Klinicka kemija i molekularna dijagnostika

MANUALIA UNIVERSITATIS STUDIORUM ZAGRABIENSIS UDŽBENICI SVEUČILIŠTA U ZAGREBU Jadranka Sertić i suradnici KLINIČKA KEMIJA I MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA U KLINIČKOJ PRAKSI drugo, dopunjeno i obnovljeno izdanje

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 1

2.2.2015. 8:32:51

MEDICINSKA NAKLADA – ZAGREB BIBLIOTEKA SVEUČILIŠNI UDŽBENICI Jadranka Sertić i suradnici KLINIČKA KEMIJA I MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA U KLINIČKOJ PRAKSI drugo, dopunjeno i obnovljeno izdanje

Stručna urednica prof. dr. sc. Jadranka SERTIĆ Recenzenti prof. dr. sc. Nada VRKIĆ prof. dr. sc. Mirko KORŠIĆ, FRCP prof. dr. sc. Željko ROMIĆ

CIP zapis dostupan u računalnome katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 893467 ISBN 978-953-176-655-5

Odlukom Senata Sveučilišta u Zagrebu: Klasa: 032-01/13-01/63; ur. broj: 380-061/160-14-3, na sjednici održanoj 11. veljače 2014. odobreno je korištenje naziva sveučilišni udžbenik (Manualia universitatis studiorum Zagrabiensis) Ÿ Medicinska naklada, Zagreb, 2015.

Nijedan dio ove knjige ne smije se umnožavati niti reproducirati u bilo kojem obliku ili na bilo koji način, elektronički ili mehanički, uključujući fotokopiranje, osim za kratke citate, bez autorova i nakladnikova pismenog dopuštenja.

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 2

2.2.2015. 8:32:51

Jadranka Sertić i suradnici

Klinička kemija i molekularna dijagnostika u kliničkoj praksi drugo, dopunjeno i obnovljeno izdanje

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, 2015.

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 3

2.2.2015. 8:32:51

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 4

2.2.2015. 8:32:51

Autori

Prof. dr. sc. Igor AURER, redoviti profesor interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, hematolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za hematologiju, Odjel za zloćudne tumore krvotvornog sustava

Prof. dr. sc. Nada BOŽINA, izvanredni profesor kliničke farmakologije s toksikologijom, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za farmakologiju; Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za farmakogenomiku i individualizaciju terapije

Žarko BAJIĆ, sveučilišni specijalist kliničke epidemiologije, Biometrika Healthcare Research, Zagreb

Dr. sc. Tamara BOŽINA, doktor medicinskih znanosti, magistar inženjer bioprocesnog inženjerstva, biokemijsko inženjerstvo, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju, Zavod za kemiju i biokemiju

Prof. dr. sc. Danica BATINIĆ, redoviti profesor pedijatrije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za pedijatriju; specijalist pedijatrije, pedijatrijski nefrolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Zavod za nefrologiju, dijalizu i transplantaciju Prof. dr. sc. Drago BATINIĆ, redoviti profesor imunologije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za fiziologiju i imunologiju; specijalist laboratorijske imunologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za staničnu imunodijagnostiku i postupke in vitro Antonela BAZINA, specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Zavod za intenzivnu neurologiju, Odjel za intenzivno liječenje neuroloških bolesnika Prim. dr. sc. Ines BOJANIĆ, profesor visoke škole Zdravstvenog veleučilišta u Zagrebu; specijalist transfuzijske medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju Prof. dr. sc. Fran BOROVEČKI, izvanredni profesor, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za anatomiju i kliničku anatomiju, Centar za translacijska i klinička istraživanja, Odjel za funkcionalnu genomiku; specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Specijalistički zavod za kognitivnu neurologiju

Prim. dr. sc. Petrana BREČIĆ, Sveučilište u Zagrebu, Edukacijsko-rehabilitacijski fakultet; specijalist psihijatrije – biologijska psihijatrija, Klinika za psihijatriju Vrapče, Zagreb, Zavod za liječenje i rehabilitaciju Dr. sc. Désirée COEN HERAK, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za laboratorijsku dijagnostiku poremećaja zgrušavanja Dr. sc. Dubravka ČVORIŠĆEC, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Ured za osiguranje i unapređenje kvalitete zdravstvene zaštite Ivan ĆELIĆ, specijalist psihijatrije, Klinika za psihijatriju Vrapče, Zagreb, Zavod za dualne poremećaje Dr. sc. Sanja DAVIDOVIĆ-MRSIĆ, specijalist transfuzijske medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hematoonkoloških bolesti Prof. dr. sc. Ivančica DELAŠ, izvanredni profesor medicinske kemije i biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju, Zavod za kemiju i biokemiju

| V

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 5

2.2.2015. 8:32:51

Prof. dr. sc. Irena DRMIĆ HOFMAN, redoviti profesor medicinske kemije i biokemije, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet, Katedra za kemiju i biokemiju; Klinički bolnički centar Split, Klinički zavod za patologiju, sudsku medicinu i citologiju

Prof. dr. sc. Dalibor KARLOVIĆ, izvanredni profesor psihijatrije, Hrvatsko katoličko Sveučilište u Zadru; specijalist psihijatrije, biologijski psihijatar, Klinički bolnički centar Sestre milosrdnice Zagreb, Klinika za psihijatriju, Zavod za biologijsku psihijatriju

Ivana FRANJIĆ ŠIMIĆ, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hematoonkoloških bolesti

Dr. sc. Ivana KARMELIĆ, viši asistent, doktor prirodnih znanosti, magistar inženjer bioprocesnog inženjerstva, biokemijsko inženjerstvo, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju, Zavod za kemiju i biokemiju

Prim. dr. sc. Marija GAMULIN, znanstveni savjetnik, specijalist onkologije i radioterapije, Klinički bolnički centar Zagreb, Zavod za internističku onkologiju Doc. dr. sc. Branka GOLUBIĆ, naslovni docent, Sveučilište u Splitu, naslovni viši asistent, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, profesor visoke škole Zdravstvenog veleučilišta u Zagrebu; specijalist transfuzijske medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju Dr. sc. Karlo GOLUBIĆ, doktor medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za bolesti srca i krvnih žila

Prof. dr. sc. Darko KAŠTELAN, izvanredni profesor interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za endokrinologiju Prim. Jadranka KELEČIĆ, specijalist pedijatrije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Zavod za kliničku imunologiju, respiracijske i alergološke bolesti i reumatologiju, Odjel za respiracijske bolesti i alergologiju Dr. sc. Nevenka KOPJAR, znanstveni savjetnik; magistar biologije, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada Zagreb, Jedinica za mutagenezu

Kristina GOTOVAC, magistar biologije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Centar za translacijska i klinička istraživanja, Odjel za funkcionalnu genomiku

Prim. Marta KORŠIĆ, specijalist interne medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za plućne bolesti Jordanovac, Zavod za tumore pluća i sredoprsja, Odjel za tumore pluća

Dr. sc. Paula GRANIĆ, specijalist analitičke toksikologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za analitičku toksikologiju i farmakologiju

Dr. sc. Ana KOZMAR, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za humoralnu imunodijagnostiku

Professor Jocelyn M. B. HICKS, profesor emeritus pedijatrije i patologije, The George Washington University School of Medicine, Washington; IFCC – bivša predsjednica Prof. dr. sc. Davor JEŽEK, redoviti profesor citologije, histologije i embriologije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Zavod za histologiju i embriologiju; doktor medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju Iva JURČEVIĆ, doktor medicine, Klinika za psihijatriju Vrapče, Zagreb Mr. sc. Ljiljana JURIČIĆ, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku Doc. dr. sc. Mirjana KALAUZ, docent interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, gastroenterolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Dnevna bolnica s dijagnostičko-terapijskom gastroenterologijom

Prof. dr. sc. Vesna KUŠEC, izvanredni naslovni profesor kliničkih medicinskih znanosti, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet; doktor medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za biokemiju vitamina i koštanih biljega Zdenka LALIĆ, magistar farmacije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za analitičku toksikologiju i farmakologiju Doc. dr. sc. Robert LIKIĆ, docent interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, farmakolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za kliničku farmakologiju Prof. dr. sc. Jasna LOVRIĆ, redoviti profesor medicinske kemije i biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju, Zavod za kemiju i biokemiju Dr. sc. Mila LOVRIĆ, viši znanstveni suradnik, medicinska biokemija; specijalist analitičke toksikologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za multidisciplinarnu primjenu kromatografije

VI |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 6

2.2.2015. 8:32:51

Dr. sc. Hana LJUBIĆ, doktor prirodnih znanosti, magistar biologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku Prof. dr. sc. Branko MALENICA, profesor prirodnih znanosti, Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet; doktor medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za humoralnu imunodijagnostiku Domagoj MARIJANČEVIĆ, profesor visoke škole Zdravstvenog veleučilišta u Zagrebu; specijalist medicinske biokemije i laboratorijske medicine, Klinička bolnica Dubrava, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Jedinica za biokemiju i analitičku toksikologiju Prof. dr. sc. Jasenka MARKELJEVIĆ, izvanredni profesor interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, imunolog i alergolog, KBC Sestre milosrdnice, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za kliničku imunologiju, pulmologiju i reumatologiju Dr. sc. Danica MATIŠIĆ, profesor visoke škole Zdravstvenog veleučilišta Zagreb, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za specijalnu biokemiju Prim. mr. sc. Višnja MATKOVIĆ, specijalist onkologije i radioterapije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za ženske bolesti i porode, Zavod za ginekološku onkologiju, Odjel za kemoterapiju i radioterapiju Ana MERKLER, magistar inženjer bioprocesnog inženjerstva, biokemijsko inženjerstvo, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku Dr. sc. Ivanka MIHALJEVIĆ, doktor biomedicinskih znanosti, magistar medicinske biokemije, Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinu Zagreb, Odjel za istraživanje i razvoj Dr. sc. Marija MILOŠ, specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za specijalnu i molekularnu hematologiju

Dr. sc. Maja PERAICA, znanstveni savjetnik; doktor medicine, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada Zagreb, Jedinica za toksikologiju Prim. dr. sc. Sanja PLEŠTINA, specijalist interne medicine, pulmologija i internistička onkologija, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za plućne bolesti Jordanovac, Zavod za tumore pluća i sredoprsja, Odjel za rijetke tumore toraksa Prof. dr. sc. Zdravka POLJAKOVIĆ, izvanredni profesor neurologije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za neurologiju; specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Zavod za intenzivnu neurologiju Doc. dr. sc. Dražen PULANIĆ, docent interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, hematolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za hematologiju Prim. dr. sc. Ivo RADMAN LIVAJA, profesor visoke škole Zdravstvenog veleučilišta u Zagrebu; specijalist interne medicine, hematolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za hematologiju Dr. sc. Dubravka RAŠIĆ, doktor prirodnih znanosti, magistar biologije, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada, Zagreb, Jedinica za toksikologiju Akademik Željko REINER, redoviti profesor interne medicine u trajnom zvanju, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, endokrinolog i dijabetolog, FRCP, FESC, FACC, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za bolesti metabolizma Prof. dr. sc. Nadan RUSTEMOVIĆ, izvanredni naslovni profesor interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, gastroenterolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za intervencijsku gastroenterologiju

Prim. dr. sc. Zoran MITROVIĆ, doktor prirodnih znanosti, specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Kabinet za elektrodijagnostiku i praćenje nasljednih neuromuskularnih bolesti

Prof. dr. sc. Jadranka SERTIĆ, redoviti profesor kliničke biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju; naslovni redoviti profesor medicinske biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet; specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku

Prof. dr. sc. Daria PAŠALIĆ, izvanredni profesor medicinske kemije i biokemije, magistar medicinske biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju, Zavod za kemiju i biokemiju

Dr. sc. Boško SKORIĆ, znanstveni suradnik, specijalist interne medicine, kardiologija, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za kardiologiju, Zavod za intenzivnu kardiološku skrb, aritmije i transplantacijsku kardiologiju, Odjel za intenzivno kardiološko liječenje

| VII

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 7

2.2.2015. 8:32:51

Dr. sc. Patrik STANIĆ, doktor prirodnih znanosti, magistar biologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za ženske bolesti i porode, Zavod za humanu reprodukciju, Odjel za metode pomognute oplodnje Doc. dr. sc. Feodora STIPOLJEV, docent temeljnih medicinskih znanosti, Sveučilište u Osijeku, Medicinski fakultet, Katedra za medicinsku biologiju i genetiku; magistar biologije, doktor medicinskih znanosti, Klinička bolnica Sveti Duh, Klinika za ginekologiju i porodništvo, Citogenetički laboratorij Zrinko ŠALEK, doktor medicine, Klinički bolnički centar Sestre milosrdnice Zagreb Dr. sc. Helena ŠARAC, specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Odjel za heredodegenerativne bolesti Dragana ŠEGULJA, magistar medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za specijalnu biokemiju Lucija ŠIMETIĆ, specijalist medicinske biokemije i laboratorijske medicine, Klinički bolnički centar Osijek, Odjel za kliničku laboratorijsku dijagnostiku Livija ŠIMIČEVIĆ, magistar medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku Doc. dr. sc. Iveta ŠIMIĆ, docent interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine i kliničke farmakologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za bolesti metabolizma Dr. sc. Mirjana ŠIMIĆ, znanstveni suradnik; doktor prirodnih znanosti, inženjer biokemijskog inženjerstva, medicinska biokemija, Imunološki zavod Zagreb, Odjel za preradu plazme

Prof. dr. sc. Duška TJEŠIĆ-DRINKOVIĆ, izvanredni profesor pedijatrije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za pedijatriju; specijalist pedijatrije, gastroenterolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Zavod za gastroenterologiju, hepatologiju i prehranu Prof. dr. sc. Monika TOMIĆ, izvanredni profesor interne medicine, Sveučilište u Mostaru, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu, Sveučilište u Mostaru, Farmaceutski fakultet; specijalist interne medicine, nefrolog, Sveučilišna Klinička bolnica Mostar, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za nefrologiju i dijalizu Prof. dr. sc. Milica TRBOJEVIĆ-ČEPE, izvanredni profesor medicinske biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutskobiokemijski fakultet; Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za neurobiokemiju Dr. sc. Marijo VODANOVIĆ, specijalist interne medicine, hematolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za hemostazu i trombozu te benigne bolesti krvotvornog sustava Dr. sc. Željka VOGRINC, znanstveni suradnik; specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za opću kliničku biokemiju Dr. sc. Marijana VUČIĆ LOVRENČIĆ, znanstveni savjetnik; specijalist medicinske biokemije, Klinička bolnica Merkur, Zagreb, Klinički zavod za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu Dr. sc. Ana VUJAKLIJA BRAJKOVIĆ, znanstveni suradnik; specijalist interne medicine, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za intenzivnu medicinu

Prof. dr. sc. Anton ŠMALCELJ, redoviti profesor interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, kardiolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za bolesti srca i krvnih žila, Zavod za opću kliničku kardiologiju

Prof. dr. sc. Renata ZADRO, redoviti profesor medicinske biokemije, Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Katedra za medicinsku biokemiju i hematologiju; specijalist medicinske biokemije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za specijalnu i molekularnu hematologiju

Prim. dr. sc. Ružica ŠMALCELJ, specijalist interne medicine, nefrolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Zavod za nefrologiju, arterijsku hipertenziju, dijalizu i transplantaciju

Dr. sc. Marija ZEKUŠIĆ, doktor prirodnih znanosti, magistar biologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička jedinica za nasljedne metaboličke poremećaje

Doc. dr. sc. Srđana TELAROVIĆ, docent neurologije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za neurologiju; specijalist neurologije, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za neurologiju, Odjel za heredodegenerativne bolesti

Prof. dr. sc. Silva ZUPANČIĆ ŠALEK, izvanredni profesor interne medicine, Sveučilište u Osijeku, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu, naslovni docent interne medicine, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za internu medicinu; specijalist interne medicine, hematolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za unutarnje bolesti, Odjel za hemostazu i trombozu te benigne bolesti krvotvornog sustava

Prof. dr. sc. Dorian TJEŠIĆ-DRINKOVIĆ, izvanredni profesor pedijatrije, Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Katedra za pedijatriju; specijalist pedijatrije, pedijatrijski pulmolog, Klinički bolnički centar Zagreb, Klinika za pedijatriju, Zavod za kliničku imunologiju, respiracijske i alergološke bolesti i reumatologiju, Odjel za respiracijske bolesti, kliničku imunologiju i alergologiju

Dr. sc. Davor ŽELJEŽIĆ, znanstveni savjetnik; magistar biologije, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada Zagreb, Jedinica za mutagenezu

VIII |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 8

2.2.2015. 8:32:51

Predgovor

Autori i izdavač sa zadovoljstvom izdaju 2. izdanje sveučilišnog udžbenika Klinička kemija i molekularna dijagnostika u kliničkoj praksi za studente medicine i biomedicinskih znanosti. Ovo izdanje sadrži egzaktnu analitiku u kliničkoj praksi, koncizne podatke koji proniču u biokemijsko-molekularne procese, metode i terapijske učinke te zorno pokazuje koliko i na koji način klinička kemija i molekularna dijagnostika služe u kliničkoj praksi.

Drugo izdanje podvrgnuto je temeljnim promjenama u kojemu su autori nastavnici Medicinskog fakulteta te Farmaceutsko-biokemijskog, Stomatološkog i Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta i specijalisti/subspecijalisti medicine, medicinske biokemije, laboratorijski eksperti i znanstvenici, iskusni stručnjaci u kliničkoj i laboratorijskoj praksi napisali racionalni pristup kliničkoj kemiji, biokemiji i molekularnoj dijagnostici u 12 glavnih dijelova: 1. Molekularna dijagnostika, klinička kemija i laboratorijska medicina; 2. Laboratorijska dijagnostika najčešćih bolesti metabolizma, kardioloških i neuroloških poremećaja; 3. Odabrana poglavlja iz molekularne dijagnostike neuroloških i psihijatrijskih poremećaja; 4. Laboratorijska dijagnostika imunoloških i plućnih bolesti; 5. Laboratorijska dijagnostika bolesti bubrega; 6. Laboratorijska dijagnostika bolesti jetre i gušterače; 7. Odabrana poglavlja iz laboratorijske endokrinologije; 8. Odabrana poglavlja iz onkologije solidnih tumora i laboratorijska dijagnostika; 9. Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze; 10. Laboratorijska dijagnostika psihijatrijskih poremećaja; 11. Laboratorijska toksikologija, farmakologija i prehrana; 12. Laboratorijska medicina – odabrani primjeri laboratorijskih nalaza.

Klinička važnost kliničke biokemije i laboratorijske medicine prikazana u svim poglavljima vodi u smjeru racionalnog i optimalnog korištenja laboratorijskih pretraga za vitalne funkcije i stanja organskih sustava suvremenim pristupom dijagnostici. Prikazana je vrijednost i domet laboratorijskog nalaza koji se temelji na dobrom poznavanju kliničkih, predanalitičkih i analitičkih aspekata iz svakodnevne dugogodišnje prakse, a knjiga može također nadopuniti znanja u svim granama kliničke medicine.

Ravnopravno mjesto u knjizi je našla i molekularna dijagnostika koja je ušla u sve grane medicine od monogenskih, multifaktorskih, onkoloških te virusnih bolesti uključujući preventivnu, prediktivnu i personaliziranu medicinu, te prikazuje najnovije relevantne pomake znanja i tehnologije u laboratorijskoj dijagnostici i kliničkoj praksi. Molekularna dijagnostika metaboličkih, kardioloških, neuroloških, gastroenteroloških, virusnih, hematoloških, imunoloških i endokrinoloških bolesti nastala je na znanstvenim temeljima i namijenjena je učenju molekularne medicine, postavljanju dijagnoze i praćenju terapije prema međunarodnim

| IX

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 9

2.2.2015. 8:32:51

smjernicama. Primjena farmakogenomike u svakodnevnoj kliničkoj praksi temelji se također na najnovijim međunarodnim uputama i standardima. Autori teksta stručnjaci su s kliničkim i laboratorijskim iskustvom, a ujedno su i znanstvenici što knjizi daje i pečat znanstvenog pristupa. Također, medicinska etika u svjetlu personalizirane medicine postala je prepoznata i nezaobilazna znanstvena disciplina u području genomske medicine.

Poglavlja iz statističke obrade podataka trebaju pomoći mladim liječnicima, istraživačima i laboratorijskim stručnjacima, potaknuti ih na prikupljanje, obradu te publiciranje rezultata temeljenih na znanstvenim metodama, što znači na suradnju koja će omogućiti objektivnu predikciju rizika kliničkih entiteta.

Poglavlje laboratorijske toksikologije, farmakologije i prehrane daje pregled o najnovijim dostignućima o laboratorijskoj dijagnostici akutnog otrovanja, imunosupresivnim lijekovima u bolesnika s transplantatom, obradi bolesnika s alergijama na lijekove, ljudskim imunoglobulinima kao biološkom lijeku, prehrani i personaliziranom liječenju. Poglavlje mikotoksikoze u ljudi i biljezi izloženosti mikotoksinima je prikaz bolesti koje se povezuju s izloženošću mikotoksinima.

Ovaj udžbenik je nastao iz ukupnosti sadašnjeg znanja i svakodnevne kliničke i laboratorijske prakse, a namijenjen je studentima medicine i ostalih biomedicinskih znanosti sa svrhom razumijevanja povezanosti kliničke kemije i molekularne dijagnostike sa zdravljem i bolesti. U skladu sa sadašnjim znanstvenim dostignućima genomike, proteomike, metabolomike, nutrigenomike i medicinske etike postoji potreba za većom zastupljenošću kliničke kemije, molekularne dijagnostike i laboratorijske medicine u edukaciji. Uz to, nadamo se da će sadržaj knjige i spoznaja o mnogim nerazjašnjenim uzrocima bolesti i stanja za studenta i specijalizanta biti poticaj da slobodno zaplovi morem istraživanja na putu prema istini. „Gledaj, ribar vesla na pučinu. Blago njemu, neće mu tamo dojahati konjanici niti će ga umesti pohara...� Jozo Vrkić (iz zbirke novela Šapat, 1996.)

Zahvaljujem Medicinskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, dekanu akademiku Davoru Miličiću i prof. dr. sc.

Jasni Lovrić, pročelnici Katedre za medicinsku kemiju, biokemiju i kliničku kemiju koji su me podržali na putu do ostvarenja ovog izdanja.

Zahvaljujem svim cijenjenim autorima koji su se odazvali mojoj zamolbi da sudjeluju u pisanju ovog udžbenika.

Veliku zahvalnost upućujem recenzentima prof. dr. sc. Nadi Vrkić, prof. dr. sc. Mirku Koršiću i prof. dr. sc. Željku Romiću za bezrezervnu stručnu pomoć kojom je tekst ove knjige poboljšan.

Zahvaljujem prof. dr. sc. Nadi Božini za konstruktivne kliničke savjete i podršku.

Veliku zahvalnost izražavam prof. dr. sc. Igoru Andreisu koji je pročitao i unaprijedio cijeli rukopis.

Zahvaljujem Medicinskoj nakladi koja je objavila udžbenik, posebice direktorici i glavnoj urednici gospođi Anđi Raič, prof., te gospodinu Marku Habušu, grafičkom uredniku, koji je s velikim entuzijazmom i pažnjom oblikovao tekst i izvršio komplicirani postupak slaganja tablica, slika i fotografija.

Prijedlozi studenata također su pomogli oblikovanju ovog izdanja. Zahvalna sam im za sve konstruktivne ideje i zapažanja čime su knjigu učinili boljom.

Zagreb, 3. ožujka 2014.

Jadranka Sertić

X |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 10

2.2.2015. 8:32:51

Pokrate Iva Jurčević

AA aplastična anemija (engl. aplastic anemia) AAM autoprotutijela protiv mijelina A1AT α1-antitripsin (engl. alpha-1 antitrypsin) ABC engl. ATP-binding cassettes ABS acidobazni status (engl. acid-base status) ACE enzim konverzije angiotenzina (engl. angiotensin-converting enzyme) AchR acetilkolinski receptor aCL antikardiolipinska protutijela (engl. anticardiolipin antibodies) ACS akutni koronarni sindrom (engl. acute coronary syndrome)

AG autoimunosni gastritis AGA antiglijadinska protutijela AGLM protutijela protiv glatke muskulature (engl. anti-smooth muscle antibodies) AH50 ukupna hemolitička aktivnost alternativno­g puta aktivacije komplement­a (engl. total alternative complement pathway hemolytic activity) AID heterologna inseminacija, arteficijalna inseminacija sjemenom donora (engl. artificial insemination by donor) AIDS sindrom stečene imunodeficijencije (engl. acquired immunodeficiency syndrome)

ACTH adrenokortikotropni hormon (engl. adrenocorticotropic hormone)

AIH autoimunosni hepatitis (engl. autoimmune hepatitis)

ADCC celularna citotoksičnost ovisna o protutijelima (engl. antibody-dependent cellular cytotoxicity)

AIH homologna inseminacija, arteficijalna inseminacija sjemenom supruga (engl. artificial insemination by husband)

ADH antidiuretski hormon ili vazopresin (engl. antidiuretic hormone ili vasopressin) ADP adenozin-difosfat (engl. adenosine diphosphate) ADR adiponektinski receptor (engl. adiponectin receptor) ADR nuspojava lijeka (engl. adverse drug reaction) ADRB2 b2-adrenergički receptor (engl. beta-2 adrenergic receptor) ADT deprivacijska androgenska terapija (engl. androgen deprivation therapy) AFP α-fetoprotein (engl. alpha-fetoprotein) AG anionski procijep (engl. anion gap)

AIHA autoimunosne hemolitičke anemije (engl. autoimmune hemolytic anemia) AKB anemija kronične bolesti (engl. anemia of chronic disease, ACD) AL akutna leukemija (engl. acute leukemia) ALA aminolevulinska kiselina (engl. aminolevulinic acid) ALCL anaplastični limfom velikih stanica (engl. anaplastic large cell lymphoma) ALK kinaza anaplastičnog limfoma (engl. anaplastic lymphoma kinase) ALL akutna limfocitna leukemija (engl. acute lymphoblastic leukemia ili acute lymphocytic leukemia)

| XI

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 11

2.2.2015. 8:32:51

UKPDS engl. United Kingdom Prospective Diabete­s Study UNESCO engl. United Nations Educational, Scientific and Cultural Organisation UZV ultrazvuk VAPB engl. vesicle-associated membrane protein VC vitalni kapacitet (engl. vital capacity) VEGF faktor vaskularnoga endotelnog rasta (engl. vascular endothelial growth factor)

WAS Wiskott-Aldrichov sindrom (engl. Wiskott-Aldrich syndrome) WB Western blot WB Wilsonova bolest (engl. Wilson’s disease) WG Wegenerova granulomatoza WHR omjer opsega struka i opsega bokova (engl. waist to hip ratio) WMDA engl. World Marrow Donor Association wt “divlji� (izvorni) oblik (engl. wild type)

VKOR vitamin K epoksid reduktaza (engl. vitamin K epoxide reductase)

XLA spolno vezana agamaglobulinemija (engl. X-linked agammaglobulinaemia)

VKORC1 kompleks vitamin K-epoksid reduktaze, podjedinica 1 (engl. vitamin K epoxide reductase complex subunit 1)

XLP spolno vezani limfoproliferativni sindro­m (engl. X-linked lymphoproliferative syndrome)

VLDL lipoproteini vrlo male gustoće (engl. very low-density lipoproteins) VLDLR VLDL receptor VZV virus varicella zoster (engl. varicella zoster virus) VWF von Willebrandov faktor (engl. von Willebrand factor)

ZEA zearalenon (engl. zearalenone) ZNF9 zinc finger protein 9 χ2 Hi kvadrat (engl. Chi square) φ Phi koeficijent asocijacije dvije neovisne, binarne varijable

XXIV |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 24

2.2.2015. 8:32:52

Sadržaj

Dio I.

Molekularna dijagnostika, klinička kemija i laboratorijska medicina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Poglavlje 1. Molekularna dijagnostika – personalizirana dijagnostika (Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Poglavlje 2. Farmakogenomika (Nada Božina). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Poglavlje 3. Medicinska etika u svjetlu personalizirane medicine (Jasenka Markeljević) . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Poglavlje 4. Strateško planiranje: Neodgodiva potreba kliničkog laboratorija (Jocelyn M. B. Hicks). . . . . . 26 Poglavlje 5. Klinička kemija – pouzdanost laboratorijskih pretraga (Dubravka Čvorišćec). . . . . . . . . . . . . . . 31 Poglavlje 6. Kliničkolaboratorijske korelacije (Ivo Radman, Marijo Vodanović). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Dio II. Laboratorijska dijagnostika najčešćih bolesti metabolizma, kardioloških i neuroloških poremećaja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Poglavlje 7. Dislipidemije i prevencija kardiovaskularnih bolesti (Željko Reiner). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Poglavlje 7.1. Fenotipizacija lipoproteina i apoproteini (Željka Vogrinc). . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Poglavlje 7.2. Molekularni temelji hipertrigliceridemije (Daria Pašalić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Poglavlje 8. Prekomjerna tjelesna masa i debljina (Jasna Lovrić, Ivana Karmelić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Poglavlje 9. Biokemijski i genski biljezi ateroskleroze (Jadranka Sertić, Tamara Božina, Antonela Bazina, Jasna Lovrić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Poglavlje 10. Metabolički sindrom i nutrigenomika (Tamara Božina, Jasna Lovrić, Jadranka Sertić). . . . . . . . 87 Poglavlje 11. Osnovni pojmovi statističke analize podataka u medicini (Žarko Bajić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Poglavlje 12. Akutni koronarni sindrom (Boško Skorić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 Poglavlje 13. Fibrilacija atrija (Anton Šmalcelj, Karlo Golubić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Poglavlje 14. Moždani udar (Zdravka Poljaković). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Poglavlje 15. Laboratorijska dijagnostika likvora (Milica Trbojević-Čepe, Željka Vogrinc). . . . . . . . . . . . . . . . . 124

Dio III. Odabrana poglavlja iz molekularne dijagnostike neuroloških i psihijatrijskih poremećaja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Poglavlje 16. Miotonična distrofija (Zoran Mitrović, Ana Merkler, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

| XXV

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 25

2.2.2015. 8:32:52

Poglavlje 17. Huntingtonova bolest (Srđana Telarović, Hana Ljubić, Ivan Ćelić, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . 150 Poglavlje 18. Spinocerebelarne ataksije i Friedreichova ataksija (Srđana Telarović, Ljiljana Juričić, Petrana Brečić, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 Poglavlje 19. Sindrom fragilnog X-kromosoma (Feodora Stipoljev, Dalibor Karlović, Ivan Ćelić, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Poglavlje 20. Nasljedne polineuropatije Charcot-Marie-Tooth (Zoran Mitrović, Ljiljana Juričić, Ana Merkler, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Poglavlje 21. Progresivna mišićna distrofija Duchenne/Becker (Zoran Mitrović, Ana Merkler, Jadranka Sertić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Poglavlje 22. Spinalna mišićna atrofija (Srđana Telarović, Ljiljana Juričić, Ana Merkler, Jadranka Sertić). . . . 178

Dio IV. Laboratorijska dijagnostika imunoloških i plućnih bolesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Poglavlje 23. Laboratorijska imunodijagnostika autoupalnih i autoimunosnih bolesti (Branko Malenica, Ana Kozmar). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 Poglavlje 24. Sjögrenov sindrom (Jasenka Markeljević). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 Poglavlje 24.1. Neurološke komplikacije Sjögrenovog sindroma (Helena Šarac) . . . . . . . . . . 221 Poglavlje 25. Kronična opstruktivna plućna bolest i deficit a1-antitripsina (Marta Koršić, Danica Matišić, Jadranka Sertić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 Poglavlje 26. Acidobazna ravnoteža (Ana Vujaklija Brajković). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235

Dio V. Laboratorijska dijagnostika bolesti bubrega . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 Poglavlje 27. Kliničkobiokemijska dijagnostika bolesti bubrega (Danica Matišić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247 Poglavlje 27.1. Kronično zatajenje bubrežne funkcije – dijaliza i transplantacija (Ružica Šmalcelj). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 Poglavlje 28. Uloga endotelina-1 i dušikova oksida u patogenezi hipertenzije u bubrežnih bolesnika (Monika Tomić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 Poglavlje 29. Nefrotski sindrom (Danica Batinić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270

Dio VI. Laboratorijska dijagnostika bolesti jetre i gušterače . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 Poglavlje 30. Laboratorijska dijagnostika bolesti jetre (Daria Pašalić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 Poglavlje 31. Virusni hepatitis (Ivanka Mihaljević). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 Poglavlje 32. Nasljedna hemokromatoza (Iveta Šimić, Ana Merkler, Iva Jurčević, Jadranka Sertić). . . . . . . . . 303 Poglavlje 33. Wilsonova bolest (Mirjana Kalauz, Hana Ljubić, Srđana Telarović, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . 309 Poglavlje 34. Gilbertov sindrom (Jadranka Sertić, Lucija Šimetić, Iveta Šimić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 Poglavlje 35. Bolesti gušterače (Nadan Rustemović) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325 Poglavlje 36. Cistična fibroza (Duška Tješić-Drinković, Dorian Tješić-Drinković, Marija Zekušić, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334

Dio VII. Odabrana poglavlja iz laboratorijske endokrinologije. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345 Poglavlje 37. Primjena hormonskih pretraga u kliničkoj praksi (Saša Kralik Oguić, Vesna Kušec). . . . . . . . . 347 Poglavlje 38. Bolesti štitnjače (Darko Kaštelan) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 Poglavlje 39. Klinička biokemija šećerne bolesti (Marijana Vučić Lovrenčić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364 Poglavlje 40. Hiperglikemija u teškoj akutnoj bolesti (Ana Vujaklija Brajković). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373

XXVI |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 26

2.2.2015. 8:32:52

Poglavlje 41. Biokemijski i genomski biljezi koštanog sustava (Kristina Gotovac, Fran Borovečki). . . . . . . . 381 Poglavlje 42. Laboratorijski aspekti humane reprodukcije (Patrik Stanić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393 Poglavlje 42.1. Kromosom Y i neplodnost u muškarca (Irena Drmić Hofman, Davor Ježek, Livija Šimičević, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401

Dio VIII. Odabrana poglavlja iz onkologije solidnih tumora i laboratorijska dijagnostika. . . . 413 Poglavlje 43. Rak prostate (Marija Gamulin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 Poglavlje 44. Rak testisa (Marija Gamulin). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 Poglavlje 45. Rak jajnika (Višnja Matković). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425 Poglavlje 46. Rak dojke (Marija Gamulin). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430 Poglavlje 47. Rak pluća (Sanja Pleština). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436

Dio IX. Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze . . . . . . . . . 443 Poglavlje 48. Anemije (Ivo Radman, Marijo Vodanović). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445 Poglavlje 49. Tumori krvotvornog i limfnog tkiva (Igor Aurer). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Poglavlje 50. Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija (Danica Matišić). . . . . . . . . . . . . . . . . . 475 Poglavlje 51. Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija (Dragana Šegulja, Danica Matišić). . . . . . . . . . 485 Poglavlje 52. Citogenetičke metode u dijagnostici akutnih leukemija (Sanja Davidović-Mrsić, Ivana Franić Šimić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490 Poglavlje 53. Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti (Renata Zadro). . . . . . . . . . . . . . . . 501 Poglavlje 54. Primarne imunodeficijencije (Jadranka Kelečić, Ana Merkler). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507 Poglavlje 55. Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma (Drago Batinić). . . . . . . . . . . . . . 521 Poglavlje 56. Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze (Désirée Coen Herak, Marija Miloš). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533 Poglavlje 57. Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja (Silva Zupančić Šalek). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 547 Poglavlje 58. Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica (Branka Golubić Ćepulić, Ines Bojanić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553

Dio X. Laboratorijska dijagnostika psihijatrijskih poremećaja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561 Poglavlje 59. Laboratorijska dijagnostika psihijatrijskih poremećaja (Dalibor Karlović) . . . . . . . . . . . . . . . . . 563 Poglavlje 60. Poremećaji metabolizma porfirina (Mila Lovrić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575

Dio XI. Laboratorijska toksikologija, farmakologija i prehrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583 Poglavlje 61. Laboratorijska dijagnostika akutnog otrovanja (Mila Lovrić, Zdenka Lalić, Paula Granić). . . . 585 Poglavlje 62. Imunosupresivni lijekovi: određivanje i značenje u bolesnika s presađenim tkivima i organima (Paula Granić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 601 Poglavlje 63. Obrada pacijenata s alergijama na lijekove (Robert Likić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 607 Poglavlje 64. Klinička prehrana (Ivančica Delaš) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613 Poglavlje 65. Ljudski imunoglobulini kao farmaceutski pripravak i klinička primjena intravenskih imunoglobulina (Mirjana Šimić, Dražen Pulanić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623

| XXVII

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 27

2.2.2015. 8:32:52

Poglavlje 66. Mikotoksikoze u ljudi i biljezi izloženosti mikotoksinima (Maja Peraica, Dubravka Rašić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633 Poglavlje 67. Mikronukleus-test (Nevenka Kopjar). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 641 Poglavlje 68. Komet-test i primarna oštećenja genetičkog materijala u kliničkoj primjeni (Davor Želježić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 655

Dio XII. Laboratorijska medicina – odabrani primjeri laboratorijskih nalaza (Slučajevi za studente) (Jadranka Sertić, Domagoj Marijančević, Tamara Božina, Dražen Pulanić). . . . . . 671 Kazalo pojmova (Zrinko Šalek, Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 699

XXVIII |

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 28

2.2.2015. 8:32:53

DIO I. Molekularna dijagnostika, klinička kemija i laboratorijska medicina

Poglavlje 1.

Poglavlje 2.

Poglavlje 3.

Poglavlje 4.

Poglavlje 5.

Poglavlje 6.

Molekularna dijagnostika – personalizirana dijagnostika (Jadranka Sertić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Farmakogenomika (Nada Božina). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Medicinska etika u svjetlu personalizirane medicine (Jasenka Markeljević). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Strateško planiranje: Neodgodiva potreba kliničkog laboratorija (Jocelyn M. B. Hicks). . . . . . . . . . . . . . . . 26 Klinička kemija – pouzdanost laboratorijskih pretraga (Dubravka Čvorišćec). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Kliničkolaboratorijske korelacije (Ivo Radman, Marijo Vodanović). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

1

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 1

2.2.2015. 8:32:53

nutrigenomike i bioinformatike daju temeljnu mogućnost za razuGENSKI BILJEZI: SVE VEĆI UTJECAJ U LABORATORIJSKOJ MEDICINI mijevanje molekularne osnove zdravlja i promicanje razumijevanja projekt humanog genoma etiopatogeneze složenih bolesti. To znači i povećano razumijevanje molekularne osnove bolesti mogućnost otkrivanja genskih i biokemijskih genetika genomika proteomika: nove mogućnosti biljega u nastanku i moduliranje rizičnih čimbenika multifaktorpredviđanje nastupa bolesti predviđanje povrata bolesti skih bolesti, kao što je dislipidemija, šećerna bolest, ateroskleroza, PERSONALIZIRANA procjena odgovora na liječenje MEDICINA hipertenzija i debljina, pri čemu poznavanje zajedničkih signalnih mreža varijabilnih Slika 1.1. Humani genom i personalizirana dijagnostika i terapija. gena lipidnog profila, inzulinske rezistencije, čimbenika imunosti, upale i nuklearnih receptora predstavlja privlačne Pristup zdravstvenoj skrbi 20. stoljeća razvio se namolekularne ciljeve i otvara novo područje liječe- kon uvođenja znanosti poput fiziologije, kemije, nja. Molekularni biljezi imaju također prediktivni i imunologije, mikrobiologije i radiologije u medicini prognostički značaj u tumorima, prepoznavanju mo- i uključuje identificiranje osnovnog uzroka bolesti te guće nasljedne predispozicije u onih s pozitivnom njegovo uklanjanje. obiteljskom anamnezom, omogućivši tako primjere- Prospektivni pristup vezan je uz nove znanosti niju prevenciju i rano otkrivanje bolesti u njihovih (-omics) u medicini: genomiku, proteomiku, metajoš zdravih srodnika. Značaj molekularne karakteri- bolomiku, molekularnu dijagnostiku i mogućnost zacije tumora analizom biljega stanične proliferacije predikcija rizika, praćenja napredovanja bolesti, posebno je velik u razvoju i primjeni ciljane biološ- predviđanje kliničkih događaja te omogućuje persoke terapije kod nasljednog karcinoma kolona, pluća, naliziranu, prediktivnu i preventivnu skrb što znači melanoma i leukemija. Pozitivna primjena navede- prevenciju i minimalizaciju bolesti. nih otkrića i poznavanje personaliziranog genoma Molekularnom dijagnostikom dobivaju se informapomaže u kreiranju genomskih karti i profila iz kojih cije za pacijente i liječnike kao holistički pristup i će se moći očitati protektivni i rizični DNA biljezi, norma modernog doba genomike, proteomike i kumulativni učinci, genomska heterozigotnost, inte- nutrigenomike uključujući i medicinsku etiku. Nurakcije gena međusobno, gena i vanjskih čimbenika, kleinske kiseline DNA i RNA su živi stanični jezik kao što je prehrana te predodređenost za složene koji se odaziva i na stil života i okolišne čimbenike bolesti kao što su metabolički sindromi i kardio-ce- regulacijom gena, a genom sadrži informacije života rebrovaskularni poremećaji s ciljem prevencije u kao biološki kôd naše prošlosti, sadašnjosti i bunekim segmentima. dućnosti.

4 | Molekularna dijagnostika, klinička kemija i laboratorijska medicina

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 4

2.2.2015. 8:32:53

Poglavl je

4.

Strateško planiranje: Neodgodiva potreba kliničkog laboratorija Jocelyn M. B. Hicks

Zašto je strateško planiranje neophodno za klinički laboratorij? Tu postoji nekoliko razloga koji više-manje uključuju činjenicu da se pristup zdravstvenoj njezi neprekidno mijenja s upoznavanjem uzroka bolesti, napretkom tehnologije i zahtjevima za naknadu bez obzira jesu li vezani za državu ili privatne osiguranike.

Strateško planiranje omogućuje voditelju laboratorija da se usredotoči na važne potrebe laboratorija i posveti pažnju vanjskom okolišu. Također omogućuje razvoj budućih ciljeva i postavljanje rokova unutar kojih se ti ciljevi trebaju realizirati.

Strateški se plan određuje kao razvoj metoda i rokova na osnovu kojih se ostvaruje vizija za budućnost. Definicija vizije podrazumijeva jedinstvenu i idealnu sliku budućnosti koja određuje standarde izvrsnosti koje treba postići.

Kod strateškog planiranja vrlo je važno uključiti sve razine osoblja radi lakšeg usvajanja procesa. Svi segmenti tvrtke, direktori, rukovoditelji, nadzornici, tehnolozi i pomoćno osoblje moraju biti uključeni. Zadnje dvije kategorije osoblja često shvaćaju operativne probleme i sposobni su predlagati kreativna rješenja jer su svakodnevno uključeni u radni proces.

U smislu provedbe strateškog planiranja nužno je očuvati temeljne vrijednosti i svrhu neke operacije te modificirati samo načine i izvedbenu praksu. Slika 4.1. prikazuje korake razvoja strateškog plana.

TEMELJNE ODREDBE RAZVOJA (engl. MISSION STATEMENT) Jednogodišnji plan Nakon razvijanja adekvatnih temeljnih odredbi razvoja, preporučuje se osmisliti jednostavan jednogodišnji plan koji se lako može procijeniti u smislu pronalaženja uzroka uspjeha ili neuspjeha. Primjeri su poboljšanje vremena obrade hitnih pretraga ili uvođenje ili poboljšanje dijagnostičke učinkovitosti. Kako su hitne

26

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 26

2.2.2015. 8:32:54

Za potonje je potrebno kraće vrijeme jer ne uključuje centrifugiranje.

strateški plan

Vizija

osmišljavanje vizije za sljedećih 3-5 godina

Nakon uspješnog ostvarenja jednogodišnjeg plana, potrebno je odrediti daljnje prioritete poput akreditacije, sigurnosti, programa dodatne izobrazbe i financijskog plana.

osmišljavanje jednogodišnjeg plana određivanje temeljnih odredbi razvoja

Akreditacija Najprije treba razmotriti vremenske rokove. Dvije godine se čini razuman rok.

Slika 4.1. Koraci razvoja strateškog plana.

pretrage vrlo važne bolesnicima, liječnicima i ostalim zdravstvenim djelatnicima, to može biti logični jednogodišnji cilj.

Drugi cilj mogao bi biti poboljšanje kvalitete odgovaranja na telefonske pozive stranaka unutar laboratorija. Na telefon se valja javiti brzo, najkasnije nakon četiri signala za poziv, operater treba predstaviti sebe i laboratorij te ponuditi pomoć tipa “Mogu li Vam nekako pomoći?�.

Vraćajući se na hitne pretrage bitno je prvo objasniti pojam “stat testing� (hitne pretrage). Izraz potječe od latinske riječi “statim�, što znači odmah i odnosi se na hitne laboratorijske pretrage čije rezultate treba liječnik radi optimalne bolesničke skrbi. Kod ocjene učinkovitosti Vašeg laboratorija prvo treba odrediti prosječno vrijeme između uzimanja uzoraka i dobivanja rezultata. To se vrijeme može kretati od 30 minuta do više od 2 sata. U slučaju potonjeg valja provjeriti svaku fazu procesa kako bi se otkrio zastoj. Kašnjenje može nastati zbog nepravovremene dostave uzoraka u laboratorij, nedovoljno brzog unošenja rezultata u računalo, neodvajanja hitnih od manje hitnih nalaza, neodvajanja uzoraka za centrifugu, nepravovremene dostave u prostor za obradu uzoraka, neobjavljivanja rezultata na vrijeme, nejavljanja rezultata liječniku itd. Kod ispitivanja tih problema vrijeme od uzimanja uzoraka elektrolita do dobivanja rezultata ne smije biti dulje od 45 min, a vrijeme za potpunu analizu krvi ne smije biti dulje od 32 min.

Razmislite koju bi vrijednost akreditacija donijela Vašem laboratoriju. Nadzor stručnih, kompetentnih osoba uz izobrazbu i rad prema priznatim međunarodnim normama znači veliki korak naprijed u Vašoj usluzi bolesnicima. S druge strane, akreditacija Vašem osoblju donosi osjećaj postignuća i pouzdanja, čime se vremenom dodatno poboljšava rad laboratorija.

Nužno je donijeti odluku o izboru akreditacijskog sustava. Izbor će najvjerojatnije biti dio sustava ISO. Ipak, sustav Zbora patologa (the College of Pathologists (CAP)) je također u uporabi u nekim dijelovima svijeta. Svaki program akreditacije sadrži čitav niz zahtjeva, poput kompetentnosti rukovodstva i osoblja, redoslijeda i opisa radnih postupaka, sigurnosti na radu itd.

Za laboratorij je ključno odrediti osobu koja će na najbolji način predvoditi postupak akreditacije. Po mom mišljenju za to je najprikladniji predstojnik laboratorijske medicine uz pomoć iznimno predanog i organiziranog koordinatora. Te se dvije osobe trebaju redovito sastajati. Osim toga treba postojati Akreditacijski odbor sastavljen od voditelja raznih odjela, npr. transfuzijske medicine, hematologije, kliničke kemije, toksikologije, mikrobiologije/virologije, kao i citogenetike i molekularne dijagnostike.

Sigurnost Poboljšanje sigurnosti je još jedan moguć i izuzetno važan cilj. Mora se imati u vidu sigurnost osoblja u laboratorijima, sigurnost bolesnika, posjetitelja i okoliša.

Strateško planiranje: Neodgodiva potreba kliničkog laboratorija | 27

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika1.indd 27

2.2.2015. 8:32:54

slaganje da je upala krvožilne stijenke ključni čimbenik u razvoju ateroskleroze, nestabilnosti ateroma, te kidanja naslaga praćenih lokalnom trombozom koji je u osnovi kliničke prezentacije akutnih koronarnih sindroma. Kronična endotelna disfunkcija ima bitnu ulogu u aterogenezi i mogla bi biti najranija dokaziva abnormalnost. Rizični čimbenici bilo akutni (infekcije, imunosne lokalne reakcije) bilo stalni (hipertenzija, oksidacijski stres, dijabetes, dislipidemija, debljina, hiperhomocisteinemija, pušenje itd.) izazivaju endotelnu disfunkciju, ozljedu stanice te proupalnu okolinu koja rezultira lokalnim imunosnim reakcijama kao i aktivaciju posredovanu tkivnim faktorom kaskade zgrušavanja. U ateromskoj okolini prokoagulacijske i antikoagulacijske sile određuju stvaranje naslaga zajedno s pro/antifibrinolitičkim čimbenicima. Specifičnije rečeno, postalo je jasno da imunosni sustav ima vodeću ulogu u razvoju i napredovanju ateroskleroze. Postoje definirani autoantigeni kao što su oksidirani LDL i b2-glikoprotein-I (apoH) u

ranoj fazi ateroskleroze, a dokazano je da imunosni odgovor posredovan T-stanicama unutar ateroma i sistemski pospješuje aterogenezu. Rizični biljezi ateroskleroze su biljezi upale, faktori rasta, interleukini IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-1a, IL-1b, VEGF, EGF, IFN-g, TNF-a i MCP-1, anti-oxLDL, hsCRP, HcT, LpPLA2 i biološki regulatori adipoznoga tkiva leptin i adiponektin. Koncept atero-upale izranja kao mjesto sastajanja različitih bolesti uključujući dislipidemiju, debljinu, hipertenziju, oksidacijski stres, dijabetes, autoimunost, infekcije, hiperhomocisteinemiju, prehranu i pušenje (slika 9.1.). Danas općenito postoji slaganje oko toga da je ateroskleroza upalna bolest: stvaranje naslaga iziskuje složeno međudjelovanje između komponenti imunosnoga sustava i izražaj različitih gena, a ne samo jednostavno nakupljanje lipida. Ima dokaza da su nuklearni receptori PPARa i g regulatori u metabolizmu lipida, homeostazi glukoze i upalnim procesima. Povezanost varijabilnih gena kao što su geni za ACE, ATR1, ApoB, ApoE,

vezanje proteina na LPL ligand PPAR

zadržavanje lipoproteina na izvanstaničnom matriksu

homocistein

proliferacija SMC ESR1, IL-8, ET1

MTHFR, selektin

ACE

VCAM MCP-1

oksidacijski stres, tromboza, apoptoza

lipoliza

HMG-CoAR kolagen i MMP

VLDLkatabolizam

kolesterol

Hiperlipidemijski učinak

ateroskleroza LDL

TNF-α Ang I

transaktivacija PPARα

NO

Ox LDL

Lp-PLA2

PPARγ CD36 Upalni izražaj gena IL-6

Slika 9.1. Homocistein je povezan s brojnim biokemijskim i genskim čimbenicima kao što su kolesterol, kolagen, HMG-CoAR, IL-8, MMP, oLDL, TNF, VCAM, selektin, SMC, LPL, Lp-PLA2, PPAR, AngI, ACE, MCP-1, te oksidacijskim stresom, trombozom i apoptozom.

78 | Laboratorijska dijagnostika najčešćih bolesti metabolizma, kardioloških i neuroloških poremećaja

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika2.indd 78

2.2.2015. 8:35:27

FMR1 gen nalazi se u kromosomskoj regiji Xq27.3 i sadrži 17 eksona koji obuhvaćaju 38 kb genomske DNA. Produljenjem broja tripleta do pune mutacije iznad 200 dolazi do hipermetilacije CpG otoka i CGG ponavljanja unutar eksona 1 gena FMR1, čime dolazi do stišavanja transkripcijske aktivnosti i sinteze proteina.

FMR1 aleli se dijele prema broju umnoženih CGG troslovnih zapisa u eksonu 1 i metilacijskom statusu ponavljajuće regije u više skupina.

4. puna mutacija alela je iznad 200 ponavljanja i s aberantnom hipermetilacijom FMR1 promotorske regije. Sva muška djeca pokazuju blagi do teški oblik mentalne retardacije, dok je u 50% ženske djece prisutno intelektualno zaostajanje različitog stupnja.

Genotipizacija se provodi umnažanjem DNA fragmenata od interesa PCR–om, slijedi analiza rezultata

1. normalni (zdravi) aleli imaju od 5-44 ponavljanja 2. intermedijarni aleli imaju od 45-54 ponavljanja i potrebno je istaknuti da ne uzrokuju FRAXA; međutim 14% njih je nestabilno i može se proširiti u premutacijski alel kada se prenosi preko majke. Ne opisuju se slučajevi širenja u punu mutaciju, te rizik za sindrom fragilnog X-kromosoma nije značajno povišen u potomstvu.

3. premutacijski aleli imaju od 55 do 200 ponavljanja i žene koje ih nose imaju rizik rađanja djeteta sa sindromom fragilnog X-kromosoma.

U tako zahvaćenim obiteljima premutacija gena u majke često prelazi u punu mutaciju u djece jer navedeni troslovni zapisi u genu nisu stabilni, već su dinamični, te dolazi do njihove ekspanzije iz generacije u generaciju i anticipacije bolesti. Rizik da majčina premutacija prijeđe u punu mutaciju u potomstvu ovisi o broju ponavljajućih CGG tripleta. U nositelja premutacije 70-79 tripleta, rizik prelaska u pravu mutaciju iznosi 31%, dok u onih s 90-99 tripleta iznosi oko 80%. Duži CGG sljedovi dovode do ranije pojavnosti bolesti i teže kliničke slike. Muškarci koji nose premutaciju prenose je na sve svoje kćeri. Oni su tzv. prenositelji. U žena s premutacijskim alelima ekspresija određenih kliničkih osobitosti ovisi o procesu inaktivacije X-kromosoma, čime ih čini somatskim mozaicima.

Proces inaktivacije je nasumičan, gdje u jednoj stanici može doći do inaktivacije X-kromosoma s normalnim alelom, dok se u drugoj inaktivira mutacijski alel. U oko 4-6% žena s premutacijskim alelom i normalnim kariotipom dolazi do prijevremenog ulaska u menopauzu prije 40. godine.

1

2

3

4

5

6

7

Slika 19.2. Molekularna dijagnostika FRAXA (PCR/elektroforeza u agaroznom gelu/hibridizacija) – prikaz autoradiograma. 1, 2 i 4 – DNA ulomci s ekspandiranim alelima CGG>200; 3, 5 i 6 – CGG ulomci s normalnim brojem tripleta (zdravi aleli); 7 – molekularni standard.

Senka Škaro, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb.

Sindrom fragilnog X-kromosoma | 163

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika3.indd 163

2.2.2015. 8:35:51

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Slika 22.1. SMA PCR/RFLP: eksoni 7 i 8 gena SMN1 i SMN2; linija 4 – delecija eksona 7 gena SMN2; linija 10 – delecija eksona 8 gena SMN2, linija 1 i 7 – PCR produkt prije digestije restrikcijskim enzimom (Senka Škaro, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb).

troforezom. Za razliku od standardne višestruke PCR reakcije, MLPA koristi samo jedan par PCR početnica za sve svoje sonde, i to čini ovu metodu vrlo pouzdanom.

Osnovno za MLPA reakciju je da se PCR-om ne umnožava DNA uzorak već sonde koje su hibridizirane na DNA uzorak. Svaka MLPA sonda sasto-

ji se od dva oligonukleotida koji se trebaju vezati za susjedne krajeve ciljane DNA sekvencije u cilju ligacije. Nakon ligacije sonda postaje jedinstvena molekula koja se eksponencijalno umnaža za vrijeme PCR reakcije. Svaka pojedinačna sonda u smjesi MLPA sondi ima za posljedicu PCR reakcije ulomak jedinstvene duljine. PCR reakcijama testom

Slika 22.2. SMA - MLPA elektroferogram: SMA uzorak s 1 kopijom eksona 7 gena SMN1; plavi vršci ulomci DNA uzorka dobiveni kapilarnom elektroforezom, crvena strelica obilježava 1 kopiju eksona 7 gena SMN1 (Ana Merkler, Ljiljana Juričić, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb).

180 | Odabrana poglavlja iz molekularne dijagnostike neuroloških i psihijatrijskih poremećaja

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika3.indd 180

2.2.2015. 8:35:53

Tablica 23.12. Antineutrofilna citoplazmatska protutijela (ANCA) u sistemskim vaskulitisima.

Bolest

Autoprotutijelo

WG

C-ANCA

Autoantigen PR3

P-ANCA MPO MPA

C-ANCA PR3 P-ANCA MPO

iNCGN

C-ANCA PR3 P-ANCA MPO

CSS

C-ANCA PR3 P-ANCA MPO

PAN

C-ANCA PR3 P-ANCA MPO

Test

Osjetljivost (%)

Specifičnost (%)

IIF

80-90

95-98

ELISA, IB

85

98-100

IIF

3-20

81-94

ELISA, IB

10-20

81-94

IIF

35-45

92-97

ELISA, IB

26

86-89

IIF

45-65

94

ELISA, IB

58

99

IIF

30-40

95

ELISA, IB

50

86-89

IIF

45-65

81

ELISA, IB

64

91

IIF

14-33

94

ELISA, IB

33

94

IIF

33-42

94

ELISA, IB

50

99

IIF

5-10

ELISA, IB

5

IIF

5-30

ELISA, IB

38

WG-Wegenerova granulomatoza, MPA-mikroskopski poliangiitis, iNCGN-idiopatski sklerozirajući glomerulonefritis, CSS-Churg-Straussov sindrom, PAN-nodozni poliarteritis

klinička sumnja na sistemski vaskulitis

IIF-granulociti (etanol)

titar autoAb

C-ANCA

P-ANCA

PR3/MPO-ELISA

titar autoAb

PR3-ANCA

MPO-ANCA

WG MPA CSS

MPA WG CSS

IIF-granulociti (formaldehid)

C-ANCA

ANA (HEp-2)

a-ANCA

ANA

Slika 23.5. Shema imunodijagnostičkog postupka pri sumnji na sistemski vaskulitis.

204 | Laboratorijska dijagnostika imunoloških i plućnih bolesti

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika4.indd 204

2.2.2015. 8:36:06

A

e

f

c-ANCA

B

e

f

P-ANCA

C

e

f

a/p-ANCA Slika 23.6. Karakteristični obrasci imunofluorescencije ANCA na etanolom (e) i formaldehidom (f) fiksiranim ljudskim granulocitima: A-zrnasta fluorescencija citoplazme s izrazitom fluorescencijom jezgrinih septuma - C-ANCA; B-intenzivna perinuklearna fluorescencija s vrlo slabom fluorescencijom središnjeg dijela jezgre (e) - P-ANCA i grubo zrnasta fluorescencija citoplazme s izrazitom fluorescencijom jezgrinih septuma koja se vidi na formaldehidom fiksiranim granulocitima (f) i C-izrazita (atipična) perinuklearna fluorescencija jezgre (e)-a/P-ANCA i negativna fluorescencija na formaldehidom fiksiranim granulocitima (f). (Ana Kozmar, Nevenka Živković, Klinička jedinica za humoralnu imunodijagnostiku, KBC Zagreb)

karakteristična za autoimunosne bolesti koje su često udružene s PBC kao što su Raynaudova bolest, sika sindrom, reumatoidni artritis (RA), autoimunosni tiroiditis i skleroderma (osobito CREST oblik).

Za razliku od PBC, autoimunosni hepatitis (AIH) karakteriziraju AGLM, LKM, LC, SLA/LP, ANA i a/P-ANCA protutijela (tablica 23.13.). Na temelju nalaza stanovitih autoprotutijela AIH se klasificira u tri tipa. AIH tip 1 karakteriziraju ANA, AGLM i a/PANCA. Nalaz ANA odlikuje visoka osjetljivost, visoki titar u testu IIF na HEp-2 stanicama i niska specifičnost. Ciljni autoantigeni su jezgrini lamini. Osim ANA, za AIH tip 1 karakteristična su i AGLM autoprotutijela.

Iako posjeduju iznimnu osjetljivost (95-100%), specifičnost im je osrednja. Visoki titar protutijela (>1:160) karakterističan je za aktivnu bolest. Nalaz aktina F u ELISA testu visoko je specifičan za AIH tip 1. a/P-ANCA su česta u bolesnika s AIH tip 1 (tablica 23.13.). Specifičnost im je niska jer se gotovo s jednakom učestalošću nađu i u bolesnika s ulceroznim kolitisom (UC) i primarnim sklerozirajućim kolangitisom (PSC; tablica 23.13. i 23.14.). Unatoč tome, diferencijalno dijagnostički su vrijedna jer ih selektivno nalazimo samo u bolesnika s AIH tip 1.

Autoprotutijela protiv mikrosoma jetre i bubrega - 1 (LKM-1) iznimno su osjetljiva i specifična za AIH tip 2 (tablica 23.13.). Ona dominantno prepoznaju epitop na citokromu P4502D6. Bez obzira što i ELISA i IB

Laboratorijska imunodijagnostika autoupalnih i autoimunosnih bolesti | 205

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika4.indd 205

2.2.2015. 8:36:06

YY 0,18 0,16

CC

fluorescencija –d(F2)/dT

0,14 0,12 0,10

CY

0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 –0,02 46,0

48,0

50,0

52,0

54,0

56,0

58,0

60,0

62,0

64,0

66,0

68,0

70,0

72,0

temperatura (°C) Slika 32.2. HH – molekularna dijagnostika; PCR u stvarnom vremenu (mutacija C282Y). Crvena linija s jednim vrhom krivulje taljenja na temperaturi oko 56°C – genotip CC; plava linija s dva vrha krivulje taljenja na temperaturama oko 56°C i oko 62°C – genotip CY; crna linija s jednim vrhom krivulje taljenja na temperaturi oko 62°C – genotip YY; zelena linija – slijepa proba (H2O), (Karolina Petrović, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb).

LIJEČENJE Liječenjem hemokromatoze treba nastojati odstraniti suvišno željezo u tijelu te pružiti potporne mjere liječenja oštećenih organa. Najjednostavniji, najučinkovitiji i najjeftiniji način odstranjivanja suvišnih količina željeza iz organizma su venepunkcije.

Liječenje treba započeti u svih bolesnika koji su homozigoti ili heterozigoti za HH, ili imaju fenotip za hemokromatozu bez obzira na genotip ako je feritin: 1) >200 µg/L u žene ili osobe mlađe od 18 godina i 2) >300 µg/L u muškarca. U prve dvije godine terapije potrebna je jedna venepunkcija tjedno po 500 mL krvi (500 mL krvi sadržava od 200 do 250 mg željeza), budući da se ukupno treba odstraniti 25 g željeza. Terapiju treba provoditi sve dok hematokrit ne padne ispod 37%, a tijek liječenja se prati uz pomoć laboratorijskih pretraga hematokrita, feritina i transferina. Mlađi bolesnici mogu podnijeti i 2-3 venepunkcije tjedno.

S ciljem praćenja terapijskog odgovora preporučuje se provjeriti zasićenje transferina i koncentraciju feritina

u serumu svaka 2 do 3 mjeseca, dok se hematokrit određuje prije svake sljedeće venepunkcije. Kada se zalihe željeza iscrpe, odnosno kada vrijednosti feritina padnu ispod 50 µg/L uz zasićenje transferina ispod 50% indicirana je venepunkcija održavanja od jedne doze pune krvi (500 mL) svaka 2 do 3 mjeseca.

U bolesnika s anemijom ili hipoproteinemijom primjenjuje se kelirajući agens deferoksamin. To je tvar koja povećava izlučivanje željeza urinom u svrhu mobilizacije željeza iz parenhimnoga tkiva. Primjenjuje se parenteralno i dnevno omogućuje uklanjanje 10 do 20 mg željeza, dakle manje od količine željeza koja se ukloni venepunkcijom jednom tjedno. Bolesnicima se također savjetuje izbjegavanje hrane koja sadrži veće količine željeza (špinat, kiseli kupus, iznutrice, jetra, krvavice, žumanjak).

Prognoza ove bolesti ovisi o stadiju kada je bolest dijagnosticirana. U simptomatskih bolesnika bez znakova ciroze jetre, primjena odgovarajuće terapije znatno produljuje preživljenje, međutim u kasnijim stadijima preživljenje ovisi o razvoju komplikacija ciroze jetre.

Nasljedna hemokromatoza | 307

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika6.indd 307

2.2.2015. 8:36:37

C

A

G T

G

A

A

C

A

C/A

C

C

C

T

T

G

G

G

C

G

T

G

G

C

A

G

Slika 33.2. Elektroferogram dijela sekvencije eksona 14 gena ATP7B s mutacijom promjene smisla, c.3207C>A, p.His1069Gln u heterozigotnom statusu. Strelica pokazuje mjesto zamjene baze citozin u adenin u jednom alelu, dok je drugi alel bez ove mutacije. Vrhovi različitih boja odražavaju slijed nukleotida u DNA. Crvena boja - dušična baza timin, crna boja - gvanin, zelena boja - adenin, plava boja - citozin (Hana Ljubič, Ana Acman Barišić, Klinička jedinica za laboratorijsku dijagnostiku, KBC Zagreb).

baze mutacija za WB, http://www.wilsondisease. med.ualberta.ca/database.asp. Patogenost mutacija promjene smisla koje do sada nisu bile prijavljene u bazu mutacija za WB moguće je i teoretski procjenjivati pomoću kompjutorskog programa PolyPhen2, verzija 2.2.2, no za pravi uvid u djelovanje novootkrivene varijante u DNA potrebna su detaljnija istraživanja, kao što je njena ekspresija u kulturi stanica tkiva, testovi komplementacije s kvascem itd.

Iako je mutacijska analiza gena ATP7B metodom sekvenciranja dugotrajna i skupa, napredovanjem laboratorijskih tehnika i prepoznavanjem sve većeg broja patogenih mutacija genetičko testiranje postalo je sastavni dio dijagnostičkog algoritma za WB. Zbog veli-

kog broja mutacija zabilježenih u genu ATP7B, analiza sekvenciranjem najbolja je za molekularnu dijagnostiku WB, iako u genetički izoliranih populacija (npr.

Sardinija, dijelovi Kine, otočje Gran Canaria) mogu biti korisni tzv. specifični paneli dizajnirani u svrhu otkrivanja ograničenog broja mutacija karakterističnih upravo za tu populaciju. Naime, klinički spektar WB je vrlo širok, a postavljanje dijagnoze bolesti ne uvijek jednostavno, osobito u jetrenih bolesnika, stoga su mutacijske analize iznimno važne u bolesnika s atipičnom kliničkom slikom i dvojbenim laboratorijskim nalazima. U njih mutacijska analiza može definitivno potvrditi dijagnozu što znači pravovremeni početak liječenja i dobru prognozu. Budući da je WB autoso-

314 | Laboratorijska dijagnostika bolesti jetre i gušterače

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika6.indd 314

2.2.2015. 8:36:38

Poglavl je

34.

Gilbertov sindrom Jadranka Sertić, Lucija Šimetić, Iveta Šimić

Gilbertov sindrom (Meulengrachtova bolest), poznat kao obiteljska nehemolitička žutica, je nasljedna bolest jetre koja rezultira porastom vrijednosti nekonjugiranog bilirubina u krvi.

To je ujedno i najčešći nasljedni poremećaj glukuronidacije bilirubina. Bolest se češće javlja u nekim obiteljima, iako se ponekad može javiti i u izoliranim slučajevima.

Značajke sindroma su blaga nekonjugirana hiperbilirubinemija te odsutnost konjugirane bilirubinemije, hemolize ili funkcionalnog poremećaja jetre. Bolest je karakterizirana intermitentnim epizodama žutice koje mogu biti uzrokovane dehidracijom, gladovanjem, interkurentnim bolestima ili menstruacijom.

Prema dostupnim literaturnim podatcima prevalencija Gilbertovog sindroma u populaciji je između 4 i 16%.

Klinička slika se u potpunosti razvije tijekom puberteta, kada koncentracija steroidnih hormona djeluje na metabolizam bilirubina, uzrokujući povećanje koncentracije bilirubina u krvi. Zbog toga, bolest se rijetko dijagnosticira prije puberteta. Bolest se češće javlja u muškaraca, nego u žena (2-7:1), vjerojatno kao posljedica produkcije većih količina bilirubina.

Gilbertov sindrom nastaje kao posljedica genskog poremećaja u promotorskoj regiji gena koji kodira enzim uridin difosfat glukuronil transferazu 1A1 (UGT 1A1), koja je odgovorna za konjugaciju bilirubina s glukuronskom kiselinom. Osnovni poremećaj metabolizma bilirubina sastoji se u smanjenju jetrenog klirensa bilirubina zbog smanjenog transporta i/ili konjugacije bilirubina.

KLINIČKA SLIKA Većina bolesnika s Gilbertovim sindromom se prezentira s recidivirajućim epizodama blage intermitentne žutice, prvenstveno kao posljedica nekonjugirane hiperbilirubinemije. Vrijednosti bilirubina u pravilu ne prelaze 103 μmol/L. Između ataka bolesnici imaju skoro uredne vrijednosti bilirubina. Iako većina bole-

320

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika6.indd 320

2.2.2015. 8:36:38

snika nema nikakvih simptoma, u manjeg broja se može javiti niz nespecifičnih simptoma poput mučnine, proljeva, umora, smanjenja apetita, neugode u abdomenu ili osjećaja težine u abdomenu koji su neovisni o vrijednostima bilirubina u krvi. Fizikalni pregled je obično u potpunosti uredan, osim ikteričnih bjeloočnica tijekom epizoda žutice. Epizode mogu biti uzrokovane i vanjskim čimbenicima kao što su: fizički napor, gladovanje, stres, umor, menstruacija, hemoliza ili febrilna stanja.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA – KLINIČKA KEMIJA

CH3 N

N

Molekularna dijagnostika potvrđuje dijagnozu (slika 34.2.). Histološki se ne nalaze veće promjene jetrenog tkiva, osim nakupljanja lipofuscina u hepatocitima i hipertrofija endoplazmatskog retikula.

O N

C N

O

O O CH2CH3

HO

irinotekan

CES

CH3 H

CH2

O

O N

U laboratorijskim pretragama nalaze se povišene vrijednosti nekonjugiranog bilirubina.Vrijednosti konjugiranog bilirubina su skoro uvijek normalne, kao i vrijednosti krvne slike, retikulocita, transaminaza i alkalne fosfataze. U 40% bolesnika s Gilbertovim sindromom javlja se blaga hemoliza bez anemije, te se nalaze povišene vrijednosti urobilinogena u urinu.

Definitivna dijagnoza se može postaviti kontinuiranim praćenjem bolesnika i laboratorijskih nalaza kroz 12-18 mjeseci. Test gladovanja se danas rjeđe koristi, a pozitivnim se smatra u slučaju da dođe do porasta vrijednosti nekonjugiranog bilirubina za dva do tri puta od početnih u bolesnika koji su kroz 24 sati bili na dijeti od 400 kcal bez masti. Nikotinski test i fenobarbitonski test se izuzetno rijetko primjenjuju.

CH2

O

N

O HO

O CH2CH3

SN-38

UGT

COOH OO H HO

OH H H

H

OH

CH3 CH2

O N

N

O HO

O CH2CH3

SN-38 glukuronid Slika 34.1. Prikaz metabolizma irinotekana. Enzim karboksilesteraza (CES) prevodi irinotekan u aktivni metabolit SN-38. Uridin difosfat glukuronil transferaza (UGT) u jetri vrši glukuronidaciju SN-38 i on se kao glukuronid izlučuje u žuč. U nedostatku aktivnosti UGT enzima raste koncentracija SN-38, koji je 100-1000 puta toksičniji od prolijeka irinotekana.

MOLEKULARNA GENETIKA I DIJAGNOSTIKA

raju glukuronidacijom) postaje topljiv u vodi i može se sa žuči izlučiti iz organizma.

Gilbertov sindrom posljedica je promjena u genu za uridin difosfat glukuronil transferazu (UGT). Ovaj enzim katalizira reakcije glukuronidacije, tijekom koje prenosi glukuronsku kiselinu na nekonjugirani bilirubin koji time prelazi u konjugirani oblik. Glukuronidacijom bilirubin (a i lijekovi koji se metabolizi-

UGT geni su podijeljeni u dvije obitelji – UGT1 (sadrži UGT1A gene) i UGT2 (sadrži UGT2A i UGT2B gene). UGT1A geni su locirani na kromosomu 2q37 i sadrže 13 eksona, UGT1A1 do UGT1A13. Za UGT1A2, UGT1A11, UGT1A12 i UGT1A13 postoje i pseudogeni. Zbog alternativnog prekrajanja na 3’

Gilbertov sindrom | 321

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika6.indd 321

2.2.2015. 8:36:38

Biljeg monoklonske sinteze lakih lanaca je poremećen omjer SLL κ/λ tipa i to povišen kod monoklonske sinteze SLL κ tipa odnosno snižen kod monoklonske sinteze SLL λ tipa.

elektroforeza proteina u serumu

vizualni pregled

klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce

bez promjena

BJP ?

kvantitativno određivanje SLL κ i λ u serumu/urinu te njihovog omjera κ/λ

imunofiksacija MP

definicija M-P (određ. razreda i tipa)

denzitometrijska kvantifikacija M-P opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Slika 50.2. Preporučeni laboratorijski dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina koji je danas u uporabi: nakon definiranja razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina imunofiksacijom izmjere se kvantitativno SLL te odredi κ/λ omjer.

Monoklonski SLL su važan tumorski biljeg za identifikaciju i praćenje bolesnika s multiplim mijelomom lakih lanaca i amiloidoze lakih lanaca. Međutim, treba naglasiti da istovremeni porast koncentracije SLL κ i λ tipa u normalnom omjeru, ne znači monoklonsku sintezu lakih lanaca iako su njihove pojedinačne vrijednosti patološke odnosno izvan referentnog intervala. Poliklonski porast lakih lanaca može biti znak nekog drugog upalnog procesa.

Kod raznih nemalignih bolesti, kao što su reumatoidni artritis, SLE i kronično bubrežno zatajenje, mogu se naći pozitivni SLL u povišenim vrijednostima. Visoke doze penicilina ili aspirina prije skupljanja 24-satnog urina mogu dati lažno pozitivan rezultat.

Uvođenje određivanja κ/λ omjera SLL u rutinu povećalo je kliničku važnost BJP-a i znatno skratilo cijeli postupak laboratorijske dijagnostike monoklonskih gamapatija.

Referentne vrijednosti i referentni intervali za κ/λ omjer u serumu i 24-satnom urinu određeni su na velikom broju ispitanika s različitim imunoproliferativnim bolestima. Istraživanje je provela grupa kliničkih kemičara na čelu s profesorom Robertom Kyle iz klinike Mayo. Test je tako uveden u rutinu prije 10-tak godina.

Prvi komercijalni test priredili su profesor Bradwell i njegov tim stručnjaka. Test je od Free Light Chain dobio skraćeno ime FLC koje ćemo često naći u literaturi.

Serumska koncentracija monoklonskih SLL tj. BJP korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg MG. Jedan posebno važan aspekt BJP je njihov kratak poluživot: 2-3 sata za kapa i 5-6 sati za lambda, što je 150 puta kraće vrijeme od 21 dana koliko je, primjerice, poluživot IgG. Tako koncentracija BJP omogućuje vrlo brzu procjenu učinka kemoterapije: 92-128 dana brže nego koncentracija M-Ig ali isto tako i raniju procjenu relapsa bolesti.

Koncentracija BJP ovisi o sintezi plazma-stanica, ali isto tako i o bubrežnom klirensu. Uz poliklonsku sintezu imunoglobulina i/ili bubrežnog oštećenja, naći ćemo 10-20 puta povećanu koncentraciju BJP u serumu. Bubrežno izlučivanje BJP raste s koncentra-

478 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika9.indd 478

2.2.2015. 8:37:19

cijom u serumu, ali značajno opada kada je visoka koncentracija kombinirana s bubrežnim oštećenjem.

Odlaganje BJP je izravno odgovorno za patološke procese tubulointersticijskog oštećenja. Nakon filtracije, BJP se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze i hidrolize BJP se vraćaju kao aminokiseline u cirkulaciju. BJP su otrovni zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona. Nefrotoksični potencijal BJP ovisan je o njihovom fizikalno-kemijskom sastavu kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze.

Sakupljanje 24-satnog urina nije standardizirani postupak, mukotrpno je za bolesnike i uglavnom netočno. Laboratorijski postupak evaluacije monoklonskog proteina znatno se produljuje zbog obrade urina. Stoga mnogi kliničari predlažu da se obrada 24-satnog urina ukloni iz primarnog postupnika za definiranje M-proteina.

Katzmann J. A. i Hill P. G. pokazali su na velikom broju bolesnika, u dvije odvojene studije, da zbog

oštećenja bubrega u približno 25% bolesnika s MG možemo naći lažno pozitivne nalaze BJP u serumu, odnosno lažno negativne u urinu.

Može se zaključiti da primjenjujući program određivanja ukupnih proteina u serumu, elektroforeze proteina u serumu, kvantitativnog određivanja SLL κ i λ tipa u serumu kao i njihovog omjera eliminiramo potrebu sakupljanja 24-satnog urina, što znatno skraćuje proces definiranja M-proteina. Mokraća će se obrađivati diskontinuirano, tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je Mprotein već identificiran.

Kao što je već navedeno, prvi korak za definiranje M-proteina je elektroforeza proteina u serumu. Danas najraširenija elektroforetska tehnika je kapilarna zonska elektroforeza (CZE), elektroforeza visoke djelotvornosti, koja je razvijena u ranim ‘90.-im godinama. Odvajanje analita bazirano je na veličini i naboju samog analita u unutrašnjosti kapilara koje su napravljene iz posebnih silaniziranih vrsta stakla negativno nabijenih, promjera 15-20 µm. Kapilare

Elektroforeza proteina u serumu

Frakcija

Rez %

Ref. int. %

Rez. g/L

Ref. int. g/L

Albumin Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma

39,7 2,8 7,7 6,5 43,3

55,8 - 66,1 2,9 - 4,9 7,1 - 11,8 8,4 - 13,1 11,1 - 18,8

36,9 2,6 7,2 6,0 40,3

40,2 - 47,6 2,1 - 3,5 5,1 - 8,5 6,0 - 9,4 8,0 - 13,5

93

(60 - 78)

Ukupni proteini: A/G:

0,66

(0,80 - 2,00)

Komentar:

Voditelj laboratorija: Slika 50.3. Elektroforeza proteina u serumu - nađen monoklonski protein (Marica Carić, Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 479

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika9.indd 479

2.2.2015. 8:37:20

LITERATURA Bradwell A. R. Serum Free Light Chain Analysis (plus Hevylite). The Binding Site Group Ltd. Birmingham 2013.

Katzmann JA. Screening Panels for Monoclonal Gammopathies: Time to Change. Clin Biochem Rev 2009;30:105-111.

Cockwell P, Hutchison CA. European trial of free light chain removal by extended haemodialysis in cast nephropathy. Hematology Meeting Reports 2008;2:17-18.

Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Gorevic PD, Kyle R, Tomar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of patiens with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:106-107

Goeken JA, Keren DF. Introduction to the report of the consensus conference on monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:104-105 Holding S, Spradbery D, Hoole R et al. Use of serum free light chain analysis and urine protein electrophoresis for detection of monoclonal gammopathies. Clin Chem Lab Med 2011;49:83-88.

Hutchison CA, Basnayake K, Cockwell P. Serum free light chain assessment in monoclonal gammopathy and kidney disease. Nature Reviews 2009;5:621-627.

Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of Crioglobulins.

Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-125

Lakshminarayanan R, Li Y, Jantpour K, Beckett L, Jialal I. Detection by Immunofixation of M Proteins in Hypogammaglobulinemic Patients With Normal Serum Protein Electrophoresis Results. Am J Clin Pathol 2007;127:746-751.

Matišić D. Nova strategija u dijagnostici monoklonskih gamapatija. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S22-S23.

Tatsas AD, Jagasia MH, Chen H, McCurley TL. High-Resolution Serum/Urine Electrophoresis or Marrow Biopsy With Immunohistochemical Analysis? Am J Clin Pathol 2010;134:139-145.

Pitanja i odgovori 1. Koji su osnovni kriteriji dijagnostike monoklonskih gamapatija?

Nalaz monoklonskog proteina u serumu i/ili urinu, infiltracija koštane srži plazma-stanicama (>10%), te nalaz osteolitičkih žarišta.

2. Koji je prvi korak u dijagnostici MG? Elektroforeza proteina u serumu.

3. Po čemu razlikujemo benigne od malignih MG? Benigna MG podrazumijeva koncentraciju M-proteina manju od 10 g/L, normalnu sintezu neuključenih imunoglobulina, negativan nalaz BJP u serumu i/ili urinu i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon nekoliko narednih godina. Malignu MG prati koncentracija M-proteina veća od 10 g/L, odsutnost sinteze ostalih neuključenih imunoglobulina, te pozitivan nalaz BJP u serumu i/ili urinu kod 80-96% bolesnika s multiplim mijelomom s intaktnim M-Ig. 4. Kojom metodom se može napraviti tipiziranje BJP? Za određivanje tipa BJP potrebno je napraviti imunofiksaciju najmanje 100× ukoncentriranog uzorka 24-satnog urina.

5. Što pokazuju rezultati desetgodišnjeg korištenja određivanja κ/λ omjera u serumu?

Rezultati pokazuju da bi se inicijalni probir laboratorijske dijagnostike MG trebao sastojati od elektroforeze proteina u serumu i κ/λ omjera u serumu.

484 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika9.indd 484

2.2.2015. 8:37:21

pozitivnog rezultata testiranja (potvrde kliničke dijagnoze), bitno je i genetičko savjetovanje nakon testiranja, da se detaljno razjasne rezultati provedene analize, da bolesnik shvati medicinske činjenice, dijagnozu, tijek bolesti, mogućnosti liječenja i da dobije informacije o raznim udrugama, zdravstvenim i socijalnim službama koje bi mu mogle koristiti.

G

G

T

G

T

Y

C

C

T

G

C

Prednosti molekularne dijagnostike u dijagnozi primarnih imunodeficijencija Molekularna dijagnostika pomaže liječniku u potvrđivanju kliničke dijagnoze, identificiranju novih i atipičnih prezentacija bolesti, postavljanju dijagnoze u novorođenčadi gdje konvencionalni dijagnostički testovi nisu pouzdani. Ovisno o utvrđenoj mutaciji moguća je lakša prognoza bolesti i odluka o tome da li je bolesnik pogodan za gensku terapiju. Moguće je učiniti presimptomatsko testiranje što pomaže u ranom prepoznavanju bolesti prije razvijanja simptoma. Isto tako molekularne analize se koriste u istraživanju i identifikaciji novih genskih poremećaja.

Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijencija obuhvaća skup testova i metoda koje kao glavni analit koriste DNA. DNA se može izolirati iz periferne krvi kojoj je dodan antikoagulans EDTA, iz amnijske tekućine ili iz korionskih resica.

G

A

G

C

A

T

G

A

G

A

T

Slika 54.2. Heterozigotna mutacija promjene smisla u bolesnika s autosomno-dominantnim oblikom neutropenije (označena crvenom strelicom) (Ana Merkler, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb).

Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijencija provodi se metodom sekvenciranja kodirajuće regije gena (eksona). To je metoda kojom se utvrđuje redoslijed nukleotida (A, T, G, C) u molekuli DNA. Najčešće korištena metoda sekvenciranja je Sangerova dideoksi-metoda.

G

A

G

C

A

T

G

A

G

A

T

Slika 54.3. Hemizigotna besmislena mutacija u bolesnika s X-vezanom agamaglobulinemijom (slika lijevo, označeno crvenom strelicom) i ista mutacija u majke bolesnika u heterozigotnom obliku (slika desno, označeno crvenom strelicom) (Ana Merkler, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku, KBC Zagreb).

Primarne imunodeficijencije | 515

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika9.indd 515

2.2.2015. 8:37:24

nja s antigenima koji su izazvali njihovu sintezu. Na temelju tih funkcijskih kriterija u protutijela je svrstana skupina heterolognih molekula koje pripadaju serumskoj frakciji g-globulina ili imunoglobulina. Plazma-stanice, koje su završni zreli oblik diferencijacije limfocita B, sintetiziraju protutijela i izlučuju ih u izvanstaničnu tekućinu. Tu se protutijela vežu s antigenom tvoreći imunokomplekse. Tako mogu neutralizirati toksine ili viruse, ali ne mogu izravno razoriti antigen.

Osnovnu jedinicu građe protutijela čine dva para istovrsnih polipeptidnih lanaca, koji se razlikuju po broju aminokiselina. Laki su lanci sastavljeni od oko 220, a teški od 440 aminokiselina. Sva četiri lanca (po dva jednaka laka i dva jednaka teška) povezana su međusobno disulfidnim vezama u osnovnu četverolančanu jedinicu (monomer). Laki se lanac sastoji od dviju imunoglobulinskih domena koje se nazivaju varijabilna domena (VL) i konstantna domena (CL).

Teški lanac svih razreda imunoglobulina sadržava po

Fab

VH VL

VH VL

CH CL

teški lanac

CL

laki lanac

Fc

Slika 65.1. Građa protutijela. Fab ulomci – specifično mjesto vezivanja antigena, sastoje se od cijelog lakog lanca i jednog dijela teškog lanca. Fc fragment – dio molekule koji određuje biološka svojstva protutijela neovisno o njegovoj specifičnosti za antigen.

VL-varijabilna domena lakog lanca, CL-konstantna domena lakog lanca, VH-varijabilna domena teškog lanca, CH-konstantna domena teškog lanca.

jednu varijabilnu domenu (VH) i tri (lgG, IgA, IgD) odnosno četiri (IgM, IgE) konstantne domene (CH).

Domene VL i VH nalaze se u N-terminalnom kraju fragmenta Fab i tvore vezno mjesto za antigen.

Molekula protutijela sastoji se od dva funkcijski i topološki različita dijela. Jedan dio protutijela obavlja funkciju prepoznavanja (fragment Fab), tj. specifičnog reverzibilnog vezanja s antigenom, a drugi (fragment Fc) efektornu funkciju, tj. aktiviranje obrambenih mehanizama i određivanje drugih bioloških svojstava neovisnih o specifičnosti.

Laki (L) i teški (H) lanci međusobno su povezani disulfidnim vezama u tetrapeptidnu jedinicu. Molekula nalikuje slovu Y. Gornji kraci su dva istovrsna fragmenta Fab na koje se vežu ukupno dvije molekule antigena, a donji dio je fragment Fc čija je funkcija aktiviranje obrambenih mehanizama te održavanje drugih bioloških svojstava neovisnih o specifičnosti.

Ljudski imunoglobulini kao farmaceutski pripravak Prikupljanje plazme za frakcionaciju Lijekovi proizvedeni iz ljudske krvi i plazme razlikuju se od ostalih lijekova iz dva važna razloga: potječu od ljudi i sastoje se od biološkog (potencijalno infektivnog) materijala. Poznato je da se neke zarazne bolesti mogu prenositi krvlju i lijekovima proizvedenim iz krvne plazme na što značajno utječe epidemiološki status populacije koja daje krv. Kako je epidemiologija zaraznih bolesti vrlo složena i nije ista u svim dijelovima svijeta, lako je moguće da se preparatima priređenim u jednom dijelu svijeta prenese uzročnik neke zarazne bolesti u drugi dio svijeta gdje ga inače nema. Iz tog razloga Vijeće Europe promiče, a Svjetska zdravstvena organizacija podržava tzv. načelo nacionalne samodostatnosti (Direktiva 39/381/EEC) po kojem bi svaka zemlja u pogledu krvi, krvnih pripravaka i derivata iz ljudske plazme bila samodostatna. Kvaliteta ljudske plazme za preradu je važan, ako ne i najbitniji čimbenik za dobivanje imunobiološkog preparata sigurnog glede prijenosa zaraznih bolesti.

Kvaliteta plazme svake pojedinačne donacije mora zadovoljavati propisane zahtjeve vrhunskih regulatornih agencija; SZO, European Pharmacopoeia i preporuke Vijeća Europe.

626 | Laboratorijska toksikologija, farmakologija i prehrana

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika11.indd 626

2.2.2015. 8:39:03

O

O

O

O

O

O O

O

O

aflatoksin B1 O

O

aflatoksin B2 O

O

O O

O

O

O

O

O O

O

O

aflatoksin G1 O

O

aflatoksin G2 O

OH O O

O

aflatoksin M1 Slika 66.1. Kemijske strukture najvažnijih aflatoksina.

adukata od onih koje nemaju mjerljivu koncentraciju AFB1-albuminskih adukata. Izloženost aflatoksinima je velika u tropskim krajevima gdje zbog siromaštva i/ili neorganiziranosti nadzora nad proizvodnjom hrane nije moguće smanjiti izloženost ljudi, prevencija nastanka HCC-a je cijepljenje protiv HBV-a u što ranijoj dobi. Cijepljenje protiv HBV-a već je u nekim dijelovima Afrike dalo pozitivne rezultate i smanjilo incidenciju HCC-a.

FUMONIZINI Fumonizini su skupina mikotoksina od 14 derivata osnovne strukture koja se sastoji od hidroksiliranog ugljikohidratnog lanca s metilnim i etilnim amino- i acetilnim grupama. Hranu najčešće kontaminiraju fumonizin B1 (FB1), B2 (FB2) i B3 (FB3). Najčešće se nalazi i najtoksičniji je FB1. FB1 se nalazi uglavnom na kukuruzu, a rjeđe na drugim žitaricama. Preradom kukuruza njegova se koncentracija smanjuje,

no ipak se može naći u pivu, kukuruznim pahuljicama i tortiljama. Rjeđe se nalazi na drugim žitaricama kao što je riža. Nađen je u Africi, Americi, Europi, Aziji i Oceaniji, a u više istraživanja provedenih u uzorcima kukuruza iz različitih krajeva Hrvatske gotovo su svi uzorci bili kontaminirani s niskim koncentracijama FB1.

Na pokusnim je životinjama nađeno da se FB1 slabo resorbira, ne metabolizira se, ne akumulira se i brzo se eliminira iz organizma. FB1 ima malu akutnu toksičnost u svim ispitivanim vrstama, a do sada je opisan samo jedan slučaj akutnih simptoma koji su pripisani djelovanju ovog mikotoksina. Radilo se o epidemiji u Indiji s abdominalnim bolovima i dijarejom koja nije imala smrtnih ishoda. Pri dugotrajnom izlaganju ovom mikotoksinu u različitim životinjskim vrstama ima vrlo različite toksične učinke. FB1 u konja uzrokuje leukoencefalomalaciju, u svinja hidrotoraks i edem pluća, a u glodavaca je hepatotoksičan i nefrotoksičan. Fumonizini su strukturno slični sfingoidnim bazama i njihova je toksičnost rezultat uplitanja u metabolizam sfingolipida inhibicijom ceramid-sintetaze, ključnog enzima njihovog metabolizma. Zbog inhibicije ceramid-sintetaze u organizmu dolazi do reverzibilnog nakupljanja supstrata tog enzima sfinganina (Sa) i sfingozina (So), a zatim i njihovih metabolita Sa- i So 1-fosfata. Do povećanja koncentracije Sa, So i Sa- i So 1-fosfata dolazi prije lezija bubrega i ovisi o dozi FB1 i duljini izloženosti zbog čega bi se mogli koristiti kao biljezi izloženosti ovom mikotoksinu. Nažalost, mjerenje tih parametara ima dosta ograničenja u epidemiološkim istraživanjima i njihova korisnost za tu svrhu nije dokazana.

FB1 je karcinogen za pokusne životinje pa ga je zbog nedostatnih epidemioloških istraživanja IARC svrstao u skupinu 2B (mogući karcinogen za ljude).

U dugotrajnim istraživanjima na pokusnim životinjama izloženost tom mikotoksinu uzrokuje nastanak jetrenih i bubrežnih tumora, ovisno o životinjskoj vrsti i soju. Primijećeno je da je u područjima gdje je osnovna (ili vrlo česta) hrana kukuruz i prerađevine od kukuruza (koji je često kontaminiran s FB1) vrlo velika učestalost karcinoma jednjaka. Međutim, epidemiološkim istraživanjima provedenim u Transkeiu

636 | Laboratorijska toksikologija, farmakologija i prehrana

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika11.indd 636

2.2.2015. 8:39:04

DIO XII. Laboratorijska medicina – odabrani primjeri laboratorijskih nalaza Slučajevi za studente

Jadranka Sertić, Domagoj Marijančević, Tamara Božina, Dražen Pulanić Akutni infarkt miokarda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 673 Kronično bubrežno zatajenje. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 675 Ciroza jetre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 678 Akutni pankreatitis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 680 Cushingov sindrom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 681 Kolorektalni karcinom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 683 Multipli mijelom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 685 Sideropenična anemija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 688 Akutna limfoblastična leukemija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 689 Kronična mijeloična leukemija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 690 Stečena hemofilija A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 691 Gilbertov sindrom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 693 Rabdomioliza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 696 Akutno trovanje psihotropnim lijekovima. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 697 Spinalna mišićna atrofija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 698

671

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika12.indd 671

2.2.2015. 8:39:17

AKUTNI INFARKT MIOKARDA Podatci o bolesniku: Muškarac, 70 godina, iz Centra za hitnu medicinu, zatim iz koronarne jedinice i kardiološke ambulante.

Prikaz laboratorijskih nalaza:

Klinička biokemija Pretraga

03.04.

Glukoza

10,4

06.04.

26.04.

Jedinica

Referentni interval

4,2

mmol/L

4,4 – 6,4

17

µmol/L

3 – 20

5,8

mmol/L

2,8 – 8,3

123

µmol/L

79 – 125

Urat

322

µmol/L

182 – 403

AST

20

U/L

11 – 38

ALT

19

U/L

12 – 48

GGT

25

U/L

11 – 55

61

U/L

< 177

U/L

< 5% CK

177

U/L

< 241

Kolesterol

6,0

mmol/L

< 5,0

Trigliceridi

1,9

mmol/L

< 1,7

4,2

mmol/L

3,9 – 5,1

Bilirubin, ukupni Ureja

8,2

Kreatinin

120

CK

106

CK-MB aktivnost LDH

118

233 25

140

687

Kalij

3,9

4,3

Natrij

139

135

mmol/L

137 – 146

CRP

8,1

1,5

mg/L

< 5,0

7,3

%

< 6,0

0,05

µg/L

< 0,1

2053

pg/mL

< 100

26.04.

Jedinica

Referentni interval

mm/h

5 – 28

HbA1c Troponin T

0,08

5,16

ProBNP

Laboratorijska hematologija Pretraga

03.04.

SE

06.04.

10

Eritrociti

4,38

4,04

3,98

×1012/L

4,34 – 5,72

Hemoglobin

127

116

122

g/L

138 – 175

Hematokrit

0,380

0,369

0,353

L/L

0,415 – 0,530

MCV

86,8

90,9

88,6

fL

83,0 – 97,2

MCH

29,0

28,6

30,7

pg

27,4 – 33,9

MCHC

334

314

346

g/L

320 – 345

 | 673

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika12.indd 673

2.2.2015. 8:39:18

SPINALNA MIŠIĆNA ATROFIJA Podatci o bolesniku: Muško dijete, 2 godine, zbog kliničke sumnje na spinalnu mišićnu atrofiju upućeno na molekularnogenetičku obradu. PTC terapija, mutacije i biosinteza proteina?

Prikaz laboratorijskih nalaza:

Molekularna dijagnostika

Tumačenje

Gen

Genotip (broj kopija gena)

SMN1; ekson 7 SMN1; ekson 8 NAIP; ekson 5

0 0 2

SMN2; ekson 7 SMN2; ekson 8 NAIP; ekson 5

2 2 2

Metoda

MLPA i/ili PCR/RFLP

Analizom DNA utvrđene su delecije eksona 7 i 8 (0 kopija) – gena SMN1

LITERATURA Sertić J i sur. Katalog laboratorijskih pretraga s primjerima iz kliničke prakse. Medicinska naklada, Zagreb, 2011.

Lab Tests Online. http://labtestsonline.org National Comprehensive Cancer Network v2. 2015. Clinical Practice Guidlines in Oncology. Colon Cancer. www.nccn.org

698 | Laboratorijska medicina – odabrani primjeri laboratorijskih nalaza

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika12.indd 698

2.2.2015. 8:39:20

Kazalo pojmova Zrinko Šalek, Jadranka Sertić

A

‡‡ perkutana koronarna intervencija, 110 albumin, 614, 615, 620

ablacija jajnika, 432 acidemija, 236, 240, 242 acidoza, 236, 240 • metabolička, 236-240, 242-243 • respiratorna, 236-237, 241-242

α1-antitripsin, deficit, 228-233 • klinička kemija, 229-230 • klinička slika, 228 • molekularna dijagnostika, 230 • liječenje, 233

adenokarcinom pluća, 438, 439

alfaradin, kod raka prostate, 418

adiponektin, 91

ALK, kod raka pluća, 439-441

adrenomijeloneuropatija (AMN), 166

alkaloza, 236

AFP

• metabolička, 236-237, 240-242

• kod raka jajnika, 426, 428 • kod raka testisa, 421-423

• respiratorna, 236-237, 242-243 alkoholi, 591

agamaglobulinemija, 510

• etanol, 591

aktivirani protrombinski kompleks, 551

• izopropanol, 592

aktivirani rekombinantni faktor VII, 551

• metanol, 591

aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme, 539

anafilaksija, 610

akutni koronarni sindrom, 108

analgetici, 592

• diferencijalna dijagnoza, 109 • klinička kemija, 109

• acetaminofen, 592 • salicilati, 592

‡‡ kreatin-kinaza, 109

anastrazol, 433

‡‡ srčani troponin I, 109

anemija, 445, 617

‡‡ srčani troponin T, 109 • klinička slika, 108

• aplastična, 462 • apsolutna, 445

‡‡ NSTEMI, 109

• endokrine bolesti, 453

‡‡ reinfarkt, 109

• Fanconijeva, 463

‡‡ STEMI, 109

• hemolitička, 456

• liječenje, 110 ‡‡ antitrombocitni lijekovi, 110 ‡‡ fibrinoliza, 110

‡‡ autoimunosna, 460 ‡‡ stečena, 459 • hipoproliferacijska, 445, 447

| 701

Klinicka kemija i molekularna dijagnostika12.indd 701

2.2.2015. 8:39:20