEA di II° livello:  Azienda Ospedaliera Universitaria Città della Salute e della Scienza di Torino  Azienda Ospedaliera Universitaria Maggiore della Carità di Novara  Azienda Ospedaliera SS.Antonio e Biagio e C. Arrigo di Alessandria All’Istituto di ricerca e cura a carattere scientifico (IRCSS) di Candiolo viene riconosciuto il ruolo di centro monospecialistico per la terapia del dolore oncologico. La delibera di Giunta elimina la distinzione tra centri spoke di primo e di secondo livello, equiparando le attività di tutte le strutture ospedaliere non sede di hub ed individuando i seguenti centri spoke sul territorio regionale: Area territoriale Torino Sud Est: - Asl TO5 Area territoriale Torino Nord: - Asl TO2 - Asl TO4 Area territoriale Torino Ovest: - Asl TO1 - Asl TO3 - AOU S.Luigi Gonzaga di Orbassano - AO Ordine Mauriziano Area territoriale Piemonte Nord Est: - Asl VC - Asl BI - Asl NO - Asl VCO Area territoriale Piemonte Sud Ovest: - Asl CN1 - Asl CN2 - AO Santa Croce e Carle di Cuneo Area territoriale Piemonte Sud Est: - Asl AL - Asl AT Il provvedimento prevede che i centri hub operino in sinergia con tutti i centri spoke del territorio, concordando procedure e linee guida omogenee per la selezione delle casistiche di pazienti colpiti da tutte le tipologie di dolore, a partire dalle malattie più frequenti. http://www.regione.piemonte.it/governo/bollettino/abbonati/2015/50/attach/dgr_02484_830 _23112015.pdf

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REGIONE PIEMONTE BU50 17/12/2015 Deliberazione della Giunta Regionale 23 novembre 2015, n. 50-2484 Riorganizzazione e razionalizzazione della rete dei Laboratori di Analisi. Prime indicazioni alle Aziende Sanitarie Regionali per il consolidamento delle analisi ad elevata automazione pag.5 : “...Le analisi in automazione da accorpare fanno parte delle seguenti tipologie: • ematologia • coagulazione • chimica clinica • proteine specifiche e elettroforesi • immunometria • sierologia • tossicologia di base Le analisi in automazione prevedono per ciascuna area sovrazonale l’individuazione di :  un Laboratorio hub con Urgenze e Specialistica (es: Baldi & Riberi) di grande automazione.  alcuni Laboratori spoke di sole Urgenze nelle sedi di presidi ospedalieri dotati di reparti di acuzie medico-chirurgici e di punti analisi per gli Ospedali di base e per quelli di area disagiata. L’organizzazione deve prevedere l’integrazione del sistema informativo, organizzazione dei trasporti, strumentazione uguale o simile nelle diverse sedi...”

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DAL QUESITO CLINICO ALLA DIAGNOSI DI LABORATORIO

La Diagnostica di Laboratorio è la prima a rispondere ad un bisogno di salute, ad un quesito clinico, ad un dubbio. Arriva prima della Diagnostica per Immagini (radiologia). Mette “a nudo” e converte in numeri la fisiologia o la patologia di una persona.

1) Medico & Paziente : quesito clinico



FASE PRE-ANALITICA

2) richiesta esami di laboratorio 3) prenotazione sistema informatico (territorio / ospedale) 4) prelievo non traumatico (nurse) 5) etichettatura idonea (nurse / oss) 6) trasporto in laboratorio (interno hosp / esterno CP, amb)

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

FASE ANALITICA

7) indossare Dispositivi Protezione Individuale 8) smistamento (automatizzato) 9) check in (numerazione) 10) calibrazioni strumentali 11) controlli di qualità interni 12) analisi campioni biologici di pazienti 13) valutazione risultati (manuale / sistema esperto-InfoTech) 14) diluizioni e/o ripetizioni re-run (manuali / auto)

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FASE POST-ANALITICA

15) validazione risultati (tecnica / clinica) 16) stoccaggio campioni (refrigerato/congelato) 17) referto al paziente (firma digitale dirigenti) / medico (web-pdf) 18) manutenzioni strumentali programmate 19) carico reagenti (magazzino) 20) spegnimento (non x tutti ! )

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LABORATORIO ANALISI BIOCHIMICA CLINICA: Urgenze, Routine, Specialistica, Automazione, Test analitici x Area

3.1

Progetto Laboratorio Logico Unico

Biochimica Clinica : costi, personale, ammortamenti, forniture reagenti e strumenti, trasporto provette, informatica comune, spazi necessari. Attualmente numero esami x anno = 7 000 000 circa Esempio : Laboratorio analisi Molinette (B&R) Laboratorio analisi OIRM – Sant'Anna Laboratorio analisi CTO Laboratorio analisi Chieri Laboratorio analisi Moncalieri Laboratorio analisi Carmagnola III piano

Allergologia, Autoimmunità, RIA, Biologia-molecolare

Hplc, LC-ms/ms, Assorbimento-Atomico

II piano

Area plasma (Coagulazione + Ematologia), Urine, Feci

Area siero (Immunometria + Biochimica+ Proteine)

I piano

Centro Prelievi + Segreteria

Smistamento Ospedali Esterni Regione

3.2

Esami Urgenti

Urgenza assorbita all'interno dei vari settori di Routine che la gestiscono autonomamente con la stessa strumentazione usata per la routine ma nel rispetto dei TAT. Per TAT (Turn Around Time) si intende il tempo che intercorre tra il momento del prelievo e l'acquisizione del risultato da parte del richiedente. Laboratorio Urgenze integrato VANTAGGI : • Corsi di istruzione sul personale nuovo assunto possono essere tenuti al di fuori della gestione quotidiana dell’urgenza; • Facile attuazione delle procedure di back–up a seguito di guasti o malfunzionamenti; Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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• Più facile comparabilità dei risultati. • Procedure amministrative unificate per la fornitura dei prodotti • Gestione delle scorte più agevole all’interno del laboratorio • Previsioni di consumo e di spesa in sede di budget più facili • Riduzione della quota di sprechi nell’utilizzo di confezioni di grosso taglio SVANTAGGI : • Necessario open-space condizionato e isolato • Ambiente caotico • Necessario personale polivalente Laboratorio Urgenze separato VANTAGGI : • Concentrazione in un'unica area della strumentazione • Destinazione unica dei campioni urgenti e dei referti • Omogeneità ed affiatamento del personale • Ottimizzazione dei tempi di risposta (TAT) • Continuità operativa • Valutazione di costi delle analisi in urgenza SVANTAGGI : • Occupazione di spazio • Carenza di supporto dal laboratorio centrale e viceversa • Minor controllo dell’afflusso delle richieste ( doppioni ) • Frustrazione del personale (turnazione e sensazione di scollegamento) • Scoordinamento con l’attività del laboratorio centrale • Supplemento di attività amministrative Per Esame di Urgenza si deve intendere quell’analisi di laboratorio la cui richiesta, esecuzione e refertazione debbono essere attuate in un tempo tale da assicurare un’ottimale condotta diagnostica e terapeutica in situazioni cliniche gravi e talora di pericolo per la vita del paziente (esempio: t = 1 h). E’ indispensabile la presenza di adeguati Sistemi Informatici di Laboratorio e di Ospedale connessi tra di loro e di un metodo di identificazione dei campioni che ne permetta la tracciabilità durante l’iter preanalitico, analitico e postanalitico. Un sistema di trasporto dei campioni al laboratorio rapido, sicuro ed efficiente. Un sistema di accettazione, check-in, aliquotazione e smistamento campioni completamente automatico La strumentazione analitica deve essere di capacità adeguata alla realtà locale sia per cadenza analitica che per tipologia di analiti determinabili, idealmente composta da strumenti identici per tipo o di un adeguato sistema di “back-up”. La trasmissione informatica (non cartacea) dei risultati al Clinico/reparto richiedente Es. pannello Esami Urgenti (dipende dall'ospedale, in base a specialità del presidio) : Emo+Formula, PT, aPTT, Fibri, DD, AT3, Fatt-V, EGA, Glu, Crea, Urea, Na, K, AST, ALT, GGT, LDH, n.Dib, ALP, CK, P-amy, Bili, TP, Alb, Ca, PCR, TnT-hs, Pro-Bnp, PCT, IgA, Amm.A/V, Etanolo / Droghe, Antiepilettici, Immunosoppressori, TSH, B-hcg

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3.3

AREA PLASMA

SETTORE : EMATOLOGIA = provette 4 ml viola (anticoagulante EDTA K3) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

Globuli Rossi cellule

impedenza

Anemia, emorragia, tumori

Globuli Bianchi

cellule

citofluorimetria

Infezioni, leucemie, linfomi

Formula Leucocitaria

Cellule % Citofluorimetria +Microscopia

Infezioni, leucemie, linfomi

Piastrine

cellule

Impednz+fluor

Coagulazione sangue / salicilati

Emoglobina

proteina

colorimetrico

Anemia, tumori, emorragia

VES

mm/h

ottico

Infezioni, tumori

Reticolociti

cellule

citofluorimetria

Valutaz attivitĂ midollare

HbA1c

Hb glicata HPLC

Valutaz glicemia ultimi 3/4 mesi

SETTORE : COAGULAZIONE = provette 4 ml tappo azzurro (anticoagulante Na-Citrato) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

Tempo di protrombina

coagulativo nefelometria

TAO con Coumadin/Warfarin

aPTT

Tempo di coagulativo Tromboplasti nefelometria na Parz Attiv

Trombi, emboli, terapia Eparina

Tempo trombina

Identificare livello terapeutico Eparina

coagulativo nefelometria

Fibrinogeno proteina

coag-nefelom Omeostasi, formaz coagulo, > infiammaz

AT III

proteina

cromogenico carenza = resistenza al trattam con eparina assorbanza

didimero

immunologic TVP, embolia polm, CID, dissecaz aorta turbidimetrico

LAC

Ab-anti fosfolipidi

nefelometria

LupusES, trombosi

PCcoag

proteina

assorbanza

Vit.k dipendente, se < risk TVP (contracc orali)

Prot S

proteina

assorbanza

se < risk Tromb ven (contracc orali)

APC-r

resistenza

assorbanza

mutaz Leiden fatt V sindrome, predisp a TVP

Fattore V

peptide

nefelometria

Riduzione in TVP , CID

Fattore VIII peptide

nefelometria

Alto in trombo-embolie Riduzione in Emofilia, CID, Von Willebrand

Fattore X

nefelometria

Riduzione CID

peptide

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SETTORE : LIQUIDI BIOLOGICI = contenitori da 10 ml per urine Esame Urine : esame Fisico: aspetto, colore, densità; esame Chimico: pH, Glu, Alb, Hb, Corpi-chetonici, Bili, Urobilinogeno; esame Microscopico Sedimento: identificare e misurare il tipo di cellule (sfaldamento) e altre componenti patologiche (cristalli, batteri, leucociti, muco) che possono essere presenti nell'urina dopo apposita centrifugazione. Esame Feci : aspetto (colico, liquido); microscopia: fibre vegetali, fibre carnee, grassi, amidi, G.R., G.B., spore, miceti. Sangue Occulto x screening.

3.4

AREA SIERO

SETTORE : BIOCHIMICA = provette 7 ml gialle secche con separatore (no anticoagulante) o verdi (LiEparin) con separatore, provette 4 mL lilla scuro (EDTA), siringhe x EGA (LiEparin) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

numero

elettrochimico

Acidosi / alcalosi metabolica

PO2 A/V

ossigeno

elettrochimico

Valutaz funzionalità respiratoria / circolat

HCO3

bicarbonato

elettrochimico

Acidosi / alcalosi metabolica

P CO2 A/V

An.carbonica elettrochimico

Ca ++

elemento

Potenziometr dir Valutazione ossa/reni/paratiroidi

Meta Hb

proteina

spettrofotometria Fe+++, intossicaz chimiche / farmac, fumo

glucosio

monosac aldeidico

esochinasi

metabolismo zuccheri

urea

diammide ac.carb

ureasi UV

valutazione renale

creatinina

degradz crea Jaffè-fixedT

valutazione renale

Na / K

elementi

Potenziom indir

Bilancio idrico , Na/K basso = disidrataz

AST

Enzima tranferasi

IFCC

valutazione cuore/scheletro

ALT

Enzima tranferasi

IFCC

Valutazione epatica

Enzima f.chinasi

IFCC

valutazione muscolo cardiaca

P-AMY

enzima

ImmunoEPS

valutazione pancreas

proteine

biureto

>disturbi metabolici < danni renali

BILI tot

Catab Hb

JendrassikGrof

valutazione fegato

BILI ind

libera

calcolo

malattie emolitiche (itt. neonato)

BILI dir

coniug

JendrassikGrof

malattie epatobiliari (itt. epatico)

CHE / enzima n.dibucaina

butirriltiocolina

depress respiratoria nel corso di operazione chirurgica

GGT

szasz

valutazione fegato / alcolismo

enzima

Valutaz funzionalità respiratoria / circolat

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Pag. 19

ALP

enzima

IFCC

valutazione fegato / ossa

LDH

enzima

DGKCH

Danno cell / necrosi

Ca tot

elemento

ocresolftaleina

Valutazione ossa/reni/paratiroidi

elemento

Enzim-colorim

Valutazione muscolo/reni

Pho

elemento

enzimatico

Valutazione ossa/reni/paratiroidi

Ac Urico

m.organica

uricasiPAP

Articolaz / gotta /reni

Albumina

proteina

BCG

Fegato / reni / leucemie / autoimm

Ferro

elemento

ferrozina

< anemia

CHOL

molecola

chodPAP

Aterosclerosi / prec.ormoni

Trigliceridi

lipidi

gpoPAP

Aterosclerosi / dieta

HDL

lipoproteina

chodPAP

Chol buono +

LDL

lipoproteina

calcolo

Chol cattivo / risk cardiovascolare

Lipasi

enzima

Cinetico-colorim

Valutaz pancreas

IgG IgM IgA proteine

turbidimetria

Valutaz sistema immunitario / leucemie

Tranferrina

proteina

turbidimetria

>Emocromatosi <epatopatie

Ferritina

proteina

turbidimetria

>Emocromatosi <anemie

HPT

proteina

turbidimetria

Riduz da anemia emolitica

Antitripsina Glicoproteina turbidimetria

>infezioni <cirrosi

ceruloplasm proteina

turbidimetria

>intozzicaz Cu <M.Wilson

C3 C4

Prot.compl

turbidimetria

Infez / edemi / autoimm LES AR

K /L

Catene legg

turbidimetria

Mieloma / valutaz reni

ASLO

anticorpi

turbidimetria

Post infez strepto

PCR

proteina

turbidimetria

Stress acuto (si lega cell necrosi o batteri)

Auto Ab

turbidimetria

Artrite Reumatoide

Ac. Lattico

Acido debole spettrofotometria > traumi / cirrosi / tumori

Etanolo

alcol

Clereance Na K Urea Crea UA Glu

Calcolo (calcolo) (velocità filtrato glomerulare)

La clearance della crea misura la quantità di sangue depurato dalla creatinina a livello glomerulare, per unità di tempo (24h). Si esprime in mL/min. Creatininuria (mg/dl) x Diuresi delle 24ore / Creatininemia x 1440

TnT-Hs

proteine

ECLIA

Marcatore cardiaco spec. infarto (curva)

Myoglobina proteina

ECLIA

Inizio infarto

CK-MB

ECLIA

Marcatore cardiaco (aspecifico)

nt.Pro BNP Pept.natriur.

ECLIA

Scompenso cardiaco

PCT

ECLIA

> sepsi batteriche, differenzia infezioni batteriche da virali

enzima Pre-h

Enzim-spettrofot Abuso d'alcol

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SETTORE : PROTEINE / FARMACI = provette 7 ml ruggine o rosse secche con o senza separatore (no anticoagulante) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

QPE

proteine

Elettroforesi capilalre

disprotidemie infiammaz leucemie

AMMONIO V/a

NH4+

Enzimatico UV

Sindrome Reye (ped), encefalopatia epatica

HCY

amminoacido

nefelometria

>risk cardiovascolare

ACE

enzima

spettrofotometria

sarcoidosi

Ac Biliari

acidi

spettrofotometria

Valutaz epatica /intestinale

Digossina

farmaco

Immuno-turbidim

Insuff. cardiaca

Vancomicina antibiotico

Immuno-turbidim

infezioni gravi da stafilo e le endocarditi da strepto

Amikacina

antibiotico

Immuno-turbidim

setticemie, infezioni app respir e genitourinario

Gentamicina antibiotico

Immuno-turbidim

patologie cutanee / ustioni

Tobramicina

antibiotico

Immuno-turbidim

Infezioni occhio

Teofillina

Vasodilatat alcaloide

Immuno-turbidim

Patologia vie respiratorie

Litio C

farmaco

colorimetria

Disturbo bipolare

Pannello Tox droghe Urina

immunochimico

Oppio, metad, coca, THC, anfet, ecstasy, BNZ, BAR

Metotrexato

Imm-enzimat

Antiblastico x LLA e linfomi

farmaco

SETTORE : IMMUNOMETRIA = provette 7 ml BLU ELETTRICO secche con separatore (no anticoagulante) TEST

FORMA

METODO

Vit B12

C.Cobalam CMIA (prot animali)

Sviluppo SN e MO, <dieta vegana, <rimozione hcy e >risk cardiov.

Vit B9

Ac folico

verdure verdi, importante in gravidanza, sintesi Dna ed Hb

CEA

glicoproteina CMIA

Marcatore K mammella, polmone,ovaio, utero ,pancreas, fumo

AFP

alfafetoprot

ICMA

Tri-test x gravide, epatocarcinoma

CA 19-9

mucina

CMIA

Marcatore K pancreas, fegato, stomaco, colon.

CA 125

mucina

CMIA

Marcatore K ovaio

CMIA

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

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CA 15-3

mucina

CMIA

Marcatore K seno

NSE

Enolasi

TRACE

Marcatore k polmoni, neuroblast ped.

PSA tot/free

glicoproteina ICMA

patologia prostatica ben / mal

h.luteinizz

ICMA

Infertilità, produz TST uomo e ESTR donna

FSH

h. follicolostimolante

ICMA

Infertilità, stimola ovulazione donna e spermatogenesi uomo

Prolattina

h.ipofisario

CMIA

Adenomi ipof, impotenza, disturbi ciclo mestr

DHEA-S

h.steroideo

ICMA

Sindr Ovaio Polic, irsutismo femm.

DHEA

h.steroideo

ICMA

Valutaz ghiandola surren.

h. crescita

ICMA

Valutaz crescita bambini, acromegalia

TST

h.steroideo

ICMA

Valutazie gonadi

Progesterone h.steroideo

CMIA

impianto e crescita del feto

Estradiolo

estrogeno

CMIA

indice funzionalità ovarica

B-hcg

Gonadotropi CMIA na Corionica

Test di gravidanza

PTH

h.paratiroid

CMIA

alterato metabolismo del calcio , osteoporosi

Calcitonina

h.tiroideo

ICMA

carcinoma midollare tiroide

cortisolo

h.surrene

CMIA

Valutaz funzion corticosurr (>Cushing, <Addison), stress fisico

ACTH

corticotropina ICMA

Ipofisi: stimola surrene a prod CORT. <Cushing, >Addison (feed-back con surrene)

TSH

h. tireostimol CMIA

stimola produz Ft3, fT4 (feed-back)

fT4

tiroxina

ipertiroidismo,TSH basso e fT3 fT4 alti

fT3

triiodotironina CMIA

ipotiroidismo,TSH alto e fT3 fT4 bassi

HTG

tireoglobulina ICMA

Follow up k tiroide

Ab-HTG

anticorpi

ICMA

tiroidite di Hashimoto e il morbo di GravesBasedow.

Ab-TPO

anticorpi

ICMA

tiroidite di Hashimoto e il morbo di GravesBasedow.

TRAb

anti-recettore CMIA

morbo di Graves-Basedow.

Gastrina

h. peptidico

ICMA

K gastrico, ulcere

B2microglob proteina

ICMA

linfoma

Insulina

h. peptidico

ICMA

< DM tipo I (giovan/no-produz), >DM tipo II (adulto/resistenz)

C-peptide

Precurs ins

ICMA

indice secrezione dell'insulina (pancreas DM1)

CMIA

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3.5

SPECIALISTICA

SETTORE : AUTOIMMUNITA' e ALLERGOLOGIA = provette 7 ml BLU ELETTRICO secche (no anticoagulante) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

IgE tot

immunoglob

IFMA

Allergie, asma, diarrea

RAST

IgE specifiche

IFMA

Alimenti, animali, piante

Ab ANA

Ab antinucleo

FEIA

LES, sclerodermia, AR, Sjogren

FEIA

Lupus Eritematoso Sistemico

Ab anti DNA anticorpi Ab ENA

Ab anti Ag FEIA nucleari estraibili

II° livello dopo + ANA

ANCA c,p

Ab anti citopl Neutrofili

IFMA/ IF

Vasculiti, colite ulcerosa

Ab-antiCCP

Ab anti citrullina

IFMA

Artrite Reumatoide

B2-GPI

Ab anti glicoproteina

FEIA

sindrome da antifosfolipidi, trombosi ricorrenti, aborti

EMA

Ab anti Endomisio

IF esofago di scimmia

celiachia

IgA-Ttg

Ab anti FEIA transglutaminasi

celiachia

SETTORE : RIA = provette 7 ml BLU ELETTRICO secche (no anticoagulante) TEST

FORMA

METODO

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche

Aldosterone h.steroideo RIA

Valutaz pressione arteriosa

CromoA

proteina

RIA

K gastrico, feocromocitoma

ADH

h.antidiur

RIA

regolatore dell’equilibrio idroelettrolitico

Ioduria

elemento

RIA

Carcinoma tiroide

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SETTORE : TOSSICOLOGIA (HPLC, LC-MS/MS, ASSORBIMENTO ATOMICO) = provette varie per sangue intero, siero, plasma, urine spot e raccolta 24h TEST

FORMA

METODO

Catecolamine

Adren/noradr

Metanefrine

Metab Cat

HVA, VAM

Metab Cat

5-HIAA

Metab Serot

5HT

serotonina

Ossalati / Citrati CDT Benzodiazepine TCA Clozapina CBZ / MHD VPA Lamotrigina Fenobarbital Fenitoina Etosuccimide Levetiracetam Lacosamide Rufinamide Voriconazolo Posaconazolo Teicoplanina Vit A /E Vit B1, B2, B6 MPA Tacrolimus Rapamune Certican CYA Rame Zinco Calcio Selenio Piombo Alluminio Manganese Cromo Ferro

acidi proteina varie vari di-benzo antiepilett ac.valproico antiepilett antiepilett antiepilett antiepilett antiepilett antiepilett antiepilett antifungal antifungal AB vitamine vitamine Ac micofen FK Sirolimus Everolimus Ciclosporina Oligo elem Oligo elem Oligo elem Oligo elem Oligo elem elemento Oligo elem Oligo elem elemento

HPLCcoulometrico HPLCamperometrico HPLCamperometrico HPLCamperometrico HPLCamperometrico HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC UV HPLC+fluorscnz HPLC+fluorscnz HPLC UV HPLC UV HPLC+fluorscnz HPLC UV LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS AA fiamma AA fiamma AA fiamma AA fornetto AA fornetto AA fornetto AA fiamma AA fiamma AA fiamma

INDICAZIONI GENERALI aspecifiche Feocromocitoma, neuroblast.ped Feocromocitoma Neuroblastoma pediatrico Tumori neuroendocrini / emicrania "ormone del buonumore" Se >O e <C : calcoli renali Valutaz alcolismo cronico (patenti) Ansia, insonnia, epilessia Depressione, dolore, dist. bipolare psicosi epilessia anticonvulsivo epilessia epilessia epilessia epilessia epilessia epilessia epilessia micosi micosi endocarditi Valutaz stato nutriz Valutaz stato nutriz Imm Soppres TrapOS Imm Soppres TrapOS Imm Soppres TrapOS Imm Soppres TrapOS Imm Soppres TrapOS Sintomi aspec malessere Sintomi aspec malessere Valutaz scheletro Sintomi aspec malessere Intossicaz saturnismo Valutaz dialisi Sintomi aspec malessere Sintomi aspec malessere Valutaz trattam desferal x anemia

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VARIABILITÀ PRE / POST ANALITICA, METODI, VALORI NORMALI ed ERRORI

4.1

Variabilità Pre-analitica (legata al paziente)

Dipende da: età, sesso, paziente non standard (pazienti ambulatoriali), assunzione medicamenti, dieta, attività fisica, postura, ritmi biologici. Queste notizie cliniche devono / dovrebbero essere inserite dal richiedente nel campo note della richiesta di esami. Possibili errori grossolani. Per Valore Normale si intende il valore più frequentemente riscontrato negli individui sani della specie umana. I fattori di variabilità del concetto di normalità sono: età , sesso, razza, estrazione sociale, abitudini di vita, ecc.

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Da qui il postulato di R. Grasbeck che ha sostituito il concetto di valore normale con quello di Valore di Riferimento, calcolato su una popolazione ristretta con almeno caratteristiche genetiche ed ambientali confrontabili con quelle del soggetto a cui il risultato di laboratorio si riferisce. Si preferisce quindi parlare di valori di riferimento. Se la distribuzione è statisticamente normale, i valori di riferimento vengono arbitrariamente fissati come pari alla media +/- 2 DS; vi si include così circa il 95% della popolazione sana. Il principale fattore che influenza i valori di riferimento è la Variabilità Biologica La Variabilità Biologica è l'oscillazione naturale posseduta da ciascun analita all’interno di un fluido biologico dovuta a fattori quali : CAUSE

ANALITI

Ritmi circadiani (ora prelievo)

insulina, ormoni steroidei, TSH, Fe

Variazioni stagionali

Elettroliti, vit.D3

Dieta

Urea, Cra, glu, chol, Tg, Fe, etc...

Postura

Meta, Cat. plasm

Età

Emocromo e biochimica in genere

Sesso

Emocromo e biochimica in genere

Gravidanza

Fibrinogeno, Fe, LDH, Ca, estrogeni ...

Massa corporea

Crea, Urea, CK

Ciclo mestruale

Elettroliti, ormoni, Fe, Hb

Razza

CK, CK-MB, Myo, elettroliti

Tipo di attività lavorativa e classe sociale

Tossicologia, meta-Hb, Pb

Localizzazione geografica

GR, Hb

Tabagismo

CEA, meta-Hb

Ingestione recente di cibo

Glu, TG, p-Amy, Lipasi, ALT

Esercizio fisico

CK, CK-mb, LDH, AcLattico, AST

Assunzioni di farmaci

Emocromo e Biochimica in genere

Disturbi del sonno, stati d’ansia

Ormoni steroidei, Catecolamine, EGA, PRL

Fase REM del sonno

Ferro, Prolattina

L’intervallo dei valori di riferimento per un determinato analita è quindi l’insieme dei valori ottenuti con un determinato metodo su una popolazione sana e omogenea rispetto al fattore di variabilità legata al paziente che può influenzare quel parametro. In altri casi vengono individuati dei valori decisionali in base alla necessità da parte del medico di operare opportune scelte cliniche o farmacologiche, quando il livello di alcuni analiti raggiunge determinati valori, come nel caso dei Valori di Panico per valori estremamente alti di K o estremamente bassi di Ca o di Glu (VEDI CAPITOLO 7).

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Pag. 26

4.2

Variabilità Pre-analitica (legata al prelievo)

Premessa : ogni campione è identificato (o dovrebbe) da una etichetta leggibile con:       

tipo di anticoagulante, barcode, cognome e nome, data di nascita, data giorno prelievo, laboratorio / settore di destinazione, reparto di provenienza o codice.

Possibili errori grossolani. VARIABILE

ESAME

ALTERAZIONE

Scambio nosografico : provetta etichettata con dati di altro paziente

tutti

Rischio vita x paziente a cui vengono associati valori non suoi. Verificare storico esami se presente.

Provetta errata

tutti

vedi capitolo 5 Provette e Anticoagulanti

Insufficiente: provetta non riempita in toto. Rapporto errato 9.sangue / 1.anticoagualante

COA Riduz: Fibrinogeno e DD (< conc) (diluizione / RAP) Increm: PT (sec), aPTT (sec)

Coagulo: presenza di grumo EMO (Plt+GR+Fibrina) nel sangue COA intero

Riduz : Plt, Hb, GR x sottrazione

Emolisi: visibile dopo COA centrifugazione definita da (Hb > 0,6 g/L) presenza di Hb libera nel siero o nel plasma > 0,30 g/L BIOCHIMICA (Hb varie)

Riduz: PT (sec), aPTT, ATIII, Fibri

Riduz: PT, aPTT, Fibri x attivaz cascata coag

Increm: DiDimero Riduz : PCR, ALP, GLU, Cl Increm: K, LDH, CK, AST, ALT, GGT, Bili, PT, Alb, Chol, TG, Urea, Crea, Ca, Mg, Pho, Fe, CHE, Lipasi

Ittero: bilirubina giallo/verde COA nel siero o plasma >40mg/dL Lipemia: a L 660/700 nm e corrisponde a concentrazione di TG > 300 mg/dL nei campioni centrifugati.

Interferenza su Fibrinogeno

BIOCHIMICA

Interferenza su AcLattico, UA, Pho

COA (tg >2000)

Increm: AT3, Fibri, DD

EMO

Interferenze su Hb (turbidity)

BIOCHIMICA

Riduz: ALP, Chol, Lipasi, Crea, Pcr, Na Increm: AST, ALT, GGT, Bili, PT, Alb, TG, Ca, Mg, Pho, Fe, CHE, K

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tappo di Fibrina, siero “duro” AREA SIERO

No aspiraz campione (< tutti analiti)

Tempo di conservazione AREA PLASMA alti. Il sangue allontanato dal torrente circolatorio si altera portando ad una riduz o aum AREA SIERO degli analiti in base a consumo, inattivaz, produz, deaminaz, emolisi. Di norma eseguire gli esami da 30’ a 4 h dal EGA prelievo. EGA in acqua & ghiaccio ! All’interno di siringa EGA il metabolismo cell continua !

Perdita morfologia cell. EMA x striscio

Bolla d'aria. Effetti EGA proporzionali alla dimensioni e al tempo di giacenza della bolla in siringa.

Riduz : PCO2

Temperature alte (già 37°) tutti accelerano il deterioramento dei costituenti ematici.

Per la maggiorparte degli analiti si raccomanda una temperatura di conservazione tra 4 e 20ºC x rallentare le attività enzimatiche

Esposizione alla Luce degradaz x fotosensibilità

AREA SIERO

Riduz : Bili tot/dir

SPECIALISTICA

Riduz : Vit D3, A, E, B12, B6, B2, B1 ,C

Riduz : tempi COA Riduz : Glu (consumo da leucocitosi), Vitamine, Etanolo, B-hcg Increm : AMM, AcLattico, AST, LDH, K, Pho, Si consuma <O2, si produce >CO2, scende <pH e si verifica citolisi. Si metabolizza il <Glu e si produce >AcLat e >HCO3-

Increm : PO2 ,SO2, pH

Congelamento t<0°=emolisi AREA PLASMA

Riduz : Hb, GR

Stasi (laccio emostatico x prelievo)

AREA PLASMA

Attivaz cascata coag (< Pt, aPtt, Fibrin) Riduz : PLT

Sterilità

MICROBIOLOGI

Contaminazioni

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Le determinazioni di molti analiti possono essere inficiate dalla presenza di sostanze interferenti. Nel laboratorio di Chimica Clinica le tre condizioni più frequenti sono rappresentate dalla presenza anomala in circolo di emoglobina libera (EMOLISI), bilirubina (ITTERO) e trigliceridi (LIPEMIA). Queste tre condizioni possono dare problemi analitici, in particolare si possono osservare importanti variazioni dipendenti dal sistema di rilevazione sia esso di tipo magnetomeccanico, foto-ottico e spettrometrico. L'emolisi, ad esempio, oltre a comportare il rilascio nel siero o plasma di elementi abitualmente ritenuti all'interno del globulo rosso a concentrazioni molto differenti da quelle del liquido extracellulare (potassio, magnesio, fosfati, enzimi LDH + AST, etc.), libera anche l'emoglobina. Questa proteina, come pigmento ad elevato assorbimento in alcune zone dello spettro, può interferire con la misurazione spettrofotometrica di numerose reazioni analitiche, falsandone i risultati. (E) Emolisi Meccanismi di interferenza:  Aumento costituenti intracellulari nello spazio extracellulare x rottura membrane in shock-osmotico (es: uso di H20 distillata x diluizioni)  Interferenza ottica  Cause : in vivo (infezioni, disordini autoimmuni, agenti fisici, prelievo) ; in vitro (traumi, temperature)  I primi parametri in assoluto ad essere inattendibili saranno in ordine : K, LDH, AST, PCR, GLU, Fibrinogeno, aPTT, etc…

(L) Lipemia Meccanismi di interferenza:  Interferenza spettrofotometrica (torbidità)  Riduzione del volume morto (lo spostamento dell'acqua serica per opera dei lipidi per il loro mantenimento in sospensione, riduce il volume d'acqua disponibile per la dissoluzione delle altre sostanze, aumentando falsamente la loro concentrazione).  Interferenza chimico-fisica (aumento del volume lipofilo con anomala distribuzione di alcuni analiti)

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(I) Ittero Meccanismi di interferenza:  Interferenza spettrofotometrica (compressione della linearità per quegli analiti i cui metodi di dosaggio utilizzano lunghezze d’onda tipiche della bilirubina)  Interferenza chimica (utilizzazione del perossido d’idrogeno)

I moderni analizzatori di Chimica Clinica elaborano un SERUM- INDEX per ogni situazione di interferenza (E, I , L). Uno dei metodi più semplici consiste nel dispensare il siero o plasma con una opportuna quantità di tampone e leggere a 6 lunghezze d’onda prefissate. Il programma strumentale ha tre curve di calibrazione per quantità crescenti di emoglobina, bilirubina e trigliceridi. In base alle letture si estrapolano gli indici per E, I e L. I produttori di reagenti/strumenti associano per ogni analita da determinare la soglia massima di interferente (cut-off) che non interferisce con l'analisi. In base alle letture dello strumento e all’elaborazione dell’indice di siero, il software strumentale associa ogni analita all’indice e nel caso di superamento invia al server di refertazione il dato numerico coperto dall'indicazione specifica : (se E >0.3 ==> Potassio, LDH , Fibrinogeno = emolisi ).

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Pag. 30

4.3

Variabilità Analitica

La variabilità analitica è legata a : metodi di analisi, metodo di misura, strumenti di analisi, tecnico di laboratorio in turno. Al Laboratorio Analisi e al personale che ci lavora si richiedono dunque risultati attendibili, affidabili, validi, elevata qualità, assenza di errori. Bias del metodo: differenza tra i risultati ottenuti da laboratori diversi con lo stesso metodo ed il valore di riferimento accettato. Bias di uno strumento : sorgente di errore sistematico connessa alle indicazioni di uno strumento di misurazione. Bias di laboratorio: differenza tra un risultato ottenuto da un certo laboratorio ed il valore di riferimento accettato. Gli errori grossolani sono quelli che vengono commessi in seguito ad un’ inappropriata applicazione del metodo analitico. Errore inaccettabile che impone l’abbandono dell’analisi (per es. caso di perdita anche parziale o contaminazione abnorme del campione, ecc.). Gli errori sistematici rappresentano la tendenza di un dato metodo a sovrastimare (o sottostimare) il vero valore. Gli errori sistematici possono essere suddivisi in errori sistematici strumentali, di metodo e personali. Quelli strumentali sono dovuti ad inesatta calibrazione o utilizzazione impropria degli strumenti di misura, all'uso di strumenti non idonei, ecc. (per es. correzione solo parziale di un background particolarmente elevato in spettroscopia atomica, uso di pHmetro non calibrato, ecc). Gli errori sistematici di metodo sono dovuti ad un comportamento non ideale di reattivi e reazioni, o all'uso di condizioni sperimentali non idonee (per es. fenomeni di coprecipitazione, di fasi mobili non idonee, età). Gli errori sistematici personali, infine, sono errori operativi dovuti a distrazione o ignoranza della corretta procedura (errori di parallasse nella lettura di strumenti analogici, o uso di valori critici errati nei test statistici, età). Gli errori sistematici possono essere costanti o proporzionali. Gli errori casuali sommano tutte le piccole e imprevedibili variazioni nell’esecuzione delle varie operazioni analitiche. Sono studiati in statistica e pertanto le misure fluttuano attorno a un valore μ e questo tipo di distribuzione dei dati segue una curva “gaussiana” a campana. L' errore totale = valore vero – valore misurato = errore casuale + errore sistematico Il Laboratorio Analisi deve tenere sotto controllo le determinazioni analitiche effettuate, attraverso le attività di validazione e verifica dei Metodi analitici utilizzati. Metodo analitico : Applicazione di una tecnica analitica per risolvere un problema analitico specifico. Tecnica analitica : Insieme dei principi teorici e degli accorgimenti sperimentali che permettono di utilizzare un fenomeno scientifico fondamentale al fine di ottenere informazioni sulla composizione di un certo campione biologico. Procedura analitica : Insieme delle operazioni d’impostazione, esecuzione e presentazione dei risultati di un’analisi chimica. Può essere schematizzata come segue: Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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1. Definizione generale del problema (committente, chimico analitico) 2 .Definizione analitica del problema (chimico analitico) 3. Scelta di metodo, tecnica, procedura, protocollo (chimico analitico) 4 .Campionamento (committente?, chimico analitico?) 5 .Trattamento del campione (chimico analitico) 6 .Analisi (chimico analitico) 7 .Valutazione dei dati (chimico analitico) 8 .Conclusioni (chimico analitico) 9 .Relazione (committente, chimico analitico) Necessaria la validazione dei metodi analitici quali/quantitativi interamente sviluppati nel laboratorio (tecniche “home made”). Necessaria la verifica dei metodi analitici quantitativi o qualitativi o semiquantitativi muniti di marchio CE ed accreditati dal Produttore (normati) qualora sia da prevederne l’introduzione in uso, nei casi di :  confronto dello stesso analita con metodi diversi (il confronto di metodi viene utilizzato quando si introduce un nuovo metodo o più spesso quando, in presenza di metodi diversi, si vuole verificare la loro concordanza)  valutazione sostituzione di analita e metodo/apparecchiatura. Necessaria la ri-verifica dei metodi analitici quantitativi o qualitativi o semiquantitativi muniti di marchio CE ed accreditati dal Produttore (normati) qualora incorrono :  variazioni significative delle metodica analitica in uso  variazioni sostanziali delle fase pre-analitica e/o analtica (es CQI)  variazioni delle prestazioni del metodo (maggior accuratezza, maggior specificità, abbattimento costi). Le Linee Guida disponibili in letteratura suggeriscono un numero minimo di 40 – 60 campioni per validare o confrontare un metodo analitico. La responsabilità di eseguire quanto descritto è del personale Tecnico di Laboratorio addestrato affiancato e coordinato dal personale dirigente. Il Dirigente è responsabile della programmazione e supervisione della procedura. La responsabilità decisionale è del Dirigente previa consultazione con il personale tecnico. Per robustezza di una procedura analitica si intende la capacità di non essere influenzata da piccole variazioni nei parametri del metodo, (% solventi organici, pH, temperatura, flusso) e fornire una indicazione della sua affidabilità durante l’impiego normale. La valutazione della robustezza dovrebbe essere considerata in fase di sviluppo e dipende dal tipo di metodo in studio. L’ attendibilità di un metodo analitico dipende da diversi fattori, tra cui i principali sono:  la precisione  l’accuratezza  la sensibilità analitica (diversa dalla sens diagnostica)  la specificità analitica (diversa dalla spec diagnostica) La precisione è la concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso tecnico, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo). Si misura con :  deviazione-standard (DS valore assoluto con unità di misura) = radice quadrata positiva della varianza. Parametro di quantificazione della precisione di un set di misure, xi, ottenute mediante misurazioni ripetute.  varianza (CV valore relativo = DS / m x100 ) = misura della dispersione di una serie di risultati sperimentali, ottenuta come rapporto tra somma degli scarti quadratici delle misure dalla media e numero delle misure, n (varianza della popolazione) o numero delle misure diminuito di 1 (varianza di un campione della popolazione). La ripetibilità è la concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica). La riproducibilità è la concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, tra serie analitiche diverse, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi. La accuratezza indica quanto un valore medio si scosta dal valore atteso ed equivale alla concordanza tra il valore dato ed il valore vero e dipende dal metodo usato. Viene descritta dall’errore assoluto e dall’errore relativo. Contrariamente all' errore assoluto che rappresenta l'intervallo entro il quale siamo convinti che il valore vero della grandezza si trovi, l' errore relativo non ha le stesse dimensioni della grandezza, ma è adimensionale: per questo motivo molto spesso si preferisce esprimerlo in forma percentuale. Un metodo di analisi è tanto più accurato, quanto più si avvicina ai valori determinati mediante un metodo di riferimento gold-standard (Lc-ms/ms, Anatomia patologia, Biologia Molecolare) L’ imprecisione è la dispersione tra misure ripetute rispetto ad un valore medio (allontanamento dalla media). Riflette l’errore casuale. Si valuta analizzando lo stesso campione più volte. L’ inaccuratezza può anche essere definita come la differenza tra il valore misurato e il valore vero. E’ dovuta alla presenza di un errore sistematico del metodo adottato.

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La sensibilità analitica (da non confondere con la Sensibilità Diagnostica) è data dalla minima quantità di un analita rilevabile in un campione biologico. Attitudine del metodo a dosare piccole quantità del componente studiato distinguendolo dal Bianco-cuvetta strumentale. Il limite di rilevabilità indica la più piccola quantità di sostanza che il metodo riesce a dosare, minimo segnale significativo, segnale vicino a quello del bianco strumentale. La specificità analitica (da non confondere con la Specificità Diagnostica) indica la capacità del metodo di determinare un dato analita senza subire interferenze, ossia la capacità del metodo di distinguere tra una sostanza e possibili sostanze interferenti. Per affidabilità di un test s’intende la capacità di offrire sempre lo stesso risultato nel corso di misurazioni ripetute. Per validità di un test la capacità del test di distinguere in una popolazione i soggetti sani da quelli malati.

4.4

Variabilità Post-analitica

Associata a :  validazione clinica del dato di laboratorio (vedi Capitolo. 7),  raccolta e consegna dei dati busta o via web,  esposizione dati nel referto cartaceo o pdf,  interpretazione dei risultati di diagnostica nel contesto clinico. Possibili errori grossolani.

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TIPOLOGIA DI PROVETTE e ANTICOAGULANTI (sangue intero, plasma, siero, diluizioni)

5.1

Provette ed Anticoagulanti

Quando il Sangue Intero (venoso) é allontanato dal torrente circolatorio attraverso il prelievo, esso si altera, portando ad una riduzione od ad un aumento di livello degli analiti. Conservando il prelievo a bassa temperatura si rallentano o si bloccano tutte le attività enzimatiche, che hanno a 37 °C la loro temperatura ideale, compresa quella degli enzimi glicolitici, e ciò permette di prolungare l'integrità del prelievo per la glicemia. Meglio ancora se il prelievo é costituito dal solo siero e non dal sangue in toto. E' possibile inibire l'attività enzimatica con l'aggiunta di sostanze che la paralizzano dette anticoagulanti. Anche per problemi di profilassi, sono diventate sempre più diffuse le provette sotto vuoto, i Vacutainer, che consentono, con l'ausilio di opportuni aghi e raccordi per esse predisposti, di fare aspirare il sangue direttamente dall'ago all'interno della provetta, sfruttando come forza di aspirazione una depressione all'interno della provetta stessa. Tale sistema, consentendo il prelievo di una quantità costante nota di sangue, permette di ottenere un perfetto rapporto tra sangue e anticoagulante presente dentro la provetta (esempio COA tappo azzurro: DILUIZIONE 1 a 10 = rapporto 1 anticoagulante / 9 sangue). E' importante che, per gli esami della coagulazione, si eviti di fare avanzare troppo il fenomeno coagulativo durante la fase d’aspirazione del prelievo, con una permanenza troppo lunga del sangue nell'ago e nel raccordo, al di fuori del vaso venoso, e prima del rimescolamento con l'anticoagulante nella provetta. Ciò può accadere, quando, si presentino difficoltà nell'aspirazione del sangue, o quando si usi un ago di calibro troppo piccolo. L'innesco della coagulazione dovuto alla fase estrinseca, causata dal trauma della puntura, con rilascio di tromboplastina tissutale, e dall'attivazione delle piastrine per loro contatto con superfici non fisiologiche, quali ago, raccordo o siringa, parete della provetta, é un evento purtroppo inevitabile, ma che va ridotto al minimo. Per minimizzarne le conseguenze é buona norma, oltre all'uso d'aghi siliconati atraumatici di lume grande, che il sangue per studi dell'emostasi non sia il primo che esce, ma che i primi millilitri siano usati per altri esami o che in ogni caso le prime gocce siano scartate.

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Come avrete intuito, la scelta del colore del tappo della provetta è tutt’altro che casuale e viene fatta a seconda del tipo di esame che dovrà essere effettuato sul nostro sangue. E' indispensabile perché il campione sia idoneo scegliere l’anticoagulante giusto, che non vada ad interferire con il dosaggio degli analiti. La tavola dei colori ci consente di associare in maniera molto facile ogni tappo ad uno specifico anticoagulante. Nonostante vi siano differenze fra i vari ospedali, a livello mondiale si sta cercando di uniformare il più possibile il criterio d’interpretazione, per evitare di formare ogni volta il personale sanitario. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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 TAPPO ROSSO / GIALLO / BLU / ROSA – NO ANTICOAGULANTE "secca" : le provette con questo tappo sono destinate ad essere utilizzate dopo centrifugazione per esami sierologici (biochimica, proteine, immunometria, tossicologia). Queste provette infatti contengono al loro interno microparticelle di silice che attivano la coagulazione nel momento in cui la provetta viene invertita, dopo il prelievo. Su questo tipo di campione possiamo dosare una vastità di analiti: enzimi epatici, ormoni, anticorpi. Non può essere utilizzato per i test di coagulazione, dal momento che il sangue ha già formato un coagulo e quindi i fattori sono già stati “consumati”. L’aggiunta di SEPARATORE in silice consente di migliorare la separazione siero/cellule aiutando il deposito di fibrina e di evitare possibile emolisi durante la conservazione del campione in frigo o per inversione accidentale.  TAPPO VIOLA – EDTA (acido etilendiaminotetracetico): l’EDTA è un forte chelante degli ioni Calcio, formando con esso dei sali insolubili: l’impossibilità di utilizzare gli ioni Calcio blocca la cascata coagulativa. Questa provetta può essere usata direttamente sugli analizzatori automatici per eseguire l'emocromo (conta dei globuli bianchi, globuli rossi, piastrine). L’EDTA infatti non altera la morfologia delle cellule del sangue ed entro 3 ore dal prelievo si può usare il campione anche per effettuare degli strisci di sangue da osservare al microscopio ottico.  TAPPO AZZURRO – SODIO CITRATO : questo anticoagulante dopo centrifugazione è di elezione per i tempi di coagulazione (Fibri, PT, aPTT), è meno forte dell'EDTA, non entra nei rossi ma si diluisce solo nel plasma. E' un chelante reversibile del Calcio (tramite aggiunta durante l'analisi di CaCl2). Il sangue trattato con sodio citrato viene utilizzato per la VES, per lo studio dei fattori di coagulazione e per la determinazione della funzionalità piastrinica (PLT clumps). E’ anche l’anticoagulante che viene utilizzato per il sangue delle trasfusioni.  TAPPO GRIGIO – FLUORURO DI SODIO : questo anticoagulante, oltre a sequestrare gli ioni Calcio, è una sostanza che stabilizza la concentrazione di glucosio nel sangue, inibendo la glicolisi. Per questo motivo è usato per determinare la glicemia sul campione. Usato anche per l' etanolo dopo centrifugazione.  TAPPO VERDE – EPARINA : dall'alto peso molecolare, al contrario degli altri anticoagulanti, non agisce sugli ioni Calcio ma impedisce la formazione di trombina e fibrina. E’ un anticoagulante “naturale” dal momento che è presente a bassi livelli sia nel sangue che nei tessuti. Viene utilizzata dopo centrifugazione per le determinazioni plasmatiche di biochimica clinica (GGT, AST, ALT, CK, LDH, Na, K, etc...). . 5.2 Provetta Errata  Gli anticoagulanti presenti nel plasma (es.eparina) interferiscono sull’ Elettroforesi delle proteine in cui compare il picco del Fibrinogeno (falso aumento) in zona gamma.  Il Glucosio presente nel siero (no anticoagulanti) si riduce del 5% x h causa glicolisi.  Il plasma con Fluoruro di sodio darebbe un falso aumento del Na e false riduzioni di AST, ALP, LDH x inibizione di attività enzimatica (= no x Biochimica).  Il plasma con EDTA-K3 darebbe falso aumento del K e false riduzioni di AST, ALP, LDH x inibizione di attività enzimatica (= no x Biochimica).  Il plasma con Eparina o EDTA darebbe false riduzioni di alcuni esami (non tutti) eseguiti con tecniche Immuno-Enzimatiche, Immuno-Fluorescenza, ImmunoMartinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Luminescenza, RIA a causa dell'interferenza da parte dei Fattori della Coagulazione (non presenti nel siero) nelle reazioni Ag-Ab (occupazione siti) e successive reazioni dovute al legame: colore, fluoresc, luminesc, raggi gamma (= no x Immunometria).  Il plasma con Eparina o EDTA non permette la distinzione e quantificazione nel tracciato cromatografico dei picchi/analiti in HPLC-scambio-ionico per occupazione dei siti nella resina di scambio (= no x Farmaci).  Il sangue intero con Eparina non può essere usato per emocromo dal momento che altera la morfologia delle cellule del sangue, peggiora la colorazione su striscio e provoca aggregazione piastrinica (= no x Emocromo).  Il sangue intero con Sodio Citrato non puo' essere usato per l'emocromo perchè la diluizione 1:10 creata dall'anticoagulante dentro la provetta darebbe una falsa riduzione della conta cellulare di GR, GB, plt (= no x Emocromo).

5.3

Diluizioni manuali e automatizzate

In CHIMICA :

Soluzione (sangue intero)

Soluto + Solvente (analita) (siero o plasma)

Quando la concentrazione di un analita supera la Linearità del Metodo è necessario procedere alla diluizione di tale del campione affinchè si rientri nella curva di calibrazione. Range Lineare = Intervallo di concentrazione in cui il segnale varia linearmente con la concentrazione, massima concentrazione rilevabile, ultimo punto della calibrazione strumentale, plateau. (Vedi Cap 6. TECNICHE, METODOLOGIE, CALIBRAZIONI...) Attenzione alla matrice ! = insieme di tutte le componenti chimico/fisiche di un materiale. Esempi :  Glicemia su plasma > 750 mg/dL. Si procede con diluizione 1 : 2 con soluzione fisiologica (500 uL plasma + 500 uL NaCl 0,9%). Si farà ripetere dallo strumento l'analisi e, se non previsto in automatico, si dovrà moltiplicare x 2 il risultato ottenuto. 240 mg/dL dosati dallo strumento (rientrati nella linearità della metodica) x 2 (fattore di diluizione manuale) = 480 mg/dL (risultato corretto). Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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 ASLO su siero > 600 UI/L Si procede con diluizione 1 : 3 con soluzione fisiologica (500 uL siero + 1000 uL NaCl 0,9%). Si farà ripetere dallo strumento l'analisi e, se non previsto in automatico, si dovrà moltiplicare x 3 il risultato ottenuto. 300 UI/L dosati dallo strumento (rientrati nella linearità della metodica) x 3 (fattore di diluizione manuale) = 900 UI/L (risultato corretto).  Sodio su plasma > 160 mmoli/L Si procede con diluizione 1 : 2 con acqua distillata (50% plasma + 50% H2Od). Si farà ripetere dallo strumento l'analisi e, se non previsto in automatico, si dovrà moltiplicare x 2 il risultato ottenuto. 70 mmoli/L dosati dallo strumento (rientrati nella linearità della metodica) x 2 (fattore di diluizione manuale) = 140 mmoli/L (risultato corretto). NB: non si deve diluire l'analita con fisiologica (NaCl 0,9) perchè contiene Na che aumenterebbe in modo FP il risultato.  FK su sangue intero > 44 ng/mL Si procede con diluizione 1 : 4 con calibratore 0 di sangue intero (50 uL SI + 150 uL cal 0). Si farà ripetere dallo strumento l'analisi e, se non previsto in automatico, si dovrà moltiplicare x 4 il risultato ottenuto. 10 ng/mL dosati dallo strumento (rientrati nella linearità della metodica) x 4 (fattore di diluizione manuale) = 40 ng/mL (risultato corretto). NB: si deve diluire l'analita con calibratore 0 sangue intero per conservare la matrice simile e per aver la certezza di utilizzare un sangue privo del farmaco in esame. In assenza di Cal-0 usare soluzione fisiologica.

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Diluizione 1 : 2

= (1+1) =

1 parte di Campione + 1 parte di Fisiologica

Diluizione 1 : 3

= (1+2) =

1C + 1F + 1F

Diluizione 1 : 4

= (1+3) =

1C + 1F +

N.B. : il modo migliore per effettuare le diluizioni (ad es 1 : 10 ) sarebbe quello di partire sottraendo al volume maggiore (10 mL di Fisiologica) il volume da diluire (1 mL di Fisiologica) ed infine aggiungere la quantità di Campione da diluire (1 mL di Campioneplasma) mescolando bene prima dell'analisi ( = 1 + 9 ) N.B. : Ricordarsi che esiste un VOLUME FINALE massimo entro il quale deve essere fatta la diluizione affinchè la soluzione stia nella cuvetta di reazione (solitamente circa 1 mL). Dil 1:2 ==> 500 uL C + 500 uL F = 1 mL nella cuvetta Dil 1:3 ==> 300 uL C + 600 uL F = 0.9 mL nella cuvetta Dil 1.10 ==> 100 uL C + 900 uL F = 1 mL nella cuvetta N.B. : Ricordarsi che 1 cm3 (cc) = 1 mL (milli-litri) = 1000 uL (micro-litri) Ricordardi che 1 mm3 (mc) = 0.001 mL = 1 uL

La Soluzione Fisiologica (o soluzione salina) in concentrazione Normale / Molare, è una soluzione contenente il 0,9 % P / V di Na-Cl (cioè circa 9 g/L o 0.9 g/100mL) Esempio pratico : Determinare a quale concentrazione giungo se diluisco 1:10 1 mL di plasma di un paziente diabetico contenente 750 mg/dL di glucosio mantenendo la soluzione finale con lo stesso volume di quella iniziale.  Proporzione diretta 1:10 = x:1000uL ==> x = 1000/10 = 100 uL  Prelevo 100uL di plasma dalla provetta madre, li metto in una provetta figlia e porto a volume (1mL) aggiungendo 900uL di fisiologica.  Concentrazione finale soluzione diluita ==> proporzione diretta M1:V1 = M2:V2 750 mg/dL : 1000uL = x : 100uL ==> x = 750*100/1000 = 75 mg/dL I moderni Analizzatori di Laboratorio effettuano le diluizioni e i calcoli in automatico in base alla linearità del metodo impostato dalla ditta produttrice senza bisogno di manipolare il campione o effettuare calcoli manuali. E' importante sapere che nelle diluizioni manuali la scelta della soluzione per la diluizione è decisiva per l'analisi. Se si diluisce un sangue intero con Acqua Distillata (anziché Fisiologica) si crea l'emolisi del campione per differenza di pressione osmotica. Il globulo rosso infatti scambia sostanze e liquidi attraverso la membrana semipermeabile, si genera una differenza di pressione osmotica, l'acqua tende quindi ad entrare nel globulo rosso per Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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ristabilire l'equilibrio osmotico mentre i sali tendono ad uscire, di conseguenza il globulo rosso scoppia. Il campione non sarà più idoneo per molti test di Biochimica Clinica (vedi Cap. 4.2 Variabilità Pre-analitica legata al prelievo).

5.4

Concentrazioni

La concentrazione di una soluzione ne esprime la composizione quantitativa, o titolo, cioè la quantità di soluto contenuta in una determinata quantità di soluzione o, in alcuni casi, di solvente. A seconda di come si sceglie di esprimere le quantità di soluto e di solvente, la concentrazione di una soluzione può venire espressa in modi differenti, di cui i principali sono i seguenti: La percentuale in peso (% P / P ) indica la quantità espressa in grammi di soluto presente in 100 g di soluzione:

La percentuale in volume (% V / V ) indica la quantità espressa in ml di soluto presente in 100 mL di soluzione (soluto + solvente):

La percentuale in peso/volume (% P / V ) indica la quantità espressa in grammi di soluto presente in 100 mL di soluzione:

La molarità o concentrazione molare ( M ) indica il numero di moli n di soluto disciolte in 1 L di soluzione:

La molalità o concentrazione molale ( m ) indica il numero di moli n di soluto presenti in 1000 g di solvente puro:

La frazione molare (XA) indica il rapporto fra il numero di moli di soluto nA e la somma del numero di moli di soluto e del numero di moli di solvente nB:

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La normalità ( N ) indica il numero di equivalenti, neq, di soluto presenti in un litro di soluzione:

Va rammentato che la definizione di Normalità dipende dalla natura della reazione nella quale è coinvolto il soluto. In generale tra la Molarità (M) e la Normalità (N) di una soluzione esiste la relazione: N = M · v dove v rappresenta il numero di ioni H+ in gioco nella reazione, oppure il numero di elettroni scambiati se si tratta di una reazione di ossidoriduzione. Esempio pratico : In laboratorio abbiamo un matraccio contenente HCl al 37 % P/P in soluzione acquosa (massima concentrazione possibile e con densità 1,19 g/mL). Abbiamo bisogno però per le nostre analisi cromatografiche di crearci 300 mL (0.3 L) di HCl 8 M. Procedere alla diluizione. 

HCl 37 % P/ P = 37g / 100g => trasformiamo %peso in %volume



P/Px d



37g/100g x 1,19g/mL = 0,44 g / mL



concentrazione = 440 g / L e Peso Molecolare HCl = 36,5 g/mole



proporzione diretta 36,5 g : 1 mole = 440 g : x ==> x = 440 / 36,5 = 12 moli in 1L



HCl 37% P/P = HCl 12 M



ora diluiamo fino ad arrivare a HCl 8 M con la formula : M1 x V1 = M2 x V2



Miniziale x Viniziale = Mfinale x Vfinale ==> 12M x xL = 8M x 0,3L ==> x = 8 x 0,3 /12 = 0,2 L



prelevo 200 mL di HCl dal matraccio iniziale (soluzione madre) e li metto in un altro matraccio (soluzione diluita) contenente già 100 mL di H2O distillata

=> (P / P) x (m / V) = P / V

N.B. “mai dar da bere ad un acido” = mettere prima l'acqua e dopo l'acido 

alla fine avremo ottenuto un matraccio contente 0,3 L (300 mL) di HCl 8 M.



12 : 0,3 = 8 : 0,2 ==> 12 = 8 0,3 0,2



alla fine abbiamo fatto una diluizione 1 : 1.5 della soluzione iniziale.

==>

12 = 0,3 8 0,2

==> 1.5

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TECNICHE, METODOLOGIE, CALIBRAZIONI e CONTROLLI DI QUALITA' in Chimica Clinica

6.1

Tecniche Spettroscopiche

Una parte molto importante della Chimica Clinica è basata sullo studio dello scambio di energia (interazioni) tra la radiazione elettromagnetica e la materia. Ogni radiazione, o onda-elettromagnetica, è caratterizzata da i parametri:

Esistono quindi vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d'onda e di conseguenza per la loro frequenza ed energia.

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Alle diverse radiazioni visibili, che differiscono per la loro lunghezza d'onda e di conseguenza per la loro frequenza ed energia, corrispondono i diversi colori. L'analisi spettrofotometrica consiste nella misurazione di radiazioni elettromagnetiche emesse o assorbite delle sostanze in esame. Poiché ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda caratteristica, l’analisi spettrofotometrica è in grado di fornire informazioni sia qualitative che quantitative: L'analisi dello spettro permette di individuare la natura (Qualità) della sostanza in esame Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l'esame di tali spettri permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni noti o tramite banche dati di spettri)

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La misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla Quantità di sostanza analizzata. Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici (calorifici, elettrici, elettro-magnetici,...) possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia e passare a stati energetici più alti (eccitati). Spettroscopia di ASSORBIMENTO (Spettro-Fotometria e Colorimetria) : quando atomi o molecole vengono eccitati da opportune radiazioni elettromagnetiche, passando a stati energetici maggiori Spettroscopia di EMISSIONE (Fluorimetria) : dagli stati eccitati, ritornando allo stato fondamentale, gli atomi e le molecole emettono energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche Per eseguire analisi quantitative si fa uso di raggi monocromatici. Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente in funzione della concentrazione. Appositi dispositivi sono in grado di misurare l'intensità del flusso luminoso ed in particolare:

Se facciamo passare una luce monocromatica di 450 nm (blu) e di una certa intensità (Io) ritroviamo al di là della soluzione una radiazione, sempre verde ma di intensità I minore di Io in quanto una parte della radiazione è stata assorbita dalla soluzione stessa. Tanto minore risulta l’intensità della luce emergente, cioè I ,quanto maggiore è stato l’assorbimento da parte della soluzione. Dalla misura di Io e I gli strumenti forniscono direttamente i valori di TRASMITTANZA e ASSORBANZA, che rappresentano le grandezze caratteristiche della spettroscopia di assorbimento. Il rapporto tra l'intensità del raggio uscente e quella del raggio entrante si chiama TRASMITTANZA: T = I / I0 Questa grandezza esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il campione senza essere assorbita. T può assumere valori compresi tra 0 e 1. L' ASSORBANZA, detta anche densità ottica o estinzione : A = - log T L'assorbanza viene utilizzata nelle analisi quantitative poichè risulta direttamente proporzionale alla concentrazione. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Trasmittanza e assorbanza sono adimensionali (numeri, senza unita di misura). Prendendo in considerazione una cella, contenente una sostanza in soluzione, attraversata da un raggio di luce monocromatica, si dimostra che : A=exlxc dove: A = assorbanza (adimensionale) e = coefficiente di estinzione molare caratteristico della sostanza (mol-1 L cm-1) l = cammino ottico (cm), cioè lo “spessore” della soluzione c = concentrazione della sostanza (mol/L) dunque la concentrazione di una sostanza si ottiene : c =A/ e xl Il fenomeno dell’assorbimento della luce da parte delle soluzioni è definito in termini quantitativi dalla Legge di Lambert e Beer che è alla base dell’analisi chimica quantitativa : se una radiazione monocromatica passa attraverso una soluzione, l’assorbanza subita dalla radiazione è direttamente proporzionale allo spessore e alla concentrazione della soluzione stessa. Nel caso si possa dimostrare linearità fra assorbanza e concentrazione si ha a disposizione un metodo di analisi quantitativo per assorbimento nell’ultravioletto e visibile. La linearità si verifica, di solito, in ristretti intervalli di concentrazione La relazione lineare di proporzionalità tra A e c, in realtà, non è più verificata al crescere della concentrazione; infatti si possono verificare deviazioni dalla legge di Lamber-Beer con scarsa attendibilità del dato analitico. Dunque tale legge è valida per soluzioni diluite: noto il coefficiente di estinzione molare e lo spessore della soluzione, una volta determinata per via strumentale l’assorbanza si può ottenere la concentrazione della soluzione. Validità della legge di Lambert-Beer: la luce incidente e’ monocromatica, l’assorbimento del solvente e’ trascurabile, la concentrazione del campione e’ contenuta entro limiti adatti, non si verificano reazioni chimiche delle molecole del campione fra loro o con il solvente. Gli apparecchi utilizzati per compiere le misure necessarie sono i fotometri (selettore di λ a filtri) o gli spettrofotometri (selettore di λ a prisma o reticolo). Dal punto di vista concettuale uno Spettrofotometro segue il seguente schema:

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Esempio : La Guanosina mostra il massimo di assorbanza a 275 nm. Sapendo che ε275 = 8400 M-1 cm-1 e lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 1 cm calcolare la concentrazione di una soluzione di tale sostanza se lo spettrofotometro legge A275 = 0.70 Applichiamo la legge di Lambert-Beer: A = ε x l x c e sostituendo i valori si ha: 0.70 = 8400 M-1 cm-1 x 1 cm x c Da cui c = A / ε x l Da cui c = 8.33 x 10-5 M (concentrazione molare)

6.2

La curva di taratura

È la premessa a qualsiasi metodica di laboratorio. È la rappresentazione grafica della assorbanza (o densità ottica) in funzione della concentrazione della sostanza in esame. Si costruisce effettuando una serie di misurazioni con concentrazioni note a scalare della sostanza e, conoscendo le corrispondenti assorbanze, si ottiene, in un sistema di assi cartesiani, una retta, definita retta di interpolazione; questa è una risposta lineare. Abitualmente si procede nella costruzione di una retta di taratura: viene misurata l’assorbanza di soluzioni a titolo noto e si riportano in grafico tali punti sperimentali ponendo in ascissa la concentrazione e in ordinata l’assorbanza. Se la soluzione è diluita tali punti si allineano lungo una retta che costituisce la retta di taratura anche detta retta di lavoro: la concentrazione di una soluzione incognita (Conc campione X ) viene determinata per interpolazione conoscendone l’assorbanza. Una volta stabilite la retta o curva di interpolazione, è possibile misurare tutti i campioni con concentrazioni comprese tra i due limiti, mediante il metodo grafico, ovvero tracciando rette perpendicolari, e mediante il metodo algebrico (proporzione diretta) Concentraz camp : Concentraz standard = Assorbanza camp : Assorbanza standard Una volta che il detector dello spettrofotometro ci determina l'Assorbanza del campione noi possiamo fare il seguente calcolo : Cc = (Cst x Ac) / Ast Se l'assorbanza del campione in esame cade al di fuori dei limiti si possono operare delle diluizioni (vedi Paragrafo. 5.3 DILUIZIONI) e in tal caso il risultato dovrà essere moltiplicato per quanto è stato diluito. Dunque con il termine Calibrazione si intende la sequenza d’operazioni necessarie a stabilire, in determinate condizioni sperimentali, la relazione tra i valori forniti da uno strumento o sistema di misurazione (per es. assorbanza) ed i valori ad essi corrispondenti di un parametro (per es. concentrazione) di uno o più materiali di riferimento. Il risultato della calibrazione è espresso, in genere, come fattore di calibrazione, o come una serie di fattori di calibrazione in forma di curva di calibrazione. La curva di taratura / calibrazione definisce, pertanto, i limiti di utilizzazione, ovvero il range di Linearità del Metodo. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Per Intervallo di Lettura si intende il valore minimo e il valore massimo entro i quali la linearità del metodo offre garanzie sulla affidabilità del dato analitico strumentale riferito al campione in analisi. Per Linearità del Metodo si intende l'ambito di concentrazioni di analiti il cui valore finale quantificato dallo strumento è proporzionale alla quantità da misurare. Tali valori posso oscillare in alcune condizioni patologiche in un range molto ampio e superare l'ultimo punto di concentrazione di una curva di calibrazione. Quando i valori ottenuti sono superiori al Limite di Linearità del metodo sia superiore (ultimo punto della curva calibrazione) che falsamente inferiore (punto 0-bianco cuvetta), occorre diluire il campione, ripetere la misura (facendola rientrare nel range di linearità) ed infine moltiplicare il risultato X il fattore di diluizione. La Linearità del metodo deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99.

I moderni Analizzatori di Laboratorio hanno limitato fortemente le variabili che possono modificare la condizioni analitiche nel tempo (temperatura di esercizio, precisione nella dispensazione di campione e reagente, tenuta sotto controllo di tempi di incubazione, temperatura e condizioni di conservazione e stabilità dei reagenti, emissione della fonte luminosa e sicurezza nell’utilizzo delle λ), permettendo l’esecuzione di molte metodiche contemporaneamente (random access). La frequenza di calibrazione è definita dal fornitore della strumentazione e può essere in funzione della stabilità dei reattivi a bordo macchina. L’operatore può decidere di calibrare con frequenza diversa o al bisogno in caso di mutate condizioni strumentali (es. sostituzione lampada o reagente) o in seguito a mal funzionamenti dell’apparecchio. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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6.3

Controlli di Qualità (cenni di Accreditamento e Certificazione)

Terminate le calibrazioni e prima di procedere all'analisi dei campioni prelevati dai pazienti è necessario eseguire i Controlli di Qualità Interni. Il controllo di qualità interno valuta in tempo reale la stabilità del sistema analitico. E’ d’obbligo la sua valutazione per la validazione della seduta analitica. Il QC è un’attività fondamentale per assicurare l’ affidabilità dei referti di laboratorio. La risposta del laboratorio deve essere attendibile per permettere una diagnosi e trattamento adeguato. L' attendibilità analitica è la proprietà complessiva di un metodo/sistema per cui le misurazioni si discostano poco o molto dal valore vero. Il CQI e’ un controllo statistico con cui analizzare le deviazioni dalla norma di una misura, consentendo di valutare se la variabilità rimane entro limiti accettabili. Il CQI è lo studio degli errori (dal ricevimento del campione alla refertazione), che rientrano nella responsabilità del laboratorio e della procedura utilizzata. (Vedi Cap. 4.3 Variabilità Analitica) Secondo James Westgard i principi della gestione, assicurazione e controllo della qualità sono divenuti elementi fondanti la gestione dei laboratori clinici. L'attenzione alla qualità si è concentrata prevalentemente sulla fase analitica e quindi sulla qualità del processo analitico. La qualità analitica si basa su due capisaldi:  Il controllo Interno di qualità : CQI  La Verifica Esterna di qualità : VEQ I due sistemi non sono alternativi, ma integrativi.

CQI : Controllo Interno di Qualità è la determinazione quotidiana, in ogni serie analitica, di campioni di controllo, aventi concentrazione nota di analita, e successivo confronto fra i valori osservati e i valori noti. Questi ultimi rappresentano un intervallo di valori “accettabili” definiti da un limite superiore ed uno inferiore riconosciuti solitamente con + / - 2 DS a seconda del metodo di analisi. E’ necessaria l’osservazione attenta delle Carte di Controllo per individuare spostamenti significativi nella distribuzione tipica dei dati (shift della media improvvisi o graduali) ed inoltre un aumento della dispersione dei dati (incremento dell’errore casuale, imprecisione) che provocheranno un aumento degli allarmi (superamento frequente dei limiti di controllo). Le frequenze sperimentali dei limiti adottati nelle carte di controllo devono essere in linea con il modello teorico utilizzato poiché la variabilità casuale delle misure è, per definizione, gaussiana, la distribuzione dei dati di controllo è simmetrica e a forma di campana. Per descrivere questa distribuzione sono sufficienti due parametri, la media e la deviazione standard, inoltre in questa distribuzione gli indici di tendenza centrale media, moda e mediana, coincidono. Le proprietà della distribuzione sono tali che è possibile calcolare la percentuale teorica dei valori compresi fra il valore medio ± n DS, cioè ) : - entro ± 1 DS sono compresi circa il 68,3% dei dati - entro ± 2 DS sono compresi circa il 95,5% dei dati - entro ± 3 DS sono compresi circa il 99.7% dei dati Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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* (Linee guida sulla gestione dei programmi di Controllo di Qualità Interno. Documento preparato a cura del Gruppo di Lavoro SIBioC: “Linee guida sul controllo di qualità interno”. Aprile 2008.)

Le carte di Levey-Jennings si utilizzano come carte di controllo per il monitoraggio della precisione e della accuratezza. Queste sono strumenti grafici nei quali i valori osservati sono disposti in rapporto al tempo a seconda della frequenza della determinazione (ora, giorno, settimana). I valori noti sono rappresentati con un intervallo di accettabilità definito da un limite superiore ed uno inferiore di controllo stabiliti precedentemente con l'analisi statistica (solitamente +/- 2 DS). E' necessario un periodo preliminare durante il quale raccogliere i dati (almeno 20, meglio 40) per costruire il grafico di Levey e Jennings che rappresenterà, da quel momento in poi, il riferimento per la accettazione dei dati successivi.

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Carte di Controllo Radar :

Il campione di controllo deve essere stabile nel tempo, avere una composizione chimica e fisica simile ai campioni da esaminare, essere disponibile con più livelli (almeno 2) di concentrazioni. Il CQI può essere fornito dalla ditta fornitrice dell'analizzatore, dalla ditta fornitrice dei reagenti necessari al funzionamento dello strumento oppure da una ditta esterna specializzata. Per ottimizzare il potere statistico di evidenziare i casi di rigetto della serie analitica minimizzando i falsi allarmi si utilizzando le Regole di Westgard. Sono regole e metodi per garantire un buon compromesso fra la probabilità di rigettare una serie analitica per la presenza di valori sospetti e la probabilità di evitare falsi allarmi.

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Le più comuni azioni da intraprendere in caso di violazione delle regole di Westgard sono:  esecuzione di una nuova calibrazione,  sostituzione dei reagenti e ri-calibrazione,  taratura degli strumenti volumetrici (es pipette),  manutenzione ordinaria dei sistemi di rilevazione eseguita dal TSLB in turno,  manutenzione straordinaria eseguita dalla ditta fornitrice/produttrice,  sostituzione o ricostituzione di calibratori e/o controlli

VEQ : Verifica Esterna di Qualità è un esercizio di qualità con il quale il laboratorio confronta la propria capacità analitica con quella di altri laboratori. Questo controllo si basa sull’analisi, da parte del laboratorio aderente, di campioni biologici a concentrazione incognita provenienti da una Struttura Esterna Certificata che organizza la VEQ. I controlli devono essere opportunamente preparati e quantificati con metodi di riferimento assoluti gold-standard (es. GC-MS, LC-MS/MS) a cura dell’organizzatore. Le VEQ vengono poi distribuite a tutti i laboratori partecipanti che le debbono analizzare specificando il metodo con cui le analizzano e scrivendo il valore che la strumentazione in dotazione fornisce. I dati vengono spediti dal laboratorio partecipante alla ditta organizzatrice dove vengono raccolti ed elaborati statisticamente. Infine i risultati vengono inviati ai laboratori partecipanti. Ogni risultato e’ valutato in rapporto ad un valore target :  VALORE di CONSENSO (mediana, o media escludendo out-liers)  VALORE di RIFERIMENTO (ottenuto con metodiche di riferimento da laboratorio di riferimento) Le caratteristiche del programma VEQ sono : • il pannello di analiti deve essere ampio così da poter monitorare il maggior numero di costituenti/test • La frequenza di controllo non e’ elevata: il programma VEQ non sostituisce quello QIC; • La frequenza di rielaborazione dei dati deve essere tale da permettere eventuali azioni correttive, le informazioni non sono fornite in tempo reale, ma rappresentano la “fotografia ” retrospettiva delle prestazioni del lab rispetto agli altri in un determinato momento Gli obiettivi del programma VEQ sono : • Monitoraggio delle prestazioni analitiche di un lab o un test in termini di scostamento del risultato dal valore target: esattezza • Confronto e valutazione dei metodi e dei sistemi diagnostici in termini di variabilità interlab (CV %), DS, e valori di consenso • Supportare il CIQ.

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E' fondamentale ricordare che :  Ogni tecnica (strumento della ricerca scientifica) e ogni metodo (insieme di procedure) di laboratorio necessita, prima di ogni analisi su campioni, di CALIBRAZIONE e CQI.  Il laboratorio presso il quale si eseguono le analisi deve essere ACCREDITATO. Accreditamento Istituzionale per tutte le strutture che vogliono erogare prestazioni in nome, per conto ed a carico del SSN = conferimento oggettivo di credito, valore, qualità assegnato da un soggetto esterno all'Ente che chiede di essere accreditato. In Italia esistono più Enti di accreditamento. Il SINCERT accredita gli Organismi di certificazione, il SINAL accredita i Laboratori. L’accreditamento di un organismo di certificazione è il riconoscimento formale della idoneità ad effettuare la certificazione di prodotti e/o di Sistemi di Qualità. L’accreditamento di un laboratorio è il riconoscimento formale della idoneità ad effettuare specifiche prove o determinati tipi di prova. Ad esempio, l'accreditamento ISO/IEC17025 applica criteri e procedure specifiche per determinare la competenza tecnica di un laboratorio, cioè determina competenze tecniche specifiche.  Il laboratorio presso il quale si eseguono le analisi dovrebbe essere CERTIFICATO. Certificazione = atto mediante il quale una terza parte indipendente dichiara che un determinato prodotto, processo o servizio è conforme ai requisiti di una specifica norma. Ad esempio, la certificazione ISO 9001 di un'azienda dichiara la conformità ai requisiti della norma UNI EN ISO 9001:2000 e riguarda principalmente la gestione generale, i processi e la manipolazione dei dati. Accreditamento e Certificazione sono gli strumenti in grado di dare valore aggiunto al nostro SSN. Essi, sebbene uno risponda a criteri di obbligatorietà e l’altro a criteri di volontarietà, non sono discordanti fra loro ma complementari perchè si basano su principi comuni: miglioramento, innovazione, soddisfazione delle parti interessate, crescita professionale del personale, valutazione dei risultati e degli obiettivi, erogare prestazioni efficaci, uso dei sistemi di gestione, uso di indicatori e di eventi sentinella per il monitoraggio e prevenzione/correzione.

6.4

Tecniche ottiche

Tutte le tecniche d’analisi ottiche si basano sul fatto che tutte le sostanze sono composte da molecole che assorbono elettivamente alcune radiazioni a determinate lunghezze d’onda. Il fenomeno dell’assorbimento delle radiazioni luminose per una soluzione dipende dalla concentrazione delle molecole che costituiscono i centri di assorbimento della sostanza (analita) disciolta. Quanto maggiore è il numero di queste molecole (maggiore concentrazione dell'analita), maggiore sarà l’assorbimento delle radiazioni incidenti. Il fenomeno dell’assorbimento della luce da parte delle soluzioni è definito in termini quantitativi dalla Legge di Lambert–Beer (vedi Paragrafo 6.1). Le tecniche ottiche principali che si basano su questo principio sono la fotometria e la spettrofotometria. Queste sono misure dell’assorbimento da parte del materiale in esame di radiazioni luminose incidenti, di caratteristiche spettrali ben definite, in genere comprese tra 220 e 800 nm. Per ogni sostanza è possibile determinare uno spettro o curva d’assorbimento che dipende dal numero delle molecole in esame. L’analisi fotometrica diretta avviene quando si studiano sostanze che presentano uno spettro di assorbimento naturale come le porfirine e la bilirubina. L’analisi fotometrica indiretta avviene quando si studiano sostanze che necessitano la trasformazione in un derivato foto-assorbente. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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6.4.1 FOTOMETRI E SPETTROFOTOMETRI I fotometri servono per studi dell’assorbimento nella regione del visibile, mentre gli spettrofotometri permettono studi anche monocromatici e nell’infrarosso ed ultravioletto. Entrambi i due sistemi sono composti da:      

Sorgente di luce policromatica. Lente collimatrice. Filtro o un monocromatore. Cella o cuvetta di lettura. Lente che focalizza la luce trasmessa su un sistema fotometrico. Un sistema foto-rilevatore.

La spettrofotometria per i dosaggi enzimatici è una tecnica che ci permette di studiare anche l’attività enzimatica, come quantità di substrato consumato o quantità di prodotto ottenuto. Le metodiche end-point enzimatiche utilizzano come reattivo un enzima che ha come substrato proprio l’analita da dosare; a partire da questa reazione si sviluppa, al termine del dosaggio, un prodotto colorato, direttamente o in seguito a reazioni successive. Esempi :  Piruvato + NADH + H+ (OX)==> Lattato + NAD+ Si misura l’attività della LDH, registrando il decremento di assorbanza a 340 nm, dato dall’ossidazione del NADH.  Chetoglutarato + Alanina ==> Glutammato + Piruvato Piruvato + NADH + H+ (OX)==> Lattato + NAD+ Il decremento di assorbanza fornito da NAD+ è funzione del substrato Piruvato presente, la cui concentrazione è funzione dell’attività transaminasica ALT.  Creatinin-P + ADP ==> ATP + Creatina Piruvato + ATP ==> Fosfoenolpiruvato + ADP (mediante PK) Piruvico + NADH + H+ (OX)==> Lattato + NAD+ (mediante LDH) Si misura la quantità di CPK presente nel siero di un paziente. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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 Glucosio: reazione enzimatica end-point; lettura finale a 510 nm Glucosio + O2 ==> ac. gluconico + H2O2 2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenolo ==> chinonimina (rosso) + 4 H2O Il colore rosso sviluppato e proporzionale al contenuto di Glucosio nel campione. La Spettrofotometria con metodiche non enzimatiche end-point si basa sullo sviluppo di un prodotto colorato, da leggere al termine del dosaggio, a partire da una reazione chimica con l’analita da dosare; tra questi vi sono: bilirubina, Fe, Ca, Pho  fosforo: reazione non enzimatica con lettura finale a 650 nm fosforo + molibdato di ammonio ==> acido fosfomolibdico acido fosfomolibdico + solfato ferroso ==> blu di molibdato Il colore sviluppato e proporzionale al contenuto di Fosforo nel campione. 6.4.2 FLUORIMETRIA La fluorimetria si basa sulla proprietà di alcune sostanze di assorbire energia di una data lunghezza d’onda e di emetterne un'altra a lunghezza d’onda maggiore (fluorescenti). Se la sostanza da dosare non è fluorescente, la si marca, con ad esempio la fluoresceina Sono fluorescenti le sostanze che assorbono radiazioni elettromagnetiche ad una data λ (luce eccitante EX) e riemettono in tempi brevi radiazioni a λ superiore (luce fluorescente di emissione EM). La sensibilità di tali metodiche è 1000-10000 volte superiore ai metodi fotometrici. La rilevazione di sostanze attraverso fluorimetri è molto usata il HPLC. Misura della fluorescenza diretta: la sostanza da determinare e auto-fluorescente in determinate condizioni (es. barbiturici, porfirine) Misura della fluorescenza indiretta: la sostanza diventa fluorescente in seguito a reazioni con determinati reagenti(Vit B1, B6, B2, Antifungini)

6.4.3 TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA Uso di una radiazione monocromatica che irradia un sistema disperso, formato cioè da particelle solide disperse in un mezzo disperdente liquido (sospensioni semplici, soluzioni colloidali). Si osservano fenomeni di diffusione della luce che possono essere sfruttati a fini analitici, per la determinazione quantitativa del materiale in sospensione. Affinchè questi fenomeni di diffusione della luce possano essere utilizzati a fini analitici, occorre che si verifichino alcune condizioni necessarie: Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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  

radiazione monocromatica o anche policromatica (intervallo ristretto di 40-50 nm); sospensioni stabili, senza fenomeni di sedimentazione durante le letture mezzo disperdente e particelle sospese devono avere indici di rifrazione abbastanza diversi Quando una radiazione luminosa attraversa una sospensione di particelle finemente disperse, si potranno avere o fenomeni di ASSORBIMENTO di una parte della radiazione, o di DIFFUSIONE (riflessione, rifrazione, diffrazione). Se prevale il fenomeno di assorbimento della luce (quando la dimensione delle particelle che provocano torbidità e dell'ordine o superiore al micrometro), si ricorre alla turbidimetria. Rapporto tra assorbimento e concentrazione della sostanza in sospensione che segue abbastanza bene la legge di Lambert-Beer. Uso di un fotometro o spettrofotometro per la rilevazione. Metodo non particolarmente preciso ed accurato. Dosaggio proteine del siero e delle urine.

Se si è in presenza di particelle di più piccole dimensioni (dell'ordine di decine o centinaia di nm), si utilizza la nefelometria. Misura della diffusione della luce dalla sospensione in una direzione a 90° rispetto a quella della radiazione incidente (fotometri o spettrofotometri). Presenta elevati livelli di sensibilità e può essere anche molto precisa. L'intensità della luce dispersa diventa funzione lineare della quantità di particelle in sospensione (Legge di Rayleigh, I = KxN). Utilizzata per dosaggi lipoproteine, amilasi, lipasi sieriche e proteine urinarie.

6.4.4 FOTOMETRIA D'EMISSIONE Questa studia le radiazioni caratteristiche emesse dalle molecole, dagli ioni o dagli atomi, legati ai processi di eccitazione. È impiegata per o studio di concentrazioni dei metalli : Co, Cr, Cd, Mn, Fe, Pb, Cu. La spettrofotometria di assorbimento atomico è una tecnica che permette di eseguire analisi di metalli sia quantitative, sia qualitative, su un campione solido o in soluzione. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Quando un atomo viene posto nelle condizioni di acquistare energia elettromagnetica di intensità adeguata, uno o più elettroni possono abbandonare gli orbitali nei quali si trovano per venire promossi ad orbitali più ricchi di energia. Di conseguenza l'atomo passa dallo stato energetico fondamentale a un livello energetico più ricco di energia e quindi meno stabile (stato eccitato). Da questo stato eccitato l'atomo ricade rapidamente allo stato fondamentale, restituendo all'ambiente l'energia appena acquisita. La variazione dell'energia è data dalla costante di Planck per la frequenza, la quale è uguale alla velocità della luce fratto la lunghezza d'onda: E = h*v = h *c / λ Dato che ogni atomo dispone di un proprio numero di elettroni, situati su determinati orbitali, è possibile registrare spettri di assorbimento atomico caratteristici costituiti da una serie di righe. Ogni riga corrisponde ad un salto energetico ovvero all'energia assorbita per passare da un livello all'altro. Ogni riga è a lunghezze d'onda caratteristiche per ogni metallo ed è per questo possibile l'identificazione qualitativa. L'intensità di energia assorbita è proporzionale al numero di atomi che passa dallo stato fondamentale a quello eccitato. E' per questo possibile la determinazione qualitativa. Poi è possibile effettuare misure quantitative applicando la Legge di Lambert-Beer e calibrazioni specifiche. Uno spettrometro di assorbimento atomico si compone di 5 componenti fondamentali: I) La sorgente di radiazione elettromagnetica è data da una lampada a catodo cavo (Hollow Cathode Lamp, HCL) la quale emette con uno spettro molto ristretto e caratteristico dell'elemento II) Il sistema di atomizzazione è il sistema mediante il quale il campione in analisi, e quindi i metalli da ricercare, viene ridotto allo stato di gas monoatomico, condizione necessaria per misurare la differenza di intensità della radiazione elettromagnetica prima e dopo. Esistono vari tipi di sistemi di atomizzazione:  Atomizzazione mediante fiamma, che sfrutta la temperatura di una fiamma aria-acetilene oppure protossido di azoto-acetilene, molto più calda oppure aria-idrogeno, in cui viene nebulizzato il campione.  Atomizzazione mediante fornetto di grafite, che sfrutta le alte temperature raggiunte da un tubicino di grafite alle cui estremità viene applicata una forte differenza di potenziale. III) Il sistema ottico e il monocromatore, è un sistema di lenti e specchi che serve per collimare, indirizzare e gestire la radiazione proveniente dalla lampada e in uscita dal campione. Il monocromatore serve per rendere la radiazione elettromagnetica il più possibile monocromatica prima di inviarla al rivelatore. IV) Il rivelatore, è un foto-elettrodo che sfrutta la proprietà particellare della luce per evidenziare una radiazione incidente su un elettrodo mediante una differenza di potenziale; talvolta si ricorre ad un foto-moltiplicatore che moltiplica di molte volte il segnale originale permettendo una migliore interpretazione (a discapito di parte dell'accuratezza analitica) V) Il sistema di elaborazione, che serve per il calcolo e il salvataggio dei dati (PC)

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6.5

Tecniche immuno-analitiche

L’Immunometria comprende tutte le tecniche che utilizzano una reazione Ab-Ag per misurare la concentrazione di un dato analita. Tra di esse alcune utilizzano isotopi radioattivi, altre utilizzano reazioni colorimetriche o reazioni enzimatiche. Il complessi AbAg possono essere sia in fase liquida che su supporto; gli Ab, a loro volta, possono essere monoclonali o policlonali. 6.5.1 RIA (Radio Immuno Assay) È di largo impiego per il dosaggio di ormoni ed altre sostanze di interesse (TST, DHEA, ferritina, antigeni virali, CEA). La condizione essenziale è la disponibilità di un antigene identico a quello che si vuole misurare, marcato con un radioisotopo. Questa tecnica si basa sulla competizione tra un antigene freddo ed una quantità limitante di corrispondente antigene marcato, per il legame con un numero limitato di siti anticorpali presenti in una quantità costante d’antisiero. All’equilibrio, in presenza di un eccesso di antigene, ci saranno sia antigeni liberi che antigeni legati. La quantità di antigene marcato all’anticorpo diminuirà con l’aumento dell’antigene freddo nel campione. Allestendo una curva di taratura, ponendo in ascissa quantità note e crescenti di antigene da dosare ed in ordinata il segnale radioattivo, dato il complesso Ab-Ag, sarà possibile risalire alle concentrazioni incognite dell’analita nei vari liquidi biologici. All’aumentare della concentrazione dell’analita diminuirà la radioattività del complesso, essendo la quantità dell’antigene da dosare crescente e la quantità di antigene marcato e di anticorpo uguale in tutte le prove. Negli antigeni proteici il gruppo fenolico di un residuo di tirosina marcato con Iodio125 che Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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emette Raggi Gamma; gli apteni non proteici sono normalmente marcati con 3H+.

6.5.2 IRMA (Immuno-Radiometric-Assay) Prevede l’utilizzo di antisieri marcati che reagiranno con il campione fino a marcare tutto l’antigene. Il conteggio della radioattività determinerà la misura diretta dell’antigene presente. È questa la principale differenza con RIA, perché in questo caso la proporzionalità tra radioattività e concentrazione di antigeni è diretta, mentre nel RIA è inversa ed è un procedimento che si basa sulla competizione. Si effettua il dosaggio diretto degli anticorpi marcati. Usata per dosaggio Cromo-A e GH. 6.5.3 Western Blot Serve per calcolare la quantità relativa ed il peso molecolare di una proteina contenuta in una miscela di proteine. Usata per ricerca mutazioni geni e DNA o RNA virali. L’antigene è sottoposto a separazione elettroforetica dagli altri. Le proteine sono trasferite (blotting) dal gel su una membrana di nitrocellulosa. La posizione dell’antigene sulla membrana è visualizzata mediante legame di un anticorpo radiomarcato o coniugato con un enzima mediante una reazione con un substrato cromogeno specifico.

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6.5.4 IF (Immuno-fluorescenza) L’immunofluorescenza è una delle tecniche più usate per rilevare in un certo campione la presenza di antigeni o anticorpi la cui controparte nota è variamente legata ad un marcatore. Il marcatore è un fluorocromo, ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (ultravioletti) emette nel visibile. Il fluorocromo più impiegato è l'isotiocianato di fluorescina che, assorbendo raggi ultravioletti con l'ausilio di un microscopio a fluorescenza, emette luce verde. Esistono due principali metodiche che utilizzano il principio dell'immunofluorescenza, quella diretta e quella indiretta. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto la presenza di anticorpi contro l'antigene. IFMA (immuno fluorometric assay) è usata per determinare IgE specifiche (RAST per allergie) ed EMA per celiachia.

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6.6

Tecniche Immuno-enzimatiche (EIA)

Queste tecniche sfruttano la possibilità di coniugare anticorpi con alcuni enzimi; il legame enzima-Ab è svelato aggiungendo il substrato ed i reattivi necessari per la reazione catalizzata; il prodotto terminale deve essere colorato e la sua concentrazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita. Allestendo una curva di calibrazione è possibile determinare le concentrazione incognite dei nostri campioni in esame. 6.6.1 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Metodo d'analisi immunologica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più anticorpi ai quali è legato un enzima. Le reazioni sono eseguite in pozzetti, al cui interno vengono fatti aderire antigeni o anticorpi noto. Vanno inseriti, poi, gli analiti e dopo i lavaggi necessari, i complessi Ab-enzima. La positività della reazione dell’enzima al substrato si appalesa per la comparsa di un prodotto di reazione colorato, quantizzato mediante spettrofotometria. Ci sono diverse varianti del test ELISA, che si differenziano a seconda del componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto la presenza di anticorpi contro l'antigene. Il saggio può essere competitivo o non competitivo. L'ELISA non competitivo diretto si effettua secondo diverse metodiche: semplice e sandwich. Usata per dosaggi leptina, resistina, pro-insulina.

6.6.2 FEIA (fluorescence enzyme immunoassay) L'esame è un immunodosaggio d'enzima fluorescente ed è progettato sotto forma di immunodosaggio "sandwich". Un well viene rivestito con un antigene specificamente riconosciuto dagli anticorpi bersaglio, che rappresentano i marcatori per una determinata malattia autoimmune. Se sono presenti questi specifici anticorpi nel campione ematico del paziente, si legheranno all'antigene. Nella successiva fase di reazione, un anticorpo secondario coniugato all'enzima si lega all'anticorpo bersaglio già legato all'antigene. L'enzima trasforma un substrato aggiunto in un prodotto fluorescente. Confrontando il segnale della fluorescenza con quello di calibratori di concentrazioni note, può essere determinata la concentrazione anticorpale nel campione dell'esame. Usato per Ana-screening e Ab autoimmuni. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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6.6.3 ACMIA (antibody conjugated magnetic immunoassay) E' un test diagnostico in vitro finalizzato alla misurazione quantitativa dei farmaci nel sangue intero umano. Si tratta di un metodo automatizzato che impiega una tecnica di immunodosaggio in cui il coniugato anticorpo-enzima legato al farmaco e il coniugato libero vengono separati mediante particelle magnetiche al Cromo. Il sistema miscela e lisa il campione di sangue intero. Il campione lisato viene, quindi, miscelato con il coniugato anticorpo-enzima (Ab-β-gal). Il farmaco presente nel campione viene legato dal coniugato e separato magneticamente dal reagente anticorpo-enzima libero in eccesso attraverso l’aggiunta di particelle magnetiche rivestite del farmaco in esame. In seguito alla separazione, il supernatante contenente il complesso farmaco-anticorpo-enzima viene trasferito in un’altra cuvetta e miscelato con il substrato (CPRG). La β-galattosidasi catalizza l’idrolisi del CPRG producendo CPR (rosso clorofenolo) che assorbe la luce a 577nm. La variazione dell’assorbanza è direttamente proporzionale alla quantità di farmaco nel campione in esame e viene misurata mediante una tecnica di cinetica bicromatica (577, 700 nm). Tecnica usata per il Therapeutic Drug Monitoring (es. per immunosoppressori come tacrolimus e cyclosporina). 6.6.4 EMIT (enzyme multiplied immunoassy technique) Tecnica basata sulla competizione per il sito anticorpale legato all'analita target. La marcatura dell'antigene Ag (farmaco/droga) avviene per opera di un enzima ad alta specificità. Quando Ag marcato con enzima si trova in presenza di Ab specifico si ha la formazione del complesso Ag-Ab-enzima. Se il campione in analisi contiene un Ag (drug) libero attivo entrerà in competizione con le molecole marcate con enzima rimuovendo il complesso Ag-enzima per fissarsi al suo posto sull' Ab. L'enzima (Glu6-PDH) a questo punto libera il suo sito attivo e reagisce col substrato aggiunto (Glu-6-P) con conseguente variazione della densità ottica letta mediante spettrofotometro. Usato in particolare per rintracciare droghe d'abuso su urina. Nel siero si possono rilevare teofillina, fenitoina, fenobarbital, carbamazepina, valproato e metotrexato.

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6.7

Immuno-luminescenza (LIA)

L’illuminescenza è il fenomeno di emissione di luce da una molecola in seguito al passaggio da uno stato elettronico eccitato allo stato fondamentale. Questo procedimento è legato al reazioni esoergoniche, che cedono energia al sistema, come l’incubazione del composto adatto con H2O2. La sensibilità è paragonabile a quella del RIA, ma la specificità risulta inferiore. 6.7.1 ICMA (chemiluminescent microparticle immunoassay) E' una tecnica sandwich non competitiva dove la quantità di segnale emesso è direttamente proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. Usata per dosaggio sierico di insulina, PSA, B2-microglobulina, 17OH-Vit.D, 17Bestradiolo, ACTH, AFP, C-peptide, calcitonina, DHEAs, gastrina.

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6.7.2 ECLIA (elettro chemi luminescenza) Lo sviluppo di ECL è basato sull'uso di un complesso di rutenio e tripropilammina (TPA). La reazione di chemiluminescenza per la rilevazione del complesso reazione viene iniziata mediante l'applicazione di una tensione di corrente alla soluzione campione risultante in una reazione controllata con precisione. La tecnologia ECL può ospitare molti principi di immunodosaggio pur fornendo prestazioni superiori. Usata per dosare su siero CK-MB, TNT-hs, Myo, PCT.

6.8

Tecniche Elettroforetiche

Principio : migrazione attraverso un mezzo liquido e/o solido e sotto l’impulso di un campo elettrico, di particelle dotate di cariche, ioni o polielettroliti. Molte molecole biologiche (aa, peptidi, proteine, DNA,RNA) hanno gruppi ionizzabili e pertanto ad un determinato pH esistono in soluzione come specie cariche elettricamente, cationi (+) e anioni (-). L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica. I cationi (+) migreranno verso catodo- mentre gli anioni (-) verso anodo+ ad una velocità che dipende dall'equilibrio tra la forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti (frizionali del gel ed elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo circostante. Il supporto deve essere sempre in contatto col tampone di corsa. Quindi, la migrazione è DIRETTAMENTE proporzionale alla carica (z) netta di una molecola , (che dipende dal proprio punto isoelettrico e dal pH del mezzo), ed INVERSAMENTE proporzionale alle dimensioni (m). Questo è uno studio semiqualitativo e semi-quantitativo, perché non si determina specificamente una sola molecola ma gruppi di proteine (o famiglie). Comunemente si esegue una siero-elettroforesi impiegando un tampone a pH alcalino (basico) il quale conferisce alle molecole proteiche una carica negativa (anioni -) rendendole solubili senza sottoporle a denaturazione.

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6.8.1 Elettroforesi su acetato di cellulosa Le separazioni elettroforetiche delle siero proteine vengono quasi sempre eseguite su supporti solidi che funzionano come setacci molecolari cioè dei fogli sottili come acetato di cellulosa, gel di agarosio, gel di poliacrilamide. Queste separazioni elettroforetiche vengono poi evidenziate mediante una colorazione specifica (Rosso Ponceau S , Blue di Comassie, etc). Il campione di siero viene deposto sulla superficie del supporto di acetato di cellulosa che è imbibito del tampone di corsa e successivamente viene applicata una differenza di potenziale (ddp). Il pH basico del tampone determina la carica (-) delle molecole che si separano verso anodo+ secondo il loro rapporto m/z e l’attrito del gel che incontrano nel muoversi. L’ analisi viene condotta in circa 15’. In questo tracciato elettroforetico normale si trovano diversi picchi e curve che danno origine a 6 frazioni (da sinistra a destra): il primo più alto e stretto corrisponde alla banda dell’albumina, seguono poi la banda α1, la banda α2, la banda β1, la banda β2 e la banda gamma. La banda dell’albumina è in posizione anodica+ ed è quella con maggiore mobilità elettroforetica mentre la banda gamma è in posizione catodica- ed è la più lenta. Al termine della corsa elettroforetica vi è un densitometro (spettrofotometro) in grado di misurare la trasmissione della luce attraverso una striscia colorata anziché attraverso una soluzione contenuta in una cuvetta. La striscia viene posta su un apposito carrello trasportatore che avanza a velocità costante di fronte al fototubo in modo che lo spettrofotometro possa leggere le diverse strisce. Il densitometro dà le percentuali delle diverse frazioni proteiche su un display digitale; se è collegato ad un registratore si ottiene un grafico avente in ordinata i valori dell'assorbanza ed in ascissa la posizione delle bande. Il densitometro è stato oramai sostituito dal computer, che mediante un programma specifico effettua la lettura della striscia elettroforetica e ne elabora poi il grafico.

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6.8.2 Elettroforesi Capillare (CE) L’elettroforesi avviene all’interno di un tubo (capillare) stretto, di solito realizzato in silice fusa o teflon, avente diametro interno nel range di 25-75 μm e diametro esterno di 350-400 μm, rivestito da uno strato protettivo di poliamide che lo rende resistente ma anche maneggevole. Questo tipo di realizzazione permette di minimizzare i problemi derivanti dallo sviluppo di calore che, tradizionalmente, limitano le tecniche elettroforetiche, in quanto causa di gradienti di temperatura non uniformi, cambiamenti locali di viscosità e conseguenti zone allargate. Il calore generato dal passaggio della corrente elettrica causa un aumento di temperatura che è funzione delle dimensioni dei capillari, della conduttività del buffer e della tensione applicata. È possibile ottenere alte efficienze di separazione utilizzando campi elettrici elevati (nel range 100-500 V/cm). La lunghezza del capillare non influisce sull’efficienza del processo, ma gioca un ruolo importante sul tempo di migrazione e quindi sulla durata dell’analisi. La situazione ideale consisterebbe nell’applicare un potenziale il più alto possibile, utilizzando un capillare il più corto possibile. Il funzionamento di una apparecchiatura per elettroforesi capillare è il seguente: una piccola quantità di soluzione contenente il campione (10 uL) viene iniettata nel capillare, che contiene un buffer appropriato, dall’estremità anodica+. Per effettuare la separazione viene applicata una differenza di potenziale tra le due estremità del capillare. All’interno del capillare, oltre all’attrazione dei poli sulle molecole di segno opposto, si ha un flusso elettro-osmotico (EOF) verso il catodo-. Ulteriore beneficio derivante dalla presenza dell’EOF è che esso causa la migrazione di tutte le specie (anioni e cationi), indipendentemente dalla carica, nella stessa direzione, cioè verso il catodo-. Anche gli anioni migreranno tutti verso il catodo dal momento che il flusso elettroosmotico è più grande, di almeno un ordine di grandezza, della loro mobilità elettroforetica. In conclusione, anioni, cationi ed elementi neutri in un capillare migrano tutti nella stessa direzione se sottoposti a elettroforesi. I cationi migrano più velocemente, dal momento che l’attrazione elettroforetica verso il catodo e l’EOF sono diretti nella stessa direzione e quindi si sommano. In vicinanza del catodo le molecole attraversano una finestra dove ne viene rivelato il passaggio attraverso varie tecniche. La rivelazione avviene senza ausilio di coloranti ma tramite misura dell’assorbanza a 214 nm da parte di un detector UV posto alla fine del capillare. I risultati della CE sono presentati sotto forma di elettroferogramma, che mette in relazione la risposta del rivelatore in funzione del tempo di migrazione.

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6.8.3 IsoElettroFocusing ( IFE ) E' una tecnica elettroforetica ad alta risoluzione che ricerca la presenza di bande oligoclonali (BO) IgG nel LCS (liquor) estratto attraverso la rachicentesi o puntura lombare. Le bande oligoclonali sono sottili strisce costituite da anticorpi appartenenti alla classe delle IgG che, insieme ad altre proteine, sottoposte ad una differenza di potenziale, migrano su un apposito gel di agarosio con pH variabile tra 3 e 10, fino a quando non raggiungono il valore di pH al quale la loro carica netta viene annullata (punto isoelettrico). In quella posizione “focalizzano” e si concentrano. Attraverso l' ImmunoBlotting vengono poi trasferite (“blottate”) su membrana di nitrocellulosa e in seguito immunofissate con anticorpo specifico antimmunoglobuline umane (Ig) coniugato con perossidasi, per evidenziare le bande specifiche IgG. Il tracciato viene poi interpretato qualitativamente comparando la presenza/assenza delle bande oligoclonali nel siero e nel LCS. Il pattern di Ig liquorali deve essere sempre confrontato con quello delle Ig sieriche del paziente, per cui è necessario che sia il LCS che il siero siano studiati contemporaneamente in parallelo. Molte patologie presentano bande IgG mono/oligoclonali. La Sclerosi Multipla ad esempio presenta tipicamente IgG oligoclonali nel tracciato LCS ma non nel tracciato sierico.

6.9

Cromatografia

Il processo della cromatografia si basa su interazioni tra una miscela di sostanze da frazionare sciolte in un liquido (fase mobile) ed una matrice solida porosa (fase stazionaria). Per registrare il cromatogramma all’uscita della colonna cromatografica si può misurare l’Abs a 280 nm (aa aromatici) o a 214/220 nm (legami peptidici) in funzione del tempo o del volume di eluizione. Quando il rivelatore posto in fondo all'apparecchio registra il passaggio di una sostanza eluita, elabora i dati su di un "cromatogramma", un grafico che rappresenta la quantità di sostanza rilevata in funzione del tempo. Ogni volta che una sostanza viene rivelata, il rivelatore registra un Picco con una Area più o meno alta a seconda della concentrazione della sostanza. Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabile, deve avere una buona risoluzione.

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Cromatogramma : Area Analita (serotonina) + Area Internal Standard



Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall'inizio all'uscita della colonna.



Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile.



Fattore di capacità (k'): è un parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col tempo morto.



Selettività (α): per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversa devono avere tempi di ritenzione diversi. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro.



Efficienza: avere una buona selettività non basta. Infatti, anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongono fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie vengano eluite con la stessa velocità, di modo che la banda all'interno della colonna cromatografica sia il più stretta possibile. L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna, si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici (N). Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria; sostanzialmente un piatto teorico è la più piccola fetta della colonna in cui due molecole dotate di diverso coefficiente di ripartizione hanno la possibilità di dimostrare diverse velocità di migrazione. Migliore una colonna, minore è l'altezza del piatto teorico (lo ‘spessore' della fetta).

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6.9.1 Cromatografia a scambio ionico In questa tecnica le molecole cariche si legano a gruppi immobilizzate sulla matrice (cellulosa o agarosio). Le proteine ed altri polielettroliti che hanno gruppi carichi possono legarsi a scambiatori di cationi o di anioni. L’affinità per una proteina per lo scambiatore dipende dalla presenza di altri ioni che competono con la proteina per il legame allo scambiatore e dal pH della soluzione che influenza la carica netta della proteina.

6.9.2

Cromatografia per gel filtrazione

In questa tecnica detta anche esclusione molecolare o setaccio molecolare, le molecole sono separate in base alle loro dimensioni e alla loro forma. La fase stazionaria e formata da granuli di gel contenenti pori di dimensioni variabili. Le molecole grandi percorrono la colonna più rapidamente di quelle piccole che attraversano i pori entrando nei granuli.

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6.9.3

Cromatografia per affinità

Nella cromatografia per affinità una molecola (ligando) che si lega specificamente alla proteina di interesse e legata covalentemente alla matrice inerte della fase stazionaria. A differenza degli altri tipi di cromatografia non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche. Esempio di cromatografia per affinità di una proteina che lega il glucosio. L’eluizione può essere effettuata mediante l’aggiunta di glucosio che compete con il ligando immobilizzato sulla fase stazionaria per il legame alla proteina.

6.9.4

Cromatografia a fase inversa

In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria apolare (di natura idrofobica non solubile in acqua) e una fase mobile polare (di solito una miscela di acqua e acetonitrile). Questa cromatografia permette di separare le proteine/molecole in base alla polarità, in aggiunta a seconda della lunghezza delle catene idrofobiche della fase stazionaria è possibile separare proteine di diversa grandezza. Le colonne C4 possiedono una corta catena composta da 4 atomi di carbonio e sono più adatte alla separazione di grosse molecole, invece le colonne C18 con una catena idrofobia di 18 atomi di carbonio sono più adatta alla separazione di piccole proteine o peptidi. L’eluizione viene effettuata aumentando la percentuale del solvente apolare in maniera tale che le proteine più idrofiliche vengono eluite prima.

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6.9.5 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) HPLC è una tecnica cromatografica basata su un fase mobile fatta flussare grazie a delle pompe e una fase stazionaria solida impaccata in una colonna cromatografica. La differenza rispetto ad altre cromatografie liquide, è l’utilizzo di elevate pressioni, che permettono di separare miscele molto complesse in poco tempo. Il campione che si vuole separare è miscelato alla fase mobile e quindi trasportato in colonna a contatto con la fase stazionaria. La molecola a seconda della sua struttura chimica avrà una diversa “affinità” per la fase mobile e per la fase stazionaria. Maggiore è l’affinità per la fase stazionaria (colonna), maggiore è il tempo che la molecola ci metterà ad uscire dalla colonna. Il tempo impiegato dalla molecola ad uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione. Il cuore di un sistema HPLC sono le colonne e la fase stazionaria impaccata al loro interno. Normalmente le colonne hanno una lunghezza variabile tra i 10 e i 30 cm, anche se ultimamente vengono prodotte colonne sempre più corte intorno ai 3 cm. In HPLC all’ uscita della colonna cromatografia è presente un rilevatore che permette di “rilevare” le molecole e quindi di valutare se la miscela iniettata è stata adeguatamente separata.

L’utilizzo dei rilevatori dipende dalla natura chimica delle miscele da separare :  UV / VIS / Infra Rosso (vedi PARAGRAFO 6.4.1 FOTOMETRI E SPETTROFOTOMETRI)  FLUORESCENZA (vedi PARAGRAFO 6.6.2 FEIA fluorescence enzyme immunoassay)  ELETTROCHIMICO e COULOMETRICO. In questi rivelatori "amperometrici" i composti cedono o acquistano elettroni (reazioni RED-OX) alla superficie di un elettrodo. La corrente dovuta a questo passaggio elettronico è proporzionale alla concentrazione dell'analita nel campione in modalità voltammetrica (si applica un potenziale e si misura la corrente mV). Alla fine si ottiene un voltammogramma. Il processo "coulometrico" è simile a quello amperometrico ma differisce per l'efficienza (100%) del processo di RED-OX che semplifica la determinazione quantitativa della sostanza in analisi. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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In HPLC, come in Cromatografia in genere, viene utilizzato e aggiunto durante le fasi preanalitiche di estrazione dei campioni uno Standard Interno ( IS ). In Chimica Analitica è una sostanza chimica che viene aggiunta in quantità esattamente nota ai campioni, al bianco e agli standard di calibrazione. Nel caso di una calibrazione a Standard Interno si determina la correlazione tra il rapporto delle risposte strumentali degli standard e dello Standard Interno e il rapporto tra le loro concentrazioni. Questo espediente permette di compensare gli errori derivanti da perdita di analita durante le fasi di trattamento del campione e di analisi, assumendo che lo standard interno subisca una perdita analoga. Per questa ragione lo standard interno è un composto che deve comportarsi in maniera simile alla specie chimica di interesse nei campioni, dato che gli effetti della preparazione del campione devono essere il più simili possibile sul segnale dello standard interno e dell'analita nel campione. Nel Cromatogramma (mV / t) si vedranno le varie Aree coi picchi corrispondenti ai vari analiti in esame. Più alta è l’area  maggiore sarà la concentrazione Il rapporto fra i due segnali (Area Standard-Interno / Area Analita) viene poi usato per ottenere i punti della curva di Calibrazione (Conc cal). Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Viene poi quantificata la concentrazione (?) dell' analita del Campione (Conc camp) in esame attraverso una proporzione diretta coi rapporti Area Standard-Interno / Area Analita del calibratore visto prima. Cromatogramma calibratore (noto) Conc cal x Area IS cal Area cal Conc campione =

Cromatogramma campione (?) =

Conc camp x Area IS camp Area camp

Conc Cal x Area IS Cal x Area Camp Area Cal x Area IS camp

6.9.6 UPLC LC-MS/MS (spettrometria tandem-massa ultra performante) La configurazione tradizionale della Tandem Mass prevede la presenza di un sistema di campionamento e di un sistema di separazione cromatografica HPLC o UPLC accoppiato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo.

La metodica analitica della spettrometria di massa si basa essenzialmente sulla separazione dalla matrice biologica di molecole che vengono ionizzate, e dei loro relativi frammenti secondo il rapporto massa/carica (m/z) e secondo specifici parametri chimicofisici. La spettrometria di massa consiste, dunque, nella ionizzazione di molecole in fase gassosa, nella separazione dei diversi ioni prodotti e nella loro rivelazione. Il campione analizzato viene pretrattato per diminuire lâ&#x20AC;&#x2122;effetto matrice e la soppressione della ionizzazione per la presenza dei lipidi (estrazione manuale delll'analita da quantificare).

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Standard interno e analita sono eluiti nella sorgente di ionizzazione dove l’applicazione di un alto voltaggio e di un’alta temperatura nebulizza e ionizza le molecole a livello dell’interfaccia ESI (Electron Spray Ionization) dello spettrometro di massa. Gli ioni per i quali il valore di m/z corrisponde all’analita di interesse sono trasferiti da un campo elettrico e da un sistema sotto vuoto all’interno degli analizzatori o filtri di massa (quadrupoli: MS1, MS2) posti in serie e collegati fra loro da una cella di collisione. Nella cella di collisione solo lo “ ione molecolare” viene frammentato da un gas neutro (argon), dando origine a ioni prodotto caratterizzati da strutture specifiche. La seconda fase della spettrometria di massa prevede il trasferimento nel rivelatore degli ioni corrispondenti a uno dei prodotti di ionizzazione (in genere il prodotto più abbondante) Il risultato dell’esperimento è uno spettro di massa tipico di ogni composto in quanto direttamente correlato alla sua struttura chimica ed alle condizioni di ionizzazione cui è stato sottoposto.

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6.10 Emogasanalisi P.O.C.T. (point of care testing): analisi di laboratorio svolta in prossimità del paziente. La valutazione dell’ equilibrio acido-base impiega analizzatori automatici capaci di effettuare contemporaneamente la misura del pH, della pCO2, della pO2 e dell’Hb. Il dosaggio è effettuato su un piccolo campione di sangue, 125 nl, prelevato con una siringa eparinizzata, dell’arteria femorale o omerale. L’analizzatore comprende elettrodi speciali ed un fotometro.  Misurazione di pH : Si serve di un elettrodo di vetro sensibile al pH. Si genera, per scambio ionico, differenza di corrente (DV) proporzionale alla differenza di pH che c’è tra le soluzioni separate dal vetrino. Valore : 7,37 – 7,43.  Misurazione della pCO2 : Si serve dell’elettrodo di Seringhaus e Bradley, rivestito da una membrana di teflon. La CO2 diffonde attraverso la membrana in funzione del gradiente pressorio. Attraversata la membrana ed a contatto con HCO3 e NaCl, si idrata e produce acido carbonico secondo la seguente: CO2 + H2O => H2CO3 => H- + HCO3. Si crea, così, una variazione di pH proporzionale alla quantità di CO2 penetrata e, quindi, alla sua pressione parziale. Valori: 36-44 mmHg. HCO3- : 22-26 mEq/l.  Misurazione della pO2 : Si serve dell’elettrodo di Clarke, riempito con una soluzione elettroconduttrice con KCl a debole concentrazione in tampone fosfato, rivestito da una membrana di propilene. O2 diffonde attraverso la membrana fino alla superficie del catodo; tra catodo ed anodo è presente una DV di 630 mV: se non è presente O2, non ci sarà riduzione. Se è presente O2, si genera una corrente elettrica proporzionale alla tensione di O2. Valore: > 96 mmHg. PaO2: 103,5 – (0,43 x età) mmHg; sono presenti cambiamenti fisiologici della [O2] arteriosa in base all’età, così come è diversa P.Alveolare [O2] 100 mmHg da P.arteriosa [O2] 95 mmHg, data la presenza di shunt artero-venosi, ovvero anastomosi tra arterie e vene polmonari;  Dosaggio dell’ Hb Si basa sulla legge di Beer, secondo la quale, la quantità di luce monocromatica assorbita da una soluzione colorata è funzione esponenziale della sostanza assorbente presente in soluzione. Valore:12,5 – 15,5 g/dl.  Basandosi su questi 4 valori, si può anche ricavare: Bicarbonati, Eccesso di basi, Saturazione di O2.

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6.11 Coagulazione L’emostasi è un insieme di meccanismi fisiologici che l’organismo mette in atto per riparare una lesione di continuo di un vaso. È un processo finemente regolato, localizzato e finito nel tempo. Il sistema della coagulazione consta di due vie convergenti intimamente connesse fra loro, che culminano con l’attivazione della trombina (dalla protrombina) con conseguente formazione di fibrina (dal fibrinogeno). All’emostasi prendono parte cinque sistemi: Sistema vasale sottoendoteliale. Piastrine. Cascata emocoagulativa. Sistema della fibrinolisi. Sistema degli anticoagulanti naturali.

 Tempo di Protrombina (PT, tempo di Quick): è la misura del tempo impiegato dal plasma, povero di piastrine, a formare fibrina, dopo l’aggiunta di Tromboplastina (FIII) e Ca2+ (FIV). Tecnica : incubare 100uL di sangue a 37°C. Si aggiungono 200uL di TPL e Ca2+ (si annullano in questo modo gli effetti del citrato) e si avvia il contasecondi fino alla formazione dei primi filamenti di fibrina. Misurazione : è il rapporto (ratio) tra tempo di coagulazione del plasma del paziente ed il tempo di coagulazione normalizzato : Ratio = PT paziente / PT normale %. La misura corretta del PT si chiama INR: International Normalized Ratio. Valori normali = INR : 0.85 - 1.25 (9.5 - 13.8 secondi). Indicazioni: Controllo della terapia Warfarin (Coumadin). valutazione delle carenze della via ESTRINSECA & COMUNE infatti risulta prolungato nei deficit dei Fattori VII (proconvertina) & X (stuart), V (proaccelerina), II (protrombina) e I (fibrinogeno) Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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 Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT). È la misura del tempo impiegato dal plasma povero di piastrine a formare i primi filamenti di fibrina per azione di un attivatore della fase di contatto ed in presenza di FIII che simulano quelli piastinici. Tecnica: incubare 100uL di reagente nella cuvetta per 5 minuti. Aggiungere 100uL di plasma ed incubare per 3-10 minuti. Aggiungere 100uL di starter CaCl2 0,02 M preincubato a 37°C. Registrare il tempo. Valori normali = Ratio : 0.80 – 1.18 (25 - 42 secondi). Indicazioni: Controllo della terapia eparinica. Valutazione delle carenza della via INTRINSECA & COMUNE. Se aPTT aumenta e PT è normale, c’è carenza congenita di un fattore della via intrinseca o c’è la presenza di un inibitore. PTT è prolungato in tutte le carenze dei fattori della coagulazione, ad esclusione di VII e XIII.  Fibrinogeno (FIB): quantità della proteina funzionante, tecniche gravimetriche e immunologiche misurano la concentrazione di fibrinogeno. Si calcola dopo coagulazione del plasma, successiva separazione del coagulo fibrinico e quantificazione del coagulo attraverso la determinazione in azoto. Valori normali: 160 - 400 mg/dL. Significato diagnostico: Afibrinogenemia ed ipofibrinogenemia. Malattie infiammatorie ed autoimmuni (il fibrinogeno è una proteina della fase acuta).  Tempo di Trombina (TT) : misura il tempo di coagulazione del plasma in presenza di trombina. Si mettono 0,2 ml di plasma citrato a bagnomaria e si aggiungono 0,2 ml di trombina diluita. Valori normali : 18-20 secondi. Significato diagnostico: Difetto qualitativo del fibrinogeno. Presenza di eparina. Presenza di inibitori della polimerizzazione dei monomeri di fibrina.  Antitrombina III (ATIII): Appartenente alla famiglia delle serpine (inibitori delle Serin-Proteasi). Sintetizzata nel fegato e nell’endotelio. Inibisce: Trombina e Xa. IXa, Xia, XIIa. L’eparina aumenta di circa 200 volte la velocità d’interazione ATIIItrombina. Deficit congeniti autos. dom. Ridotta sintesi per epatopatie. Aumentato catabolismo come CID e ustioni. Perdite renali come sindrome nefrosica. Farmaci come estrogeni. I metodi di studio per l’ATIII sono immunochimici. Ad una diluizione di plasma in tampone eparinato, è aggiunta per un tempo fisso un eccesso di trombina. La quantità di trombina residua, misurata con un substrato cromogenico, è inversamente proporzionale dell’attività di ATIII. Valori normali : 83 - 118 %  D-Dimero : è un prodotto di degradazione della fibrina. Diagnosi di Trombosi venosa profonda (TVP), Embolia polmonare (EP). La Specificità del test insieme alla valutazione della Probabilità Pre-test (score di wells) permette di evirare il ricorso a tecniche invasive radiologiche costose. Tecnica : si basa su una reazione immunoturbidimetrica di lattice potenziato. Le proteine del D-Dimero nel campione si legano allo specifico anticorpo anti DDimero, che è rivestito di particelle di lattice, provocando agglutinazione. Il grado di torbidità causata dall’agglutinazione può essere misurata otticamente ed è proporzionale alla quantità di D-Dimero nel campione. Valori normali < 500 ng/mL Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Gli ANALIZZATORI - AUTOMATIZZATI moderni, rispetto a quelli del recente passato (che utilizzavano una rivelazione del coagulo in cuvetta di tipo magnetico-meccanico), sono dotati di un sistema di lettura foto-ottico che misura la varazione di intensità di luce di un campione prima, durante e dopo la formazione del coagulo (test coagulativo) e la variazione di densità ottica del campione in un tempo definito (test cromogenici e test immunologici). Esempio : Metodo di lettura: nefelometria  Test coagulativi : PT, aPTT, Fibri, TT, Fattori carenti (II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII) sorgente luminosa con led a 660 nm. Il metodo di lettura delle analisi con il canale nefelometrico si basa sulla misura dell'aumento della torbidità che avviene per la formazione del coagulo. Il fascio luminoso generato dal led è trasmesso direttamente sul campione da un sistema di fibre ottiche; la luce riflessa è trasmessa ad un sensore, posizionato a 90° rispetto alla sorgente luminosa. Metodo di lettura: assorbanza  Test cromogenici : AT III, Proteina C, Fatt VIII sorgente luminosa con lampada alogena (filtro 405 nm). La determinazione delle analisi con il canale di assorbanza viene eseguita misurando la densità ottica e mettendola in correlazione con il tempo.  Test immunologici - turbidimetrici : DDimero, Ag Fatt von Willebrand l’agglutinazione delle particelle di lattice legate all’anticorpo è eseguita a 405 nm misurando la densità ottica e mettendola in correlazione con il tempo.

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6.12 Esame Emocromocitometrico L’emocromo è un esame del sangue prescritto abitualmente dal medico e misura quante sono le cellule del sangue e le loro caratteristiche fisiche, ad esempio le dimensioni, la forma e il contenuto N.B. : 1 mm3 = 1 uL (micro-litro)

Il moderno Analizzatore per Emocromo è un citometro a flusso in fluorescenza che utilizza il principio impedenziometrico associato a un sistema ottico basato su un raggio di luce emesso da una laser a semi conduttore. GR e PLT-I : La conta e le misurazioni volumetriche di globuli rossi e piastrine vengono effettuate utilizzando il metodo di rilevazione resistivo o impedenzionetrico. L’impiego della focalizzazione idrodinamica, grazie al quale un flusso di diluente in pressione che raccoglie le cellule, le allinea in singola fila e le indirizza verso il centro dell’orifizio del trasduttore. RET : La conta dei reticolociti avviene mediante aggiunta di un colorante fluorescente polimetinico, che penetra attraverso la membrana cell: i ret sono separati dai GR maturi in funzione del differente contenuto di RNA e dalle cell nucleate in funzione del differente contenuto di DNA/RNA, utilizzando i segnali di FSc / SFL. I reticolociti vengono suddivisi in 3 frazioni (HFR,MFR e LFR) in funzione della quantità di RNA. Plt-O : conteggio ottico delle piastrine è determinato dal Ret- scattergram. In un campione con una distribuzione anormale delle piastrine, il sistema referta automaticamente il valore di Plt-O. Il conteggio di Plt-O è più affidabile in presenza di grandi piastrine o microcitemie. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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WBC-FL : La separazione delle cellule, per la determinazione della formula leucocitaria, è ottenuta utilizzando 3 diversi segnali:  scatter Frontale (forward scatter FSc)  scatter Laterale (side scatter SSc)  fluorescenza Laterale (side fluorescence SFL) L’intensità del forward scatter indica il volume della cellula mentre il side scatter indica il contenuto cellulare come nucleo e granuli. La side fluorescence indica la quantità di DNA e RNA presenti. Queste misurazioni vengono effettuate in diversi canali analitici per ottenere una formula leucocitaria completa, i segnali di anomalia morfologica e il conteggio degli eritroblasti e delle cellule immature.  canale Diff vengono ottenute le informazioni per la caratterizzazione dei leucociti. Maggiore è la complessità del nucleo ed il numero di granuli presenti, più elevata sarà l’intensità del segnale di side scatter. L’intensità del segnale di side fluorescence dipende dalla quantità di acidi nucleici contenuti nella cellula. Maggiore è la quantità di acidi nucleici e maggiore sarà l’intensità del segnale di side fluorescence.  canale WBC/Baso dove vengono contati i basofili e dove viene anche determinato il conteggio totale dei leucociti.  canale NRBC, nel quale si esegue la conta degli eritroblasti. Qui il colorante polimetinico fluorescente colora gli acidi nucleici dei globuli bianchi e degli eritroblasti. In questo modo vengono chiaramente separate due popolazioni sulla base della differente intensità di fluorescenza. I segnali di allarme per la presenza di cellule anomale, come linfociti atipici, blasti e granulociti immaturi, vengono ricavati dall’insieme delle informazioni ottenute nei suddetti canali analitici, in associazione con quelle ottenute dal canale IMI.  canale IMI, dedicato al riconoscimento e al conteggio degli elementi immaturi.

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WBC, NRBC, Basofili: analisi in Citometria a Flusso in fluorescenza.

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6.13 Esame Urine Fondamentale della diagnostica nefrologica. Prime Urine del mattino (le urine sono più concentrate) e accurata pulizia dei genitali, eliminazione del primo getto (mitto intermedio con almeno 10 mL). Refrigerare se non analizzato entro 2 ore. Provetta di plastica 10 mL Tappo bianco. Comprende: Esame fisico, Esame chimico, Esame del sedimento. Ormai la realtà dei grandi Laboratori prevede una robusta automazione sia nella parte dell'esame Chimico/Fisico che nella parte della Centrifugaz/Microscopia del Sedimento. ESAME FISICO COLORE : Normale: giallo Anormale: Bianco (pus), Rosa/rosso (sangue emoglobina), Marrone (bilirubina), Altri colori (farmaci) ASPETTO E CARATTERISTICHE: Normale: limpido Anormale: torbido = Materiale amorfo, Pus, Sangue, Cellule epiteliali, Batteri, Cristalli, Cilindri ODORE Normale: caratteristico provocato da acidi volatili Anormale: Acetone (odore di frutta), Batteri (odore di ammoniaca) PESO SPECIFICO Indica la capacità del rene di concentrare o di diluire le urine Aumenta: Disidratazione, Glicosuria, Aumento di ADH Diminuisce: Riduzione di ADH, Insuf.renale, Glomerulonefriti. ESAME CHIMICO GLUCOSIO (non rilevato fino a quando il livello ematico > 160-180 mg/dl) Causa più comune: iperglicemia, Insufficiente riassorbimento renale. BILIRUBINA Danno epatico, Ittero ostruttivo, Anemia emolitica. CHETONI : composti chimici che derivano dalla degradazione degli acidi grassi. Normalmente non presenti nelle urine. Aumentano quando l’ organismo non potendo utilizzare gli zuccheri, ricorre all’ossidazione dei grassi per ottenere energia. PESO SPECIFICO: Indica la capacità del rene di concentrare le urine. Una delle prime funzioni perse in seguito a danno tubulare. SANGUE : Ematuria: presenza di sangue nelle urine –Possono essere globuli rossi (GR) intatti o emoglobina da GR emolizzati. pH (RANGE 5-9): Normale: tra 5,5 e 6,5. Misura l’acidità o l’alcalinità . Determinato da: •Dieta •Metabolismo Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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PROTEINE: Normalmente non sono presenti in quanto sono sostanze importanti per l'organismo e quindi riassorbite nel torrente circolatorio. UROBILINOGENO : ↑ nelle patologie epatiche. Valori di riferimento: 0.2-1.0 UI NITRITI : Presenti in molte infezioni delle vie urinarie. LEUCOCITI : La presenza è segno indiretto di infezione delle vie urinarie. Normalmente sono assenti

ANALISI MICROSCOPICA DEL SEDIMENTO Urine centrifugate a 2000 giri x 5 minuti (provetta di plastica 10 mL tappo bianco). Analisi del sedimento “a fresco” per identificare la presenza di elementi significativi: globuli rossi, globuli bianchi, batteri, cell. epiteliali, cristalli, cilindri e muco GLOBULI ROSSI (EMATURIA) Se presenti in grossa quantità : infezioni / infiammazioni, Traumi, Tumori, Calcoli renali– Danno glomerulare , Contaminazione di origine mestruale

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GLOBULI BIANCHI (LEUCOCITURIA) La loro presenza suggerisce processi infiammatori del tratto uro-genitale

CELLULE EPITELIALI SQUAMOSE Origine uretrale o vaginale : scarso significato

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CILINDRI I cilindri sono il segno tipico di una tipico di una nefropatia. Formati essenzialmente da proteine. CILINDRI IALINI: – I più comuni – Rinvenuti spesso dopo esercizio fisico o stress.

CILINDRI GRANULARI –La loro presenza indica normalmente patologie renali significative renali.

CILINDRI ERITROCITARI –Indicativi di ematuria di genesi renale , glomerulonefrite.

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CILINDRI LEUCOCITARI: Osservati in Nefrite lupica.

BATTERI Le urine sono normalmente sterili. Un grande numero di batteri e WBC è indicativo di infezione del tratto urinario (UTI). La presenza di soli batteri, senza WBC, può indicare una contaminazione (Falso positivo)

LIEVITI. Possono riscontrarsi nelle infezioni e nei diabetici

MUCO FILAMENTI Presenti in infiammazione ( non batterica/virale), attività sessuale

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SPERMA : attività sessuale CRISTALLI CRISTALLI DI ACIDO URICO. Anche nelle urine normali e nel 16% dei pz con gotta

CRISTALLI DI OSSALATO DI CALCIO. Alte concentrazioni di acido ossalico in Vegetali a foglia verde, Pomodori, Bibite gassat, The, Cioccolato.

CRISTALLI PATOLOGICI : CRISTALLI DI TRIPLOFOSFATO (Infezioni del tratto urinario). CRISTALLI DI CISTINA (Patologie metaboliche). CRISTALLI DI TIROSINA E LEUCINA (Patologie degenerative tissutali, incluse le epatiti e le leucemie) PROTEINURIA nelle 24 ore (raccolta) I soggetti normali eliminano quantità molto piccole di proteine. Un qualsiasi aumento persistente può essere considerato come un segno di danno renale Una normale escrezione urinaria di proteine è < a 150 mg al giorno; Una escrezione urinaria di proteine > a 150 mg al giorno viene definita proteinuria. L’entità di proteine escrete viene misurata con una raccolta delle 24 ore. Albuminuria,Globinuria,Bence-jones,Microalbuminuria sono indice precoce di danno glomerulare nei pazienti diabetici. MICROALBUMINURIA Condizione caratterizzata da minima escrezione urinaria di albumina 30-300 mg/24 ore Di rilievo nel diabete come marker di rischio di nefropatia diabetica che evolve fatalmente in insuf.renale . Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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INTERVALLI DI LETTURA, VALORI DI PANICO e VALIDAZIONE TECNICA / CLINICA DI UN RISULTATO STRUMENTALE

Concludiamo il nostro percorso di ANALISI DI LABORATORIO su un campione biologico appartenente ad un paziente. Dopo aver :  preparato la strumentazione (manutenzioni e carico reagenti)  calibrato la metodica  eseguito e verificato (+/-2DS) i Controlli di Qualità Interni  eseguito le analisi sui campioni appartenenti a pazienti .==> ora si deve VALIDARE IL RISULTATO strumentale affinchè venga riportato sul REFERTO destinato al paziente. Posto che : per Valore Normale si intende il valore più frequentemente riscontrato negli individui sani della specie umana. Si preferisce parlare di valori di riferimento e se la distribuzione è statisticamente normale, tali valori vengono arbitrariamente fissati come pari alla media +/2 DS; vi si include così circa il 95% della popolazione sana; per Intervallo di Lettura si intende il valore minimo e il valore massimo entro i quali la linearità del metodo offre garanzie sulla affidabilità del dato analitico strumentale riferito al campione in analisi; per Range dinamico Lineare si intende l’intervallo di concentrazione in cui il segnale varia linearmente con la concentrazione; per Linearità del Metodo si intende la sua abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti dosati nei campioni all’interno di un determinato campo di validità. Tali valori posso oscillare in alcune condizioni patologiche in un range molto ampio e superare l'ultimo punto di concentrazione di una curva di calibrazione. Quando i valori ottenuti sono superiori al limite di linearità del metodo (ultimo punto di calibrazione) occorre diluire il campione, ripetere la misura (facendola rientrare nel range di linearità) ed infine moltiplicare il risultato X il fattore di diluizione. (Vedi paragrafi : 5.3 Diluizioni manuali e automatizzate + 6.2 La curva di taratura) Da molti anni ormai le strumentazioni di laboratorio sono collegate direttamente ai PC-LIS, per la visualizzazione digitale dei risultati delle analisi eseguite, attraverso dei programmi di trasferimento dati (DNA o HALIA). I dati dai vari strumenti convergono all'interno del SOFTWARE aziendale (DnLab) che permette la visualizzazione della RICHIESTA completa appartenente al paziente. risultati emocromo + coagulazione + biochimica ==> richiesta paziente VALORI DI PANICO per i quali, essendo il paziente in condizioni critiche, è necessario contattare telefonicamente il reparto per la comunicazione del dato :

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TEST

Unità di misura

Emogobina (Hb)

LIMITE INFERIORE

LIMITE SUPERIORE

g/dL

Piastrine (PLT)

x 109 /L

1000

Leucociti (WBC)

x 109 /L

1000

50000

PT (INR)

6,5

aPTT

sec

Glucosio (GLU)

mg/dL

500

Sodio (Na)

mmoli/L

120

160

Potassio (K)

mmoli/L

2,5

6,5

7,2

7,6

140

Ca++ ionizzato

mmoli/L

0,7

Calcio totale

mmoli/L

1,5

Digossina (DIGO)

ng/mL

3,5 3

ESEMPI DI RANGE IN BIOCHIMICA :

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Il dato, associato all’anagrafica, è inserito nel sistema informatico per una Validazione di I° livello (validazione tecnica). La validazione tecnica è stata tradizionalmente interpretata come validazione analitica ristretta al controllo strumentale e al controllo di qualità interno. Occorre per il rilascio del referto che i dati analitici siano sottoposti ad una Validazione di II° livello. Occorre, per ogni dato riportato su PC dallo strumento, tenere in considerazione alcune regole basilari prima di Validare un dato (I e/o II livello) :  conoscere i valori normali / riferimento  saper leggere una curva di calibrazione  conoscere le regole di Westgard per i CQI  conoscere gli intervalli di lettura strumentali x ogni analisi  conoscere le regole per i rerun  saper effettuare le opportune diluizioni  controllore lo storico del paziente e le sue precedenti analisi  valutare il reparto / ambulatorio /CP di provenienza del paziente In un Laboratorio di medie/grandi dimensioni (Hub) ogni giorno sono prodotti decine di migliaia di numeri che devono passare al vaglio del processo di validazione. Sono ormai installati programmi particolari che permettono di impostare dei filtri per eseguire una Validazione Automatica per i pazienti che rientrano nei range di normalità e permettono anche di visualizzare lo storico del paziente per poter valutare un risultato critico. I più utilizzati sono i MIDDLEWARE che si inseriscono fra lo strumento ed il LIS collegandoli fra loro. Sono chiamati anche SISTEMI ESPERTI di validazione. I dati che passano il controllo del sistema di validazione intelligente sono automaticamente validati al II° livello e quindi rilasciati. Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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In alcuni sistemi di laboratorio questo II° livello è definito Validazione Clinica ma non ha nessuna delle caratteristiche per essere definito tale, manca infatti la conoscenza della clinica del paziente. Solo il medico curante ha la possibilità di dichiarare validi i dati se correlanti con la storia clinica del paziente. Il T.S.L.B in base alle proprie conoscenze biologiche di base , decide se rilasciare alla validazione clinica il dato analitico definito “critico” o se ripetere il campione per un ulteriore controllo (concetto di lavorare in autonomia) , il che non esclude un eventuale consulto con il personale laureato interno e clinico esterno (concetto di collaborazione ). Al clinico spetta la validazione della richiesta nella sua completezza ed in base alle proprie conoscenze di superiore livello è in grado di stabilire la congruità fra i vari dati analitici e quindi di rilasciare il referto. Si parla di rilascio dei risultati da parte del T.S.L.B. e non di referto. Il tecnico è responsabile del dato rispetto agli accorgimenti tecnici e al corretto svolgimento delle procedure di analisi, ma non è responsabile dei risultati rispetto al loro utilizzo clinico. D.M. del 14 settembre1994 n°745: regolamento concernente l’ individuazione della figura e del relativo profilo professionale del Tecnico di Laboratorio Biomedico.

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VALIDITA' DIAGNOSTICA DEI TEST DI LABORATORIO

8.1

Screening

Uno screening è un tentativo di identificazione precoce di una patologia. Trattasi di prevenzione secondaria (diagnosi precoce e trattamento) ed in Italia è a carico del Servizio Sanitario Nazionale. Un programma di screening consiste nel selezionare, in una popolazione, particolari sottogruppi tramite un qualche test (es. laboratorio: PAP-test, fenilchetonuria, S.O.feci). La selezione avviene in un gruppo di persone sane che, essendo risultate positive ad un test, hanno alta probabilità di una data malattia in fase pre-clinica. Tali persone sono verranno poi sottoposte ad ulteriori accertamenti (II°livello Imaging o Biopsia) che ne confermereanno o meno la patologia. Alle persone che risultano malate viene somministrato un trattamento. L'obiettivo del programma di screening : applicare test alla popolazione, individuare le persone, confermare la diagnosi. L’obiettivo finale è la diminuzione della mortalità. Misure di processo: indicatori intermedi del fatto che il test funzioni = Sensibilità e Specificità diagnostica, ValorePredittivoPositivo, ValorePredittivoNegativo, Prevalenza. Misure di efficacia: diminuzione della mortalità. Caratteristiche della misura di un test :  PRECISIONE: coerenza di risultati tra osservazioni diverse effettuate nelle stesse condizioni, più i singoli valori di un test sono ripetibili e si concentrano intorno alla media e più si è precisi, possibili errori casuali. La precisione si misura in DS o CV  VALIDITA’ (da non confondere con Accuratezza analitica) : corrispondenza tra il valore medio rilevato e valore vero, possibile errore sistematico.

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8.2

Validità del test

Validità del test : “capacità del test di discriminare gli individui malati da quelli non malati”. Esempio pratico di laboratorio: La quantità di emoglobina nelle feci aumenta come conseguenza di malattie con lesioni emorragiche nel tratto digestivo, in particolare di quello inferiore, anche se spesso il sanguinamento non è visibile (sangue occulto). Di conseguenza, la misurazione della quantità di Hb nelle feci è un metodo efficace di analisi per la tempestiva diagnosi e terapia del cancro al colon. Per queste caratteristiche, il test del sangue occulto nelle feci ( FOBT ) costituisce il test di primo livello di screening per il carcinoma del colon retto.

Il sistema OC Sensor ad esempio è utilizzato nel 90% dei programmi di screening. È uno strumento di screening e non diagnostico. Il FOBT viene consigliata dal Ministero della Salute ogni due anni nelle persone tra i 50 e i 69 anni, oppure seguendo la prescrizione medica basata sulla famigliarità del paziente. La maggior parte dei pazienti che si sottopone all’esame è asintomatica. In base alle Linee Guida si è posto il limite di 100 ng/ml come discriminante tra risultato NEG e POS. Se > di 100 si raccomanda di eseguire la Colonscopia + Istologico della biopsia (metodo gold-standard x diagnosi). In media, per ogni 100 persone che fanno l'esame, 5 risultano positive. Non tutte, però, avranno polipi: le tracce di sangue possono essere dovute per esempio a emorroidi o assunzione Aspirina (Falso Positivo). In statistica per popolazione si intende l'insieme degli elementi che sono oggetto di studio => statistica descrittiva Il campione è un sottoinsieme della popolazione (la rappresenta), di dimensioni ridotte, ma avente le stesse caratteristiche => statistica inferenziale.

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Esempio-1: Campione adulti >50aa in città USA.

(NB dati creati a scopo didattico)

K colon

sani

FOBT +

80 VP

135 FP

215

FOBT -

20 FN

765 VN

785

100 (istol+)

900 ( - )

1000

MALATI CERTI (analisi gold-standard Anatomia Patologica) VP+FN = 100 PREVALENZA del campione in esame, proporzione di soggetti che in una data popolazione e in un dato momento (fotografia) presentano una certa malattia (o altro evento). Numero persone malate sul tot del nostro campione (estratto dalla popolazione) = VP+FN / Tutti = 100 / 1000 = 10 % INCIDENZA invece misura la proporzione di "nuovi eventi" che si verificano in una popolazione in un dato lasso di tempo (film). Anche in questo caso, per "evento" si può intendere la comparsa di un qualsiasi carattere (comparsa di nuovi casi di malattia). SENSIBILITA’: Capacità del test di fornire risultati positivi nei soggetti malati (capacità del test di identificare coloro che hanno la malattia) VP / VP+FN 80 / 100 = 0.8 = 80% SPECIFICITA’: Capacità del test di fornire risultati negativi nei soggetti non malati (capacità del test di identificare coloro che non hanno la malattia) VN / VN+FP 765/ 900 = 0.85 = 85% NB : non confondere Sensibilità/Specificità Diagnostica (questa) con la Sensibilità/Specificità Analitica (vista in precedenza Par. 4.3 Variabilità Analitica) Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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Nella pratica clinica quando si usa un test diagnostico, non si sa se il soggetto sia malato o sano ma ci si trova nella situazione opposta. Sappiamo Sens e Spec del kit da bugiardino, sappiamo se il risultato del test è POS o NEG e vogliamo sapere quale è la probabilità che quel soggetto risultato POS al test sia malato (VPP) o viceversa (VPN). Valore Predittivo Negativo VPN = Probabilità che una persona negativa al test sia veramente sana VPN = VN / FN+VN = veri sani / - al test = 765 / 785 = 97,4 % Valore Predittivo Positivo VPP= Probabilità che una persona positiva al test sia veramente malata VPP = VP / VP+FP = veri malati / + al test = 80 / 215 = 37,2 % Ma ... cambiando la Popolazione in esame rispetto a prima, cambia la Prevalenza della malattia in quanto variabile indipendente. Esempio-2: Campione adulti >50aa in città Indonesia.

(NB dati creati a scopo didattico)

K colon

sani

FOBT +

8 VP

148 FP

156

FOBT -

2 FN

842 VN

844

10 (+ istol)

990 ( - )

1000

Prevalenza = 10 / 1000 = 1% Sensibilità = 8 /10 = 80 % Specificità = 842 / 990 = 85% VPN = 842 / 844 = 99,8% VPP = 8 / 156 = 5,12 % !!! Rispetto a prima: stesso test diagnostico FOBT, stessa Sens e Spec ma la Prevalenza era del 10% e avevamo un VPP del 37,2% !!! Al diminuire della Prevalenza della malattia il VPP diminuisce mentre il VPN aumenta. Questo accade perché la diminuzione della Prevalenza comporta l'incremento delle persone sane 990 rispetto a 900; ciò, a sua volta, fa sí che aumenti il numero di Falsi Positivi 148 rispetto a 135 (ad es. per emorroidi da stitichezza). Lo stesso Test applicato a due popolazioni in cui la malattia ha diversa Prevalenza ha VPP differente. Non bisogna farsi ingannare da SENS e SPEC alte che si vedono nei bugiardini dei test diagnostici perchè quello che determina il VPP di un test è la PREVALENZA di una malattia nella Popolazione (es: nazione USA diversa da Indonesia). Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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SENS e SPEC (indici di performance diagnostica) di un test dipendono dalla tecnologia del kit e dalla strumentazione a disposizione. Non sono influenzati dalla Prevalenza ma dalla bontà del test. VPP (indice di conferma diagnostica) è fortemente condizionato dalla Prevalenza . In generale si puo' dimostrare che il massimo contributo di un test si ottiene per valori di Prevalenza compresi tra il 40 - 60 %.

8.3

Teorema di Bayes

Il Teorema di Bayes, rapporta la Sensibilità alla Probabilità di Malattia : se la se la se la se la

Prev Sens Spec Spec

scende, aumenta il denominatore e VPP diminuisce sale il VPP non cambia (si annullano numerat. e denom.) sale, diminuisce il denominatore e il VPP aumenta scende, aumenta il denominatore e il VPP diminuisce

VPP Bayes =

(Sens x Prev) _____________________________________ (Sens x Prev) + [ (100 - Spec) x (100 -Prev) ]

numeratore _____________ denominatore

Il Teorema di Bayes consente, conoscendo la Prevalenza di una malattia e la Sensibilità e la Specificità di un esame per la sua diagnosi, di calcolare la probabilità di malattia in caso di esame positivo. Esempio (tratto da Besozzi, biochimica clinica, 2008, vol. 32, n. 5) : Si consideri un esame destinato a rivelare la presenza nel siero di anticorpi anti-HIV Sensibilità del 100% (3/3) , l’esame è positivo nel 100% dei malati Specificità del 99,7% (994/997), l’esame è negativo nel 99,7% dei soggetti sani. Si sa che la Prevalenza dell'infezione da HIV nella popolazione è 3/1000 sieropositivo

sano

Test Ab-anti HIV +

3 VP

3 FP

Test Ab-anti HIV -

0 FN

994 VN

994

3 malati

997 sani

1000

Quale è il valore predittivo dell’esame positivo VPP ? Supponendo di effettuare l’esame su 1000 soggetti presi a caso i risultati saranno i seguenti:  3 soggetti presenteranno positività agli anticorpi anti-HIV (VP), in quanto la prevalenza è del 3 per mille e la sensibilità dell’esame del 100% Martinelli Francesco©, TSLB, Scienze Tecniche di Medicina di Laboratorio nell'Organizzazione del Lab Analisi, I aa II sem. TO2017.

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 A causa del fatto che la specificità dell’esame è del 99,7% ci dovremo aspettare 994 VN e 3 FP su 1000 soggetti . Essendo in totale 6 i soggetti positivi al test ma solo 3 i veri positivi :  VPP del test HIV = 3/6 = 50% ( monetina ? ) Possiamo calcolare (rigorosamente) il valore predittivo dell’esame positivo P(M+|T+) applicando direttamente il teorema di Bayes:

Nel caso degli anticorpi antiHIV, la differenza tra la probabilità di essere malati a posteriori (dopo avere effettuato l’esame, pari al 50% = VPP) e la probabilità di essere malati a priori (prima di avere effettuato l’esame, pari allo 0,3% = 3 /1000 = Prevalenza) rappresenta appunto il valore aggiunto che il test HIV è in grado di fornire. La seconda considerazione parte dal fatto che la determinazione degli anticorpi anti-HIV, un esame di primo livello, poco costoso, consente di restringere da 1000 a 6 soli individui la rosa dei candidati ad essere sottoposti a un esame di secondo livello (Western-Blot), che è sì risolutivo dal punto di vista diagnostico, ma che ha un costo molto superiore a quello del dosaggio degli anticorpi. Un esame con sensibilità del 100% e specificità del 100% ha per definizione un valore predittivo del risultato positivo VPP = 100%. Nel caso esemplificato sopra degli anticorpi anti-HIV le caratteristiche dell’esame erano pressoché ideali (sensibilità del 100% e specificità del 99,7%). Ma ... nonostante queste buone performance il VPP risultava solamente del 50%. In condizioni di bassa Prevalenza, riduzioni anche minime della Specificità di un esame possono comportare drastiche riduzioni del valore predittivo positivo VPP. NB: se la Specificità scende (100-Spec), aumenta il denominatore e il VPP diminuisce Questo non avviene per il valore predittivo negativo VPN che risulterà uguale a 994/994 = 100% ==> un esame negativo consente nel caso specifico di escludere la malattia.

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RISORSE E COSTI DI LABORATORIO NELL'ATTUALE SCENARIO ECONOMICO

INTRODUZIONE: fra il 2011 e il 2012 la fiducia dei mercati azionari nell’acquisto dei titoli di stato è venuta a mancare. E’ evidente lo squilibrio creatosi tra economia reale di produzione e finanza del debito. Nel 2012 il 6,1% della popolazione italiana aveva un’età superiore agli 80 anni (12.500.000). Gli over 65 sono il 20,3% e nel 2021 saranno il 23,9%. A causa della crisi finanziaria e la lenta ripresa dell’economia, la spesa per l'assistenza sanitaria dovrebbe salire al 10,5% del PIL entro il 2014. Nel 2021 vi sarà un drammatico spostamento verso le malattie croniche con un conseguente aumento del consumo di risorse sanitarie. Tale sistema impone un rigoroso monitoraggio delle prestazioni erogate per contenere i costi e rientrare nelle tariffe previste. Il 6 luglio 2012 è uscito il Decreto Legge n.95 meglio conosciuto come “Spending review”, all’Art.15 troviamo “Disposizioni urgenti per l'equilibrio del settore sanitario e misure di governo della spesa farmaceutica” che prevede un nuovo Nomenclatore Tariffario Nazionale contenente tariffe non più riferite ai reali costi di produzione ma più basse di quelle calcolate mediante la completa rilevazione dei Costi Standard. La spesa per la diagnostica non è una variabile indipendente, deriva in modo lineare dall’attività assistenziale, quindi dalla domanda di salute. Quando queste aumentano, sale la pressione all’uso dei laboratori. Il 70% delle diagnosi mediche dipende da esami di laboratorio. Ciononostante, percentuali rilevanti 20-40 % di esami sono richiesti senza motivazione, senza utilità o ridondanti. Le motivazioni che conducono all'abuso dei test diagnostici sono molteplici: interesse delle industrie (fenomeno del technology-creep), disinformazione sulle caratteristiche dei test (sensib, specific, VPP, costi), l'insistenza del paziente e la disponibilità del medico ad assecondare le sue richieste (Consumerismo), sottovalutazione dei costi reali e complessivi per l‘Azienda dei test e dell’impatto che hanno sui costi di ribaltamento per i reparti richiedenti, eccesso di prudenza del medico per tutelarsi dal punto di vista medico-legale (Medicina difensiva). Possibili interventi: opportunità offerte dall’ Information Tecnology attraverso l’utilizzo di software che guidano la prescrizione, blocchi nella richiesta qualora non risponda agli standard dell’EBM, eliminazione di esami obsoleti ed aggiunta di esami innovativi di comprovata efficacia, blocchi nella richiesta di esami con ripetizione ingiustificata. SCOPO DEL LAVORO : il contesto è quello del Laboratorio Analisi Biochimica Clinica “Baldi & Riberi” Ospedale Molinette, appartenente all’Azienda Ospedaliera “Città della Salute e della Scienza di Torino”. L’obiettivo è ridurre i Costi del laboratorio e conseguentemente quelli di ribaltamento sugli altri centri di costo finali dell'Azienda attraverso la riduzione del numero di esami di laboratorio richiesti inappropriatamente . É stata scelta la nuova Tecnologia Informatica coniugata con l'EBM. Il numero di esami richiesti può essere ridotto attraverso l'installazione e l'utilizzo di un software di nome Prometeo (NoemaLife S.p.a.) che prevede l'impostazione di Vincoli o Gating-rules alla prenotazione di test di laboratorio. L’oggetto dello studio permette di verificare la correttezza delle richieste tramite l'applicazione di regole e di agire di conseguenza su tutte le richieste inappropriate. Al momento della creazione di una nuova richiesta, apparirà un avviso (finestra pop-up) all’operatore con una breve motivazione sul perché l’esame che sta prenotando non è appropriato allegandovi la bibliografia da cui ha origine.

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MATERIALI E METODI : disegno dello studio: si tratta di una ricerca quantitativa/descrittiva. Lo studio è di tipo osservazionale: vengono riportati il numero di esami eseguiti presso il Laboratorio durante tutto il 2012 e i relativi costi associati da Tariffario. Successivamente, in modo retrospettivo, con l'applicazione dei Vincoli ai test già richiesti nel 2012, verrà quantificato il numero e il costo degli esami che possono essere risparmiati. Il Numero di esami inappropriati estrapolati dal database a nostra disposizione è stato moltiplicato X la Tariffa corrispondente al test, ottenendo così il totale dei costi dovuti ai test richiesti inappropriatamente. Per questo motivo abbiamo creato 4 diversi tipi di avviso suddividendo i vincoli in base a : Ridondanza nel dosaggio dell'analita legata all'invarianza nel tempo (MRI: Minimum Retesting Interval), test scelti: Num.Dibucaina 999gg, Formula leucocit 1gg, Tipiz linfocit 7gg, QPE 21gg, IgA, IgG, IgM 21gg, Apolipoprotein A1+B 90gg, Chol tot 7gg, Chol HDL 21gg, Trigl 7gg, Hb glicata 90gg, HCY 30gg, Calcitonina 90gg, PCT 1gg, Tireoglobulina 90gg, Alfa-feto-prot 7 gg, PSA tot 30gg, Cromogranina 90gg, CA125 90gg, CA15-3 90gg, CA19-9 90gg, CEA 40gg. Associazioni errate di 2 o più test all'interno della stessa richiesta del paziente, test scelti: tTg-Ab + tTg-Ab, tTg-Ab senza IgA, TnThs+CKMB, TnThs+Myo, Crea+Urea. Età del paziente, test scelti: B-HCG < 12aa e >55aa. Sesso del paziente test scelti: escluso B-hcg x M, PSA per F, CA125 per M, CA15-3 x M. Da questi calcoli sono stati esclusi reparti come trapianti, urologie, oncologie, neurologie che per motivi clinici posso scavalcare i vincoli. RISULTATI : rispetto agli esami eseguiti nel 2012, il numero tot di test inappropriati applicando i Vincoli x Ridondanza è di 94.085 (12%) che corrisponde ad un costo di 712.186 euro. Il numero totale di test inappropriati applicando i Vincoli x errata associazione di 2 o + test è di 147.248 (96.6%) che corrisponde ad un costo di 394.503 euro. Il numero totale di test inappropriati applicando i Vincoli x età o sesso del paziente è di 461 (1.5%) che corrisponde ad un costo di 8.938 euro. Riassumendo: le richieste esaminate sono state 965.290 di cui 241.794 (25%) erano inappropriate; ciò riconduce ad un costo quantificato in 1.115.628 euro tra materiale sanitario usato e personale di laboratorio mal allocato. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI : la concezione del laboratorio è meccanicistica ed economicistica. Si evince il principio dell’economia di scala, secondo il quale il principale processo di cambiamento dei laboratori consiste nel loro accorpamento in grandi strutture o Aree-Vaste, non rinnovando il personale, impedendo le remunerazioni sugli straordinari effettuati per gli eccessivi carichi di lavoro, tentando di dare in gestione a società private (o consortili) i laboratori analisi. I risparmi sui costi che si ottengono derivano esclusivamente dall’utilizzo di lavoro precario, occasionale o a chiamata. Come conseguenza la privatizzazione dei servizi di diagnostica consentirebbe, scorrettamente, di far apparire il servizio pubblico stesso meno efficiente rispetto al privato. In realtà, se la medicina di laboratorio è un fattore di costo per la sanità, ciò avviene in fase pre-analitica e l’errato utilizzo di risorse avviene durante la fase prescrittiva e dunque ben prima che il campione giunga in laboratorio per l’analisi.

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4 diversi tipi di avviso suddividendo i vincoli in base a : A) ridondanza/ripetitivitĂ nel dosaggio dell'analita legata: alla concentrazione iniziale, all'emivita (half-life) che ne determina l'invarianza della concentrazione a distanza di tot giorni tra un prelievo e l'altro oppure legata al tempo che la terapia somministrata impiega a dare i suoi effetti di cura (Minimum Re-testing Interval). B) associazioni errate o inutili di due o piĂš test all'interno della stessa richiesta del paziente C) etĂ del paziente D) sesso del paziente

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Tabella_1_Test scelti per i Vincoli suddivisi in categorie.

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Avviso: Vincoli per RIDONDANZA test ( MRI )

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Avviso: Vincoli per ASSOCIAZIONE errata di 2 o più test

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Avviso: Vincoli per ETA' paziente

Avviso: Vincoli per SESSO paziente

Le prestazioni di laboratorio eseguite nell’anno 2012 presso la Struttura Complessa Laboratorio Analisi Biochimica Clinica “Baldi & Riberi” dell'Azienda Ospedaliera Città della Salute e della Scienza di Torino sono in totale = 6.043.900 esami. Nel Report indicatori si può osservare la suddivisione per provenienza della richiesta: ambulatori e centro prelievi 2.113.344 esami, reparti ospedalieri/aziendali 3.369.990 esami, pronto soccorso 440.478 esami, ospedali esterni 120.088 esami

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Costi inappropriattezza per Ridondanza richieste (Minimum Re-testing Interval)

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Costi inappropriattezza per Errata Associazione di piĂš test nella stessa richiesta.

Costi inappropriattezza per test non adeguati a Sesso e/o EtĂ del paziente.

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Costi Complessivi 2012 dovuti ad inappropriattezza delle richieste.

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