Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 94 de 156
PRÁCTICA 11 – DETERMINACIÓN DE α-AMILASA 1. Objetivo • •
Determinar la actividad enzimática de α-amilasa en nuestras biológicas para aportar con evidencia clínica en pacientes con patologías asociadas al tracto gastrointestinal. Diferenciar las enzimas con actividad órgano específicas versus las enzimas que son originadas por diferentes órganos y como se usan en la práctica clínica.
2. Resultados de aprendizaje esperados •
•
•
Ejecutar los procesos preanalíticos, analíticos y posanalítico para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las normas de bioseguridad y el control de calidad respectivos Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo con lo descrito en la literatura médica.
3. Fundamento teórico 3.1 Introducción El páncreas, ubicado en la zona retroperitoneal en el abdomen superior, es un órgano glandular lobulado, que actúa como una glándula accesoria del aparato digestivo, con funciones mixtas, exocrinas y endocrinas. (Rodwell, 2016) Su peso está constituido por agua en el 71% y por proteínas en el 13%, mientras que su composición grasa en variable y puede oscilar entre un 3 al 20%. Anatómicamente está dividido en cuatro porciones, la cabeza, el cuello, el cuerpo y la cola, aunque también se lo puede dividir en páncreas derecho, páncreas central y páncreas izquierdo. Posee varios tipos celulares, contiene tejido exocrino conformado por células acinares productoras de enzimas digestivas, como la α-amilasa y también presenta un tejido endocrino compuesto por las células de los islotes de Langerhans, que producen hormonas que mantienen la homeostasis de la glucosa, como se aprecia en el gráfico 16. (Gaw A. , 2015) (Olvera-Granado, 2008)
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Gráfico 16 Anatomía e Histología pancreática 3.2 α-Amilasa Es una metaloenzima que requiere calcio y pertenece a la clase de hidrolasas. La reacción enzimática que cataliza esta enzima es hidrólisis aleatoria de enlaces glicosídicos α-1,4 internos del almidón, glucógeno y otros polímeros de la glucosa, como se muestra en el gráfico 17. Los productos de digestión de la amilasa, que es una cadena lineal que contiene sólo enlaces glicosídicos α-1,4 son: • • •
Maltosa Maltriosa Dextrinas
La α-amilasa también hidroliza enlaces α-1,4 de la amilopectina, que es la molécula de almidón ramificada. Su peso molecular no sobrepasa los 50 kDa, por lo cual no se filtra en los glomérulos renales; una pequeña porción que se filtra aparece en la orina, ya que los túbulos la reabsorben de manera parcial, por lo tanto la actividad de α-Amilasa en orina es de gran ayuda además de la determinación en suero. (Greenstein & Wood, 2016) Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Gráfico 17 Acción hidrolítica de la Amilasa 3.3 Fuentes tisulares de α-Amilasa Las principales fuentes tisulares de esta enzima son las glándulas salivales y las células acinares del páncreas. La actividad de α-Amilasa no es específica para estos tejidos, ya que también se encuentran en: • • • • •
Epitelio intestinal Trompas de Falopio Mucosa del cuello uterino Endometrio Tejido mamario durante la lactancia
La principal función de la amilasa se debe a la fracción pancreática, que ayuda a la digestión de almidón, glucógeno y sus productos de descomposición en el intestino delgado. La amilasa salival inicia la digestión del almidón en la cavidad oral pero su acción termina con rapidez a consecuencia del pH ácido del jugo gástrico durante la deglución. (John W. Baynes, Marek H. Dominiczak, 2015)
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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3.4 Isoenzimas Al revisar las isoenzimas de la amilasa, podemos indicar que existe: • •
Amilasa pancreática (P) – originada en el páncreas Amilasa salival (S) – originadas en las glándulas salivales, pulmón, huevos, ovarios y tiroides.
En un individuo adulto, cerca del 40% de la actividad se debe a la amilasa de origen pancreático y el 60% restante a la de origen salival. Existen tres isoenzimas salivales: S1, S2 y S3, las mismas migran de forma más rápida en electroforesis, mientras que las isoenzimas P1, P2 y P3 lo hacen de manera más lenta. Las isoenzimas S1 y P1 son las que más actividad enzimática representan en suero, sin embargo, solo la fracción P3 tiene mayor significado clínico, ya que solo se detecta en pancreatitis aguda. 3.5 Significado Clínico La actividad de amilasa se eleva en varias enfermedades, no obstante, su significado clínico se relaciona principalmente con el diagnóstico de pancreatitis aguda. No hay que olvidar su gran distribución en el área abdominal, algunas otras afecciones intraabdominales también provocan hiperamilasemia, generando poco de confusión diagnóstica. Estas afecciones incluyen: • • • • • • • •
Úlcera péptica perforada Oclusión intestinal Apendicitis aguda Ruptura por embarazo ectópico Enfermedades de las glándulas salivales Adenocarcinoma de pulmón, ovarios o páncreas Trastornos hepáticos y renales Macroamilasemia
4. Actividades prácticas A nivel de laboratorio, se procederá a determinar la actividad enzimática de amilasa en muestras proporcionadas por el docente. 4.1 Reactivos, materiales y equipos Los reactivos, materiales y equipos que vamos a usar son:
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Versión: 2.0 Página 98 de 156
Tabla 29 Insumos necesarios para procesar alfa-amilasa REACTIVOS Reactivo para determinación de amilasa REF 12018
MATERIALES
EQUIPOS
Puntas amarillas nuevas
Espectrofotómetro Clinicon
Pipetas azules nuevas Tubos vidrio 12 x 75 nuevos Guantes descartables
Pipetas automáticas de volumen variable de 10 a 100 µ L Pipetas automáticas de volumen variable de 200 a 1000 µ L Cronómetro
Vasos para descartar puntas 1 ml de Suero fresco Papel absorbente Agua Destilada tipo II
4.1.1
Procedimiento
El procedimiento a usar será el recomendado por el fabricante, sin embargo, se agregan los puntos relevantes a continuación: 4.1.1.1 Preparación de la muestra: suero Se deben usar sueros frescos. Este kit también puede ser usado para la determinación de alfaamilasa en orina y en plasma heparinizado. 4.1.1.2 Preparación de la curva de calibración Para este caso, se ha a usar el procedimiento directo manual, por lo que no se requiere de procesar una calibración. 4.1.1.3 Esquema de pipeteo El esquema de pipeteo se describe en la tabla 30. Tabla 30 Esquema pipeteo alfa-amilasa REACTIVO TRABAJO 1.000 μL ---
Reactivos y reactantes RT (reactivo trabajo) Muestra
Muestra ----10 μL
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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4.1.1.4 Procedimiento La reacción se debe realizar a 37o C y en tubos de vidrio. Usando el esquema de pipeteo de la tabla 30, se debe permitir que la reacción permanezca por 1 minuto a la temperatura indicada, y automáticamente terminado el minuto, se deben realizar tres (3) lecturas de sus absorbancias a 405 nm con lapsos de 60 segundos. Al final de proceso, se deberán tener las siguientes lecturas: Tiempo 0´ (después de 1 minuto de incubación) Tiempo 1´ (60 segundos después de T0´) Tiempo 2´ (60 segundos después de T1´) Tiempo 3´ (60 segundos después de T2´)
1er. lectura 2da. lectura 3er. lectura 4ta. lectura
Registrar cada lectura en su cuaderno de laboratorio. A manera de ejemplo, se han obtenido las siguientes absorbancias: Tiempo 0´ Tiempo 1´ Tiempo 2´ Tiempo 3´
: : : :
0.0072 0.0077 0.0084 0.0091
5. Cálculos y/o resultados Como se trata de la determinación de la actividad enzimática, se debe realizar el cálculo de los Deltas (Δ), por lo tanto, se debe proceder así, según el siguiente ejemplo: Tiempo 0´ Tiempo 1´ Tiempo 2´ Tiempo 3´
: : : :
0.0072 0.0077 0.0084 0.0091
Con estas lecturas, se calcula primero el promedio de las lecturas. Para ello se debe restar la lectura T3´ - T2´; T2´ - T1´; T1´ - T0´: 0.0091 – 0.0084; 0.0084 – 0.0077; 0.0077 – 0.0072. Las sumas de las diferencias dan 0.0021 que, al dividirlas para tres, nos da un valor de 0.0007. El factor que debe ser usado para calcular el valor de la actividad enzimática indicado en el inserto es: 20820. Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Docente 11/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Por lo tanto, el valor de alfa-amilasa para este ejemplo es de 17,3 U/L, que equivale a 17 U/I.
6. Instrucciones para el informe de resultados A continuación, podrán identificar las instrucciones para completar el informe de resultados de laboratorio correspondiente a esta práctica: • • •
El informe de resultados debe incluir los valores obtenidos de alfa-amilasa según los valores asignados a cada alumno. El informe de resultados debe incluir el valor de alfa-amilasa en orina, correlacionado con el valor obtenido del cálculo de los resultados de amilasa asignados. El informe de resultados debe incluir el valor de lipasa sérica que refleje una pancreatitis aguda.
Por lo tanto, el informe de resultados debe tener un total de 3 analitos, con sus respectivos intervalos de referencia y demás observaciones o cometarios que amerite el informe.
7. Conclusiones y recomendaciones Al final de la práctica, el alumno deberá demostrar: • •
Capacidad de diferenciar las pruebas diagnósticas para valorar la función del páncreas a nivel exocrino. Aplicar metodologías analíticas correctas para determinar la actividad enzimática de αamilasa en nuestras biológicas y sus isoenzimas.
8. Anexos relacionados
Amilasa_human.pdf
9. Bibliografía Gaw, A. (2015). Bioquímica clínica : texto y atlas en color ([tr. 5a. ed. ing. ed.). Madrid: Elsevier. Greenstein, B., & Wood, D. (2016). Endocrinología - Lo esencial de un vistazo (3er. ed.). Madrid: Editorial Médica Panamerica. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Olvera-Granado, C. P. (Octubre de 2008). Páncreas y células beta: mecanismos de diferenciación, morfogénesis y especificación celular endocrina.¿Regeneración? Artenisa, 306-324. Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Rodwell, V. W. (2016). Harper : bioquímica ilustrada (30a. Ed. ed.). México: McGraw-Hill.
PRÁCTICA 12 – ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO TOTAL 1. Objetivo •
Determinar la concentración de PSA total en muestras asignadas para la práctica de laboratorio utilizando técnicas de ELISA. • Aplicar el cálculo de PSA total y libre para determinar el riesgo relativo de presencia de cáncer de próstata en pacientes ambulatorios y con sospecha de cáncer de próstata.
2. Resultados de aprendizaje esperados
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Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Dr. Santiago Escalante
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Docente 11/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020