Reporte técnico final, sagarpa 2005 12690 by SNITT Sistemas

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A.C.

Mérida, Yucatán a 31 de Marzo de 2009.

Lic. Rafael Pando Cerón Secretario Técnico Fondo Sectorial SAGARPA-CONACYT Av. Insurgentes 1582, 5° Piso Col. Crédito Constructor CP 03940 México, D.F. Estimado Lic. Pando Cerón: Por este conducto le hago llegar el Informe Final del proyecto SAGARPA-2005-12690 “Micropropagación de cocotero Alto del Pacífico resistente al Amarillamiento Letal: producción de embriones somáticos y su conversión a plántulas”. Agradezco ampliamente el apoyo otorgado por el Fondo. Sin más por el momento, aprovecho para enviarle un cordial saludo.

Atentamente

Dr. Carlos Oropeza Salín Responsable del Proyecto

CICY, Calle 43 N° 130, Colonia Chuburna de Hidalgo 97200 Mérida, Yuc., México. Tel: 52 (999) 942-8330 Fax: 52 (999) 981-3900

REPORTE TÉCNICO FINAL

Clave del Proyecto:

SAGARPA-2005-12690

Título del Proyecto:

“Micropropagación de cocotero Alto del Pacífico resistente al Amarillamiento Letal: producción de embriones somáticos y su conversión a plántulas”

Sujeto de Apoyo:

Centro de Investigación Científica de Yucatán

Responsable Técnico: Carlos M. Oropeza Salín Informe:

Final

1. RESULTADOS DEL PROYECTO 1.1. INTRODUCCIÓN

El cocotero es una especie muy importante desde el punto de vista económico y de subsistencia. Es una fuente de ingresos importante para México ya que de ella dependen aproximadamente 50,000 familias y se cultiva en una superficie cercana a 100,000 ha (www.conacoco.com.mx). Las diferentes partes de esta palma permiten una gran diversidad de usos. Por ejemplo las hojas se pueden usar para la construcción de palapas, y la madera del tronco se puede usar para la elaboración de casas, muebles, pisos, utensilios caseros, etc. Sin embargo es el fruto y los diferentes materiales que se pueden obtener de él, lo que permite la mayor diversidad de usos y los más importantes desde el punto de vista económico. Del neollo se obtiene aceite que se usa principalmente para la elaboración de jabones. De la concha se puede producir carbón activado. De bonote se obtienen productos para la industria automotriz y la horticultura. Actualmente hay tres productos relativamente nuevos que tienen un gran potencial y que podrían ser muy rentables. Dos de ellos el agua embotellada y el aceite virgen ya están en el mercado en nuestro país y en Estados Unidos y Europa. El tercer producto es el coco-biodiesel, en particular usándose como aditivo para combustible de origen fósil, pues se ha reportado una reducción de hasta el 90% de las emisiones nocivas al medio ambiente, usándose al 1-2% (Lao, 2006; Díaz, 2008). Esta aplicación ya está disponible comercialmente en Filipinas (Philippine Department of Energy, http://www.doe.gov.ph /AF/Biofuels.htm). Desafortunadamente la productividad del cocotero en México es baja debido a la senectud de las palmas y enfermedades como el amarillamiento letal (AL), que es causada por fitoplasmas (Beakbane et al., 1972; Heinze et al., 1972; Plavsic-Banjac et al., 1972) que puede ser trasmitida, al menos en Florida, a través de el homóptero Myndus crudus (Howard et al., 1982). En México apareció en los años setenta, con la pérdida de más del noventa por ciento de las palmas en la Península de Yucatán y actualmente está devastando los estados del Golfo de México y amenaza a los del Pacifico (ver Oropeza et al., 2005a). Hasta la fecha la forma más eficaz de enfrentar al AL es replantando con genotipos resistentes. Pero su disponibilidad es muy baja y su propagación por semilla tomaría demasiado tiempo, sobre todo si se hace a partir de palmas seleccionadas por su alto rendimiento. Una alternativa es la micropropagación que permitiría multiplicar individuos elite en números suficientes para los futuros programas de replantación. Estudios de 14 años de productividad y resistencia al AL en 18 poblaciones mexicanas de cocotero conducidos por el CICY, permitieron identificar tres ecotipos del Pacifico Mexicano (Zizumbo et al., 1999). Dos de ellos Mx-PT2 y Mx-PT1 con baja mortalidad al AL de 25 y 30% respectivamente (Zizumbo et al., 1999), de los que se han seleccionado plantas de estos con alta productividad. Asimismo, el CICY ha desarrollado un protocolo eficiente de micropropagación de cocotero Enano Malayo mediante la aplicación de la embriogénesis somática secundaria y la multiplicación de callos embriogénicos (Pérez-Núñez et al., 2006). En la presente propuesta se optimizará dicho protocolo para cocotero Alto del Pacífico (Mx-PT2 y Mx-PT1) resistentes al AL y seleccionadas por sus características agronómicas. Además de aplicarle para la producción de mil plantas, que posteriormente se usarán para establecer una plantación demostrativa de 4 ha en Colima. El presente proyecto es continuación de otro de un año de duración que el CICY llevó a cabo (SAGARPA 2004 C01-99), en el cual los objetivos fueron producir embriones cigóticos de palmas seleccionadas de Altos del Pacifico y su utilización como explantes para iniciar cultivos in vitro, mismos que fueron la base para las actividades del presente proyecto.

OBJETIVO

Establecer un protocolo de alta eficiencia para la micropropagación de palmas elite de cocotero de los ecotipos Alto del Pacífico seleccionadas por su resistencia al amarillamiento letal y su alta productividad, que permita la producción masiva de palmas de cocotero necesarias ayudar a revitalizar a este cultivo en nuestro país, renovar el paisaje necesario para industria turística y evitar la erosión de las playas.

1.2. RESULTADOS EXPERIMENTALES

a. Formación de embriones cigóticos como fuente de explante

El enfoque de micropropagación utilizado en el presente proyecto se basa en el uso de plúmulas como explantes primarios, las que son obtenidas a partir de embriones cigóticos. Por ello se trabajó en la formación de frutos mediante polinización controlada, cruzando palmas que habían sido seleccionadas previamente. La producción de estos frutos y la obtención de los embriones cigóticos correspondientes se inició en el proyecto previo SAGARPA-2004-C01-99/A-1 y se continuó en el presente proyecto. En la Tabla 1 se presenta las cifras de producción de embriones cigóticos: 615 en el proyecto previo y 369 en el presente. Se incluyen frutos formados mediante autopolinización en palmas seleccionadas en la última etapa del proyecto, de los que se cosecharon nueve embriones cigóticos.

Tabla 1. Embriones cigóticos formados que fueron usados como fuente de explante. N° embriones cigóticos obtenidos Tipo

Cruza Cruza Autofecundado Autofecundado

Progenitores

Colima x Michoacán Michoacán x Colima Colima Michoacán Total

Proyecto SAGARPA2004-C01-99/A-1 274 341 0 0 615

El presente proyecto 174 186 5 4 369

Total 448 527 5 4 984

Tabla 2. Formación de callos embriogénicos y de embriones somáticos. Productos de cultivo

Lote 1

Lote 2

Lote 3

Lote 4

Lote 5

Lote 6

Total

Callos embriogénicos

829 a

708 c

1,163 e

7,565 g

14,372 i

12,628 k

37,265

Embriones somáticos

1,516b

1,453d

1,757f

1,204h

8,391j

13,882l

28,203

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) (l)

Callos embriogénicos obtenidos en el proyecto previo 2004-C01-99. Embriones somáticos obtenidos en el presente proyecto a partir de los callos del proyecto previo 2004-C01-99. Callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 1. Embriones somáticos obtenidos de los callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 1. Callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 2. Embriones somáticos obtenidos de los callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 2. Callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 3. Embriones somáticos obtenidos de 512 callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 3. Callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 4. Embriones somáticos obtenidos de 2264 callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 4. Callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 5 (extensión). Embriones somáticos obtenidos de 3584 callos embriogénicos obtenidos en el presente proyecto etapa 5 (extensión).

b. Desarrollo morfológico in vitro

A partir de las plúmulas aisladas utilizadas como explantes primarios y cultivadas en medio I, se obtuvieron callos embriogénicos (Fig. 1A) que mostraron las estructuras características denominadas estructuras embriogénicas (Pérez-Núñez et al, 2006, Sáenz et al., 2006). Estas estructuras embriogénicas fueron aisladas y a su vez utilizadas como explantes secundarios para generar nuevos

callos embriogénicos como parte del proceso de multiplicación de callo embriogénico, permitiendo una producción continua de callos embriogénicos. Cuando estos callos fueron puestos en medio II se formaron embriones somáticos (Fig. 1B) que germinaron (Fig. 1C y 1D) y desarrollaron para formar brotes (Fig. 1E) y finalmente plantas (Fig. 1F).

Figura 1. Desarrollo morfológico in vitro: (A) callos embriogénicos mostrando estructuras embriogénicas [EE]; (B) callos con embriones somáticos [ES]; (C) y (D) callos con embriones germinando [ESg]; (E) callos con brotes en desarrollo [B]; y (F) planta completa.

La multiplicación de callos embriogénicos durante ciclos subsecuentes permitió una producción continua para alcanzar un total de 37,265 callos (Tabla 2), incluyendo los 829 callos que se habían obtenido durante el proyecto previo 2004-C01-99. A los callos obtenidos de cada plúmula se les dio seguimiento y se clasificaron en función de su capacidad para generar callo embriogénico durante su multiplicación, definiéndose así líneas de callos embriogénicos con diferente nivel de desempeño. En una primera selección se eliminaron las que producían bajos porcentajes de callo. De esta forma se conservaron solo 41 líneas (Tabla 3), cuyos desempeños han sido regular (30-50%), bueno (>50-70%), muy bueno (>70-

90%) o excelente (>90%). Estas incluyen las recientemente obtenidas de embriones cigóticos producidos a través de autopolinización, que han mostrado un muy buen desempeño (Fig. 2), en particular las líneas 9 (87%) y 30 (97%), superior a las líneas obtenidas por cruzamiento.

Tabla 3. Líneas de callos embriogénicos de cocotero Alto del Pacífico, origen y desempeño en términos de su capacidad para multiplicarse en condiciones in vitro. No. Líneas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41.

Tipo de material Autopolinizado Autopolinizado Autopolinizado Autopolinizado Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza Cruza

Progenitor femenino C1-9 M1-30 C1-83 C1-29 C1-79 C1-62 C1-62 C1-29 C1-26 C1-26 C1-26 M1-192 M1-192 M1-192 M1-192 M1-150 M1-150 M1-79 M1-25 M1-192 M1-2 M1-2 C1-79 C1-69 C1-35 C1-29 C1-26 C1-29 C1-29 M1-133 M1-133 M1-133 M1-133 M1-82 M1-82 M1-60 M1-60 M1-30 M1-30 M1-30 M1-25

Progenitor masculino C1-9 M1-30 C1-83 C1-29 M1-2 M1-150 M1-2 M1-2 M1-150 M1-192 M1-192 C1-83 C1-29 C1-29 C1-69 C1-29 C1(29) C1-133 C1-29 C1-79 C1-69 C1-79 M1-133 M1-133 M2-100 M1-133 M1-150 M1-133 M1-2 C1-69 C1-29 C1-79 C1-69 C1-29 C1-79 C1-79 C1-29 C1-29 C1-29 C1-69 C1-66

Plantación Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Covadeiria Covadeiria Guadalupe Covadeiria Covadeiria Covadeiria Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Covadeiria Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Covadeiria Guadalupe Guadalupe Covadeiria Covadeiria Covadeiria Covadeiria Covadeiria Covadeiria Covadeiria Covadeiria Guadalupe Guadalupe Guadalupe Covadeiria

Clasificación 1 Excelente Excelente Muy buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular Regular

(1) Clasificación: Excelente: >90%. Muy buena: >70-90%. Buena: >50-70%. Regular: 30-50%.

Figura 2. Desempeño de líneas de callo embriogénico obtenidas de plúmulas de frutos formados por autopolinización, en porcentaje de formación de callo embriogénico. Los resultados muestran el promedio de dos ciclos de multiplicación y las barras denotan desviación estándar.

Asimismo se evaluó el desempeño de las líneas en cuanto a su capacidad de multiplicación, si se conservaba constante o no, producción de embriones y porcentaje de conversión a plántula. En la Tabla 4 se presenta los resultados de la evaluación de algunas líneas. Esto permitió observar que hay diferencias, unas tienen valores más altos que otras en el promedio de porcentaje de producción de callo embriogénico, producción de embriones somáticos por callo y porcentaje de conversión. Sobresalen las líneas M1192 x C169 y M1192 x C129 con mejor desempeño general (Tabla 4, resaltadas en negritas). El hecho de que se pudieran obtener embriones somáticos de callos embriogénicos obtenidos después de varios pasos de multiplicación, permitió confirmar la capacidad de estos callos para generar embriones somáticos.

Tabla 4. Desempeño de varias líneas de callo embriogénico a través de diferentes ciclos de multiplicación.

Planta C126 C129 C162 M1192 M1192 M1192

Padres Inflorescencia 16 15 15 17 19 20

Polen M1192 M1 2 M1 2 C169 C129 C129

Plúmula Inicial (n) 5 3 2 2 1 3

Multiplicación de callo (%) C0

C1I C1II C1III CES

C2I C2II C2III Prom

40 100 50 50 100 66

36 31 33 30 35 67

67 70 78 47 54 52

45 60 67 56 41 37

42 27 69 49 35 62

58 56 53 59 48 49

42 45 70 57 46 70

58 30 69 56 43 71

48.5 52.3 61.1 50.5 50.2 59.2

n C n ES ES/callo

Conversión %

73 158 2.1 ± 0.7 161 764 4.7 ± 0.7 51 131 2.7 ± 0.6 182 1716 8.9 ± 2.4 197 1463 7.4 ± 1.7 141 804 5.5 ± 2.3

8.8 7 44.2 33.1 39.5 9.4

Figura 3. Proceso de micropropagación de cocotero Alto del Pacífico. Se integran todas las etapas desde la obtención de la plúmula a partir del embrión cigótico, hasta la formación de planta. También se incluyen los procesos de multiplicación de callo embriogénico y de embriogénesis somática secundaria.

Para resumir el proceso completo de micropropagación implementado, se presenta un esquema en la Fig. 3 con sus diferentes etapas morfogénicas: desde explante hasta planta, mostrándose también como se incorpora la multiplicación de callo embriogénico y la embriogénesis somática secundaria. Durante el desarrollo del proyecto no se conservaron todos los callos producidos pues hubiera sido imposible manejarles en cuanto a personal y espacio en cuartos de cultivo. Por lo tanto el esquema de producción de callo se efectuó con base a usar una parte o alícuota de los callos, para aislar estructuras embriogénica y usarlas como explantes en el siguiente paso, eliminando a aquellos callos que no se usaron. En la Tabla 5A para ilustrar el caso de una línea individual, se muestran las cifras utilizadas de callos embriogénicos [CE], estructuras embriogénicas [EE] y embriones somáticos [ES]. Las cifras reales de callos producidos y utilizados acumulados de todas las líneas que se manejaron, fueron 37,265 callos y 28,203 embriones somáticos (ver Tabla 2). En contraste, para una sola línea, si no se hubiera eliminado ninguno de los callos producidos se podría alcanzar una producción total de callos de 1,966,080 y de embriones somáticos de 4,915,200 (Tabla 5B). Con lo que tenemos una idea del potencial del proceso si se operara a toda su capacidad.

Tabla 5. Capacidad estimada de propagación del proceso. (A) Esquema de trabajo usado en el desarrollo del proyecto. Se muestran las cantidades utilizadas de callos embriogénicos [CE], estructuras embriogénicas [EE] y embriones somáticos [ES]. Representan en cada caso alícuotas de la producción total. El resto fueron desechados. (B) Esquema estimado de producción total de CE, EE y ES, asumiendo que no se desecho ninguno de los producidos y se utilizaron todos para fines de multiplicación.

Producción

Proyección Explantes

Tiempo Paso (meses) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 6 9 12 13 16 19 22 23 26

Explantes N°

Tipo

300 Plúmula 300 EE 300 EE 300 EE 100 ES 300 EE 300 EE 300 EE 100 ES 300 EE

Callos Callos Callos formados elimiutilizados (40%) nados 120 120 120 120 40 120 120 120 40 120

30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

90 90 90 90 10 90 90 90 10 90

Plúmulas 300 -

Callos producidos

Embriones somáticos producidos

120 1,200 480 4,800 1,920 19,200 7,680 19,200 19,200 7,680 76,800 30,720 307,200 122,880 1,228,800 491,520 1,228,800 1,228,800 491,520 4,915,200 1,966,080 4,915,200

Figura 4. Etapas finales del proceso de micropropagación de cocotero. (A) Plántulas en condiciones in vitro listas para ser transferidas a condiciones ex-vitro para aclimatación. Aclimatación de plántulas en invernadero sembradas en mezcla con tierra: (B) con cubierta transparente perforada y (C) posteriormente sin la cubierta transparente, para ajuste gradual a un medio ambiente más seco.

c. Conversión de los embriones somáticos a plántula

Como ya se mencionó, los embriones fueron capaces de germinar y desarrollar a planta completa con hojas y raíces. Este paso de embrión a planta o conversión, ocurrió en porcentajes que según la línea de que se trate, variaron de 7 a cerca de 40% (Tabla 4). Al terminó del proyecto se contaba con 180 plantas en invernadero y aproximadamente 2000 plantas en diferentes etapas de desarrollo en condiciones in vitro. Estas serán utilizadas para el establecimiento de parcelas de evaluación y demostrativas. Se están haciendo arreglos para el establecimiento de parcelas en: Yucatán con los miembros del Ejido de San Crisanto; Tabasco con el INIFAP y el Consejo Estatal del Cocotero de Tabasco; y Colima con la Universidad de Colima y el Consejo Estatal del Cocotero de Colima.

d. Mejora de pasos individuales del proceso

El proceso descrito arriba muestra un rendimiento muy grande en términos de callos embriogénicos y embriones somáticos formados, por medio de la acumulación de estas estructuras a través de pasos repetitivos de multiplicación. Sin embargo los rendimientos y desempeño de los pasos individuales, porcentaje de explantes que forman callo embriogénico, cantidad de embriones somáticos formados, proporción de embriones somáticos que germinan y el desarrollo durante la conversión de embrión a plántula, aún son bajos y deben de ser mejorados. Este proceso de acumulación por multiplicación de callos embriogénicos y embriogénesis somática secundaria, es exponencial, por lo que pequeños incrementos en algunos parámetros como el porcentaje de explantes que forman callo embriogénico y el número de embriones que se forman en cada callo embriogénico, pueden generar incrementos globales enormes. Por lo tanto se decidió en la parte final de proyecto llevar a cabo actividades adicionales con este propósito, como se presenta a continuación. Adecuación al manejo del carbón activado El carbón activado es un componente esencial del medio de cultivo para cocotero, pues reduce la perdida por necrosis de tejidos cultivados, lo que ocurre probablemente por disminución de la concentración de compuestos tóxicos al ser atrapados por el carbón activado. Durante la preparación del medio de cultivo y dosificación a frascos individuales, ocurre sedimentación del carbón activado. Se anticipa que esto puede ser generar una gran variación del carbón activado que se dosifica en cada frasco, lo que a su vez puede ser causa de variación en el contenido del medio en cada frasco de componentes importantes como las fitohormonas, redundando en una disminución del desempeño de los tejidos cultivados. Por ello se tamizó al carbón para así poder usar solo las partículas chicas, las menos susceptible de sedimentar. Esto se probó en una tesis de licenciatura (Uicab, 2007, ver Productos) realizada como parte de este proyecto (ver productos). En la Fig. 5 se muestra que cuando se usa carbón activado sin tamizar, tal como se usa regularmente, o partícula grande se obtiene una gran variación de su cantidad presente en cada frasco. En contraste esta variación fue muy pequeña cuando se uso la partícula chica. Cuando se evaluaron medios con carbón de diferente tamaño de partícula, se encontró que hacía una gran diferencia. En el medio con partícula chica, se obtuvo un porcentaje de formación de callo embriogénico de 70% en contraste con alrededor de 40% con el carbón estándar sin tamizar (Fig. 6). También se probaron otras marcas de carbón activado, Darco, Merck y USP, además del que regularmente se ha usado PCCT y utilizando las partículas de menos de 45 micras los resultados de la obtención de callo embriogénico y de las concentraciones optimas para cada carbón se muestran en la Fig. 7. En todos los casos el resultado fue 70% o más. Sobresalió USP pues permitió que más del 80% de los explantes probados formara callo embriogénico observándose que la mejor respuesta se obtuvo con el carbón USP con 87%.

40 Sin tamizar

10 Promedio = 25.05 ± 5.85; %CV= 23.36

Carbón activado (mg)

Tamizado Partícula chica

10 Promedio = 25.92 ± 1.78; %CV = 6.85

0 Tamizado partícula grande

0 0

Número de vial

Figura 5. Contenido de carbón activado (PCCT, Sigma) por vial en una serie de 55 viales después de dosificación de medio de cultivo. Se presentan resultados con carbón sin tamizar (A), tamizado partícula chica (B) y tamizado partícula grande (C).

% de explantes que forman callo embriogénico Porcentaje

Tipo de carbón:

Completo Partícula chica

Partícula grande

40 20 0 0.5

0.6

0.7

Concentración del 2,4-D Concentración de 2,4-D en el(mM) medio Figura 6. Obtención de callo embriogénico usando carbón activado sin tamizar, y de partícula chica y partícula grande después de tamizar. La respuesta se evaluó con tres concentraciones de 2,4-D.

% de explantes que formaron callo embriogénico

100

0.60 mM 0.70 mM

0.55 mM

0.65 mM

80 60 40 20 0 Darco

USP

Merck

PCCT

Tipo de carbón Figura 7. En la grafica se presentan los resultados obtenidos en los diferentes carbones tamizados y utilizando la partícula pequeña (de menos de 45 micras) probados, observándose que el carbón USP presentó la mejor respuesta con un 87 % de inducción de callo.

Efecto de citocinina benciladenina en formación de callo, embriones y su germinación Para evaluar el efecto de la citocinina benciladenina (BA) se añadió en diferentes concentraciones, 0, 25, 100 y 200 µM, al medio de cultivo para inducción de la formación de callo, el medio I que regularmente contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético 0.60 mM sin BA. En cuanto a la formación de callo embriogénico, prácticamente no ocurrieron diferencias entre los diferentes tratamientos. Los callos embriogénicos formados a partir de los explantes sometidos a estos tratamientos fueron transferidos a medio II que se usa para inducir la formación de embriones somáticos y su germinación. Este medio contiene regularmente 2,4-D 6 µM y BA 300 µM, y no fue modificado. En este caso con 100 µM de BA, el 72% de los callos formaron embriones y con los otros tratamiento los valores variaron entre 24 y 36% (Fig. 8A). Con respecto al número de embriones formados en cada callo embriogénico que respondió, con 100 µM de BA fueron 27, mientras que los valores fueron mucho más bajos con los otros tratamientos (Fig. 8B). Al evaluar cuantos callos tenían embriones germinando, el mejor resultado fue de 50% con 100 µM de BA (Fig. 8C). En cuanto al número de embriones número de embriones formados en cada callo embriogénico que respondió, con 100 µM de BA fueron 10, mientras que los valores fueron mucho más bajos con los otros tratamientos (Fig. 8D). Los rendimientos totales por cada 100 explantes fueron para embriones formados y embriones germinando fueron 73.6 y 19.0 respectivamente con 0 µM de BA, y 753.2 y 249.0 con 100 µM de BA respectivamente (Tabla 6). Por lo tanto, estos resultados muestran que el uso de BA permite una mejora importante en la eficiencia de la formación de embriones somáticos y su germinación como parte del proceso de micropropagación del cocotero. Este trabajo forma parte de la tesis de doctorado de Mayra Montero Cortés, que fue dirigida parcialmente como parte de la última etapa de este proyecto (ver Productos).

Tabla 6. Resumen comparativo de los resultados cuantitativos de cambios morfogénicos en explantes de cocotero Alto del Pacífico cultivados in vitro que fueron expuestos al mejor tratamiento con la citocinina benciladenina (100 µM BA) y al tratamiento control (0 µM BA) al día 150. Resumen Explantes al principio Explantes que formaron CE Explantes con CE que formaron ES Explantes con CE con ESg

0 µM BA

100 µM BA

Incremento (veces)

100.0 49.0 ± 9.6 16.0 ± 4.9 12.0 ± 2.0

100.0 47.0 28.0 24.0

± 11.5 ± 6.3 ± 2.4

0 0 1.75 2.00

04.6 ± 1.0 01.6 ± 0.4

26.9 10.2

± 2.5 ± 2.4

5.84 6.37

Rendimientos por callo que respondió nES / CE que respondió nESg / CE que respondió Rendimientos totales por 100 explantes Producción total de ES Producción total de ESg

73.6 19.0

753.2 249.0

10.23 13.10

Abreviaciones: CE, callo embriogénico; ES, embriones somáticos; y ESg, embriones somáticos germinando.

Figura 8. El efecto de la citocinina benciladenina en la formación de embriones somático [ES] en callos embriogénicos [CE], y la germinación de los embriones. Los callos embriogénicos se formaron a partir de explantes (estructuras embriogénicas) de cocotero Alto del Pacífico. (A) Porcentaje de callos embriogénicos con embriones somático. (B) Número de embriones somáticos por callo embriogénico que respondió. (C) Porcentaje de callos embriogénicos con embriones somáticos germinando [ESg]. (B) Número de embriones somáticos germinando por callo embriogénico que respondió. Se presentan promedios y las barras indican desviación estándar (n de lotes = 3, cada uno con 20 callos embriogénicos, el asterisco denota diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).

Uso de biorreactores para optimizar desarrollo de plántula El uso de biorreactores del tipo de inmersión temporal BioMINT, diseñados en CICY (Fig. 9). Se realizaron dos experimentos. El primero no se concluyó satisfactoriamente por una falla del equipo. El segundo si se concluyó satisfactoriamente y se presentan los resultados. El experimento duró 120 días en los que se cultivaron brotes de cocotero Alto del Pacífico que fueron obtenidos por embriogénesis somática partiendo de explantes de estructuras embriogénicas. Se usó medio I pero sin agente gelificante. Para los tratamientos el tiempo de inmersión para todos los casos fue 2 minutos y la frecuencia fue de cada: 1, 2, 4 y 8 horas, para T1, T2, T3 y T4 respectivamente. Para fines de comparación se incluyó un tratamiento en el sistema regular, medio semisólido e inmóvil.

Como se muestra en la Tabla 7, en todos los tratamientos hay en promedio más de 4 hojas por brote, la longitud promedio de hoja varía de los 2.13 cm a los 5.23 cm y el incremento en el tamaño de la hoja varía de 20.9 a 48.5 %. Los tratamientos T1 y T2 (con inmersión cada 1h y 2h respectivamente), presentaron los mayores valores de porcentaje de incremento de hojas por brote, los mayores valores de longitud promedio de hoja, y los mayores valores de porcentaje de incremento de longitud de hoja (Tabla 7). El porcentaje de brotes con raíz por tratamiento presentó un rango de 30 a 90 %, la longitud promedio de raíz varía de 0.35 a 1.39 cm y el porcentaje de incremento de longitud de raíz varía de 16.6 a 64.7 % (Tabla 7). En los tratamientos T1 y T2 se presentaron los mayores valores en cuanto al porcentaje de brotes con raíz, y la longitud promedio de raíz (Tabla 7). El tratamiento T1 presentó el mayor valor de porcentaje de incremento de longitud de raíz y solamente se presentó mortalidad de brotes en el control y en el tratamiento T4 (Tabla 7). En la Fig. 10 se presentan imágenes que ilustran ejemplos representativos de las plántulas que se formaron en cada tratamiento. Estos resultados indican que el uso de biorreactores BioMINT es potencialmente muy útil para la conversión de brotes a plántula y valdrá la pena desarrollarlo más para integrarlo al proceso de micropropagación, particularmente para escalarlo a nivel de planta piloto. Este trabajo forma parte de la tesis de doctorado de Antonio Andrade, que fue dirigida parcialmente en como parte de la última etapa de este proyecto (ver Productos).

Tabla 7. Resultados del experimento de brotes en Biorreactor BioMINT al día 100. Control, medio semisólido. T1, inmersión cada 1h. T2, inmersión cada 2h. T3, inmersión cada 4h. T4, inmersión cada 8h. Los valores son promedios con la desviación estándar o el porcentaje cuando así se indica.

Control 4.4 ± 1.04

T1 4.8 ± 0.91

Tratamientos T2 5.1 ± 0.73

T3 4.3 ± 0.94

T4 4.4 ± 1.42

18.1

29.4

13.9

22.7

Longitud de hoja (cm) Porcentaje de incremento de longitud de hoja

4.6 ± 1.17

5.23 ± 2.2

4.81 ± 1.4

2.95 ± 1.16

2.13 ± 0.64

33.3

48.5

48.1

20.9

21.4

Porcentaje de brotes con raíz Porcentaje de brotes con raíces secundarias Porcentaje de incremento de brotes con raíz secundaria

87.5

100

0.825 ± 1.07

1.39 ± 1.17

1.08 ± 0.75

0.35 ± 0.59

0.5 ± 0.6

64.7

38.4

21.4

16.6

Parámetro Número de hojas por brote Porcentaje de incremento de hojas por brote

Longitud de raíz (cm) Porcentaje de incremento de longitud de raíz Porcentaje de mortalidad de brotes

Figura 9. Ensayos en biorreactores para evaluar el desarrollo de plántulas de cocotero Alto del Pacifico obtenidas por micropropagación.

Figura 10. Aspecto de brotes cultivados por 120 días en biorreactor en diferentes regimenes de tiempo para inmersión y su frecuencia (T1 a T4). Para fines de comparación se presenta un brote sin haber sido tratado (EI) y uno cultivado en sistema con medio semisólido e inmóvil (C). El tiempo de inmersión para todos los casos fue 2 minutos y la frecuencia fue de cada: 1, 2, 4 y 8 horas, para T1, T2, T3 y T4 respectivamente. Barra de referencia = 2 cm.

e. Fitoplasmas en embriones y plántulas obtenidas por micropropagación

Con el propósito de determinar si existe riesgo de que si se usan explantes para micropropagación provenientes de plantas infectadas los fitoplasmas que causan el amarillamiento letal, las plantas que se produzcan los contengan se realizó el siguiente experimento: se colectaron embriones de palmas Alto del Atlántico en un sitio con alta incidencia de AL, en Pailebot, Tabasco. A los embriones se les separó la plúmula para cultivarla y se analizó al resto del embrión por PCR anidado. De esta forma se podía conocer que plúmulas puestas en cultivo provenían de embriones con fitoplasmas. Los embriones se colectaron de 11 palmas con síntomas aparentes de AL. En 8 de las palmas se confirmó la presencia de fitoplasmas con PCR anidado. De estas palmas se obtuvieron 165 embriones y 20 de ellos fueron positivos. De las tres palmas que no fueron positivas se obtuvieron 20 embriones y ninguno fue positivo. Los embriones se pusieron a germinar y después de tres meses se obtuvieron 58 brotes. Cuatro fueron positivos por medio de la técnica de PCR anidado, todos provenientes de embriones que fueron positivos. Para fines comparativos también se colectaron embriones en un área de muy baja incidencia en San Crisanto, Yucatán, provenientes de palmas sin síntomas y con detección negativa por PCR anidado. Ninguno de estos embriones fue positivo al analizarlo por PCR anidado. Estos resultados indican que es posible que plúmulas derivados de embriones positivos puedan acarrear a los fitoplasmas del AL y contenerles después de su germinación al menos a nivel de brotes. Por otro lado si se tiene el cuidado de evitar colectar plantas con síntomas y/o con detección positiva por PCR de ADN de fitoplasmas del AL, no debe de haber riesgo de que se produzcan por micropropagación plantas que puedan estar infectadas.

Figura 11. Establecimiento del ensayo experimental de palmas de cocotero (var. Enano Malayo Verde) obtenidas por micropropagación en San Crisanto, Yuc., en Enero de 2006: (A) preparación de una poceta; (B) siembra de una palma micropropagada; y (C) panorámica de la plantación ya establecida. Para comparación se incluyeron palmas obtenidas de la germinación in vitro de embriones cigóticos y por germinación de semillas.

Evaluación de la fidelidad al tipo

Inicialmente cuando este proyecto fue sometido incluía como actividad el establecimiento de un ensayo de evaluación de fidelidad al tipo. Debido a que el presente proyecto se retrasó administrativamente y no se podía esperar a realizar la siembra de las palmas que ya se tenían listas, se procedió a hacerlo como parte de las actividades finales del proyecto previo 2004-C01-99 en Febrero de 2006. El ensayo se estableció en San Crisanto, Sinanche, Yucatán en un predio propiedad del Lic. José Inés Loria (Fig. 11). Se sembraron 50 plantas producidas por micropropagación, 60 por germinación in vitro de embrión cigótico y 49 por germinación de semilla, el arreglo espacial fue de acuerdo al esquema que se presenta en la Fig. 12. Estas plantas son de la variedad Enano Malayo Verde, que es la variedad con la que se había trabajado previamente para desarrollar la tecnología de micropropagación para cocotero (Oropeza et al., 2005b; Pérez-Núñez et al., 2006). Los resultados de este ensayo nos han permitido tener una primera evaluación en campo de plantas obtenidas por micropropagación, comparándolas con las obtenidas en forma tradicional por germinación de semilla. Además se incluyo un grupo de plantas obtenidas de germinación in vitro de embrión cigótico aislado. Esto es importante pues está técnica es la aceptada internacionalmente para el intercambio de germoplasma entre países. En el caso de cocotero el CICY ha desarrollado previamente un protocolo para este propósito (Pech y Ake et al., 2004; 2007), pero las plantas producidas no habían sido probadas en campo.

Mar Dunas ÍTelchac Puerto 16 15 14 z 8 z z z z z z 8 z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z 8 8 8 8 8 8

13 z 8 z 8 z z 8 z 8 z z z 8 8

12 z z z z z z z z z z 8 8 8 8

11 z z 8 z z z z 8 z z z z 8 8

10 z z z z 8 z z 8 z z z z 8 8

9 z 8 z z z z z 8 z z z z 8 8

Carretera 8 7 z z 8 z z z z z 8 8 z z z z z z z z z z z z 8 8 8 8 8 8

6 z z z z z z 8 z z z z 8 8 8

5 z z z z z z z z z z 8 8 8 8

4 8 z z z z 8 8 8 z z z z 8 8

3 z 8 8 z 8 8 z z z z z z z 8

San CrisantoÎ 2 1 z z 1 z z 2 z z 3 z z 4 z z 5 z z 6 z z 7 z z 8 z z 9 z z 10 z z 11 8 z 12 8 8 13 8 8 14

Cienega

z Plantas provenientes de germinación in vitro de embrión cigótico (n = 60). z Plantas provenientes de micropropagación (n = 50). z Plantas provenientes de semilla (n = 49).

Plantas que ya existían en la plantación y fueron conservadas (no participan en la evaluación).

Figura 12. Croquis de la plantación en San Crisanto, Yucatán de plantas de cocotero Enano Malayo Verde, establecida en para fines demostrativos y de evaluación de fidelidad al tipo y desempeño agronómico.

Figura 13. Ensayo experimental de palmas de cocotero (var. Enano Malayo Verde) obtenidas por micropropagación en San Crisanto, Yuc. en Julio de 2008: (A) vista panorámica; (B) sistema de riego; (C) palma micropropagada; (D) vista de los racimos; (E) acercamiento mostrando una inflorescencia; y (F) acercamiento mostrando un racimo de frutos.

Las actividades posteriores relacionadas con este ensayo ya se realizaron dentro del presente proyecto. Se estableció un sistema de riego en el terreno (ver Fig. 13) y se realizaron las prácticas de mantenimiento periódicas (ver Anexo 1). Durante la duración del proyecto las perdidas fueron mínimas, quedando hasta la fecha 49 palmas obtenidas por micropropagación, 60 palmas obtenidas por germinación in vitro de embriones cigóticos y 47 obtenidas por germinación de semilla, mostrando que la supervivencia de las palmas obtenidas por micropropagación, o de embriones cigóticos, no es distinta a la de las palmas obtenidas por propagación natural de semilla. Se realizaron evaluaciones periódicas de parámetros de desarrollo a lo largo de la duración del proyecto: promedio de hojas acumuladas, porcentaje de plantas con inflorescencias, promedio de inflorescencias por planta, porcentaje de plantas con frutos y promedio de frutos por planta. Los valores registrados en cada evaluación se detallan en la Tabla 8A para hojas, Tabla 8B para inflorescencias y Tabla 8C para frutos. También se presentan los cambios en forma gráfica con respecto al curso del tiempo en la Fig. 14.

Figura 14. Resultados de la evaluación durante 30 meses de parámetros de desarrollo de plantas de cocotero después de ser sembradas en campo en San Crisanto, Sinanche, Yucatán. Las plantas evaluadas fueron de la variedad Enano Malayo Verde obtenidas por germinación de semilla, germinación in vitro de embriones cigóticos y por micropropagación vía embriogénesis somática.

Tabla 8A. Resultados de las evaluaciones de desarrollo en hojas en las plantas de Enano Malayo Verde establecidas en San Crisanto, Yucatán. Se presentan resultados para plantas provenientes de tres diferentes orígenes: embriogénesis somática, germinación in vitro de embrión cigótico y germinación de semilla. Origen de las plantas Evaluación / parámetros

1ª evaluación (Agosto 2006 / inicial*) No. de plantas Hojas totales iniciales Promedio de hojas iniciales / planta 2ª evaluación (Marzo 2007 / 6 meses*) No. de plantas Hojas totales emitidas en el periodo Promedio de hojas emitidas / planta Promedio de hojas acumuladas / planta 3ª evaluación (Agosto 2007 / 6 meses*) No. de plantas Hojas totales emitidas en el periodo Promedio de hojas emitidas / planta Promedio de hojas acumuladas / planta 4ª evaluación (Marzo 2008 / 6 meses*) No. de plantas Hojas totales emitidas en el periodo Promedio de hojas emitidas / planta Promedio de hojas acumuladas / planta 5ª evaluación (Junio 2008 / 3 meses*) No. de plantas Hojas totales emitidas en el periodo Promedio de hojas emitidas / planta Promedio de hojas acumuladas / planta 6ª evaluación (Nov 2008 / 3 meses*) No. de plantas Hojas totales emitidas en el periodo Promedio de hojas emitidas / planta Promedio de hojas acumuladas / planta

Embriogénesis somática

Germinación in vitro de embrión cigótico

Germinación de semilla

49 610 12.4 ± 1.9

59 625 10.5 ± 2

49 505 10.3 ± 1.6

49 367 7.4 ± 1 20.2

60 437 7.2 ± 1.1 17.7

48 323 6.7 ± 1 17

49 424 8.6 ± 1.9 28.8

60 504 8.4 ± 0.9 26.1

47 363 7.7 ± 1 24.7

49 496 8.6 ± 1.1 37.4

60 531 8.8 ± 1 34.9

47 392 8.3 ± 1.1 33

49 158 3.2 ± 0.7 40.6

60 208 3.4 ± 0.6 38.7

47 162 3.4 ± 0.5 36.4

49 207 4.2 ± 0.7 44.8

60 266 4.4 ± 0.7 43.1

47 216 4.5 ± 0.8 40.9

* Periodo evaluado en meses.

Evaluaciones de hojas En cuanto al número de hojas, inicialmente tenían 12.4, 10.5 y 10.3 para las plantas micropropagadas, de embrión cigótico y de semilla, respectivamente (Tabla 8A, Fig. 14A); incrementando al final de proyecto a 44.8, 43.1 y 40.9, respectivamente.

Evaluaciones de inflorescencias Con respecto a inflorescencias, se pudo observar que después de 12 meses ninguna planta tenía todavía, pero a los 18 meses comenzaron a aparecer inflorescencias en 36.7% de las de micropropagación, 10% de las de embrión cigótico y 8.5% de las de semilla (Tabla 8B, Fig. 14B). El promedio de inflorescencias acumuladas por planta fue de 4.4 para las de micropropagación, 2.5 para las de embrión cigótico y 3 para las de semilla (Tabla 8B, Fig. 14C). Para el final del proyecto a los 30 meses se observaban inflorescencias en 93.8% de las de micropropagación, 91.6% de las de embrión cigótico y 85.1% de las de semilla (Tabla 8B, Fig. 14B). El promedio de inflorescencias acumuladas por planta fue de 16 para las de micropropagación, 11.4 para las de embrión cigótico y 12.5 para las de semilla (Tabla 8B, Fig. 14C).

Tabla 8B. Resultados de las evaluaciones de desarrollo en inflorescencias en las plantas de Enano Malayo Verde establecidas en San Crisanto, Yucatán. Se presentan resultados para plantas provenientes de tres diferentes orígenes: embriogénesis somática, germinación in vitro de embrión cigótico y germinación de semilla. Origen de las plantas Evaluación / parámetros

1ª evaluación (Agosto 2006) 2ª evaluación (Marzo 2007) 3ª evaluación (Agosto 2007) No. de plantas No. de plantas con inflorescencias % de plantas con inflorescencias Inflorescencias totales acumuladas Promedio inflorescencias acumuladas / planta 4ª evaluación (Marzo 2008) No. de plantas No. de plantas con inflorescencias % de plantas con inflorescencias Inflorescencias totales acumuladas Promedio inflorescencias acumuladas / planta 5ª evaluación (Junio 2008) No. de plantas No. de plantas con inflorescencias % de plantas con inflorescencias Inflorescencias totales acumuladas Promedio inflorescencias acumuladas / planta 6ª evaluación (Noviembre 2008 ) No. de plantas No. de plantas con inflorescencias % de plantas con inflorescencias Inflorescencias totales acumuladas Promedio inflorescencias acumuladas / planta

Embriogénesis somática

Germinación in vitro de embrión cigótico

Germinación de semilla

NA NA

49 18 36.7 80

60 6 10 15

47 4 8.5 12

4.4 ± 1.9

2.5 ± 1.6

3 ± 1.4

49 38 77.5 308

60 22 36.6 126

47 24 51.0 133

8.1 ± 3.9

5.7± 3

5.5 ± 3.3

49 42 85.7 457

60 51 85 349

47 37 78.7 272

10.8 ± 4.7

6.8 ± 3.7

7.3 ± 3.4

49 46 93.8 739

60 55 91.6 630

47 40 85.1 500

16 ± 4.4

11.4 ± 4.7

12.5 ± 4

Evaluaciones de frutos En cuanto a frutos, se pudo observar que después de 18 meses ninguna planta tenía todavía, pero a los 24 meses comenzaron a aparecer frutos en 28.5% de las de micropropagación, 5% de las de embrión cigótico y 4.2% de las de semilla (Tabla 8C, Fig. 14D). El promedio de frutos acumulados por planta fue de 17.3 para las de micropropagación, 9 para las de embrión cigótico y 13 para las de semilla (Tabla 8C, Fig. 14D). Para el final del proyecto a los 30 meses se observaban frutos en 85.7% de las de micropropagación, 83.3% de las de embrión cigótico y 72.3% de las de semilla (Tabla 8C, Fig. 14E). El promedio de inflorescencias acumuladas por planta fue de 61.6 para las de micropropagación, 50.6 para las de embrión cigótico y 40.7 para las de semilla (Tabla 8C, Fig. 14E). Los resultados muestran que en términos generales las plantas obtenidas por micropropagación tuvieron un mejor desempeño o similar en todos los parámetros para cada evaluación que las obtenidas de embrión cigótico; y tuvieron un mejor desempeño en cada evaluación en todos los parámetros que las obtenidas de semilla.

Tabla 8C. Resultados de las evaluaciones de desarrollo en frutos en las plantas de Enano Malayo Verde establecidas en San Crisanto, Yucatán. Se presentan resultados para plantas provenientes de tres diferentes orígenes: embriogénesis somática, germinación in vitro de embrión cigótico y germinación de semilla. Origen de las plantas Evaluación / parámetros

1ª evaluación (Agosto 2006) 2ª evaluación (Marzo 2007) 3ª evaluación (Agosto 2007) 4ª evaluación (Marzo 2008) No. de plantas No. de plantas con frutos % de plantas con frutos Frutos totales acumulados Promedio frutos acumuladas / planta 5ª evaluación (Junio 2008) No. de plantas No. de plantas con frutos % de plantas con frutos Frutos totales acumulados Promedio frutos acumuladas / planta 6ª evaluación (Noviembre 2008 ) No. de plantas No. de plantas con frutos % de plantas con frutos Frutos totales acumulados Promedio frutos acumuladas / planta

Embriogénesis somática

Germinación in vitro de embrión cigótico

Germinación de semilla

NA NA NA

49 14 28.5 240 17.1 ± 15.3

60 3 5 27 9 ± 9.2

47 2 4.2 26 13 ± 0

49 27 55.1 902 33.4 ± 26.6

60 15 25 353 23.5 ± 15.9

47 13 27.6 196 15 ± 15.8

49 42 85.7 2591 61.6 ± 30.2

60 50 83.3 2531 50.6 ± 37.9

47 34 72.3 1387 40.7 ± 24.8

Evaluaciones de parámetros fotosintéticos Por último se realizó una evaluación de parámetros fotosintéticos que se muestran en la Fig. 15, comparando solo a las plantas obtenidas por micropropagación y las de semilla. Se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de plantas en la eficiencia del fotosistema II y en la tasa fotosintética, siendo en ambos casos mayores para las plantas de micropropagación. Esto podría explicar en parte el mejor desempeño de estas plantas.

Figura 15. Evaluación de parámetros fotosintéticos en las palmas de cocotero (var. Enano Malayo Verde) del ensayo establecido en San Crisanto, Yuc.: (A) eficiencia del fotosistema II [PSII] y (B) tasa fotosintética. Se presenta comparación entre palmas obtenidas por germinación de semilla y por micropropagación via embriogénesis somática. La evaluación se efectuó en Septiembre de 2008.

1.3. CONCLUSIONES

Se estableció un protocolo para la micropropagación de palmas elite de cocotero de los ecotipos Alto del Pacífico. Se partió de palmas que fueron seleccionadas por su resistencia al amarillamiento letal y sus cualidades agronómicas. La eficiencia obtenida para la producción global de callos embriogénicos y embriones somáticos fue muy alta. La productividad de cada paso es aún baja y se trabajó para

mejorarla. El protocolo permitió germinar embriones somáticos y producir plantas que serán utilizadas para establecer una plantación de evaluación y demostrativa en Colima; y se seguirán produciendo más palmas para establecer otras plantaciones en otros Estados. Adicionalmente se estableció una colección de líneas de callos embriogénicos, misma que sirve de plataforma de producción y puede ser duplicada para su transferencia a otros laboratorios. Finalmente el seguimiento de una plantación establecida al inició de este proyecto con plantas de cocotero micropropagadas de la variedad Enano Malayo Verde permitió observar que la plantas pudieron ser transferidas exitosamente a campo, mostrando fidelidad al tipo y que también se desempeñan exitosamente, habiendo entrado a producción más temprano que las similares obtenidas de germinación de semilla. Las plantaciones que se establecerán con plantas micropropagadas de Alto del Pacífico, nos permitirán hacer una evaluación similar con este genotipo y así tener una creciente base genética de plantas micropropagadas con muy buen desempeño y fidelidad al tipo confirmados.

1.4. MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal.- Se utilizaron frutos de cocotero Altos del Pacifico (Altos x Altos) de 9-12 meses después de la polinización. Frutos muy maduros con el exocarpo totalmente oscuro no son recomendables ya que es posible que estén germinando en el interior y por lo tanto la plúmula se destruiría al momento de sacarla. Tampoco frutos muy jóvenes ya que los embriones son demasiados pequeños para extraerles la plúmula. Fueron utilizadas las plúmulas de aproximadamente 1 mm de diámetro, las cuales fueron extraídas del embrión cigótico, consistiendo en el meristemo apical, los primordios foliares y el tejido cotiledónario, con ayuda de un estereo-microscopio. Condiciones de cultivo.- Ya extraídas las plúmulas fueron depositadas en un medio de cultivo de inducción de callo y callo embriogénico. Durante esta fase se utilizó el medio I, el cual consiste del medio de cultivo Y3 de acuerdo a Eeuwens (1976), adicionado con sacarosa (5%), gelrite (0.3%), carbón activado (0.25%) y la auxina ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 0.6 mM). Los explantes de plúmulas furon cultivados en frascos de vidrio con capacidad de 35 ml conteniendo 10 ml de medio de cultivo y se establecieron bajo condiciones de obscuridad durante 3 meses sin subcultivos a 27°C. Formación de callos.- Después de 15 días los explantes comienzan a crecer, a los 30 días el tamaño de los explantes es de 2-3 mm de diámetro y su consistencia es dura y de color blanco o beige. A los 45 días de cultivo los explantes son compactos y de color blanco, pero muestran una desdiferenciación parcial con el desarrollo de los callos con estructuras traslucidas. Formación de callo embriogénico.- A los 60 días los callos son de aproximadamente 4-5 mm de diámetro. Al día 75 las estructuras nodulares se convierten en estructuras globulares aperladas, a partir de las estructuras los embriones somáticos se desarrollan eventualmente. Alrededor del día 90 los callos son de aproximadamente 5-7 mm de diámetro de una consistencia compacta, de apariencia lisa y fácilmente distinguible del resto del callo. Multiplicación de callo.- Se tomaron callos embriogénicos después de tres meses de inducción en la oscuridad y tomando solamente la zona de la periferia del callo embriogénico que tienen las estructuras embriogénicas con células altamente meristemáticas y se dividieron en pequeños explantes con ayuda de un bisturí y un microscopio estereoscopio. El callo embriogénico fue subdividido en 10-15 explantes aproximadamente y cultivados en medio I (con 2,4-D 0.6 mM) para la inducción de nuevo de callo embriogénico. Obtención de embriones somáticos. En el último ciclo, una vez obtenidos los callos embriogénicos se pasaron a un medio de cultivo utilizando la auxina 2,4-D a 0.3 mM con la cual se generan embriones somáticos globulares. La formación de embriones somáticos se presenta aproximadamente a los 30 días

del subcultivo. Los embriones somáticos inmaduros se observan como estructuras globulares translucidas de 1-2 mm de diámetro, generalmente se presentan de 3-10 embriones somáticos por callo. Posteriormente los embriones globulares generados fueron puestos al medio de cultivo para la inducción de callo embriogénico el cual fue multiplicado por tres veces. Posteriormente los callos embriogénicos después de tres ciclos de multiplicación fueron puestos de nuevo en el medio de generación de embriones somáticos por 1 mes. Germinación de los embriones somáticos.- Los callos que generaron embriones fueron puestos en un medio II, conteniendo el medio basal Eeuwens (1976), sacarosa (5%), gelrite (0.3%), carbón activado (0.25%), carbón activado (0.25%). y las fitohormonas benciladenina (BA, 300 µM), 2,4-D (6 µM) y Giberelina (GA3, 0.289 µM) Los callos embriogénicos con los embriones somáticos fueron cultivados en frascos Gerber de vidrio de capacidad de 100 ml conteniendo 25 ml de medio de cultivo. Esta etapa se realiza bajo condiciones de fotoperíodo de 16 h de iluminación por 8 h de oscuridad a 27°C y con resiembras cada 2 meses. Después de dos a tres meses de cultivo en esta etapa, los embriones somáticos comienzan a germinar, formar brotes y posteriormente plantas. Obtención de plantas.- Los brotes que lograron formarse fueron subcutivados en un medio de cultivo suplementado con fitohormonas BA (300 µM) y 2,4-D (6 µM) con sacarosa (5%), Gelrite (0.2%) y carbón activado (0.25%) y cuando alcanzaron aproximadamente 5 cm de altura fueron trasladados a un medio líquido con sacarosa 5% y carbón activado 0.25% y sin fitorreguladores para su desarrollo hasta plantas de aproximadamente 10 a 15 cm de talla con 3-4 hojas y raíces primarias y secundarias. Posteriormente las plantas son puestas a condición ex vitro y llevadas a un invernadero por tres meses, después son puestas bajo condiciones de vivero durante aproximadamente 6 meses. Posteriormente las plantas podrán ser sembrarlas bajo condiciones permanentes de cultivo. Cultivo en biorreactores.- Diez brotes de entre 2 y 3 cm de longitud se colocaron en cada biorreactor BioMINT. El tiempo de duración del experimento fue de 120 días utilizando un módulo SyB con cuatro plataformas, cada una controlada por un temporizador independiente. En cada plataforma se colocaron biorreactores BioMINT con brotes. Cada biorreactor se preparó con 200 ml de medio líquido Y3 con carbón activado (Chan et al., 1998), Se realizó la renovación de medio cada 60 días. Se aplicaron las siguientes tratamientos: (T1) 2 minutos de inmersión / 1 hr de aireación; (T2) 2 minutos de inmersión / 2 hr de aireación; (T3) 2 minutos de inmersión / 4 hr de aireación; y (T4) 2 minutos de inmersión / 8 hr de aireación. Grupo control: se colocaron frascos Gerber con medio Y3 semisólido con carbón activado (Chan et al., 1998) conteniendo brotes. Análisis por PCR.- Se utilizó 1 gramo de tejido de tronco de cocotero empleando el método de CTAB (20 mM EDTA pH 8·0, 100 mM Tris-HCl pH 8·0, 2% CTAB, 1.4 M NaCl, 2-mercaptoethanol in agua destilada estéril) a 65 °C por 1 h. El ADN se precipitó con etanol. La pastilla obtenida se resuspendió en 100 μl of TE buffer (1 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8) e incubado con RNAasa por 1 hr a 37°C. Aproximadamente 25 ng de ADN total se utilizó como molde para las corridas de PCR. La detección del fitoplasma del AL se determinó por PCR anidado. Para llevar a cabo este proceso se utilizaron iniciadores universales (P1P7 iniciadores universales), que pueden detectar cualquier tipo de fitoplasmas. Estos iniciadores amplifican un fragmento de 1.8 Kb del operón de 16S rRNA que abarca los genes 16S y 23S de los fitoplasmas. El producto de la amplificación con los iniciadores universales P1/P7 se diluyó en una relación 1:40 y se tomó 5µl de éste para hacer una segunda amplificación (nested-PCR) usando iniciadores de grupo LY16Sr / LY16Sf. Estos, detectan únicamente fitoplasmas del AL y los relacionados o emparentados a este grupo. Se utilizó Buffer de PCR 10X 2.5 µL, MgCl2 (50mM) 1 µL, Iniciador 0.5 µL (100mM), Taq polimerasa 0.2 µL (5 U/ µL), 50 ng de ADN molde (1 µL), DNTP´S 0.5 µL (10mM). Volumen final 25 µL. En cada prueba se utilizó un control positivo (DNA de palma enferma con síntomas típicos de AL) y un control negativo (DNA extraído de una palma sana o agua destilada estéril en sustitución del DNA).Los productos amplificados por PCR y nested-PCR se analizaron con base a la separación por electroforesis de los segmentos obtenidos. Este se efectuó en geles de agarosa al 1% teñidos con Bromuro de Etidio y visualizado en un transiluminador de luz UV (Spectroline Bi-o-Visión).

1.5. BIBLIOGRAFÍA

1. Beakbane AB, Slater CHW and Posnette AF (1972). Mycoplasmas in the phloem of coconut, Cocos nucifera L., with lethal yellowing disease. J. Hort. Sci. 47:265. 2. Chan J, Sáenz L, Talavera C, Hornung R, Robert M and Oropeza C (1998). Regeneration of coconut (Cocos nucifera L) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Reports, 17:515-521. 3. Diaz, RS (2008). Coconut for clean air. Asian Institute of Petroleum Studies, Manila, Philippines, http://www.coconutresearchcenter.org/coconutforcleanair.pdf 4. Eeuwens CJ (1976) Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms (Cocos nucifera L.) and cultured in vitro. Physiol Plant 36:23-28. 5. Heinze et al. 1972 Heinze KG, Schuiling M and Romney DH (1972). The possible cause of lethal yellowing disease of coconut. FAO Plant Protect. Bull. 20:58-68. 6. Howard et al, 1982 Howard F.W., Norris R.C. and Thomas D.L. 1982. Evidence of transmission of palm lethal yellowing agent by a planthopper, Myndus crudus. Trop. Agric. 60:168-171. 7. Lao DA (2006). Coco-biodiesel as an alternative to petro-diesel, prospects, challenges and marketing strategy. Paper presented at the 42nd APCC COCOTECH Meeting in Manila, August 21-25, 2006. 8. Oropeza C, Escamilla JA, Mora G, Zizumbo D and Harrison NA (2005a). Coconut lethal yellowing. In: P. Batugal, V. Ramanatha Rao and J. Oliver (eds) Coconut Genetic Resources. International Plant Genetic Resources Institute – Regional Office for Asia, the Pacific and Oceania (IPGRI-APO), Serdang, Selangor DE, Malaysia, pp 349-363. 9. Oropeza C, Rillo E, Hocher V and Verdeil JL (2005b). Coconut micropropagation. In: P Batugal, V Ramanatha Rao and J Oliver (eds.). Coconut Genetic Resources. International Plant Genetic Resources Institute – Regional Office for Asia, the Pacific and Oceania (IPGRI-APO), Serdang, Selangor DE, Malaysia, pp 334-348. 10. Pech y Ake A, Souza R, Maust B, Santamaría J and Oropeza C (2004). Enhanced aerobic respiration improves in vitro coconut embryo germination and culture. In Vitro Cell Develop Biol-Plant 40: 90-94. 11. Pech y Ake A, Maust B, Orozco-Segovia A and Oropeza C (2007). The effect of gibberellic acid on the in vitro germination of coconut zygotic embryos and their conversion into plantlets. In Vitro Cell Dev Biol - Plant 43: 247-253. 12. Pérez-Núñez et al, 2006 Pérez-Núñez M. T., Chan J.L., Sáenz L., González T., Verdeil J.L. and Oropeza C. (2006) Improved somatic embryogenesis from coconut (Cocos nucifera L.) plumule explants cultured in vitro. In vitro cellular and developmental biology-plant. 42 (1): 37-43. 13. Plavsic-Banjac et al. 1972 Plavsic-Banjac, B., P. Hunt and K. Maramorosch. 1972. Mycoplasma-like bodies associated with lethal yellowing disease of coconut palms. Phytopathology. 58:298-299. 14. Sáenz L, Azpeitia A, Chuc-Armendariz B, Chan JL, Verdeil J-L, Hocher V and Oropeza C (2006). Morphological and histological changes during somatic embryo formation from coconut plumule explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant 42: 19-25. 15. Uicab Bayotte F (2008). Optimización del uso del carbón activado en la micropropagación del cocotero. CICY. Tesis de Licenciatura. Asesores: Carlos Oropeza y José Luis Chan. 16. Zizumbo, D., Fernández, M., Torres, H. and R. Cardeña. 1999. Lethal Yellowing resistance germplasm from Mexico. In: Oropeza et al., (eds). Current Advances in Coconut Biotechnology. Kluwer Academic Publishers. Dordretch, The Netherlands. pp. 131-144.

2. LOGRO DE METAS RESPECTO DE METAS COMPROMETIDAS Se cumplieron las metas programadas. Los detalles se presentan en la sección 1 de Resultados.

3. LOGRO DE OBJETIVOS RESPECTO DE COMPROMISO Objetivo Establecer un protocolo de alta eficiencia para la micropropagación de palmas elite de cocotero de los ecotipos Alto del Pacífico seleccionadas por su resistencia al amarillamiento letal y su alta productividad, que permita la producción masiva de palmas de cocotero necesarias ayudar a revitalizar a este cultivo en nuestro país, renovar el paisaje necesario para industria turística y evitar la erosión de las playas. Logro: 100% Se estableció un protocolo para la micropropagación de palmas elite de cocotero de los ecotipos Alto del Pacífico. Se partió de palmas que fueron seleccionadas por su resistencia al amarillamiento letal y sus cualidades agronómicas. La eficiencia obtenida para la producción global de callos embriogénicos y embriones somáticos fue muy alta. La productividad de cada paso es aún baja y se trabajó para mejorarla. El protocolo permitió germinar embriones somáticos y producir plantas que serán utilizadas para establecer una plantación de evaluación y demostrativa en Colima; y se seguirán produciendo más palmas para establecer otras plantaciones en otros estados. Adicionalmente se estableció una colección de líneas de callos embriogénicos, misma que sirve de plataforma de producción y puede ser duplicada para su transferencia a otros laboratorios. Finalmente el seguimiento de una plantación establecida al inició de este proyecto con plantas de cocotero micropropagadas de la variedad Enano Malayo Verde, permitió observar que la plantas pudieron ser transferidas exitosamente a campo, mostrando fidelidad al tipo así como también un desempeño exitoso, habiendo entrado a producción más temprano que las similares obtenidas de germinación de semilla. Las plantaciones que se establecerán con plantas micropropagadas de Alto del Pacífico, nos permitirán hacer una evaluación similar con este genotipo y así tener una creciente base genética de plantas micropropagadas con muy buen desempeño y fidelidad al tipo confirmados.

4. GRUPO DE TRABAJO (a) Investigadores de CICY o o o o

Dr. Daniel Zizumbo Villarreal, Ensayos en campo. Dr. Luis Sáenz Carbonell, Cultivo in vitro. Dr. Jorge Santamaría, Fisiología Dr. Carlos Oropeza, Cultivo in vitro

(b) Técnicos Pagados por el proyecto: o IBQ Guillermo Rodríguez, Cultivo in vitro.

De CICY: o o o o o o o

Ing. José Luis Chan Rodríguez, Cultivo in vitro. Ing. Miguel Fernández Barrera, Ensayos en campo. Téc. Nelson Torres Hernández, Ensayos en campo. M.C. Ivan Cordova, Análisis de fitoplasmas. QBB Maria Narváez, Análisis de fitoplasmas. M.C Carlos Talavera May, Fisiología. M.C. Francisco Espadas, Fisiología.

5. DESVIACIONES Y/O MODIFICACIONES Se realizaron experimentos adicionales para mejorar la eficiencia de pasos individuales dentro del proceso de micropropagación.

6. ACCIONES DERIVADAS DE LAS DESVIACIONES Y/O MODIFICACIONES Se trabajo en: (a) La adecuación al manejo del carbón activado. (b) El estudio del efecto de citocinina benciladenina en formación de callo, embriones y su germinación. (c) El uso de biorreactores para optimizar el desarrollo de plántula.

7. ACCIONES REALIZADAS CON LOS SECTORES USUARIOS Se realizaron diferentes actividades de interacción con productores de varios estados del país y a novel internacional para dar a conocer avances del trabajo del presente proyecto. Un listado des estas actividades se presenta en el Anexo 2.

8. OBSERVACIONES RELEVANTES SOBRE EL PRESUPUESTO AUTORIZADO No hay ninguna observación.

9. APORTACIONES COMPLEMENTARIAS El Sr. José Inés Loria, propietario del predio en San Crisanto donde se estableció la plantación de evaluación y demostrativa, contribuyó con: (a) $3,400.00 al mes por treinta meses, total $ 102,000.00, para pagar a los trabajadores de campo que se encargan de las labores de mantenimiento; y (b) $1,160.00 al año por tres años, total $ 3,480.00, para el costo de agroquímicos.

10. PRODUCTOS OBTENIDOS 10.1. Material vivo

o Plantas de cocotero Alto del Pacífico 2 producidas por micropropagación. Estas serán utilizadas para el establecimiento de parcelas de evaluación y demostrativas. Al momento de la preparación de este reporte se contaba con 180 plantas en invernadero y aproximadamente 2000 plantas en diferentes etapas de desarrollo en condiciones in vitro. Se están haciendo arreglos para el establecimiento de parcelas en: Yucatán con los miembros del Ejido de San Crisanto; Tabasco con el INIFAP y el Consejo Estatal del Cocotero de Tabasco; y Colima con la Universidad de Colima y el Consejo Estatal del Cocotero de Colima. o Plataforma de propagación. Se produjo durante el proyecto una colección de líneas de callos embriogénicos. Estos se derivaron de plúmulas obtenidas de cruzamientos entre individuos seleccionados por su resistencia al amarillamiento letal y por sus características agronómicas. Las líneas seleccionadas son las que han tenido mejor desempeño en multiplicación y formación de embriones. Estas líneas conforman una plataforma base para el proceso de micropropagación. o Banco de líneas de callos embriogénicos. Además las líneas de callos embriogénicos se mantienen como colección que puede ser duplicada y transferida a otros laboratorios. Esta colección se seguirá enriqueciendo conforme se preparen nuevas líneas de Altos del Pacífico, así como de otras variedades en las que hay interés. . 10.2. Plantación de evaluación y demostrativa

o Plantación experimental en San Crisanto, Yucatán establecida con plantas de cocotero Enano Malayo Verde para fines demostrativos y de evaluación de fidelidad al tipo y desempeño agronómico. Está conformada con plantas obtenidas por: micropropagación vía embriogénesis somática (49), germinación in vitro de embrión cigótico (60) y germinación de semilla (47). Las plantas ya tienen más de tres años de haber sido plantadas y ya son productivas.

10.3. Divulgación

(a) Publicaciones o Artículos sometidos a revistas científicas internacionales. Se sometieron dos artículos: Luis Sáenz, Gastón Herrera Herrera, Frank Uicab Ballote, José Luis Chan, Carlos Oropeza. The effect of the addition of activated charcoal of different sources on the in vitro formation of embryogenic callus from coconut plumule explants. Sometido a: Plant Cell Tissue and Organ Culture. Se anexa resumen y carta de recepción.

Mayra I. Montero-Cortés, José Luis Chan, Ivan Cordova, Carlos Oropeza, Luis Sáenz. Addition of benzyladenine to coconut explants cultured in vitro improves the formation of somatic embryos and their germination. Sometido a: In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. Se anexa resumen y carta de recepción. o Documento de divulgación de los resultados Se está preparando una versión del reporte para fines de divulgación de los resultados. Estará disponible en versión impresa y en versión pdf para su distribución. (b) Interacción con productores o Se realizaron diferentes actividades de interacción con productores de varios estados del país y a nivel internacional para dar a conocer avances del trabajo del presente proyecto. Un listado de estas actividades se presenta en el Anexo 2.

10.4. Formación de recursos humanos (a) Nivel Licenciatura o Tesis Uicab Bayotte, Frank (2008). Optimización del uso del carbón activado en la micropropagación del cocotero. CICY. Tesis de Licenciatura. Adscripción del estudiante: Asesores: Carlos Oropeza y José Luis Chan. Fecha de examen: Marzo 13, 2008. o Residencia profesional Efraín Uriel Pacheco Mutul. Durante el período 1 de julio al 28 de noviembre de 2008. Adscripción: Instituto Tecnológico de Conkal. o Entrenamiento técnico Efraín Uriel Pacheco Mutul. Durante el período marzo - agosto de 2008. Adscripción: Instituto Tecnológico de Conkal. o Servicio social Efraín Uriel Pacheco Mutul. Durante el período 3 de Septiembre de 2007 al 29 de febrero de 2008. Adscripción: Instituto Tecnológico de Conkal. (b) Nivel Postgrado o Tesis, dirección parcial (un año en el proyecto) Montero Cortés, Mayra Itzcalotzin (En proceso). Estudios moleculares durante la formación y germinación de embriones de cocotero. Tesis de Doctorado. Programa de Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas, CICY, Mérida, Yucatán. Asesores: Luis Sáenz y Carlos Oropeza. Andrade, Antonio (En proceso). Uso de diferentes estrategias para mejorar la micropropagación del cocotero a partir de explantes de plúmula y de inflorescencia inmadura. Tesis de Doctorado. Programa de Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas, CICY, Mérida, Yucatán. Asesor: Carlos Oropeza.

ANEXO 1

ACTIVIDADES DE MANTENIMIENTO DE LA PLANTACIÓN DE EVALUACIÓN Y DEMOSTRATIVA SAN CRISANTO, SINANCHE, YUCATÁN

El Sr. José Inés Loria, propietario del predio, contribuyó con: $3,400.00 al mes para pagar a los trabajadores de campo que se encargan de las labores de mantenimiento, y $1,160.00 al año para el costo de agroquímicos.

Control de plagas y enfermedades 28-29/Dic/2005 26-27/Ene/2006 23-24/Feb/2006 30-31/Mar/2006 27-28/Abr/2006 25-26/May/2006 29-30/Jun/2006 27-28/Jul/2006 30-31/Ago/2006 28-29/Sept/2006 26-27/Oct/2006 23-24/Nov/2006 29-30/Dic/2006 25-26/Ene/2007 22-23/Feb/2007 29-30/Mar/2007 26-27/Abr/2007 24-25/May/2007 28-29/Jun/2007 26-27/Jul/2007 30-31/Ago/2007 27-28/Sept/2007 25-26/Oct/2007 29-30/Nov/2007 27-28/Dic/2007 24-25/Ene/2008 28-29/Feb/2008 27-28/Mar/2008 24-25/Abr/2008 29-30/May/2008 25-26/Jun/2008 26-27/Jul/2008 30-31/Ago/2008 27-28/Sept/2008 25-26/Oct/2008 29-30/Nov/2008

Fertilización

28-29/Mar/2006

8-9/Jun/2006

27-28/Mar/2007

12-13/Jun/2007

24-25/Mar/2008

23-24/Jun/2008

Control de maleza

Poda sanitaria 27/Dic/2005 25/Ene/2006 22/Feb/2006 29/Mar/2006 26/Abr/2006 24/May/2006 28/Jun/2006 26/Jul/2006 29/Ago/2006 27/Sept/2006 25/Oct/2006 22/Nov/2006 28/Dic/2006 24/Ene/2007 21/Feb/2007 28/Mar/2007 25/Abr/2007 23/May/2007 27/Jun/2007 25/Jul/2007 29/Ago/2007 26/Sept/2007 24/Oct/2007 28/Nov/2007 26/Dic/2007 23/Ene/2008 27/Feb/2008 26/Mar/2008 23/Abr/2008 28/May/2008 24/Jun/2008 25/Jul/2008 29/Ago/2008 26/Sept/2008 24/Oct/2008 28/Nov/2008

Manual

Mecánico

18-24/Dic/2005

27/Dic/2005 25/Ene/2006 22/Feb/2006 29/Mar/2006 26/Abr/2006 24/May/2006 28/Jun/2006 26/Jul/2006 29/Ago/2006 27/Sept/2006 25/Oct/2006 22/Nov/2006 28/Dic/2006 24/Ene/2007 21/Feb/2007 28/Mar/2007 25/Abr/2007 23/May/2007 27/Jun/2007 25/Jul/2007 29/Ago/2007 26/Sept/2007 24/Oct/2007 28/Nov/2007 26/Dic/2007 23/Ene/2008 27/Feb/2008 26/Mar/2008 23/Abr/2008 28/May/2008 24/Jun/2008 25/Jul/2008 29/Ago/2008 26/Sept/2008 24/Oct/2008 28/Nov/2008

16-20/Feb/2006 15-21/Abr/2006 18-24/Jun/2006 9-15/Ago/2006 14-18/Oct/2006 12-17/Dic/2006 10-15/Feb/2007 13-19/Abr/2007 17-22/Jun/2007 15-19/Ago/2007 16-21/Oct/2007 15-21/Dic/2007 12-19/Feb/2008 15-19/Abr/2008 14-22/Jun/2008 15-19/Ago/2008 16-21/Oct/2008

Riegos de auxilio 16-19/Nov/2005 21-26/Nov/2005 28-3/Dic/2005 5-10/Dic/2005 12-17/Dic/2005 19-24/Dic/2005 26-31/Dic/2005 2-7/Ene/2006 9-14/Ene/2006 16-21/Ene/2006 23-28/Ene/2006

ANEXO 2

ACTIVIDADES CON PRODUCTORES

Marzo 31, 2006. Participación en la reunión del Comité del Sistema Produce de Coco de Tabasco, Villahermosa. Carlos Oropeza asistió a petición del Comité para discutir y asesorar al Consejo Estatal de Coco de Tabasco sobre que variedades de cocotero son las más adecuadas para establecer programas de replantación en el Estado. Abril 21, 2006 Participación en la reunión del Sistema-Produce de Coco del Estado de Veracruz en las instalaciones de SAGARPA de Jalapa. Carlos Oropeza asistió para la presentar el tema “Germoplasma de cocotero y amarillamiento letal” como parte de una sesión para discutir y asesorar al Consejo Estatal de Coco de Veracruz sobre que variedades de cocotero son las más adecuadas para establecer programas de replantación en el Estado. Abril 25, 2006. Participación en una reunión con el Comité del Sistema Producto Coco de Colima. Carlos Oropeza asistió para presentar los avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del proyecto SAGARPA 2004-C01-99 y el presente proyecto SAGARPA 12690. Abril 27, 2006. Visita a Cihuatlán, Jalisco a petición del Consejo Estatal de Coco de Jalisco. Carlos Oropeza asistió para recorrer plantaciones de cocotero y explorar la presencia de palmas con síntomas de amarillamiento letal. No se encontró ninguna y los productores no han observado palmas sospechosas hasta el momento. Abril 29, 2006. Visita a Couhuayana, Michoacán a petición del Consejo Estatal de Coco de Michoacán y del Comité de Sanidad Vegetal. Carlos Oropeza asistió para recorrer plantaciones de cocotero con focos de amarillamiento letal. Se registraron los síntomas en las palmas, los cuales coinciden con los reportados para esta enfermedad. Posteriormente en las oficinas del Comité tuvimos una reunión para discutir actividades futuras para realzarse en una visita próxima al estado de Michoacán. Julio 28 al 30 y del 4 al 6 de Agosto del 2006. Participación del CICY en la Feria del Coco del Ejido de San Crisanto, Yucatán. Se presentaron carteles sobre los avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del proyecto SAGARPA 2004-C01-99 y el presente proyecto SAGARPA 12690. Julio 25 al 27 y del 3 al 5 de Agosto, 2007. Participación del CICY en la Feria del Coco del Ejido de San Crisanto, Yucatán. Se presentaron carteles sobre los usos del cocotero, el amarillamiento letal, y los avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del presente proyecto SAGARPA 12690. Julio 29, 2007. La Dra. Luz George, Coordinadora de COGENT (Coconut Genetic Resources Network), visitó los ensayos experimentales de CICY en colaboración con el Ejido de San Crisanto, incluyendo los ensayos de evaluación de resistencia al amarillamiento letal del germoplasma de cocotero mexicano Yucatán y la plantación de evaluación y demostración de palmas de cocotero micropropagadas que fue establecida dentro del presente proyecto. La Dra. George y un grupo del CICY fuimos recibidos y atendidos por el Sr. Nicolas Puc Gamboa y otros miembros del Ejido de San Crisanto, incluyendo al Lic. José Inés Loria, propietario del predio donde está establecido el la plantación de palmas micropropagadas. Mayo 28-30, 2008. Visita a Brasil de miembros del Comité Nacional del Sistema Produce de Coco, organizada por el Consejo Nacional del Cocotero (CONACOCO) para realizar una prospección de variedades de cocotero

en el norte de ese país, con particular en el Enano Verde de Brasil. Carlos Oropeza asistió invitado por el Comité para apoyar técnicamente. Julio 25 al 3 Agosto de 2008. Participación del CICY en la Feria del Coco del Ejido de San Crisanto, Yucatán. Se presentaron carteles sobre los usos del cocotero, el amarillamiento letal, y los avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del presente proyecto SAGARPA 12690. Noviembre 03-04, 2008. Visita a Jalisco de Carlos Oropeza, invitado por el Comité del Sistema Producto Coco del Estado de Jalisco. Se ofreció el “Taller de actualización sobre el amarillamiento letal y la micropropagación de palmas resistentes”, incluyendo avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del presente proyecto SAGARPA 12690. Se realizó una salida de campo para conocer su problemática y perspectivas de germoplasma potencial para iniciar la planeación de un programa estatal de replantación. Noviembre 06-07, 2008. Visita de Carlos Oropeza a Colima invitado por el Sr. Mauricio Barreto Presidente del CONACOCO. Se revisaron los avances de su programa de replantación con palmas del ecotipo Alto del Pacífico 2 seleccionado por CICY. Se realizó una de campo para visitar el Rancho Valenzuela, que es la fuente de Alto del Pacifico 2 para el Programa de Replantación de Colima. Visitamos también el vivero de Alto del Pacífico 2, una fábrica de procesamiento de fibras y una para el agua del cocotero, ambos proyectos de CONACOCO. Visitamos Las nuevas plantaciones con Alto del pacífico 2 para revisar su grado de desarrollo, las palmas ya están floreciendo y formando frutos a los cuatro años de haber sido sembradas. Se presentaron avances de la investigación en cultivo in vitro del cocotero dentro del presente proyecto SAGARPA 12690. Diciembre 04-05, 2008. Participación de Carlos Oropeza en la una reunión del Sistema Producto Coco del Estado de Quintana Roo en la que se presentaron los avances del trabajo de investigación y desarrollo de tecnología del INIFAP y del CICY. Se presentó un reporte del los logros del presente proyecto SAGARPA 12690, con énfasis en la plantación de evaluación pues ha generado mucho interés por el desempeño de las palmas obtenidas por micropropagación.