Spatial transcriptomics

Data-analyse uitdaging bij transcriptoomonderzoek

Spatial transcriptomics: RNA met ruimtelijk inzicht

Spatial transcriptomics maakt het mogelijk om te meten welke genen worden afgelezen op elke locatie in een weefsel. Een fascinerende technologie in een verrassend groot aantal varianten.

Els van den Brink

Terwijl alle cellen in ons menselijk lichaam hetzelfde DNA

bevatten, zijn ze toch heel verschillend. Een bloedcel, een hersencel en een huidcel zijn nauwelijks met elkaar te vergelijken, ondanks dat ze allemaal hetzelfde genoom in zich hebben. Dat heeft te maken met de mate waarin de verschillende genen worden afgelezen en vertaald naar RNA – ook wel het transcriptoom genoemd. In een bloedcel is het transcriptoom heel anders dan in een huidcel of hersencel. Vandaar dat steeds meer onderzoekers niet alleen het genoom van cellen analyseren, maar ook het transcriptoom. De laatste jaren was dit ook steeds beter mogelijk voor individuele cellen. Dit staat bekend als single cell transcriptomics.

Alles over het transcriptoom

Het gezegde ‘Hoe meer je weet, hoe meer je weet dat je niks weet’ is een uitspraak die op dit gebied ook zeker van toepas-

‘Spatial transcriptomics is als een vruchtentaart’

sing is. Het is mogelijk allerlei cellen te karakteriseren, maar als niet precies bekend is wat hun locatie en hun omgeving is, dan kunnen onderzoekers er nog steeds niet zo veel mee. Bij immunotherapie tegen kanker, willen die niet alleen weten

welke immuuncellen aanwezig zijn, maar ook waar ze precies gelokaliseerd zijn, en in hoeverre ze ook echt een tumor binnendringen. Vandaar dat er nieuwe technologieën zijn ontwikkeld die nog een stap verder gaan en de analyse van het transcriptoom kunnen linken aan de locatie van deze cellen in het weefsel, de zogenaamde spatial transcriptomics.

Van smoothie tot vruchtentaart

De oorspronkelijke transcriptomics-analyse is vergelijkbaar met het meten aan een smoothie, waarbij de resultaten een mix zijn van alle ingrediënten. Single cell transcriptomics ging al een stap verder, eerder een fruitsalade, met alle ingrediënten duidelijk herkenbaar, maar nog wel door elkaar gehusseld. Spatial transcriptomics, gaat nóg een stap verder en is als een vruchtentaart, waar alle verschillende fruitsoorten mooi op gerangschikt liggen. Zo is exact vast te te stellen waar welke soort ligt en hoe ze met elkaar verbonden zijn.

Onderzoek en diagnostiek

Spatial transcriptomics werd door Nature in 2020 uitgeroepen tot methode van het jaar. De technologie wordt vooral gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek, met name op het gebied van immuno-oncologie en neurologie. Onderzoekers gebruiken het bijvoorbeeld voor onderzoek naar immunotherapie tegen kanker, en om de hersenen in kaart te brengen. In principe zou de technologie ook gebruikt kunnen worden voor diagnostisch onderzoek, in het kader van personalized medicine. Elke tumor heeft namelijk een unieke omgeving die bepaalde immuuncellen kan onderdrukken en de behandeling kan er veel baat bij hebben om dat voor elke individuele tumor apart vast te stellen.

Tal van varianten

Spatial transcriptomics bestaat ondertussen in enorm veel verschillende varianten. Het zijn er zelfs zo veel, dat het overweldigend kan aanvoelen, al zitten er ook een aantal tussen die alleen worden toegepast binnen het instituut dat ze heeft ontwikkeld. Elke variant heeft weer net iets andere kenmerken en voor- en nadelen, bijvoorbeeld qua ruimtelijke resolutie, het aantal genen dat gemeten kan worden en de throughtput. Bij sommige technieken is de resolutie zo hoog, dat het mogelijk is om individuele cellen te

‘Qua data-analyse zijn al snel de grenzen bereikt van wat haalbaar is’

onderscheiden, en soms zelfs subcellulaire delen zoals de celkern of organellen. Hierbij is het vaak wel zo dat het aantal genen dat gemeten kan worden beperkt is. Andere technieken hebben een minder hoge resolutie en kunnen naastgelegen cellen niet altijd

Overzicht van de verschillende varianten van Spatial Transcriptomics

Techniek Hoe het werkt Voorbeelden Kenmerken

Microdissectie Cellen worden uit het weefsel gesneden met behulp van een laser. Daarna wordt uit deze cellen het RNA geïsoleerd en gesequenst TOMO-seq, ProximID, TIVA, LCM-seq, Geo-seq, NICHE-seq Complete transcriptoom, beperkte resolutie, gebaseerd op microscopie

Fluorescentie in situ hybridisatie

RNA wordt gevisualiseerd met fluorescente labels. Er wordt niet gesequenst, het gaat om een beperkt aantal genen, die tegelijkertijd of na elkaar worden gemeten. Door multiplexing kan dit aantal worden verhoogd tot 140 (MERFISH) smFISH, seqFISH+, MERFISH, smHCR, osmFISH, seqFISH, DNA microscopie Beperkt aantal genen, hoge resolutie. Er kan sprake zijn van zelfquencing of autofluorescentie, gebaseerd op microscopie

In situ sequencing RNA wordt gesequenst door het te vertalen naar cDNA terwijl de cellen in het weefsel blijven, cDNA wordt zichtbaar gemaakt met fluorescente probes FISSEQ, Barista-seq, ISS padlock, STARmap Beperkt aantal genen, hoge resolutie, gebaseerd op microscopie

In situ capturing RNA wordt gekoppeld aan een barcode en wordt daarna buiten het weefsel gesequenst. Door de barcode kan de sequentie gekoppeld worden aan de locatie Nanostring GeoMx, 10xVisium, slide-seq, APEX-seq, HDST Lagere resolutie, compleet transcriptoom, zonder microscopie

In silico constructie

RNA wordt geanalyseerd met single-cell sequencing, de locatie wordt vastgesteld op basis van een computerreconstructie novoSpaRc, ISH, DistMap Compleet transcriptoom, ruimtelijk informatie onzeker

‘Gewoon maar eentje kiezen waarvoor de meeste reclame wordt gemaakt?’

van elkaar onderscheiden, maar hebben daarbij vaak wel weer de mogelijkheid om het complete transcriptoom te analyseren.

Vijf groepen

De varianten zijn in principe onder te verdelen in vijf groepen: • microdissectie • fluorescente in situ hybridisatie • in situ sequencing • in situ capturing • in silico constructie (zie bovenstaande tabel).

De kunst is om tussen al die varianten degene te vinden die het beste aansluit bij de eigen onderzoeksvraag. Malte Kühnemund, directeur R&D van 10x Genomics, een van de grootste spelers op het gebied van spatial transcriptomics, waarschuwt in een interview met labiotech.eu: ‘Het risico bestaat dat mensen gewoon maar eentje kiezen waarvoor de meeste reclame wordt gemaakt, zich dan realiseren dat ze niet de antwoorden krijgen die ze nodig hebben en het dan maar opgeven.’

Dataverwerking = bottleneck

Naast de verdere ontwikkeling van de technologie zelf is de verwerking van de data een van de grote uitdagingen. Door de combinatie van genetische en ruimtelijke informatie levert dit soort analyses al gauw enorme hoeveelheden data op, waarmee al snel de grenzen bereikt worden van wat haalbaar is qua data-analyse. Waarschijnlijk zal de data-analyse voorlopig de bottleneck zijn die bepaalt wat deze technieken aan waardevolle informatie kunnen opleveren.

Wetenschapper Kiki Andree als scientist en business developer en wetenschapper Menno de Jong van VyCAP stellen dat hun celsorteertechnologie de farmacie weken tijdswinst kan opleveren bij ontdekkingswerk naar nieuwe medicijnen.

VyCAP-technologie versnelt ontwikkeling antilichaamproducerende cellijnen Microwell chip sorteert, karakteriseert en selecteert cellen in 2 dagen

Het Twentse spin-off bedrijf VyCAP heeft een unieke technologie ontwikkeld om cellen te sorteren en te karakteriseren. Hierbij wordt niet alleen gekeken naar de cellen zelf, maar ook naar de stoffen die ze uitscheiden. Dat biedt interessante mogelijkheden, van onderzoek naar kankertherapie tot de ontwikkeling van antilichaamproducerende cellijnen.

Els van Brink | Fotografie: Marco Vellinga

De door VyCAP ontwikkelde technologie maakt het mogelijk om individuele cellen te isoleren en te karakteriseren,

en eventueel later weer door te kweken. De spin-off van de Universiteit Twente werd in 2011 opgericht door Arjan Tibbe. Het bedrijf heeft op dit moment tien medewerkers. In het begin lag de focus vooral bij circulerende tumorcellen, maar ondertussen is de technologie zo ver ontwikkeld, dat er nieuwe toepassingen mogelijk zijn.

Circulerende tumorcellen

Een bekend gegeven bij het werken met cellen is dat ze niet allemaal precies hetzelfde zijn, zelfs al zijn ze van hetzelfde celtype. Zo produceren antilichaamproducerende witte bloedcellen niet allemaal dezelfde antilichamen, en zeker niet in dezelfde hoeveelheden. Ook bij tumorcellen kan het voorkomen dat cellen uit verschillende delen van de tumor iets van elkaar verschillen. Dit is terug te zien in de circulerende tumorcellen. Circulerende tumorcellen zijn tumorcellen die zijn losgeraakt van de tumor en in de bloedbaan terecht zijn gekomen, waardoor ze op andere plaatsen in het lichaam uitzaaiingen kunnen veroorzaken. Ook deze cellen kunnen onderling van elkaar verschillen, net als de tumor waar ze vandaan komen, en bijvoorbeeld verschillend reageren op een behandeling.

Cellen sorteren en karakteriseren

De VyCAP microwell chip wordt geladen in een vacuümbuis, een pomp helpt cellen uit suspensie in de microwells van de chip te laden. Detail, onder: de technologie kan met een punchaald individuele cellen uit de chip te isoleren en die vervolgens te karakteriseren op DNA- en RNA-niveau. “We doen dat met behulp van de punchnaald, wat eigenlijk geen naald is, maar een stokje met een bolletje. Hiermee slaan we de bodem weg uit een cupje, zodat we de cel uit dit cupje kunnen opvangen”

chip, die bestaat uit 6400 cupjes. Elk cupje heeft een doorsnee van tachtig micrometer, met in de bodem een gaatje van vijf micrometer. Wanneer een oplossing met cellen hier doorheen

‘Wat farmaceuten normaal in zes weken doen, kunnen wij al in twee dagen’

wordt gepompt, stroomt de vloeistof door deze gaatjes, totdat ze worden afgesloten door een cel. Zodra dit gebeurt, stopt de stroming in dit cupje, waardoor er geen andere cellen meer bijkomen. Zo kunnen er 6400 cellen verdeeld worden over alle gaatjes.”

“Deze cellen kunnen vervolgens op verschillende manieren worden gekarakteriseerd,” vervolgt Andree. Allereerst is het mogelijk om de cellen vooraf aan te kleuren met verschillende fluorescente markers, die zichtbaar worden als de cellen in de chip bekeken worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. Op basis daarvan kunnen sommige cellen geselecteerd worden voor verder onderzoek. De technologie biedt namelijk de mogelijkheid om individuele cellen uit de chip te isoleren en die vervolgens te karakteriseren op DNA- en RNA-niveau. “We doen dat met behulp van de punchnaald, wat eigenlijk geen naald is, maar een stokje met een bolletje. Hiermee slaan we de bodem weg uit een cupje, zodat we de cel uit dit cupje kunnen opvangen”, legt Andree uit. De cel zelf wordt hierbij overigens niet geraakt, doordat het 5 micrometergaatje aan de zijkant van het cupje zit. Hierdoor blijft de cel intact en kan hij moleculair gekarakteriseerd en eventueel zelfs verder doorgekweekt worden.

Circulerende tumorcellen

Verschillende ziekenhuizen gebruiken deze technologie ondertussen al voor hun onderzoek naar circulerende tumorcellen, vertelt Andree. “Eerder was al bekend dat het aantal circulerende tumorcellen, CTC, iets zegt over hoe het gaat met een patiënt en hoe een behandeling aanslaat. Later kwam men echter tot het inzicht dat het ook belangrijk is om deze cellen individueel te karakteriseren, omdat er ook cellen tussen kunnen zitten die minder goed op de behandeling reageren dan de rest. Daar zijn wij met deze technologie op ingesprongen.”

Uitgescheiden antistoffen

Naast het karakteriseren van de cel zelf, is het ook interessant om te weten welke stoffen door een cel worden uitgescheiden. Zo kwam in het begin van de coronatijd het idee op om in het bloed van coronapatiënten op zoek te gaan naar de witte bloedcellen die antistoffen produceren tegen corona. Voor dit type onderzoek

De VyCAP microwell chip wordt geladen in een vacuümbuis, een pomp helpt cellen uit suspensie in de microwells van de chip te laden. Na het laden kunnen de individuele cellen in de microwells onder een microscoop bekeken worden (bovenste rij). Moleculen uitgescheiden door cellen in de microwells worden met behulp van een membraan met selectiemoleculen onder de poriën gedecteerd (linksonder). Interessante cellen verhuizen naar reageerbuisjes of wellplaten door de bodem uit hun microwell te ‘punchen’ (rechtsonder).

worden cellen eerst in de microfluïde chip over de verschillende cupjes verdeeld. Vervolgens wordt deze chip op een geactiveerd membraan geplaatst, waarna dit in een speciale houder gaat, gevuld met kweekmedium. In een incubator krijgen de cellen vervolgens een aantal uren de tijd om te groeien en stoffen te produceren. Wanneer een cel een bepaalde stof produceert, bindt dit direct ter plekke aan het geactiveerde membraan. Na de incubatietijd kunnen de geproduceerde stoffen gelabeld worden met fluorescente antilichamen, net zoals bij ELISA’s, waarna ze geanalyseerd kunnen worden met fluorescentiemicroscopie.

Corona-antilichamen

Voor het onderzoek naar antilichamen tegen corona bleek dit toch een stuk ingewikkelder dan gedacht. “Voor ons was dit project vooral bedoeld om het principe aan te tonen, en daar hebben we ontzettend veel van geleerd. Daarbij liepen we vooral tegen heel praktische problemen aan”, vertelt business developer en wetenschapper Menno de Jong. “Doordat we samenwerkten met een lab in Rotterdam, bleek het een logistieke toer om de cellen intact te houden tijdens het vervoer van Rotterdam naar Enschede en vice versa. We merken dat dit soort dingen voor ons nog extra uitdagend zijn, omdat wij meer gekomen zijn vanuit de technologie en het CTC-onderzoek, terwijl we voor dit soort projecten meer specifieke celbiologische kennis nodig hebben. Dat willen we dan ook in huis halen. Vandaar dat we nu ook bezig zijn met nieuwe samenwerkingsprojecten, bijvoorbeeld op het gebied van auto-immuunziektes.”

Productie-cellijnen

“Als je zo veel kunt meten, kun je deze technologie dus veel breder inzetten”, concludeert De Jong. Vandaar dat VyCAP nu ook bezig is met projecten op het gebied van drug discovery en de ontwikkeling van antilichaamproducerende cellijnen. Vooral dat laatste biedt op korte termijn al interessante mogelijkheden, denkt De Jong. “Dit kan de farmaceutische industrie veel tijdwinst opleveren. Wat zij normaal in zes weken doen, kunnen wij al in twee dagen.” Bij de ontwikkeling van een hoog-producerende cellijn is de uitdaging om deze te selecteren uit een mengsel van heel veel cellen met verschillende productieniveaus. Normaal gesproken wordt dit gedaan door een mengsel van cellen te verdunnen en uit te vullen over 96-wells platen. Hierbij zijn de cellen zodanig verdund, dat er gemiddeld in elk welletje één cel terecht komt. Alles bij elkaar kunnen dat wel zo’n vierhonderd platen zijn, die in verschillende kweekrondes gekweekt worden. Met de technologie van VyCAP kan dat een stuk eenvoudiger. Hierbij worden de cellen in de microfluide chip gesorteerd, waarna ze vervolgens in de chip nog even worden doorgekweekt in aanwezigheid van een geactiveerd membraan. Op die manier kan de antilichaamproductie voor elke cel precies gemeten worden, waarna de beste cel eruit gehaald kan worden om die vervolgens verder te kweken. “We zijn nog een relatief nieuwe speler, maar we hopen dat we over een paar jaar een bekende naam zijn geworden op dit gebied”, besluit de Jong.