Πολυδύναμα Βλαστικά iPSCs

Optimized Approaches for Generation of Integration-free iPSCs from Human Urine-Derived Cells with Small Molecules (SM) and Autologous Feeder Di Li, Linli Wang, Jundi Hou, Qun Shen, Qianyu Chen, Xiaoshan Wang, Juan Du, Xiujuan Cai, Yongli Shan, Tian Zhang, Tiancheng Zhou, Xi Shi, Yuhua Li, Hua Zhang, and Guangjin Pan

Παραγωγή iPSCs από hUCs Στη μελέτη αυτή:  βελτιστοποιούμε

μεθόδους επαναπρογραμματισμού για hUCs με πολύ χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιώντας ένα σύνθετο «κοκτέιλ» παραγόντων (SM).

 αντικαθιστούμε

το matrigel με αυτόλογα τροφικά hUCs.

 δημιουργούμε

«τράπεζες» ειδικών iPSCs για τον ασθενή, με βολικό και μη επεμβατικό τρόπο, για εξατομικευμένη ιατρική, ανακάλυψη φαρμάκων και μοντελοποίηση ασθενειών. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

 καλλιέργειες

hUCs από διαφορετικούς δότες

 σημαντικός

αριθμός των hUCs με πολύ χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

 προβληματικά

για περαιτέρω παραγωγή iPSC.

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

http://www.cell.com/stem-cell-reports/abstract/S2213-6711(16)30007-8 ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές hUCs (HM1-1, HM1-2, και HM1-3) από το ίδιο άτομο, επαναπρογραμματίζονται χωρίς SM. (Α) Καμπύλες ανάπτυξης των hUCs με P 2-5. (Β) Άρα ο κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για μια επιτυχημένη γενιά iPSC. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Τα ποσοστά απόπτωσης, λόγω ηλεκτροδιάτρησης, δεν αυξήθηκαν σημαντικά σε hUCs με υψηλότερο Ρ. Άρα η απόπτωση των hUCs ίσως δεν είναι ο περιοριστικός παράγοντας που καθορίζει το ποσοστό του επαναπρογραμματισμού. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες



Η p53 αυξήθηκε από το Ρ6 στο Ρ12, των hUCs (D).



Με προσθήκη CPFT-α, μειορρυθμίζεται η p53 (Ε), ενώ βελτιώνεται σημαντικά, η απόδοση του επαναπρογραμματισμού (F, G). Άρα η p53 θα μπορούσε να είναι ένας αρνητικός παράγοντας για επαναπρογραμματισμού των hUCs. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Plan B: Προσθέσαμε τους 5 παράγοντες (SM) στο αρχικό στάδιο (πρώτες 7 ημέρες) και μία ακόμη ένωση, PD, σε μεταγενέστερο στάδιο, για επέκταση του επαναπρογραμματισμού των iPSCs (H). Απόδοση επαναπρογραμματισμού με plan B, με P 2-5 (I). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Χαρακτηρισμός δημιουργημένων iPSCs, με plan B, B από υγιή αρσενικά(ΗΜ1-iPS) και υγιή θηλυκά (IF1-iPS). Φυσιολογική μορφολογία ανθρώπινων εμβρυικών βλαστικών (A,B), φυσιολογικός καρυότυπος (C,D), ΑΡ θετικότητα σε πολλά passages (E,F), ανίχνευση γονιδίων πολυδυναμίας με FACS (Η), απομεθυλιωμένοι υποκινητές Oct4 και Nanog (Ι), τερατώματα (J) σε ποντίκια μετά από έκχυση. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Η απόδοση του επαναπρογραμματισμού με το plan B, μειώθηκε κατά το ήμισυ περίπου, όταν και οι έξι SMs αποσύρθηκαν σε μετέπειτα στάδιο (RM + 5Μ [ACTPN σε RM] -mTeSR1). Μειώθηκε ακόμα πιο δραματικά με την απόσυρση στο αρχικό στάδιο επαγωγή (RMmTeSR1 + 6M [ACTPN + PD σε mTeSR1]). Άρα η χρήση των SMs σε πρώιμο στάδιο είναι πολύ πιο απαραίτητη για τον επαναπρογραμματισμό. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Ο ρόλος των SM ξεχωριστά, σε hUCs με χαμηλό πολ/σμό (Κ). Μπορούν να αφαιρεθούν οι Α και Τ, χωρίς σημαντική μείωση επαναπρογραμματισμού. Ο ρόλος των SM ξεχωριστά, σε hUCs με κανονικό πολ/σμό (L).

Mπορεί να αφαιρεθεί ο N, χωρίς σημαντική μείωση επαναπρογραμματισμού. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Ανοσοφθορισμός των αποικιών του Oct4 + με εισαγωγή PD (SM) σε προχωρημένο στάδιο (Ρ5) (plan C).

C) ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Κοκτέιλ με αναστολέα p53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM) βελτιώνει την απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Πτώση επιπέδων έκφρασης, 14 γνωστών αναστολέων του επαναπρογραμματισμού σε hUCs με RM+5SM ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Αυτόλογα UCs τροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

Το ποσοστό επιβίωσης των hUCs μετά την ηλεκτροδιάτρηση για τη διαμόλυνση των παραγόντων επαναπρογραμματισμού ήταν μικρότερο από 10% (Α). Επιτυχής δημιουργία αποικιών iPSC εάν ο αριθμός των επιζώντων κυττάρων είναι πάνω από 2,5x104. Όχι, όμως, εάν είναι λιγότερα από 1,5 x104 (cells/well) (Β). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Αυτόλογα UCs τροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

hUCs από ασθενή με διαβήτη τύπου 1 (T1D3-P4), δεν μπορούν να δημιουργήσουν iPSCs χρησιμοποιώντας plan Β, Β λόγω των χαμηλών ποσοστό επιβίωσης μετά την ηλεκτροδιάτρηση (πάνω). Χρησιμοποιώντας το plan C εμφανίστηκαν κλώνοι iPSC, (κάτω). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Αυτόλογα UCs τροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

Πυκνότητα των τροφικών UCs και βέλτιστος επαναπρογραμματισμός σε: • UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και μεγάλο P (D) • UCs με κανονικό ρυθμό πολλαπλασιασμού και μικρό P (E). Η χρήση αυτόλογων τροφικών hUCs δεν ήταν ωφέλιμη, ίσως και ανασταλτική (Ε). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Αυτόλογα UCs τροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

Κύτταρα από ανθρώπινη ακροποσθία (HFF1-P8) και κύτταρα αμνιακού υγρού (AF1-P6), ως τροφικά (F και G), έχουν μικρή επίδραση στον επαναπρογραμματισμό.

Aντικατάσταση του Matrigel με συγκεκριμένο αριθμό αυτόλογα hUCs (gelatin+feeder) και παραγωγή iPSCs (Η). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Σύγκριση των plan Α, plan Β, και plan C για επαναπρογραμματισμός των UCs, σε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου

Ανθρώπινων iPSCs με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο Plan Α για hUCs με υψηλό πολλαπλασιασμό.

Plan Β για hUCs με μέτριο πολλαπλασιασμό.

Plan C αν το ποσοστό επιβίωσης των hUCs μετά την ηλεκτροδιάτρηση είναι πολύ χαμηλό. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Σύγκριση των plan Α, plan Β, και plan C για επαναπρογραμματισμός των UCs, σε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου

Χρώση αλκαλικής φωσφατάσης, των επαγώμενων iPSCs από HM1-3-P3 (Β). hUCs με μέτριο πολλαπλασιασμό για iPSCs με plan A, B, C. C Το plan C ήταν το καλύτερο, μετά το Β, και μετά το Α (Β και C). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Σύγκριση των plan Α, plan Β, και plan C για επαναπρογραμματισμός των UCs, σε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου

Δημιουργία τράπεζας iPSCs από τις περισσότερα είδη κυττάρων (D-F) με plan Α, Β, και C. C

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

Σύγκριση των plan Α, plan Β, και plan C για επαναπρογραμματισμός των UCs, σε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου

Επαναπρογραμματισμός κυττάρων αμνιακού υγρού (AF1) (G) από ομφάλιο λώρο (MSCs) με plan Α, Β, και C. C Πολύ μικρότερος επαναπρογραμματισμός μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από ομφάλιο λώρο (MSCs) με plan Α, Β, και C. C ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ •

Παραγωγή των ανθρώπινων iPSCs μέσω μη ιικής ενσωμάτωσης είναι συνήθως αργή και λιγότερο αποτελεσματική

•

Ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων hUCs έδειξαν χαμηλό πολλαπλασιασμό και ήταν δύσκολο να επαναπρογραμματιστούν για την παραγωγή iPSCs χρησιμοποιώντας την μη-ιική προσέγγιση.

•

Δύσκολη η φύλαξη iPSCs από διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο και διαφορετικούς ασθενείς.

Αλλά • Κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπινα ούρα παρέχουν ένα βολικό και μη επεμβατικό τρόπο για να ληφθούν κύτταρα του ασθενούς για παραγωγή iPSCs. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ρόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCs •

Ο C (Chir, αναστολέα GSK3b) και ο Ρ (CPFT-α, αναστολέας p53) έδειξαν σημαντική βελτίωση στον επαναπρογραμματισμό hUCs, ενώ ο Ν (ΝαΒ, αναστολέας της HDAC) έδειξε μέτρια βελτίωση.

•

Ο Α (Α-83-01, αναστολέας TGF-β) και ο Τ (TZV, αναστολέας ROCK) είχαν ελάχιστη επίδραση όταν χρησιμοποιήθηκαν μόνοι τους.

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ρόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCs •

Ο PD (PD0325901, αναστολέας MEK/MAPK/ERK) φαίνεται να καταστέλλει την ανάπτυξη των μη επαναπρογραμματισμένων κυττάρων και να προωθεί τον επαναπρογραμματισμό όταν προστεθεί σε μεταγενέστερο στάδιο.

•

προσθέτοντας PD σε πρώιμο στάδιο αναστέλλεται ο επαναπρογραμματισμός των hUCs αλλά σε μεταγενέστερο στάδιο προωθείται. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ p53 •

Σημαντική ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη

•

αυξορρυθμίζεται από παράγοντες OSKM, προκαλώντας κυτταρική γήρανση, άρα και αναστολή του επαναπρογραμματισμού,

•

μειορρυθμίζεται από τον Ρ (CPFT-α) και από τον παράγοντα επαναπρογραμματισμού, SV40LT,

•

καταστέλλοντας την p53 (RNAi ή με knockout), επάγεται επαναπρογραμματισμός και παραγωγή iPSCs, ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ p53 •

όμως, χαμηλής δραστηριότητα της p53 εγείρει ανησυχίες για γενωματική αστάθεια.

•

θεωρώντας τον SV40LT, ως έναν αρνητικό παράγοντας για την p53, που είχε ήδη χρησιμοποιηθεί στον επαναπρογραμματισμό, ελαχιστοποιούμε την εφαρμογή της Ρ (CPFT-α).

•

υπάρχει, λοιπόν, μία συνεργιστική καταστολή της p53 με SV40LT, αντί για CPFT-α.

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ν (ΝαΒ αναστολέας της HDAC) •

δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην προώθηση επαναπρογραμματισμού των hUCs, με υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

•

ενεργοποεί την έκφραση των miR302/367, τα οποία προωθούν περαιτέρω τον επαναπρογραμματισμό,

•

διευκολύνει τον επαναπρογραμματισμό μόνο με την παρουσία του εξωγενούς c-Myc. Έτσι, αντικαθιστώ το cMyc με miR302/367,

•

είναι ευεργετικό για επαναπρογραμματισμό hUCs με χαμηλό πολλαπλασιασμό (κοκτέιλ SM). ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αυτόλογα τροφικά •

αν ο αριθμός των επιζώντων κυττάρων μετά από ηλεκτροδιάτρηση, δεν είναι επαρκής, συνήθως δεν δημιουργούνται iPSCs

•

με επίστρωση των επιμολυσμένων hUCs πάνω στο αυτόλογα μη επιμολυσμένα κύτταρα (τροφικά), ήμαστε σε θέση να παράξουμε iPSCs από έναν πολύ μικρό αριθμό επιβιώντων hUCs

•

όμως, κατά τον επαναπρογραμματισμό, εάν ο συνολικός αριθμός των τροφικών hUCs είναι πολύ υψηλός, η αποδοτικότητα επαναπρογραμματισμού μειώνεται. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αυτόλογα τροφικά •

είναι δυνατή η αντικατάσταση του Matrigel ως εξωκυτταρική μήτρα για επαναπρογραμματισμό, και η παραγωγή iPSCs υπό συνθήκες χωρίς ζωικά συστατικά,

•

γίνεται παραγωγή iPSCs, (με plan A, B ή C) και είναι δυνατή η δημιουργία «τράπεζα» iPSCs από/για ασθενείς με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο.

•

ίσως και για μοντελοποίηση ασθενειών, παραγωγή νέων φαρμακευτικών ουσιών, αλλά και στην αναγεννητική Ιατρική. ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ!

ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ