MANUAL SEPAR DE PROCEDIMIENTOS
− Llenar la cámara de recuento de Neubauer con 10 μl de esta nueva solución teñida. − Contar todas las células (incluidas las escamosas) presentes en cada cuadro de esquina de 1 × 1 mm y en las cuatro esquinas de la cámara (cada uno de ellos tiene 16 cuadraditos de 0,25 × 0,25 mm). − Clasificar las células como viables (V) o no viables (NV) cuando se realiza el recuento y las células escamosas (CE) independientemente de su viabilidad. La tinción del azul de tripano, también llamada método de exclusión del azul de tripano, colorea aquellas células cuya membrana celular no está intacta, excluyendo (de ahí el nombre) aquellas que están intactas, sanas o viables. Por lo tanto, distingue como células viables aquellas que no tiñen de azul, y como no viables aquellas que sí tiñen de azul. − Anotar el recuento total (E) en la hoja de datos. El recuento celular total (RCT) será el total (E) menos las células escamosas contaminantes (CE) (E – CE = RCT). El porcentaje de células contaminantes será CE/E × 100 = %CE. − Calcular el porcentaje de células viables o viabilidad dividiendo el número de células encontradas viables (V) por el recuento celular total (RCT) de células no escamosas encontradas (viables más no viables) (V/RCT × 100 = %V). • Protocolo de preparación de cytospins y recolección del sobrenadante. − Calcular la concentración de cel/ml de la suspensión celular filtrada y ajustar con PBS para obtener una concentración teórica de alrededor de 1 × 106 cel/ml. Concentración considerada ideal para el recuento celular con cytospins. − Preparar las cytospins en la citocentrífuga añadiendo 60 μl de suspensión celular y centrifugando a aproximadamente 300 g (450 rpm en una Shandon III) durante 6 min. − Dejar la cytospin secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa). − Centrifugar el resto de la solución celular en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 750 g durante 4 min). − Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular. − Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C por cortos periodos (días, semanas) también es factible. • Protocolo de preparación de extensiones y recolección del sobrenadante. Este procedimiento es alternativo al recomendado con cytospins y está indicado en el caso de carecer de una citocentrífuga. Ha sido probado en nuestro laboratorio con buenos resultados. − Centrifugar la solución celular filtrada en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 750 g durante 4 min). − Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular.
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