Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 10 de 160
PRÁCTICA 1 - MARCADORES ENZIMÁTICOS: CREATIN QUINASA – CK y MB 1. Objetivo • •
Examinar muestras biológicas de individuos aparentemente sanos y enfermos para detectar estados agudos asociados a condiciones cardíacas. Clasificar los diferenciar marcadores cardíacos en función de su utilidad diagnóstica para pacientes con sospecha de infarto agudo de miocardio.
2. Resultados de aprendizaje esperados • • •
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo con lo descrito en la literatura médica. Ejecutar los procesos preanalíticos, analíticos y pos-analítico para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las normas de bioseguridad y el control de calidad respectivos.
3. Fundamento teórico Las pruebas realizadas en la rutina del laboratorio clínico aportan con un valor diagnóstico significativo para decidir tratamientos o terapias. Ciertas proteínas, relacionadas con el daño del músculo cardiaco son consideradas de un gran valor diagnóstico y debido a la necesidad urgente de los resultados, se pueden considerar pruebas de emergencia médica, clasificándose a estas muestras como prioridad ASAP (del inglés, As Soon As Possible) o prioridad STAT (del inglés, Sample TurnAround Times), con forme los protocolos de Triaje propuestos por la Organización Panamericana de la Salud y el Código de Manchester, para nivel 1 y 2. (Organización Panamericana de la Salud, 2011) La alteración de los niveles plasmáticos de ciertas enzimas suele mostrar relación con la gravedad de la lesión tisular. Existen enzimas cardiacas cuya interpretación clínica representan una gran ayuda para diagnosticar y valorar un infarto agudo de miocardio (IAM) y su correcta correlación clínica en función del tiempo de liberación más otros procedimientos diagnósticos, permiten tomar decisiones clínicas de manera urgente. Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 11 de 160
3.1 Creatin Kinasa – CK Es una enzima que se encuentra en el músculo cardíaco, cerebro, músculo esquelético y otros tejidos. Su actividad principal es catalizar la síntesis de fosfato de creatina, el mismo que es importante para la contracción muscular; para que esta actividad sea eficaz, se requieren de moléculas de Mg++, como se muestra en el Gráfico 1. A nivel de laboratorio, se puede determinar su actividad enzimática en muestras biológicas para monitorear el daño muscular, provocado por destrucción de la masa muscular o por abuso de ciertos medicamentos que provocan daño muscular. Las pequeñas concentraciones que podemos encontrar en sangre periférica de CK total provienen principalmente del músculo esquelético; cualquier condición que causa daño muscular o interfiere con la producción de energía del músculo puede causar un incremento de la CK. Si el valor de la CK es elevado y la localización del daño muscular es incierta, se debe identificar las isoenzimas de la CK. Las isoenzimas de la CK son: • • •
CK-MM (en músculo esquelético y corazón) CK-MB (en mayoritariamente en corazón, pero hay pequeñas cantidades en músculo esquelético) CK-BB (mayoritariamente en el cerebro y músculo liso, como en intestinos y útero)
La determinación de CK puede ser solicitada por la sospecha de: • • •
Dolores musculares Debilidad muscular Orina de color oscura
Gráfico 1 Actividad enzimática de la CK
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 12 de 160
3.2 Creatin Kinasa MB – CK–MB La prueba de CK-MB era usada para el seguimiento de pruebas de CK elevadas para determinar si el incremento de la CK es por daño cardíaco o por daño de músculo esquelético. La prueba CK-MB estaba indicada en pacientes con dolor del pecho o si el diagnóstico es incierto, como en pacientes con síntomas de dificultad para respirar, fatiga extrema, nausea o mareos. INFORMACION IMPORTANTE: A partir del 2014, la Asociación Americana del Corazón (del inglés, AHA American Heart Association) y la Federación Mundial del Corazón (del inglés, WHF World Heart Federation) que CK-MB no es útil para diagnóstico de Síndrome Coronario Agudo (SCA) (nivel Clase III de evidencia.) (Mayo Clinical Laboratories, 2019) 3.3 Aplicación clínica diagnóstica En términos generales, el uso de la CK en la práctica clínica está asociado para detectar y monitorizar un daño muscular o para diagnosticar enfermedades asociadas al daño muscular (Miopatías) y para determinar la presencia o no de un infarto agudo de miocardio (IAM). (American Association for Clinical Chemistry, 2019) Las miopatías pueden ser causadas por factores congénitos (distrofia muscular), infecciones virales o lesiones agudas secundarias a anorexia, infecciones, tóxicos, fármacos o drogas; también puede darse una debilidad muscular por falta de moléculas generadoras de energía o la alteración en el equilibrio de los electrolitos presentes en el interior y alrededor de las células musculares. (Gaw, 2015) La debilidad muscular, que puede avanzar o no a rabdomiólisis y la distrofia muscular de Duchenne presentan concentraciones séricas elevadas de CK, por lo tanto, su monitorización es importante. En este mismo sentido, en la rabdomiólisis como parte de la destrucción muscular, también se libera mioglobina, potasio e iones fosfato al suero, provocando estados de hiperpotasemia, hiperfosfatemia que concomitantemente podrían desarrollar estados de hipocalcemia. Estos trastornos pueden generar estados de acidosis (concentraciones altas de H- en sangre), convirtiendo a la mioglobina en ferrihemato, que produce radicales libres, causando nefrotoxicidad directa o una necrosis tubular aguda, convirtiendo a la determinación de mioglobina como un indicador de destrucción muscular al encontrarse excretada por la orina. (Gaw, 2015) En relación con la determinación de la actividad de sus isoenzimas, su utilidad está asociada para diferenciar el origen del daño muscular, por lo tanto, la detección de CK-MB está implicada en destrucción del músculo cardíaco. (Rodwell, 2016)
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de BioquĂmica Clinica
Nivel: Q108-07-70
Manual de prĂĄcticas de Laboratorio de BioquĂmica ClĂnica III Plan: B011
CĂłd. asignatura: Q0224-05
VersiĂłn: 2.0 PĂĄgina 13 de 160
4. Actividades prĂĄcticas La actividad programada para esta prĂĄctica finalizarĂĄ con la determinaciĂłn de la actividad enzimĂĄtica de creatin-quinasa CK total (referida en el kit como CK NAC) y la determinaciĂłn de la actividad enzimĂĄtica de la isoenzima CK-MB en nuestras biolĂłgicas asignadas por el profesor. 4.1 DeterminaciĂłn de CK NAC o CK Total La determinaciĂłn de la actividad enzimĂĄtica de la CK NAC serĂĄ realizada mediante espectrofotometrĂa. Para la determinaciĂłn de la actividad de la CK Total, se debe entender las fases de la reacciĂłn para esta determinaciĂłn: Fosfocreatina + ADP ⇆ Creatina + ATP ATP + Glucosa ⇆ Glucosa − 6 − fosfato + ADP Glucosa 6 fosfato + NADP ⇆ 6 − fosfogluconato + NADPH + H Esta reacciĂłn nos demuestra que el incremento en la producciĂłn de NADPH es proporcional a la actividad de la CK. 4.2 DeterminaciĂłn de CK-MB La determinaciĂłn de la actividad enzimĂĄtica de la CK-MB se basa en un principio de inmunoinhibiciĂłn. Para el efecto se usarĂĄ un anticuerpo monoclonal contra la isoenzima CK-MM y la subunidad (M) de la CK-MB. La actividad de la CK-B no inhibida se determina segĂşn la siguiente reacciĂłn: đ??šđ?‘œđ?‘ đ?‘“đ?‘œđ?‘?đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘–đ?‘›đ?‘Ž + đ??´đ??ˇđ?‘ƒ ⇆ đ??śđ?‘&#x;đ?‘’đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘–đ?‘›đ?‘Ž + đ??´đ?‘‡đ?‘ƒ đ??´đ?‘‡đ?‘ƒ + đ??şđ?‘™đ?‘˘đ?‘?đ?‘œđ?‘ đ?‘Ž ⇆ đ??şđ?‘™đ?‘˘đ?‘?đ?‘œđ?‘ đ?‘Ž − 6 − đ?‘“đ?‘œđ?‘ đ?‘“đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ??´đ??ˇđ?‘ƒ đ??şđ?‘™đ?‘˘đ?‘?đ?‘œđ?‘ đ?‘Ž 6 đ?‘“đ?‘œđ?‘ đ?‘“đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + đ?‘ đ??´đ??ˇđ?‘ƒ ⇆ 6 − đ?‘“đ?‘œđ?‘ đ?‘“đ?‘œđ?‘”đ?‘™đ?‘˘đ?‘?đ?‘œđ?‘›đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ + NADPH + đ??ť
Esta reacciĂłn nos demuestra que el incremento en la producciĂłn de NADPH es proporcional a la actividad de la CK-B.
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
4.2.1
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0
Cód. asignatura: Q0224-05
Página 14 de 160
Reactivos, materiales y equipos
Tabla 1 Insumos requeridos para la determinación de CK NAC Reactivos
Materiales
Equipos
Puntas azules Puntas amarillas sin filtro Agua Destilada grado II Kit CK NAC marca LABKIT
Tubos de vidrio 12 x 75 mm Pipetas monocanal volumen variable: 10 a 100 µL
Espectrofotómetro Baño María a 37o C Cronómetros
Pipetas monocanal volumen fijo: 1000 µL Guantes descartables Tabla 2 Insumos requeridos para la determinación de CK-MB Reactivos
Materiales
Equipos
Puntas azules Puntas amarillas sin filtro Agua Destilada grado II Kit CK-MB marca LABKIT
Tubos de vidrio 12 x 75 mm Pipetas monocanal volumen variable: 10 a 100 µL
Espectrofotómetro Baño María a 37o C Cronómetros
Pipetas monocanal volumen fijo: 1000 µL Guantes descartables
4.2.2
Procedimiento
El procedimiento para la determinación de CK está basado en el inserto LKBEDTT02 Ed. 03/2017 referencia de reactivo 30200. El procedimiento para la determinación de CK-MB está basado en el inserto LKBEDTT04 Ed. 03/2017 referencia de reactivo 30203. Sin embargo, los pasos principales son: 4.2.2.1 Preparación de las muestras, tanto para CK como CK-MB: Las condiciones preanalíticas son importantes en las pruebas de laboratorio, por lo tanto la matriz recomendada para esta prueba será suero o plasma llevado a temperatura ambiente. Los sueros o plasmas pueden ser conservados entre 2o C a 8o C por un máximo de 7 días. Se aconseja revisar las Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 15 de 160
condiciones intraindividuales e interindividual para garantizar el éxito en la determinación. Cada estudiante tendrá su propia muestra asignada. 4.2.2.2 Preparación del reactivo de trabajo, tanto para CK como CK-MB (RT): Se debe tomar 1 pastilla del frasco marcado como R2 (sustrato) con 2.5 ml del frasco marcado como R1. Esta operación deber hacerse en un tubo de vidrio 12 x 75 mm nuevo. Con movimientos suaves circulares se debe promover la disolución de la pastilla. Para facilitar este paso, se podrá tapar el tubo de vidrio con papel Parafilm para evitar pérdidas de solución. Este procedimiento es válido para realizar 2 pruebas, quedando un remanente de 500 µL que podrá ser usado por otro compañero para otra prueba. 4.2.2.3 Desarrollo del procedimiento analítico, tanto para CK como CK-MB: A continuación, se describen las condiciones generales del ensayo: - La temperatura establecida para esta actividad será a 37o C. - Filtro usado: 340 nm; se podrá usar modo K60 o modo absorbancias. - Encerar con agua destilada. - Una vez que el equipo, RT y muestra cumplan las condiciones óptimas para el análisis, se procederá a seguir el siguiente esquema de pipeteo: Tabla 3 Esquema de pipeteo para CK NAC 37o C 1.0 20
Reactivos y reactantes RT (mL) Muestra (µL)
Tabla 4 Esquema de pipeteo para CK-MB 37o C 1.0 40
Reactivos y reactantes RT (mL) Muestra (µL)
Para CK: Esta mezcla debe permanecer incubada a 37o C por un lapso de 2 minutos. Al fin de los dos minutos de incubación, se debe leer la primera absorbancia, la misma que deberá ser registrada. Inmediatamente leída la primera absorbancia, se deberá cronometrar 180 segundos (3 minutos) y se deberán hacer lecturas con el lapso de 60 segundos. Al final de proceso, se deberán tener las siguientes lecturas: Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Versión: 2.0
Cód. asignatura: Q0224-05
Tiempo 0´ (después de los 2 minutos de incubación) Tiempo 1´ (60 segundos después de T0´) Tiempo 2´ (60 segundos después de T1´) Tiempo 3´ (60 segundos después de T2´)
Nivel: Q108-07-70
Página 16 de 160
1er. lectura 2da. lectura 3er. lectura 4ta. lectura
Para CK-MB: Esta mezcla debe permanecer incubada a 37o C por un lapso de 10 minutos. Al fin de los diez minutos de incubación, se debe leer la primera absorbancia, la misma que deberá ser registrada. Inmediatamente leída la primera absorbancia, se deberá cronometrar 5 minutos y leer su absorbancia al final de este lapso, la misma que deberá ser registrada. Al final de proceso, se deberán tener las siguientes lecturas: Tiempo 0´ (después de los 10 minutos de incubación) Tiempo 1´ (5 minutos después de T0´) 4.2.3
1er. lectura 2da. lectura
Fuentes de error
La forma de pipetear genera un error analítico importante, por lo tanto, no olvidar las buenas prácticas de laboratorio relacionada con el pipeteo de fluidos. La falta control en la temperatura del baño María genera errores en la activación enzimática, por lo tanto, es vital que todo el procedimiento se realice a 37o C. La temporización para la realización de las lecturas es vital. Es recomendable que se tenga establecido el tiempo en el cronómetro antes de empezar el ensayo. 4.2.4
Valores de referencia
Al estar influenciada la actividad enzimática de la CK por condiciones intraindividuales, es necesario definir el sexo o género del paciente, así como su edad. Los intervalos de referencia establecidos por el fabricante para CK a 37o C son: Tabla 5 Intervalo referencia CK Total Género Hombres Mujeres
Intervalo de referencia < 130 U/L < 110 U/L
Las siguientes condiciones pueden provocar un incremento de la CK:
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
• • • • • • • • • • • • •
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 17 de 160
Lesiones por aplastamiento reciente y compresión muscular, traumatismos, quemaduras y la electrocución. Miopatías hereditarias, como la distrofia muscular. Trastornos hormonales (endócrinos) como los trastornos de la tiroides, enfermedad de Addison o enfermedad de Cushing. Ejercicio agotador. Cirugías prolongadas. Convulsiones. Infecciones virales (tales como la gripe y VIH), infecciones bacterianas, fúngicas y parasitarias (como la malaria). Trastornos del tejido conectivo (por ejemplo, el lupus, la artritis reumatoide). Enfermedad celíaca. Insuficiencia renal en pacientes críticamente enfermos. Fiebre alta acompañada de escalofríos. Un coágulo de sangre (trombosis) bloqueando el flujo de sangre. Cualquier fármaco o toxina que interfiere con la producción de energía muscular o aumenta las necesidades de energía.
En relación con la actividad de la CK-MB, un individuo aparentemente sano no debería tener valores por encima de los siguientes puntos de corte: Tabla 6 Intervalos de referencia para CK-MB Intervalo de referencia CK-MB
> 24 U/L
En algunos textos, se considera que el valor de la CK-MB se encuentra entre el 6 % y 25 % de la actividad total de la CK. 4.2.5
Valores de alerta (críticos, pánico)
La determinación de CK es considerada como una prueba de carácter STAT, por lo tanto, aplicando las recomendaciones de la norma ISO 15189:2012, los resultados que representan más de 5 veces del valor del intervalo de referencia deben ser avisados al médico o al servicio de urgencias médicas de manera inmediata.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 18 de 160
5. Cálculos y/o resultados Para el caso de CK: Como se trata de la determinación de la actividad enzimática, se debe realizar el cálculo de los Deltas (Δ), por lo tanto, se debe proceder así, según el siguiente ejemplo: Tiempo 0´ Tiempo 1´ Tiempo 2´ Tiempo 3´
: : : :
0.0926 0.0916 0.0910 0.0909
Con estas lecturas, se calcula primero el promedio de las lecturas. Para ello se debe restar la lectura T3´ - T2´; T2´ - T1´; T1´ - T0´: 0.0909 – 0.0910; 0.0910 – 0.0916; 0.0916 – 0.0926. Las sumas de las diferencias dan 0.0017 que, al dividirlas para tres, nos da un valor de 0.00056. El factor que debe ser usado para calcular el valor de la actividad enzimática indicado en el inserto es: 8095. Por lo tanto, el valor de CK para este ejemplo es de 4.58 U/L. Para el caso de CK-MB: Como se trata de la determinación de la actividad enzimática, se debe realizar el cálculo del Delta (Δ), de las dos absorbancias, para lo cual se procederá según el siguiente ejemplo: Tiempo 0´ (después de los 10 minutos de incubación) : 0.3250 Tiempo 1´ (5 minutos después de T0´) : 0.6250 Se realiza la resta y tenemos un Δ: 0.3000 El factor indicado en el inserto para CK-MB es de 1651, por lo tanto, el valor de CK-MB para este ejemplo es: 495 U/L.
6. Presentación de Informe de resultados de laboratorio El informe de resultados se debe presenta en a través del Moodle, en formato pdf y con forme los requisitos descritos en el Anexo 4. Se debe presentar el informe de resultados de laboratorio en formato pdf en el espacio designado en el EVA. El sistema Moodle no recibirá informes atrasados o fuera del tiempo. Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 19 de 160
7. Conclusiones y recomendaciones Al final de esta práctica, el alumno deberá demostrar: • •
Procesar muestras biológicas de manera urgente para apoyar con el diagnóstico de estados agudos de condiciones cardiacas Diferenciar los marcadores cardíacos usados por un laboratorio clínico, tanto en su tiempo de respuesta como en su metodología analítica para establecer las mejoras estratégicas diagnósticas.
8. Anexos relacionados inserto CK MB.pdf
inserto CK TOTAL.pdf
Biomarcadores Insuficiencia cardiaca.pdf
9. Bibliografía American Association for Clinical Chemistry. (2019). LAB TESTS ONLINE. Recuperado el 23 de Agosto de 2019, de https://www.labtestsonline.es/tests/creatina-quinasa Gaw, A. (2015). Bioquímica clínica : texto y atlas en color ([tr. 5a. ed. ing. ed.). Madrid: Elsevier. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Mayo Clinical Laboratories. (2019). Mayo Foundation for Medical Education and Research. Obtenido de https://www.mayocliniclabs.com/test-catalog/search.php?search=ckmb Organización Panamericana de la Salud. (2011). “Manual para la implementación de un sistema de triaje para los cuartos de urgencias (Matilde E. Molina ed.). Washington, D.C. Rodwell, V. W. (2016). Harper : bioquímica ilustrada (30a. Ed. ed.). México: McGraw-Hill. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020