MANEJO ACUÍCOLA competitiva se empleó para obtener datos cuantitativos utilizando una concentración estándar de los aislados de Pseudovibrio. La preparación de las suspensiones patógenas de Vibrio fue idéntica al método de inoculación puntual descrito anteriormente. Doscientos (200) μl de cada suspensión bacteriana se extendieron en placas MA y se perforaron pocillos de 6 mm de diámetro en las placas de agar preparadas con una varilla de vidrio hueca estéril. Se inocularon colonias individuales de aislados de Pseudovibrio en 10 ml de medio LB preparado en NSW y se incubaron a 28 °C con agitación a 200 rpm durante 24 h. Los cultivos de Pseudovibrio se centrifugaron (3000 g, 10 min, 4 °C), se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos celulares se resuspendieron en NSW. Se realizaron diluciones para obtener 1.1 × 106 CFU mL-1 inóculo. Cincuenta (50) μL de las suspensiones de Pseudovibrio se agregaron a los pocillos. Cada ensayo se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 48 h y 72 h a 28 °C. Después de la incubación, se evaluó la actividad antibacteriana midiendo las zonas de inhibición alrededor del pozo que contiene el Pseudovibrio. Amplificación de la secuenciación del gen 16S rRNA Los tres aislamientos más bioactivos (Ps11, ps17 y Ps18) se identificaron mediante análisis molecular. El ADN bacteriano se extrajo siguiendo el procedimiento descrito por Anand et al. (2006) con ligeras modificaciones. En resumen, las colonias individuales frescas de cada aislado de Pseudovibrio se suspendieron en 500 μl de solución tampón (NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0) y 80 μL de SDS al 10%. Las soluciones tamponadas se dejaron durante una hora en un baño de agua a 55 °C con la adición de 600 μl de fenol y se centrifugaron a 16000 g durante 10 min. Los sobrenadantes se recuperaron y se añadieron 100 μl de cloroformo-isoamilo (24:1). Las mezclas se agitaron y se centrifugaron a 16000 g durante 10 minutos a 4 ° C. Se añadieron doscientos cincuenta (250) μL de etanol al 100% y 500 μL de acetato de amonio (5 M) a las mezclas. Las soluciones se almacenaron a -20 °C durante la noche. Las soluciones se centrifugaron a 16000 g durante 15 minutos a 4 °C y se eliminaron
- AGOSTO 2019 los sobrenadantes. Los gránulos se lavaron dos veces con 300 μl de etanol al 70% y se dejaron secar durante 2 horas a 45 °C. El ADN resultante finalmente se resuspendió en 50 μl de agua Milli-Q. La amplificación del gen 16S rRNA se realizó por PCR utilizando los cebadores universales bacterianos 27F (5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ‘) y 1492R (5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’), específicos para las bacterias del dominio (Lane, 1991). Los productos de PCR de las cepas de ARNr 16s Ps11, Ps17 y Ps18 se enviaron a Macrogen (Seúl, Corea) para su secuenciación. Las secuencias obtenidas se compararon con una base de datos pública utilizando NCBI BLASTn, enfocándose en las identidades superior al 95%. Evaluación de seguridad de P. denitrificans en la supervivencia de postlarvas de P. vannamei Para descartar efectos negativos de P. denitrificans en la salud de las larvas de camarones, los camarones en etapa temprana zoea-1 fueron expuestos a los aislados de Pseudovibrio Ps11, Ps17 y Ps18. El bioensayo se realizó en placas de cultivo celular de 6 pocillos. Se colocaron diez larvas de camarones de la etapa P. vannamei zoea-1 en cada pocillo. Los aislados de Pseudovibrio se cultivaron como se describió anteriormente. Los cultivos de Pseudovibrio se centrifugaron (3000 g, 10 min, 4 oC) y los sedimentos bacterianos resultantes se resuspendieron en agua de mar estéril y se ajustaron las concentraciones por densitometría óptica (OD600 ~ 0.55) equivalentes a 1.5 × 108 CFU mL-1. Mil (1000) μL de cada suspensión de Pseudovibrio se aplicaron directamente a los pozos que contienen larvas de camarones zoea-1 (dosis final de 1.5 × 107 CFU mL-1). También se incluyó en el ensayo un grupo de control que contenía larvas de camarones en etapa zoea-1 no expuestas a Pseudovibrio. Cada tratamiento con 6 réplicas. La supervivencia se evaluó después de 48 h de exposición directa. La supervivencia de las larvas etapa zoea-1 de camarones del tratamiento de control se estableció en el 100% y los otros tratamientos se normalizaron en consecuencia. Ensayo in vivo: efecto de P. denitrificans
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en postlarvas de P. vannamei expuestas a Vibrio patógenos. Efecto de P. denitrificans en la supervivencia de P. vannamei postlarvas y juveniles mediante prueba de desafío con V. campbellii y V. parahaemolyticus Primero, se evaluó el efecto protector de P. denitrificans Ps11, Ps17 y Ps18 en postlarvas sanas de P. vannamei (PL2), desafiadas con V. campbellii (LM2013). En la prueba de desafío, se distribuyeron 800 PL en 16 matraces de vidrio que contenían 2000 ml de agua de mar esterilizada por filtración y UV (Cincuenta PL2 por réplica). Se proporcionó aireación continua y se ajustó la temperatura a 30.5 ± 0.4 oC. Los PL2 fueron alimentados con una dieta comercial cada cuatro horas durante todo el bioensayo. Se aplicaron tres tratamientos (Ps11, Ps17 y Ps18) y un control (sin la aplicación de P. denitrificans). Los aislados de Pseudovibrio se prepararon como se describió anteriormente y se aplicaron en el agua cada doce horas a una concentración final de 105 UFC mL-1. Cada tratamiento tenía cuatro réplicas. Después de cinco días, los PL se expusieron a V. campbellii (106 UFC mL-1 de agua de mar). El intercambio de agua del (50%) se realizó veinticuatro horas después de la exposición (hpe) y la supervivencia de las larvas de camarones se cuantificó 48 hpe. Para preparar el inóculo bacteriano, se sembró V. campbellii en agar de tripticasa de soja (2% de NaCl TSA), se transfirieron ocho colonias a 1000 ml de NaCl TSB al 2% y se incubaron durante siete horas a 30 °C, con movimiento constante. Posteriormente, el cultivo se centrifugó (4000 g, 10 min, 25 °C), se descartaron los sobrenadantes, y los sedimentos celulares se resuspendieron en solución salina estéril (NaCl al 2%). La suspensión de Vibrio se ajustó por densitometría óptica a una densidad de 108 UFC mL-1, y se inoculó inmediatamente. El efecto protector de tres aislamientos también se verificó mediante una prueba de desafío con juveniles sanos de P. vannamei de peso 1.93 ± 0.66 g, con V. parahaemolyticus (BA94C2). En la prueba de desafío, se distribuyeron 160 juveniles de camarones en 16 matraces de vidrio que contenían 2000 ml de agua de mar filtrada y esterilizada con