PRODUCCIÓN
- DICIEMBRE 2019 (Iryani et al., 2017). La caída o baja de Hsp70 no afecta ni el desarrollo embrionario ni la viabilidad de nauplios A. franciscana, pero la supervivencia de nauplios que carecen de Hsp70 es reducido a un 41% por estrés de calor y 34% por infección por Vibrio campbellii, en comparación con los animales que contienen Hsp70 (Iryani et al., 2017). En este estudio, los ARNds de Hsp70 y Hsc70 que se administraron mediante microinyección a las postlarvas de L. vannamei se mostraron mediante electroforesis SDS con gel de poliacrilamida e inmunoprobing de Western blots para suprimir a Hsp70 y Hsc70, respectivamente. Se examinaron luego, los efectos de la reducción de Hsp70/Hsc70 en postlarvas de L. vannamei en su tolerancia a pH bajo y salinidad.
Materiales y métodos
Mantenimiento de L. vannamei Postlarvas, etapa donde el camarón blanco L. vannamei está completamente desarrollado y mide aproximadamente 1 cm de longitud, se aclimataron en el laboratorio de la Universidad Malaysia Terengganu durante 1 semana antes de su uso en experimentos. Dos individuos por litro de agua de mar fueron mantenidos en tanques de 500 l de fibra de vidrio a 28 °C ± 1 °C, pH 7.8–8.0 y salinidad de 32‰. Las postlarvas se sembraron a una densidad de 2000 individuos/l y se alimentaron a saciedad con nauplios de Artemia viva dos veces al día. Preparación de ARNds Hsc70 y Hsp70 El ARN se extrajo de tejidos caudales de L. vannamei con el reactivo (Bioline) TRIsure ™ y los ADNc se sintetizaron usando un Kit de síntesis de ADNc Tetro (Bioline). El ADNc de Hsp70 se amplificó usando el primer delantero(5′-TAATACGACTCACTATA GGCTCCTGCGTGGGTGTGTT-3′) y el primer reversa(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCG GCGTCACCAATCAGA-3‘), mientras que el ADNc de Hsc70 se amplificó utilizando el primer (5′-TAATACGACTCACTATAG GCATCGTAGATCATTCCGC-3′) y el primer reversa (5′-TAATACGACTCACTATA GGGGTCTGGAATGGTTTACTGA-3′), cada uno con el promotor T7, TAATACGACTCACTATAGG, en el extremo 5’ (Bioline). Los primers se construyeron sobre la base de secuencias de nucleótidos de Hsp70 y Hsc70 de L.
vannamei disponibles en la base de datos del NCBI Genebank con el número de acceso AY645906.1 y EF495128.1 (Fig. 1). Las secuencias que se usaron para hacer el los ARNds de Hsp70 y Hsc70 se especifican en las Fig. 1A y B. Se realizó PCR con MyTaq Mix (Bioline) según las instrucciones del fabricante como se detalla a continuación: 2 min a 95 °C seguido de 35 ciclos a 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C durante 2 min, seguido de 10 min a 72 °C. El producto de la PCR se resolvió en gel de agarosa al 1% (p/v) en 1 × TBE (20 mM TRIS, 10 mM ácido acético, 0.5 mM EDTA, pH 8.5) a 90 V durante 45 min y teñido con bromuro de etidio (Sigma Aldrich) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante previo a la visualización con un Gel Doc™ XR + con Software Image Lab™ (BioRad). Se observó en los geles de agarosa, bandas fuertes de tamaños esperados para los ADNc, los mismos que eran 120 pares de bases para Hsp70 y 98 pares de bases para Hsc70. Los productos de la PCR se usaron como plantillas para generar ARNds usando el kit ARNi MEGAscript® (Ambion Applied Biosystems). La reacción mezcla se incubó a 37 °C durante 4 h seguido de 5 min a 75 °C y enfriándose a temperatura ambiente. El ARNds se trató con nucleasa para eliminar el ADN residual y el ARN monocatenario, seguido de purificación (Ambion Applied Biosystems). El ARNds se visualizó en el sistema de documentación de gel después de electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, revelando bandas fuertes del tamaño esperado. El ARNds específico para Hsc70 se generó utilizando el primer (5′- TAATACGACTCACTATA GGCATCGTAGATCATTCCGC-3′) y primer de reversa (5′- TAATACGACTCACTATAG GGGTCTGGAATGGTTTACTGA-3’) mientras el ARNds específico para Hsp70 se generó utilizando el primer delantero (5′TAATACGACTCACTATAGGCTCCTGCGTGGGTG TGTT-3′) y primer de reversa(5′-TAATACG ACTCACTATAGGGCGGCGTCACCAATC AGA3’), con condiciones de PCR como se describe anteriormente (Qian et al., 2012). Inyección de ARNds Hsc70 y Hsp70 a L. vannamei Las postlarvas fueron inmovilizadas en agar frío al 3% (p/v) (King y MacRae, 2012) y
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colocadas en un microscopio estereoscópico Olympus SZ61. Para la inyección de ARNds específicos para Hsp70 y Hsc70, se mezclaron por separado en una relación 1:1 (v/v) con 0.5% (p/v) de solución salina tamponada rojo fenol en fosfato de Dulbecco (DPBS) (SigmaAldrich) (King y MacRae, 2012). Luego 1 μl de solución que contiene aproximadamente 80 ng de Hsc70 o ARNds Hsp70 fue inyectada en el 4º segmento abdominal de L. vannamei con un micromanipulador (sistema de microinyector Eppendorf TransferMan® NK 2, Alemania) conectado a un microscopio Olympus® IX 71 (Alemania). Las postlarvas que recibieron ambas ARNds Hsc70 y Hsp70 fueron inyectadas con 0.5 μl de solución que contenía aproximadamente 40 ng de Hsc70 y 40 ng de ARNds Hsp70. Las postlarvas inyectadas, fueron monitoreadas durante al menos 2 h y aquellas que exhibían un comportamiento normal de natación fueron seleccionadas para su uso en experimentos. Verificación de quiebre de Hsc70 y Hsp70 Se tomaron muestras de tejidos de camarón del área caudal 48 h después de la inyección de ARNds y se homogenizaron en tampón frío K (10 ml de agua estéril, 0.27 g sorbitol, 0.16 g de gluconato de potasio, 0.07 g de MgCl2, 7 mg de NaH2PO4, 95 mg de cóctel de HEPES compuesto por un inhibidor de proteasa (Calbiochem, EE. UU.), a una ratio de 1:10 con respecto al tampón K (Sung et al., 2008). Los tejidos fueron homogeneizados durante 5 minutos en hielo y los tubos se centrifugaron a 2000 × g durante 5 minutos. Los sobrenadantes que contenían proteínas se almacenaron a -80 °C. Electroforesis SDS en gel de poliacrilamida y prueba de western blots Alícuotas de homogeneizado se combinaron con volúmenes iguales de 2 veces el buffer muestra con dodecil sulfato de sodio (SDS) (Laemmli, 1970), agitado en vórtex, calentado a 95 °C durante 5 min, enfriado y centrifugado durante 30 s. Se cargó quince microlitros de muestra que contenía 50 μg de proteína por carril de geles de poliacrilamida SDS al 10% y electroforesis a 120 V por 15 min seguidos de 150 V durante 45 min. Se corrieron dos geles simultáneamente uno de los cuales se tiñó con Coomassie Biosafe (Laboratorios Bio-Rad) y el otro se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno