Παρουσίαση p14arf

Απώλεια της p14ARF προσδίδει αντοχή σε κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από θερμικό σοκ (HS) και οξειδωτικό στρες (OS) με υπερρύθμιση της β-κατενίνης Alexander Damalas, Georgia Velimezi, Alexander Kalaitzakis, Michalis Liontos, Athanasios G. Papavassiliou, Vassilis Gorgoulis and Charalampos Angelidis

p14ARF • Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη που ενεργοποιείται από ογκογόνα ερεθίσματα και ενεργοποιεί την p53.

• Δεν φαίνεται να ενεργοποιείται από βλάβη στο DNA • Καταστολή της αυξάνει την αντίσταση σε κυτταρικό θάνατο, που προκαλείται όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Η2Ο2 (HS) ή εκτέθηκαν σε θερμικό σοκ (OS).

p14ARF • Επάγεται σε απόκριση σε αυξημένη μιτογονική διέγερση • Συσσωρεύεται κυρίως στον πυρηνίσκο, όπου σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με Mdm2 (αρνητικός ρυθμιστής του ογκοκατασταλτικού p53, και αναστέλλει τη μεταγραφή του) • Δρα ως καταστολέας όγκων.

p53 • Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη, που ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο. Στη μεταλλαγμένη της μορφή, όμως, ευνοεί την ανάπτυξη καρκίνου.

• Αποτελεί σημαντικό διαγνωστικό δείκτη σε πολλούς τύπους καρκίνου.

β-κατενίνη • Συνδέει πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού με τις κατχερίνες της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Εξασφαλίζεται, έτσι, η στενή σύνδεση των κυττάρων μεταξύ τους.

• Είναι επαγωγέας της p14ARF • Συχνά υπερεκφράζεται ή μεταλλάσσεται σε διάφορα καρκινώματα • Επάγει μεταγραφή

Hsp70 Η έκφρασή της αυξάνεται εντυπωσιακά μετά από HS και OS, οπότε μετακινείται στον πυρήνα και ειδικότερα στον πυρηνίσκο.

Είναι παράγοντας επιβίωσης για καρκινικά κύτταρα. Εμφανίζεται αυξημένη σε αυτά, αλλά εμποδίζει τη μετάστασή τους. Σχετίζεται με: • θερμοανθεκτικότητα (heat-shock protein) • μεταφορά πρωτεϊνών (chaperone) • ρύθμιση πρωτεϊνικής αποικοδόμησης • αντιαποπτωτική λειτουργία • προστασία DNA από μονόκλωνες ρήξεις.

p14ARF / β-κατενίνη / Hsp70 Στην εργασία αυτή φαίνεται ότι: • Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF, μετά από OS ή HS • αυξημένα επίπεδα και δραστικότητα της β-κατενίνης προσφέρει προστασία από κυτταρικό θάνατο με απόπτωση.

• η Hsp70 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης με αλληλεπίδραση με p14ARF. Άρα • η Hsp70, η p14ARF και η β-κατενίνη δημιουργούν μια ρυθμιστική ομάδα

• αυτή η νέα οδός επάγει σήματα κυτταρικού θανάτου όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε HS και OS.

Η αποσιώπηση της p14ARF εξασθενεί την αποπτωτική απόκριση μετά από HS και OS

Ανάλυση κηλίδος (western blot) Η α-τουμπουλίνη χρησίμευσε ως μάρτυρας (Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά από HS)

Η αποσιώπηση της p14ARF εξασθενεί την αποπτωτική απόκριση μετά από HS και OS

Κυτταρομετρία ροής (FACS) σε μάρτυρα (ctrsh) και σε κύτταρα που μετασχηματίστηκαν με πλασμίδιο αποσιώπησης της p14ARF (shp14)

Η αποσιώπηση της p14ARF εξασθενεί την αποπτωτική απόκριση μετά από HS και OS

Ανάλυση κηλίδος (western blot) για p14ARF σε κύτταρα NARF2 (επάγει p14ARF με IPTG), κάποια από τα οποία υποβλήθηκαν και κάποια όχι σε HS, πριν και μετά την προσθήκη IPTG Η α-τουμπουλίνη χρησίμευσε ως μάρτυρας

Η αποσιώπηση της p14ARF εξασθενεί την αποπτωτική απόκριση μετά από HS και OS

Κυτταρομετρία ροής (FACS) σε κύτταρα NARF2 σε κύτταρα χωρίς HS και με HS.

Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF προστατεύοντας τα κύτταρα από OS που προκαλεί απόπτωση

Ανάλυση κηλίδος (western blot) για τα επίπεδα της β-κατενίνης σε μάρτυρα (ctrsh) και σε shp14 κυττάρων HeLa και Η1299, καθώς και σε διεγερμένα και μη διεγερμένα κύτταρα NARF2 μετά από HS και OS. Η α-τουμπουλίνη χρησίμευσε ως μάρτυρας

Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF προστατεύοντας τα κύτταρα από OS που προκαλεί απόπτωση

Ανάλυση RT-PCR δεν αποκαλύπτει καμία διαφορά στα επίπεδα mRNA βκατενίνης σε κύτταρα H1299 (ctrsh και shp14) μετά από HS και OS.

Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF προστατεύοντας τα κύτταρα από OS που προκαλεί απόπτωση

Ανάλυση κηλίδος (western blot) δείχνει εξάντληση της β-κατενίνης μετά από siRNA. Η ακτίνη χρησίμευσε ως μάρτυρας

Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF προστατεύοντας τα κύτταρα από OS που προκαλεί απόπτωση

Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS) σε ctrsh και shp14 μετά από OS και αποσιώπηση β-κατενίνης (si β-cat).

Η β-κατενίνη, ρυθμίζεται αυξητικά με την αποσιώπηση της p14ARF προστατεύοντας τα κύτταρα από OS που προκαλεί απόπτωση

Δοκιμασία λουσιφεράσης σε κύτταρα HeLa και Η1299, μετρά τη δραστικότητα της β-κατενίνης, σε ctrsh και shp14.

Αγρίου τύπου (wt)-TFC είναι ο μάρτυρας λουσιφεράσης που περιέχει ένα τεχνητό υποκινητή της β-κατενίνης (TOPFlash) Κυρίαρχο αρνητικό (DN)-TFC είναι ο μάρτυρας λουσιφεράσης που καθοδηγείται από τον κυρίαρχο αρνητικό υποκινητή της β-κατενίνης.

Η Hsp70 ρυθμίζει την έκφραση της β-κατενίνης και αλληλεπιδρά με p14ARF μετά από HS και OS Ανάλυση κηλίδος (western blot) για Hsp70, σε κύτταρα HeLashp14, μετά από HS και OS Knock-down της Hsp70 (shHsp70) αποτρέπει ρυθμιζόμενη αύξηση της βκατενίνης σε ctrsh (b) και σε shp14 (c).

Η α-τουμπουλίνη και η ακτίνη χρησίμευσαν ως μάρτυρες.

Η Hsp70 ρυθμίζει την έκφραση της β-κατενίνης και αλληλεπιδρά με p14ARF μετά από HS και OS

Ανάλυση ανοσοφθορισμού δείχνει μετατόπιση της Hsp70 στον πυρήνα μετά από HS και συνεντοπισμός με p14ARF στον πυρηνίσκο σε HeLa (d) και H1299 (e) (λευκή διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τα πυρηνικά όρια).

Η Hsp70 ρυθμίζει την έκφραση της β-κατενίνης και αλληλεπιδρά με p14ARF μετά από HS και OS

Συνανοσοκατακρήμνιση (CoIP) αποδεικνύει την αλληλεπίδραση των ενδογενών Hsp70 και p14ARF σε HeLa κύτταρα. Η εισαγωγή έγινε στις 3 πρώτες λωρίδες ως θετικός μάρτυρας, Οι τρεις μεσσαίες λωρίδες είναι προϊόντα λύσης με αντίσωμα αντι-Hsp Οι τρεις τελευταίες λωρίδες αντιπροσωπεύουν προϊόντα λύσης που καταβυθίστηκαν με μη ειδικό αντίσωμα

Το προτεινόμενο μοντέλο που απεικονίζει τον μηχανισμό της ρύθμισης της ρύθμισης της βκατενίνης με άξονα τις p14ARF-Hsp70 Τα στρεσογόνα ερεθίσματα HS και OS προκαλούν την μετατόπιση της Hsp70 στον πυρήνα. Με την παρουσία της p14ARF (μπλε διακεκομμένη γραμμή), συνδέεται με Hsp70 που συσσωρεύεται στον πυρηνίσκο και δεν επηρεάζει την αποικοδόμηση της βκατενίνης μέσω ουβικιτινίωσης (απόπτωση).

Το προτεινόμενο μοντέλο που απεικονίζει τον μηχανισμό της ρύθμισης της ρύθμισης της βκατενίνης με άξονα τις p14ARF-Hsp70 Σε απουσία της p14ARF (κόκκινη διακεκομμένη γραμμή), αν και συσσωρεύεται λιγότερη Hsp70 στον πυρήνα, αυξάνει το κυτταροπλασματικό της κλάσμα, προστατεύοντας την β-κατενίνη από την αποικοδόμηση (η β-κατενίνη πηγαίνει στον πυρήνα, επάγει μεταγραφή, όχι απόπτωση).

Αποτελέσματα - συζήτηση Σε ποντικούς ξέρουμε ότι η ARF: • είναι πρωτεΐνη ογκοκαταστολέας, • αισθάνεται ογκογόνα ερεθίσματα, ενεργοποιεί την p53, και έτσι ρυθμίζεται ο κυτταρικός κύκλος, • δεν φαίνεται να παίζει ρόλο στην αντιμετώπιση βλαβών του DNA

Αποτελέσματα - συζήτηση • Η απόπτωση που προκαλείται από HS και OS, φαίνεται να έχει σχέση με την p14ARF.

• Η απόπτωση που προκαλείται από p14ARF, είναι επίσης ανεξάρτητη της p53, (τα HeLa και H1299, έχουν ή απενεργοποιημένη ή μη υπάρχουσα p53) • Η β-κατενίνη (γνωστός ενεργοποιητής της p14ARF), είναι αυξημένη σε κύτταρα shp14 και συναντάται συχνά σε μεγάλες ποσότητες (υπερεκφραζόμενη) στον καρκίνο.

• Αποσιώπηση της β-κατενίνης, έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση που προκαλείται από HS και OS. Δρα λοιπόν ως προ-επιβιωτικός παράγοντας.

Αποτελέσματα - συζήτηση • Η β-κατενίνη και η p14ARF, σχηματίζουν έναν βρόγχο αρνητικής ανάδρασης.

• Αποσιώπηση της Hsp70,οδήγησε σε μειωμένη έκφραση της β-κατενίνης σε κύτταρα στα οποία προκλήθηκε HS ή OS, ενώ ανοσοφθορισμός και ανάλυση συνανοσοκατακρήμνισης, έδωσε αποδεικτικά στοιχεία ότι, η Hsp70 συνδέεται με p14ARF, στους πυρηνίσκους. Άρα αποδεικνύεται: μια λειτουργική σχέση μεταξύ Hsp70, p14ARF και β-κατενίνης.

Αποτελέσματα - συζήτηση • Η p14ARFαλληλεπιδρά με την Hsp70 μετά από HS ή OS. Αυτή η αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών, επιτρέπει να γίνει μια υποβάθμιση της β-κατενίνης, οδηγώντας τελικά σε απόπτωση.

• Σε απουσία της p14ARF, η Hsp70 συσσωρεύεται σε ένα μικρότερο βαθμό στους πυρηνίσκους. Ένα αυξημένο ελεύθερο κλάσμα της, θα μπορούσε να καταστείλει την αποικοδόμηση με ουβικιτινίωση της β-κατενίνης, προωθώντας έτσι την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του καρκίνου.

• Αυτό το εύρημα θα μπορούσε να έχει πιθανές κλινικές εφαρμογές, όσον αφορά την θεραπεία ασθενών με καρκίνο, με καινούρια φάρμακα αναστολείς της β-κατενίνης.