Lezione 3 il sistema rh

Il sistema Rh

Il sistema Rh • Storia • Significato clinico • Genetica • Biochimica

• Espressione dell’antigene D • D debole • Altri antigeni Rh • Anticorpi anti-Rh • Tipizzazione Rh

- I termini Rh positivo ed Rh negativo si riferiscono alla presenza o assenza dell’antigene eritrocitario D - Il primo anticorpo anti-D è stato descritto nel 1939 da Stetson e Levine in una donna il cui feto era affetto da malattia emolitica fetale/neonatale; la donna presentò una reazione emolitica dopo una trasfusione di sangue dal marito

- Nel 1940, Landsteiner e Wiener descrissero un anticorpo ottenuto immunizzando delle cavie e dei conigli con le emazie di scimmie Rhesus - L’anticorpo agglutinava circa l’85% degli eritrociti umani esaminati - L&W diedero il nome di Rh al determinante corrispondente

- Nello stesso anno, Levine e Katzin trovarano anticorpi analoghi nei sieri di diverse donne che avevano partorito recentemente e almeno uno di questi sieri presentava reazioni analoghe a quelle ottenute con i sieri anti-Rhesus di origine animale

- Poco dopo la scoperta dell’antiD, studi familiari dimostrarono che l’antigene D è geneticamente determinato e la via di trasmissione del carattere seguiva quella di un carattere autosomico dominante

Significato clinico 1 • Dopo gli antigeni (ag) A e B, il D è il più importante nella pratica trasfusionale • Differentemente dagli ag A e B, le persone che NON possiedono l’ag D sui propri recettori NON presentano di norma l’anticorpo (ab) anti-D • L’ab anti-D origina dalla esposizione ad emazie D+ in seguito a trasfusioni o gravidanze

Significato clinico 2 • Rispetto agli altri antigeni eritrocitari, l’ag D possiede l’immunogenicità più spiccata • è stato stimato che dal 30 all’85% delle persone D negative che ricevono una trasfusione D positiva svilupperà l’anti-D

• per questo motivo, nella maggior parte dei paesi, tutti i riceventi e tutti i donatori di sangue vengono esaminati per l’ag D al fine di assicurare che i riceventi D negativi vengano identificati e ricevono sangue D negativo

Oltre all’ag D • A metà degli anni ’40 sono stati descritti altri 4 ag C, c, E, e che vennero riconosciuti come facenti parte del sistema Rh • In seguito sono stati scoperti molti altri antigeni; attualmente 49 antigeni sono correlati al sistema Rh

• molti di questi antigeni presentano differenze - qualitative - quantitative

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Oltre all’ag D • Sebbene il numero degli ag del sistema Rh sia cospicuo, in gran parte dei contesti di Medicina Trasfusionale i 5 antigeni principali, D, C, c, E, e ed i loro rispettivi anticorpi costituiscono la maggior parte delle problematiche cliniche che coinvolgono il sistema Rh

• BenchÊ gli ag Rh siano pienamente espressi alla nascita e siano precocemente rilevabili sin dalla 8° settimana di gestazione, essi sono presenti SOLO sui globuli rossi mentre non sono rilevabili sulle piastrine, sui linfociti, sui monociti, sui neutrofili o in altri tessuti

Genetica del sistema Rh 1 • Due geni altamente omologhi situati sul braccio corto del cromosoma 1, codificano per polipeptidi NON glicosilati che esprimono gli ag Rh

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Genetica del sistema Rh 2 • un gene, RHD, codifica una proteina che attraversa ripetutamente la membrana eritrocitaria e conferisce la specificità antigenica D al globulo rosso • nei soggetti caucasici D negativi (Rh -) il gene RHD è deleto • in altre popolazioni (africani, asiatici) il fenotipo D negativo è associato ad un gene RHD inattivo, mutato o parziale

Genetica del sistema Rh 3 • il gene RHCE determina gli antigeni C, c, E, e.

• gli alleli sono RHCe, RHCE, RHcE ed Rhce.

• studi di transfezione genica indicano che entrambi C/c e E/e risiedono su un singolo prodotto polipeptidico

Biochimica 1 • i prodotti di entrambi i geni RHD e RHCE sono proteine di 417 aa che attraversano per 12 volte la membrana eritrocitaria formando solo brevi anse esterne di aminoacidi

• i polipeptidi sono legati ad acidi-grassi e, diversamente dalla maggioranza delle proteine associate ai gruppi sanguigni, non presentano residui glucidici

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Biochimica 2 • Esiste una elevata omologia tra i prodotti dei geni RHD e RHCE • i prodotti dei differenti alleli RHCE sono a un livello ancora più simile

• gli antigeni C e c si differenziano uno dall’altro solamente per 4 aa nelle posizioni 16, 60, 68 e 103: di queste differenze, solo quella tra la serina e la prolina nella posizione 103 sembra essere l’elemento critico

Biochimica 3 • la presena della prolina o dell’alanina in posizione 226 differenzia E da e • il polipeptide D invece, possiede da 32 a 35 aa che sarebbero percepiti come estranei dai soggetti D negativi

Biochimica 4 • all interno della membrana eritrocitaria, i polipeptidi Rh formano un complesso con la proteina Rh-associata (RhAG), che per il 37% della sequenza risulta omologa con i polipeptidi Rh • la proteina RhAG è codificata dal gene RHAG situato sul cromosoma 6 • lo studio delle emazie Rhnull, prive di tutti gli ag Rh, rivela che il complesso Rh-RhAG è essenziale per l’espressione di altre proteine di membrana

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Determinazione del fenotipo • nella pratica di immunoematologia, sono facilmente reperibili 5 reattivi per la tipizzazione Rh: anti-D, anti-C, anti-c, anti-E e anti-e • L’insieme degli antigeni rilevati sulle emazie di una persona costituisce il suo fenotipo Rh

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Espressione dell’antigene D 1 • le persone D- sono prive del gene RHD oppure possiedono un RHD non funzionante • la maggior parte delle persone D- sono omozigoti per l’allele Rhce, il gene che codifica per c ed e • meno frequentemente possono presentare gli alleli RHCe o RHcE • l’allele RHCE che produce C ed E è raro negli individui D negativi e D positivi

Espressione dell’antigene D 2 • il genotipo delle persone D positive (DD o Dd) non può essere determinato direttamente con i mezzi sierologici • gli studi per stabilire la dose dell’ag D non sono efficaci per stabilire se un soggetto è omozigote o eterozigote per il gene RHD • utilizzando i tests sierologici, il genotipo RHD può essere assegnato solo attraverso la deduzione degli altri antigeni che sono associati con la presenza di D • le indagini molecolari permettono la determinazione del vero genotipo D

EFFETTO POSIZIONE: interazione tra geni (o loro prodotti) • se l’interazione avviene tra geni (o loro prodotti) posti sullo stesso cromosoma, si parla di effetto cis.

• es. di effetto cis: l’ag E prodotto da DcE è quantitativamente meno espresso dell’E prodotto da cE

• se un gene (od il suo prodotto) interagisce con quello di un altro gene posizionato sul cromosoma omologo si ha l’effetto trans • es: l’espressione di C è più debole nel genotipo DCe/DcE rispetto al genotipo DCe/ce. Analogamente E è più debole in Dce/DcE che non in DcE/ce

Espressione di C, c, E, e • per stabilire se una persona possiede i geni che codificano C,c, E, e, le sue emazie vengono esaminate con l’anticorpo specifico per ognuno di questi antigeni • se le emazie esprimono sia C che c oppure sia e che e, si può presumere che i geni corrispondenti siano presenti nell’individuo • se le emazie esprimono solo C oppure solo c oppure solo E o e, si presume che la persona sia omozigote per quel particolare allele

L’origine etnica • l’origine etnica influenza le deduzioni relative al genotipo, perché la frequenza dei geni Rh si diversifica da un gruppo etnico all’altro

• per es. un soggetto caucasico che presenta un fenotipo Dce avrà probabilmente un genotipo Dce/ce • in una persona africana invece lo stesso fenotipo può essere determinato dai genotipi Dce/Dce o Dce/ce

Tratto da Technical Manual AABB 15th edition

Genotipo • l’identificazione degli ag non conduce sempre ad un affidabile deduzione del genotipo

• conoscere il genotipo può essere utile negli studi di popolazione, nelle indagini di paternità e nella previsione dei geni Rh trasmessi dal marito o partner di una donna che presenta anticorpi specifici per gli ag Rh • le tecniche molecolari basate sulla PCR sono in grado di determinare il genotipo Rh partendo dal DNA dei leucociti o amniociti oppure dal DNA fetale extracellulare presente nel plasma materno

Quesito

valutazione della ‘zigosità’ del gene D in genitori (e feti) a rischio di MEFN

Casi

2 partners di madri ccdee = Dd 1 madre CCDee (DD) con anti-c e partner CcDee (Dd) 1 madre dd, partner DD, feto (amniociti) Dd

Espressione debole dell’antigene D 1. Le emazie che non sono agglutinate direttamente con l’antisiero anti D non possono essere subito classificate come negative 2. Vengono cimentate con antisieri policlonali mediante test di Coombs indiretto (37°C e siero anti-IgG): questo è detta determinazione del Ddebole 3. Se la reazione D debole è positiva (in presenza di un Test di Coombs Diretto negativo) l’antigene è presente sulla membrana in forma debolmente espressa 4. Se la reazione è negativa l’antigene non è presente: possiamo classificare le emazie come Rh-D negative

Fenotipo D-debole • Una volta veniva chiamato Du, termine oggi non ritenuto appropriato: le emazie che presentano forme indebolite dell’ag D vengono classificate come D positive e possono essere descritte come D-deboli • Può essere ereditato in tre diverse modalità: – Dovuto all’effetto di posizione (apparentemente non ereditario) in combinazione con il C in posizione trans – Espressione debole di D “normale” (ereditario) – Antigene incompleto/parziale (D mosaico)

Espressione debole di D “normale” (ereditario)

GR con Rh-D “normale”

D debole

D parziale (in passato noto come D mosaic o D variant) • Se il paziente viene trasfuso con emazie D positive può sviluppare un allo-anticorpo anti-D rivolto contro l’epitopo del D mancante Porzione Mancante

GR

GR

Vi sono 7 categorie di D mosaico

Gestione dei D deboli/parziali 1 • D debole nei donatori di sangue: • classificare come D positivo • la trasfusione di emazie D debole in un ricevente D negativo non è raccomandata perché alcune emazie D debole o D parziale possono evocare una risposta immune contro il D

Gestione dei D deboli/parziali 2 • D debole nei riceventi una trasfusione di sangue: • materia di discussione • la maggior parte di questi pazienti può ricevere sangue D+ senza rischio di immunizzarsi • TUTTAVIA se la debole espressione antigenica del D riflette l’assenza di uno o più epitopi, esiste la possibilità che la trasfusione di sangue D positivo possa immunizzare il paziente • ciò è soprattutto vero se il paziente è un DVI

Altri alleli ed antigeni Rh • C debole (Cw) – Non allelico rispetto a C e c (C e Cw si registrano spesso assieme) – 2% dei bianchi; molto raro nei neri – Anti-Cw può essere anticorpo naturale

• f (ce) – quando c & e sono in posizione cis, es., dce/DCe – E’ un antigene combinato

Fenotipi Null • Mancanza di epitopi Cc e/o Ee – DC-, Dc-, D-E, D-– Aumentata espressione di D Ag

• Rhnull : nessuna espressione di Rh Ag ---/--– La trasfusione di qualsiasi Ag Rh provoca la formazione di Ab anti Ag più Ab anti Rh 29 (“pan” o “total” Rh) – Si associa a lieve anemia emolitica e stomatociti

Anticorpi Rh • Anticorpi Immuni (IgG1 e IgG3 più importanti); raramente naturali (CE) • Reazione ottimale a 37oC o con AHG • Ordine di immunogenicità: D>c>E>C>e • Mostrano effetto dose • Spesso potenziati da trattamento enzimatico dei GR • Non legano il complemento (la distruzione eritrocitaria è extravascolare) • Gravi reazioni emolitiche e Malattia Emolitica del Neonato • Possibili auto-anticorpi che causano Anemia Emolitica Autoimmune

COMPATIBILITA’ Rh-D • Durante il primo contatto con le emazie Rh-D positive (durante trasfusione o parto), nel 30-70% dei casi può avvenire l’immunizzazione del soggetto Rh-D negativo, ma non si hanno in genere conseguenze cliniche significative.

• E’ però molto importante tenere presente che le donne che sviluppano anticorpi anti Rh-D durante eventuali successive gravidanze correranno un alto rischio di causare nel feto la malattia emolitica del neonato – MEN – con grave pericolo di vita o di disabilità per il nascituro Rh positivo.

• E’ pertanto particolarmente importante rispettare il fenotipo Rh-D nelle bambine e donne in età fertile e trasfondere anche in urgenza solo unità Rh-D negative a riceventi di sesso femminile Rh-D negative.

• Un soggetto Rh Positivo può invece ricevere emazie Rhnegative ( il d non è un “antigene” )