Procedimiento para la inducción del esputo
− Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C durante cortos periodos (días, semanas) también es factible. − Reconstituir el sedimento celular con 50 μl de PBS. Aspirar y expulsar varias veces para distribuir bien el sedimento celular. − Preparar las extensiones depositando una o dos gotas de esta suspensión celular sobre un portaobjetos y extender suavemente formando un círculo. − Dejar la extensión secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa). Brevemente, la tinción de May-Grünwald-Giemsa se obtiene de la siguiente forma en nuestro laboratorio: el portaobjetos con la extensión o el cytospin se dejan secar bien al aire, se prepara un buffer (Na2HPO4 0,1192 g + KH2PO4 0,0907 g + 10 ml agua), se fija la muestra en metanol durante 3 min, se tiñe en cubeta con el May-Grünwald 5 ml + buffer 5 ml durante 3 min, se lava con agua bidestilada, se tiñe con Giemsa 0,75 ml + buffer 4,25 ml durante 7 min y, finalmente, se lava en agua bidestilada y se deja secar. − Otras tinciones son posibles dependiendo de nuestro interés. Las más usadas son el aceite O rojo para el estudio de las inclusiones lipídicas en los macrófagos, y el azul de Prusia para los hemosiderofágos. Igualmente, las tinciones de inmunocitoquímica son posibles. Para una completa referencia de estos procedimientos es preciso dirigirse a textos especializados.
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