2005-12441, Informe final by SNITT Sistemas

SAGARPA-CONACYT-COFUPRO INTEGRACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTROL DE NEMATODOS PARASITOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS

Proyecto 12441 Convocatoria 2005 Sujeto de apoyo: Universidad Autónoma de Yucatán

Informe final

INTEGRACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTROL DE NEMATODOS PARASITOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS

Proyecto 12441 SAGARPA-CONACYT-COFUPRO

INTEGRACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTROL DE NEMATODOS PARASITOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS

INFORME FINAL

Sujeto de Apoyo: Universidad Autónoma de Yucatán Responsable técnico: Dr. Juan Felipe de Jesús Torres Acosta

INTEGRACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTROL DE NEMATODOS PARASITOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS

RESUMEN El objetivo inicial del presente proyecto fue la evaluación bioeconómica de cuatro estrategias alternativas de control de enfermedades parasitarias (NGI) que permiten reducir el uso de antihelmínticos convencionales en rebaños ovinos tropicales. Se logro evaluar tres métodos alternativos de control contra nematodos gastrointestinales (NGI) en ovinos de pelo. Primeramente, se evaluó la composición química y actividad biológica de 6 plantas leguminosas forrajeras ricas en taninos. Tres de estas tuvieron elevadas cantidades de taninos, notable actividad biológica y sobre todo un claro efecto antihelmíntico in vitro (Lysiloma latisiluquum, Acacia pennatula y Havardia albicans). Se comprobó que los ovinos con y sin experiencia en pastoreo fueron capaces de consumir estas plantas en suficiente cantidad aún en presencia de forraje sin contenido de taninos. No se observaron efectos nocivos. Se comprobó el efecto antihelmíntico in vivo del forraje de L. latisiliquum. Lo anterior permite visualizar el uso de estas plantas nativas como nutracéuticos con efecto antihelmíntico pero se requieren estudios de campo que no pudieron ser efectuados. El segundo componente fue el uso del hongo nematófago Duddingtonia flagrans en heces de ovinos. Se desarrolló una técnica que permitió, por primera vez a nivel mundial, el conteo de clamidosporas en heces. Este avance permitió definir, en estudios in vitro y luego in vivo, que se requiere considerar la cantidad de huevos y clamidosporas en heces para entender mejor la eficacia de estas dosis orales de hongos. Incluso se comprobó que esto es válido en praderas de pasto tropical (en condiciones de invernadero). Se encontró que los ovinos en pastoreo y ramoneo consumen una cantidad cercana a 180 g/día de BMU. Por lo tanto, si se quiere utilizar a los BMU como mecanismo de dosificación, se debe incluir 28000 clamidosporas por g de bloque. Los estudios de campo no pudieron ser realizados. La tercera estrategia evaluada demostró que los ovinos en agostadero infectados naturalmente con NGI necesitan incrementar la cantidad de suplemento gradualmente, conforme crecen (1.5% del PV). Esto permite mejorar la capacidad de tolerar a los NGI. Esto fue probado con maíz quebrado como suplemento. Ahora se requiere probar fuentes alternativas de energía como los BMU. El estudio de persistencia de eficacia de las agujas de cobre (AOC) contra Haemonchus contortus se quedó en fase de desarrollo. En conclusión, los tres métodos de control alternativo evaluados muestran que es posible afectar a negativamente a los parásitos y reducir la dependencia a las drogas antihelmínticas convencionales. Es necesario probar la integración de estos métodos y su eficacia a nivel de granjas ovinas colaborantes.

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TABLA DE CONTENIDO AGRADECIMIENTOS

1. INTRODUCCIÓN.

2. AVANCES DEL PROYECTO

3. LOGRO DE LAS METAS RESPECTO DE METAS COMPROMETIDA

4. LOGRO DE OBJETIVOS RESPECTO DE COMPROMISO

5. GRUPO DE TRABAJO

6. DESVIACIONES Y/O MODIFICACIONES EN LA ETAPA

7. ACCIONES DERIVADAS DE DESVIACIONES Y/O MODIFICACIONES

8. ACCIONES REALIZADAS CON LOS SECTORES USUARIOS

9. OBSERVACIONES RELEVANTES SOBRE PRESUPUESTO AUTORIZADO 37 10. ESTADO DE APORTACIONES COMPLEMENTARIAS

11. PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA ETAPA

12. COMPROMISOS PARA LA SIGUIENTE ETAPA

13. DIFUSIÓN DE LA INFORMACIÓN GENERADA ENTRE PRODUCTORES, TÉCNICOS Y MÉDICOS VETERINARIOS EN EL SECTOR DE LA OVINOCULTURA TROPICAL

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AGRADECIMIENTOS. Los participantes de este proyecto queremos agradecer al CONACYT-SAGARPACOFUPRO por el financiamiento a este proyecto que permitió lograr considerables avances en el campo de los métodos de control alternativo de nematodos gastrointestinales en ovinos del trópico. A las autoridades y personal administrativo de la Universidad Autónoma de Yucatán y muy particularmente de la FMVZ por el apoyo incondicional y absoluto otorgado en todas y cada una de las actividades realizadas en este proyecto. A las autoridades e investigadores del CENID-PAVET-INIFAP y en especial a la sección de helmintología, por el apoyo expedito y el gran esfuerzo ejercido para el desarrollo del presente proyecto y en especial por su gran apertura a la recepción de los estudiantes de la UADY y de la UNAM que participaron entusiastamente en este proyecto. Con su magnífica colaboración nos demostraron que en México es posible trabajar en equipo con camaradería, responsabilidad y respeto. A las autoridades de la Ecole National Vétérinaire de Toulouse, Francia, en especial de la UMR 1225, “Interacción entre patógenos y hospedadores” por su gran apoyo para la ejecución de este proyecto. Les agradecemos todas las facilidades (logísticas, académicas y humanas) otorgadas tanto a los investigadores como a los alumnos Mexicanos que tuvieron el placer de acudir a sus instalaciones a realizar alguna fase de este proyecto. Agradecemos también la confianza que demostraron hacia nuestra dependencia (FMVZ-UADY) al mandar a sus alumnos de veterinaria y posgrado para realizar parte de sus proyectos de investigación en el marco de nuestro proyecto. Esta colaboración ha sido mantenida y fortalecida durante 10 años en que hemos participado juntos como hermanos en la búsqueda de métodos de control sustentable de parásitos para los productores de nuestros países. A todos los alumnos de nuestra dependencia y a los alumnos de otras Instituciones de educación superior de México y otros países por su trabajo fructífero, apasionado y de gran calidad! Todos y cada uno de estos jóvenes nos han demostrado que México tiene un gran futuro en sus manos. A todos los técnicos y trabajadores de campo de las diferentes instituciones comprometidas en el proyecto por su labor profesional y en muchas ocasiones heroica que esperamos poder recompensar de alguna manera en el futuro. A todos los productores colaborantes que nos dieron la confianza de trabajar en sus instalaciones y sus animales. Gracias por hacernos sentir útiles y por plantearnos claramente sus problemas y aspiraciones que nos hacen poner los pies sobre la tierra. Esto nos plantea el reto de aterrizar nuestra investigación para resolver los problemas reales. Personalmente agradezco a todos los investigadores participantes del proyecto por su esfuerzo, dedicación, entusiasmo, paciencia y entrega más allá del deber para ejecutar este ambicioso proyecto. Espero que podamos seguir trabajando juntos por muchos años más en la resolución de problemas de nuestra región. ¡A todos gracias! Dr. Juan Felipe de J. Torres Acosta Responsable del Proyecto

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1. INTRODUCCIÓN Los ovinocultores de las regiones tropicales de México han manifestado reiteradamente la urgente necesidad de controlar las parasitosis ocasionadas por nematodos gastrointestinales (NGI). Actualmente dependen casi exclusivamente de drogas antihelmínticas convencionales. El uso masivo y muchas veces indiscriminado de estas drogas ha ocasionado la aparición de cepas de NGI resistentes a dichas drogas. En los últimos 15 años, México ha apoyado la formación de los diferentes miembros de nuestro grupo de trabajo que se han dedicado a la investigación y desarrollo de alternativas de control de NGI que reduzcan la necesidad de usar drogas antihelmínticas comerciales en los rebaños ovinos y caprinos. Este grupo ha sido pionero en México del uso de algunas estrategias que han demostrado tener gran potencial como productos transferibles a los productores del país (Torres-Acosta y Hoste, 2008). Los métodos que se proponen en este proyecto son la suplementación alimenticia, los hongos nematófagos y los desparasitantes no-convencionales, entre los que se encuentran las agujas de cobre (AOC) y los taninos contenidos en algunas plantas nativas. Los trabajos realizados por este equipo en cuanto a suplementación en caprinos y ovinos han demostrado que estos animales pueden mejoran su capacidad de tolerar a los parásitos en agostadero nativo de Yucatán (Torres-Acosta et al., 2004, 2006; Hoste et al., 2008a). Incluso se ha estudiado que tipo de suplemento y cuando utilizarlo para optimizar el crecimiento de los caprinos y ovinos (Knox et al., 2006). Sin embargo se requiere corroborar que cantidad de suplemento optimiza aun más la ganancia de peso en ovinos de pelo. Además, es necesario explorar la posibilidad de sustituir los suplementos convencionales por otros como los bloques de melaza urea (BMU). El control biológico mediante el hongo nematófago Duddingtonia flagrans (cepa Mexicana) es otro método que tiene gran potencial para reducir la necesidad del uso de drogas antihelmínticas (Llerandi-Juárez y Mendoza de Gives, 1998; Ojeda-Robertos et al., 2005). Sin embargo, es necesario definir la dosis óptima de clamidosporas (estructuras de resistencia), que deben ser administradas oralmente a los ovinos, para alcanzar un control óptimo de larvas en las heces depositadas en el pasto. En cuanto al uso de desparasitantes no-conveniconales, nuestro grupo ha demostrado el efecto de las AOC sobre el parásito Haemonchus contortus en diversos estudios realizados en praderas de Yucatán con ovinos y caprinos (Martínez-Ortíz de M. et al., 2008). Sin embargo, un dato importante para el 6

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diseño de estrategias de control con este material, y que no ha sido determinado, es la duración de la persistencia de las AOC contra dicho parásito. Otro tipo de desparasitante no convencional que parece ser prometedor son los taninos (Hoste et al., 2005, 2006, 2008b) contenidos en numerosas plantas forrajeras de Yucatán. Nuestro grupo cuenta con las herramientas tecnológicas y humanas para estudiar el potencial de estas plantas desde el punto de vista benéfico (como antihelmíntico y alimento) y sus potenciales consecuencias negativas (toxicidad) sobre los animales. Este proyecto buscaba además integrar varios de métodos alternativos de control para potencializar el efecto positivo de cada uno. El trabajo se desarrollo con el esfuerzo de un equipo de trabajo de tres instituciones de México y una de Francia. Además contó con el apoyo de numerosos estudiantes, técnicos y productores ovinos de Yucatán. Agradecemos al financiador SAGARPA-CONACYT-COFUPRO por el apoyo recibido y esperamos que los avances alcanzados sirvan para detonar el esfuerzo en la búsqueda de tecnologías de control sustentables que puedan ser adoptadas por aquellos para quienes fueron desarrollados: los productores de ovinos de zonas tropicales de México. Referencias. Hoste H., Torres-Acosta J.F., Paolini V., Aguilar-Caballero A., Etter E., Lefrileux Y., Chartier C., Broqua C., 2005. Interactions between nutrition and gastrointestinal infections with parasitic nematodes in goats. Small Ruminant Research. 60: 141-151. Hoste, H., Jackson, F., Athanasiadou, S., Thamsborg, S.M., Hoskin, S.O., 2006. The effects of tannin-rich plants on parasitic nematodes in ruminants. Trends in Parasitology. 22, 253–261. Hoste, H., Torres-Acosta, J.F.J., Aguilar-Caballero, A.J., 2008a. Nutrition-parasite interactions in goats: is immunoregulation involved in the control of gastrointestinal nematodes? Parasite immunology. 30, 79-88. Hoste, H., Torres-Acosta, J.F., Alonso-Díaz, M.A., Brunet, S., Sandoval-Castro, C., Adote, S. 2008b. Identification and validation of bioactive plants for the control of gastro intestinal nematodes in small ruminants. Tropical Biomedicine. 25, 56-71. Knox, M., Torres-Acosta, J.F.J., Aguilar-Caballero, A., 2006. Exploiting the effect of dietary supplementation of small ruminants on resilience and resistance against gastrointestinal nematodes. Veterinary Parasitology. 139, 385-393. Llerandi-Juárez, R.D., Mendoza-de-Gives, P., 1998. Resistance of chlamydospores of nematophagous fungi to the digestive processes of sheep in Mexico, Journal of Helminthology. 72, 155-158. Martínez Ortíz de M., C., Vargas-Magaña, J.J., Aguilar-Caballero, A.J., Sandoval-Castro, C.A., Cob-Galera, L., May-Martínez, M., Miranda-Soberanis, L., Hoste, H., Torres-Acosta, J.F.J. 2008. Combining the effects of supplementary feeding and copper oxide needles improves the control of gastrointestinal nematodes in browsing goats. Veterinary Parasitology. 146, 66-76. Ojeda-Robertos, F.N., Mendoza-de Gives, P., Torres-Acosta, J.F.J., Rodríguez-Vivas, R.I., Aguilar-Caballero A.J., 2005. Evaluating the effectiveness of a Mexican strain of Duddingtonia

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flagrans as a biological control agent against gastrointestinal nematodes in goat faeces. Journal of Helminthology. 79: 151-157. Torres-Acosta, J.F.J., Jacobs, D.E., Aguilar-Caballero, A., Sandoval-Castro, C., May-Martínez, M., Cob-Galera, L.A., 2004. The effect of supplementary feeding on the resilience and resistance of browsing Criollo kids against natural gastrointestinal nematode infections during the rainy season in tropical Mexico. Veterinary Parasitology. 124: 217-238. Torres-Acosta, J.F.J., Jacobs, D.E., Aguilar-Caballero, A., Sandoval-Castro, C., Cob-Galera, L., May-Martínez, M., 2006. Improving resilience against natural gastrointestinal nematode infections in browsing kids during the dry season in tropical Mexico. Veterinary Parasitology. 135: 163-173. Torres-Acosta, J.F.J., Hoste H., 2008. Alternative or improved methods to limit gastro-intestinal parasitism in grazing sheep and goats. Small Ruminant Research. 77, 159–173.

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3. AVANCES DEL PROYECTO. Deberá describir las actividades programadas para el periodo de la etapa de acuerdo al cronograma de actividades. Describir en forma detallada las actividades realizadas en la etapa y especificar el porcentaje de avance de cada una de ellas, en relación con el porcentaje programado para la etapa. Usar diagrama de avance (Gantt) Tema 1. Determinación del consumo voluntario de bloques de melaza-urea (BMU) en ovinos en condiciones de pastoreo y de ramoneo. Experimento 1. Consumo de bloques energéticos y proteicos en corderas de pelo bajo condiciones de pastoreo de pasto estrella de África.

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Planeación y logística (Mayo) Adquisición de animales (Mayo) Adquisición de insumos (Mayo a Junio) Elaboración de dos tipos de bloques (BMU) (Junio) Desarrollo del experimento en granja (Junio a Agosto) Captura y análisis de datos (Agosto a diciembre)

Experimento 2. Consumo de bloques energéticos y proteicos en corderas de pelo bajo condiciones de ramoneo de agostadero nativo.

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Planeación y logística (Mayo) Adquisición de animales (Mayo) Adquisición de insumos (Mayo a Junio) Elaboración de dos tipos de bloques (BMU) (Julio) Desarrollo del experimento en granja (Julio a Octubre) Captura y análisis de datos (Septiembre a diciembre)

Fotos de las praderas y los animales del rancho Noc Ac en Baca Yucatán.

Fotos de animales experimentales en rancho colaborante con animales consumienod bloque después del pastoreo. Se elaboraron jaulas individuales para mejorar la precisión de las mediciones. Se finalizó el 100% de la fase de campo. Se probaron dos tipos de bloques de melaza elaborados localmente (con mayor nivel de proteína y menor nivel de proteína). Se trabajó 10

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en un rancho colaborante que aportó animales, instalaciones y personal (Rancho ovino Noc Ac, Baca, Yucatán). En este trabajo participaron alumnos para obtener su tesis de licenciatura en MVZ (Alejandro Méndez Ortiz, México) y de Maestría (Anne Brincat, Francia). Se elaboró un manual de producción de bloques de melaza que se planteaba publicar en 2009. Tema 2. Evaluación de plantas leguminosas nativas (PLN) ricas en taninos condensados (TC). Experimento 3. Determinación de la cantidad y actividad biológica de compuestos fenólicos (taninos, polifenoles) en hojas de arboles forrajeros nativos de Yucatán (Lysiloma latisiliquum, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum).

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Planeación y logística (febrero a Mayo) Corte de material vegetativo (Mayo a Julio) Determinación de composición química en laboratorio (Mayo a Julio) Producción de extractos de plantas experimentales (Mayo a Junio) Liofilización de extractos (Julio a Agosto) Determinación de contenido de compuestos polifenólicos (Mayo a Agosto) Determinación de actividad biológica (Septiembre a Octubre) Captura y análisis de datos (Julio a diciembre)

Experimento 4. Determinación de la cantidad y actividad biológica de compuestos fenólicos (taninos, polifenoles) en hojas de arboles forrajeros nativos de Yucatán (Acacia gaumeri (AG) y Havardia albicans (HA)).

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Planeación y logística (Mayo a Julio). Corte de material vegetativo (Agosto a Octubre). Determinación de composición química en laboratorio (Agosto a Octubre). Producción de extractos de plantas experimentales (Agosto a Septiembre). Liofilización de extractos (Septiembre a Noviembre) Determinación de contenido de compuestos polifenólicos (Agosto a Octubre). Determinación de actividad biológica (Octubre a Noviembre), Captura y análisis de datos (Julio a diciembre),

Experimento 5. Variabilidad en el contenido de la cantidad y actividad biológica de compuestos fenólicos (taninos, polifenoles) en follaje de arboles forrajeros nativos de Yucatán (Lysiloma latisiliquum, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum).

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Planeación y logística (febrero a Mayo). Corte de material vegetativo (Mayo). Determinación de composición química en laboratorio (Mayo a Junio). Determinación de contenido de compuestos polifenólicos (Mayo a Junio). Determinación de actividad biológica (Mayo), Captura y análisis de datos (Julio a diciembre),

Arboles ricos en taninos utilizados para obtener el material vegetativo estudiado. 12

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Fotos del material vegetativo ya cosechado y de los procesos de extracción fenólica y de determinación de composición química de los materiales.

Fotos de extractos liofilizados de las plantas nativas experimentales y de uno de los métodos de determinación de taninos (la técnica de butanol HCl).

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Tema 3. Evaluación de la selectividad y consumo de plantas leguminosas nativas (PLN) ricas en taninos condensados (TC). Experimento 6. Selectividad y consumo de hojas de arboles forrajeros nativos de Yucatán (Lysiloma latisiliquum, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum).

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Planeación y logística experimental (Febrero a Abril) Adquisición de animales experimentales (Mayo) Construcción de jaulas experimentales (Mayo) Adaptación de animales a las plantas (Mayo a Junio) Corte de material vegetativo (Mayo a Julio) Determinación de composición química en laboratorio (Mayo a Septiembre) Determinación de contenido de compuestos polifenólicos (Mayo a Septiembre) Determinación de actividad biológica (Mayo a Septiembre) Determinación diaria de consumo y preferencia (Mayo a Julio) Captura y análisis de datos (Julio a noviembre)

Experimento 7. Selectividad y consumo de hojas de arboles forrajeros nativos de Yucatán (Acacia gaumeri, Havardia albicans, Leucaena leucocephala) con y sin bloqueador de taninos (PEG).

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Planeación y logística experimental (Mayo a Julio) Adquisición de animales experimentales (Septiembre) Adaptación de animales a las plantas (Septiembre) Corte de material vegetativo (Septiembre a Noviembre) Determinación de composición química en laboratorio (Sept 2006 a Feb. 2007) Determinación de compuestos polifenólicos (Sept 2006 a Feb. 2007) Determinación de actividad biológica (Sept. 2006 a Feb. 2007) Determinación diaria de consumo y preferencia (Septiembre a Noviembre) Captura y análisis de datos (Sept. 2006 a Mzo 2007)

Se finalizó el 100% las actividades y algunos trabajos han sido publicados en revistas científicas. Se evaluaron siete especies de plantas (Lysiloma latisiliquum, Leucaena leucocephala, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum, Acacia gaumeri y Havardia albicans). Estas plantas tenían elevados niveles de taninos y algunas de ellas demostraron niveles altos de actividad biológica (para unirse a proteína). Se encontró que los ovinos son capaces de consumir considerable cantidad de plantas con altas cantidades de taninos aún cuando simultáneamente tenían acceso a plantas con escaza o nula cantidad de este compuesto supuestamente anti-nutricional. Estos animales parecen mostrar capacidad de bloquear los taninos lo que les permite consumir las plantas y hacer uso de los nutrientes de las mismas. Esto podría permitir utilizar estas plantas como posible productos nutracéuticos contra nematodos parásitos de los ovinos En este trabajo participaron alumnos de doctorado (MC Miguel Ángel Alonso Díaz) y de maestría (Guillermina Hernandez Orduño). Se elaboró un manual de determinación de taninos en plantas leguminosas forrajeras que, de acuerdo al proyecto se planteaba publicar en 2009. Se han publicado dos de estos trabajos en la Revista Animal Feed Science and Technology en 2008.

Fotos de pesaje de hojas para ofrecer a los animals en pruebass de cafetería donde disponían de hojas ricas en taninos y hojas de alto valor nutricional y sin taninos.

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Tema 4. Establecer el nivel de suplementación óptima para el control de NGI en ovinos en pastoreo. Experimento 8. Evaluación de diferentes niveles de suplementación de maíz en ovinos de pelo en pastoreo.

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Planeación y logística experimental (Marzo a Junio) Adquisición de animales experimentales (Julio) Adaptación al pastoreo y suplementación (Julio) Desarrollo del estudio (pesajes, toma y procesamiento en lab.) (Ago. – Nov.), Determinación de consumo en pastoreo (Agosto a Noviembre), Identificación de plantas consumidas (Agosto a Noviembre), Sacrificio, conteo e identificación de parásitos en contenidos (Nov-Dic) Captura y análisis de datos (Julio a diciembre),

Se finalizó el 100% de la fase de campo, se sacrificaron los ovinos experimentales al final de la prueba y actualmente se están analizando los datos y procesando muestras de contenidos preservados. En este trabajo participó la estudiante MVZ Cecilia Flores Retama para obtener la Maestría en Producción Animal Tropical, opción nutrición animal.

Fotografías de ovinos experimentales durante la prueba de pastoreo y procesamiento de muestras en laboratorio. 16

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Foto de pesaje de animales durante el estudio y de un animal sacrificado al que se le contabilizaron las cantidades de parásitos que tuvieron en el tracto gastrointestinal.

Tema 5. Establecer la eficacia de D. flagrans sobre las L3 de H. contortus in vitro y en pradera de pasto estrella de áfrica.

Experimento 9. Conteo de clamidosporas de D. flagrans en heces de ovinos.

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Planeación y logística experimental (Marzo a Mayo) Cultivo, cosecha y conteo de dosis de clamidosporas (Marzo a Mayo) Adquisición de animales experimentales (Junio) 1ª Infección artificial con H. contortus (Julio a Agosto) 2ª Infección artificial con H. contortus (Septiembre) Fase experimental (Octubre a Noviembre) Análisis de resultados (Noviembre 2006 a Enero 2007)

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Experimento 10. Eficacia de diferentes dosis de clamisdosporas de D. flagrans en heces de ovinos.

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Planeación y logística experimental (Marzo a Mayo) Cultivo, cosecha y conteo de dosis de clamidosporas (Marzo a Mayo) Infección artificial H. contortus (Agosto) Fase experimental de determinación de eficacia (Septiembre) Incubaciones de larvas in vitro (Agosto a Noviembre) Análisis de resultados (Septiembre 2006 a Enero 2007)

En estos experimentos se utilizaron clamidosporas de dichos hongos ofrecidas a los corderos directamente en la dieta. Los ovinos fueron criados libres de NGI por un productor colaborante (Rancho Paraíso, Uman, Yucatán). Los animales fueron infectados artificialmente con el nematodo abomasal H. contortus cepa CENID-PAVET-INIFAP (Cuernavaca, Morelos). Con estos trabajos se encontró que las clamidosporas de este hongo se pueden contar en heces. Las dosis planeadas, de acuerdo a los trabajos realizados en otras partes del mundo han carecido de este dato de la cantidad de clamidosporas y huevos de NGI llegando a las heces. Este trabajo ha sido publicado en la revista científica indizada internacional Veterinary Parasitology.

Experimento 11. Eficacia in vitro de clamidosporas de D. flagrans en expuestas a huevos y a larvas de H. contortus en heces de ovinos.

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o Planeación y logística experimental (Noviembre a Diciembre) o Infección artificial de donadores con H. contortus (Enero), o Desarrollo de técnicas de extracció de huevos de Haemonchus contortus de heces de ovinos (Febrero) o Fase experimental (Febrero a Abril) o Análisis de resultados (Marzo a Julio)

Este trabajo in vitro se realizó en el CENID-PAVET-INIFAP, Cuernavaca, Morelos. En este se determinó la eficacia de diferentes cantidades de clamidosporas en relación a la cantidad de huevos de H. contortus en heces y de clamidosporas con larvas del mismo parásito (2 experimentos). Se determinó con estos estudios in vitro que la eficacia tiene dependencia de la cantidad de clamidosporas que llegan a las heces. Estos trabajos son una gran contribución a la ciencia del control biológico de NGI en heces de ovinos.

Experimento 12. Eficacia de clamidosporas de D. flagrans en heces de ovinos en praderas artificiales de estrella de África.

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Planeación y logística experimental (Diciembre), Siembra de praderas de estrella de África (Diciembre a Mayo) Infección artificial de donadores con H. contortus (Abril a Mayo), Fase experimental (heces en praderas, incubaciones, eficacias (Mayo a Julio) Análisis de resultados (Mayo a Octubre)

Este trabajo en macetas de pasto estrella se realizó en un invernadero de la FMVZ-UADY. En este se confirmó en condiciones semi-naturales la eficacia de diferentes cantidades de clamidosporas en relación a la cantidad de huevos de H. contortus en heces. Estos trabajos semicontrolados permiten llegar muy cerca de su aplicación al campo para el control biológico de NGI en heces de ovinos. Los trabajos forman parte de la tesis de doctorado de la MC MVZ Nadia Florencia Ojeda Robertos. Dos de los trabajos realizados han sido publicados en Veterinary Parasitology (ver anexo) y uno más está por ser enviado a la revista Small Ruminant Research.

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Fotos con conteos de clamidosporas de Duddingtonia flagrans en heces de ovinos y de los hongos en su vehiculo de administración en melaza.

Procedimiento de infección artificial con H. contortus y de alojamiento de animales en estudio.

Obtención de muestras de ovinos con infección artificial de H. contortus y dosificados con clamidosporas de D. flagrans. Procedimiento de cultivo de heces in vitro para determinar eficacia de diferentes dosis de clamidosporas

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Medición de eficacia de clamidosporas en heces de ovinos infectados con H. contortus. Procedimiento realizado en invernadero con masetas individuales de parto Cynodon nlemfluensis.

Procedimientos realizados en el laboratorio de helmintología del CENID-PAVET. En esta fase se determinó el efecto de diferentes dosis de clamidosporas (no digeridas) y huevos de H. contortus en las heces de ovinos.

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Tema 6. Establecer cual planta es más eficaz para el control de Trichostrongylus colubriformis y H. contortus. Experimento 14. El efecto AH de plantas ricas en taninos (Lysiloma latisiliquum, Leucaena leucocephala, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum) se evaluó contra H. contortus en condiciones in vitro.

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Planeación y logística (Marzo a Abril) Extracción y liofilizado de extractos (Mayo a Agosto) Infección de ovino donador en Francia Haemonchus contortus (Abril a mayo) Fase experimental in vitro (migración larvaria y desenvaine) (Agosto a Octubre) Análisis de resultados (Agosto a Noviembre)

Experimento 14. El efecto AH de plantas ricas en taninos (Lysiloma latisiliquum, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum) se evaluó contra larvas de T. colubriformis en condiciones in vitro.

o Planeación y logística (Marzo a Abril) o Extracción y liofilizado de extractos (Mayo a Agosto)

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o Infección de ovino donador en Francia Trichostrongylus colubriformis (Abril a mayo) o Fase experimental in vitro (migración larvaria y desenvaine) (Agosto a Octubre) o Análisis de resultados (Agosto a Noviembre) Experimento 15. Evaluación de efecto antihelmíntico in vitro de plantas ricas en taninos (Lysiloma latisiliquum, Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrum) en parásitos adultos en condiciones in vitro.

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Planeación y logística (Febrero a Abril) Extracción y liofilizado de extractos (Febrero – Mayo) Infección artificial con H. contortus (Agosto) Sacrifício de animal infectado con H. contortus en Francia (Septiembre) Fase experimental (Septiembre)

Experimento 16. El efecto AH de extractos ricos en taninos (Acacia gaumeri, Havardia albicans y extracto de quebracho) se evaluó contra H. contortus de México en condiciones in vitro.

o Planeación y logística (enero a Febrero) 23

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Producción de larvas infectantes de H. contortus de México (Febrero a Abril) Obtención de hojas, extracción y liofilizado de extractos (Febrero – Abril) Fase experimental in vitro (migración larvaria) (Mayo). Captura de datos (Mayo a Junio) Análisis de resultados (Mayo a Julio 2007).

Experimento 17. Efecto antihelmíntico in vivo del consumo de forraje de Lysiloma latisiliquum sobre Haemonchus contortus.

o o o o o o o o

Planeación y logística (Marzo a Abril) Infección de ovino donador: Cuernavaca México H. contortus y (Abril a Julio) Infección de ovino donador: Francia T. colubriformis (Abril a Julio) Fase experimental in vvo (Septiembre) Infección artificial con ambos tipos de parásitos (Septiembre) Sacrificio de animales (Septiembre) Conteo de parásitos (Octubre a Noviembre) Análisis de resultados (Agosto a Diciembre)

Los estudios in vitro han confirmado que los taninos de algunas PTN de Yucatán tienen efecto antihelmíntico contra H. contortus y T. colubriformis. Se demostró este efecto antihelmíntico in vitro en varias PTN con las técnicas de inhibición de la motilidad larval (Larval migration inhibition test) y la técnica de desenvaine (exsheatment test). El trabajo con parásitos adultos no funcionó adecuadamente y se dejó para su confirmación in vivo. Los resultados fueron expuestos en diversos trabajos en los congresos: Primer Congreso Norte Americano de Parasitología (Mérida, Junio, 2007), Congreso de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria (Gante, Bélgica, Agosto, 2007) y Congreso sobre Métodos Alternativos de Control de Nematodos (Ipoh, Malasia, Febrero, 2008). Además, se han aceptado para su publicación tres trabajos de éstos métodos con diferentes plantas ó parásitos (Dos en Veterinary Parasitology y uno más en Tropical and Subtropical Agroecosystems). Se realizó un estudio in vivo con el apoyo de Severine Brunet, estudiante de Doctorado de Francia, asesorada del Dr. Herve Hoste, colaborador del proyecto. Para esto utilizó larvas 24

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de H. contortus y T. colubriformis un parásito importante de intestino delgado. El trabajo fue finalizado exitosamente y se comprobó que los taninos de las PTN pueden reducir la capacidad de establecimiento de las larvas de los dos parásitos evaluados en el abomaso e intestino de los animales expuestos a estas plantas. El artículo correspondiente a este trabajo ha sido aceptado por la revista Veterinary Parasitology.

Pruebas in vitro realizadas en el laboratorio del UMR 1225 del INRA-ENV Toulouse, Francia.

Fotos de procedimientos experimentales donde se utilizaron las plantas taniníferas en ovinos de pelo de Yucatán infectados artificialmente con Haemonchus contortus. Experimentos que quedaron truncos en el periodo de trabajo del proyecto. Experimento 19. Determinar la vida de anaquel de Duddingtonia flagrans en BMU. o Experimento pospuesto por causas de fuerza mayor (contaminación de la cepa de clamidosporas) (Junio 2006 a Junio 2007).

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o Producción de clamidosporas para los estudios de vida de anaquel (Julio a Diciembre 2007) o Pruebas de elaboración de bloques (Cancelado 2008) o Estudios de vida de anaquel (Cancelado 2008) o Pruebas de consumo de bloques (Cancelado 2008)

Foto del hongo de Duddingtonia flagrans con un crecimiento optimo el cual fue cosechado a los 21 días después de controlado el problema de contaminación en el laboratorio del CENID-PAVET. Experimento pospuesto por causas de fuerza mayor: se contaminó la cepa de clamidosporas. Los colaboradores del CENID-PAVET trabajaron para limpiar la cepa de D. flagrans de Junio 2006 a Junio 2007. El presente trabajo estaba propuesto para ser tesis de Maestría de José Antonio Fitz Aranda de la Universidad Nacional Autónoma de México. Se había planteado terminar el desarrollo como se indica en el cronograma (junio y diciembre 2008). Experimento 20. Establecer la duración de la persistencia de la eficacia de las AOC sobre H. contortus. o o o o o o o

Planeación (enero-junio 2007). Recepción de AOC del INRA, Francia (UMR-1225) (Cancelado 2008) Producción de corderos libres de NGI (Cancelado 2008) Desarrollo de fase experimental (Cancelado 2008) Sacrificio de animales (Cancelado 2008) Conteo de parásitos (Cancelado 2008) Análisis de datos y escrito de reporte y artículo (Cancelado 2009)

Experimento pospuesto por causas de fuerza mayor: se retrasó la recepción de cápsulas de cobre. Las capsulas se recibieron en febrero de 2008. El productor colaborante (Rancho ovino Noc Ac, Baca, Yucatán) había accedido a aportar los recursos para la compra de alimento y aporte del personal para manejo diario de los animales desde su nacimiento hasta el inicio del experimento y durante la duración del mismo (aproximadamente 6 meses). Se contaba con la participación de un estudiante de Maestría de la UADY. Se había planteado terminar el desarrollo como se indica en el cronograma (junio y diciembre 2008). 26

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3. LOGRO DE METAS RESPECTO DE METAS COMPROMETIDAS. Especificar el porcentaje de cumplimiento de metas con respecto a las comprometidas. (En caso de no cumplir con el 100%, justificar). Fase 1. Meta 1. Establecer el consumo voluntario de BMU que permita el consumo de dosis de 500,000 clamidosporas de D. flagrans por Kg de PV. La meta tiene un alcance de 100%. Se determinó que los ovinos de pastoreo y ramoneo consumen una cantidad de alrededor de 180 g/día de BMU. Esto significa que debe haber alrededor de 28000 clamidosporas por g de bloque. Sin embargo, los resultados obtenidos en el presente proyecto demuestran que la meta debe ser re-planteada en futuros trabajos debido a los descubrimientos de nuestro grupo de trabajo de relevancia internacional. Los descubrimientos realizados han cambiado radicalmente el paradigma de la dosificación oral de las clamidosporas de Duddingtonia flagrans: i.

ii. iii.

El primer descubrimiento consistió en desarrollar una técnica para contabilizar las clamidosporas en la heces de ovinos tratados oralmente con clamidosporas (ver artículo publicado Ojeda-Robertos et al., 2008a). El segundo hallazgo relevante fue encontrar que las clamidosporas de D. flagrans son destruidas en aproximadamente 90% en el tracto digestivo (ver resumen anexo). El tercer descubrimiento fue determinar que se requieren 10 clamidosporas por huevo de nematodo en cada gramo de heces para alcanzar buena eficacia (ver artículo aceptado Ojeda-Robertos et al., 2008b).

Nuestros resultados indican que la dosificación oral debe aportar suficientes clamidosporas de D. flagrans para tratar un animal, sea en forma aislada ó dentro de un BMU, para lograr que cada gramo de heces presente una relación de 10 clamidosporas por 1 huevo de nematodo gastrointestinal. Para esto se puede utilizar la técnica de conteo de clamidosporas en heces desarrollada en el presente proyecto. Hemos realizado los primeros ensayos in vivo en ovinos ofreciendo las clamidosporas para lograr tal relación en heces exitosamente. Se probó el efecto de proporcionar las clamidosporas a ovinos pero probando la eficacia en una pradera artificial de pasto estrella a la que se le adicionó heces con huevos y clamidosporas. Esto se realizó antes de usarlo en praderas normales para evitar efectos ambientales que influyan en el resultado. El efecto de 10 clamidosporas por huevo fue adecuado. No se probó la proporción planteada con los bloques a nivel de campo. Meta 2. Seleccionar una PTN con alta cantidad de taninos y elevada actividad biológica. La meta tiene un alcance de 100%. Se han encontrado varias plantas nativas de la selva baja de Yucatán con elevado contenido de taninos y buena actividad biológica medida in vitro. Se encontró que Lysiloma latisiliquum y Havardia albicans son las plantas más 27

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prometedoras por su alto contenido de taninos y su buena actividad biológico. En este proyecto se reportó por primera vez a nivel mundial que los fenoles totales de las plantas tienen mayor afinidad con la actividad biológica que los mismos taninos. Esto se pudo comprobar debido a que en este proyecto se realizó una caracterización química completa de cada planta que incluyo: proteína cruda, FDN, FDA, lignina, taninos condensados, taninos totales, fenoles totales, celulosa, hemicelulosa y cenizas (Ver artículos publicados de Alonso-Díaz et al., 2008c y 2008d). A raíz de que se uso esta gran variedad de contenidos, se creó un nuevo paradigma: la actividad biológica (difusión radial y producción de gas in vitro) está mejor relacionada con los fenoles totales que con los taninos (totales ó condensados). Lo anterior indica que los futuros estudios de plantas taniníferas deben considerar una variedad de elementos químicos.

Fase 2. Meta 3. Establecer el nivel de suplementación óptima para el control de NGI en ovinos en pastoreo. Esta meta tiene un avance del 100% con respecto a lo comprometido. El presente proyecto demostró que la suplementación diaria con maíz con cualquier nivel mejora la capacidad de sobrevivir y crecer bajo infecciones naturales con NGI. Sin embargo, la suplementación diaria con 1.5% del peso vivo del animal permite a los ovinos el mejor comportamiento comparado con 1% de su peso vivo y 108 g por día. i.

ii.

En el presente proyecto se desarrolló una técnica que permitió colectar las heces y orina en ovinos en pastoreo/ramoneo. Esto permitió determinar por primera vez el consumo de forraje en agostadero nativo de Yucatán. Se encontró que la suplementación sustituye una porción importante de consumo de forraje. Es decir, los animales suplementados comen menos en pastoreo. Otro hallazgo fue determinar que los animales infectados no reducen su consumo de forraje. La observación de las especies consumidas por los ovinos permitió determinar que el consumo de leguminosas forrajeras (fuente de proteína) no se incrementa con la suplementación de maíz (fuente de energía).

Meta 4. Establecer la duración de la persistencia de la eficacia de las AOC sobre H. contortus. Esta quedó con un avance de 20% a la fecha de cancelación del proyecto. El experimento quedó en desarrollarse durante 2008 de acuerdo a lo planteado en el segundo informe. El colaborador Francés (Hervé Hoste) se comprometió a enviar las AOC desde Francia. Se elaboró el protocolo, se contaba con un estudiante de posgrado para apoyar en la ejecución del experimento y además se criaron 40 corderos libres de NGI por un productor colaborante del trabajo. El trabajo se realizaría en la unidad de producción del mismo colaborante con personal y alimento financiado por el mismo productor.

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Meta 5. Establecer la eficacia de D. flagrans sobre las L3 de H. contortus in vitro. Esta meta se logró al 100%. Los resultados contribuyeron a la creación del nuevo paradigma ya antes mencionado: la eficacia de las clamidosporas depende de la cantidad de clamidosporas en las heces y esta resulta de la cantidad de clamidosporas recibidas en el alimento, su digestibilidad y la cantidad y calidad de alimento consumido por los ovinos. Los trabajos realizados in vitro y en pradera permiten visualizar que se requiere considerar la cantidad de clamidosporas y huevos de nematodos en heces siendo el óptimo de 10 clamidosporas por huevo de NGI. A partir de estos resultaos y los de los bloques, la siguiente meta a cumplir era el trabajo de campo (que es el de mayor valor para los productores).

Meta 6. Establecer cual planta es más eficaz para el control de Trichostrongylus colubriformis y H. contortus. Esta meta tiene un 100% de avance. Se realizaron cinco experimentos in vitro utilizando técnicas de inhibición de motilidad en larvas, desenvaine de larvas y motilidad de parásitos adultos. Para esto se procesaron 6 especies de plantas nativas de Yucatán para obtener sus extractos liofilizados. Los primeros 5 estudios fueron realizados en Francia con T. colubriformis y H. contortus de Europa, con apoyo logístico y financiero del Dr. Hervé Hoste (Ver artículos de Alonso-Díaz et al., 2008a y 2008b y resumen de congreso Martínez-Ortiz de M. et al., 2008). Una vez adquirida la tecnología se procedió a realizar dos estudios más con parásitos del trópico mexicano (artículo publicado Hernández-Orduño et al., 2008 y tesis de Andrés Calderón Quintal). Se encontró que L. latisiliquum y H. albicans son los candidatos viables para su uso in vivo por sus excelentes resultados in vitro. Además, se probó contra parásitos adultos de H. contortus pero el efecto sobre estos no fue significativo. Esto es un paso muy cercano a la aplicación directa de estas plantas con los productores. Este aspecto iba a ser abordado en la tercera etapa de este proyecto que no se realizará. Fases 3 y 4. No se alcanzaron las metas propuestas para estas fases por ser posteriores a la terminación del proyecto en marzo de 2008.

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4. LOGRO DE OBJETIVOS RESPECTO DE COMPROMISO. Determinar el consumo voluntario de BMU en ovinos de diferente peso vivo. Objetivo logrado para dos tipos de bloque de melaza (100%). El consumo tendría que garantizar una concentración de 10 a 15 millones de clamidosporas por cada 100 g de bloque. Se plantea utilizar bloques más pequeños y manejables para dosificar las clamidosporas. Evaluación de la viabilidad de las clamidosporas de D. flagrans administradas en BMU. Objetivo completado en 20%. Iniciado en el primer semestre de 2008 con la elaboración de primeras pruebas de bloques con cal como aglutinante y se acordó con el productor colaborante la producción de corderos experimentales. Desarrollo cancelado en Marzo 2008. Evaluación de la eficacia de la administración de clamidosporas de D. flagrans en BMU sobre la infectividad de NGI in vitro y en pradera. Objetivo cumplido al 100 % en su administración como aplicación directa de melaza-avena por animal. Se realizaron ya los trabajos in vitro y en pradera para determinar la cantidad de clamidosporas que se requieren en contacto con los huevos y larvas de H. contortus. El estudio de BMU con clamidosporas en pradera se había propuesto para el 2o semestre de 2008. Determinación de la cantidad y actividad biológica de taninos extraídos de plantas nativas de Yucatán. Objetivo cumplido al 100 %. Se tienen 4 plantas con excelentes cualidades y que están disponibles para los productores locales (Lysiloma latisiliqum, Psicidia piscípula, Acacia pennatula, Havardia albicans). La Acacia gaumeri y la Leucaena leucocephala no tuvieron elevadas cantidades de taninos y tuvieron baja actividad biológica. Evaluación de la eficacia in vitro de los taninos extraídos de plantas nativas sobre los NGI. Objetivo cumplido al 100 % mediante 5 plantas taniníferas (Lysiloma latisiliqum, Psicidia piscípula, Acacia pennatula, Havardia albicans y la Leucaena leucocephala). Se utilizaron dos técnicas in vitro para larvas y dos técnicas para parásitos adultos. Se usaron cepas francesas de H. contortus y T. colubriformis así como una cepa mexicana de H. contortus. Los trabajos mostraron la fuerte relación entre la cantidad de taninos, medida con la técnica de vainillina y la actividad biológica ó antihelmíntica. Se obtuvieron fotos electrónicas de H. contortus y T. colubriformis adultos con daños debidos a los extractos de las plantas probadas. Determinación de preferencias de consumo de plantas nativas con TC por ovinos con experiencia de pastoreo-ramoneo. 30

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Objetivo cumplido al 100 % con todas las plantas probadas en el presente proyecto. Algunos trabajos fueron realizados con y sin presencia de un bloqueador de taninos el polietilen glicol (PEG). Se encontró que la preferencia no fue afectada por los taninos en los ovinos utilizados. Esto favorece la posibilidad de usar las plantas como nutracéuticos que permitan a los animales nutrirse y obtener los efectos antihelmínticos deseados Evaluación de diferentes niveles de inclusión de taninos sobre el control de NGI en ovinos infectados artificialmente. Objetivo cumplido al 100 %. Se determinó el nivel de consumo cercano a ad-libitum con L. latisiliquum (aproximadamente 700 g/día). Debido a que se encontraron efectos antihelmínticos claros no se probaron otros niveles. El uso de estas plantas no ocasionó lesiones en los animales. Evaluación del uso de TC como una estrategia de control de NGI en ovinos en pastoreo. Estudio planeado para las fases correspondientes a 2008 y finalizar en 2009. Determinación del nivel óptimo de suplementación alimenticia para el control de NGI en ovinos. Objetivo alcanzado al 100%. Se probaron cuatro niveles: 1.5% del peso vivo, 1% del peso vivo, 108g por día y cero suplemento. Los animales consumiendo 1.5% tuvieron el comportamiento más adecuado. Se han realizado el análisis de datos y finalizado la tesis de maestría correspondiente. Comparación de BMU y Maíz en el control de NGI en ovinos en pastoreo. Estudio planeado para las fases correspondientes a 2008 y finalizar en 2009. Persistencia de eficacia antihelmíntica de AOC en contra de H. contortus en ovinos. Estudio completado hasta un 20% de sus actividades. Se planeaba realizar de 2008 a 2009.

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5. GRUPO DE TRABAJO. Los participantes del proyecto realizaron sus funciones de la siguiente manera: Dr. Armando Aguilar Caballero (FMVZ-UADY): Asesoría/apoyo logístico de alumnos en experimentos de suplementación y uso de hongos nematofagos. Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos, trabajos publicados en revistas indizadas y en la escritura de tesis de maestría (Guillermina Hernández Orduño, Cecilia Flores Retama, UADY). Presentación de trabajos en congresos locales, nacionales e internacionales. Dr. Pedro Mendoza de Gives (CENID-PAVET): Recibir a un estudiante de Doctorado para estancias de entrenamiento de dos meses en la que se le capacitó y desarrolló uno de los experimentos in vitro. Encargado de la producción de clamidosporas de D. flagrans de la cepa Mexicana y de larvas de H. contortus para diversos estudios realizados en este proyecto. Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos, trabajos publicados en revistas indizadas y asesoría de estudiantes de Doctorado (Nadia F. Ojeda Robertos, UADY) y Maestría (José Antonio Fitz Aranda, UNAM). Dr. Carlos Sandoval Castro (FMVZ-UADY). Asesoría/apoyo logístico de alumnos en experimentos de suplementación, preferencia en el consumo de taninos de plantas, evaluación de actividad biológica de los taninos, y apoyo en el análisis acerca del uso de clamidosporas. Escritura de documento de difusión. Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos, trabajos publicados en revistas indizadas y en la escritura de tesis de maestría (Guillermina Hernández Orduño y Cecilia Flores Retama, UADY). Asesoría de un estudiante de Doctorado (Miguel A. Alonso Díaz, UADY). Dr. Armín Ayala Burgos (FMVZ-UADY). Asesoría de alumnos en experimentos de clamidosporas y elaboración de bloques de melaza. Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos y trabajos publicados en revistas indizadas. Asesoría de un estudiante de Doctorado (Nadia F. Ojeda Robertos, UADY). Hervé Hoste (UMR 1225, INRA-ENVT, Francia). Capacitación en técnicas in vitro de evaluación de extractos de plantas taniníferas. Se encargó de entrenar en las pruebas de “Larval Migration Inhibition” y “exsheatment” así como “Adult motilty Inhibition”. Para este entrenamiento se realizaron dos estancias des tres meses en Francia de dos estudiantes de doctorado Mexicanos (Miguel Angel Alonso Díaz y Cintli Martinez Ortiz de Montellano, UADY). Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos, trabajos publicados en revistas indizadas. Asesoría de estudiantes de Doctorado (Miguel A. Alonso Díaz, Cintli Martínez Ortiz de Montellano, UADY). Producción de cepas francesas de H. contortus y T. colubriformis para estudios in vitro y un estudio in vivo. Aporte de cápsulas de agujas de óxido de cobre. Dr. Juan Felipe de J. Torres Acosta (FMVZ-UADY). Solicitud y comprobación de gastos. Asesoría/apoyo logístico de alumnos en los diversos experimentos. Co-autoría de diversos trabajos expuestos en congresos, trabajos publicados en revistas indizadas y en la escritura de tesis de maestría de UADY (Guillermina Hernández Orduño, Cecilia Flores Retama, UADY), UNAM (José Antonio Fitz Aranda) así como del Doctorado ((Miguel A. Alonso Díaz, Nadia F. Ojeda Robertos, Cintli Martínez Ortiz de Montellano, UADY). Presentación de trabajos en diversos congresos ya mencionados anteriormente. 32

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MC Ramón Cámara Sarmiento (FMVZ-UADY). Apoyo en todos los experimentos y apoyo a los estudiantes en particular en suplementación y agujas de cobre. Logistica en el desarrollo de cursos y otras actividades de difusión del evento.

Estudiantes. Han participado como colaboradores en diversos protocolos del proyecto los siguientes estudiantes: MC, MVZ Nadia Florencia Ojeda Robertos. Doctorado en Ciencias Agropecuarias, FMVZ-UADY (finalizará en diciembre de 2008). MC MVZ Miguel Ángel Alonso Díaz. Doctorado en Ciencias Agropecuarias, FMVZUADY (finalizará en septiembre de 2008). MC MVZ Cintli Martinez Ortíz de Montellano. Doctorado Ciencias Agropecuarias, FMVZ-UADY (finalizará en diciembre de 2010). Srita. Severine Brunet (Escuela Nacional Veterinaria de Toulouse, Francia) Srita. Anne Brincat (Escuela Nacional Veterinaria de Toulouse, Francia) MVZ Guillermina Hernández Orduño (Maestría Prod. Animal Tropical, UADY). MVZ Andrés Calderón Quintal (Maestría Prod. Animal Tropical, UADY). MVZ Cecilia Flores Retama (Maestría Prod. Animal Tropical, UADY). MVZ Francisco Alejandro Méndez Ortiz (Licenciatura MVZ, UADY). MVZ José Antonio Fitz Aranda (Maestría, FMVZ-UNAM).

Otros participantes. QFB Concepción Capetillo Leal (FMVZ_UADY). Apoyo en la determinación de taninos de las plantas forrajeras estudiadas y en pruebas de actividad biológica de taninos. QFB Raúl Reyes Ramírez (FMVZ_UADY). Apoyo en la determinación de taninos de las plantas forrajeras estudiadas y en pruebas de actividad biológica de taninos. MVZ Hilda Lorena Canul Ku. Apoyo en el desarrollo de trabajo de campo en muestreos de ovinos, construcción de jaulas, logística de elaboración de dietas de animales. QFB Rosa Valero Coss (CENID-PAVET-INIFAP). Producción de clamidosporas y limpieza de la cepa. Apoyo en procesos experimentales in vitro. MC Enrique Liebano Hernandez (CENID-PAVET-INIFAP). Producción de larvas infectantes de Haemonchus contortus para experimentos controlados. QFB Ligia Cob Galera (FMVZ-UADY). Apoyo en trabajos de conteo de huevos y clamidosporas de Duddingtonia flagrans en heces de ovinos. MC Alfredo Cuellar Ordaz (FMVZ-FESC-UNAM). Producción de larvas infectantes de Haemonchus contortus para experimentos controlados.

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6. DESVIACIONES Y/O MODIFICACIONES EN LA ETAPA. Fase 1. Meta 1. Establecer el consumo voluntario de BMU que permita el consumo de dosis de 500,000 clamidosporas de D. flagrans por Kg de PV. La dosificación de 500,000 clamidosporas por kg de PV originalmente planteada se ajustó a la cantidad necesaria para alcanzar los niveles propuestos (10 clamidosporas por huevo). Se propone alcanzar este nuevo paradigma consumiendo 5 o 6 pequeños bloques de melaza con clamidosporas prensados con cal. Fase 2. Meta 3. Establecer el nivel de suplementación óptima para el control de NGI en ovinos en pastoreo. Se presentó un problema de ectima contagioso en los corderos experimentales que debieron ser tratados y manejados para controlar el problema. No existió otra desviación.

Meta 4. Establecer la duración de la persistencia de la eficacia de las AOC sobre H. contortus. Se quedó en la fase inicial el estudio que estaba preparado para iniciar en verano del 2008 de acuerdo a lo planteado en el segundo informe. Meta 5. Establecer la eficacia de D. flagrans sobre las L3 de H. contortus in vitro y en pradera. Se utilizó la nueva técnica para contabilizar las clamidosporas en las heces de ovinos tratados oralmente con clamidosporas y se asoció por primera vez la eficacia de reducción de larvas con la cantidad de clamidosporas en heces. Debido a lo anterior se procedió a determinar cuantas clamidosporas se requieren por huevo de nematodo en cada gramo de heces para alcanzar buena eficacia. Debido a las fluctuaciones climáticas no previsibles que se presentan tanto en época de seca como de lluvia, se decidió realizar en condiciones de invernadero el estudio del efecto de incluir heces de ovino con y sin hongos sobre la infectividad de pradera de Cynodon nlemfluensis (pasto estrella de áfrica). De esta manera se controló humedad, temperatura y cantidad de “lluvia” recibida por unidad experimental (pradera). Esto se realizó para minimizar los efectos indeseables de los cambios y fluctuaciones de temperatura y lluvia que se presentan.

Meta 6. Establecer cual planta es más eficaz para el control de Trichostrongylus colubriformis y H. contortus. 34

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Los dos estudios in vivo para determinar el efecto de las plantas taniníferas sobre H. contortus (sobre parásitos larvas y adultos) fueron realizados con niveles de consumo ad libitum y no con niveles crecientes de planta. Esto debido a que la cantidad que eran capaces de consumir los animales superó las expectativas. Así se buscaba emplear la mayor cantidad de planta para poder estudiar el efecto antihelmíntico existente. Esto se comparó contra animales que no recibían la planta (cero inclusión). Fases 3 y 4. No se alcanzaron las metas propuestas por ser posteriores a la terminación del proyecto a inicios de 2008.

7. ACCIONES DERIVADAS DE LAS DESVIACIONES Y/ MODIFICACIONES Fase 1. Meta 1. Establecer el consumo voluntario de BMU que permita el consumo de dosis de 500,000 clamidosporas de D. flagrans por Kg de PV. Los hallazgos de los trabajos de consumo de BMU y de la posibilidad de cuantificar las clamidosporas que llegan a las heces de los ovinos llevaron a reorientar el estudio de los bloques para dosificar las clamidosporas. Debido a que se requiere alcanzar un consumo de bloque que permita ingerir de 10 a 15 millones de clamidosporas por cada 100 g de BMU, se replanteó el estudio de vida de anaquel a bloques de menor tamaño (100 g aproximadamente cada uno). En cada bloque se incluirán 10 millones de clamidosporas. Así, a cada animal se le podrán ofrecer cuantos bloques como sea necesario dependiendo de la cantidad de heces producidas y de la cantidad de huevos de nematodos presentes. Además, el número de bloques consumidos indicará la dosis consumida de clamidosporas. Fase 2. Meta 3. Establecer el nivel de suplementación óptima para el control de NGI en ovinos en pastoreo. Los ovinos experimentales con problema de ectima contagioso fueron tratados y manejados para controlar el problema. No existió otra desviación Meta 4. Establecer la duración de la persistencia de la eficacia de las AOC sobre H. contortus. Se procedió a alistar todo lo necesario para comenzar con el estudio en verano del 2008. Meta 5. Establecer la eficacia de D. flagrans sobre las L3 de H. contortus in vitro y en pradera. 35

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Debido al hallazgo del conteo de clamidosporas se decidió incluir dos estudios in vitro para confirmar la proporción de huevos y clamidosporas así como de larvas y clamidosporas para comparar la eficacia de control. Estos estudios fueron realizados en Cuernavaca. El efecto de heces con y sin hongos nematofagos se realizó en praderas pequeñas de pasto estrella de áfrica en un invernadero. De esta manera se pudo observar los efectos del tratamiento con hongos evitar efectos ambientales sobre la infectividad de cada pradera (inclinación del suelo, tipo de suelo, cobertura de pasto, presencia de lluvia, etc.). Esto permitió un estudio más controlado aunque en praderas de pasto Cynodon nlemfluensis. En las condiciones utilizadas en esta modificación se utilizaron “praderas” con exactamente la misma edad de pasto, cantidad de tierra, cantidad de agua de riego, temperatura y humedad ambientales controladas. Estas praderas recibieron una cantidad conocidas de heces con la misma cantidad de huevos de H. contortus y lo que varió fue la presencia y ausencia de clamidosporas. Esto facilitó el análisis en esta primera aproximación al uso de hongos nematófagos en un pasto tropical. Meta 6. Establecer cual planta es más eficaz para el control de Trichostrongylus colubriformis y H. contortus. Los dos estudios in vivo para determinar el efecto de las plantas taniníferas sobre H. contortus (sobre parásitos larvas y adultos) fueron realizados con niveles de consumo ad libitum y no con niveles crecientes de planta. Esto para poder estudiar tanto el nivel de consumo posible como el efecto anntihelmíntico simultáneamente. Esto se comparó contra animales que no recibían la planta (cero inclusión).

8. ACCIONES REALIZADAS CON LOS SECTORES USUARIOS 7.1. Participación de productores colaborantes: Los trabajos de consumo de bloques en ovinos en pastoreo fueron realizados en el “Rancho Noc Ac”, en Baca, Yucatán, propiedad del Sr. Roche y supervisado por el MVZ Edgar España España. Para este trabajo aportó el alimento, el personal para el manejo, la pradera, los cercos eléctricos y los corrales para hacer la suplementación controlada individual. El trabajo de persistencia de eficacia de las agujas de cobre se estaba realizado en el mismo “Rancho Noc Ac”, en Baca, Yucatán. Para este trabajo se había iniciado la producción de los corderos libres de nematodos. Durante el experimento se planteó que aportaría el alimento y la mano de obra durante todo el estudio que se realizaría en sus corrales de engorda elevada. Los ovinos de los trabajos in vivo con plantas taniníferas fueron criados bajo condiciones de libertad de NGI en la granja “Paraíso” propiedad del Dr. Ronald Santos Ricalde. Otras acciones con los sectores usuarios consistieron en impartir cursos y pláticas acerca de los temas de este proyecto. Estas acciones se mencionan al final del presente reporte. 36

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9. OBSERVACIONES RELEVANTES SOBRE EL PRESUPESTO AUTORIZADO La Universidad Autónoma de Yucatán aportó los recursos necesarios para iniciar el proyecto una vez que fue aceptado. Una vez que se recibieron los recursos del proyecto por parte de CONACYT fueron devueltos a la institución. Los fondos otorgados fueron suficientes durante las dos fases cumplidas. Nos permitió realizar todos los experimentos sin problema financiero. Se solicitó y aprobó una transferencia de recursos hacia el rubro de viáticos. Esta acción originalmente estaba planeada para las fechas correspondientes al segundo período en el proyecto pero se movió al tercer periodo al momento de firmar el convenio con SAGARPA. Estos recursos estaban considerados para poder realizar los gastos correspondientes para complementar el costo del viaje a Gante, Bélgica, para el congreso de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria. Esta acción contó con fondos concurrentes del proyecto ECOS-ANUIES-CONACYT M03-A03 y de la UADY. El recurso fue utilizado para 3 investigadores del proyecto (Pedro Mendoza-deGives, Armando Aguilar-Caballero y Felipe Torres-Acosta) y dos estudiantes de doctorado (Miguel A. Alonso Díaz y Nadia F. Ojeda Robertos)

10. ESTADO DE APORTACIONES COMPLEMENTARIAS Las aportaciones complementarias al proyecto no habían sido solicitadas. Sin embargo, como se mencionó antes, en las fases realizadas los productores colaborantes apoyaron con diversas actividades de personal y recursos que permitieron producir los corderos criados libres de NGI para dos de los estudios in vivo. Para esto utilizaron sus instalaciones, alimento y personal. 11. PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA ETAPA Manuales y folletos técnicos. Se comprometió en el convenio la elaboración de tres manuales que serían publicados en 2009. Los productos comprometidos fueron: 1. Manual de Bloques multinutricionales. Tecnología para productores y herramienta para la suplementación estratégica de rumiantes. Incluye información de proceso de ventajas, desventajas, proceso de elaboración, posibles equipos e ingredientes, datos de consumo por ovinos de pelo en condiciones de pastoreo y de ramoneo así como de bovinos en el trópico. Producto terminado que se programó para su impresión en 2009. (Se incluye en anexo). 2. Extracción y determinación de compuestos fenólicos en plantas (Manual ilustrado). Se incluyen una batería de procedimientos e ilustraciones para determinar los compuestos polifenólicos, con particular énfasis en los taninos. Producto terminado que se programó para su impresión en 2009 (Se incluye en anexo). 3. Utilizando la suplementación alimenticia para controlar los parásitos de ovinos y caprinos (folleto técnico). Se incluyen evidencias que muestran que los ovinos y caprinos suplementados pueden luchar mejor contra parásitos gastrointestinales que los 37

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no suplementados. Incluye estrategias de uso de suplementos y posibles limitaciones. Producto terminado que se programó para su impresión en 2009 (Se incluye en anexo). Artículos de investigación comprometidos en el convenio para estas fases. 1. Alonso-Díaz, M.A., Torres-Acosta, J.F.J., Sandoval-Castro, C.A., Capetillo-Leal, C.M., Brunet, S., Hoste, H. 2008. Effects of four tropical tanniniferous plant extracts on the inhibition of larval migration and the exsheathment process of Trichostrongylus colubriformis infective stage. Veterinary Parasitology. 153, 187-192.

Otros artículos de investigación publicados con material de estas fases (no comprometidos en el convenio). 1. Ojeda-Robertos, N.F. Torres-Acosta, J.F.J. Ayala-Burgos, A. Aguilar-Caballero, A.J. CobGalera, L.A. Mendoza–de-Gives, P. 2008. A technique for the quantification of Duddingtonia flagrans chlamydospores in sheep faeces. Veterinary Parasitology. 152, 339-343. 2. Alonso-Díaz, M.A., Torres-Acosta, J.F.J., Sandoval-Castro, C.A., Hoste, H., Aguilar-Caballero, A.J. 2008. In vitro larval migration and kinetics of exsheathment of Haemonchus contortus larvae exposed to four tropical tanniniferous plant extracts. Veterinary Parasitology. 153, 313319. 3. Hernández-Orduño, G., Torres-Acosta, J.F.J., Sandoval-Castro, C., Aguilar-Caballero, A.J. Reyes-Ramirez, R.R., Hoste, H., Calderón-Quintal, J.A. 2008. In vitro anthelmintic effect of Acacia gaumeri, Havardia albicans and Quebracho tannin extracts on a Mexican strain of Haemonchus contortus L3 larvae. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 8, 191-197. 4. Brunet, S., Martínez-Ortiz-de-Montellano, C., Torres-Acosta, J.F.J., Sandoval-Castro, C.A., Aguilar-Caballero, A.J., Capetillo-Leal, C.M., Hoste, H. 200x. Effect of the consumption of Lysiloma latisiliquum on the larval establishment of parasitic gastrointestinal nematodes. Veterinary Parasitology. 157, 81-88. 5. Alonso-Díaz, M.A., Torres-Acosta, J.F.J., Sandoval-Castro, C.A., Hoste, H., Aguilar-Caballero, A.J., Capetillo-Leal, C.M. 200x. Sheep preference for different tanniniferous tree fodders and its relationship with in vitro gas production and digestibility. Animal Feed Science and Technology (En prensa). 6. Ojeda-Robertos, N.F. Torres-Acosta, J.F.J. Ayala-Burgos, A. Aguilar-Caballero, A.J. CobGalera, L.A. Mendoza–de-Gives, P. 200x. Assesing the effect of the number of Duddingtonia flagrans chlamydospores in the efficacy or reduction against parasitic nematodes. Veterinary Parasitology. (En prensa).

Ponencias en congresos locales e internacionales comprometidas en el convenio para las fases. 1. Alonso-Díaz MA., Torres-Acosta JFJ., Sandoval-Castro C., Hoste H., Aguilar-Caballero A. 2007. Preferencia de consumo por ovinos de plantas nativas de Yucatán México. IV Reunión Estatal de Investigación Agropecuaria, Forestal y Pesca. Fundación Produce Yucatán, Yucatán, 2007. 22-23 de enero de 2007, Mérida, Yucatán. pp. 1-4. 2. Alonso-Díaz MA., Torres-Acosta J.F.J., Sandoval-Castro C., Aguilar-Caballero AJ., Hoste H. 2007. In vitro anthelmintic activity of plants extracts from tropical tanniniferous trees against Trichostrongylus colubriformis. From Alaska to Chiapas: The First North American Parasitology Congress. American Society of Parasitology, Sociedad Mexicana de Parasitologia & Parasitology section of the Canadian society of Zoologist. June 21-25, Mérida, Yucatán, México. pp. 76.

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3. Ojeda Robertos N., Mendoza de Gives P., Torres-Acosta J.F.J., Ayala-Burgos A., AguilarCaballero AJ. 2007. Efficacy of three doses of Duddingtonia flagrans Chlamidospores against Haemonchus contortus larvae in sheep faecal cultures. From Alaska to Chiapas: The First North American Parasitology Congress. American Society of Parasitology, Sociedad Mexicana de Parasitologia & Parasitology section of the Canadian society of Zoologist. June 21-25, Mérida, Yucatán, México. pp. 85. 4. Ojeda-Robertos, N., Mendoza-de-Gives P., Torres-Acosta J.F.J., Ayala-Burgos A., AguilarCaballero A.J. 2007. Using a conventional nematode egg counting technique for the estimation of Duddingtonia flagrans chlamydospores in sheep faeces. The XII conference of WAAVP. Gent, Belgium. August 19-23, 2007 5. Alonso-Díaz MA., Torres-Acosta JFJ., Sandoval-Castro C., Aguilar-Caballero AJ., Hoste H. 2007. In vitro anthelmintic activity of plant extracts from tropical tanniniferous trees against Haemonchus contortus. XII conference of WAAVP. Gent Belgium. August 19-23, 2007 6. Brunet S., Torres-Acosta J.F., Sandoval-Castro C.A., Aguilar-Caballero A., Canul-Ku L., Capetillo-Leal C., Hoste H. 2007. Effect of the consumption of a tannin-rich plant from Yucatan (Tzalam, Lisyloma latisiliquum) on the larval establishment of parasitic nematodes. XII conference of WAAVP. Gent Belgium. August 19-23, 2007. Tesis de licenciatura vinculada con el proyecto (comprometida para fines de 2008). 1. Alejandro Méndez-Ortíz. Consumo de bloques energéticos y proteicos en corderas de pelo bajo condiciones de pastoreo. Tesis MVZ. FMVZ-UADY. Junio de 2007.

Tesis de maestria vinculadas con el proyecto (comprometidas hasta fines de 2009). 1. Guillermina Hernandez Orduño, Consumo de tres plantas taniníferas de Yucatán por ovinos y caprinos y su potencial efecto antihelmíntico in vitro contra Haemonchus contortus. Septiembre 2007. 2. Cecilia G. Flores Retama. Selección y consumo de forraje en ovinos parasitados naturalmente y suplementados con maíz en una pradera de Cynodon nlemfuensis y Leucaena leucocephala. (Octubre de 2008).

Tesis de Doctorado (comprometidas hasta fines de 2009). 1. Miguel Ángel. Alonso Díaz. Taninos como método de control alternativo de nematodos gastrointestinales en pequeños rumiantes. (Preferencia de consumo y efectos antihelmínticos de plantas nativas de Yucatán, México) (Septiembre de 2008). 2. Nadia Florencia Ojeda Robertos. Uso de la cantidad de clamidosporas en heces como una forma de dosificar Duddingtonia flagrans para el control biológico de NGI en heces de ovinos (Finaliza en diciembre de 2008).

12. COMPROMISOS PARA LA ETAPA SIGUIENTE. No aplica.

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13. DIFUSIÓN DE LA INFORMACIÓN GENERADA ENTRE PRODUCTORES, TÉCNICOS Y MÉDICOS VETERINARIOS EN EL SECTOR DE LA OVINOCULTURA TROPICAL

En el transcurso del proyecto se presentó la oportunidad de presentar avances del trabajo en los estados de Campeche (Escuela Superior de Ciencias Agropecuarias, UAC, 2006), Tabasco (V y VI Seminarios de Producción de ovinos en el trópico, UJAT 2006 y 2008) y en Yucatán (IV Reunión Estatal de Investigación Agropecuaria, Forestal y Pesca.). Para acudir a estas invitaciones no se utilizó recursos del proyecto.

Fotos donde se muestra a los Técnicos, Médicos Veterinarios y estudiantes de MVZ e IAZ que recibieron capacitación acerca de métodos de control alternativo de NGI. A la izquierda en 2006 con la presencia de el Dr. Pedro Mendoza de Gives (INIFAP) y el Dr. Hervé Hoste (INRA), colaboradores del proyecto. A la derecha con técnicos del estado de Hidalgo y de Yucatán (2007). Otros dos cursos fueron impartidos: uno en la FMVZ-UADY, Mérida y otro más en el CENID-PAVET a personal veterinario de la Industria farmacéutica. Cada uno de estos cursos fue autofinanciado.