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地中海贫血 和其他血红蛋白病的预防 第二卷

John Old Joanne Traeger-Synodinos Renzo Galanello Mary Petrou Michael Angastiniotis

田佩玲 徐湘民

严提珍 译 校

国际地中海贫血联合会出版物(3)


地中海贫血和其他血红蛋白病的预防 第二卷:实验室技术

国际地中海贫血联合会出版

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ISBN 9963-623-41-7 © 2005 Team up Creations Ltd 尼科西亚 1016,Othonos 街 14 号 版权所有 未经 TIF 及编者的书面允许,此书任何部分均禁止复制和保存于可检索系统中;或以任何形 式传播、或以电子、机械、拍照复制、缩微胶片、录音或其它形式的利用 印刷

塞浦路斯 尼科西亚

封面:纯合子 β 地中海贫血患者的外周血照片,由塞浦路斯尼科西亚地中海贫血筛查实验室 主任 Mrs.A.Kyrri 惠赠

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作者与编委 John Old(co-ordinating editor) National Haemoglobinopathy Reference laboratory, Oxford Haemophilia Centre The Churchill Hospital OxfordOx3 7LJ e-mail: john.old@orh.nhs.uk

tel: 01865 225329

Joanne Traeger-Synodinos Medical Genetics,Athens University,St.Sophia’s Children’s Hospita, Athens 11527, Greece e-mail: jtraeger@cc.uoa.gr

tel: +30 210 746 7461, fax: +30 210 779 5553

Mary Petrou Head, Regional Haemoglobinopathy Genetics Centre, University College London Medical School and University College London Hospital NHS Trust, Department of Obstetrics & Gynaecology, 86-96 Chenies Mews, London WC1E 6HX e-mail: m. Petrou @uCl.ac.uk tel: +207388 9246, fax: +207380 9864 Renzo Galanello Head of paediatric Thalassaemia Centre,Ospedale Reg ionale Microcitemie, Via Jenner (sn),09121 Cagliari, Italy e-mail:renzo.galanello@mcweb.unica.it

tel: 0039-0706 095508, fax: 0039-0706 095509

Michael Angastiniotis TIF Scientific collaborator, TIFhq, 32 Ifigenias, Strovolos, 2007 Nicosia, Cyprus e-mail: m.angastiniotis@cytanet.com.cy tel: 00357 22319129, fax: 00357 22314552

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投稿人 Piero Giordano Clinical Geneticist, Hemoglobinopathies & Red Cell Diagnostics, Dept. of Human and Clinical Genetics, Leiden University M edical Centre, Wassenaarseweg 72, 2333 AL, Leiden, The Netherlands e-mail: P.C.Giordano@lumc.nl

Aurelio Maggio Divisione Ematologia II, Centro Riferimento per la Cura e la Terapia della Talassema, Azienda Ospedaliera Vzo Cervello, Palermo, Italy e-mail: aureliomaggio@virgilio.it

Antonino Gambiona Divisione Ematologia II, Centro Riferimento per la Cura e la Terapia della Talassema, Azienda Ospedaliera Vzo Cervello, Palermo, Italy e-mail: giambic@libero.it

Androulla Kyrris Thalassaemia Screening Laboratory, Cyprus Thalassaemia Centre, Akropolis Avenue, Strovolos, Nicosia e-mail: arkyrri@cytanet.com.cy

致谢 Dr Androulla Eleftheriou for co-ordinating the authors meetings. TIF secretarial staff for keeping communications going between 4 countries. Filippo Leto is thanked for his technical assistance to the work described in chapter 5.2.2.

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翻 译 田佩玲 广东省计划生育科学技术研究所优生遗传室主任 广东省计划生育专科医院优生遗传室主任技师 从事地中海贫血筛查、基因诊断及产前诊断工作 广州市梅东路17号 510600 e-mail: peilingtian@163.com tel:020-87619176

严提珍 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室博士研究生 从事地中海贫血基因诊断和临床应用研究 广州市广州大道北1838号 510515 e-mail: yantizhen@sohu.com tel: 020-62789042

审 校 徐湘民 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室教授 从事地中海贫血分子基础和基因诊断研究,以及临床遗传咨询工作 广州市广州大道北 1838 号 510515 e-mail: gzxuxm@pub.guangzhou.gd.cn

tel: 020-61648293

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序 预防手册第二卷介绍目前在世界各地实验室使用的地中海贫血和异常血红 蛋白病诊断的主要技术。本书是与第一卷配合使用的手册第二卷,本手册第一卷 描述了需要产前诊断的各类疾病及携带者筛查的策略。 本书描述的大部分操作规程都是目前在作者及投稿者实验室使用的方法。当 然它不可能包括每一个已知的筛查和突变检测的具体方法,同样它也不可能为每 个实验室提供建立所有方法的应用技术。因此,为指导实验室进行技术取舍,本 书第一章重点介绍携带者筛查和分子分析的最佳操作方案,接下来六章详细阐述 了操作规程和技术要领,这些内容不仅涉及用于地贫预防的经典流程,而且介绍 了某些诊断中心正在考虑建立的更先进、更专业化的一些新技术,最后一章则突 出了一些正在建立的新技术,并指出了即将实施的地贫预防计划的方向。 我们确信本书与第一卷合并使用,将为从事地贫及其他血红蛋白病预防的诊 断实验室提供有价值的工具和材料。 作者

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前言 关于出版者 其他 TIF 出版物

第一章

第二章

最佳操作方案推荐………………………………………………………1 1.1

血液学方法

1.2

血液学辅助方法

1.3

珠蛋白链合成

1.4

分子诊断

1.5

胎儿 DNA 分析

1.6

核查

血液学方法………………………………………………………………17 2.1

红细胞指数

2.2

红细胞形态学

2.3

网织红细胞和 HbH 包涵体检测

2.4

亨氏小体

2.5

渗透脆性试验

2.6

Hb 稳定性试验

2.7

碱变性法定量测定 HbF

2.8

HbF 的细胞内分布

2.9

HbA2 定量

2.10 HbS 检测 2.11 HbE 检测 2.12

铁状况测定

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第三章

血红蛋白谱分析…………………………………………………………40 3.1

层析法

3.2

电泳法

第四章 珠蛋白链合成……………………………………………………………58 4.1 Weatherall 和 Clegg 法 4.2

高效液相色谱法(HPLC)

4.3

垂直等电聚焦法

第五章 分子诊断…………………………………………………………………85 5.1

诊断策略

5.2 DNA 制备

5.3

-2.1

从全血中抽提 DNA:盐析法

-2.2

从全血中抽提 DNA:酚-氯仿法

-2.3

从绒毛膜中抽提 DNA:酚-氯仿法

-2.4

从羊水细胞中抽提 DNA:酚-氯仿法

已知突变诊断 -3.1

等位基因特异性寡核苷酸(ASO)点杂交

-3.2

反向点杂交(RDB)

-3.3

扩增应答突变体系 (ARMS)

-3.4

限制性酶 PCR

-3.5

缺口 PCR

-3.6

方法学评价

5.4 未知突变诊断 -4.1

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

-4.2 DNA 测序 -4.3 cDNA 测序 -4.4

方法学评价

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第六章

Southe rn 印迹杂交分析………………………………………………155 6.1

α-地贫诊断

6.2

操作流程

第七章 胎儿 DNA 分析…………………………………………………………164 7.1

用显微解剖制备绒毛

7.2

母体 DNA 污染检查

第八章 DNA 突变检测新技术……………………………………………………172 8.1

变性高效液相色谱

8.2

基因芯片分析

8.3

实时 PCR

8.4

单细胞 PCR

8.5

应用实时 PCR 检测 β-珠蛋白基因突变的实例

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在本丛书第一卷中,作者阐述了地贫预防这一主题的概况,包括流行病学数 据收集、健康教育和遗传咨询的各种方法学等内容,为读者提供了胎儿取样和实 验室技术综述的方法学应用内容。 国际地贫联合会(TIF)已经采纳预防方案,限制新生患儿的数量以作为控 制地贫和血红蛋白病的基本策略和必需要素。其他控制要素是为罹患这些遗传病 的患者提供尽可能完善的治疗。在这方面,TIF 建议作者们——这个领域的国际 专家们能更进一步,在本丛书第二卷中,提供自己所在实验中心使用的实验室技 术的详细资料,以便能指导正在建立大规模预防方案的其他实验室,专家们也需 要将这些理论性的详细资料用于实践。 本书作者团队的专家们来自英国、意大利、希腊和塞浦路斯。这些国家都是 30 年前即已实施人群预防的首批国家,大部分作者从一开始就参与了本国的预 防方案。因此,他们对本书的贡献建立在多年的经验与广博的知识之上,这些经 验与知识均来自他们长期的技术应用实践,也是目前这个领域最前沿尖端技术的 荟萃。 TIF 希望并相信:通过这本符合规范且受人尊重的参考书,将这些非常实用 的方法提供给所有正在建立地贫和血红蛋白病预防服务机构的实验室专业人员, 以帮助他们选择及应用最适于他们本国人群、遗传学特性和他们可获得的财政资 源的方法。 TIF 非常感谢每一位作者(编辑)的辛勤劳动和赞助,并感谢所有我认为对 完成这一工作做出贡献的其他人士。对于每一个预防实验室服务机构来说,这将 是一本最为实用的参考书。

国际地中海贫血联合会主席 Panos Englezos

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关于出版者 国际地中海贫血联合会(TIF)是一个与世界卫生组织(WHO)有着官方联 系的非政府、非盈利的组织,目前代表着 91 个国家,总部设在塞浦路斯尼科西 亚。 TIF 特别致力于提高公众及卫生专业人员对地中海贫血的认知,以及促进地 中海贫血预防和医疗政策的制定和完善。TIF 对于国家地中海贫血协会的资助及 其对地中海贫血有关的科学家和医务人员的定期的系列教育课程已在完成联合 会的目标上起到关键作用。 作为教育课程的一部分,TIF 出版了一系列数种文字的有关地中海贫血的控 制和临床治疗各方面的科技资料。每年有 4 万册以上的 TIF 出版物分发到各成员 组织、全世界各医疗中心的科学合作者、各医学院校、多国卫生部门及 WHO 办 公室。 除 WHO 遗传性疾病部门以外,TIF 还与国际输血协会(ISBT)、国际血液 安全协会(ICBS)和 WHO 血液安全全球合作机构(GCBC)保持着官方联系。

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其他 TIF 出版物 · 地中海贫血临床处理指南(英文、希腊文、西班牙文和阿拉伯文版)

· 什么是地中海贫血?(英文、希腊文、法文和西班牙文版)

· 用去铁胺进行铁螯合剂治疗规范(英文、希腊文、西班牙文、意大利文和 阿拉伯文版)

· 血液试剂盒(英文版)

· TIF 杂志(季刊)(英文版)

· 关于地中海贫血(英文版)

关于如何免费获得上述出版物的信息,请联系 TIF: 电话:+357 22 31929 传真:+357 22 314552 或 e-mail:thalassaemia@cytanet.com.cy 亦可在 TIF 网站 www. thalassaemia.org.cy 免费下载上述出版物。 TIF 可提供世界各地的国家地中海贫血协会及地中海贫血治疗医学中心的 详细资料。

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第一章

最佳操作方案推介

本章是基于欧洲分子遗传质控网在其举办的最佳操作方案会议之后出版的《最佳 操作方案指南》进行的概述,全文可从 http//www.emqn.orq/emgn.php 网址下载,推介 的重点是实验室技术的最佳操作方案和结果解释。 血红蛋白病可能是所有遗传病中唯一一种可通过血液学(生化)试验而非 DNA 分析来鉴定携带者的疾病。任何高危夫妇均可通过包括配偶双方的突变鉴定和随后胎 儿 DNA 分析在内的产前诊断进行生育选择从而避免患胎出生。因此,血红蛋白病遗 传学服务需要一些专业(特别是血液学和分子遗传学)之间的密切合作[1-3]。 ―筛查‖在目的上有别于―确诊‖,筛查是用简单的生化试验来确定疾病的状况,为 了获得预定诊断所必需的可靠诊断,筛查方案均设计为使用一线和二线的操作流程。 如果需要一个明确的确诊结果,必须使用基于蛋白质或 DNA 分析的定性方法。 地贫筛查可检出携带 β-地贫性状的大部分病例,但 α-地贫性状没有特异的筛查方 法,常常需要经过排除加以诊断。如果发现异常血红蛋白,得到的只是血红蛋白的初 步鉴定结果。请记住表型筛查是很重要的,一些罕见的病例有可能无法检出,在数据 解释和记录时这个问题要予以考虑。对所有样品来说,利用血液学方法进行筛查仅是 遗传学诊断的第一步[4]。 好的实验室操作方案还包括尽量减少记录错误,对承担大批量携带者筛查(一般

每天血常规数目在 1000 份以上)的血液学实验室尤为重要。注意必须进行样品的识 别(信息包括姓名、出生日期、取样日期、在最近的 4 个月内是否输过血等),推荐 使用样品条码。如果熟悉所使用的方法,应让患者了解所用方法的实验室误诊率。

1.1 血液学方法 1.1.1 全血计数 方法:推荐使用电子测定法

结果解释: 在评价过程中,红细胞的所有指标(以及其他参数)很重要,包括血红蛋白含量

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( Hb)、 红细胞计数(RBC)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞平均体积(MCV)和红 细胞分布宽度(RDW)。 MCV <78 fl 和 MCH <27 pg 是提示疑为地贫杂合子的重要阈 值。 注意:由于红细胞体积增大,导致 MCV 异常增高,因此,在评价时对取样后 24h 以 上进行血常规测定的样品应谨慎(尽管不同的分析人员对该问题有不同的观点)。

1.1.2 血红蛋白(Hb)谱分析 方法包括: 异常血红蛋白鉴定方法包括: 1.

在 pH8.6 条件下利用醋酸纤维素薄膜进行血红蛋白电泳。这种方法能可靠地检出 常见的血红蛋白变异,包括 HbS、HbC、Hb D-Punjap、HbE、Hb O-Arab 和 Hb Lepores。若使用合适的电泳时间,还能检出 HbH 和 Hb Bart’s;很多其他的变异, 如 HbJ、HbN、HbQ 和 Hb Hasharon 也能检测出来。

2.

在 pH 6.0 条件下使用酸性琼脂或柠檬酸琼脂凝胶进行血红蛋白电泳。这种方法可 用于区分 HbC、HbE 和 Hb O-Arab,同时也可区分 HbS 和 Hb D-Punjap,应注意 酸性琼脂凝胶和柠檬酸盐琼脂凝胶具有不同的迁移谱。

3.

等电聚焦(IEF)。 IEF 是一种分离血红蛋白变异的敏感方法,但由于还可以分 离出一些其他附加成分,故与电泳相比其结果需要更专业的解释。

4.

高效液相色谱(HPLC)。血红蛋白片段进行检测和定量的推荐方法。该系统自动 化,对分析员的操作要求很简单,但色谱图的解释需要专业知识。此外,要严格 进行质量控制,尤其对 HbA2 的测定。尽管每次试验的成本相对高,但这种方法 有利于大规模人群筛查计划的应用。

建议: 1.

当存在一种异常血红蛋白,仅使用某种试验来确诊是不合适的。应适当地使用第 二种甚至第三种试验方案。

2.

许多 HPLC 系统,HbS 的衍生物会随着 HbA 和 HbA2 一同洗脱,因此,当存在 HbS 时,必须进行碱性或酸性电泳来确定 HbA 是否存在。

3.

当存在 HbS 时,建议配制适当的试剂并使用电泳、洗脱或微柱层析法进行 HbA2

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的定量,尽管存在 50%以上的 HbA 应排除复合 β-地贫,但不推荐使用 HPLC 技 术。 4.

由于 HbH 不稳定,如果疑为 HbH 病,一般要分析新鲜血液样品。

1.1.3. HbA2 定量 方法包括: 1.

配有自动密度计的 Hb 电泳——不推荐。

2.

电泳和洗脱——准确但耗时。

3.

微柱层析——准确但耗时。

4.

HPLC——在无上述变异(见前面)时准确和高通量。

结果解释: 提示 β-地贫杂合子的重要阈值是 HbA2 >3.5%。3.1-3.5%为临界水平(该范围取决

于每个实验室),表明需要进行进一步的诊断(见表 1.1)。 注意:利用 WHO 供应的国际参比试剂使用电泳、洗提、微柱层析和 HPLC 技术可对 HbA2 进行定量分析。

1.1.4

HbF 定量

方法包括: 1.

碱变性法——HbF 的波动范围广,由 Pembrey 等[5]改良的方法有极好的重复性。 如果使用得当,全部的临床情况均能得到满意的结果。

2.

HPLC——使用 HbAlc 裂解液伯乐公司的 HPLC 系统可准确完成 HbF 的定量,而 在 HbF 值<1%的情况下其他系统定量可能不够准确。

结果解释: 当红细胞指数低而 HbF>5%和 HbA2 水平正常时,这两个重要阈值提示可能为 δβ地贫杂合子,但妊娠时由于 HbF 可升高至 3%,使在 3-5%范围内的检测值难以解释。 当检测值>5%时表明可能存在异细胞型 HPFH,在出生 6 个月后这一指标会调整为个 体正常水平。

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注意:WHO 供应的国际参比试剂可用 Pembrey 等[5]的 2 分钟碱变性法进行 HbF 的定 量。

1.1.5 血液学与典型 β-地贫性状不相符的解释 血液学与典型 β-地贫性状不相符可根据以下准则进行解释: 1.

红细胞指数降低及血红蛋白电泳(包括 HbA2)正常 对这些血液学参数可能的解释是:  铁缺乏  α-地贫杂合子  轻型突变所致 β-地贫杂合子(有时 HbA 2 水平处于临界值)  δ-地贫杂合子复合 β-地贫  γδβ-地贫杂合子

2.

红细胞指数正常或降低至临界值并伴随 HbA2 升高 对这些血液学参数可能的解释是:  α-地贫与 β-地贫相互作用

3.

红细胞指数正常或降低并伴随 HbF 升高(和 HbA2 正常) 对这些血液学参数可能的解释是:  δβ-地贫杂合子或 HPFH

4.

红细胞指数正常伴随 HbA2 正常 对这些血液学参数可能的解释是:  α-基因三联体(基于家系研究结果),或轻型 β-地贫突变

注意:有些 Hb 变异通过电泳或色谱技术无法检测出来,但患者会出现血液学参数异 常和/或具有临床症状,对于这些样品推荐使用质谱或 DNA 分析法进行检测。某些情 况下也可发现超不稳定的变异,由于这些变异产生的蛋白质极不稳定,故仅能通过 DNA 分析被发现。 与 HbA2 临界水平有关的基因型——相关的血液学和生物合成指标列于表 1.1。

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表 1.1 与 HbA2 临界水平有关的基因型——相关的血液学和生物合成指标 基因型

MCV(fl)

MCH(pg)

HbA2(%)

α/β 比率

β -101(C→T)

88.5±7.8

30.1±1.0

3.1±1.0

1.3±0.4

β -92 (C→T)

83.0±6.0

28.3±2.0

3.5±0.4

1.3±0.8

β +33 (C→G)

82.0±9.2

27.1±3.4

2.5±1.4

1.3±0.6

CAP+1 (A→C)

77.5±2.5

24.5±1.5

3.5±0.3

-

β IVSI-6 (T→C)

71.0±4.0

23.1±2.2

3.4±0.2

1.9±0.5

β IVSII-844 (C→G)

96.0±4.0

30.3±1.8

3.2±0.2

1.0±0.6

β +1480 (C→G)

88.3±9.5

27.9±6.0

2.7±0.8

1.6±0.4

ααα/αα

85.5±7.8

30.4±5.0

2.8±0.6

1.2±0.4

δ+β-地贫

67.6±7.6

21.8±3.6

3.3±0.4

1.7±0.6

数值(均数±2SD)是一个指标,由对携带这些突变的患者的不同研究所得到的数值进行统计(由 R.Galanello

制作)。

注意:虽然大部分人一般携带正常的 β-珠蛋白基因和 α-珠蛋白基因,但对于 HbA2 水 平处于临界值的病例,尤其当配偶为典型的 β-地贫携带者时,应对其进行详细的检测 (如 α-和 β-基因分析和珠蛋白生物合成分析)。许多 HbA2 水平处于临界值的正常个 体可以解释为 HbA2 值在正常范围的极端分布。

1.2 血液学辅助方法 1.2.1 铁(Fe)状况测定 方法包括: 1.

锌卟林(ZnPP)——可与血常规用同一管样品进行分析,样品能长期稳定保存。 虽然这种分析方法需要专用的设备,但分析快捷、简单且成本低廉。当铁缺乏时 ZnPP 升高,但在酗酒或胆红素水平升高时可能为假阳性升高。

2.

铁蛋白——预示铁缺乏最常用的试验,但费用高且在感染、肝病或肿瘤形成时可 能有假阳性升高。

3.

转铁蛋白饱和(铁 /总铁蛋白结合容量)——预示铁缺乏的最常用的试验,但费用 高且在感染、肝病及肿瘤形成时可能出现假阳性升高。

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结果解释: 对小细胞低色素且 HbA2 和 HbF 值正常的样品进行铁状况测定,能有效鉴别单纯 性铁缺乏的患者,也可鉴定疑为携带 α-地贫或静止型 β-地贫而铁状况正常的患者。这 是一种有用的方法,它不仅可免除不必要的检查,而且也避免了对某些患者进行不合 适的铁治疗。但应注意有些患者铁缺乏可能会伴发地贫,可能引起误诊。如果妊娠期 间不存在检查时间的限制,一般推荐在铁缺乏纠正后再进行血液学筛查。

1.2.2 血红蛋白变异的功能试验 方法包括: 1.

镰化试验——如果在 HbS 位置出现一条异常的迁移带,应进行镰状溶解试验。 注意:一些其他(罕见的)血红蛋白因溶解性降低而导致阳性结果,但电泳时发 现并不存在与 HbS 位置相同的迁移带。

2.

亨氏小体形成——亨氏小体的形成不具有特异性,但一般用于检测不稳定血红蛋 白变异。

3.

氧离解曲线——氧离解曲线可用于提示是否存在伴随氧亲和力改变的血红蛋白 变异。

1.3 珠蛋白链合成 可为非典型患者的诊断提供有价值的信息。珠蛋白链合成分析的方法详见第七章。 方法包括: 1.

羧甲基纤维素(CMC)色谱法——这种评价网织红细胞珠蛋白合成相对比率的原 始方法准确性高,但耗时且通量低。

2.

高效液相色谱(HPLC)——一种潜在的耗时短的方法,但对实验精确性和可靠 性的标准化非常困难。

3.

等电聚焦(IEF)——一种潜在的快速和简便的方法,可同时处理多个样品,但 需要特殊的设备和高水平的专业技能与经验[6]。

1.4 分子诊断

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目前许多血红蛋白病的 DNA 分析方法均基于聚合酶链反应(PCR),用于珠蛋白 基因突变的检测技术包括点杂交分析、反向点杂交分析、扩增应答突变系统(ARMS)、 变性梯度凝胶电泳、诱变分离 PCR、缺口 PCR 和限制性内切酶分析。这些方法作为 最佳操作方案被推荐使用,每种方法都有自身的优、缺点(见第五章)。一个实验室 选择珠蛋白基因突变或缺失诊断的特异方法,不仅取决于这个实验室所掌握的技术知 识,还取决于被检测个体(人群)的突变类型。任何 DNA 诊断实验室,至少用两种 可选择的方法来检测每种突变是最佳的操作方案。 血红蛋白病有地域特异性,不同人群会有自己独特的异常血红蛋白和地贫的疾病 谱。大部分人群的突变谱及其基因频率已公布,通常由有限的常见突变和少量的罕见 突变构成[8]。因此,了解患者的种族起源可以简化诊断策略,可快速鉴定下述缺陷。

1.4.1 α-地贫 缺口 PCR(跨越缺失断裂点的扩增)是快速诊断 α+-地贫和 α°-地贫缺失突变的一 种方法,但用于产前诊断需谨慎,这种方法可能会因等位基因脱扣(ADO)而导致假 阴性结果。早期的缺口 PCR 会存在等位基因脱扣的技术缺陷,但最近公布的引物和 条件完善了这一检测技术[8 、9]。 多数常见的 α°-地贫缺失可通过缺口 PCR 来诊断,包括东南亚人群的-- SEA 等位基 因、地中海地区人群的--MED 和-(α)20.5 等位基因、菲律宾人群的--FIL 等位基因和泰国人 群的--THAI 等位基因。两种 α+-地贫缺失(-α3.7 和-α4.2 等位基因)也可通过缺口 PCR 来 诊断,前者在非洲、地中海地区、亚洲和东南亚人群中发现,后者在东南亚和太平洋 地区人群中发现。最佳操作方案是对任何疑为 α+-地贫的个体同时筛查这两种缺失。 其他 α°-地贫和 α+-地贫缺失突变可通过使用 δ-基因和 α-基因探针的 Southern 印迹 杂交法进行诊断。这种方法也可检测 α-基因重排(α-基因三联体和四联体)。 其中一个 α-基因发生点突变也可引起 α+-地贫,这种非缺失等位基因可通过 α-珠 蛋白基因的选择性 PCR 扩增技术和一般的突变分析方法(如 SSCP 或 DNA 测序分析) 来进行检测[10]。有些非缺失突变改变了限制性酶切位点,可通过选择性扩增和限制性 内切酶分析来诊断,例如亚洲人群的 Hb Constant Spring 突变、地中海地区人群的 ATG→ACG α2 -基因突变和 IVS1 供体位点(-5bp)缺失[11]。如果已知当地人群的常见 非缺失突变类型,则建议使用特异性突变试验。

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1.4.2 β-地贫 重型地贫的风险人群的 β-地贫突变种类有限,在实际操作中可根据携带者的民族 起源来选择最合适的探针或引物。最常见的已知突变筛查方法是用等位基因特异性寡 核苷酸探针进行反向点杂交分析[12]和引物特异性扩增(ARMS)[13]。β-基因扩增产物 的限制性酶分析对少数突变检测很有用[14]。 当一种 β 地贫突变无法通过一种直接的突变检测方法来确定时,可利用变性梯度 凝胶电泳(DGGE)[15]或单链构象多态性(SSCP)分析[16]来定位 β-珠蛋白基因内的 未知突变,再对已扩增的单链 DNA 进行手工或自动直接测序来定性该突变[17]。另一 种方法是,如果一种突变类型无法通过已知突变的筛查技术进行鉴定,拥有 DNA 自 动测序设备的实验室直接进行 DNA 测序分析可能更有效。经过 DGGE 分析发现大部 分突变呈现特异性异源双链模式,因此运用突变特异方法如 ARMS 或 RE-PCR(见表 3.2.1)进行检测后,利用 DGGE 对突变进行直接鉴定很有用。 小缺失可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对 β-基因扩增产物进行检测。一些丢失 β-珠蛋 白基因的大缺失(包括 Hb Lepore、一些 δβ-地贫缺失和 HPFH 1/2/3 缺失突变)可用 缺口 PCR [18]或 Southern 印迹杂交分析来鉴别。

1.4.3 常见 Hb 变异 临床上一些重要的变异,即 HbS、HbC、HbE、Hb D-Punjap 和 Hb O-Arab 等可 用点杂交法、ARMS 技术或直接测序来诊断。除 HbC 外所有变异均可通过 β-基因扩 增产物的限制性内切酶消化(RE-PCR)来诊断。在 DNA 水平上很多其他血红蛋白变 异可通过选择性珠蛋白基因扩增、DNA 序列分析(见第五章)或通过质谱[19]来得到 阳性鉴定结果。

1.5 胎儿 DNA 分析 推荐所有参与产前诊断的夫妇可通过在血红蛋白病分子多样性方面造诣很深的 有资质的健康卫生专家进行咨询。未经资深健康卫生专家的咨询,任何妇女都不能进 行产前诊断。 用于产前诊断的 PCR 技术的相关问题,包括检测母体 DNA 污染的敏感性和检测

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多种地贫突变所需的整套复杂的探针和引物,下述的操作步骤将能把误诊率降到最 低。

1.5.1 双亲的血液样品 血液学结果的复印件应送到分子诊断实验室。 采集父母双方的血液样品,通过血常规和血红蛋白变异的筛查方法(如电泳)以 确定父母的表型,为下一步进行 DNA 分子诊断提供参考。任何夫妇每次进行产前诊 断都应重复这一步骤。

1.5.2 配偶不能接受检测 有时虽然孕妇携带者的配偶不能接受检测,但该孕妇仍需进行产前诊断。以下情 况对胎儿进行重型血红蛋白病的风险评估非常重要: a) 母亲携带镰状细胞特征而配偶未做检测。如果胎儿被诊断为 AS 基因型,应进行 β地贫常见突变检测和存在于其父亲的民族种群中的其他任何已知血红蛋白病基因 (尤其是 βC 或 βD)的检测。 b) 母亲携带 β-地贫特征而配偶未做检测。如果胎儿已诊断出与母亲相同的 β-地贫突 变,应通过检测存在于其父亲的民族种群中的 β-地贫突变或任何其他的 β-基因血 红蛋白病来排除胎儿为 β-地贫纯合子或复合杂合子的可能。另一种方法是对胎儿 DNA 样品进行测序。

1.5.3 胎儿取样 三种可行的取样方法,即绒毛膜取样、羊膜腔穿剌和胎血取样。血红蛋白病的产 前诊断以孕早期(10-12 周)进行绒毛膜取样为佳。 方法 1.

绒毛膜取样 提供 DNA 的理想来源。通过精细的显微解剖技术去除母体蜕膜能降 低母体污染的风险。如果样品进行培养,则可能存在母体污染;如果样品的量足 够则不必培养。在富有经验的诊断中心进行样品取样的流产风险很低。妊娠的早 期即可获得结果。

22


2.

羊膜腔穿剌 将羊膜腔穿刺样品中的羊水细胞离心沉淀后,可直接进行分子诊断。 这种方法一般可为基于 PCR 的诊断技术提供足够的胎儿 DNA 进行分析,样品培 养 10-14 天可获得更多的胎儿 DNA。细胞培养会降低母体污染的风险,但诊断结 果会延迟。在富有经验的诊断中心进行羊膜腔穿刺取样的流产风险很低。由于羊 膜腔穿刺不能在 16 周之前进行,故只能在妊娠的中后期获得结果。 注意:由于胎儿细胞常易被母体细胞污染,进行直接分析时应谨慎操作。

3.

胎血取样 一般获取 1-2 ml 胎血可用于分子诊断或珠蛋白链生物合成的研究。如 果一个孕妇妊娠晚期才就诊,或者配偶不能接受检查,当夫妇双方的突变未知时 可用珠蛋白链生物合成方法诊断 β-珠蛋白链(代表 HbA)和 γ-珠蛋白链(代表 HbF)的相对合成率。β/γ 链合成率大于 0.02-0.03 表明胎儿未受累(各实验室之

间稍有差异)。 注意:使用这种方法,解释结果时应注意轻型 β+-突变引起 β-珠蛋白链水平增高, 可能存在误诊[20]。

建议 

因使用胎血珠蛋白生物合成进行产前诊断引发的流产风险较高,且只能在妊娠后 期进行(18-20 周之后),因此,多数诊断中心已不再推荐使用这种方法。

胎儿 DNA 诊断的推荐方法是绒毛膜取样。

1.5.4 基因型分析 建议 

进行分子诊断的实验室应选择最适合于自己实验室、自身专业特长及当地人群的 技术。

将父母 DNA、合适的质控 DNA 与胎儿 DNA 同时进行分析且使用空白对照样品。

进行重复试验将人为误差降到最低。

为了监控如部分消化或等位基因脱扣等潜在的实验室误差,应对每份样品使用两 种独立的诊断方法以检测每种已知的突变。

尽量减少扩增循环数以便将母体 DNA 的共同扩增降至最低限度。

23


1.5.5 母体 DNA 污染 建议 

使用多态性分析以排除母体污染(也可鉴定非父源性)。

每种情况的母体 DNA 污染均要检测,尤其当胎儿基因型与母亲基因型相同时。 很多可选择的多态性标记,包括短串联重复(STR)标记(如 D21S11、D21S1414、 D18S535)[21]或可变数目串联重复(VNTR’s)标记(如 ApoB、IgJH 和 Has-ras) [22]

当胎儿与母亲基因型相同且未发现可提供母体污染存在与否信息的标记物时,胎 儿的诊断报告应陈述这些事实且提示胎儿结果误诊的风险较大。

1.5.6 患者同意和报告 采集胎儿样品应附有一份患者与咨询医生签署的知情同意书。胎儿 DNA 报告应 详细描述所做 DNA 分析的类型、所用操作流程以及因技术误差而可能存在误诊风险, 所有方法的实验室误诊率均应有书面报告并向患者解释。

1.5.7 产前诊断随访 理论上来说,胎儿 DNA 诊断应该在婴儿出生时通过采集脐血样品进行确认,并 报告胎儿诊断随访结果。一些中心还要求进行血液学、血红蛋白和 DNA 分析。 当受累孕妇终止妊娠时应要求提供胎儿材料以确认产前诊断结果。

1.6 核查 国家登记处应该成立产前诊断核查机构。英国有三家诊断实验室将每次诊断的数 据录入可共享的数据库内,汇总得到的数据可为国家进行出生前携带者筛查提供参 考,同时可核查诊断者的种群和地域,以及对所用产前诊断方法的风险和准确性进行 评估[24]。

24


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26


第二章

血液学方法

血液学方法是地贫携带者鉴定的基础,可应用的方法包括红细胞指数和形态学、 HbA2 定量和 Hb 片段分离等。没有一种方法能单独证明携带者状况,这就需要整合几 种试验方法用以综合评价。地贫筛查的流程图在第一卷图 4.2 中已描述。

2.1 红细胞指数 原理 红细胞(RBC)指数测定是最常用的实验方法,通常由自动电子血细胞计数仪来 完成。这些计数仪得出很多参数,其中少数参数如平均红细胞体积(MCV)、平均红 细胞血红蛋白含量(MCH)和血红蛋白(Hb)浓度,都与血红蛋白病的筛查有关且 很重要。各种细胞计数仪的原理已超出本书的编写范畴,但可从生产商处获得。一般 原则是选择能直接测定平均红细胞体积的计数仪,这种仪器需要每天用合适的材料进 行校正以获得准确的实验结果。

结果解释 地贫携带者 MCV 和 MCH 都有不同程度的降低。MCH 比 MCV 更为可靠,时间 过长红细胞的体积会增大,因此 MCV 不能保持稳定。MCH 可从这个计算公式得出: (MCH=Hb/RBC 数)。 某个参数从正常范围转变到异常范围的值称为临界值。使用最广泛的是 MCV 和 MCH 的临界值,疑为地贫患者 MCV 和 MCH 的临界值分别为 79 fl 和 27 pg。β-地贫 患者的 MCV 和 MCH 比正常人低,且其小细胞低色素的程度与致病突变相关。尽管 有一些重叠,一般而言,轻型 β-地贫突变引起的小细胞低色素比 β°-突变和较严重类 型的 β+-突变要轻[1 、2]。轻型 β-地贫突变携带者的 MCV 和 MCH 值正常或轻微降低。β地贫和 α-地贫复合携带者也可能出现正常的 MCV 和 MCH 值[3]。 α-地贫携带者的 MCV 和 MCH 比正常人低。α+-地贫(-α/αα)携带者的 MCV 和 MCH 可能正常或降低,而-α/-α 及--/αα 携带者的 MCV 和 MCH 总是降低

[4]

。δβ-地贫

携带者的 MCV 和 MCH 稍有降低。在地贫筛查过程中进行 MCV 和 MCH 评价时需注 意个体的铁状况应予考虑在内。

27


2.2 红细胞形态 原理 多数地贫携带者均可检出红细胞的形态变化。在病例评价时,外周血涂片染色检 查很有用。

涂片制备 EDTA 抗凝静脉全血或末稍血可用于制备血膜片。室温干燥后血膜片可用梅格伦瓦尔德染剂(或赖特氏染剂)染色。

试剂 a) 梅-格伦瓦尔德氏染剂粉末(0.3 g) b) 甲醇 (100 ml) 染色剂溶液用旋涡混合器混匀,然后在 56℃水浴箱孵育 15 分钟。不时摇动并冷 却至室温,静置 24 小时后过滤。 c) 吉姆萨染色粉末(1 g) d) 丙三醇(66 ml) e) 甲醇(66 ml) 将染色粉加入丙三醇中,然后在 56℃水浴箱内孵育 90-120 分钟。不时摇动并冷 却至室温,静置 24 小时后过滤。 f)

0.066M 磷酸缓冲液(Sorensen’s),pH 6.8。 KH2 PO4 : 9.1 g Na2 HPO4 :9.5 g(或 Na2 HPO4 。2 H2 O:14.2 g) 把上述试剂溶解于 1 L 蒸馏水,可制备 pH 6.8 的 0.066 M 磷酸缓冲液。 加入 50 ml 0.066 M pH 6.8 的磷酸缓冲液至 1 L 蒸馏水中,可用于稀释染剂和冲 洗血膜片。 配制好的染色剂溶液已有商品化产品出售。

方法 1.

滴加一小滴血液于玻片上,以 45 度角推片制作血涂片。

28


2.

空气干燥后,在盛有甲醇的器皿中固定 15 分钟。

3.

浸入以等量缓冲蒸馏水新鲜稀释的梅-格伦瓦尔德染液中 5 分钟。

4.

移至以 9 倍缓冲蒸馏水新鲜稀释的吉姆萨染液中 15 分钟。

5.

移至缓冲蒸馏水器皿中,更换 3-4 次蒸馏水进行冲洗并静置 5-12 分钟。

6.

直立静置,干燥玻片。

7.

干燥后在显微镜油镜下镜检。

解释 红细胞形态列于图 2.1。地贫患者红细胞最典型的变化是呈现小细胞、低色素和 细胞核不规则(红细胞大小和形态变异),其次嗜碱性点彩和一些靶细胞也较常见。 在一些 HbC 综合征患者中可见高含量的靶细胞。有核红细胞是骨髓机能亢进的表现, 这种细胞在 β-地贫纯合子中可发现。多染色性现象(蓝灰色和轻度增大的红细胞)与 网织红细胞的存在有关。豪-若二氏体(核 DNA 片段)在脾切除或功能性无脾镰状细 胞综合征中可见,有时在染色涂片中可观察到镰刀状细胞。

图 2.1.2 β 地贫纯合子红细胞形态

图 2.1 正常红细胞形态

2.3 网织红细胞及 HbH 包涵体的检测 原理 网织红细胞计数在地贫携带者筛查中不具诊断价值,但对于 α-地贫尤其是 HbH 病的检测,亮甲酚蓝染色可检测 HbH 包涵体。体外活体染色(亮甲酚蓝或新美蓝) 能对未成熟红细胞中残余的 mRNA 进行染色。目前一些自动电子细胞计数仪能应用 特殊的 RNA 染色法进行网织红细胞计数。

样品

29


毛细血管或 EDTA 抗凝血。

试剂 a) 亮甲酚蓝(BCB) b) 3%柠檬酸三钠(3 g 溶于 100 ml 蒸馏水中) c) 0.9% NaCl 染色液制备:1 g BCB,20 ml 3%柠檬酸三钠和 80 ml 0.9% NaCl 搅拌溶解 20 分钟,然后过滤。

方法 1.

在盛有 2-3 滴染液的试管中,加入 2-3 滴血液。

2.

混匀并于 37℃静置 15-20 分钟。

3.

制备涂片,干燥后在显微镜油镜下镜检(见图 2.2)。 计数 500-1000 个红细胞中网织红细胞(含有紫色包涵体或细丝)的百分比。 绝对数目可从下式得出: 网织红细胞 %×RBC 数/L 100 正常值: 网织红细胞%=0.0-2.0% 绝对数目=20 -100×109 /L

结果解释 网织红细胞数可用于评价红细胞生成,在溶血(或骨髓再生)时网织红细胞数明 显增加。

图 2.2 网织红细胞染色

30


2.4 亨氏小体 原理 在适当的染色条件下,红细胞内包涵体完全可见。包涵体(亨氏小体)是指细胞 内通过体外活体染色检测出来的血红蛋白沉淀物。在某些地贫类型(主要是 α-地贫) 和不稳定异常血红蛋白病中可发现。

试剂和方法 a) BCB 染色同网织红细胞一节所述。 b) 也可使用甲基紫染色(0.5 g 甲基紫溶于 100 ml 0.9%盐溶液中)。 c) 分别在 30 分钟、1 小时 、3 小时之后制备干血膜片并在显微镜油镜下镜检。

解释 亨氏小体呈现单个或多个包涵体( 见图 2.3)。HbH 病和不稳定血红蛋白病患者的 亨氏小体含量是可变的(5-50%),有时-α/-α 和--/αα 携带者的亨氏小体数目较低 (1:1000-10000 红细胞)。

图 2.3 HbH 血涂片显示亨氏小体

2.5 渗透脆性试验 渗透脆性试验(OFT)是第一种用于地贫筛查的方法,在 20 世纪 40 年代由 Silvestroni 和 Bianco 把其作为一种简便方法引进于地贫检测。这种快速简便的方法被 应用于大人群筛查试验。测定 MCV 和 MCH 的电子计数仪的推广应用使 OFT 的使用 减少,这种方法主要仍在印度和某些中东国家使用。目前已提出这种基础方法的一些 改进方案,使用最广泛的试验是 NESTROFT,即红细胞渗透脆性肉眼一管法(Naked Eye Single Tube Red Cell Osmotic Fragility Test) 的首字母缩写[5-7]。

31


原理 红细胞对低渗溶液具有一定的抵抗力。

样品 EDTA 抗凝血。

试剂 a) 0.36 % 缓冲盐水 将 10% 氯化钠(90 g)原液、磷酸氢二钠(13.65 g)及磷酸二氢钠(2.43 g)溶 于 1000 ml 蒸馏水中(pH 7.4)。 最初的方法(承蒙 Ida Bianco 教授提供)是使用泰洛氏液,用蒸馏水以 4:10 进行 稀释。 b) 泰洛氏液(1L): NaCl

8.2 g

KCL

0.2 g

MgCl2 .6 H2 O

0.2 g

CaCl2 .2 H2 O

0.2 g

NaH2 PO4 .H2O

0.1 g

NaHCO 3

0.05 g

泰洛氏液应储存于 4℃,工作液在使用前数小时内配制。

方法 1.

用吸头将 20 μl EDTA 抗凝全血加至盛有 4 ml 0.36%盐水缓冲液的玻璃管(100×10 mm)中。

2.

振荡试管,在室温内放置 30 分钟。

3.

再次振荡试管,并立即用一张正面有字的纸握住试管。

解释 如果透过试管能清楚地看见纸上的字,则试验是阴性;反之,如果不能看清纸上

32


的字则试验是阳性(具有地贫性状),这是由于液体混浊所致。

评价:此法操作简单、快速、廉价且不需要复杂的设备,但这种方法需要严格执 行标准化,在不具备电子细胞计数仪的地方尤其适用。β-地贫和 α-地贫携带者、镰状 细胞贫血和缺铁性贫血时该试验呈阳性。携带铁缺陷的患者可得到假阳性结果,因此, 受检者在 NESTROFT 呈现阳性时需进一步检查以确诊。假阴性结果也有报道[8]。

2.6 Hb 稳定性试验 血红蛋白分子正常结构破裂可导致稳定性降低,继而沉积在红细胞内引起红细胞 破裂。临床上常常表现为不同程度的溶血性贫血。 珠蛋白链的氨基酸替换,尤其是那些能构成血红素小体的非极性氨基酸,可导致 不稳定血红蛋白的产生。一般来说氨基酸替换也能引起电泳迁移率的改变,但如果被 替换的氨基酸内部或者分子的总电荷未改变,血红蛋白变异用常规的电泳法则不能检 出。因此,如果临床上疑为一种不稳定血红蛋白,即使电泳图谱显示是正常,也应该 进行不稳定血红蛋白的特异试验。轻度不稳定性可能与结合的血色素基团(Hbs)或 亚单位之间(例如 HbH 或改变氧亲和力的变异)的干扰有关。稳定性试验有两种: 异丙醇试验和热试验。

2.6.1 异丙醇试验 原理 异丙醇的存在使缓冲液极性降低,削弱了血红蛋白疏水基的结合,促进其变性和 沉淀[9]。

样品 a) 1 ml 新鲜全血(任何抗凝剂均可)用 0.9% NaCl 洗涤 2 次,加入等体积或 2 倍体 积的蒸馏水使聚集的细胞裂解,轻缓地混匀并放置几分钟,离心吸出血影细胞。 b) 某些血红蛋白变异可能较早发生沉淀并结合到细胞膜上,因此,避免使用能溶解 红细胞膜的有机溶剂,例如甲苯或四氯化碳。 c) 在相同条件下制备正常新鲜样品作为对照。使用阳性质控(如 HbH 血样品)监测

33


试剂是可取方法。

试剂 a)

Tris-HCl 0.1 M,pH 7.4: 1.21 g

Tris-羟甲基氨基甲烷

100 ml 蒸馏水 用 4 M HCl 调 pH 至 7.4 b)

Tris-异丙醇缓冲液 Tris-HCl 0.1 M pH 7.4 :83 ml 异丙醇:17 ml 室温贮存

方法 1.

取 2 只带塞的小试管(一只被测样品,另一只对照样品),每支内含 2 ml Tris-异 丙醇缓冲液及 0.2 ml 溶血液,颠倒混匀后置于 37℃水浴箱。

2.

在 5 分钟、20 分钟及 30 分钟时检查是否存在絮状沉淀物。

解释 如有絮状沉淀物表明存在不稳定血红蛋白,而对照溶液则保持清澈。 评价: HbF 具有轻微不稳定性,若 HbF 水平高于 3%可能得出假阳性结果。血液样 品贮存数日之后可引起甲基血红蛋白形成而出现假阳性结果。因此,溶血液应新鲜配 制;加入氰化钾进行溶血则可能得出假阴性结果。

2.6.2 热试验 原理 正常血红蛋白在 50℃30 分钟条件下仅有少量沉淀,而不稳定血红蛋白在相同条 件下完全变性。

样品

34


a) 可用任何抗凝剂的新鲜全血。 b) 始终检测同一个对照血液样品。

试剂和溶液 a) 0.01 M pH 7.4 磷酸缓冲液: A 液:NaH2 PO4 .2H2O:15.6 g 溶于 1 L 蒸馏水中 B 液:Na2 HPO 4 :14.2 g 溶于 1 L 蒸馏水中 b) 在 80.8 ml B 液中加入 19.2 ml A 液。 c) 混匀并于室温静置 10 分钟,测 pH 值。

方法 1.

照前面所述方法进行溶血(见异丙醇试验)。

2.

移 5 ml 溶血液和 5 ml pH 7.4 磷酸缓冲液到试管中。

3.

混匀并于 3000 rpm 离心 10 分钟。

4.

移出 2 ml 上清液到玻璃管中,然后在 50℃水浴 30-60 分钟。

解释 如果热不稳定血红蛋白存在,肉眼即可容易地观察到沉淀形成,对照样品则保持 清澈。

评价:少量沉淀的有效性难确定,如出现,应重复试验。HbF 水平高于 3%可能出现 假阳性结果。

2.7 碱变性法定量测定 HbF 胎儿血红蛋白是新生儿普遍存在的血红蛋白类型(约占 60-80%),随后逐渐降低 至较低水平,到出生后第二年低于 1%,β-地贫携带者则稍有降低。 在很多先天的/ 遗传的(δβ-地贫,缺失或非缺失 HPFH、一些 β-地贫突变)条件下和后天获得的(包

括妊娠、骨髓移植之后康复、再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征及幼稚型慢性骨 髓白血病)条件下成人 HbF 水平可能增高, HbF 仅见于称为 F 细胞的红细胞亚群中。

35


HbF 水平增高的检测和定量对于遗传咨询及 β-地贫和镰状细胞贫血的预测非常 重要。HbF 增高可能与较轻微的表型有关。 由于 HbF 的范围可由 1%到 95%,没有一种方法能准确地对 HbF 整个范围进行定 量测定。高效液相色谱(HPLC)可以给出 HbF 全范围最好的评价[10

、11]

,但其他方法

也能测定 HbF,例如碱变性法、免疫技术(通过免疫扩散法、ELISA 及免疫放射分析

法)、IEF、柱层析等。除了碱变性法之外,由于各种原因所有这些技术均不易开展而 未被广泛应用。

原理 HbF 对碱变性的抵抗力比 HbA 强。已表明碱变性法[12]在 0.8-25%的范围内可得到 可靠的结果,这个范围的 HbF 水平最常见于 δβ-地贫携带者,也是 HPFH 的主要形式。

样品 a) 任何抗凝剂抗凝的全血均可使用。 b) 用 0.9%氯化钠盐水洗涤红细胞 3 次,然后在聚集的细胞里加入 2 倍体积的水及同 样体积的甲苯或四氯化碳(CCl4 )溶血(CCl4 是有毒性的试剂,小心使用)。 c) 在机械搅拌器上振荡后,在 3000 rpm (1200×g) 离心 30 分钟,然后吸出清澈的血 红蛋白液。

试剂和溶液 a) Drabkin 氏液 K3 Fe (CN) 6

200 mg

KCN

200 mg

蒸馏水

1L

有商品化成品试剂供购买。 b) 1.2 M NaOH 4.8 g 溶于 100 ml 蒸馏水中(新鲜配制) c) (NH4 )2 SO4 :饱和溶液 706 g 溶于 1L 蒸馏水中

36


加热溶解,然后缓慢冷却至室温

步骤 1.

在 10ml Drabkin 氏液中加入 0.6 ml 溶血液(Hb 浓度 8-10g/dl,Hb 被转变为氰化

型);在 0.2 ml 碱溶液中加入 2.8 ml 血红蛋白溶液充分搅拌混匀。 2.

2 分钟后加入 2 ml(NH4 )2 SO4 溶液。

3.

用力摇动混匀后放置 5-10 分钟使变性物质沉淀。

4.

用双层滤纸(Whatman n°6 或 n°42)过滤沉淀,于 415 mm 波长读取滤液的光密 度值。

5.

将 1.4 ml 氰化 Hb、1.6 ml 蒸馏水和 2 ml 饱和硫酸铵混匀制备对照溶液,用蒸馏 水按 1:10 稀释以获得适当的光密度值。

计算 被测样品 OD415 ×100 HbF %=

对照 OD415 ×20

解释 HbF 测定是血红蛋白常规流程中最难的技术之一,不在于方法学本身,而在于如 何获得准确且具重复性的结果,只能依靠反复使用这种方法以及由经验丰富的技术人 员操作。 正常成人 HbF 含量为 0.2-1.0%。 HbF 值高于 20%时,采用这种方法其检测结果 可能会被低估。较高水平的 HbF 可用 Jonxis 和 Visser 法或 HPLC 法测定。 已发现使用不同批次的滤纸会出现误差。溶血液的浓度也很重要,稀释样品越多 可能得到的结果越高。

2.8 HbF 的细胞内分布 原理 HbF 在红细胞内的分布是不均匀的,缺失 HPFH 除外。能检测到 HbF 的细胞叫 做 F 细胞,可用 Kleihauer 酸洗脱试验[13、14]和使用特异性抗 HbF 单克隆抗体的免疫荧

37


光试验[15 、16]在血涂片上进行检测。随着红细胞悬液染色方法的建立,使红细胞经流 式细胞仪进行定量成为可能[17]。F 细胞的定量评价对 HPFH 的筛查、用去铁灵治疗镰 状细胞贫血患者的 F 细胞监控、母胎出血时在成人血液中检测胎儿细胞都很有用。最 近已报道用流式细胞仪进行 F 细胞计数的各种方法的操作步骤[18]。

2.8.1 酸洗脱技术检测 F 细胞 原理 酸洗脱技术基于酸性 pH 条件下乙醇固定的红细胞中胎儿和成人血红蛋白洗脱效 率的不同[14]。 试剂 a) pH 3.3 枸椽酸磷酸缓冲液 A 液(0.1 M 枸椽酸):21.01 g 枸椽酸溶于 1 L 蒸馏水中。 B 液 (0.2M NaH2 PO4 ) :35.6 g NaH2 PO4 .2H2 O 溶于 1 L 蒸馏水中。 将 73.4 ml A 液与 26.6 ml B 液混匀;测 pH 值,调至 pH 3.3。 b) 乙醇:80%容积 c) 染色: 0.1%赤鲜红(染料)溶于蒸馏水 Erlich 氏苏木精:将 4.0 g 苏木精结晶溶于 200 ml 95% 乙醇中并加入 8 ml 10% 碘酸纳,加入 200 ml 蒸馏水煮沸混合。冷却后加入 200 ml 含 6.0g 硫酸铵铝的丙 三醇和 200 ml 冰醋酸。溶液至少能保存 14 天。 成品试剂盒已商品化。

方法: 1.

以任何抗凝剂抗凝的全血,制备薄涂片,空气干燥 10~60 分钟。

2.

于 20-22℃下用 80%乙醇固定 5 分钟。

3.

用自来水冲洗涂片并空气干燥。

4.

用(a)液染色 3 分钟,然后用蒸馏水冲洗玻片,空气干燥。

5.

用复染剂(b)染色 3 分钟。

6.

自来水冲洗、空气干燥。

38


7.

在光学显微镜下镜检,不用油镜。

解释 F 细胞被赤鲜红深染,含有 HbA 的细胞显示为血影细胞。 成人正常值低于 0.01% 。

评价 此法不是很敏感,报告值偏低。当 HbF 浓度低时易与 HbA 从红细胞中一起洗脱 出来。浅染细胞的结果难以解释。

2.8.2 免疫荧光法检测 F 细胞 材料 a) 干净的显微镜玻片:使用从 BDH 超低温冷冻仪(Cat.no. 406/0169/02)中取出的 预先洗涤及清洁过的玻片。 用冰醋酸和乙醇先后清洁玻片,于室温干燥至少 1 小时。 每个个体用 1µl 新鲜血在干净玻片上制备 4-5 个极薄涂片,单细胞厚度。至少干燥 两天,干燥一周以上可达最佳效果。 b) 固定:乙酸/乙醇/甲醇(体积比 6:2:2)。 c) Sigma P-4417 磷酸缓冲液(PBS)。 d) 胰蛋白酶溶液:0.1%胰蛋白酶溶于 pH 7.8 的 0.1%氯化钙(CaCl2 )中。 配制 10ml 溶液[10 mg 胰蛋白酶(ICN Cat.NO.150213)+10 mg CaCl2 +10 ml 蒸馏 水]并分装为 1 ml 贮存于-20℃;或者使用胰蛋白酶片(Sigma,Cat.no.T-7168), 溶解 1 片于 1 ml 去离子水中,以 10 μl 分装并贮存于-20℃。使用前用去离子水稀 释为 500 μl(即加入 490 μl 去离子水)。使用前预温至 37℃。注意:CaCl2 的 pH 值非常重要。 e) 抗 γ 单克隆抗体(Sigma T-6653):非稀释上清液。 f)

异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记抗小鼠 IgG(Sigma T-6653)。 以 10 μl 分装、冻存。工作液:以 1:32 用 PBS 稀释。

g) 湿盒:在塑料盒内放入湿润的棉纸。

39


h) 丙三醇:PBS(1:1)或抗褪色液(Vectashield,荧光封固剂,Vector Cat.No.H-1000)。

方法 1.

用金刚钻刀片在涂片上标记一个直径约为 5 mm 的小区域。

2.

在乙酸:乙醇:甲醇固定剂中固定涂片 20 分钟,空气干燥 2 分钟(注意不能过度

干燥)。 3.

在 PBS 中重悬 5 分钟(使用盛有大量 PBS 的大容量玻璃容器),然后用蒸馏水稍 稍清洗一下,空气干燥。

4.

用预温(37℃)的 8 μl 胰蛋白酶液覆盖圆圈区域,并在 37℃湿盒中孵育 15 分钟。 注意:胰蛋白酶作用时间因片龄而异,但一般来说 15 分钟已足够。

5.

在 PBS 中轻缓地摇动洗涤 5 分钟,然后用蒸馏水洗涤,空气干燥。

6.

用 5-10 μl 抗 γ 抗体覆盖胰蛋白酶作用区域,在 37℃湿盒中孵育 30-40 分钟。

7.

照前面所述方法洗涤,空气干燥。

8.

用 5-10 μl 荧光抗小鼠 IgG 覆盖圆形反应区域,在 37℃湿盒中孵育 20-30 分钟。

9.

如前用 PBS 洗涤,用蒸馏水冲洗,空气干燥。

10. 用甘油固定:PBS 或抗褪色液。

解释和评价: 建议计数至 1000 个红细胞,相当于 4-5 个高倍视野。成人 F 细胞正常值为 0.3-4.4%,女性 F 细胞数高于男性。当然,视野数与细胞密度有关。因此,掌握制备 薄血液涂片的技术非常重要。在制备涂片前全血可贮存一周,但最好使用新鲜血。空 气干燥后的涂片用薄纸包裹室温下可保存数年。

2.9 HbA2 测定 该技术在第三章讨论。

2.10 HbS 检测 当 H b 电泳或者 HPLC 显示在 HbS 位置上出现条带或片段时,应进行 HbS 的功 能试验。有些常见的血红蛋白也会迁移至 HbS 的位置但并非镰状细胞病,这些血红

40


蛋白列于表 2.1。应注意一些其他的血红蛋白(罕见)已降低了可溶性,因此,溶解 性试验出现阳性结果,但它们不会迁移至与 HbS 相同的位置。例如 HbS-Antilles 和 HbS-Oman,这两种血红蛋白已在重型镰状细胞贫血患者中发现(见第一卷第七章)。

表 2.1 在碱性 pH 条件下电泳后与 HbS 迁移率类似的最常见的血红蛋白变异类型 血红蛋白

氨基酸替换

携带者%

人群

G-Philadelphia Hasharon

α 68 Asn→Lys α 47Asp→His

20% 15-20%

黑人、地中海地区人 艾希肯纳兹犹太人、意大利人

D-Los Angeles G-Galveston

β 121 Glu→Gln β 43 Glu→Ala

30-40% 30-40%

黑人、高加索人、印度人、地中海地区人

G-San Jose P-Galveston

β 7 Glu→Gly β117 His→Arg δβ 融合

30-40% 45-50%

意大利人、墨西哥人、美国人 黑人

<20%

地中海地区人

Lepore

黑人

2.10.1 镰状试验 进行镰状试验是诊断携带镰状细胞综合征的可疑患者的一部分。如果电泳或层析 时在 HbS 位置出现了异常血红蛋白片段(表 2.1)也应进行该试验。很多相关的试验 已报道,商业化试剂盒也已有出售。这里介绍一种已证实非常可靠且操作简单的方法。

原理 焦亚硫酸钠能降低诱导典型镰状红细胞的氧张力。

样品 以任何抗凝剂抗凝的新鲜血。

试剂 焦亚硫酸钠 0.2 g 溶于 10 ml 蒸馏水。 搅拌直至溶解,每次现配现用。 方法 1、在显微镜玻片上将 1 滴血和 1 滴 2% 焦亚硫酸钠混匀。 2、加盖玻片,用蜡与凡士林混合剂或指甲油封片,在室温可存放 1~4 小时。 3、干燥后在显微镜下镜检。

41


解释 阳性样品可见典型的镰刀状红细胞(见图 2.4)。 有时制备过程可能需要处理 24 小时,在这种情况下将玻片放入湿的陪替氏培养 皿中。 如果焦亚硫酸钠已变质或者盖玻片没封好,可能得到假阴性结果。 阳性试验不能区分镰状细胞特征(杂合子)与镰状细胞贫血(纯合子) 。操作时 需认真检查样品尤其是盖玻片边缘,这一点非常重要。

图 2.4 显示典型镰刀状红细胞的镰化试验

2.10.2 溶解度试验 还原状态的 HbS 在高磷酸缓冲液中不易溶解,形成能折射和反射光线的类晶团 聚体(水晶体)而使溶液混浊,此即溶解度试验[19]。

试剂 a) 2.58 M 磷酸缓冲液原液: 将 239.66 g K 2 HPO 4 和 164 g KH2 PO4 溶于蒸馏水中,定溶至 1L,pH 值应为 6.5。 b) 高摩尔浓度缓冲液(2 .24 M): 将上述原液 434 ml 稀释到 500 ml 蒸馏水中,搅匀并加塞。 c) 低摩尔浓度缓冲液(1.1 M) 将上述原液 213 ml 稀释到 500ml 蒸馏水中,搅匀并加塞。 缓冲液可于室温保存。在溶液清澈及无污染状态下可长期使用。 该试验试剂盒已商品化供应(例 Sickledex ,Sickle perp)

42


方法 1. 每个患者 2 只小试管(12×75 mm),贴上标签,一只标记为低摩尔浓度,另一只 标记为高摩尔浓度。 2. 吸 1 ml 高摩尔浓度缓冲液(2.24 M)和 1 ml 低摩尔浓度缓冲液分别加入相应的试 管内。 3. 用普通巴氏吸管吸取 2 滴 CCl4 溶血剂加入每管中,混匀。 4. 每管加少量(约 10-20 mg)连二亚硫酸钠粉剂,混匀并立即读数。 5. 阳性质控和阴性质控样品按上述同样步骤进行。

解释 如果贴有―高摩尔浓度‖标签的试管内有沉淀物,说明有 HbS 存在。―低摩尔浓度‖ 试管必须是无沉淀。当醋酸纤维素薄膜电泳显示在 HbS 位置出现条带,可按下表解 释可溶性试验: 低摩尔浓度

高摩尔浓度

结果

无沉淀

有沉淀

HbS

无沉淀

无沉淀

HbD 或 G

有沉淀

有沉淀

结果不确定:试剂或样品量不够

假阳性结果可能由于红细胞增多症及包括 Hb’s I、Hb Bart’s、Hb C-Georgetown、 Hb C-Alexandra 和 Hb C-Harlem 在内的异常血红蛋白所导致。阳性试验应通过血红蛋 白分离确定。高浓度的 HbF 能抑制这一反应,6 个月以内的儿童可溶性试验的阳性结 果不可靠。

2.11 DCIP 试验测定 HbE 原理 HbE 突变由 β 珠蛋白基因第 26 号密码子发生了 GAG→AAG 突变而引起,它导 致谷氨酸变成了赖氨酸,从而形成一种轻型不稳定血红蛋白并将-SH 基团暴露出来, -SH 基团在中性 pH(7.5)条件下能被包括染料 DCIP(二氯酚靛酚)在内的某些化学 试剂所氧化。HbE 和其他不稳定血红蛋白分子( 如 HbH)暴露在 37℃的上述染料中

43


将被沉淀下来[20]。

试剂 a) DCIP 试剂 Tris 碱

4.36 g

EDTA Na2 .2H2 O

2.68 g

DCIP(Sigma)

0.0276 g

皂素

0.05 g

溶于蒸馏水中,用 6 M HCL 调 pH 至 7.5 并定溶至 500ml。工作液保存于 4℃。

方法 1.

在 5 ml DCIP 溶液中加入 30 μl 全血或 20 μl 包裹的红细胞团。

2.

轻柔混匀并在 37℃孵育 1 小时。

解释: 在试管底部肉眼可见沉淀的血红蛋白。

结果与评价 纯合子 HbE 在试管底部会形成大量的沉淀物。携带 HbE 性状和 HbE/β 地贫的样 品,HbE 的沉淀物呈现浑浊或颗粒状分布。该试验在 HbH 病中也为阳性。

2.12 铁状况测定 地贫携带者筛查时常需要进行铁状况的分析和测定,很多血液学和生化指标都可 用于铁状况的测定。每一种参数反映机体不同铁代谢环节(贮存、运输、终产物、受

体)的变化且这些指标会受不同铁缺乏水平的影响。可通过简单的试验来评价铁缺乏, 例如锌血卟啉(ZnPP)、血清铁、转铁蛋白,在某些情况下也可采用血清铁蛋白测定。 红细胞 ZnPP 测定是铁缺乏筛查的最快速和最容易的方法,铁缺乏时红细胞 ZnPP 水 平将增高。铁缺乏必须用血清铁和转铁蛋白计算转铁蛋白饱和度来确诊。一些实验室 选择血清铁来测定铁状况,但应指出的是这一参数有某些局限,即存在假阳性和假阴

44


性结果。

2.12.1 锌血卟啉(ZnPP) 原理 ZnPP 是亚铁血红素生物合成期间形成的一种微量代谢产物。当铁缺乏或铁的利 用发生障碍时,锌代替了原卟啉亚铁螯酶介导的螯合作用中的铁,导致 ZnPP 形成增 多[21]。锌替换铁是铁缺乏最重要的生化反应之一,导致循环红细胞中 ZnPP 增多。

方法 ZnPP 是一种荧光复合物,任何抗凝剂的血液样品的荧光测定是检测 ZnPP 最快速 和最容易的方法。专用的血液荧光计能直接测量全血或洗涤过的红细胞的 ZnPP 荧光 与血红素(血红蛋白吸光度)的比率。氧合血液的 ZnPP 可通过波长为 415nm 的激发 光和 596nm 的发射光照射含有一层血液的玻璃载玻片表面进行测定。 目 前 , Aviv 有 限 公 司 的 lakewood NJ 和 美 国 德 州 博 蒙 特 海 伦 娜 实验 室 的 ProtoFluor Z 血液荧光计已有出售,这两种仪器便宜、快速,仅需一滴血即可。 1.

50 μl 全血滴加于载玻片上并加 25×25 mm2 盖玻片使其铺展开来。

2.

仪器应用 3 个已知血卟啉值的不同质控血液样品进行适当地校正。

结果 非铁缺乏正常个体的 ZnPP 值低于 30 μg/dl 全血。 非缺铁 β 地贫携带者的 ZnPP 值低于 40 μg/dl 全血。

评价 ZnPP 测定的其中一个优点是能与全血计数使用同一份样品。除非存在溶血,血 液样品中的 ZnPP 浓度数天内是稳定的。在铁相对缺乏时 ZnPP 会增高,此时,铁被 输送至骨髓的速率不能满足红细胞生成增加的需要,例如无效红细胞生成;高铁成红 细胞贫血症和慢性贫血病等铁利用障碍也会导致 ZnPP 增高;铅中毒时因亚铁螯合物 受到抑制 ZnPP 也会增高。而溶血和高胆红素血症会得到假的 ZnPP 增高值。 尽管 ZnPP 测定特异性低,但它是铁缺乏筛查的一种很好的工具,也被认为是铅

45


中毒的一种合适的筛查试验。一般应检测转铁蛋白饱和度以确认铁缺乏是否存在。

2.12.2 血清铁 铁贮备完全缺乏而血红蛋白水平下降时血清铁水平是降低的。一些手动和自动的 操作方法可提供,但对这些方法的描述不属于本书的范畴,在此不做介绍。 血清铁测定的局限性体现在血清铁浓度每日有较宽范围的变化,早晨浓度较下午 为低;同时与头一天所摄取的食物也有关,例如高摄入肉类可使血清铁水平增高。在 慢性感染期、炎症、发热和恶性肿瘤期的孕妇的血清铁水平较低,测试的特异性亦较 低。 血清铁应与血清转铁蛋白联合应用来计算其饱和度。

2.12.3 血清转铁蛋白 转铁蛋白是输送铁的蛋白,它能通过常规或自动的方法如总铁结合力(TIBC), 即通过血浆与铁特异性结合的量来测定,此外转铁蛋白也可用免疫学方法来测定。当 铁缺乏时血清转铁蛋白会增加,而在急性炎症、慢性感染、肾病和恶性肿瘤期则会出 现假性降低。现有一些手动和自动的操作方法可提供,但这些方法的描述不属于本书 的范畴,在此不做介绍。 转铁蛋白饱和度 转铁蛋白饱和度是指血清铁与铁结合力的比率,它是反映骨髓供铁的最准确的指 标。成人正常值高于 16%,儿童正常值高于 10%。

2.12.4 血清铁蛋白 一般血清铁蛋白用免疫放射法(IRMA)、放免法(RIA)或酶联免疫法(ELISA) 来测定。一些手动和自动的操作方法可提供,但这些方法的描述不属于本书的范畴, 在此不做介绍。 推荐 WHO 血清铁蛋白的参比标准,男性正常值为 15-300 μ/dl,女性正常值为 15-200 μ/dl。在急/慢性感染、炎症、肝病、恶性肿瘤期血清铁蛋白水平增高。当抗坏 血酸盐缺乏时血清铁蛋白水平假性降低。

46


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48


第三章

血红蛋白谱分析

3.1 层析法(HbA2 测定) HbA2 定量测定是 β-地贫携带者鉴定最有用的试验,已建立数种方法,但目 前因准确性的问题仅有少数方法值得推荐。使用醋酸纤维素薄膜电泳后经光密度 扫描测定 HbA2 的精密度和准确性不能令人满意,因此这种方法已被淘汰[1]。等 电聚焦(IEF)具有很好的分辨率,但这种方法繁琐且费时,因依赖于光密度来 定量,对 HbA2 的测定不太准确。毛细管电泳是新出现的一种血红蛋白分析方法 [2]

,有研究表明毛细管电泳和高性能阳离子交换层析(HPLC)对血红蛋白定性

和定量分析有很好的关联性[3],但这种方法尚未广泛推广应用。 最常用的 HbA2 测定方法是 DE-52 微柱层析法和阳离子交换 HPLC 法[4-7]。 这两种方法都非常准确、快速且简便。

3.1.1 HbA2 微柱层析 原理 应用 pH 梯度将 HbA2 从离子交换树脂(二乙基氨基乙基纤维素)中洗脱出 来:pH 8.3 时 HbA2 洗脱,而其他的血红蛋白成份则在 pH 7.0 时洗脱。

样品 血红蛋白浓度为 3-4 g/dl 的溶血液。 快速制备溶血液的方法是在 12-14 滴蒸馏水中加入 1 滴红细胞团。

试剂 a) 树脂:阴离子交换树脂 DE-52(英国 Whatman 公司) b) 甘氨酸(0.2 M)-氰化钾(0.01%)缓冲液: 15 g 甘氨酸+ 0.1 g KCN 溶于 1 L 蒸馏水,用 1 M HCl (37% HCl 10 ml 加蒸

馏水至 100 ml)调 pH 至 7.1-7.2。 c) 0.9% NaCl

49


树脂制备 将 100 g DE-52 加入甘氨酸-氰化钾缓冲液中并使总体积为 400 ml,磁力搅拌 15 分钟,静置 20 分钟后倒出上清。重复洗涤步骤二次,然后将离子交换树脂重 悬于新配制的 0.2 M 甘氨酸缓冲液中,在磁力搅拌时用稀释的 HCl 调 pH (7.3-7.4),静置后去除部分上清(沉淀的树脂量应相当于上清量)。已制备的树 脂在 4℃可贮存 2 周以上,但每 4-5 天需检测 pH 一次。

制备分离柱 将巴氏吸管垂直竖立于支架上,放一个小棉栓在锥形末端,栓子不能塞得太 紧。将制备好的 DE-52 填入柱中,沉淀下来的树脂应高 6-7 cm,预先填充的柱 子已有市售。

方法 1.

用巴氏吸管将溶血液加到柱子的顶部。

2.

待血红蛋白溶液沉入树脂的顶部后,加入 5 ml 甘氨酸缓冲液,收集流出液到 试管中(在加至 3-4 ml 时 HbA2 即被洗脱)。

3.

然后加 10 ml 0.9%NaCl 到柱子顶部,此时其他的血红蛋白成份将被洗脱。

4.

收集流出液并调体积为 25 ml。

5.

在 415 nm 波长读取吸光率。 按下式计算 HbA2 百分比: OD HbA2 ×100 OD HbA2 + (5×OD R*) *其余的血红蛋白

结果 非携带者 HbA2 正常值=2-3.2%。 β-地贫携带者 HbA2 值增高(3.8-7%)。

评价 适当调整 pH 值是关键,不同实验室之间或使用不同批号 DE-52 可能有差

50


异。不稳定血红蛋白携带者 HbA2 轻微增高,而 δ-地贫携带者 HbA2 降低,α-地 贫携带者 HbA2 有时也会降低。

3.1.2 用 HPLC 进行血红蛋白病筛查 阳离子交换高效液相色谱(HPLC)已成为 HbA2 、HbF 定量的首选方法, 也是其他血红蛋白变异 (尤其能与 β-地贫相互作用的血红蛋白变异)的定量方法, 如 HbS、HbE、HbC、Hb O-Arab、HbD 和 Hb Lepore 等。 原理 在一定的压力下不同浓度的磷酸缓冲液(流动相)通过离子交换柱(固定相) 。 固定相由一个温度仪构成,具有阴离子或阳离子微粒(3-5μm)的树脂检测室控 制这个温度仪。色谱站通过双活塞泵按梯度程序输送增加离子强度和 pH 值的缓 冲液到检测室,依据固定相与流动相的离子相互作用进行血红蛋白的分离。 分离后的血红蛋白通过带有滤光器的流动池,在 415 nm 波长下测量吸光率, 背景信号由另外一个波长为 690 nm 的滤光器来校正。每种血红蛋白具有各自特 异的保留时间(指由样品注入到血红蛋白色谱峰顶点所经过的时间),每次运行 开始时,用同一个校正样品对 HbA2 、HbF 和 HbA1C 进行自动校正。系统的专 用软件能把每次得到的原始数据转变为色谱图,随着血红蛋白片段被洗脱下来, 各种血红蛋白的保留时间、峰面积和测定值(%)都会显示出来。实验报告能呈 现出 HbF、HbA1C、HbA 和 HbA2 的百分比,并提供异常血红蛋白定性和定量检 测的其他信息。

样品 以任何抗凝剂抗凝的静脉血。

方法 常用的仪器是 Bio-Rad 公司的 VARIANTT M,与 Bio-Rad 公司最新型号 D10 一样,VariantⅡ是另一种常用的仪器。目前使用其他仪器也能得到可靠的结果, 如 HA8160(Menarini Arkay)和 G7 (Tosoh-生物科学 )。

51


结果与解释 正常个体 HbA2 预期正常值为 1.7~3.2%,而 β-地贫携带者为 4.0~7%,HbA2 在 3.2~3.8%被认为是临界水平。处于临界水平的样品需要进行进一步检测(见

第一卷)。一般 HbF 的正常范围是低于总血红蛋白的 1.5%。 HPLC 仪器带有一些窗口(被定义为保留时间间隔),这些窗口能帮助分析 在血液样品中检测出来的正常血红蛋白和异常血红蛋白[8]。这段保留时间间隔内 常见血红蛋白变异被洗脱(如 HbS、HbC 和 HbD),但由于其他血红蛋白变异可 能与这些常见变异具有相似的保留时间(见表 3.1),因此,利用这种方法对血红 蛋白变异进行鉴定仅能得到初步的结果(见图 3.1),血红蛋白变异的最后鉴定还 需通过 DNA 或珠蛋白氨基酸分析来进行[9]。HPLC 目前也应用于新生儿血红蛋 白病筛查计划[10]。 表 3.1 HPLC 系统中一些常见血红蛋白变异的保留时间 窗口

F ~1.20

易变的

稳定的

A 1c

A 1c

A0

A2

~2.70

~3.40

~4.16

~4.25

~4.80

Bari

Sassari

Dallas

Hastharon

E

G-Phil.

O-Padova

Lepore

D-Los Ang.

O-Arab

G.-Copen.

G-St.Jose

Shelby

J Sard.

S

Abruzzo D-lbadan Belfast M atera Zurigo 保留时间(分钟)

不同仪器所得到的洗脱谱不同

52

C ~5.20


图 3.1 高效液相色谱图

方法的局限性 由于 Hb Lepore 和 HbE 随着 HbA2 一起洗脱下来,样品中这三种血红蛋白的 存在会使得 HbA2 含量明显高于其真实水平(>10%),如此高的 HbA2 水平在 β地贫携带者是不可能存在的[6]。由于可能存在与 HbA2 峰保留时间相同的血红蛋 白变异,因此,一旦发现 HbA2 水平大于 10%的样品应进行进一步检查。由于 HbS 少量成份(可能是 HbS 翻译后修饰)与 HbA2 共同洗脱,HbS 携带者的 HbA2 水平增高到 3.5%以上。目前在 HbS 存在时 HPLC 也能定量 HbA2 ,了解生产商 的产品要求和弄清哪种方法受 HbS 的影响都很重要,这同样适用于 HbA2 洗脱 后其他的血红蛋白变异的洗脱。利用色谱也能检测 HbH 和 HbBart’s,但不能进 行定量,因为它们的保留时间为 0.1 分钟,在结合开始前就已被洗脱。

3.2 电泳法 电泳是一种基于离子在电场里迁移的分离技术,它是血红蛋白鉴定和定量的 经典方法。 在任何已知 pH 值的溶液中血红蛋白分子(如 HbA、 HbA2 、HbF 和变异体) 被电离,根据分子本身带有的离子基团(酸性或碱性侧链 ),它们可带正电荷或

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负电荷。总血红蛋白是这些分子的混合体,它具有净负电荷。当存在电位差时, 带电微粒则根据其净电荷极性而向负极或正极移动,带有不同总电荷的分子将开 始分离。

3.2.1 电泳方法的分类 电泳法有几种,主要根据支持媒介来分类。广义的分类分为―自由电泳‖和―零 位电泳‖,前者指分子在液体中发生迁移,后者指溶解于缓冲液中的分子在固态 媒介中发生迁移。 支持媒介物描述如下: a) 液体——唯一一种仍用于分离血红蛋白分子的―自由‖方法是毛细管电泳。 b) 固体——包括纸(现已不再使用)和乙酸纤维素(最常用的媒介物之一)。 c) 凝胶——如淀粉(亦不再使用)、琼脂、琼脂糖和聚丙烯酰胺。

根据分子(质量)大小、分子形状和媒介物的摩擦效应的差异,有些媒介物 能影响分子的分离。因此,媒介物的选择将影响分离的质量。迁移率和分辨率主 要依赖于: a) 电场的强度 b) 分子质量 c) 分子是否疏水 b) 缓冲液的离子强度 c) 缓冲液的温度 例如高电压下分子分离较快但过大的电流会引起发热,从而引起电解液蒸 发、虹吸而使泳动条带变形和分子变性。缓冲液的选择也很重要,由于缓冲液决 定了 pH 值和离子强度,前者影响蛋白质移动的速率和方向,后者影响分离速率。 缓冲液中的成份可与蛋白质发生相互作用而引起电荷密度的改变。 在实际操作过程中电泳方法的选择受到上述因素影响。至少可选用两种方法 鉴定阳性血红蛋白,即在 pH8.4 条件下乙酸纤维素薄膜碱性电泳和在 pH6 条件 下的柠檬酸琼脂酸性电泳。由于一些血红蛋白在某种媒介具有相同的迁移率而在 另一种媒介则可被分离,如 HbS、HbD 和 HbG-Philadelphia 碱性电泳时一起迁移,

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HbE 和 HbC 亦出现同样情况,而在柠檬酸琼脂中它们的迁移率则不同。在标准 实验室,其他的方法如等电聚焦(IEF)和/或高效液相色谱(HPLC)也可用来 解决诊断问题。 本章将概述在地贫人群筛查计划、纯合子特性诊断和各种变异鉴定中最常用 的电泳方法,主要包括乙酸纤维素薄膜电泳、柠檬酸琼脂电泳和等电聚焦。实际 上几乎所有的实验室都依赖于前两种方法,但由于一些血红蛋白的分辨率低而受 到限制。尽管大多数情况下联合使用前两种方法即可进行诊断,但用等电聚焦可 鉴定一些更为罕见的变异。

样品 a) 一般使用 2-3 ml EDTA 抗凝全血样品,也可使用其他抗凝剂。 b) 用蒸馏水和四氯化碳使红细胞裂解,然后离心得到清澈的溶血液用于电泳。 尽管贮存于-80℃的溶血液能使用,但最好使用新制备的溶血液,。

3.2.2 乙酸纤维素薄膜电泳 这是一种用硫酸作催化剂采用医用棉和乙酸产生的纤维素乙酸盐,在乙酸纤 维素板或乙酸纤维素膜表面的胶片上进行迁移。蛋白质的分离主要通过电荷,乙 酸纤维素电泳不仅可用于定性鉴别血红蛋白变异,伴随洗脱也可用于定量分析如 HbA2 、HbA、HbS、HbD、Hb Lepore、α-链变异、HbH 和 Hb Bart’s 等血红蛋白。

试剂与材料 a) Tris-EDTA 硼酸(TEB)缓冲液,pH8.4 Tris-羟甲基氨基甲烷(TRIS):10.2 g 乙二胺四乙酸(EDTA):0.6 g 硼酸:3.2 g 加蒸馏水至 1 L b) Whatman N0.3 层析纸 c) Scheicher 和 Schuell 提供的乙酸纤维素膜,40×300 mm,也可用 Sartorius 和 Shandon 公司的同类产品。

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d) HbA2 质控:由国家生物标准和质控研究所(NIBSC)提供。 质控品由人类细胞制备的血红蛋白液加入蔗糖(200 mM)、氰化钾(6 mM) 和氯霉素(1 mg/dl)稳定后冻干制成。这种质控品作为国际参比试剂由世界 卫生组织于 1994 年制备,其设计值为总血红蛋白的 5.3%。

所需设备 (i) 能输送恒定电流的电源,0-80 mA、400 伏特以内。 (ii) 水平电泳糟,配有可调节的桥式间隙和极性指示器(例如 Shandon)。 (iii) 振荡混合器。 (iv) 单束 SP6-200-Pye Unicam 分光光度计。

方法 1. 溶血液由 K 2 EDTA 抗凝全血制备,方法同前所述。 2. 在电泳糟内加入约 900 ml TEB 缓冲液,用 Grade N0.3 层析纸切成虹吸条并沿 着长 22 cm 长桥放到电泳糟中。 3. 将乙酸纤维素膜切为每条 40×100 mm 并在 TEB 缓冲液中浸泡 5 分钟(光面

向下),然后放入电泳糟。 4. 用 250V 电压通电 5 分钟使膜与缓冲液达到平衡。 5. 关闭电源,在每块膜的阴极末端用毛细管加入 8-10 μl 溶血液(10 g/μl)。 6. 然后将电压设为 250~300 伏,每块膜条以 2 mA 的恒定电流进行电泳。 7. 电泳约 45 分钟至 1 小时,直至带与带之间出现明显的分界。 8. 关闭电源,切下乙酸纤维素膜上分离出的 HbA2 ,并浸泡于盛有 4 ml 蒸馏水 的试管中,HbA 浸泡于盛有 16 ml 蒸馏水的试管中。如存在血红蛋白变异, 将其切下分别浸泡于 4 ml 或 16 ml 蒸馏水中,蒸馏水的量取决于血红蛋白变 异的质量。注意每次电泳时需同时切下一条干净的乙酸纤维素膜制备空白对 照,电泳完后切下浸于 4 ml 蒸馏水中。 9. 然后将试管放到一个旋涡混合器上振荡 30 分钟以洗脱血红蛋白。 10. 移出膜条,将试管以 3000 rpm 离心 10 分钟。 11. 空白校正后在分光光度计上以波长 413 nm 读取每种血红蛋白的光密度值。

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解释 结果按下式计算: HbA2 吸光率×100 HbA2 %=-----------------------------------------------总吸光率(HbA×4) + HbA2 吸光率

血红蛋白在乙酸纤维素膜上从阴极到阳极按下列次序迁移:HbA2 、HbE、 HbC、HbD、HbS、Hb Lepore、HbF 、HbA、快速带 Hb Bart’s 和 HbH(见图 3.2)。 HbA2 的正常范围是 2.4~3.2%。

图 3.2 乙酸纤维素膜电泳各片段的位置

影响结果的因素包括: 合适的 pH 值、合适的缓冲液浓度和温度。缓冲液温度易受电压或环境温度 的影响,一般将装有缓冲液的电泳糟保持在 4℃冷藏(尤其在炎热的天气)。当 环境温度低于 23℃进行电泳操作较为理想,因此,在温暖的气候实验室需使用 空调。载体膜的质量必须良好,质量差的膜应挑出弃之,同时膜应保持湿润。

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图 3.2.1 乙酸纤维素薄膜电泳设备

图 3.2.2 乙酸纤维素薄膜电泳图例

3.2.3 琼脂凝胶电泳 琼脂是一种取自红色海藻细胞壁的凝胶状物质,它由一种中间具有空隙的交 联分子基质构成。在电场中血红蛋白分子将通过基质移动,迁移率取决于分子大 小、形状以及电荷,也就是说带有高电荷的较小线性分子,将以较快的速率移动。 琼脂电泳不是一种令人满意的筛查技术,因为这种技术无法将各种异常血红 蛋白从 HbA 中区分出来,但这种技术能将 C 组区分为三个片段:HbC 、HbO-Arab 和 HbE+HbA2 。这种技术也能将 HbS 从 HbD 中区分出来,将 HbF 从 HbA 中区 分出来,将 HbS Little Rock、HbS Rainier 和 HbS Bethesda 从 HbA 中区分出来, 将 HbH 从 HbI 中区分出来。

试剂

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a) 储备缓冲液-柠檬酸缓冲液,pH5.9: 将 73.5 g 柠檬酸三钠(Na3 C6 H5 O7 · 2H2 O)溶解于约 700 ml 蒸馏水中。用 0.5 M 柠檬酸(10.5 g/100 ml)调 pH 至 5.9,约需 34 ml 左右。用蒸馏水定溶至 1L, 储存于 4℃。 b) 工作液: 按 1:5 加蒸馏水稀释储备液,pH 应为 6。 c) 凝胶: 预先制备 Titan IV 柠檬酸琼脂凝胶板(由英国 Helena 实验室提供)。 d) 溴酚蓝——用于凝胶染色 将 20 mg 溴酚蓝溶于 200 ml 含有 2 ml 冰醋酸缓冲液的蒸馏水中。

设备 (i)需能输送 30-40 mA 电流的电源(Vokan SAE 2761,Vokan 400)。 (ii)一台 Southern 水平电泳槽。 (iii)凝胶梳,一种制备样品点样孔的设备。

方法 1. 用凝胶梳在凝胶上作 5 个孔,中间一个位于阳极与阴极之间。 2. 用毛细管将足够的溶血液填入凝胶的每个孔中。 3. 加 700 ml 工作缓冲液到电泳槽内。 4. 沿着电泳槽内的桥放入由 Whatman N0.3 层析纸制成的膜条,沿着膜条放入 凝胶,为了确保凝胶与缓冲液充分接触,使用另一条 Whatman N0.3 层析纸 制作的膜条来固定位置。 5. 使用 30 mA 左右(40 V)的电流通过凝胶。 6. 在 4℃电泳。 7. 约 3 小时后,分离完成。 8. 用溴酚蓝染液染琼脂板 20 分钟,然后用蒸馏水冲洗。

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图 3.3 琼脂凝胶电泳图例 泳道 1、4:正常成人

泳道 2:HbS/β+- 地贫

泳道 3:HbS/β°-地贫

解释 琼脂凝胶电泳的典型结果显示于图 3.3。

3.2.4 等电聚焦 等电聚焦是根据等电点来分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的净电荷是氨基酸 和离子基团(氨基和羧基末端)的全部正、负电荷的总和。等电点(pl)是分子 净电荷为零的一个特定的 pH 值(蛋白质在 pH 值低于等电点时带正电荷,而在 pH 值高于等电点时带负电荷)。 为了使蛋白质在电场的作用下移动到其净电荷为零的位置上,需要一个 pH 值梯度。带正净电荷的蛋白质将向阴极移动,在移动过程中通过 pH 值梯度时正 电荷逐渐减少,直到它到达与其等电点值相一致的位置为止。 等电聚焦需要如琼脂凝胶和聚丙稀酰胺凝胶等固体的支持。聚丙稀酰胺是一 种具有同蛋白质大小相似的小空隙的聚合体,除了表面电荷外可根据分子大小来 进行分离。等电聚焦包含两性电解质的合成缓冲液,能缓冲 pH 梯度。 等电聚焦需要高电压(1000 V 或以上),这种方法分辨率高,比其他任何方 法分离效果都好。其分辨率取决于: i) pH 梯度 ii)凝胶厚度 ii)电泳时间

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iv)使用的电压 v)蛋白质进入凝胶的扩散度

方法 塞浦路斯实验室选用的等电聚焦技术是 Phast SystemT M,使用前浸泡聚丙稀 酰胺干胶,使用较窄的 pH 梯度(6.7~7.7)。这种 pH 梯度由 Pharmalyte®制备, 电泳期间在凝胶上能产生稳定、线性的 pH 梯度。在电场作用下血红蛋白迁移到 与其等电点相一致的 pH 值位置,分离出来的血红蛋白经染色后在凝胶上通过目 测来分析。可用已知血红蛋白变异的蛋白质谱来鉴定未知血红蛋白样品的蛋白质 谱。

试剂 a) Plast 凝胶干 IEF 板* b) pH 6.7~7.7 Pharmalyte* c) 煤油 d) 20%三氯乙酸固定液 e) 染色储备液:一片 Phast 凝胶蓝 R 片*(1 片+80 ml 蒸馏水+120 ml 甲醇), 溶液搅拌 2 分钟并过滤 2 次。 f) 甲醇 g) 含有 300 ml 甲醇+100 ml 乙酸+600 ml 蒸馏水(3:1:6)的复染液 h) CuSO 4 (5H2 O) 染色工作液制备:将 30 ml 染色储备液与 270 ml 的 3:1:6 复染液和 0.45 g CuSO 4 (5H2 O)混匀,溶液过滤并在使用前新鲜配制。 i) 0.1%三硝基甲苯 *可由 Amersham-Pharmacia 公司提供

设备 法玛西亚 LKB-Phast 系统 该系统包括:

61


a) 分离槽 b) 染色槽 c) Phast 凝胶样品——8/1 型点样器 d) Phast 凝胶样品——点孔器 e) LKB 法玛西亚光密度扫描仪 所有功能均由显微处理仪控制。

凝胶制备 干凝胶的重水合处理:用 1:16 pH 6.7~7.7 的 pharmalyte 溶液(100 μl Pharmalyte+1500 μl 蒸馏水)将干胶重水合处理。将干胶板凝胶面向下放在一块 加了微量溶液的干净塑料表面,每小时检查一次,板不能粘贴到塑料表面。 重水合处理之后,用滤纸的边缘轻轻擦拭凝胶表面,吸去多余的液体。

样品制备 将 5 μl 全血用 200 μl 0.1%三硝基甲苯稀释制备样品混合液,静置 5 分钟, 然后在旋涡混合器上混匀。5 μl 用于样品点样。

样品点样 装载点样器,在一条封口膜上制成凹孔(使用 PhastGel 点样器)。每份样品 加 5 μl 于凹孔内。每份样品用 8/1 型 PhastGel 点样器吸取 5 μl。

方法 1. 将平板置于 Plast 系统的冷却床上,每块板上滴 2 滴煤油。 2. 当凝胶接上电极后,预聚焦步骤即开始进行。 3. 预聚焦后,用 1 μl 点样器将样品点于凝胶的正极。 4. 不同类型的平板通过 Phast 系统的微处理机使用不同的分离程序。 5. 以下是在 PhastGel Dry IEF 6.7~7.7 系统上应用的分离程序: 步骤 1.1

1000 V

2.0 mA

2.0 W

15 t 75 vh

步骤 1.2

300 V

1.0 mA

1.0 W

15 t 25vh

62


步骤 1.3

1500 V

5.0 mA

3.5 W

15 t 550 vh

步骤 1.4

0V

0 mA

0W

0 t 0 vh

6. 分离程序结束 点样器降至 1.2 vh 点样器升至 1.3 vh 7. 上述在 Phast 系统上使用的方法称为分离法 1,包括 3 个分离步骤:步骤 1.1、 步骤 1.2 和步骤 1.3,最后一步即步骤 1.4 用于结束程序。 8. 步骤 1 中的 75 vh,点样器上样,此后样品即进入凝胶。期间在 73 vh 时会报 警提示点样将在 2 vh 时发生。步骤 3 中点样器将自动升高到 100 vh,分离即 按上述设定程序进行。

染色 聚焦步骤后把凝胶放到染色缸内,用 20% TCA 在 20℃固定凝胶板 5 分钟, 用蒸馏水洗 2 分钟,再用含有 0.15% w/v% CuSO 4 (5H2 O) 的 0.2% 考马斯亮蓝(储

备液:复染液=1:10)在 50℃对板进行染色。 在 50℃复染液中将板再染色 10 分钟,干燥。 在激光光密度扫描仪上扫描凝胶板,测定等电点。 已知血红蛋白(HbF、HbS、 HbA2 、HbA、Hb Lepore 和 HbD)样品和未知 血红蛋白样品在同一块板上进行电泳。这种方法不能区分 HbG-Philadelphia、Hb Lepore、HbE 和 HbO-Arab。

解释 通过激光光密度扫描仪测定血红蛋白的等电点来进行未知血红蛋白的鉴定, 同一块板上分离的已知血红蛋白的等电点值可作为质控。等电聚焦分辨率极好, 但不能精确定量。

图 3.4 举例说明了在 pH6.7-7.7Phast 凝胶板上各种血红蛋白的分离。

63


图 3.4 通过 IEF 在一块 pH6.7-7.7 凝胶板上各种血红蛋白的分离 1.

泳道 1、2、6、7、8 为脐血样品

2.

泳道 3 为 Hb Lepore 性状

3.

泳道 4 为 HbD 性状

4.

泳道 5 为 HbS 性状

3.2.5 其他方法 无论常规操作还是为了解决诊断难题,其他方法也可用。一种较新的能得到 极好分离结果的技术是毛细管电泳。这种技术用传导缓冲液充满毛细管(内径 50nm),样品从毛细管一端注入,通电后蛋白质将迁移到另一端。通常用紫外吸 光度来测定分离后的蛋白质,也可用荧光和放射性标记来测定。目前已建立多种 模式的毛细管电泳: a) 毛细管区带电泳。这种方法可用碱性或酸性缓冲液来测定血红蛋白变异,并 可定量检测 HbA2 和 HbF。 b) 毛细管凝胶电泳。 c) 毛细管等电聚焦。 d) 毛细管层析。可用微芯片毛细管电泳,适用于 DNA 分析。 已建立毛细管区带电泳分离珠蛋白链的技术。 尽管毛细管电泳尚未在常规实验室推广应用,但这种方法具有潜在的优点: 省时、自动化结果可靠,并可多通道毛细管同时进行检测,但仪器的价格不菲。

64


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65


第四章

珠蛋白链合成

30 年多前,珠蛋白链合成分析被引入地贫综合征的研究中[1],这种方法对了 解各种地贫综合征的病理生理学机制作出了极大的贡献,而且在 DNA 时代这种 方法仍是很敏感的诊断手段,对于一些复杂或非典型类型的地贫的解释也非常有 用。 本章概述两种已建立的珠蛋白链合成分析方法:一种是基于珠蛋白链分离的 羧甲基纤维素层析的 weatherall 和 Clegg 经典方法,另一种是反相高效液相色谱 (HPLC)[2]。此外,还介绍一种快速方法——垂直等电聚焦。这三种方法均使 用一些常见的实验技术(包括白细胞移除、网织红细胞富集、与氨基酸共同孵育

和放射标记氚亮氨酸),而珠蛋白链分离的实验技术不同是这三种方法的主要差 异。尽管有重叠的地方,但每种方法都将详细介绍。

4.1 Weatherall 和 Clegg 方法 这种方法已应用于产前诊断,首例血红蛋白病的产前诊断就是使用这种技术 完成[3]。目前这种方法已很少应用于产前诊断,若一对夫妇较晚做产前诊断或配 偶无法受检,或父母携带未知突变时才使用这种技术。这种方法基于 β-珠蛋白链 (代表 HbA)和γ 珠蛋白链(代表 HbF)的相对合成来进行诊断,β/γ 链合成率 在 0.02 以上表明胚胎未受累。 由于轻型 β+-地贫突变能产生更高水平的 β-珠蛋白, 这种情况下对未受累胚胎进行检测可能会引起误诊,因此,对结果的解释必须非 常谨慎[4]。 当全血计数和血红蛋白电泳无法得出结论性诊断结果时,也可使用这种方法 进行风险评估。例如一个有小细胞低色素特征而 HbA2 水平正常的个体,如果珠 蛋白链生物合成分析结果得出携带 β-地贫性状的生物合成率,那么可诊断为正常 HbA2 β-地贫性状。珠蛋白链合成也可用于骨髓移植病人在移植和随访时监测 β/α 活性。

4.1.1 血红蛋白的体外标记 66


由于胎血富含网织红细胞,使用胎血做产前诊断时,不需要进行白细胞移除 和网织红细胞富集等步骤。 方法 1. 血液样品用肝素锂抗凝并保存在 4℃。 2. 在 4℃以 4000 rpm 离心样品 15 分钟沉淀血液,移弃血清和血黄层。 3. 为了移除白细胞,将富含网织红细胞的细胞重悬于约 5 ml 冷的 krebs-Ringer 磷酸溶液中,并装载于一条长 2 cm、直径 1 cm 的柱内,柱子含有 α 纤维素 (Sigma C 8002)和 Sigmacell 50 型微晶纤维素(Sigma S 5504),它们溶解于 KRP 缓冲液而形成混合液。 4. 再用 5 ml 冷的 KRP 缓冲液洗脱红细胞,重复一次。 5. 用 0.5 mCi 3 H 亮氨酸标记红细胞团,加入 0.1 ml 孵育混合液在 37℃振荡水浴 箱内孵育 2 小时。 6. 然后将样品用冷的 KRP 缓冲液洗 2 次以去除游离的 3 H 亮氨酸。红细胞团可 直接用于珠蛋白链抽提或贮存于-80℃。

试剂 a) Krebs-Ringer 磷酸(KRP)缓冲液 KRP 是在生理 pH 条件下配制的一种平衡盐溶液,构成如下。 b) NaCl 1.5 M 87.66 g NaCl 溶于 1L 去离子水 c) 磷酸缓冲液 pH7.4 A.0.1 M NaH2 PO4 · 2H2 O(分子量为 156)= 15.6 g 溶至 1 L B.0.1 M Na2 HPO 4 · 2H2 O(分子量为 178)= 17.8 g 溶至 1 L 加 19 份 A 到 81 份 B 中,调 pH 至 7.4。 d) KCl 0.15 M 5.6 g KCl (分子量为 74.56)溶于 500 ml 蒸馏水中 e) MgSO4 0.15 M 3.7 g MgSO 4 · 7H2 O(分子量为 246.48)溶于 100 ml 蒸馏水中 f)

CaCl2 0.11 M

67


1.62 g CaCl2 · 2H2 O(分子量为 147.02)溶于 100 ml 蒸馏水中

配制 KRP 缓冲液: 将 100 ml 1.5 M NaCl 补足至 1L 加入:120 ml 磷酸缓冲液 pH 7.4 40 ml 0.15 M KCl 10 ml 0.15 M MgSO 4 10 ml 0.11 M CaCl2 ——小心搅拌,避免沉淀 用 NaOH (1 M)调 pH 至 7.4 检查渗透压,如需调节,则用 1.5 M NaCl 贮备液或蒸馏水调节渗透压到 280~300 m OsM。

培养液配制 从血库中获取一包 AB 型 Rh 阴性血液,加入 3.0 ml硫酸铵铁溶液(10.5 mg/10 ml 水),用铁使血清转铁蛋白达到饱和,室温静置 30 分钟。KRP 缓冲液注入煮 沸过的透析管中,在 4℃透析 48 小时去除游离的氨基酸,在 1 小时、6 小时和 24 小时更换 KRP 缓冲液。KRP 缓冲液内含有钙,会引起凝块,故需用尼龙网过 滤透析血清以去除纤维蛋白,将葡萄糖(6 mg/ml 血清)和不含亮氨酸的混合液 (0.133 ml/ml 血清,详见下面)加入血清中,并用 1 M NaOH 调 pH 至 7.4。终 培养液每 0.5 ml 进行分装,最后储存于-40℃备用。

不含亮氨酸的混合液配制 用水制备每种氨基酸的储备液各 20 mM(10ml),并储存在-40℃备用。表 4.1 表示氨基酸储备液的成份。为了制备不含亮氨酸的混合液,除亮氨酸外每种 氨基酸储备液 1 ml 混合成 20 ml 1 mM 的总储备液。 表 4.1 Weatherall 和 Clegg 方法所用的单氨基酸储备液的成份 氨基酸

分子量 (MW)

mg/10 ml

1

丙氨酸

68

13.6

2

精氨酸

210

42.0

68


3

天冬酰胺

133

26.6

4 5 6 7

天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸

150 157 147 146

30.0 31.4 29.0 28.0

8

75

15.0

9

甘氨酸 组氨酸

155

31.0

11

异亮氨酸

131

26.2

12

赖氨酸

183

36.6

13 14

蛋氨酸 苯丙氨酸

149 165

29.0 33.0

15 16

脯氨酸 丝氨酸

115 105

23.0 21.0

17 18

苏氨酸 色氨酸

119 204

22.8 40.8

19

酪氨酸 缬氨酸

181

36.2

57

11.4

20

3

H 亮氨酸的制备 从 Amersham 生物科学公司购买的 3 H 亮氨酸(TRK 170)是 5 mCi/5 ml 含

2%乙醇的水溶液,对产前诊断样品所需的活性标记来说,浓度太低,可用冻干 机来浓缩,再用少量已测体积的 KRP 缓冲液进行处理,通常 0.5 ml/5 mCi 3 H 亮 氨酸处理后终浓度为 10 mCi/ml。

4.1.2 载体血红蛋白 有时为了确定珠蛋白链中存在的极少量的放射活性,在珠蛋白抽提前需加入 载体溶血产物。对于胎儿样品尤其重要,由于胎儿 β-珠蛋白链微量,通过羧甲基 纤维素柱层析在光密度监测器上无法读数。载体溶血产物是一种由成人血液样品 稀释后血红蛋白浓度为 2 g/dl,分装贮存于-40℃的非放射性溶解产物。在珠蛋白 抽提前加约 0.5 ml 这种载体溶液到放射性实验样品中。

4.1.3 珠蛋白制备 珠蛋白可通过酸/丙酮沉淀来制备[5]。通过冷冻或加入蒸馏水把已孵育的细胞

69


稀释为 2-4 g/100 ml,在-20℃已预冷的 11.3 M 1.5%(V/V) HCl 的丙酮中加入溶血 产物(边滴加边搅拌),1 ml 血红蛋白溶液使用 20 ml 酸/丙酮,在这个过程中血 红蛋白发生变性,蛋白质组份被沉淀下来而血红素保留在液体中。然后在-20℃ 3000 rpm 离心 1 分钟,吸出含有血红素的酸/丙酮,用-20℃预冷的丙酮洗脱珠蛋 白 2 次,每次 3 分钟,第 3 次用二乙醚来洗脱,移弃上清液,将试管水平放置或 轻轻颠倒以便乙醚挥发。细胞团干燥前用巴氏管将其吹散,有利于完全干燥成洁 净的白色粉末。如果不立即使用珠蛋白,可贮存于-40℃。

4.1.4 羧甲基纤维素层析 Clegg 等改良了这种方法,珠蛋白链通过羧甲基纤维素(CM23,Amersham

生物科学)柱层析的尿素-磷酸缓冲液梯度来分离。分离珠蛋白链最适合使用 pH6~7 的磷酸缓冲液,但在这种 pH 条件下珠蛋白相对不易溶解,所以需要尿素 作为溶剂,还需要加入还原剂(二硫苏糖醇)以防止珠蛋白链的游离巯基形成二 硫键。珠蛋白与羧甲基纤维结合的能力取决于珠蛋白所带的净正电荷,在 pH 6~7 的条件下每种珠蛋白与纤维素的亲和力为 α>β>γ,因此,γ 链首先从柱体中洗脱, 接着 β、δ 和 α 链分别被洗脱。这种方法可制备 6 条柱子。

试剂 a) 尿素缓冲液的配制 将 1440 g 尿素溶于蒸馏水中,并定溶为 3 L 8 M 的溶液,用去离子树脂混合 床柱体过滤尿素溶液。滤液按下述方法分为两份: b) 弱缓冲液 1800 ml 8 M 尿素溶液加 1.05 g 磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ),用 20%的正磷酸调 pH 至 6.4,加入 180 mg 二硫苏糖醇。 c) 强缓冲液 1200 ml 8 M 尿素溶液加 5.1g Na2 HPO 4 ,调 pH 至 6.4,加 120 mg 二硫苏糖醇, 最后制备 0.004~0.028 M 的溶液梯度。

柱层析

70


层析的建立见图 4.1。首先在 200 ml 弱缓冲液中溶解 15 g 羧甲基纤维素 (CM23),数分钟后将缓冲液倒进 6 条柱子(0.5 cm×15 cm)内,静置后再加缓 冲液至柱子刻度为 12 cm 的位置,然后每条柱子通过聚乙烯导管与 Uvicord S11 分光度计(Amershnm 生物科学)和分馏收集器连接起来。以波长 280 nm 连续 读取流出物的光密度值,分别在 6 个通道的记录仪进行记录,其中一个通道用于 记录每次分馏收集器所收集的分馏物数量,这样就可以确定 α、β 和 γ 片段的色 谱峰的光密度值。当柱体填满后,以 0.5 ml/分的流速用弱缓冲液洗脱 10-15 分钟, 珠蛋白样品发生溶解,把溶解于 2-3 ml 弱缓冲液中 5-10 mg 珠蛋白小心地进行过 柱,再用 10 ml 弱缓冲液洗柱。 最后将柱子塞住并连接到 6 个蠕动泵上,以 5 ml/12 分钟的流速用弱缓冲液开始进行洗脱。 用二条柱子组成的线性梯度生成器制备磷酸钠梯度(每条柱的直径为 9 cm,

以聚乙烯管互相连接——此步骤可在室内进行),其中源头分隔室用 1200 ml 弱缓 冲液开始运行,其他的分隔室用 1200 ml 强缓冲液开始运行。运行前通过连接管 上的缺口隔开各个分隔室,加入弱缓冲液,冲洗梯度配制仪与分馏收集器间的管 道。当柱子与蠕动泵连接后,弱缓冲液的分隔室被调节成与强缓冲液的分隔室一 样的水平,两个分隔室通过聚乙烯连接管上的钢夹开关连接起来。 调整蠕动泵的流速为 5 ml/12 分钟,预设分馏收集器的收集时间为 12 分钟, 所有设备均连接到定时器上(预设为 17 小时),以保证在运行结束后能收集至少 80×12 分钟的分馏物。

71


图 4.1

柱的制备

4.15 放射性计数 运行结束后,读取记录仪得出的光密度值。从蛋白质洗脱开始进行计数直至 结束,将收集的分馏液等分为 0.5 ml 装入小管中,加入 4.5 ml 闪烁液,强力摇 动试管,混匀后放在闪烁计数器上,每个样品一般计数 5 分钟。

4.1.6 结果处理 每条柱子的 cpm(计数每分钟)以分馏物的数目和放射性图谱(对应光密度

图谱)进行划分来定位 α、β 和 γ 峰。按照图 4.2 和表 4.3 所示进行各峰的计数和 不同类型珠蛋白链生物合成率的计算。

72


图 4.2 中间型地贫个体的洗脱曲线 按照表 4.3 进行各峰的计数

73


表 4.3 中间型地贫患者的 β/α、γ/α 和非 α/α 珠蛋白链生物合成率的计算

前峰均应计算在内,一般在两个最矮的色谱峰顶点划一条线来计算背景信 号,而某些诊断中心则在色谱峰的最低点划一条平行线,再划一条与平行线垂直 的线来计算。虽然只计算珠蛋白链的最小值,本文选择前一种计算方法,这对产 前诊断样品尤其重要。

4.1.7 柱体的标准化和结果 柱体应当用正常成人和正常脐血样品进行标准化,调整 pH 值、梯度和温度

74


等条件,以在这些标准品中获得平衡的非 α/α 比率。正常成人标准品和携带 β地贫性状的样品的洗脱图谱分别显示于图 4.3 和图 4.4。此外,还应做一个平行 对照。

图 4.3

正常个体的洗脱曲线

在编者的研究中心, 0.02 以上的 β/α 生物合成比率预示着胎儿未受累,而 对于非胎儿样品,正常样品的 β/α 为 0.96(范围在 0.78~1.14);携带 β-地贫性状样 品的 β/α 为 0.50(范围在 0.38~0.62);携带 α°-地贫性状样品的 β/α 为 1.44(范围

在 1.22~1.82); 携带 α+-地贫性状样品的 β/α 为 1.20(范围在 0.95~1.39); 携带 HbH 病样品的 β/α 为 2.30(范围在 1.80~2.95)。

75


图 4.4

β-地贫性状个体的洗提曲线

4.2 HPLC 技术 珠蛋白链合成也可应用反相高效液相色谱(HPLC)技术来测定[6]。 试剂 a) 树脂 α-纤维素(Sigma C-8002)10 g 微晶纤维素(Sigma S-5504) 10 g 溶于 300 ml 0.9% NaCl 中 b) Percoll (Sigma P-1644) Percoll 梯度:9 ml Percoll 与 1 ml 10×KRP 混匀;然后按下列浓度配制: Percoll 9:1

KRP 1×

75%

7.5 ml

2.5 ml

60%

6.0 ml

4.0 ml

76


45%

4.5 ml

5.5 ml

c) KRP 0.9% NaCl 4000 ml

(9 g/1000 ml)

1.15% KCl 160 ml

(2.3 g/200 ml)

0.61% CaCl2 +2H2 O 120 ml

(1.22 g/200 ml)

3.82% MgSO 4 +H2 O 40 ml

(7.64 g/200 ml)

0.1 M Na2 HPO 4 800 ml

(14.2 g/1000 ml)

用 4 M HCl 或 5 M NaOH 调 pH 至 7.4。 d) 每种溶液 1 ml 混匀后,按表 4.1 制备氨基酸混合液 AB 型血浆(从血库获取,加入抗 KRP) 葡萄糖 FeSO 4 3

H-亮氨酸(TRK 510,Amersham 生命科学)

0.5 ml 1×KRP 0.5 ml AB 型血浆 20 μl 不含亮氨酸的氨基酸溶液 2 mg 葡萄糖 20 μl FeSO 4 .7H2 O(5 mg/ml) e) 洗脱缓冲液 氰化甲烷(CH3 CN) 甲醇(CH3 OH) 0.155 M NaCl,用 HCl 调 pH 至 2.7 缓冲液 A: 氰化甲烷

500 ml

甲醇

200 ml

0.155 M NaCl

300 ml

缓冲液 B: 氰化甲烷

250 ml

甲醇

400 ml

0.155 M NaCl

350 ml

77


方法 1. 用浸泡于 0.9% NaCl 中的微晶纤维素和 α-纤维素柱体过滤样品,将白细胞和 血小板从全血中去除,用盐水洗 3 次红细胞并重悬于 KRP 缓冲液中。 2. 红细胞团分别加入 75%、60%和 45%的 Percoll 梯度中,在 20℃ 1000 g 离心 20 分钟,可获得一些细胞层,其中顶部是富集的网织红细胞。 3. 用 KRP 洗细胞,将细胞团重悬于孵育的混合液中(Vol/Vol),然后每 μl 细胞 重悬液加入 1 μl Ci 3 H-亮氨酸,把试管置于 37℃水浴摇床中 2 小时。 4. 用冷盐水洗涤标记的网织红细胞和其他红细胞,通过冻融进行溶血。 5. 溶血液在 4℃ 以 13000 rpm 离心 1 分钟,然后将 10 μl 重悬液直接注入柱体 内。 6. 应用 LiChrospher RP8 柱体,5 μm 微珠 250×4 mm(Bio-Rad 公司),用洗脱 缓冲液 A 和缓冲液 B 于室温下在 Gold 分析系统(Beckham 公司)中进行珠 蛋白分离,以 0.7 ml/分钟的流速,在线性梯度为 90%至 20%的 B 液中运行 90 分钟以上。 7. 将每个色谱峰的保留时间与已知血红蛋白溶液色谱峰的保留时间相比较而进 行鉴定。 8. 将 350 μl 分馏液与 3 ml 闪烁液(Optiphase’ Hisafe 2’ Wallac)混匀,在液体闪 烁计数器(LS 6000SE;Beckham)上计数 10 分钟。

结果 正常受检者 β/α 比率为 1.0±0.08,α-地贫携带者为 1.43±0.15,β-地贫携带者 为 0.65±0.05。

评价 如不立即进行分析,样品应贮存于-20℃;溶血后,注入柱体前,样品应保 存在-4℃;温度需严格控制。 这种方法也可用于不同γ -链(Gγ 、Aγ 和 Aγ

T

)的分离。由于所需珠蛋白

量很少,这种方法还可用于分析细胞的 BFU-e 克隆的珠蛋白链生物合成。

78


4.3 垂直 IEF 法 随着 Weatherall 和 Celgg 珠蛋白链生物合成技术的普遍应用[7],学者们发现 这种方法费时且不太适合于常规分析。在莱顿,为了增加分析的能力和减少所需 的时间,一种仅需要一个熟练的技师进行操作的简化程序已被使用,这种程序第 一天用 5 个小时,第 2 天用 2 小时,第 3 天少于 1 小时。如果用这种方法同时检 测 20 个样品,能在 5 天内得到可靠的结果,每个样品耗时少于 30 分钟[8]。这种 方法适合作为常规应用于专门的实验室,但这种方法复杂且易受突发设备故障的 影响,因此应谨慎操作。

4.3.1 一些特殊的器材 这种系统有三件装置增加了操作功能,能同时分析 20 个样品。在网织红细 胞富集、孵育和珠蛋白链分离中应用的装置可自制,也可在现有商品化产品基础 上进行改造。

网织红细胞富集 转速可达 15000 rpm 的标准红细胞比容离心转子可改造成 24 只半毛细管式 Pyrex 离心管(体积 0.75 ml,外径=6 mm,内径=4 mm ,长=7 mm ,通常由当地

玻璃工厂制作)。

孵育 一个用于孵育的固定装置(非必需)安装在圆形的摇床上以保证样品在 37℃ 持续摇动,与恒温浴床相连的孵育固定装置可用有机玻璃或者相当于塑料的材料 制造。该固定装置由两个简单的部件构成,下面的部件是一组被安装在侧边、带 有出入口喷嘴的滑轮,彼此间由塑料缠绕成蛇形的约宽 2 cm 深 3 cm 的小通道 相连;上面部分由一个带 20 个孔、形状如小通道的盖子构成,其上安装了孵育 试管(15 ml,Corning25319)。在盖子间放置一个厚约 5 mm 的带有 20 个孔的硅 垫圈,通过旋转将两部分拧紧以保证密封性,当试管在原地被拧紧后,系统变为 密封,试管的圆锥形末端将在密闭的管道中与水循环相连。

79


珠蛋白链分离 垂直等电聚焦设备可放置 20 个底部稍做固定的玻璃柱体(外径=8 mm ,内

径=6 mm,长=150 mm,一般由当地玻璃厂制作),每个柱体内含有 4.25 ml 聚丙 烯酰胺凝胶。这种装置可自制,方法很简单:将两个相同的有机玻璃水槽(宽 =20 cm,直径=12 cm,高=10 cm)顶部相对,在上水槽 6 mm 厚的底部钻 20 个 孔(直径 10 mm),用 O 型环密封并将玻璃柱安装在孔上。上水槽为正极(+), 下水槽为负极(-)。

4. 3. 2 试剂 整个程序所需的 14 种溶液介绍如下。所有溶液均新鲜配制,或以冷贮备液 保存或分装冻存(- 80℃),解冻后剩下的应丢弃。所有玻璃制品和可处理的用品 必须非常干净或进行灭菌。 a) 网织红细胞磷酸缓冲盐溶液(RTBS) 0.13 M NaCl;5 mM KCl;7.4 mM MgCl2 .6H2 O;12 mM pH7.65 Tris,配制成 10×储备液并保存于 5℃。 实验开始前稀释为工作液浓度并冷藏。 b) 白细胞抽提纤维素混合悬液 α-纤维素 C-8002 和 Sigmacell 50 型 S-5504(Sigma),1:2 溶于 RTBS。纤 维素悬浮液的使用量不要求非常精确,每条柱使用 0.5~0.6 g,即 0.4 g α-纤维 素和 0.2 g Sigmacell,充入柱内约占 2-2.5 cm3 的体积。 在生物合成步骤开始当日早晨,配制待测样品所需试剂的使用量。 c) 孵育混合液(IMIX) 由不含胎儿 Calf 血清(FCS)的 48.6%氨基酸和 51.4% RTBS 配制成 100 ml 溶液,溶液内还含有 0.3 mM NaHCO 3 、0.6 mM MgCl2 · 6H2 O、3.8 mM Tris、 0.2 mM Na3 C6 H5O7 · 2H2 0 和 1.36 mM 葡萄糖,pH 均为 7.65。 0.8 ml 混合液分装并冻存于-80℃备用。 d) 氨基酸混合液(AC) 0.28 mM 赖氨酸不含谷氨酰胺和亮氨酸的溶液、0.23 mM 组氨酸溶液、0.09 mM 精氨酸溶液、0.07 mM 色氨酸溶液、0.30 mM 天冬氨酸溶液、0.23 mM 苏

80


氨酸溶液、0.25 mM 丝氨酸溶液、0.16 mM 脯氨酸溶液、0.30 mM 甘氨酸溶 液、0.49 mM 丙氨酸溶液、0.05 mM 半胱氨酸溶液、0.42 mM 缬氨酸溶液、 0.047 mM 蛋氨酸溶液、0.07 mM 酪氨酸溶液和 0.19 mM 苯丙氨酸溶液配制成 混合液,用 154 mM Tris-HCl 调 pH 至 7.65,加 RTBS 至 100ml。 1 ml 分装并冻存于-80℃备用,100 ml 储备液的配方见表 4.2。 e) 200 mM 左旋谷酰胺(Glu) 市售溶液(Gibco),0.4 ml 分装冻存于-80℃备用。 f)

铁溶液(FeMIX) 0.2 mg 硫酸亚铁胺/100 μl IMIX,使用前配制。

g) 亮氨酸 L-[3,4,5, 3 H(N)]溶于 2% 乙醇中(Leu 3 H),保存于 5℃,使用时不用 稀释。 h) pH 10.8 氢氧化铵溶液(NH4 OH-βME) 这种溶液用于细胞裂解。需新鲜配制,加入到含有 1% β-巯基乙醇(ME)的 水中,用数滴氢氧化铵调 pH 至 10.8。 i)

样品溶液(SS) 含 4 ml 乙基苯基聚乙二醇 P40(Fluka)、1 ml 安福林 6~8(Amersham 生物科

学)、10 ml β﹣巯基乙醇溶液和 8 M 去离子尿素配制成 100 ml 溶液。 1 ml 溶液分装并冻存于﹣80℃。 j)

电解质 负极(﹣)溶液为 20 mM NaOH,正极(﹢)溶液为 30 mM H3 PO 4 。

k) 聚丙烯酰胺凝胶固定液(TCA) 100%三氯乙酸溶于水(储备液),使用前按 1:5 进行稀释。 l)

聚丙烯酰胺凝胶染液 0.4 g Serva violet 49 (Serva 35052) 溶于 1 L 含有 50 ml 70% 过氯酸的蒸馏水 中。

m) 聚丙烯酰胺凝胶脱色液 10% 冰醋酸。 聚丙烯酰胺溶剂:50% 新鲜过氯酸液(Merck)加入到一定体积的饱和盐酸 胍(Fluka)溶液内配制成 3.5%的溶液,可在室温长期保存。

81


表 4.2

用于垂直 IEF 法的 100 ml 不含谷氨酰胺和亮氨酸的混合储备液配方

由于溶解度不一,应分别用试管量取下列试剂,并按指定的体积分别溶解每种氨基酸。 所有的试剂全部收集到量筒中,用 RTBS 定溶至 100 ml。 氨基酸

mg

mlRT BS

丙氨酸 精氨酸 天冬氨酸

43.7 16.4 40.3

2 1 5

1/2半胱氨酸

5.7

1

甘氨酸 组氨酸

22.8 36.3

1 3

异亮氨酸

12.3

3

赖氨酸 蛋氨酸

41.1 7

1 2

苯丙氨酸

31.1

3

脯氨酸 丝氨酸

18.9

1

26.9

1

苏氨酸 色氨酸

27.9 14.3

1 3

酪氨酸 缬氨酸

12.7

5

49.3

3

4.3.3 方法——第一天 样品收集 使用 10 ml 新鲜和无菌的肝素锂抗凝样品,EDTA 抗凝样品不适用。早晨收 集血液,在送往实验室过程中应严格保存于湿冰中(不能用冰袋和干冰),3 小 时内处理。

白细胞移除 样品在冷冻离心机中以 3000 rpm (1400 g)离心 5 分钟,分离血浆,再高速离 心收集清澈的上清液并冰冻保存备用。用巴氏滴管移去细胞表面的血黄层并保存 备以抽提 DNA。 每个样品取 1 ml 红细胞团用 3 倍体积的冷冻 RTBS 重悬,立即用预先挑选

82


并平衡的纤维素混合柱对悬浮液进行分层。当日早上制备玻璃棉柱子,通过约 1×10 cm 的含有 2 cm3 纤维素混合液的玻璃试管过滤。不含白细胞的红细胞迅速 从 10 ml RTBS 柱中洗脱出来。

网织红细胞富集 从柱体中洗脱得到的红细胞悬液在冷冻离心机中以 2500 rpm(1000 g)离心 5 分钟,将上清液倒弃,从上层取出约 1 倍体积的红细胞团重悬于预先过滤的 2 倍体积的原始血清中。用巴氏长滴管将 0.5 ml 上述重悬液移至能盛放 0.7~0.8 ml 红细胞悬液的微量离心管中(内径为 3 mm,外径为 6 mm ,高为 70 mm 的离心

管),所有试管均在 5 ℃血球比容计冷冻离心机中以 15000 rpm(20000 g)离心 15 分钟,小心移去血浆,再轻缓地从表面移出 5-10 μl 红细胞团,将这些微量富 集物重悬于含有 12 ml 冷 RTBS 液的 15 ml 圆锥形聚丙烯试管(Corning)内。这 种高质量带密封塞子的试管安装在孵育槽孔上,能经受操作过程的离心处理,也 可避免放射性物质的污染。轻缓摇动悬液并在 5℃以 2500 rpm(1000 g)离心 5 分钟,将 RTBS 彻底吸净,洗涤过的红细胞团即可进行预孵育。应用这个操作流 程常能富集到 10 倍的网织红细胞。

预孵育 迅速在每个样品中加入孵育混合液(800 μl IMIX、200 μl AC、20μl Glu 和 20μl FeMIX),将试管置于 37℃孵育槽内轻轻摇动,预孵育 10-15 分钟。预孵育的作 用是启动合成,消除内源性亮氨酸,由于内源性亮氨酸能与 3 H 亮氨酸竞争,以 非随机的方式形成冷链。

孵育和合成 小心将 20 μl Leu- 3 H 迅速加入每份样品中,样品置于 37℃轻轻摇动孵育 60 分钟,孵育期间温度应严格保持在 37℃以避免发生有利于其中一条珠蛋白链的 情况,因为这可能导致错误的珠蛋白失衡分析结果。理论上,标记链的合成将持 续到网织红细胞的合成能力耗尽为止,但实际上孵育时间延长 1 小时以上仅能增 加合成产物的量,并不会增加新合成链水解蛋白质消化的风险,因为这些链不能

83


变成四聚体而改变 β/α 比率。因此,孵育 1 小时后,将样品移放于湿冰上,以阻 断孵育和蛋白质水解。比率失衡的样品游离珠蛋白链容易水解和退化,因此,在 冻干步骤前孵育后低温处理有利于最大限度地降低水解作用。

洗涤 将细胞在冷冻离心机中以 2000 rpm(600 g)离心 5 分钟,小心吸去放射性 上清,加入新鲜的冷冻 RTBS,细胞重悬并重复洗涤离心 3 次,温度严格控制在 5℃以下。

溶解和冻干 第 3 次离心后,将洗好的细胞团用 2 ml NH4 OH-βME 溶解并分装为 2 份,将 约 1/3 的溶液移到 eppendorf 管内用于链分离,剩余的在孵育管中储存。两份样 品均在-90℃储存 15 分钟,再高真空过夜冻干。

4.3.4 方法——第 2 天 制备等电聚焦(IEF)链分离使用的聚丙烯酰胺柱 第二天早上制备聚丙烯酰胺柱,下午预运行,第 2 天结束时将样品装到 IEF 上。柱子预先硅化,底部密封,垂直放置,聚丙烯酰胺溶液的量根据所需柱子的 数目而定。100 ml 溶液配方如下:8.53 g 聚丙烯酰胺(Bio-Rad 实验室,161-0101)、 1.47 g N,N,’二丙烯基酒石二酰胺(DADT)(Bid-Rad 实验室,161-0620)和 48.23 g 尿素(USB 公司,ultrapure 75826)溶于约 80 ml 蒸馏水中,内含 1 g 已混合的 树脂床 AG 501-×8(D)(Bio-Rad 142-6425),旋转至澄清,过滤上清液并收集在 一个含有 50 g 赤藓醇(DTE)(Sigma D-8255)和 2 g β-丙氨酸(Merk 1008)的 分度量筒内。加入 3.5 ml pH6.7~7.7 phamalyte(Amersham-Pharmacia 17-0566-01) 和 pH 8~10.5 0.9 ml phamalyte(Amersham-Pharmacia 17-0455-01),加蒸馏水定 溶至 100 ml, 最后加 入 112 μl N,N,N’,N’ 四甲基乙二胺(TEMED)(Amer sham-Pharmacia 17-1312-01)和 170 μl 新鲜配制的 10% 过硫酸铵,并大力摇匀。 为了避免提前聚合,迅速把溶液填充玻璃柱体至离顶部 1 cm 处,防止出现气泡。 在聚丙烯酰胺表面滴加 1 滴蒸馏水进行分层,聚合应在 2 小时内完成。

84


预运行 将聚丙烯酰胺柱底部的封口和水层除去,然后将柱小心放到垂直电泳设备的 孔内。可用硅润滑油使柱子垂直下滑到下水槽(-)底部,槽内有足够的电解质 (NaOH 溶液),柱的底部浸入水槽深约 5 mm;上水槽(+)内有足够的电解质 (H3 PO4 溶液),柱的底部浸入水槽深约 5 mm。在聚丙烯酰胺柱的顶部加入 100 ml 样品溶液(SS),在室温下用 300 伏预运行 2 小时。

样品制备、加载和运行 在预运行后期,在上、下水槽内加入等量的对应的电解质溶液。冻干样品提 前 1 小时溶解于 200 μl 样品溶液(SS)中,并混匀至完全清澈。当样品的聚丙烯酰 胺柱呈现 100 μl 清淅的分层现象时开始运行,链分离的最佳条件是在室温下以 300 伏运行至少 16 小时。

4.3.5 方法——第 3、4、5 天 剥胶、固定、去封、染色和脱色 第三天早上 IEF 结束。用 10 ml 注射器针头在凝胶和柱壁间注入几毫升蒸馏 水,使凝胶从硅化柱内剥离出来。虽然凝胶柔软,但足以把其拿起转移到带塞约 70 ml 的玻璃培养试管中,用 20%TCA 固定,几分钟后珠蛋白链的乳色条带即可 看见。在第 3 天结束时用等量的染液置换 TCA 并过夜。次日早晨,用脱色液置 换染液,凝胶变透明,此过程不超过 24 小时。

从凝胶中抽提珠蛋白链、溶解和计数 将脱色后的凝胶从溶液中移出,水平放置在一块玻璃板上进行拍照,光盒内 显示的照片见图 4.5,γ-、β-和 α-链条带分离出来,轮廓清晰,容易鉴别(当存

在异常血红蛋白时异常珠蛋白链的条带同样能显现)。如果 IEF 运行时间太长,α链的条带可能会变模糊,β-和 γ-链迁移后彼此会靠近。用解剖刀切下条带并放在 玻璃闪烁瓶内,收集 α-链条带时要小心操作以免丢失,收集 β-链条带和 γ-链条 带时要避免污染。尽管某些样品合成相当数量的 γ-链,但由于含量低而可能导致

85


在 IEF 上看不见 γ-链的条带,对于这样的样品,在装载 IEF 前加入 3 μl 胎儿溶血 液到样品中,用冷 γ-链来进行标记,在室温下轻轻摇动,0.5 ml 溶解液中的聚丙 烯酰胺在 1-2 小时后即被彻底溶解,然后加 10 ml 闪烁剂混合液到每个瓶中,用 力摇荡使之混合。避光 30 分钟或以上,对每个瓶在标准闪烁计数器上使用 DPM-CPM3 H 程序计数 10 分钟。

图 4.5 显示分离产物的聚丙烯酰胺凝胶柱 γ-、β-、α-链电泳条带切下后放入闪烁瓶中处理

结果解释 新合成链的 3 H 亮氨酸结合量非常低,但对于网织红细胞数量增多的样品, 计数信号可超过 100000 cpm。一般来说,新鲜正常样品 β-和 α-链得到的信号应 在 1000-10000 cpm,足以用于计算比率。在骨髓活性较低的患者中或样品处理质 量较差时,结合的标记信号可能不足,500-1000 cpm 之间的信号得到的比率可能 不够准确,500 cpm 以下的信号应考虑为不可靠。应通过对几个标准品和空白对 照样品计数的测定来检验闪烁计数仪使用的本底阈值(由等量的不含 3 H 标记链

的聚丙烯酰胺凝胶构成空白对照),在莱顿实验室,所有不含 3H 标记的珠蛋白条 带和大小相似的聚丙烯酰胺均得到约 40 cpm 的恒定本底数。当珠蛋白信号低于 1000 cpm 时,应减去本底数;如果闪烁计数仪上设定了合适的发光校正,有时 出现样品计数稍低的结果也是可靠的。

86


4.3.6 结果 这种方法已被广泛应用[9-13],直至 1998 年在莱顿大学实验室利用改良的生 物合成法已完成了约 2000 例的生物合成率的测定。其实所有合成率不平衡的样 品,经过 DNA 水平的分析,相应的分子缺失已被发现。 可预测的结果总结如下: 铁缺乏 由于血红素与 β-链的结合优于 α-链,铁缺乏的患者在珠蛋白链合成前应先 进行完善地补铁治疗,由于铁缺乏可能导致一种人为的珠蛋白合成率失衡(在孵

育期间加入铁并不能修复),因此,对于 β/α 比率在 1.1~1.4 间的疑似 α-地贫患, 可能归因于铁缺乏而并非地贫。虽然铁缺乏与地贫常常同时存在,尤其在 α-地贫 女性患者中。 地贫 非地贫或非铁缺乏的样品将得到平衡的 β/α 比率。一般根据地贫的类型和特 殊的分子缺失来对 β/α 比率的分布进行分类,见图 4.6。

图 4.6 图显示了根据分子缺失和地贫的不同类型来进行分类而测定的 β/α 比率的分布。从左 到右,由 β0 - 地贫引起的重型 β-地贫所显示的比率范围为 0~0.1,β0- 地贫携带者显示的比率 在 0.2~0.7 之间,β+- 地贫携带者在 0.3~0.9 之间,轻型 β+- 启动子缺失携带者得到的比率在

87


0.7~0.9 之间,非地贫或非铁缺失样品的 β/α 比率一般是完全平衡的(比率在 0.95~1.05 之间)。 位于分布图边缘的比率出现轻微失调,大多数归因于较低计数的样品。1.1~1.4 之间的区域 表示存在大量疑似 α-地贫患者,这些患者并非地贫,而是完全铁缺乏。单个 α- 基因缺失的 β/α 比率在 1.15~1.65 之间,2 个 α- 基因缺乏的比率在 1.25~1.80 之间,3 个 α- 基因缺失(HbH

病)在 1.5~5.0 之间(见小图)。更多的详情见正文。

由 β°-或 β+-纯合子或复合杂合子引起的所有地贫样品的 β/α 比率接近零,轻 型 β+-启动子缺失携带者与其他的 β°-和 β+-引起的地贫样品的 β/α 比率有明显偏 离。对于 α-地贫,杂合子(-α/αα)、纯合子 α+(-α/-α)缺失、杂合子 α°(--/αα) 和 α+/α2 基因的 α°聚腺苷酸缺失之间的 β/α 比率有所重叠,无法通过平均比率来 得到缺失一个或两个 α-基因间的差异,但当 β/α 比率在 1.4~1.6 之间时,从统计 学角度分析两个基因受累的几率比一个基因受累的几率高 2.3 倍。相反地,90% 单个 α-基因缺失的地贫,其 β/α 比率为 1.2~1.3,3 个基因缺失的 α-地贫(HbH

病)的 β/α 比率范围较为分散,从 1.5 至接近 5.0。

异常血红蛋白 珠蛋白链合成有利于地贫的分析,也有利于地贫复合常见或罕见异常血红蛋 白的分析,珠蛋白链合成的另一个优点是能鉴别等电聚焦提示的某个基因上需进 行测序的异常 α-链或 β-链。HbS 纯合子和复合杂合子 HbS/β 地贫之间的差异可 通过检测双方的 β-等位基因的表达来进行诊断,尤其是复合 β-珠蛋白基因缺失 的诊断[9]。此外,很多种族的 α+-地贫发病率很高,尤其是 HbS 携带者常产生遗 传复合体[10

、11 、13]

,这些都可根据它们合成比率来检测。

88


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89


第五章 分子诊断

血红蛋白病是一组隐性遗传疾病,包括地贫和镰状细胞病。血红蛋白病是第 一种在分子水平上被定性的遗传病,因此,这种疾病被用作建立突变检测新技术 的模型。目前有许多基于 PCR 的不同技术用于诊断已知珠蛋白基因突变,包括 点杂交分析、反向点杂交分析、扩增应答突变系统(ARMS)、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)、聚合酶链诱变分离、缺口 PCR 和限制性酶(RE)分析[1-4]。每种方 法都有其自身的优、缺点,一个实验室选择某种诊断点突变的特异技术,不仅取 决于这个诊断实验室的技术经验,而且取决于个体筛查时所碰到的突变类型和变 异体。

5.1 诊断策略 表 5.1 总结了血红蛋白病常用的主要诊断方法。在此简明扼要介绍珠蛋白基 因突变的不同种类和主要的诊断方法,下面的章节将会介绍诊断已知突变的五种 常用技术的详细步骤,这五种技术包括点杂交分析、反向点杂交分析、扩增应答 突变系统(ARMS)、缺口 PCR 和限制酶(RE)分析。

5.1.1

α-地贫

缺口 PCR 能快速诊断 α+-地贫和 α°-地贫缺失,但用于产前诊断时需慎重。 大多数由基因缺失引起的常见 α-地贫等位基因可通过缺口 PCR 进行诊断,目前 已公布了诊断 5 种 α°-地贫缺失和 2 种 α+-地贫缺失的引物序列[5-9],见表 5.2。可 通过缺口 PCR 诊断的 α°-地贫缺失包括:东南亚人群的-- SEA 等位基因、地中海地 区人群的--MED 和-(α)20..5 等位基因、菲律宾人群的-- FIL 等位基因和泰国人群的 --THAI 等位基因。两种 α+-缺失突变为 3.7kb 和 4.2kb 的单个 α-基因缺失突变,分 别命名为-α3.7 和 α4. 2 。 α-珠蛋白基因簇序列比 β-珠蛋白基因簇序列扩增技术难度更大,由于断裂点

90


内序列的高 GC 含量和 α-珠蛋白基因簇内存在高度同源序列,因此成功扩增需要 更严格的条件。许多实验室的经验已表明有些引物对并不可靠,有时会引起不可 预见的反应失败和等位基因脱扣的问题,但是最近公布的引物[8 、9]似乎比早期公 布的序列在扩增方面更为强劲,可能由于额外地加入了甜菜碱到反应混合物中。 在牛津大学实验室虽然这些引物在个体突变试验时被成对使用,但它们也被设计 用于多重突变筛查试验。 表 5.1

血红蛋白病的 DNA 诊断

疾病和突变类型

诊断方法

ɑ°-地贫 ɑ+-地贫

缺口 PCR,Southern 杂交法

缺失 非缺失

缺口 PCR,Southern 杂交法 ASO, RE, DGGE

β-地贫 缺失

缺口 PCR,

非缺失 δβ-地贫

ASO,反向点杂交, ARMS, RE-PCR, DGGE 缺口 PCR,Southern 杂交法

HPFH 缺失 非缺失 Hb Lepore HbS

缺口 PCR,Southern 杂交法 ASO, ARMS, RE-PCR, DGGE 缺口 PCR ASO, 反向点杂交, ARMS, RE-PCR

HbC HbE Hb D-Punjab

ASO, 反向点杂交, ARMS ASO, 反向点杂交, ARMS, RE-PCR ASO, 反向点杂交, ARMS, RE-PCR

Hb O-Arab Hb variants

ASO, ARMS, RE-PCR 反转录 PCR 和 DNA 测序

表 5.2 疾

已通过缺口 PCR 诊断的地贫缺失突变 缺失突变 SEA

ɑ°-地贫

ɑ+-地贫 β°-地贫

参考文献

---MED

[6] [6]

-(α)20..5 --FIL

[6] [8.9]

--THAI -ɑ3.7

[8.9] [7]

-α4.2 290 bp 缺失

[7] [33]

532 bp 缺失

[34]

91


619 bp 缺失

[35]

1393 bp 缺失 1605 bp 缺失 3.5 kb 缺失 10.3 kb 缺失

[36] [37] [38] [39]

45 kb 缺失

[40]

Hb Lepore 西班牙人 西西里岛人

[20]

越南人

[20]

马其顿人/土耳其人 印度人

[20] [20]

中国人 HPFH1(非洲人)

[20] [20]

HPFH2(加纳人)

[20]

HPFH3(印度人)

[20]

(δβ)°-地贫

(A γδβ)°-地贫

HPFH

[20] [20]

由于断裂点序列尚未确定,有些 α° -和 α+ -地贫不能通过缺口 PCR 来诊断, 这些缺失突变可应用 δ-基因和 α-基因探针的 Southern 杂交技术来诊断。由于单 次试验 Southern 杂交技术可诊断 α-地贫缺失和 α-基因重排(α-基因三联体和四

联体),因此这种技术仍非常有用

[10]

。α+-地贫也可由其中一个 α-珠蛋白基因发

生点突变引起,这些非缺失等位基因可通过对每个 α-珠蛋白基因应用选择性扩增 的 PCR 技术和突变分析的常用方法如 DGGE[11]或 DNA 测序分析[12]来检测。一 些改变限制性酶位点的非缺失突变可通过选择性扩增和限制性内切酶分析来诊 断,后者可根据已报道的形成不稳定 α-珠蛋白链变异的 Hb Constant Spring[13]突 变的策略来进行诊断。

5.1.2 β-地贫 β-地贫是一组具有异质性的缺陷类型,迄今为止已鉴定了 170 多种突变[14]。 大多数缺陷为单个核苷酸替换、插入或缺失,已鉴定的大基因缺失仅有 13 种, 其中 8 种可通过缺口 PCR 来诊断,见表 5.2。尽管基本原理相同,但有些突变需 要用不同的方法检测,即突变有区域特异性,每种风险人群都有几种常见突变和 各种不同的稀有突变,因此,对于任何给定地域的种群来说,首先应使用为常见

92


特异性突变而设计的 PCR 方法,对于大多数种群这些方法将可鉴定 80%以上的 突变,必要时对已知稀有突变的进一步筛查将可鉴定另外 10-15%的缺陷,目前 未经鉴定的突变可通过 DNA 测序来进行定性分析。 第一种应用广泛的基于 PCR 的方法是通过点印迹将等位基因特异性寡核苷 酸探针(ASOs)与已扩增的 DNA 结合于尼龙膜上进行杂交[15]。虽然这种方法仍 在使用,但限制于检测多种突变需要独立的杂交步骤,上述局限可通过建立反向 点杂交技术来克服,亦即将已扩增的 DNA 与固定在尼龙膜条上的一组突变特异 性探针杂交。这种技术是 β-地贫突变筛查的最佳策略,第一次筛查时用一组已知 的常见突变的膜条,第二次筛查用一组稀有突变膜条[16]。 扩增应答突变系统(ARMS)[10]满足 PCR 技术的主要需求,如速度、成本、 简便和同时检测多种突变的能力,不需要标记引物或已扩增的 DNA。尽管多重 ARMS 引物在单个 PCR 实验中是可行

[17]

,但这种简单的方法主要是为了能同时

用 PCR 实验来筛查突变。 变性梯度凝胶电泳(DGGE)[18]是一种应用较为广泛的定性 β-地贫突变的间 接方法。这种方法将迁移的电泳带与正常电泳带相比较,在 β-地贫突变频发的国 家至少可检出 90%的 β-地贫突变,可作为 ASO 探针或 ARMS 的替代方法[19]。

5.1.3

δβ-地贫和 HPFH

δβ-地贫和遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)由 β-基因和 δ-基因 的大缺失所引起。限制性酶图谱已能定性 50 多种缺失,它们在 Gγ-基因与 δ-基因 之间起始于不同的缺失断裂点,并延伸至 β-珠蛋白基因下游 100kb 处。在两种情 况下,即地中海人/土耳其人(δβ)°-地贫基因和印度人(Aγδβ)°-地贫基因,突变是由 两种缺失侧翼的插入 DNA 序列构成的一种复杂的重排。少数缺失的断裂点已确 定,可通过缺口 PCR 来诊断[20],缺口 PCR 也能用于因 δ-和 β-珠蛋白基因之间 DNA 序列的缺失而产生的 Hb Lepore 的诊断,Hb Lepore 是 δβ-融合基因的产物, 与重型 β-地贫表型有关。目前可通过缺口 PCR 来诊断的缺失突变列于表 5.2;其 他的突变只能通过 Southern 杂交分析鉴别断裂点来进行诊断。

5.1.4

Hb 变异 93


至今已发现 700 多种血红蛋白变异,其中大部分变异类型可通过蛋白质分析 进行鉴定。尚未经过 DNA 水平的定性分析,阳性鉴定结果可通过选择性珠蛋白 基因扩增和 DNA 测序分析来得到。但是临床上一些重要的变异,如 HbS、HbC、 HbE、Hb D-Punjap 和 HbO-Arab,可通过更简单的 DNA 分析技术来诊断。如 ASO 杂交、ARMS 技术或 PCR 产物的限制性酶消化(除 HbC 外)[10]。镰状细胞基因 突变在第 6 号密码子消除了一个 Dde I 识别位点,通过扩增产物 Dde I 消化来诊 断仍是镰状细胞病 DNA 分析最简单的方法,HbD-Punjap 和 Hb O-Arab 突变消除 了第 121 号密码子的 EcoR I 位点,也可以用相似的方法进行诊断,而破坏了 Dde I 位点的第 6 号密码子的 HbC 突变则需要用其他方法来诊断。HbE 突变临床症状 变异范围较宽,可产生中间型地贫或输血依赖型的重型地贫,这种突变可通过 ASO 杂交、ARMS 或对 β 珠蛋白基因序列进行限制性酶分析(该突变消除了 Mnl I 位点)来诊断。

5.2 DNA 制备 为了制备高质量的 DNA,应尽量用新鲜全血。全血样品的处理应十分小心, 与传染的潜在来源同样对待。在所有实验室方案中,对各种试剂的存储、操作和 处理所存在的危险都必须用当地实验室标准操作规程进行评估和适当的记录。 外周血白细胞(WBC)通常是与血红蛋白病 DNA 分析有关的人类基因组 DNA 最简便的来源。估计 10 ml 全血能产生约 250 μg DNA,足以提供目前已开 展的各种珠蛋白基因分析方法(例如基于 PCR 的方法)所需的用量。DNA 是一 种非常稳定的分子,而催化核苷酸分解的酶(核酸酶)在所有细胞都能找到。在 完整细胞的细胞核内可发现 DNA,它们被保护起来,可防止胞浆中富含核酸酶 的溶酶体的溶解作用,但是当细胞被裂解时,细胞各部分的间隔膜破裂,核酸酶 能与 DNA 相接触。因此,DNA 抽提的第一步需使用含有抑制核酸酶活性的缓冲 液,此外所有步骤均需在低温下(0℃)进行,建议在抽提前样品长期保存在-70℃。 许多从全血中抽提 DNA 的不同方法已介绍,下面介绍的盐析法和酚-氯仿法是本 书部分编委所在实验室使用的方法。一些从全血中抽提 DNA 的试剂盒已商品化 出售,效果很好,但如果从 5-10 ml 血液中制备 DNA 使用这些试剂盒则成本偏 高。

94


5.2.1 从全血抽提 DNA:盐析法 此法能产生质量好的高分子量 DNA,避免使用有害有机溶剂。 试剂 a) 裂解缓冲液 I:155 mM NH4 Cl ,10 mM KHCO 3 ,1 mM EDTA,pH7.4。 b) 裂解缓冲液 II:10 mM Tris HCl, 400 mM NaCl,2 mM EDTA,pH8.2。 c) 6 M NaCl d) 蛋白酶 K 粉末(Roche) e) 100% 乙醇(贮存于带锁的“易燃物品橱”内) f)

70% 乙醇

方法 1. 采集 EDTA 抗凝全血 10 ml。 2. 为了充分裂解红细胞,最好将全血冻存于-20℃数小时。 3. 解冻全血,尽可能保持低温,将溶血液转移至容量至少为 40 ml 的离心管(有

盖)内。 4. 加入 20~25 ml 冷裂解 I 缓冲液并充分混匀,在 4℃放置 30 分钟。 5. 在 4℃以 2500~3000 g 离心 15 分钟。 6. 小心移去上清,不要搅动松软的细胞团,用 20~30 ml 预冷的裂解缓冲液 I 洗 细胞团 2 次以上。 7. 在细胞团(主要是白细胞和细胞膜)中加入 6 ml 裂解缓冲液 II,充分旋转以 使细胞团匀化,然后加入 400 μl 10% SDS 和约 2 mg 蛋白酶 K 粉末(用试剂

棒挑取少许即可)。 8. 盖上每个离心管,充分旋转后在 37℃振荡水浴槽内孵育 16 小时(过夜),然 后置于 55℃ 1 小时。 9. 加入 2 ml 饱和 NaCl(约 6 M),充分旋转并在 16℃以 2500~3000 g 离心 15 分钟。 10. 轻轻地移去上清,注意不要搅动带起任何细胞团,将上清液转移到一只干净 的离心管内,并以 2500~3000 g 在 16℃离心 15 分钟。 11. 将上清移到干净的离心管内,加入 25 ml 预冷的无水乙醇,盖上离心管倒转

95


几次,直到可见絮状 DNA 为止。 12. 用一根优质的长玻璃吸管缠绕起 DNA 并移入一只干净的 1.5 ml eppendorf 管 内。 13. 加入 1 ml 70%乙醇冲洗 DNA,轻轻旋转并在微量离心机中离心以使 DNA 形 成小团。 14. 倒出 70%乙醇,小心勿移动 DNA 小团,将 EP 管倒转使乙醇滴干,使细胞团 彻底干燥(数小时)。 15. 用约 500 μl 无 DNA 酶蒸馏水(如高压消毒蒸馏水)重悬 DNA 小团。 16. 将 DNA 贮存于 4℃,在﹣20℃可长期贮存。

5.2.2 从全血抽提 DNA:酚-氯仿法 试剂 a) 网织红细胞盐溶液:5 mM KCl,0.13 M NaCl,7.4 mM MgCl2 b) 10×裂解混合液:0.77 M NH4 Cl,46 mM KHCO 3 ,稀释为 2×,构成红细胞裂 解混合液 c) 白细胞裂解液:100 mM NaCl,25 mM EDTA d) 10% SDS [十二烷基硫酸钠盐](用 20%贮备液配制) e) 10 mg/ml 蛋白酶 K [ICN Pharmacueticals] f)

酚(用 0.1 M Tris 饱和)[Rathburn 化学制品]

g) 氯仿 h) 7.5 M 醋酸铵 i)

100% 乙醇(储存于带锁的“易燃品柜”中)

j)

70% 乙醇

方法 1. 转移 2-10 ml EDTA 抗凝全血于 15 ml 离心管中,3000 rpm 离心 10 分钟。 2. 小心移去上清(血浆)。 3. 加入 15~30 ml 2×裂解混合液到离心管内(根据溶血物的量而定),充分摇匀 并旋转 10 分钟以裂解红细胞(当溶液清澈鲜红时表示已充分裂解)。

96


4. 3000 rpm 离心 10 分钟,白细胞团应沉淀于离心管底部,小心吸走上清,留 下粘附于离心管底部的小团,重复步骤 3 和 4 以得到洁白纯净的小团。 5. 加入 450 μl白细胞裂解液到一个标有实验编号的 eppendorf 管中,再加入 30 μl 10% SDS,移出一半左右白色小团(根据量而定)到盛有 450 μl 裂解液和 SDS 的已编号的 eppendorf 管内,然后将剩余的白细胞和 200 μl 裂解液移到一个 新的 eppendorf 管中作为血黄层储存于冰箱中备用。加入约 200μl 蛋白酶 K(10 mg/ml)到浸于裂解液和 SDS 的白细胞中(根据白细胞的量而定),用吸管吹 打几次后,裂解液将呈现粘稠状,此时需要再加一些裂解液。 6. 在 37℃孵育过夜或在 55℃孵育 4-5 小时,由于白细胞破裂,溶液的粘滞性降 低。 7. 在进行酚-氯仿抽提之前应先检查样品溶血是否充分,如果用巴氏滴管能很容 易地吸起和吹出溶液,表示裂解完全,如果裂解不够充分,则再加入一些蛋 白酶 K 并进一步孵育。 8. 加入等量酚(用 0.1 M Tris HCl 饱和)到样品中(一般加入 700 μl),混匀并 在微量离心机中以 3000 rpm 离心 5 分钟。 9. 将上清液移到一只干净的适当标记的离心管中,并加入等量的酚。 10. 将上清液移到一个干净的离心管中,并加入等量的氯仿,以 3000 rpm 离心 5 分钟。 11. 移出上清液,另外加入等量氯仿,并以 3000 rpm 离心 5 分钟。 12. 移出上清液到一只干净的离心管中,加入 1 ul 4 M 醋酸铵和 2 倍体积的 100% 乙醇,并轻缓摇动以沉淀 DNA。 13. 以 3000 rpm 离心 5 分钟使 DNA 成小团状。 14. 小心倒出 100% 乙醇(注意勿搅动 DNA 小团),并加 500 μl 70% 乙醇洗涤 DNA,充分摇匀并以 3000 rpm 离心 5 分钟。 15. 小心倒去 70% 乙醇,将 DNA 留于管底,空气干燥 DNA 小团直到乙醇完全 挥发,小团仍清晰。 16. 用适量的灭菌水溶解小团。 17. 在 4℃置放 4-5 小时以使 DNA 溶解。 18. 从酚与氯仿中离心出来的溶解废物应放入溶解废物箱中,并按照当地废物处

97


理规则处理。所有试管应放箱中高压消毒。

5.2.3 从绒毛膜抽提 DNA:酚-氯仿法 通过显微解剖移去所有母体组织的成份后(见第七章 ),绒毛膜可运送到分 子诊断实验室,置于组织培养液或 0.5 ml 绒毛膜裂解液中。如果运送时间超过 24 小时,用裂解缓冲液比较好,因为室温下 DNA 在 CVS 裂解液中两周以上或 更长时间都是极其稳定的。这种酚抽提法非常快速,包括两次 30 秒的酚-氯仿抽 提去除蛋白质,两次氯仿洗涤移去酚和乙醇沉淀。 试剂 a) CVS 裂解液:150 mM NaCl,25 mM EDTA,0.1% SDS(十二烷基硫酸钠盐), 50 μg/ml 蛋白酶 K。 b) 酚(用 0.1 M Tris 饱和)(Rathburn 化学制品) c) 氯仿 d) 7.5 M 醋酸铵 e) 100% 乙醇(贮存于带锁的“易燃物品柜”中) f)

70% 乙醇

方法: 1. 将置于组织培养液中的分选的 CVS 转移至 1.5 ml effendorf 管中,以 3000 rpm 离心 30 秒,小心移去上清液。如果 CVS 是置于裂解液中,直接进行第 4 步。 2. 将 CVS 重悬于 0.5 ml 150 mM NaCl 和 25 mM EDTA 中洗涤,以 3000 rpm 离 心 30 秒,小心移去上清。 3. 加入 0.5 mlCVS 裂解液并旋转混匀。 4. 在 37℃孵育过夜或 55℃孵育 3 小时。 5. 加 0.25 ml 氯仿和 0.25 ml 酚(用 0.1 M Tris HCl 饱和),混匀并在微量离心机 内离心,以 3000 rpm 离心 30 秒。 6. 把上清液吸到一只干净的已编号的管中,重复第 5 步,进行第 2 次抽提。 7. 把清液吸到一只干净的已编号的管中,加入 0.5 ml 氯仿,并充分混匀。 8. 以 3000 rpm 离心 30 秒,小心移出上清到一只干净的已编号的管中。

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9. 充分混匀并 3000 rpm 离心 30 秒,小心移出上清到干净的已编号的管中。 10. 加入 7.5 M 醋酸铵 250 μl 并混匀,加入 1.5 ml 100% 乙醇,轻缓混匀以沉淀 DNA,此步骤将使 DNA 沉淀成白色絮状物。如果此步骤未见 DNA,进行第 15 步操作。 11. 以 3000 rpm 离心 30 秒,使 DNA 成为小团。 12. 小心倒出 100% 乙醇(小心勿搅动 DNA 小团),并小心加入 500 μl 70% 乙醇 洗涤 DNA 小团,3000 rpm 离心 30 秒。 13. 小心倒出 70% 乙醇洗液,留下粘附于试管底部的 DNA,空气干燥 DNA 小 团直至乙醇彻底挥发,小团变为清晰。 14. 用 50 μl 灭菌蒸馏水溶解 DNA 小团(如样品量少则用 25 μl,样品量多则用 100 μl)。 15. 如果在第 10 步因浓度太低而看不见白色絮状物,将乙醇混合液置于-20℃至 少 1 小时,或者将管浸入干冰内冷冻 5 分钟,在微量离心机上以最高速度离 心 20 分钟。继续重复步骤 12,注意此过程将同时沉淀 DNA 与 RNA,因此, 无法评估 DNA 的准确浓度,除非用 RNA 酶处理以去除溶液中的 RNA。

5.2.4 从羊水细胞中抽提 DNA:酚-氯仿法 无论从样品中直接获取细胞还是从培养后的样品中获取细胞,从羊水细胞中 抽提 DNA 的方法与 CVS 基本相同。一般建议以培养方案作为替补手段,因为 有时直接从羊水中获取的样品不足以提供足量的 DNA 来进行 PCR 扩增和诊断。 培养细胞也能提供与直接获取细胞同样准确的结果,而直接获取的细胞有时被母 亲血液所污染,将得出可疑的结果。 DNA 产量比从 CVS 中获取要少一些,因此所有使用溶液的量为 CVS 的 1/5 (0.1ml 裂解液、50μl 氯仿,等等)。

5.3 已知突变的诊断 珠蛋白基因突变分析需要在特定突变所在的 DNA 区域进行 PCR 扩增,由于 珠蛋白基因不是太大,一般只需扩增一至两个片段。本节将介绍目前国际通用的 珠蛋白基因突变分析和诊断的基本方法:

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a) ASO-探针法:点印迹(DB)和反向点杂交(RDB)法的原理是已知序列的 单链 DNA 分子(“寡核苷酸”)能与第二个包含互补序列(“靶”)的 DNA 分子杂交,这种互补序列的稳定性依赖于配对碱基的长度。两种方法的 DNA 特异性扩增片段均需要与固定于膜条表面(RDB)的 ASO 探针杂交,或通 过与点状(DB)形式固定于膜条上的 DNA 样品的放射性标记探针进行杂交。 对每种突变的每条探针 DB 需要不同的杂交和洗膜温度,在每张膜条上筛查 多个样品的同一种突变。RDB 是一种非放射性方法,这种方法需要相同的杂 交和洗膜温度,RDB 可在一张膜条上筛查一个样品的多种突变。 b) 扩增应答突变系统(ARMS):这种方法是一种基于 PCR 的反应系统,这个 系统对应于正常序列或突变序列的核苷酸,在 3′端设计能区分正常等位基因 和突变等位基因的引物,如果发生退火的引物与基因组序列完全匹配,则 PCR 可扩增出目的 DNA 片段。这是一种快速、简单的非放射性方法,这种 方法可用于对一个样品的多种突变进行筛查,但需要丰富的经验以弄清假阴 性结果。 c) 限制性酶分析:这是一种快速、简单的非放射性方法,用于诊断产生或消除 限制性位点的突变。当特殊的点突变存在时,用限制性酶消化 PCR 片段, 该片段可能被切开或不能切开。这种方法的局限是大部分珠蛋白基因突变不 会产生或消除限制性酶位点,而且某些限制性酶分析成本非常昂贵。 d) 缺口 PCR:这是一种快速、简单的非放射性方法,这种方法能鉴别 DNA 缺 失或基因重排,如 α-地贫缺失、δβ-地贫缺失、Hb Lepore 重排等等。这种方 法的局限是必须已知缺失的断裂点以便设计引物。

5.3.1 等位基因特异性寡核苷酸(ASO)点杂交 点杂交分析是一种在硝酸纤维素膜或尼龙膜上回收扩增 DNA 的技术,在杂 交 DNA 制剂中,可进行杂交分析以确定相应的靶序列。点杂交分析最早由 Kafatos 等报道[21],这种技术最初用于测定一系列 DNA 样品的靶序列的相对总 量。在膜的表面可同时进行大量样品的杂交,也可在单个杂交实验中筛查很多不 同的 DNAs,或在连续的杂交实验中研究几种不同的突变。 试剂

100


a) 20×SSPE 2 M NaCl 0.2 M NaH2 PO4 · 2H2O 0.02 M Na2 EDTA,pH7.4

(用 10 M NaOH 调)

b) 50×Denhardt’s 试剂 1% 菲可 1% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1% 牛血清白蛋白(BSA)

方法 一般用一个固定在吸入装置上的复式接头将样品点于膜上,尤其是将不同时 间内制备的样品一起进行杂交时常用此装置。将转出的已扩增的 DNA 样品进行 变性(加入 10 倍体积 0.4 M NaOH,25 mM Na2 EDTA 或加热至 80℃ 5 分钟),然 后加到浸于盐缓冲液的膜上。―杂交‖后,用变性剂(0.4 M NaOH)和中和液 (2×SSC)洗膜,在 80℃真空中孵育(硝酸纤维膜)或紫外辐射( 尼龙膜)使 DNA 固定。 上述步骤完成后就可进行杂交。被检的每种突变(和其所对应的野生序列)的 寡核苷酸探针(ASO’s)一般设计为 19bp,待测的突变核苷酸最好在中间。ASO 探针在杂交前进行标记,可在 5’端用 γ32 ATP 标记 ASO,方法如下:250 ng 寡核 苷酸探针、125 μCi 放射性物质,10 个单位 T4 激活酶和 10×T4 激活酶缓冲液, 终体积为 20 μl,在 37℃孵育 2 小时后,加入 1 μl 0.5 M EDTA 和 480 ul 水,单 基团的放射性 dNTP 通过 NAP-5 柱移出。 1. 用 3 倍体积的水过柱。 2. 将已标记的 ASO 探针(500 μl)装于柱内运行,丢弃最初的洗脱液。 3. 用 1 ml 水洗注,把放射性洗脱液收集到 1.5 ml eppendorf 管内(如需要,则

进行计数)。 4. 加 1.5 ml 经标记的探针到 8.5 ml 杂交缓冲液(5×SSPE , 0.5% SDS 和 5×Denhardt’s)中进行杂交。杂交后,在杂交缓冲液中的 10 ml 放射性探针可 冻存在-20℃达 4-6 周,或只要放射性信号存在可长期保存。

101


在 2℃左右的温度下杂交 2 小时,这个温度低于探针的解链温度(解链温度

通过简化的公式计 算: Tm=4×[G+C]+2×[A+T] )。适当孵育后,在室温下用 10×SSPE 溶液和 0.5% SDS 溶液洗膜 2 次,每次 15 分钟;然后在 ASO 解链温度 下(4×SSPE 和 0.5% SDS)洗膜一次。移去所有非特异性结合的探针,仅留下与 靶 DNA 碱基配对的探针。 杂交和洗膜后,膜进行 12~16 小时的放射自显影,图 5.1 显示了点杂交分析 (同位素)的结果。除去膜的杂交痕迹(用 0.4 M NaOH 在 42℃处理 30 分钟,

然后用 0.2 M Tris/HCl,0.2×SSC 和 0.5% SDS 纯化)后再用其他探针再次杂交。 该法一次只能分析一个突变,正因为如此,筛查多种突变需要很多时间。而且, 每条寡核苷酸探针的杂交和洗膜温度都不同,在同一个程序中,可以进行多个样 品同一种突变的研究。

图 5.1 图 A 是用 IVS 1-110(G→A)突变探针进行杂交的放射自显影结果,图 B 是用 IVS 1-110(G→A)正常探针进行杂交的放射自显影结果。图 A:2 和 5 是 IVS 1-110(G→A) 突变阳性样品,1、3、4 是 IVS 1-110(G→A)突变阴性样品,样品 2 和 5 是 IVS 1-110(G→A) 杂合子。

5.3.2 反向点杂交(RDB) 反向点杂交分析是一种在尼龙膜上固定等位基因特异性探针而不是单个 DNA 样品的技术。该法是一种非放射性方法,多对突变和正常 ASO 探针被固定 于尼龙膜上。对单次诊断试验来说,一张已定位的包含很多种正常和突变寡核苷 酸的膜条,可以与一个特异的 DNA 样品杂交以筛查多种突变。反向点杂交分析 最初由 Saiki 等报道[22],后来发展为对西西里人群多种 β 突变进行筛查和用于产

102


前诊断[23 、24]。 理论上反向点杂交是为已建立起严格条件的国家检测任何已鉴定的点突变 而设计。在西西里 RDB 也用于检测 α-地贫[25]和 δ-地贫点突变,并用于 β-珠蛋白 基因变异(HbS、HbC、HbD 等) 的基因分型。下面介绍这种方法的大致要点, 更多的细节请查阅参考文献 23-25。

方法 用带生物素的 5′修饰引物标记已扩增的 DNA,或者在扩增时用生物素 -16-dUTP 进行标记。基因组 DNA 扩增总体积为 50 μl,包含每种 5’生物素标记 的引物或者在 PCR 反应期间加入生物素-16-dUTP(Roche)代替 dTTP。如果使用 5′ 生物素标记引物,建议在最后的合成步骤过程中使用市售的 5’生物素基团。 A.Giambona 医生和 A.Maggio 教授所在实验室使用的操作流程表明在 PCR 扩增 过程中可引入了生物素-16-dUTP。

扩增和标记 β-珠蛋白基因 1. 这里介绍的方法使用 2 对 PCR 引物同时扩增 2 段包括所有已知 β-地贫突变的 β-珠蛋白 DNA 片段,在同一管中同时使用 4 条引物进行二重 PCR,在此过 程中左向的引物对直接扩增 735 bp 的片段,右向的引物对扩增 526 bp 的片段。 2. 左向引物对由上游引物 5′GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA3′和下游引 物 5′TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAAC3′构成。 3. 右 向 引 物 对 由 上 游 引 物 5′GGGTTAAGGCAATAGCAAT3′ 和 下 游 引 物 5′CTGACCTCCCACATTCCCTT3′构成。 4. 以下的扩增缓冲液和热循环条件适用于 β-珠蛋白基因和用生物素标记 DNA 的 PCR 扩增。 5. 0.2 μg 靶 DNA 在 50 μl 反应混合液中扩增,还包含以下成份: 每条引物 10 pm 1×PCR 缓冲液 1.5 mM MgCl2 100 μM dNTPs

103


10 μM 生物素-16-dUTP(Roche) 2U 重组 Taq 聚合酶(Invitrogene) 6. 以 94℃ 5 分钟进行一个循环;以 94℃ 45 秒、55℃ 45 秒和 72℃ 45 秒进行 30 个循环,然后在 72℃进行 7 分钟最后延伸。

扩增和标记 α-珠蛋白基因 1. 在 α2-和 α1-基因之间 3′端存在差异的区域选择一条引物,在两个 α-基因设计 一条 5′共用引物,α2-和 α1-珠蛋白基因可进行选择性扩增。α2-珠蛋白基因片 段为 923 bp,α1-珠蛋白基因片段为 922 bp。 2. α2 和 α1 的 5′共用引物为 CCAAGCATAAACCCTGGCGCGCT。 3. α2 的 3′区引物为 AACACCTCCATTGTTGGCACATTCC。 4. α1 的 3′区引物为 CCATGCTGGCACGTTTCTGAG。 5. 每个被检的 DNA 样品建立两个 50 μl 的扩增反应体系,α2-基因一个,α1-基 因一个。 6. 扩增体系包括以下成份: 每条引物 10 pm 2.5 mM MgCl2 50 mM Tris-HCl pH 8.9 100 mM dNTPs 10 μM 生物素-16-dUTP 13% 甘油 2 U 天然 Taq 聚合酶(Invitrogene) 7. 进行 30 个循环:98℃ 45 秒,55℃ 30 秒,72℃ 45 秒进行 5 个循环;96℃ 30 秒,55℃ 30 秒,75℃ 45 秒进行 25 个循环,最后再加上一个 72℃ 7 分钟的 延伸步骤。

扩增 DNA 的杂交 1. 寡核苷酸探针为 5′端氨基酸-修饰型,在合成的最后一步加入一个 NH2 基团 (MWG-Biotech AG)。

104


2. 表 5.3 罗列了每种用于滤膜的 β-珠蛋白基因序列和皮摩尔数。 3. 表 5.4 罗列了每种用于滤膜的 α2-和 α1-珠蛋白基因的序列和皮摩尔数。 4. 用 16% EDC(1-十六醇-3-二甲胺丙基碳化二亚胺,Sigma)激活生命达因-C 膜(PALL-Biosupport)15 分钟,用水冲洗、空气干燥。 5. 寡核苷酸探针用 pH 8.4 的 0.5 M NaHCO 3 / Na2CO3 缓冲液稀释至表 5.3 和表 5.4 中给出的膜的使用浓度。 6. 用 2 μl 移液器吸取 1 μl 寡核苷酸探针点于每张杂交膜的表面,在同一条泳道 的左边点上正常寡核苷酸探针,右边点上突变寡核苷酸探针。 7. 空气干燥膜条并用 0.1 M NaOH 灭活膜条 10 分钟,然后用水冲洗膜条,空气 干燥。 常温下以这种方式制备好的膜条在干贮箱中能保存 6 个月以上。 8. 将每张与寡核苷酸探针结合的膜条放入 3 ml 由 2×SSC 和 0.1% SDS 配制成的 杂交液中。 9. 用 0.5 ml 杂交液(2×SSC 和 0.1% SDS)稀释 20 μl 扩增的 DNA 并在 95℃变 性 5 分钟。 10. 立即将变性 DNA 加入到 3 ml 杂交液中,并在 45℃振荡水浴箱中孵育 60 分 钟。 11. 用 2×SSC 和 0.1% SDS 在 45℃洗膜 2 次,并收集洗液。 12. 在含有 5 个单位链霉抗生物素蛋白-AP 接合(Roche)的 20 ml 2×SSC 和 0.1% SDS 溶液中室温孵育 30 分钟。 13. 用 2×SSC 和 SDS 在室温下洗膜 2 次,每次 15 分钟。 14. 在室温下用新鲜配制的含有氮蓝四唑的溶液避光孵育滤膜 30 分钟以显色。 15. 氯盐(NBT、Roche)和溴氯吲哚氧基磷酸(BCIP、Roche)用 Tris-HCl 调 pH 至 9.4,30~45 分钟内显色。 16. 用蒸馏水振荡洗膜 2 次。

105


表 5.3

用反向点杂交法(RDB)诊断西西里人 β-地贫突变的寡核苷酸探针序列和数量(应

用于每条滤膜的皮摩尔数) 位置

探针

-101

正常

ACCTCACCCTGTGGAG

5

-101

C>T 正常

GCTCCACAAGGTGAGGT

5

GTGGAGCCACACCCTA

5

C>T 正常

TAGGGTGTAGCTCCAC 与-87正常探针相同

C>T 正常

ACCCTAGGATGTGGCT

5 5 5

C>G

GGAGCCACACCCTAG ACCCTAGCGTGTGGC

5 5

-87 -30

C>T 正常

AACCCTAGAGTGTGGCT CTGACTTTTATGCCCAG

5 3

-30 Cd 5

G>C 正常

CTGACTTTTGTGCCCAG 与 Cd 6正常探针相同

3 8

Fr Cd 5

-CT 正常

TTCTCCTCGAGTCAGGT

5

ACTCCTGAGGAGAAGT TTCTCCCAGGAGTCAG

8 8

TGAGGAGAAGTCTGCC

5

-AA 正常

AGGGCAGACCTCCTCA 与 IVS1.nt 1 正常探针相同

5

G>C 正常

CTGGGCACGTTGGTA ATACCAACCTGCCCAG CTGGGCAGATTGGTAT 与 IVS1.nt 6 正常探针相同

-92 -92 -88 -88 -87 -87

Cd 6 Fr Cd 6

-A 正常

Cd 8 Fr Cd 8 Cd 30 Cd 30 IVS1.nt 1 IVS1.nt 1 IVS1.nt 5 IVS1.nt IVS1.nt IVS1.nt IVS1.nt

5 5 6 6

IVS1.nt 110 IVS1.nt 110

G>A 正常 G>A G>C 正常 T>C 正常

数量

3 3 3 3 4

GCAGGTTGATATCAAGG GCAGGTTGCTATCAAG CCTTGATACCAACCTGC CAGGTTGGCATCAAGGT

5 5 5 5

GAAAATAGACCAATAGGCAGA CTGCCTATTAGTCTATTTTC

7 7

ACCCTTAGGCTGCTGG ACCCTTACGCTGCTGG

5 5

CTTGGACCCAGAGGTTCTT

6

Cd 39

G>A 正常 G>C 正常

Cd 39 IVS2.nt 1

C>T 正常

AGAACCTCTAGGTCCAAGG AACTTCAGGGTGAGTCTAT

6 4

IVS2.nt 1 IVS2.nt 745

G>A 正常

CTTCAGGATGAGTCTATGG CAATCCAGCTACCATTC

4 4

IVS2.nt 745

C>G

GAATGGTACCTGGATTG

4

IVS1.nt 130 IVS1.nt 130

表 5.4

用反向点杂交法(RDB)诊断 α-地贫突变的寡核苷酸探针序列和数量(应用于每条

滤膜的皮摩尔数量)

106


位置

探针

序列

数量

α2 IVS1 供体位点 α2 IVS1 供体位点 α2 起始密码子 α2 起始密码子

正常

GAGGTGAGGCTCCCTC CTGGAGAGCTCCCTCC ACCCACCATGGTGCTGT CCCACCACGGTGCTGT

8 8 7 7

GCCTCCCTGGACAAG

5

CCTCCCCGGCAAGT

5

AAATACCGTTAAGCTGGA AAATACCGTTAAGCTGGA AAATAGGCTAAAGCTGGA

5 5 5

AATACCGTGAAGCTGGA AATACCGTTCAGCTGGA

5 5

GTCTTTGAATAAAGTCTGA TTTGAATAAGGTCTGAGTG

4 4

GAGGTGAGGCTCCCTC ACCCACCGTGGTGCTG

7 7

α2 Cd 125 α2

Qoung-Sze

Cd 125

α2 Cd 142 α2 Constant Spring Cd 142 α2 lcaria Cd 142 α2 Seal Rock Cd 142 α2 Koya Dora Cd 142 α2 PolyA 信号 α2 T Saudi α1 起始密码子 α1 起始密码子

-TGAGG 正常 CATG > CACG 正常 CTG > CCG 正常 TAA > CAA TAA > AAA TAA > GAA TAA > TCA 正常 AATAAA > AATAAG 正常 CATG > CGTG

对所有探针的单次洗涤温度进行优化是这种方法的关键要点,最好通过对每 条寡核苷酸探针的长度和量的优化来完成,一般需要合成和测试很多探针。某些 些情况下,寡核苷酸序列中单个核苷酸的增加或缺失是正确分型的关键。 包含共价结合的寡核苷酸探针的膜条可以大批量制备,并可在室温下贮存 6 个月备用。 应用回收 ASO 探针进行反向点杂交的主要步骤显示于图 5.2。

图 5.2

反向点杂交分析的主要步骤

107


结果解释 需要特别强调的是必须区别由于本底信号导致的假阳性和质控样品的真阳 性。如果测试有疑问应予重复测试。与 ARMS-PCR 一样,策略是在一张膜条上 筛查常见突变,如果未观察到阳性结果,则在第二张膜条上筛查罕见突变,对于 仍未被鉴定的任何突变将进行直接测序。

图 5.3 反向点杂交分析的一个例子,显示了两个个体存在于地中海地区人群最常见突变的检 测结果。左边为点突变 Cd 39 (C→T)的阳性携带者,而右边鉴定为点突变 IVS 1-6(T→C)。 N:正常寡核苷酸,M:突变寡核苷酸。

图 5.3~5.6 显示了 A.Giambona 医生和 A.Maggio 教授所在实验室得到的 RDB 检测结果。图 5.3 显示了用 RDB 技术筛查西西里人 7 种最常见突变的结果。这 些突变占西西里人 95%的 β-地贫缺陷。图 5.4 显示了用 RDB 进行 β-地贫产前诊 断的结果。图 5.5 和 5.6 显示了 RDB 用于检测 α-地贫和 δ-地贫点突变的结果。

108


图 5.4

通过 RDB 进行产前诊断的一个例子。左边(A)为 Cd 39(C→T)(双亲均为

Cd 39 携带者)的产前诊断结果,胎儿是 Cd 39 突变纯合子。右边(B)为 IVS I-110 (G→A) 和 IVS I-6(T→C)的产前诊断结果,胎儿是 IVS I-110 及 IVS I-6 突变杂合子。

图 5.5 经杂交和显色后的非缺失型 α+-地贫缺陷反向点杂交膜条,杂交探针与固定于这些反 向点杂交膜条上的 6 种常见地中海地区人群 α-地贫突变和非地中海地区人群突变互补。在 每张滤膜上,正常探针位于右边,突变探针位于左边,每种探针所代表的突变列于上面,受 检 DNA 样品的基因型列于下面。

109


图 5.6 膜条 A 显示 δ-珠蛋白基因上的 3′IVSII(A→G)突变,膜条 B 显示 δ-珠蛋白基因上 的 Cd 27(G→T)突变,这是西西里岛频率最高的突变,表 A 和 B 分别为相应突变的表型。

5.3.3 扩增应答突变系统(ARMS) 原理 检测已知点突变的 ARMS 技术最早由 Newton 等报道[26],现已发展为诊断 在所有种群中发现的全部常见 β-地贫突变的技术[10]。该技术根据 PCR 过程中等 位基因特异性引物的原理,即特异性引物仅在其 3′末端核苷酸与其靶序列相配对 才发生扩增。因此,为了检测 β-地贫突变 IVS I-5(G→C),ARMS 引物的 3′端 核苷酸为 G,以对应于突变 DNA 的替换碱基为 C,引物与正常 DNA 形成了一 个 G-G 错配,但这是一个弱碱基错配,不足以阻止引物本身的延伸。已发现只 有强错配(C-C,G-A 和 A-A)能将引物效率降低到零或低于-5%,同时为了阻止 扩增,需从引物 3′末端的第二、第三或第四个核苷酸引入与靶序列进一步的错配 [27]

。 作为 ARMS 引物设计的一般规则,如果 3′末端错配是弱错配,那么第二个

需引入强错配,如果 3′末端错配是一个强错配,第二个需引入弱错配。通常第一 种情况是在 3′末端的第二个核苷酸设计错配,然后测试引物的特异性和形成的产 物,如果引物无效则可以改变错配的位置,或者如果观察到非特异条带则可增加 错配的强度。根据 Little 的人类遗传学现行方案[28],错配碱基对的强度为:GA、 CT、TT 最强;CC 强;AA、GG 中等;CA、GT 弱;AT、GC 没有强度。 牛津大学实验室用于诊断最常见的 25 种 β-地贫突变(加上血红蛋白变异

110


HbS、HbC 和 HbE)的突变特异性 ARMS 引物列于表 5.5。全部引物均为 30 个 碱基长,这样它们就可在单个高退火温度(65℃)下使用。

表 5.5 用于检测常见 β 地贫突变的 ARMS-PCR 引物序列 突变

寡核苷酸序列

第二

产 物 大 小

引物

( bp)

-88 (C→T) -87 (C→G)

TCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCTCAT CACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACCCG

A A

684 683

-30 (T→A) -29 (A→G)

GCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGGAA CAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGTATG

A A

626 625

-28 (A→G) CAP+1 (A→G)

AGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCTTAG AAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGGTTC

A A

624 597

Cd 5 (-CT) Cd 6 (-A)

TCAAACAGACACCATGGTGCACCTGAGTCG CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGCC

A B

528 207

Cd 8 (-AA)

ACACCATGGTGCACCTGACTCCTGACAGG

A

520

Cd 8/9 (+G) Cd 15 (G→A)

CCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCACACC TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCAGTA

B A

225 500

Cd 16 (-C)

TCACCACCAACTTCATCCACGTTCACGTTC

B

238

Cd 17 (A→T)

CTCACCACCAACTTCACCACGTTCAGCTA

B

239

Cd 24 (T→A) Cd 39 (C→T) Cd 41/42 (-TCTT) Cd 71/72 (+A)

CTTGATACCAACCTGCCCAGGGCCTCTCCT CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACCTGTA GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAG

B B B C

262 436 439 241

IVSI-1 (G→A)

TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCGAT

B

281

IVSI-1 (G→T) IVSI-5 (G→C) IVSI-6 (T→C) IVSI-110 (G→A)

TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACGAAA CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG TCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTCATG ACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAAAATAGAGT

B B B B

281 285 286 419

IVSII-1 (G→A) IVSII-654 (C→T)

AAGAAAACAT CAAGGGTCCCATAGACTGAT GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAACGT *

B D

634 829

IVSII-745 (C→G)

TCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCGAGG*

D

738

βS Cd 6 (A→T)

CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGCA

B

207

β Cd 6 (G→A) βE Cd 26 (G→A)

CCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCGTT TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCGTT

B B

206 236

C

上述引物是成对存在的,或与引物 A:CCCCTTCCTATGACATGAACTTAA , 或引物 B: ACCTCACCCTGTGGAGCCAC;或引物 C:TTCGTCTGTTTCCCATTCTAAACT ;或引物 D: GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA 。除了标有*号的两条引物外,上述所有突变特异性 ARM S 引物使用的质 控引物都是引物 D+E:CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC(产生一段861 bp 的产物,见图5.7)。标有*号的两 条引物使用的质控引物是 Gγ-Hind III RFLP 引物[8]。

典型的单个突变 ARMS 实验由两个使用同样的基因组 DNA作为底物在相同

111


的反应混合液中扩增构成。特异性 ARMS 引物及其引物对(当基因组 DNA 中存

在突变时)产生一段扩增产物,另一段扩增产物是在相同的 PCR 条件下从基因 组的无关区域由两条引物扩增形成的质控片段。质控产物的产生表示反应混合液 和热循环仪工作状态理想。图 5.7 显示一个 β-地贫突变的 DNA 样品筛查结果, 策略是首先筛查患者所属种群所在国家的已知常见突变,然后再筛查稀有突变, 之后未确认的突变通过基因组测序来鉴定。

图 5.7 用 ARMS-PCR 筛查常见 β-地贫突变的例子。溴化乙锭染色的凝胶显示一个 DNA 样 品通过 ARMS-PCR 筛查 4 种亚洲印地安人常见 β-地贫突变的结果:泳道 1,IVS I-5(G→C); 泳道 2,IVS I-1(G→T);泳道 3,Cd 41/42(-TCTT);泳道 4,Cd 8/9 (C→T),结果显示病 人携带了 IVS I-1(G→T)突变。质控引物 D 和 E 在 4 个泳道均产生了一个 861 bp 的正常 DNA 片段,所用引物列于表 5.4。

大部分这些突变的正常等位基因的诊断引物列于表 5.6。当携带相同突变的 夫妇要求进行 β-地贫产前诊断时需要使用这些引物。使用突变和正常 ARMS 引 物进行产前诊断的例子见图 5.8。 表 5.6 用 ARMS-PCR 法测定正常 DNA 序列所使用的引物 突变

寡核苷酸

第二 引物

-87 (C→G)

CACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACCCG

A

683

Cd 5 (-CT)

CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCT

A

528

Cd 8 (-AA) Cd 8/9 (+G) Cd 15 (G→A) Cd 39 (C→T)

ACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGCAGA CCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCACACT TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCAGTA TTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGTCCC

A B A A

520 225 500 299

Cd 41/42 (-TCTT)

GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAAAGA

B

439

112

产物大小 ( bp)


IVSI-1 (G→A)

TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCGAT

B

281

IVSI-5 (G→C) IVSI-6 (T→C) IVSI-110 (G→A) IVSII-1 (G→A)

CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG AGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGT ACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAAAATACACC AAGAAAACAT CAAGGGTCCCATAGACTGAC

B A B B

285 419 419 634

IVSII-654 (C→T)

GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAACGC

D

829

IVSII-745 (C→G)

TCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCGAGC

D

738

A B

527 236

β Cd 6 (A→T) AACAGACACCATGGTGCACCTGACTCGTGA E β Cd 26 (G→A) TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCGTC 引物 A-D 和质控引物的详细说明参见表5.4的标注。 S

试剂 a) dNTPs:每一种 dNTP 各 100 mM 溶液(如购买)共加入 50 μl 和 3.8 ml 蒸 馏水,1.25 mM dNTP 储备液分装冻存。 b) ARMS-PCR 缓冲液:50 mM KCl,10 mM Tris-HCl (室温下 pH8.3),1.5 mM MgCl2 ,100 μg/ml 明胶。将 0.5 ml 1 M Tris-HCl(室温下 pH8.3),1.25 ml 2 M KCl,75 μl 1 M MgCl2 ,5 mg 明胶和 3.275 ml 蒸馏水加到一起制备 10×储备 缓冲液。将储备液在 37℃加热直到明胶溶解,然后分装冻存。 c) Taq 聚合酶:建议使用下述产品:金牌 AmpliTaq

(PE 生物系统 )用于

ARMS-PCR/RE 消化试验效果最好,Platinum Taq (Gibco 生命技术)用于 缺口 PCR 最佳(见“方法”) 。 d) Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液:89 mM Tris-硼酸,89 mM 硼酸,10 mM pH8.0 EDTA。

图 5.8 AMRS-PCR 产前诊断的一个例子。溴化乙锭染色的凝胶显示了使用表 5.4 和表 5.5 中 的 ARMS 引物进行 IVS I-5(G→C)β-地贫突变产前诊断的结果(父母双方都是 IVS I-5 G→C

113


携带者)。泳道 1 和 2 显示用突变引物检测的父亲和母亲的 DNA 样品,泳道 3 显示用正常 引物检测的纯合子 IVS I-5 G→C 质控 DNA 样品,泳道 4 和 5 分别显示用突变探针和正常探 针检测的胎儿 DNA 样品。正常引物扩增产生 285 bp 的 ARMS 特异性产物,突变引物扩增 产生的 285 bp 产物的缺乏表示胎儿是正常的。

方法 1. 制备 200 个反应的反应混合液(4 ml),构成如下:0.5 ml 10×ARMS-PCR 缓冲 液;1.25 ml 1.35 mM dNTP 混合液;2.65 ml 灭菌蒸馏水。 2. 用移液器吸 20 μl PCR 反应混合液到 0.5 ml 管中。 3. 加入每种引物各 1 μl(1 个光密度单位/ml)。 4. 加入 0.05 μl 聚合酶(5 单位/μl)。 5. 当将要进行一个以上的试验时,可在加入反应液之前将引物和酶混合到一个 单独的管中,当使用量较大时可降低吸液误差。 6. 加入 1 μl 基因组 DNA(100 ng/μl)。 7. 用 25 μl 矿物油覆盖。 8. 混匀离心并放到热循环仪上。 9. 按下面条件扩增 25 个循环:94℃ 1 分钟 / 65℃ 1 分钟/ 72℃ 1.5 分钟,在第 25 个循环之后,最后加上一个 72℃ 3 分钟的延伸。 10. 从热循环仪中取出试管,加入 5 μl 蓝色染料,混匀并离心。 11. 将 20 μl 的分装液点于 3%琼脂凝胶上,并在 TEB 中以 100V 运行 45 分钟。 12. 用溴化乙锭液(0.5 μg/ml)染凝胶 15~30 分钟,在紫外光箱中(312 nm)使 带显影并用电子相机系统或安装了橙色滤光片(例如 Wratten 22A)的宝丽莱 CU-5 相机拍照。

5.3.4 限制性酶 (RE)-PCR 原理 少数 β-地贫突变产生或消除了珠蛋白基因序列中的限制性内切酶识别位点。 以酶有市售(并非都有市售)和没有其他的位点与突变位点靠近为前提,识别位 点的丢失和产生可用于诊断突变的存在与否,这对于诊断某些 β-地贫非常有用, 如表 5.7 所示。 然而这种 PCR 技术的主要应用在于诊断临床上重要的 Hb 变异,如 HbS、

114


Hb D-Punjap 和 Hb O-Arab。图 5.9 显示了用该技术进行 HbS 突变的测定。牛津 大学实验室用于这些 Hb 变异诊断的引物序列见表 5.8,但也可应用跨越突变位 点的其他引物序列。无论何时可用的扩增产物应包括适用的限制性酶的第二个位 点,这个位点将作为消化反应的质控,它应在正常和突变 DNA 等位基因得到的 产物完全被切开。这对 HbS 和 HbE 突变来说是可能的,但对 Hb O-Arab 及 Hb D-Punjap 则不行,因为侧翼的 EcoR I 位点离侧翼的密码子 121 太远了。 RE-PCR 也应用于 β 珠蛋白基因单倍型分析,在 β 珠蛋白基因簇内至少已有 18 种 RFLP s 被定性,然而这些 RFLP 位点中大部分彼此之间是非随机相连的, 所以它们组合后仅仅产生少数单倍型[29],特别是当它们形成了从 5′端至 δ 基因的 基因簇和从 β 珠蛋白基因下游延伸而成的 3′端基因簇时,这两个基因簇之间的 DNA 包含一个减数分裂重组的相关热点,其几率大约为 350 次减数分裂发生一 次[30]。正常情况下,β-珠蛋白基因簇单倍型由位于 5′端的 5 个 RFLP′s(Hind II/ε 基因;Hind III / Gγ 基因;Hind III /Aγ 基因;Hind II /3ψβ 基因和 Hind II/5ψβ 基因) 和位于 3′端的 2 个 RFLPs(Avα II/β 基因,BamH I/β 基因)构成[31]。

表 5.7 通过 RE-PCR 法检测的 β-地贫突变 位置

突变

种群

受累位点

-88

C→T

非洲人/亚洲印第安人

- Fok I

-87 -87 -87 -86

C→G C→T C→A C→G

地中海人 意大利人 非洲人/南斯拉夫人 黎巴嫩人

-

-86 -29

C→A A→G

意大利人 非洲人/中国人

- Avr II + NIa III

+43 to +40 起始 Cd

(-AAAC) T→C

中国人 南斯拉夫人

+ Dde I - Nco I

起始 Cd

T→G

中国人

- Nco I

起始 Cd

日本人

Cd 5

A→G (-CT)

地中海人

- Nco I - Dde I

Cd 6 Cd 15

(-A) (-T)

地中海人 亚洲印第安人

- Dde I + BgI I

Cd 17 Cd 26

A→T G→T

中国人 泰国人

+ Mae I - MnI I

Cd 26 Cd 27 Cd29

G→A G→T C→T

东南亚人 地中海人 黎巴嫩人

- MnI I - Sau96 I - BspM I

115

Avr II Avr II Avr II Avr II


Cd 30

G→C

突尼斯人/非洲人

- BspM I

Cd 30 IVSI-1 IVSI-1 IVSI-2

G→A G→A G→T T→G

保加利亚人 地中海人 亚洲印第安人/中国人 突尼斯人

-

IVSI-2

T→C

- BspM I

IVSI-2

T→A

非洲人 阿尔及利亚人

IVSI-5 IVSI-6

G→A T→C

地中海人 地中海人

+ EcoR V + SfaN I

IVSI-116

T→G

地中海人

+ Mae I

IVSI-130 IVSI-130

G→C G→A

土耳其人 埃及人

- Dde I - Dde I

Cd 35 Cd 37

G→A G→A

泰国人 沙特阿拉伯人

- Acc I - Ava II

Cd 38/39 Cd 37/8/9

(-C) (-GACCCAG)

捷克斯洛伐克人 土耳其人

- Ava II - Ava II

Cd 39

C→T

+ Mae I

Cd 43 Cd 47

G→T (+A)

地中海人 中国人 苏里南人

Cd 61

A→T

- Hph I

Cd 74/75

(-C)

非洲人 土耳其人

Cd 121 IVSII-1 IVSII-4,5 IVSII-745

G→T G→A (-AG) C→G

波兰人/法国人/日本人 地中海人 葡萄牙人 地中海人

- EcoR I - Hph I - Hph I + Rsa

图 5.9

BspM I BspM I BspM I BspM I

- BspM I

- Hinf I - Xho I - Hae III

应用 RE-PCR 诊断镰状细胞病的一个例子,经溴化乙锭染色的凝胶显示使用表 5.7

中介绍的引物通过 Dde I 消化后的扩增 DNA。消化产物图谱所提示的镰状细胞基因型标注

116


于每个泳道的下面。 表 5.8 用限制性片段长度多态性检测 βS、βE 、βD Punjap 和 βO Arab 突变的寡核苷酸引物 引物和受累 位点

引物序列

引物大小 (bp): 位点缺失

引物大小 (bp): 位点存在

HbS (Dde I)

ACCTCACCCTGTGTGGAGCCAC GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAAAGA

376/67

201/175/67

HbE

ACCTCACCCTGTGTGGAGCCAC

(Mnl I) Hb D-Punjab

GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAAGGA CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC

231/89/56/35/33

171/89/60/35/33

(EcoR I) Hb O-Arab

GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC

861

552/309

(EcoR I)

GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA

861

552/309

所有引物对的退火温度均为 65℃

除了 BamH I 位点外,这 7 个 RFLPs 均可使用 3.2.3 中介绍的程序通过 PCR 简便而快速地分析。引物序列和所产生的片段大小列于表 5.9。BamH I RFLP 位 于 L1 重复元件内,产生的扩增问题,正好位于 3′端至 β-珠蛋白基因的 Hinf I RFLP 被替用,因为已发现这两个 RFLP’s 存在连锁不平衡[32]。 表 5.9 用于分析 β-珠蛋白基因簇的 RFLP 的寡核苷酸引物序列 退火 RFLP

ε-Hind II G

G

A

γ-Xmn I γ-Hind III γ-Hind III

5,ψβ-Hind II

引物序列

引 物 大 小 (bp): 位点缺失

引物大小 (bp): 位点存在

55

760

314/446

55

650

450/200

65

323

235/98

55

635

327/308

55

794

687/107

温度 (℃)

TCTCTGTTTGATGACAAATTC AGTCATTGGTCAAGGCTGACC AACTGTTGCTTTATAGGATTT AGGAGCTTATTGATAACTCAGAC AGTGCTGCAAAGAAGAACAACTACC CTCGCATCATGGGCCAGTGAGCCTC ATGCTGCTAATGCTTCATTAC TCATTGTGTGATCTCTCTCAGCAG TCCTATCCATTACTGTTCCTTGAA ATTGTCTTATTCTAGAGACGATTT

5'ψβ-Ava II

TCCTATCCATTACTGTTCCTTGAA ATTGTCTTATTCTAGAGACGATTT

55

794

442/352

3'ψβ-Hind II

GTACTCATACTTTAAGTCCTAACT TAAGCAAGATTATTTCTGGTCTCT

55

914

480/434

β-Rsa I

AGACATAATTTATTAGCATGCATG CCCCTTCCTATGACAT GAACTTAA

55

692/413/100

692/331/100/82

β-Ava II

GTGGTCTACCCTTCCACCCAGACG TTCGTCTGTTTCCCATTCTAAACT

65

328

227/101

117


GCAGGTTAAAGTTTTGCTATGCTGAT

β-Hinf I

GGGCCTATGATAGGGTAAT

65

320/155

219/155/108

方法: 1. 加入下列成份到一个 0.5 ml 管中:20 μl PCR 反应混合液(见 ARMS 步骤 3.2.1

中所详述);每种引物 1 μl;1 μl 基因组 DNA(100 ng/μl);2 μl 灭菌蒸馏水; 0.05 μl 扩增 Taq DNA 聚合酶(5 μ/μl)。 2. 用 25 μl 石蜡油履盖。 3. 置于热循环仪上进行 30 个循环:94℃ 1 分钟 / 65℃ 1 分钟 / 72℃ 1.5 分钟, 在最后一个循环之后再加上 72℃ 3 分钟的一个延伸。 4. 取出试管并加入 5-10 单位适合的限制性酶,再加 2 μl 相应的 10×缓冲液。 5. 在 37℃至少孵育 1 小时。 6. 按照 ARMS-PCR 方法加入蓝色染料、混匀并离心。 7. 等量加载 20 μl到由 50% Nusieve GTC 琼脂和 50%普通琼脂组成的 3%琼脂凝 胶上。 8. 按 ARMS-PCR 一节所描述的步骤进行电泳、染色并拍照。

5.3.5 缺口 PCR 原理 β-珠蛋白基因簇的基因缺失突变可通过应用与缺失侧翼的 DNA 区域的有义 链和反义链互补的两条引物进行 PCR 反应来检侧。对于小于一千个碱基对的小 缺失,引物对将产生两种产物,缺失等位基因将产生较小的片段。对于大的缺失 来说,两条侧翼引物之间的距离太远以至于不能扩增正常等位基因,产物仅能从 缺失等位基因获得。在这些情况下,正常等位基因可以使用与缺失序列互补的一 条引物和与侧翼 DNA 互补的另一条引物进行跨越断裂点的扩增来检测。

118


图 5.10

图 5.11

+

应用表 5.9 中的引物通过多重缺口 PCR 进行 α -地贫缺失突变的检测

应用表 5.10 和 5.11 中的引物通过多重缺口 PCR 进行 α°-地贫缺失突变的检测

缺口 PCR 可应用于一些 δβ-地贫缺失、HPFH 缺失、α-地贫缺失(表 5.2) 和由 3.7kb 的单个 α-基因缺失产生的 α 三联体的检测[5],经典的缺口 PCR 试验见 图 5.10 和 5.11。对于 α-地贫的诊断,目前可用多重的引物。3.7kb 和 4.2kb α+地贫缺失可在同一次试验中检测(表 5.10),--- MED 及-(α)20.5 α°-地贫缺失可在同 一次试验中检测(表 5.11),三种东南亚型 α°-地贫缺失可在同一次试验中检测(表 5.12)。在牛津大学实验室利用这些多重引物的操作步骤见表 5.10~5.12,但应注 意相对其他的引物每一对引物的量需作调整,以得到所有产物的最适扩增状态。 三重 α-基因(反式 3.7 等位基因)的 PCR 诊断需要两次单独的检测(表 5.13 和 5.14)。在大多数情况下,等位基因的存在可通过将每一次检验操作的结果进行 比较而诊断,DNA 样品的基因型也可由此推断(表 5.15)。 通过可变数目串联重复(VNRT)多态性分析[41]缺口 PCR 也可用于检测胎儿

119


DNA 样品中的母体污染,详述于第七章。

试剂 a) dNTPs:每种 100 mM 的 dNTP 溶液(如市售)共加入 50 μl,再加 3.8 ml 蒸 馏水。1.25 mM dNTP 储备液应分装冻存。 b) 10×缺口 PCR 反应缓冲液(根据所用的引物而成份各异)见方法和各表。 c) 二甲胺乙内脂(英国 Sigma-Aldrich 生化有限公司) d) 覆盖 PCR 反应的石蜡油 e) PCR 引物:将分装的引物储备液稀释为 1 OD 单位/ml 的工作液并冻存。 f)

硫酸铵缓冲液:75 mM Tris-HCl(pH9.0),20 mM (NH4 )2 SO4 ,2.0 mM MgCl2 , 0.01% 吐温 20,10% 二甲基亚砜,10 mM β-疏基乙醇(均为终浓度)。

g) Taq 聚合酶和 10×Taq 缓冲液:牛津大学实验室配方如下:金牌扩增 Taq (PE

生物系统)用于 ARMS-PCR/RE 消化分析效果最佳,Platinum Taq(Gibco 生命技术)用于缺口 PCR 效果最佳(见方法)。 h) Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液:89 mM Tris-硼酸,89 mM 硼酸,10 mM EDTA, pH8.0。 i)

蓝色 running 染料(15%菲可/ 0.05%溴酚蓝)。

j)

紫外分析仪和宝丽莱相机或紫外电子相机系统。

k) 0.5 μg/μl 溴化乙锭。

3.7

4.2

表 5.10 诊断-α 和-α 缺失的多重 PCR 步骤 A) 引物序列 引物

类型

序列

退火温度(℃)

1

α2/3.7-F

CCCCTCGCCAAGTCCACCC

64

2 3

3.7/20.5-R α2-R

AAAGCACTAGGGTCCAGCG AGACCAGGAAGGGCCGGTG

64 64

4 5

4.2-R 4.2-F

CCCGTTTACCCATGTGGTGCCTC GGTTTACCCATGTGGTGCCTG

64 64

120


B) PCR 反应混合液 成分

μl

α2/3.7-F (10 μM) α2-R (10 μM)

1.0 0.25

α2/20.5-R (10 μM)

1.0

4.2-F (10 μM)

1.0

4.2-R (10 μM) 10×buffer (750 mM Tris-HCl pH 8.8. 200 mM (NH4 )2 SO4,0.1% 吐温 20)

1.5 2.5

25 mM MgCL2 (1 mM)

1.5

dNTPs (1 mM) 甜菜碱(5 M)

5.0 3.75

DMSO (10%) Platinum Taq (5单位/μl) DNA 模板(100 ng/μl) 水

1.25 0.1 1.0 5.2

C) 凝胶电泳条件 将 PCR 产物在 1.5% (Nusieve:琼脂糖=1:1)凝胶中电泳 2-3 小时。 D) 结果解释 PCR 片段大小(bp)

基因型

引物的产物

2020

α+-地贫: -α3.7

1+2

1800

正常(αα)

1+3

1628

α -地贫: -α +

4.2

4+5

表 5.11 诊断---MED 和(-α)20.5 缺失的多重 PCR 步骤 A)引物序列 退火温度

引物

类型

序列

1

MED(F)

CGATGAGAACATAGTGAGCAGAATTGCAGG

60

2 3

MED(R) SEA (F)

ACGCCGACGTTGCTGCCCAGCTTCTTCCAC CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGGGAAGGAG

60 60

4

SEA (N)

TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGTGACCG

60

5 6

(℃)

- (α)

20.5

(F)

GGGCAAGCTGGTGGTGTTACACAGCAACTC

60

- (α)

20.5

(R)

CCACGCCCAT GCCTGGCACGTTTGCTGACG

60

121


B) PCR 反应混合液 成分

μl

SEA (F) (10 μM) SEA (R) (10 μM)

1.0 0.5

MED (F) (10 μM) MED (R)(10 μM)

0.4

(F) (10 μM)

0.4

-(α)

20.5

0.4

-(α) (R) (10 μM) 10×buffer (750 mM Tris-HCl pH 8.8, 200 mM (NH4 )2 SO4,0.1% 吐温20)

0.4 2.5

25 mM MgCl2 (1 mM)

1.5

dNTPs (1 mM) 甜菜碱(5 M)

4.0

20.5

3.75 1.25

DMSO (10%) Platinum Taq (5单位/μl) DNA 模板(100 ng/μl)

0.1 1.0

6.2

C) 凝胶电泳条件 将 PCR 产物在 2% (Nusieve:琼脂糖=1:1)凝胶中电泳 1-1.5 小时。 D) 结果解释 PCR 片段大小(bp)

基因型

引物的产物

1175

α0 -地贫: -(α)20.5

5+6

1010

正常(αα)

3+4

875

α -地贫-0

表 5.12

诊断--

SEA

/--

FIL

MED

/--

THAI

1+2

α°地贫缺失的多重 PCR 步骤

A)引物序列 退火温度

引物

类型

序列

1 2 3 4

FIL (F) FIL (R) SEA (F) SEA (N)

AAGAGAATAAACCACCCAATTTTTAAATGGGCA GAGAT AAT AACCTTTATCTGCCACATGT AGCAA CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGGGAAGGAG TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGTGACCG

60 60 60 60

5

SEA (R)

AT ATATGGGTCTGGAAGTGT ATCCCTCCCA

60

6 7

THAI (F) THAI (R)

CACGAGT AAAACATCAAGT ACACTCCAGCC TGGATCTGCACCTCTGGGTAGGTTCTCTACC

60 60

(℃)

122


B) PCR 反应混合液 成分

μl

SEA (F) (10 μM)

2.0

SEA (N) (10μM)

1.0

SEA (R) (10 μM)

4.0

FIL (F) (10 μM) FIL (R) (10 μM) THAI (F) (10 μM)

4.0 1.0 1.0

THAI (R) (10μM) 10×buffer (750 mM Tris-HCl pH 8.8, 200 mM (NH4 )2 SO4,0.1% 吐温 20)

2.5 1.5

25 mM MgCL2 (1 mM) dNTPs (1 mM) 甜菜碱(5 M)

4.0 5.0 3.75 1.25

DMSO (10%) Platinum Taq (5 单位/μl)

0.1

DNA 模板 (100 ng/μl) 水

1.0 0.65

C) 凝胶电泳条件 将 PCR 产物在 1.5% (Nusieve:琼脂糖=1:1)凝胶中电泳 2 小时。 D) 结果解释 PCR 片段大小(bp)

基因型

引物的产物

1010 660 550 495

正常(αα) SEA α°-地贫:-α°-地贫 -FIL α°-地贫:--THAI

3+4 3+5 1+2 6+7

诊断 ααα(反式 3.7)等位基因的 PCR 步骤:反应混合液 1

表 5.13 A)引物序列 引物

类型

序列

退火温度(℃)

1 2

C10 C3

GATGCACCCACTGGACTCCT CCATTGTTGGCACATTCCGG

55 55

123


B) PCR 反应混合液 成分

μl

C10 (10 μM) C3 (10 μM) 10×buffer (750 mM Tris-HCl pH 8.8, 200 mM (NH4 )2 SO4, 0.1% 吐温 20)

1.0 1.0

25 mM MgCl2 (1 mM)

1.5

dNTPs (1 mM) 甜菜碱 Betaine (5 M)

5.0 3.75 1.25

DMSO (10%) Platinum Taq (5 单位/μl)

2.5

DNA 模板 (100 ng/μl)

0.1 1.0

12.9

C) 凝胶电泳条件 将反应液混合物 1 的 PCR 产物在 2% (Nusieve:琼脂糖=1:1)凝胶中电泳 2 小时,在下一个泳 道电泳反应液混合物 2 的 PCR 产物。结果解释见表 5.15。 D) 产物大小 PCR 片段大小(bp)

基因型

引物的产物

没产物

α+-地贫:-α3.7 正常(αα) ααα:(反式 3.7)

1+2 1+2 1+2

1900 1900

诊断 ααα(反式 3.7)等位基因的 PCR 步骤:反应混合液 2

表 5.14 A)引物序列 引物

类型

序列

退火温度(℃)

1 2

C10 C2

GATGCACCCACTGGACTCCT CCATGCTGGCACGTTTCTGA

50 50

B) PCR 反应混合液 成分

μl

C10 (10 μM)

1.0

C2 (10 μM) 10×buffer (750 mM Tris-HCl pH 8.8, 200 mM (NH4 )2 SO4, 0.1% 吐温 20)

1.0 2.5

25 mM MgCl2 (1 mM) dNTPs (1 mM)

1.5 5.0

124


甜菜碱(5 M)

3.75

DMSO (10%) Platinum Taq (5 单位/μl) DNA 模板(100 ng/μl) 水

1.25 0.1 1.0 12.9

C) 凝胶电泳条件 将反应液混合物 2 的 PCR 产物在 2%(Nusieve:琼脂糖=1:1)凝胶中电泳 2 小时,在下一个泳 道电泳反应液混合物 1 的 PCR 产物。结果解释见表 5.15。 D) 产物大小 PCR 片段大小(bp)

基因型

引物的产物

2100

正常(αα)

1+2

2100 1900

ααα:(反式 3.7)

1+2 1+2

α+-地贫:-α3.7

表 5.15

ααα(反式 3.7)等位基因反应混合液 1 和 2 的诊断结果解释

A) 产物(bp) 基因型

引物:C2+C10

引物:C3+C10

αα/αα -α3.7/ αα

2100 2100 + 1900

1900 1900

-ɑ3.7 /-ɑ3.7 3.7 ααα/-α ααα/αα 或 ααα/ααα

1900 2100 + 1900 2100

2100 + 1900 2100 + 1900

注意: αα 等位基因:用 C3+C10 (1.9kb)和 C2+C10 (2.1kb)扩增。-α3.7 等位基因:仅用 C2+C10 扩增。由于 α 基因缺失,得到的产物比正常为短(1.9kb)。ααα 等位基因:由于额外的 α-基因 的存在用 C3+C10 (1.9kb)和两倍 C2+C10 (2.1kb)扩增。 B) 可能的凝胶模式 α 基因型 αα/αα

-α3.7/ αα

-α3.7 /-α3.7

ααα/αα 或

ααα/-α3.7

ααα/ααα 引物对 C2+C10

C3+C10

C2+C10

C3+C10

C2+C10

C3+C10

C2+C10

C3+C10

C2+C10

C3+C10

2.1kb

1.9kb

带模式 —

— —

125


方法 1. 建立终体积为 22 μl 的反应混合液加入 0.5 ml 试管中,需以下成份:1 μl 基因 组 DNA(100 ng/μl),1 μl 正向引物-侧翼序列(10 pmol/μl),1 μl 反向引物侧翼序列(10 pmol/μl),1 μl 引物-缺失序列(10 pmol/μl),1 μl 引物-插入序 列(10 pmol/μl),2.5 μl 1.25 mM (dNTP 混合物),在原参考文献(见表 5.2) 和下面为这些引物所推荐的 2.3 μl 10×缺口 PCR 缓冲液。 2. α-地贫引物推荐缓冲液:750 mM Tris-HCl,pH8.8,200 mM(NH4 )2 SO4 ,0.1% 吐温 20。α-地贫引物缓冲液也可包含 0.5 M 二甲铵乙内酯和 0.5%二甲基亚砜 (加 2.5 μl 5 M 二甲铵乙内酯和 1.25% μl 10%二甲基亚砜即可完成)。 3. 所有反应均用灭菌蒸馏水定溶为 22 μl。 4. 覆盖 25 μl 石蜡油。 5. 制备酶混合液:0.2 μl 反应缓冲液(10×),0.1 μl 扩增 Taq(5U/μl) (PE 生物

系统)用于 β-基因引物,0.1 μl Platiaun Taq(5U/μl)(Invitrogen)用于 β-基 因引物,用 2.7 μl 灭菌蒸馏水定溶为 3 μl。 6. 混匀酶混合液并放在冰上。 7. 将反应混合液放到热循环仪上,在 94℃2 分钟的变性步骤之后加 3 μl 酶混合 液,按下述程序运行一个循环:94℃4 分钟 / 55-65℃ 1 分钟(参照推荐部分) /72℃ 1.5 分钟。 8. 按下列程序继续进行 33 个循环:94℃ 1 分钟 / 55-65℃ 1 分钟(参照已发表

的参考文献或表 5. 10~5.14 中所推荐的方法)/ 72℃ 1.5 分钟。 9. 以下面一个循环结束运行:94℃ 1 分钟 / 55-56℃(参照所推荐的方法)1 分 钟 / 72℃ 10 分钟。 10. 置于 15℃直到进行凝胶电泳。 11. 从热循环仪中取出试管,加入 5 μl 蓝色染料,混匀并离心。 12. 根据预测的片段大小,等量装载 20 μl 到 1-3%琼脂凝胶上,在 1×Tris-硼酸 -EDTA 缓冲液(TBE)中 100V 下运行 45 分钟至 2 小时。 13. 在溴化乙锭溶液(0.5 μg/ml)中染凝胶 15~30 分钟。在紫外光箱中(312 nm) 显带并用电子摄像系统或带橙色滤光片(如 Wratten 22A)的宝丽莱相机拍照。 结果解释指导见注解 6、7 和 8。

126


5.3.6 方法评价 各种已知突变分析方法的优、缺点小结如下: 优点

缺点

1) ASO 点印迹杂交

ASO 点印迹杂交

·适用范围广和可靠

·传统步骤使用放免标记探针 ·耗时、一次只能筛查一种突变 ·昂贵

2) 反向点杂交(RDB)

反向点杂交(RDB)

·同时筛查多种突变

·需要质控样品标准化新突变

·通常无放射性

·建立和完善 RDB 需要良好的实验室技术

·相对廉价 ·简便、快速和可靠

经验 ·试剂盒不一定可靠(一些实验室的经验

已证实不同批次试剂盒有差异)

3) ARMS-PCR

ARMS-PCR

·简便、快速和廉价

·需要质控 DNA 以确认试验,纯合子状

·适于技术改良 ·可多重检测突变

4) 缺口-PCR

态的一些罕见突变不能得到 ·引物易降解,出现非特异性信号

缺口-PCR

·简便、快速和廉价

·需要质控 DNA 确认试验

·可多重检测突变

·局限于对已知 DNA 断裂点序列的缺失 的诊断 ·α-基因区域扩增存在技术难度 ·存在等位基因脱扣的可能,产前诊断 时需要谨慎,尤其对 α-地贫纯合子

5) 限制性酶(RE)-PCR

限制性酶(RE)-PCR

127


·简便和快速

·并非对所有突变都有效

·可靠

·需谨慎以避免消化不全的问题 ·―高频剪切酶‖用处不大 ·一些酶价格昂贵 (―高频剪切酶‖:识别位点为四碱基的内切酶)

5.4 未知突变的诊断 5.4.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 原理 变性梯度凝胶电泳或 DGGE,最初由 Myers 等在 1987 年[42]报道,该法能够 分离并检测只存在一个单核苷酸差异的 DNA 分子。电泳分离以双链 DNA 分子 的解链特性为基础,在增高温度的条件下或在某些化学制品(称为变性剂)的影 响下,DNA 的两条互补链分离(解链)。一个 DNA 分子周围温度的增高和/或化 学变性剂浓度的增高将引起 DNA 沿着称为解链域的分离带或区域解链,解链域 的长度在 25 至数百个碱基(bp)之间变化,每个碱基都在一个称为 Tm 的特定 温度下同时解链。一个解链域的 Tm 与其核苷酸序列密切相关,即使一个单碱基 替换就足以改变一个解链域的 Tm。 DGGE 涉及通过增高化学变性剂浓度(与温度相反,这实际上更难控制)的 一个线性梯度(从顶端至底部)的双链 DNA 分子(高至 400-500bp 均能有效分

析)的垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳。当一个 DNA 片段进入使其解链域在最低温度 开始变性的变性浓度时,域―开放‖形成了带有支链结构的 DNA 分子,这种支链 DNA 在凝胶矩阵中有极大迟缓的迁移率。如果 DNA 样品在其有别于正常序列的 域内含有点突变,则域的 Tm 值将不同,DNA 分子将在一个轻微不同的 Tm 值 下解链,与质控 DNA 相比,这种 DNA 分子在凝胶中的迁移率将发生变化。 DGGE 可用于检测除 DNA 片段的最高温度解链域外所有的单碱基改变。为了促进沿着 受检 DNA 片段的全长进行突变检测,在 PCR 反应过程中可将富含 GC 部分附在 DNA 片段的一个末端上(在其中一条引物 5′ 末端额外加上富含 GC 的序列),这 种富含 GC 的片段,或 GC-夹(通常长 30~60bp)有很高的 Tm,相比之下其余 的 DNA 片段则有单一和较低的 Tm 值[43], 如图 5.12 所示。

128


A

B

图 5.12 A.

解链图例

无 GC 夹(i)和有 GC 夹(ii)的片段 B;

B. 无 GC 夹(i)和有 GC 夹(ii)的片段 F。 在 PCR 方法发明之前,供 DGGE 分析的 DNA 片段由克隆来产生。现在有 了适当的 PCR 引物,产生任何感兴趣的基因片段都是可能的。如果一个 DNA 样 品是点突变的杂合子,PCR 反应将产生一种双链分子的混合物,在 DGGE 凝胶 运作后可观察到多达 4 条带,包括源于野生和突变序列而生成的同源双链,另外 还有两种类型的异源双链 DNA 分子(以更慢的速率迁移),这种异源双链 DNA 分子表示杂交错配的野生和突变 DNA 链,它们在 PCR 反应过程中通过 DNA 链 重新组合形成。如果样品是正常(野生)序列或突变的纯合子,则将只有同源双 链(图 5.13)。

129


图 5.13 A.

DGGE 原理

具有高解链域 A 和低解链域 B 的 DNA 片段,两种 PCR 产物电泳结果,两者之间 的区别仅在于域内一个单核苷酸发生替换。

B.

通过在从顶部到底部不断增加的化学变性剂浓度的凝胶电泳,可使 DNA 分子“熔 解打开”,不同的变性剂浓度有所不同,使 DNA 链有着不同的电泳迁移率。

C.

在 DGGE 之后,理论上可预见的的带纹举例:在域中受评估的样品包括野生型纯 合子(WT)、野生和突变等位基因的杂合子(Het)或突变等位基因纯合子(Mut)。

为了选择 DGGE 分析中用于扩增 DNA 一段区域的引物的理想位置和估计所 需的化学变性剂的范围,了解所研究片段解链情况的前期知识是很有用的。这可 应用 Lerman 和 Silverstein 在 1987 年[44]研发的计算机算法(Melt’87 版)来完成。 对 DNA 片段最合适的化学梯度以最低(更为重要)域的 Tm±10℃计算,由此得 出 1℃等于 3%的变性剂(参见“计算”)。 如果不能应用上述方法,化学梯度可通过在与电泳方向垂直梯度的凝胶上正

130


在电泳的 DNA 片段凭经验来分析(图 5.14)。

图 5.14 A. 垂直 DGGE 凝胶制备,顶部的间隔器成为一个可沿着凝胶的总宽度装载样品的长形槽。 B. 电泳后拉出溴化乙锭染色的垂直凝胶,由于具有较低 Tm 值的域的共同解链使凝胶中部 的迁移率急剧降低。当为凝胶拍照时,在凝胶的顶部或底部放一把尺子,这样可测定迁 移率转变中点(印迹线)的相对位置,从左至右的转变距离片段与域解链的变性剂百分 比相符。在本例子中,6/16 或 0.375 是总距离的片段,即 0.375×80%=30%,这样,具有 15~45%左右范围的平行变性凝胶就是这一片段分析的理想条件。(改编自 Myers RM , Hedrick Ellenson L ,Hayashi K, 基因组分析,实验室手册第 2 卷 Birren B ,Green ED, Klaholz S,Myers RM , Roskans J,Cold Spring Harbor 实验室印刷,1998)

制备和运作 DGGE 凝胶所需的许多设备都十分专业化,小容量的梯度接合 器需在凝胶上增加垂直化学梯度(图 5.15)。

131


图 5.15 A. 制备 DGGE 凝胶。 B. 凝胶电泳盒,凝胶装在该盒中电泳(改编自 Myers RM ,Hedrick Ellenson L,Hayashi K,

基因组分析,实验室手册第 2 卷,Birren B ,Green ED,Klaholz S,Myers RM , Roskans J 再版,Cold Spring Harbor 实验室印刷,1998)。

而且凝胶必须在高温(通常 60℃)下电泳 12 小时以上,这需要能加热电泳 环境(缓冲液)的设备来维持稳定的温度和在电泳期间在阴极通过再循环补充缓 冲液。因此,电泳必须在一个足以放置凝胶和加热器并带有外置泵以循环缓冲液 的槽内进行(图 5.16)。商品化的 DGGE 系统较少,目前最广泛的是 Bio-Rad 公 司的 D-基因系统。

图 5.16 电泳槽和电泳所需的其他设备(改编自 Myers RM ,Hedrick Ellenson L ,Hayashi K,

基因组分析,实验室手册第 2 卷,Birren B ,Green ED,Klaholz S,Myers RM , Roskans J

132


再版,Cold Spring Harbor 实验室印刷,1998)。

必须注意 DGGE 不是一种直接定性点突变的方法,但是,对于以下情况该 法极其有用: a) 为了定位潜在突变,同时排除没有突变的区域而筛查基因区域(可多至数百

个碱基对)。 b) 由于大多数核苷酸的改变均有独特的 DGGE 条带图谱,因此,对于这些发生 于靶基因区域内的已知突变可直接用直接突变试验,例如 ARMS 或 RE-PCR。 c) 在产前诊断样品、父母突变的阳性和阴性质控中研究基因型状态。

贯穿大部分珠蛋白基因全长来进行突变检测的步骤已有介绍[45~48]。,这里我 们着重介绍适合 β-珠蛋白基因检测的步骤。

β-珠蛋白基因 DGGE 分析的步骤 DGGE 分析的步骤包括: 1. 被检片段进行 PCR 扩增 2. 凝胶制备 3. 凝胶电泳 4. 凝胶染色和成像观察 每一步骤的具体细节根据实验室拥有的设备不同而有少许差异,这里描述的 是固定的准则。

β-珠蛋白基因区域的 PCR 扩增 本手册中的 PCR 方法以 Losekoot 等 1990 年[45]和 Kleiman 等 1994 年[49]的描 述为基础,适合下面提及的全球范围内大部分常见的 β-地贫点突变的检测。 β-珠蛋白基因分为 8 种不同的片段(命名为 A~H),它跨越了全部编码区和 基因的 5′端与 3′端侧翼区域(图 5.17)。用于扩增每一片段的引物的理想位置及 GC-夹的长度和位置可应用计算机算法[44]通过预测各片段的解链图谱而获得,见

图 5.12 所描述的例子。为了最大限度的降低非特异性 PCR 产物[50],一些 PCR

133


引 物 的序 列 已通 过应 用 扩增 2.0 版 计 算机 软件 进 行了 改 良( Bill Engels , 1992~1995,免费软件,美国)。A~H 片段的扩增引物序列列于表 5.16,这些片 段在所研究的人群中对突变频率以最合适的顺序进行筛查,片段 E 是一段不包 括许多常见突变的区域,但它包括预示 β-珠蛋白基因框架的 5 个多态性位点中的 3 个位点(图 5.18) ,适当的时候对于连锁分析有潜在的用途[51],例子见图 5.19。

图 5.17 显示 DGGE 可扩增的 β-珠蛋白基因区域,黑框代表外显子,白框代表内含子。

图 5.18 具有框架多态性的位置和碱基替换的 β-珠蛋白基因,尤其通过片段 E 分析检测得到 的多态性位点,黑框代表外显子,白框代表内含子。

图 5.19 EB 染色和紫外线观察的 DGGE 凝胶照片。片段 B 的分析结果,泳道 1、4、6、8: 无突变; 泳道 2:IVS I-6(T→C)纯合子; 泳道 3、13: IVS I-6 (T→C)杂合子; 泳

134


道 5、9:IVS I-110(G→A)杂合子;泳道 7 、11: IVS I-5(G→A)杂合子; 泳道 10: Cd 39(C→ T)杂合子; 泳道 12: IVS I-1(G→A)杂合子。

表 5.16

对 8 种不同片段(A~H,见图 5.17)进行 β-珠蛋白基因扩增片段 DGGE 分析的引

物序列 寡核苷酸命名

序列(5’到 3’)

GC-类

1 2-GC 3 3-GC

TGAAGTCCAACTCCT AAGCCA GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA CAACTTCATCCACGTTCACC CAACTTCATCCACGTTCACC

a-3

GGTGAACGTGGATGAAGTT

4 5-GC* a-5-GC 6

ACCTTGAT ACCAACCTGCC TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT AGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCA AAACGATCCTGAGACTTCCA

7 8

GTGTACACAT ATTGACCAAA AGCACACAGACCAGCACGTT

a-8 9

AACGTGCTGGTCTGTGTGCT ATTCTGAGTCCAAGCT AGGC

无 无

10-GC

CTTAGGGAACAAAGGAACCTT

11 GC-45

AAATGCATGACCTCCCACA CGCCCGCCCCGCCCCCGTGCCCCCCGC

GC-45* 无

GC-57

GCCGCCCGCCCCGCCCCC CCCGCCCCGCCCGCCCCCGCCCCGCCC

GC-45* 无 GC-45* 无 GC-45* * GC-45 无 无

GCCGCGCCCCCCGTGCCCCCGCCCCGCCCG *

GC= 5′端具有 GC-夹的引物

a=反式或互补序列

PCR 试剂 每种 β-珠蛋白基因片段进行 PCR,使用 50 μl 反应体系,将下列成份加入置 于冰上的 eppendorf 管中: a) 0.5 μg 基因组 DNA b) 每种引物 15-20 pmol(相应的片段正向和反向引物) c) 用蒸馏水加至 50 μl 终体积 d) 5 μl 10×反应缓冲液(通常由供应商随 Taq 聚合酶提供,包含 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl、pH8.0,25 mM MgCl2 ,2 mg/ml BSA) e) 2 mM dNTP’s

135


f)

1 单位 Taq 聚合酶

g) 用 50 μl 石蜡油覆盖

PCR 条件 下列循环条件适合于在大部分 PCR 仪器上对所有片段进行扩增,但需要进 行一些细微的调整以优化 PCR 反应: a) 95℃变性 60 秒 b) 58~60℃退火 60 秒(不同的 PCR 仪可能有所不同) c) 72℃延伸 90 秒,重复 35~40 个循环。 PCR 反应之后,取 5 μl 在 1.5%琼脂凝胶上进行电泳以检查 PCR 效率和特异 性,片段 A~H 的预期大小列于表 5.17 中。将 10 μl PCR 产物与 5 μl 装载染料混 合以制备装载于 DGGE 凝胶的样品。 表 5.17 片段 A~H DGGE 凝胶电泳条件

*

片段

扩增引物

PCR 产物大小(bp)

梯度

聚丙酰胺(%)

A

2-GC 和 3

252

45-75

6

B C D E

a-3 和 5-GC 7和8 a-8 和 11 a-5-GC 和 6

370 423 317 194

40-70 25-55 25-55 35-55

6 6 6 6

F

1 和 3-GC

295

45-75

6

G H

9 和 10-GC 2-GC 和 4

243 285

40-70 40-70

6 6

该大小不包括 GC 夹的长度

DGGE 的基本设备 a) 两块 18×20 cm 左右的玻璃板,一块―有把手‖,另一块普通的即可 b) 隔离器和 1 mm 厚的梳子 c) 在凝胶制备期间固定玻璃板的 DGGE 架 d) 梯度接合器,用于小容量(最多约 25 ml/室)和合适的试管 e) 磁力搅拌器和与梯度混合器室相匹配的小磁铁 f)

胶带

g) 带电极的 DGGE 托(凝胶电泳槽) h) 带盖子透明槽(以避免电泳过程中缓冲液过度蒸发)

136


i)

具有恒温和循环能力的加热元件

j)

在电泳期间监控温度的温度计

k) 电源 l)

在样品装载前冲洗槽壁的注射器和针

m) 样品装载使用的精细端口(鸭嘴形)吸头 n) 染色盘 o) 紫外分析仪,波长 256 nm p) 相机

DGGE 试剂 a) 40% 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺:二聚丙烯酰胺 37.5:1

100 g

加至 250 ml

b) 20×TAE,pH8.0 Tris-HCl

800 mM

96.912 g

Na2 EDTA

20 mM

7.445 g

乙酸钠

400 mM

54.432 g (约 36 ml)

用乙酸调 pH c) 80% 变性剂 / 6% 聚丙烯酰胺 40%的 6% 聚丙烯酰胺贮备液

75 ml

32%甲酰胺 100%贮备液

160 ml

5.6 M 尿素

170 g

1×TAE:20×TAE 贮备液

25 ml

加至 500 ml

d) 0% 变性剂 / 6% 聚丙烯酰胺 40%的 6% 聚丙烯酰胺贮备液

75 ml

1×TAE:20×TAE 贮备液

25ml

加至 500ml

e) 80% 变性剂 / 8% 聚丙烯酰胺

137


40%的 8% 聚丙烯酰胺贮备液

100 ml

32% 甲酰胺 100%贮备液

160ml

5.6 M 尿素

170g

1×TAE:20×TAE 贮备液

25ml

加至 500ml

f) 10% Ammonium peroxydedipersulphate 每 50 ml 水 5 g 1 ml 分装贮存于-20℃,使用后剩余的丢弃。 g) TEMED:N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 贮存于 4℃ h) 装载缓冲液 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯苯胺 FF 15% 菲柯尔-甲泛影钠制剂(6.1%~18.6%) i) 溴化乙锭 10 mg/ml(贮存于深色瓶内)

DGGE 凝胶制备 1. 依次用强去污剂、水、丙酮或乙醇彻底清洁玻璃板,彻底凉干。 2. 将间隔器放在板和带子之间的四周和底部,密封以防止泄漏(见图 5.15)。 3. 将梳子放在玻璃板之间,然后将该构造置于能在垂直位置使板稳定的托上。 注意:玻璃板合适的大小约为 18×20 cm,带有间隔器和 1 mm 厚的梳子。所 需凝胶的体积约为 32 ml。 4. 使用开关或夹子将试管接到干净和干燥的梯度接合器上,关闭 2 个舱之间的 连接通道和从梯度接合器引向玻璃板的试管。从梯度接合器引向玻璃板的试 管长度约为 25~26 cm。 5. 磁力搅拌器的位置大约在玻璃板上 25 cm 左右,将梯度接合器放在顶部,固 定好。 6. 分别在两只单独的试管中制备两种变性液(代表适合片段的高与低范围),每 只 16 ml*,加入 10 μl TEMED 和 130 μl 新鲜 Ammonium peroxydedipersulphat

138


(10%APS),充分混匀。 *因玻璃板的大小约为 18×20 cm,并具有深 1 mm 的间隔器,所以要得到 0% 和 80%聚丙烯酰胺的相对容积的更高和更低限度的范围应按下列公式计算: (0%变性剂/80%变性剂)×容积 例如,70%变性液计算为 70/80×16,即 14 ml 80%溶液+2 ml 0%溶液。为了 梯度尽可能精确,聚丙烯酰胺的体积应是两个板之间的容积加上 1-2 cm 空 间以作为轻微漏出量的补偿。 7. 马上将最低变性剂浓度的溶液放到距离玻璃板最远的梯度接合器的舱中(图 5.15 A 舱),使尽可能少的溶液流过连接管以避免空气阻塞,然后将带有最高 变性剂浓度的溶液放到离玻璃板最近的舱中(图 5.15 B 舱)。 8. 在舱中放磁铁,转动顶部搅拌器并打开舱之间的连接管开始混合两种溶液。 立即打开管上通向玻璃板的连接,聚丙烯酰胺开始在重力的作用下平稳地流 动。 9. 当溶液到达梳子时(和轻微溢出),立即停止流动并移开试管。用自来水彻底 冲洗试管和梯度接合器。 10. 根据周围温度凝胶将在 30~45 分钟内聚合(气温越高,聚合越快)。

DGGE 凝胶电泳 1. 将电泳缓冲液填满电泳槽(1×TAE,根据设备要求约 15~20 升)。加热缓冲液 至 60℃(注意:电泳缓冲液可重复使用 5 次)。 2. 一旦凝胶开始聚合,小心移开梳子并清除多余的聚丙烯酰胺,小心不要损坏 孔。从玻璃板底部移开带子。 3. 将凝胶放在凝胶电泳暗盒中(图 5.15 B)和淹没于槽中的缓冲液内(图 5.16)。 接上电泳电缆(阴极在顶部),凝胶在 40 伏(约 40 mA)预运行约 30 分钟。 4. 用注射器冲洗孔, 使用末端尖细或鸭嘴型吸头加样,每份含有染料的样品加 样 10~15 μl。 5. 在 40~50 伏凝胶电泳约 16 小时(过夜),当溴酚蓝染料完全跑出凝胶时可准 备成像观察。

139


DGGE 凝胶染色和成像观察 1. 电泳后,关闭电源从槽和托上移出凝胶。 2. 拆开玻璃板边缘的密封带,轻缓移去其中一片玻璃板,将凝胶留在另一片玻 璃板上。 3. 将凝胶(位于玻璃板上)放在一个盛有约 250 ml 含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 1×TAE(或水)的容器中染色约 15 分钟(注意:容器应加盖使凝胶避光)。 4. 将凝胶放在水中脱色 5 分钟。 5. 将凝胶放入紫外分析仪内,小心将凝胶从玻璃板上滑下,凝胶不能折叠或裂 开。 6. 在紫外光下(256 nm 波长)检测凝胶并拍照。

故障查寻和预防 DGGE 是一种技术性要求高的方法,必须注意下列几点: 所有使用的化学品尤其是凝胶的成份(聚丙烯酰胺、甲酰胺和尿素)均应是 质量最好的并尽可能新鲜。聚丙烯酰胺溶液不太稳定,因此建议使用聚丙烯酰胺 粉末,在使用前用该粉末配制成的溶液不能放太久。 DGGE 中使用的很多化学品都有高毒性(例如聚丙烯酰胺、甲酰胺),应该 十分谨慎地处理。 DGGE 图谱的解释应与质控样本认真比对,因为任何核苷酸的改变包括多态 性都可能检出。必须注意,DGGE 并非一种直接定性点突变的方法,任何检出的 突变都应该用另一种直接突变分析来验证。

温度转换为变性剂浓度的计算和 DGGE 梯度范围的计算 1.

100% 变性剂= 7 M 尿素+40% 甲酰胺 (80%变性剂贮备液和 0%变性剂适合于制备大部分梯度范围,见表 5.17)。

2.

梯度范围应按照主要解链域的 Tm ± 10℃来计算。

3.

1℃等于 3%变性剂。 所以当凝胶在 60℃电泳时,变性剂浓度%计算为 3×(Tm - 60℃) 例如,对于主要的 (最低)解链域为 72℃的片段,梯度范围应该是 62℃~82℃。

140


62℃=3×(62 - 60)=6% 82℃=3×(82 - 60)=66%

5.4.2

DNA 测序

Sanger 或 dideoxy 方法的原理 DNA 测序可分析所研究的基因或基因区域的准确核苷酸序列。应用最普遍 的是根据 Sanger 等 1977 年首次介绍的方法[52]。该法依赖于从 DNA 模板(通常

用现行 PCR 法扩增而得)复制形成的 DNA 链的体外合成,在此期间每条新生 DNA 链的合成在双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的随机结合后沿着链被终止于 每一种残基上。ddNTP’s 可通过 DNA 聚合酶结合到正在生成的链中,但在 3′端 羟基残基的缺乏阻止 DNA 链的延伸。 基本的反应包括模板 DNA(单链的),其新合成的序列链将是一段互补的拷 贝;一条约长 20bp 的合成寡核苷酸或―引物‖,其与需要测序的靶区域附近的模 板 DNA 的一小段区域互补;一种专门的 DNA 聚合酶(T7 或耐热 DNA 聚合酶) 和游离的核苷酸,其中大部分为脱氧三磷酸核苷酸(dNTP’s),小部分为双脱氧 三磷酸核苷酸(ddNTP’s)。 Sanger 的方法有些变化,差异在于与链合成和/或用于检测新合成 DNA 链的 检测系统引入的 DNA 聚合酶有关。对所谓的手工测序法而言,测序反应产物通 常是放射性标记并用垂直聚丙烯酰胺凝胶所分离,然后再曝光产生放射自显影图 像供手工读取(图 5.20)。 对 Sanger 方法的最新改良包括循环测序(利用热稳定 DNA 聚合酶)和使用 自动测序仪[53]检测荧光标记的新合成 DNA。在循环反应之后,根据产物大小在 聚丙烯胺凝胶(或毛细管)上进行分离,这可通过激光检测荧光标记的新合成链 来进行监测。标记新合成链的荧光染料化学品主要有两种:包括荧光引物或荧光 dNTP’s。 本章所介绍的两种普通测序方法的基本步骤概括如下: 1. 使用单链 DNA 模板、T7 聚合酶和放射性标记的手工测序。 2. 应用荧光标记和自动测序仪分析的循环测序。

141


通过不对称 PCR 制备单链 DNA 模板( 手工测序): 该法包括一个首次扩增以产生双链 DNA。一个总量 50 μl 的反应,需加入下 面的成份到置于冰上的 eppendorf 管内: a) 0.1~0.5 μg 基因组 DNA b) 每种引物 20 pmol(相应片段的正向和反向引物) c) 加水至 50 μl 终体积 d) 5 μl 10×反应缓冲液(通常由生产商随 Taq 聚合酶提供,包含 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl,pH8.0,25 mM MgCl2 ,2 mg/ml BSA) e) 2 mM dNTP’s f)

1 单位 Taq 聚合酶

g) 用 50ul 石蜡油覆盖

PCR 方法(手工测序): 1.

30 个循环:95℃变性 60 秒,在适合引物对 Tm 值的温度下退火 60 秒,72℃ 延伸 90 秒。

2.

用第一次 PCR 的反应产物 2 μl 和两对引物中的一条在 100 μl 反应体积中进 行第 2 次 PCR 反应。

3.

第 2 次 PCR 之后,产物纯化,去除多余的 dNTP’s 等。

4.

加 1 倍体积的氯仿,混匀并在微量离心机中以 10000 rpm 离心 5 分钟。

5.

将上清移到一个干净的 eppendorf 管中,加入 100 μl 5 M 乙酸铵和 200 μl 异 丙醇。

6.

静置 10 分钟,然后以 10000 rpm 离心 10 分钟。

7.

丢弃上清,用 70% 乙醇洗 DNA 小团并干燥。将单链 DNA 小团溶于 15 μl 蒸馏水中。

8.

在 TBE 液中 1% 琼脂凝胶电泳检查 3~5 μl 扩增产物,用溴化乙锭染色并在 紫外光下观察(单链 DNA 产物通常较等量的双链 DNA 产物迁移得慢一些)。

测序反应方法( 手工测序): 可使用许多市售试剂盒中任意一种,只要能提供反应缓冲液、标记混合液(包

142


括 dNTP’s)、终止混合液(包括 ddNTP’s),T7 DNA 聚合酶和酶稀释缓冲液。使 用者必须自行购买放射性标记 dNTP(通常为[a-35-S]-dATP 或[a-35-S]-dCTP)。 1. 取 10 μl 单链 DNA 产物,加 2 μl 测序引物。 2. 在 37℃孵育 10-20 分钟,然后在室温下进一步静置 10-20 分钟以确保引物模板退火。 3. 加 3 μl 标记混合液、1 μl 放射性 dNTP(10 μCi)和 2 μl T7 聚合酶(通常在使用

前用酶稀释缓冲液稀释)到退火的引物-模板混合液中。 4. 轻缓混合并在 37℃静置 5 分钟。 5. 在此期间标记 4 个 eppendorf 管(分别为 A、C、G、T),加 2 μl 合适的 ddNTP 终止混合液到每管中并置于 37℃保温数分钟。 6. 把 4.5μl 充分标记的反应液分配到 4 种 ddNTP 终止混合液的每个管中,进一 步孵育 5 分钟。 7. 加 5 μl 终止液并将管放到冰上。 8. 在装载前,立即加热样品到 80℃ 2 分钟,再放回冰上。

变性聚丙烯酰胺凝胶的制备、电泳和放射自显影(手工测序): 市售电泳设备有很多种类,玻璃板和间隔器的排列可能有所不同。标准的测 序凝胶通常长约 40 cm,带间隔器,梳子厚 0.4 mm。所有测序电泳设备都包括一 个可加热的―板‖以在电泳期间加温凝胶的表面。 凝胶中聚丙烯酰胺的浓度取决于被分析的 DNA 片段的大小。来自引物的 20~250 个核苷酸序列可通过 40 cm 长的凝胶和单个上样的 6%聚丙烯酰胺读取。

试剂(手工测序 ): 含有 6%或 8%聚丙烯酰胺的溶液可按下列成分配制: a)6% 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺

17.1 g

二聚丙烯酰胺

0.9 g

尿素

150 g

10×TBE*

30 ml

143


蒸馏水加至

300 ml

b)8% 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺

22.8 g

二聚丙烯酰胺

1.2 g

尿素

150 g

10×TBE*

30 ml

蒸馏水加至

300 ml

(* 10×TBE:0.89 M Tris,0.89 M 硼酸,0.02 M EDTA) 这些溶液在 4℃可稳定保存数月。

聚丙烯酰胺电泳方法(手工测序): 1. 测序凝胶应在上样前至少 2 小时配制。 2. 长 40 cm、宽 20 cm、厚 0.4 mm 的板约需要 40 ml 凝胶,制作如下:40 ml 6% 或 7%的聚丙烯酰胺/8 M 尿素、300 μl 10%磷酸铵和 30 μl TEMED,该混合液 在 1 小时之内聚合。 3. 一旦聚合,从顶部移开孔成形器,清除多余的聚丙烯酰胺,然后将凝胶放到 电泳槽里。用 1×TBE 缓冲液充满槽的上下,凝胶预电泳约 30~60 分钟,使温 度达到 50℃左右。 4. 放一把鲨鱼齿梳在凝胶顶部,做出加样孔并从每种样品加载每种 dNTP 2~3 μl 到每个泳道上(即一个样品 4 个泳道,A、C、G 和 T 各一泳道)。 5. 在 1500~2000 伏电泳 2~3 小时,根据被分析引物的距离而定。 6. 电泳之后,关闭电源,移出其中一块玻璃板,放一张 Whatman 纸(35×42 cm) 粘在整片凝胶的表面,小心勿形成气泡和不要弄裂凝胶。 7. 用 Saran-包膜(或同类产品)小心盖住凝胶的四边,有纸的一面朝下放在凝 胶干燥仪上,在真空下 80℃干燥 90 分钟。 8. 将包膜从凝胶上移开,在暗室内放一片 35×42 cm X-射线胶片(柯达 XAR-2

或同类产品)并放到 X-射线暗盒内。过夜进行放射自显影并根据大小读取核 苷酸序列(图 5.20)。

144


循环测序 由于自动测序仪的方法细节取决于所使用的特殊系统,这里对普通的方法作 一概述。对于模板制备和测序等大部分准备步骤均可由商品化的各种试剂盒所提 供。一些仪器仅能检测一种荧光标记,另一些仪器可检测多种荧光标记。自动化 的水平与凝胶(或毛细管)制备有关,样品加样在不同仪器之间有较大不同。此 外,每种系统将有自身的特殊软件以控制电泳条件和分析数据。模板的质量和测 序反应的精确性对于得到良好的碱基测序数据极其重要。

双链 DNA 模板制备和采用商品化柱进行纯化(循环测序) 需 50 μl PCR 反应产生双链 DNA,加入下列成份到置于冰上的 eppendof 管中: a) 0.1~0.5 μg 基因组 DNA b) 每一种引物 20 pmol(相应片段的正向和反向引物) c) 蒸馏水定溶至 50 μl d) 5 μl 10×反应缓冲液(通常由供应商随 Taq 聚合酶提供,包含 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl,pH8.0,25 mM MgCl2 ,2 mg/ml BSA) e) 2 mM dNTP’s f)

1 单位 Taq 聚合酶

g) 用 50 μl 石蜡油覆盖 h) 进行 30 个循环:95℃变性 60 秒,用引物对 Tm 适合的温度退火 60 秒,72℃ 延伸 90 秒 i)

扩增反应之后,分装 5 μl 置于 1×TBE 的 1%琼脂凝胶中进行检查,然后用市 售的 PCR 产物纯化试剂盒(如 Qiagen)来进行纯化。

PCR 反应(循环测序) 市面上有一些商品化循环测序试剂盒,大部分供应商会根据所用自动测序仪 推荐最适合的那种(或那些)试剂盒。此外有两种主要的荧光染料化学品用于标 记新合成的 DNA 链,包括荧光引物或荧光 dNTP’s。 实质上循环测序是一个 PCR 反应,它包括制备模板-引物混合液,然后把混 合液分装至 4 个含有 dNTP’s、极少量的 ddATP 或 ddCTP 或 ddGTP 或 ddTTP、

145


一种合适的缓冲液和一种耐热聚合酶的管中。

图 5.20 描述了手工测序的原理、随后的电泳和放射自显影。

图 5.20

手工测序反应的原理、随后的电泳和放射自显影

5.4.3 cDNA 测序 下面介绍的通过 cDNA 测序检测罕见和异常血红蛋白变异的方法是一种尚 未发表的方法,该方法基于由 Liu[54]等先前报道过的技术所改良。这里描述的技 术通过 5 个步骤的程序对异常血红蛋白的转录产物进行测序来鉴定新变异。首

146


先,从网织红细胞抽提 RNA,然后通过 RT-PCR 合成珠蛋白 cDNA。第三步,分 别使用特异的引物扩增 β-基因、α1-基因和 α2-基因的 cDNA。扩增产物通过琼脂 凝胶电泳定量后纯化以备测序之用。最后,通过循环测序法直接对 cDNA 产物 进行测序。本方法可以在单次测序进行中对每一个基因编码的整个区域进行点突 变的筛查。

RNA 的制备 应用 Chomczynski 等[55]的单步法从网织红细胞抽提总 RNA。离心全血以使 网织红细胞聚合,然后把其移出,用操作简便的市售试剂盒抽提 RNA,如生物 基因有限公司(英国 Poole)的 RNA STAT-50TM LS,当然任何用于 mRNA 制备 的试剂盒均可使用。 成功窍门:确保所有的塑料和溶液都不含 RNA 酶,使用不含 RNA 酶的滤头, 在抽提过程中经常更换手套。 1. 用 2 倍体积的网织红细胞盐溶液离心 10 ml 全血,然后从血黄层下面收集约 500 μl 网织红细胞放入一个高压灭菌的 1.5 ml eppendorf 管内,小心不要吸入 血黄层。 2. 加入 0.75 ml 的 RNA STAT-50T M(从生物基因有限公司订购,产品目录 # CS114,传真# 01202 660020)用旋涡混合器强力旋转至少 15 秒(-70℃长期

贮存)。 3. 加入 200 μl 氯仿并再旋转至少 15 秒。 4. 4℃全速离心(14000 rpm)15 分钟。 5. 吸出上清到一个新的 1.5 ml eppendorf 管中。 6. 加入 0.5 ml 异丙醇,充分旋转并在室温下放置 10 分钟。 7. 在 4℃以 14000 rpm 离心 10 分钟。 8. 吸出上清丢弃。 9. 加入 1 ml 75% 乙醇,涡旋并在 4℃14000 rpm 离心 5 分钟。 10. 用移液枪吸出上清,在 37℃干燥 15 分钟。 11. 加 20 μl 不含 RNA 酶/DNA 酶的蒸馏水(Promega)。 12. 贴标签并贮存于-70℃。

147


反转录 珠蛋白 mRNA 可通过反转录法转录成 cDNA。应用 Promega 公司的商品化 试剂盒——反转录系统,按生产商的说明书进行操作。 Promega 公司的试剂盒 (英国索斯安普敦、产品目录 # A3500)可进行 100 次反应。 1. 按下述配方配制反应混合液(20 μl): a) 25 mM MgCl2

4 μl

b) 10 mM dNTP’s

2 μl

c) 10× RT 缓冲液

2 μl

d) RNA 抑制剂

0.5 μl

e) AMV RT

0.8 μl

f)

1 μl

Oligo dT

g) 无核酸酶蒸馏水

7.7 μl

h) 模板 RNA

2 μl

2. 置于 42℃加热板 15 分钟

β-基因 cDNA 扩增 1. 反应混合液 A 和 B 的具体配制见如下: 混合液 A

混合液 B

(35 μl)

(5 μl)

a) 25 mM MgCl2

2 μl

b) 10×IV 缓冲液

3.5 μl

c) 5′端普通引物(#331)

1 μl

0.5 μl -

10 pmol/μl(正向) d) 3′端普通引物(#334)

2 ul

-

10 pmol/μl(反向) e) 扩增 Taq 聚合酶

-

0.2 μl

f) DMSO

5 μl

-

g) 25 mM dNTP’s

0.2 μl

-

h) 水

21.3 μl

4.3 μl

148


2. 加入 35 μl 混合液 A+10 μl 已反转录的 RNA 模板(cDNA) 3. 用矿物油覆盖 4. 按下列程序设置 PCR 仪: 1× 94℃ 3 分钟(热启动) 29× 94℃ 1 分钟,60℃ 1 分钟,72℃ 1 分钟 1× 72℃ 3 分钟 5. 热启动两分钟后,每只管加入 5 μl 混合液 B 6. 循环至程序结束 7. 从 50 μl产物中吸出 5 μl在 2%琼脂凝胶上电泳; β-珠蛋白 cDNA 产物为 584 bp 8. 用 Amicon 滤器过滤剩余的 45 μl 并贮存。

α1-基因 cDNA 扩增 使用与 β-基因 cDNA 扩增同样的方法,预期使用#390 5′α-公共引物(正向) 和#391 3′α1-特异引物(反向)。 1. 热启动反应 2 分钟,然后加 5μl 混合液 B 到每个管中。 2. 循环条件: 1× 94℃ 3 分钟 29× 94℃ 1 分钟,60℃ 1 分钟,72℃ 1 分钟 1× 72℃ 3 分钟 3. 取 5 μl 在 2%琼脂凝胶上电泳,产物大小为 541 bp。 4. 用 Amiconi 滤器过滤剩余的 45 μl 并贮存。

α2-基因 cDNA 扩增 使用与 β-基因 cDNA 扩增同样的方法,预期使用#390 5′α-公共引物(正向) 和#392 3′α2-特异引物(反向)。 1.

热启动反应 2 分钟,然后加 5 μl 混合液 B 到每个管中。

2.

循环条件 1× 94℃ 3 分钟 29× 94℃ 1 分钟,54℃ 1 分钟,72℃ 1 分钟

149


1× 72℃ 3 分钟 3.

取 5 μl 在 2%琼脂凝胶上电泳,产物大小为 554 bp。

4.

用 Amicon 滤器过滤剩余的 45 μl 并贮存。

引物序列 a) β-基因 cDNA 正向 #331 5′-ACA TTT GCT TCT GAC ACA ACT GTG-3′ b) β-基因 cDNA 反向 #334 5′-GCC CTT CAT AAT ATC CCC CAG TTT-3′ c) 5′α-cDNA 普通正向 #390 5′-CTG GTC CCC ACA GAC TCA GA-3′ d) 3′α1-cDNA 特异反向 #391 5′-ACG GGG GTA CGG GTG CAG GAA-3′ e) 3′α2-cDNA 特异反向 #392 5′-TTT ATT CAA AGA CCA GGA AG-3′ f)

3′α1-cDNA 反向测序 #392 5′-AGC CCC AGG GGG CAA GAA GCA T-3′

g) 3′α2- cDNA 反向测序 #394 5′-GCC GGT GCA AGG AGG GGA GGA G-3′

PCR 产物的纯化 在循环测序之前必须纯化已扩增的产物。例如使用 AMICON Microcon 滤过 设备。 1. 在管上贴标签并过滤。 2. 将滤器蓝色面向上放进管中,沿管壁推入。 3. 将 45 μl PCR 产物加入滤器中,不带矿物油,加 50 μl 蒸馏水在 5000 g 离心 3~4 分钟。 4. 加 100 μl 蒸馏水并以 500 g 再离心 3~4 分钟。 5. 再加 100 μl 蒸馏水并以 5000 g 再离心 3~4 分钟。

150


6. 给新管贴上标签,从原来的管上移开过滤设备并转动,使白色的一边朝上并 完全推入相应的已贴标签的新管中。 7. 加 15 μl 蒸馏水到滤器的白色面,5000 g 离心 3~4 分钟。 8. 再加 10 μl 蒸馏水,5000 g 再离心 3~4 分钟。 9. 2 μl ―已纯化‖的产物在 2%的凝胶上电泳, 4 μl(50 ng/μl)对照即 200 ng λHind III 和 φX174 DNA 标记以确定在循环测序反应中使用的量。 (λHind III 顶端带 = ~100 ng,φX174 中央带= ~ 22 ng)

循环测序 根据供应商的说明书稍作改良,可使用一个染料终止反应试剂盒在基因分析 仪上对 PCR 产物进行直接测序。在 α1-和 α2-基因序列分析中用 2 μl 5 M 强力变 性剂——甜菜碱取代水参与循环测序反应。 1. 每个样品单独反应需要正向和反向引物: β-基因测序使用#331(正向)和 #334(反向) α1-基因测序使用#390(正向)和 #393(反向) α2-基因测序使用#390(正向)和 #394(反向) 2. 根据下表建立反应混合液(每种样品): a)

cDNA 模板(最多 5 μl)

b)

引物(2 pmol/μl)(正向或反向,同一试管不能有两种) 1.5 μl

c)

2 M 甜菜碱(对于 α1-和 α2-基因)

1 μl

d)

大染料(Big dye)混合液

4 μl

e)

蒸馏水

加至 10 μl

15~45 ng

混匀、离心,用 10 μl 矿物油覆盖。 3. 按下列程序进行循环测序: [95℃ 30 秒,50℃15 秒,60℃ 4 分钟]×25,终止于 10℃。 4. 移出每种反应混合液,尽量不带矿物油,移到一只新的已贴标签的 0.5 ml eppendorf 管中。 5. 每管内加入 35 μl 蒸馏水,5 μl 3 M 乙酸钠和 150 μl 95% 乙醇。 6. 充分混匀在冰上放置 10 分钟(不能超时)。

151


7. 全速离心 25 分钟。 8. 吸去上清,每管内加入 50 μl 65%乙醇,强力旋转(20 秒)并全速离心 5 分 钟。 9. 用移液器小心吸去上清,剩余的在一块 55℃热板上干燥(去除乙醇)1 小时。

此时可在 DNA 测序仪上进行循环测序反应。如果样品不直接使用,可贮存 于冰箱直至需要之时。如果样品贮存在冰箱,建议样品取出后在后续步骤进行之 前放到 55℃的加热板上 20 分钟,这样是为了消除解冻时形成的凝集作用,这种 作用能影响反应。

5.4.4 方法评价 定性未知突变最常用方法的优、缺点列于下面: 优点 1.

缺点

DGGE

DGGE

·相对廉价

·当 DGGE 检测多态性和致病突变时

·适合大规模筛查

,结果的解释需要具备经验

·定性图谱归功于异源双链

·CG 富集区域难以研究

·预定的电脑软件使其更容易优化

·有时优化条件比较耗时 ·总的来说 DGGE 技术性要求高

2. 直接测序(自动化)

直接测序(自动化)

·使用自动化测序仪使操作更

·处理过程相对昂贵

快速和更简便

·PCR 产物需要纯化

·在有些系统中 ddNTP’s 可以 标记,不需使用修饰的引物 ·突变直接定性

152


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156


第六章 Southern 印迹分析 Southern 印迹是一种复杂、冗长且耗时的技术,该技术已被能检测大部分已 知常见缺失突变的基于 PCR 的方法所替代。然而,仍有少数 α-地贫、β-地贫和 δβ地贫缺失的缺失断裂点尚未标示出来,也没有直接能用的 PCR 检测技术。这些 情况只能通过 Southern 印迹分析来定性。这里所介绍的方法针对 α-地贫缺失突 变。该法也能用适合于 β-珠蛋白基因簇的基因探针进行 β-地贫及 δβ-地贫缺失分 析。

6.1 α-地贫诊断 所有常见 α- 地贫缺失突变加上 α- 基因等位基因三联体和四联体都能通过 Southern 印迹分析结合使用限制性酶消化和基因探针来进行常规诊断[1]。牛津大 学实验室为诊断所用的一系列特征性异常限制片段列于表 6.1。Bam HI 与 α-珠蛋 白基因探针消化杂交被用于鉴别 α-珠蛋白等位基因单倍体、二倍体、三联体和四 联体,同时也可诊断地中海人 α°-地贫缺失基因-(α)20.5 。Bam HI 与 δ-珠蛋白基因 探针消化杂交则可诊断-- SEA α°-地贫等位基因,同样地,BgI II 与 δ-珠蛋白基因探 针消化杂交可诊断--MED 等位基因。大多数 α-地贫等位基因的诊断需要根据两种 不同的酶消化和探针杂交结合来解释结果,通常一种为 Bam HI/α-探针印迹,一 种为 BgI Ⅱ/δ-探针印迹。这是由于几个等位基因具有相似大小的异常 BgIⅡ/δ 探 针片段,而一些则具有相似大小的正常基因片段。例如-α3.7 和 ααα 等位基因均产 生 16 kb BgIⅡ/δ 片段,-α4.2 、-- SEA 和-- BRIT 等位基因都产生相似大小的 7-8kb BgIⅡ/δ 片段,同时--- SEA 等位基因产生的片段可与一段 10.5kb 的正常片段混淆。 Bam HI 和 BgIⅡ联合消化可用于除--T HAI 和-- FIL 缺失外的所有常见 α-地贫缺失基 因的诊断。这两个等位基因可通过 Sst I 与一条位于 δ-珠蛋白基因下游的 DNA 探 针消化杂交(命名为 LO)来进行诊断。

157


表 6.1 α-珠蛋白基因和 α-地贫缺失的正常和异常(有下划线)限制性片段大小 限制性酶 / 基因探针

等位基因 Bam HI/α αα

BgI II/α

Bam HI/δ

BgI II/δ

12.6

10-11.3

12.6 或 5.2

7.4

5.9

10-11.3

12.6

10-11.3

12.6 或 5.2

7.4

5.9

10-11.3

12.6

10-11.3

12.6 或 5.2

7.4

5.9

10-11.3

14

ααα

18

αααα

22

-α3.7

10.3

-α4.2

9.8

-(α)20.5

10-11.3

16

5.9

10-11.3

8.0

10-11.3

10-11.3

7.4

5.9

8.0

16

Sst I/ LO 5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

4.0

10.8

5.9

10.8

5.0

MED

5.9

13.9

5.0

--SEA

10.5

5.0

--SA

--

5.9

7.0

5.0

BRIT

5.9

7.5

5.0

THAI

8.0

7.4

---

20 5.9

--FIL

片段大小为千碱基对,有下划线为特征性异常片段

6.2 操作流程 该技术首次由 Southern 于 1975 年[2]引入且作为操作流程被广泛应用于基因 作图和突变分析。最初的方法随着膜条技术和探针标记等新技术的进步已广泛地 进行了改良,从而产生了很多种不同方法的 Southern 印迹。这些方法种类繁多, 难以在此一一总结,这些方法均可得到相同的最终结果。然而无论选择使用哪一 种方法,必须注意对准备用的膜条类型以及与所选探针标记系统有关的杂交和洗 膜使用正确的条件,等等。这里介绍的方法是在尼龙膜条上的 DNA 印迹和 32P标记质粒探针的杂交。

6.2.1

DNA 的限制酶消化

DNA 通常由 EDTA(首选)或肝素抗凝的全血制备。DNA 可通过酚-氯仿抽 提和乙醇沉淀的标准方法抽提,或通过使用基于盐抽提、蛋白质沉淀等其中一种

158


市售试剂盒来分离。从 5-10 ml 外周血中能得到足够的 DNA 用于分子诊断,随 后贮存于-20℃的 DNA 库中[3]。如果不需要贮存,很少量的全血即可用于珠蛋白 基因疾病的 PCR 诊断。

方法 每一种酶都有一套最适反应条件以确保最大限度的活性,生产商通常在说明 书中附有详细说明。缓冲液配制为 10×终浓度同酶一起贮存于-20℃。 1. 将 7 μg DNA 吸取到 1.5 ml Eppendorf 管中,加蒸馏水至体积为 30 μl。在冰块 上配制含有限制性酶、10× RE 缓冲液和亚精胺的混合液,这样每一份 DNA 样品得到 30-40 个单位的限制酶,终体积 1/10 的 10×缓冲液与酶(3-4 单位/μg DNA)和 3 μl 10×缓冲液、 3 μl 10 mM 亚精胺和 0.3 μl 牛血清白蛋白(10 mg/ml) 混合。该混合液放于冰上,加入适量的限制性酶。 2. 将酶混合液加至每一管(3-4 单位/μg DNA)已稀释的等量 DNA 中。 3. 混匀,旋转并在 37℃(除非有其他特殊情况)孵育至少 4 小时或过夜。 4. 加 10 μl 溴酚蓝/菲柯尔溶液(0.05%溴酚蓝 / 15%菲柯尔 400 溶于 1×TBE 缓

冲液中)并混匀。

如果 DNA 样品消化失败,可进行下面两个步骤: a) 用酚/氯仿重新抽提 DNA 溶液。 b) 用醋酸铵重新沉淀 DNA。

6.2.2 琼脂凝胶电泳 方法 1. 在 TBE 溶液中煮足够的琼脂(TBE:0.089 M Tris, 0.089 M 硼酸, 0.002 M EDTA,pH 8.0)制作所需的 0.8%琼脂凝胶。325 ml 凝胶需要 2.4 g 琼脂。 2. 倒凝胶之前将琼脂溶液冷却至 65℃。 3. 让凝胶凝固,小心移开梳子,制作 DNA 样品加样孔,将凝胶放至电泳槽内。 4. 用 TBE 缓冲液倒满凝胶电泳槽,覆盖加样孔。用自动移液管小心把每一例 DNA 样品打到加样孔内,用 Hind Ⅲ消化过的 35 S 标记的 λ DNA 作为标记

159


ladder。 5. 白天将凝胶在 95 伏电泳 9 小时,然后转至 85 伏过夜。为了保证被 BgIⅡ消 化的所有多态片段很好地分离,次日早上凝胶在 95 伏电泳直至二甲苯 Cynol 染料泳动至离点样处至少 15 cm 处。而 Bam HI 消化的话则不应迁移到超过 15 cm 的地方,以免丢失 4 kb 的条带。 6. 电泳后凝胶在 0.5 μg/ml 溴化乙锭溶液中染色 5 分钟,在蒸馏水中脱色,冲洗 并用安装了红色明胶滤光片的宝丽莱相机在紫外透视仪下用紫外光(300 nm) 拍照。 7. 用 λ Hind Ⅲ DNA 标记作为大小标准整修凝胶,23 kb 以上或约 3 kb 以下的片 段不需要。在凝胶底部的左边角(对应泳道 1)剪一个小斜角以使凝胶定位。

6.2.3 印迹操作流程 处理凝胶或滤膜时通常要戴手套。使用特殊的真空印迹设备虽然一次只能印 迹一块凝胶,但可缩短转移过程。 方法 1. 将凝胶在 500 ml 0.4 M NaOH、1.5 M NaCl 中浸泡 2 次,每次 15 分钟,轻缓 搅动。 2. 用蒸馏水冲洗凝胶,然后加入 500 ml 新配制的中和液(0.5 M pH7.5 Tris-HCl , 1.5 M NaCl)并轻轻摇动 20 分钟。重复中和步骤,然后将凝胶进行如下印迹 步骤。 3. 加 1 L 10×SSC 缓冲液到一个大托盘中,上面用玻璃或者用盖有一张 3 mm Whatman 牌纸巾的海绵覆盖,并用 2×SSC 浸泡,制成一个吸水棉芯(20×SSC

缓冲液:3 M NaCl,0.3M 柠檬酸三钠,pH7.0)。 4. 用蒸馏水冲洗凝胶,再用 2×SSC 洗,然后将凝胶反转并滑入吸水棉芯的中部, 小心勿使凝胶下面产生气泡。 5. 用封口膜封住整个托盘,切掉盖住凝胶的封口膜,仅暴露凝胶表面的顶部。 6. 剪一张与边角被剪的凝胶大小完全相同的尼龙膜,覆盖在凝胶上并做好凝胶 编号和相关的酶的标记。膜在覆盖凝胶顶部之前先用 2×SSC 浸泡。 7. 用一张在 2×SSC 中浸泡过切成与凝胶同样大小的 3 mm Whatman 纸覆盖膜,

160


然后再用一叠纸巾、玻璃板依次覆盖并加压。 8. 凝胶印迹过夜或至少 16 个小时,在此步骤中可通过对凝胶预拍照来检查转移 效率。 9. 拆开印迹设备,取出滤膜。 10. 将 DNA 固定到滤膜上,固定方法取决于所使用膜的类型: a) Hybond N+ 置于 0.4 M NaOH 中 20-60 分钟,然后在 2×SSC 中振荡,用封口膜包裹, 保存于冰箱中备用。 另外可选择将滤膜面向紫外透照仪暴露 1-2 分钟来固定 DNA并干燥储存。 b) 伯乐公司 δ-探针 GT 膜 建议使用紫外交联。 c) 用硝基纤维素膜,如 hybond C 夹在两张 Whatman 滤纸中间于真空烤箱中 80℃烤 2 小时,干燥保存。

6.2.4 探针标记 培养并收获包含人类 α-基因(PRA1)和 δ-基因(PBRζ)的质粒,通过限制 酶消化切断的基因组序列,电泳后从琼脂凝胶上把其分离出来,探针详情列于表 6.2。质粒可从英国牛津大学 John Radcliffe 医院 Weatherall 医学分子研究所 D.Higgs 教授处获取,同时也可以获得需培养的质粒探针和基因组探针片段切除 的信息。这些技术的具体操作方案超出了本书的范畴,在此不做介绍。 表 6.2

α-基因和 δ-基因探针详情

探针

载体

基因组插入

插入大小

探针切除

探针大小

抗生素抗性

PRA1

PBR322

Pst I

1.3kb

Pst I

1.3kb

四环素

pBRzeta

PBR322

EcoR I/Bam HI

5kb

Sac I

1.8 kb

氨苄青霉素

方法: Amersham Megaprime 试剂盒可用于放射性标记的探针。共需要 50 ng 的模板 DNA。 1. 加 5 μl 引物溶液到 DNA 中,加蒸馏水至 50 μl,在 95~100℃变性 10 分钟。

161


2. 加 10 μl 标记缓冲液,4 μl ATP、GTP、TTP、3 μl 32 P-dCTP (Amersham AA 0005) 和 2 μl Klenow 酶,加灭菌蒸馏水至 100 μl。 3. 在 37℃孵育 20 分钟,取 2 μl 加至 5 ml 闪烁液中。 4. 将剩余的溶液装入平衡柱中,1000 rpm 离心 3 分钟。 5. 取 1 ml 注射器制备柱子,在底部放置少量玻璃棉,用在 2×SSC 中制备的预 溶胀的 G50 交联葡聚糖凝胶填满柱子。也可使用预先填好的 CP 柱。 6. 柱子在 1000 rpm 离心 3 分钟,交联葡聚糖凝胶应离心沉降到 1 ml 刻度左右。 加入 100 μl 2×SSC 到平衡柱子顶部并在 1000 rpm 离心 3 分钟。重复这一步骤, 直至管底部出现 100 μl 沉淀物为止。 7. 在管底部放一个做了记号的去盖的 Eppendorf 管收集探针,按前面步骤离心。 8. 用镊子小心移开 Eppedorf 管,吸取 2 μl 探针到 5 ml 闪烁液中,在 β-闪烁计 数器上计数。将剩余探针以 50 μl 分装后转移到一个新的 Eppendorf 管中以便 估计探针的容积和特异活性。每个探针滤光片每分钟计数一千万次。 9. 在 Eppendorf 管的盖子上钻一个孔,然后煮沸探针 10 分钟,马上使用。

6.2.5 滤膜杂交 杂交和洗膜步骤最好在一个带有旋转玻璃瓶的特殊烤箱内进行。反应条件 可在同一瓶子内处理几张滤膜来进行优化。 。

试剂 a) Denhardt’s Soln:0.02%菲柯尔 400,0.02%牛血清白蛋白,0.02%聚烯毗酮。 b) SSPE:3.0 M NaCl,2.0 mM NaH2 PO 4 ,20 mM EDTA pH7.4 c) 杂交缓冲液 7.5% 硫酸葡聚糖 5×Denhardt’s soln 1.5×SSPE 1% SDS 100 μg/ml 鲑鱼精子 DNA

162


方法 1. 用 2×SSC 浸湿滤膜和筛网,然后在少量杂交液里将膜夹在两层筛网之间,再 卷起来并放入瓶中。 2. 加杂交缓冲液到瓶中,每片滤膜加 5 ml,每个瓶子最多放 4 片滤膜。 3. 在 65℃烤箱中孵育至少 1 小时。 4. 加已变性的探针到瓶子底部,小心勿将探针注射到膜上,否则将出现热点。 5. 在 65℃烤箱中孵育过夜。

6.2.6 洗膜和放射自显影 1. 倒入 20 ml 2×SSC 到每个杂交瓶中,冲洗并小心将瓶内的内容物倒进放射性 标记的洗涤槽中,用 2×SSC 将瓶填满一半并再放入烤箱 20 分钟。 2. 20 分钟后倒出冷洗液,移出滤膜和筛网并放入塑料盒内。加入 0.1×SSC 溶液 和已加热至 60℃的 0.1%SDS 液,放在摇床上摇 30 分钟。对于 α 和 δ 探针则 需要进行更严格的第二次洗膜,例如,将洗液加热至 65~75℃以除去背景计 数。 3. 当计数水平降至每秒 5 次或以下时,移除滤膜并放在一片 Whatman 纸间至晾 干为止。 4. 当滤膜彻底晾干后,用保鲜膜包裹并放在一个安装了加强遮蔽的 X-射线暗盒 内并在暗室内加上 X-射线胶片,滤膜上下各一张。 5. 放在-70℃过夜或更长时间使上面的胶片显影。 6. 为获得理想结果,需判断底部胶片留置的时间以得到最大曝光时间。

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第七章

胎儿 DNA 分析

用于产前诊断的 DNA 分析方法与第五章中用于突变筛查的方法相同。产前 诊断的主要区别是在夫妇双方都携带有相同突变的情况下,需要检测突变位点的 正常 DNA 序列。当父母携带不同的突变时,每一方都需要进行简单的突变筛查。 但是,无论父母携带哪一种突变,每一病例都需进行多态性分析以检查母体 DNA 污染,这是误诊的首要潜在原因。

7.1 用显微解剖镜制备绒毛 存在于样品中的任何母体组织都必须去除,因为母体组织的存在可能导致 误诊。样品应该置于 Petri 平皿内并用盐水或培养液洗涤以除去存在的任何母体 血液。然后将 Petri 平皿放在显微解剖镜下,用干净的小镊子或两支针移去母体 蜕膜。 用清洁后的羊水细胞小球绒毛膜样品制备 DNA 的方法已在第五章中介绍。

7.2 母体 DNA 污染检查 为了排除母体污染,需要通过 PCR 分析进行胎儿和父母 DNA 样品的短串 联重复序列(STR’s) 或可变数目串联重复序列(VNTR’s)的常规检查。 DNA 的串联重复“小卫星”区域是鉴定母体污染的理想方法。这些高度多 态性 DNA 区域显示为重复单位数目的等位基因变化。由于有大量的不同等位基 因,这些重复的 DNA 区域提供了有信息的遗传标记。根据孟德尔遗传学规律这 些变异是可遗传的,因此,它们可用于检测母体污染,的确也能鉴定非亲子关系。 建议每一例产前诊断都检查母体 DNA 污染,尤其是当胎儿的基因型与母亲 相同时。多态性标记的可选择范围很广,包括短串联重复(STR)标记如 D21S11、 D21S1414、D18S535[1]或可变数目串联重复(VNTR)标记如 ApoB、IgJH 和 Has-ras[2]。 应用下面介绍的染色体非整倍体的荧光定量 PCR(QF-PCR)技术可以检测 三等位基因类型[3]。

164


7.2.1 短串联重复分析 随着侧翼的重复序列独特的荧光寡核苷酸引物的应用,使用缺口 PCR 能扩 增染色体上的多态性区域。PCR 产物可被分离并用自动激光 DNA 分析仪(ABI Prism 310 或 3100)和合适的基因扫描软件来进行分析。

试剂 a) PCR 混合液(8 ml) 1 ml 10×Cetus 缓冲液 5.4 ml 灭菌蒸馏水 1.6 ml 1.25mM NTPs 8 μl 1 M 亚精胺 1 ml 分装冻存 PCR 反应终浓度:50 mM KCl,10 mM Tris,1.5 mM MgCl2 ,0.01%明胶, 每种 dNTP 200 μM b) 10×Cetus 缓冲液 1.25 ml 2 M KCl (储备液) 0.5 ml 1 M Tris,pH 8.3(储备液) 75 μ11 M MgCl2

(储备液)

5 mg 明胶 (300 bloom) 3.2 ml 灭菌蒸馏水 置于 37℃以使明胶溶解 冷冻保存 c) 储备液 2 M KCl 14.91g/100 ml 1 M Tris 12.11g/100 ml 用浓盐酸调 pH 至 8.3 1 M MgCl2 .6H2 O 20.33 g/100 ml 储存于 4℃ d) dNTPs 1.25 mM –100 mM(浓度) 每种 dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各 60 μl

165


4.74 ml 灭菌蒸馏水 冷冻储存 e) 亚精胺 自由基从 Sigma 公司可得到(S:2626) 于蒸馏水中配制 1 M 溶液(MW:145.2) 冷冻储存

引物 所有引物均稀释为 1 个 OD 值,即约 10 pg/ml 并冷冻储存。表 7.1 显示了 用于多重 QF-PCR 的引物。这里介绍 7 个 STR 标记。7 个标记中每组的正向引物 均用荧光染料标记[3 、4]。为了保证相当量的 PCR 产物这些引物都需要优化。另外, 在牙釉蛋白基因(AMDXY)上的标记也可使用。应用这些标记可以确定胎儿性 别,Y 染色体产生 252 bp 的片段,X 染色体产生 432 bp 的片段[5 、6]。

荧光 PCR (QF-PCR)方法 1. 在 0.5 ml 的 Eppendorf 管内加入: 20 μl PCR 混合液 正向标记引物(浓度见表 7.1) 反向引物 (见表 7.1) 0.1 μl-0.5 单位 taq 聚合酶(Perkin Elmer) 1 μl 1/10 DNA 稀释液 1 滴石蜡油 加蒸馏水至 25 μl 2. 放入热循环仪,程序如下: 93℃变性 48 秒 60℃退火 48 秒 72℃延伸 1 分钟 共 25 个循环 72℃延伸 3 分钟

166


冷冻 3. 加 1 μl扩增产物到含有 12 μl 甲酰胺和 0.5 μl 大小标准(基因扫描 500 TAMRA

或如果使用 ABI 3100 则用 Rox 大小标准)的 0.5 ml 无盖样品管(ABI 可提供) 中,确保无气泡。在每支管内放入灰色隔片(来源于 ABI)。如果使用 ABI 3100 则用微孔洗脱。 4. 置于 92℃ 2 分钟。PCR 产物通过毛细管(15 千伏,60℃ 24 分钟)进行检测。 测量特异性 PCR 产物的大小,通过荧光活性的程度(等于所产生的荧光峰面 积)来估计每一种 PCR 产物的量。

表 7.1 用于多重 QF-PCR 的引物 标记

染色体定位

引物序列(5’-3’)

荧光定量标记

度 D21S11 (F)

TATGTGAGTCAATTCCCCAAG TGA

D21S11 (R)

GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC

D21S1411 (F)

TATGTGAGTCAATTCCCCAAGTGA

D21S1411 (R)

GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC

D21S1414 (F)

GGCACCCAGTAAAAAATTACT

D21S1414 (R)

CTGTCTGTCTGTCTGTCTATC

D18S535 (F)

TCATGTGACAAAGCCACAC

21q21

21q22.3

21q21

18q12.2-12.3

产物 大小 (bp)

10

6-FAM

10

10

HEX

10

10

6-FAM

10

5

TET( 用 NED

172-264

270-308

330-380

150-180

的 ABI 3100) 5

10

HEX

10

20

HEX

Y252

20

X432

21q21.1-

10

HEX

234-274

TCTCCAGAATCACATGAGCC

q21.2-

10

CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC

21q21.1-

10

TET( 用 NED

D18S535 (R)

AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA

D13S631 (F)

GGCAACAAGAGCAAACTCT

D13S631 (R)

TAGCCCTCACCATGATTGG

AM DXY (F)

CTGATGGTTGGCCTCAAGCCT

AM DXY (R)

ATGAGGAAACCAGGGTTCCA

D21S1442 (F)

CTCCTCCCCACTGCAGAC

D21S1442 (R) D21S1435 (F)

13q31-32 X和Y

的 ABI 3100) D21S1435 (F)

GCAAGAGATTTCAGTGCCAT

q21.2-

167

10

187-208

172


表 7.2 在 ABI 基因扫描上显示的短串联重复标记 荧光标记

S TR

ABI310/ABI3100

基因扫描 500 Tamra:

基因扫描 500 Rox:

ABI310 分 析 的 大小

ABI3100 分 析的大小

标准和颜色

标准和颜色

D21S11

6 FAM

蓝色

红色

红色

D21S1414

6 FAM

蓝色

红色

红色

D21S1411

HEX

黄色/黑色 (ABI 310)

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

红色

绿色(ABI 3100) D13S631

HEX

黄色/黑色(ABI 310) 绿色(ABI 3100)

D21S1442

HEX

黄色/黑色(ABI 310) 绿色(ABI 3100)

AM DXY

HEX

黄色/黑色(ABI 310) 绿色(ABI 3100)

D18S535

D21S1435

TET (ABI 310)

绿色(ABI 3100)

NED (ABI 3100)

黄色/黑色(ABI 310)

TET (ABI 310)

绿色(ABI 3100)

NED (ABI 3100)

黄色/黑色(ABI 310)

结果解释 理论上峰的高度应在 100 到 1000 之间。对于<100 的峰高,应将产物进一步 扩增 5 个循环并重新分析。表 7.2 显示了如何在 ABI 基因扫描上分析荧光标记和 使用合适的大小标准。图 7.1 是一个 D21S11 STR 分析的例子,(a) 父亲等位基 因 215 bp 和 223 bp;(b) 胎儿等位基因 223 bp 和 227 bp;(c) 母亲等位基因 227 bp 和 237 bp。因此,胎儿已遗传了父亲的 223 bp 等位基因和母亲的 227 bp 等位基 因。所以我们可得出结论,由于胎儿样品中不存在母亲的 237 bp 等位基因,故 无母体污染。图 7.2 显示在一个双胎妊娠中胎儿样品取样出现污染。

168


图 7.1 使用 STR D21S11 检查母体 DNA 污染的例子。图中显示了(a)父亲等位基因 215 bp 和 223 bp;(b)胎儿等位基因 223 bp 和 227 bp; (c)母亲等位基因 227 bp 和 237 bp 的 STR 分析。结果显示胎儿已遗传了父亲的 223 bp 等位基因和母亲的 227 bp 等位基因。所以我们 可得出结论,由于 237 bp 母亲等位基因未出现,故胎儿样品中无母体污染。

169


图 7.2 显示一个双胎妊娠胎儿在样品取样期间发生污染的结果

多重 PCR 技术方案 引物也可以为多重的;下面的方法使用 D21S11、D13S631、D18S535 和 AMDXY 引物。 1. 在一个 0.5ml Eppendorf 试管内加入: 2.5 μl 10×PCR(随扩增 Taq 酶配送) 1.5 μl 25 mM MgCl2 (随扩增 Taq 酶配送) 4 μl 1.25 mM dNTPs 适量的 D21S11 正向和反向引物、D13S631 正向和反向引物、 D18S535 正 向

和反向引物、AMDXY 正向和反向引物(见表 7.1)

0.2 μl~1 单位 taq 聚合酶(Perkin Elmer) 1 μl 1/5 稀释 DNA(原液约为 0.5 mg/μl) 1 滴石蜡油 用去离子蒸馏水定溶至 25 μl。 2. 按上面阐述的方法进行扩增,只是在 25 个循环后用 60℃延伸 30 分钟。如前 所述用 ABI 310 或 3100 分析红色大小标准和其他与所使用的 STR 标记有关 的颜色。 3. 如果某一标记效果不好,用该 STR 引物单独重复进行扩增。

7.2.2 可变数目串联重复(VNTR)分析 应用缺口 PCR 操作步骤通过可变数目串联重复(VNTR)多态性分析,PCR 也可用于检查胎儿 DNA 样品中的母体污染。这种非荧光 PCR 的试剂和方法在第 五章中已详述。该法使用琼脂凝胶和溴化乙锭染色的简单技术,缺点是琼脂凝胶 电泳的低分辨率意味着仅有 30 个或 30 个以上大小的核苷酸的可变数目串联重复 才有用,并且这种非荧光方法在鉴别小量污染时也不如荧光 STR 法那么敏感。 Apo B、 IgJh、Col2A1 和 D4S95 VNTR 多态性分析所需的引物序列详述于

表 7.3。一个可提供信息的试验是当双亲都有两个不同大小的等位基因时,可清 楚地看到胎儿已遗传母亲一个等位基因和父亲一个等位基因。如果在胎儿 DNA

170


中看到母亲第二个等位基因的弱阳性信号(总共显示出三条带),这提示有母体 DNA 污染。 表 7.3

通过 VNTR 分析用于监测母体污染的引物

引物对

VNTR

退火温度 (℃)

重复长度 (bp)

产物大小 (bp)

ApoB

GAAACGGAGAAATTATGGAGGG TCCTGAGAT CAATAACCTCG

55

30

541-871

IgJh

GGGCCCTGTCTCAGCTGGGGA TGGCCTGGCTGCCCTGAGCAG

68

50

520-1720

55

34&31

584-779

60

39

900-1600

Col2A1 D4S95

CCAGGTTAAGGTTGACAGCT GTCATGAACTAGCTCTGGTG GCATAAATGGGGATAACAGTAC GACATTGCTTTATAGCTGTGCCTCAGTTT

除 IgJh 外所有引物均使用标准 PCR 缓冲液。IgJh 引物需要(NH4 )2 SO4 缓冲液(详见第 5 章方 法部分)。

参考文献 1.

2.

Samura O, Pertl B, Sodha S,Johnson KL, SekiZawa A, Falco VM, lelmes RS, Bianchi DW(2000) Female fetal cells in maternal blood: use of DNA polymorphisms to prove origin. Human Genetics.107:28-32. Decorte, R., Cuppens, H., Marynen, P. & Cassiman, J..(1990) Rapid detection of hypervariable regions by the polymerase chain reaction technique. DNA Cellular Biology. 9: 461-469.

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171


第八章

DNA 突变检测的新技术

本章将概述 DNA 突变检测的一些最新方法,尽管随着技术的不断发展和改 进这些方法很快就会过时。目前这些技术在临床诊断学应用方面的经验还很有 限,所以我们还不能就血红蛋白病在 DNA 水平的诊断推荐最可靠、高性价比的 方法,也无法介绍大部分方法的具体操作流程。这些方法都是基于对感兴趣的基 因区域的 PCR 反应生成的扩增子进行分析且涉及高价位设备的使用,虽然在大 多数情况下后续的样品分析步骤可能是经济有效的。

8.1 变性高效液相色谱(DHPLC) 一种新的固相的合成是 DHPLC 发展的第一步(目前 Transgenomics Inc.已

有商品化试剂),这种固相最初允许双链(ds)DNA 片段以很高的分辨率根据片 段大小而分离。随着包括提升柱体温度在内等实验条件的改进,双链 DNA 分离 不再依赖于片段大小而与双链 DNA 分子的解链特性有关(例如 AT/GC 含量)。 此外,带有单碱基错配的双链 DNA 分子,异源双链与同源双链具有更低的保留 时间。目前 DHPLC 的两种可选择的应用已有进展,包括部分变性条件和完全变 性条件两种模式,对于 DNA 分析来说,两种模式具有不同的潜在能力。 部分变性 DHPLC 是一种突变扫描方法,与 DGGE(见 5.3.1)相似,后者 在基因的 PCR 产生区域能够鉴定单核苷酸替代或小插入 / 小缺失。通过部分变 性 DHPLC 对基因区域的突变的检测是基于异源双链和同源双链在已变性和重退 火的 PCR 扩增子的混合液中具有不同的保留时间。DHPLC 不需要特异的 PCR 引物或 PCR 后续处理,但是对 PCR 扩增子的质量要求高,亦即需要有效的产率 和不存在 PCR 人工产物。操作温度决定灵敏性,尽管需要经验“精细调整” ,但 最佳的温度条件可通过计算预测(从 www.insertion.stanford.edu/melt.html 在线免

费获得)。异源双链比相应的同源双链保留时间少,洗脱的 DNA 分子(大小为 1.5kb)可通过 UV 或荧光检测器在加样后几分钟内检测出来。部分变性 DHPLC 筛查 β 珠蛋白基因突变的可靠性最近已由 Colosimo 等在 2002 年报道[1],结果发 现特异性和灵敏度达到 100%。部分变性 DHPLC 唯一的缺点是不适合于纯合子 样品的基因分型,除非在 DHPLC 分析之前将这种样品与一种已知基因型(最好

172


是野生型)的参比物混合在一起。此外,尽管一些早期研究提示了大多数的突变 与特征性洗脱峰图谱有关

[1 、2]

,但部分变性 DHPLC 仅是一种间接的突变检测方

法,所以,对于已定位于任何基因区域中的突变的最终定性,通常建议使用如 ARMS-PCR(见 5.4.2)或测序(5.3.3.或 5.3.4)之类的直接突变检测方法来完成。 完全变性 DHPLC 能够处理相对较短(达 70-80bp 左右)的已知大小(仅一

个碱基不同)的单链 DNA 分子,因此这种方法可应用于已知突变/多态性的样品 进行基因分型。该法可用于处理除单个 C→G 替换之外的所有可能的碱基替换[2]。 联合引物延伸 PCR (PE-PCR)产生等位基因特异性扩增子,然后通过完全变性 DHPLC 对常见中国人 β-地贫突变进行基因分型的分析方法最近已由 Wu 等在 2003 年[3]报道,该法准确率达 100%。 总的来说 DHPLC 是在 DNA 水平检测突变的一种有效方法。它非常灵敏、 自动化程度高且运作成本低。虽然在诊断的应用上经验尚有限,但该法不失为一 种检测珠蛋白基因突变的好方法。

8.2 基因芯片分析 基因芯片也称为 DNA 芯片、生物芯片或微矩阵,正发展为分子分析和诊断 学强大的工具。典型的基因芯片由一种有序的微点集合在一种表面基质上构成, 基质上的每一个微点都包含一种已知的单核苷酸。微矩阵的制作以选择定位在矩 阵上的探针开始,通常有三种方式:定位大的 DNA 片段(cDNA’s 或 PCR 扩增

产物)、定位预先合成的寡核苷酸、或者原位(在芯片上)合成的寡核苷酸。 微矩阵技术以核苷酸杂交为基础,序列互补使两条单链核苷酸分子发生杂 交,其中一条单链固定于基质上[4]。指示在芯片上样品-探针发生了杂交的点的 检测需要标记样品,通常用一半的荧光。 基因芯片或矩阵技术对基因发现、基因表达、基因作图和突变检测有着潜 在的应用价值[5],而突变检测的应用对于构成血红蛋白合成疾病基础的珠蛋白基 因上的突变(点突变)的定性非常合适。开发可靠的基因芯片以诊断与突变有关 的疾病受到同时分析(多重突变)广泛和不同范围的 DNA 序列所需要的理想而 一致的严格杂交条件难题的阻碍,尤其是当需要辩别仅有单个核苷酸差异的样品 的等位基因(例如野生型纯合子 /突变型纯合子 / 杂合子 )时。然而,最近的文

173


献[6 、7]已经证明基因芯片对 β-地贫突变能可靠地进行基因分型,结果表明这个方 面已有进展,基因芯片不久将更广泛地应用于潜在的最终使用人群。而且,一些 研究促进了 Nanogen 公司商品化试剂盒的研发 [8] 。这种试剂盒可供使用者在 Nanochip®分子工作站(见 http://www.nanogen.com)上使用,可检测地中海人 群中 8 种常见的 β-地贫突变。 总的来说,基因芯片技术为遗传诊断学提供了潜在的高通量和高度自动化 的手段,尽管目前的运作成本比其他方法可能高一些。

8.3 实时 PCR 实时 PCR是一种使用荧光探针和专用的设备在整个 PCR反应过程中监测产 生的扩增产物累积的新技术。 最近已开发了一些商品化的设备,将微量快速循环 PCR 与荧光测定法集成 起来,提供了定量 PCR 分析扩增反应的实时荧光监测和/或 PCR 产物的快速基因 分型的定性方法,不需进行 PCR 之后的样品后续处理[9 、10]。 有的商品化系统可应用于基因分型(包括点突变在内的序列差异检测),每 一种系统都有其自身的杂交和检测过程,其中最流行的两种系统是 Roche 公司的 Lightercycler 和应用生物系统公司的实时 PCR 系统。 光循环系统(Roche)使用两条与扩增的靶 DNA 内相毗连的序列杂交的荧 光标记探针,其中一条探针覆盖了包括突变在内的区域。退火探针的紧密靠近促 进它们发生荧光偏振能量转移(FRET)(图 8.1A)。探针被设计为不同的解链温 度(Tm),以便具有较低 Tm 值的探针伸展至突变位点(图 8.1A)。

174


图 8.1 利用 Lightcycler(Roche)进行实时 PCR 和等位基因分型的原理 A、两个毗邻的杂交寡聚体之间的 FRET 原理

随着温度的增高,发射荧光信号的监测器将测出荧光(F)丢失,这是由于 较低 Tm 值的探针从模板上解链所致(图 8.1B)。探针内的单碱基错配导致 Tm 值偏移 5-10℃,使得野生型与突变等位基因之间容易区别( 图 8.1B)。检测低 Tm 值探针(突变检测探针)碱基错配的能力和应用两种不同颜色的探针可以在 单次 PCR 反应中筛查一个以上的突变( 图 8.1B)。

175


图 8.1 B .随着温度的升高荧光信号的衰减取决于等位基因特异性寡核苷酸的解链温度,如 果在等位基因特异性寡核苷酸内存在错配碱基,其在更低温度下将发生变性,使野生型(W) 或突变型(M)之间容易识别。

应用生物系统公司的实时 PCR 体系所使用的检测化学方法,利用了 Taq 聚 合酶的 5’核酸酶活性,具体如下:一条与其中一条靶 DNA 链的某段区域互补的 等位基因特异性寡核苷酸在 5’端标记荧光基团而在 3’端标记淬灭基团(图 8.2A)。 在 DNA 聚合酶的作用下探针与模板完全杂交,当其到达探针杂交的区域时即引 发半量荧光的释放。当荧光分子上的发射基团与淬灭基团不再靠近时,半量荧光 便可发射出来。为了等位基因的鉴别,须使用一对等位基因特异性寡核苷酸探针。 每条探针以不同的荧光标记,其原理图见图 8.2B。 对于优化方法设计两个系统均有很好的灵活性,通常很容易操作,可给出 可重复的结果,且运作成本相当低。尤其是 Ligthcycler 系统,一些描述各种 β 珠蛋白基因突变的准确而快速的基因分型方法已有报道[11 、12 、13]。

176


图 8.2 利用应用生物系统公司的 Taqman 探针和体系进行实时 PCR 和等位基因鉴别的原理。 荧光检测基于 5’核酸酶的分析。只有完全配对的寡聚体才能与靶 PCR 产物杂交并释放出荧 光信号。

8.4 单细胞 PCR 单细胞 PCR 的应用包括植入前诊断(PGD)或妊娠期由母体循环系统中分 离的胎儿细胞分析(见地中海贫血和其他遗传病的预防,第一卷,第 8 章)。单 个细胞大约包含 6.6 pg DNA,仅基于单细胞中 2 段起始靶序列(等位基因),例 如 β 珠蛋白基因,成功地进行基因分型需要最大限度的优化聚合酶链反应。然而, 一个或两个细胞的 PCR 诊断有内在的局限性,包括 PCR 失败、等位基因脱扣 (ADO)和污染,同时方法的设计和结果的评估应该将这些因素考虑在内。 非荧光检测方法的单细胞 PCR 产物显影可能需要额外附加 70 个循环的扩

177


增。然而由于 Taq 聚合酶约在 40 个循环之后即倾向于出现结合错误,故使用巢 式 PCR 法更可取[14]。巢式 PCR 包括两轮 PCR,且第二轮 PCR 通常使用定位于 第一轮引物对内部的引物。应用合适的分析方法对巢式 PCR 产物进行等位基因 鉴定如第 5 章所述。 基于 PCR 产物的荧光检测的方法灵敏 1000 倍以上,但可能排除巢式 PCR 的应用。在自动测序仪上基于 PCR 产物的荧光检测的单细胞分析方法已应用于 PGD。实时 PCR 也是单细胞基因分型的一种合适的方法,该法灵敏、准确、有 效、快速且简便[15]。

8.5 应用实时 PCR 检测 β-珠蛋白基因突变的实例 这里描述的方法基于《临床化学》[13]的一篇最新文献,该方法无需改良就 可适用于全世界范围内大部分最常见的 β-珠蛋白基因突变的检测。

8.5.1 PCR 引物和突变检测探针的设计 通过解链曲线分析在 LightCyclerT M 仪 (Roche 分子生物化学) 上进行 PCR 和突变检测,该设备能同时测量 2 种不同的荧光基团发射出的信号。PCR 引物 (正向:5’-GCT GTC ATC ACT TAG ACC TCA-3’、反向:5’-CAC AGT GCA

GCT

CAC TCA G-3’)用计算机软件(扩增版 2.0,Bill Engels 1992-1995)设计。该引 物扩增 β-珠蛋白基因 587 bp 区域,在该区域周围涵盖全球人群大部分最常见的 β地贫突变和 Hb S 突变(表 8.1,图 8.3)。

表 8.1

据 Vrettou 等 2003[13] 文献中的操作流程通过 Lightcycler 突变检测探针进行突变检测

突变检测探针

检测的突变

发现的人群

Ac +20

CAP +20 (C→T) CAP +22 (G→A)

地中海人

Hb S (Cd 6 A→T) Cd 5 (-CT)

非洲、沙特阿拉伯、印度、地中 海

Cd 6 (-A) Cd 8 (-AA)

地中海人 地中海人,美国黑人

Cd 8/9 (+G)

地中海人 亚洲印度人,日本人

IVSI-1 (G→A)

地中海人

*

Ac Cd5.6.8

Ac IVSI-1.5.6

地中海人,保加利亚人

178


Ac IVSI-110

Ac Cd39

IVSI-1 (G→T)

亚洲印度人,东南亚人,中国人

IVSI-2 (T→G) IVSI-2 (T→C) IVSI-2 (T→A) IVSI-5 (G→A)

突尼西亚人 美国黑人 阿尔及利亚人,意大利人 地中海人,阿尔及利亚人

IVSI-5 (G→C) IVSI-5 (G→T)

亚洲印度人,东南亚人 地中海人,北欧人

IVSI-6 (T→C)

地中海人

IVSI-110 (G→A) IVSI-116 (T→G)

地中海人 地中海人

Cd 39 (C→T) Cd 37 (TGG→TGA)

地中海人

Cd 41/42 (-TCTT)

中国人,东南亚,印度

沙特阿拉伯人

根据 http://globin.cse.psu.edu 进行突变命名 *:多态性通常与 IVSⅡ-745(C→G)突变连锁

小距离内很多突变成簇,故仅设计三种组合(或三组 )探针即可进行突变 检测。一种相对常见的地中海人突变(IVSⅡ-745 C→G)并不位于基因 5’区域 的已扩增的 587 bp 中,但已在 200 多个携带该突变的样品的 5’UTR 观察到顺式 多态性碱基改变(+20 C→T);所以针对连锁的多态性改变+20 C→T 设计一条特 异性检测探针以便对 IVSⅡ-745 突变进行间接检测。受体突变检测探针的设计考 虑了二级结构特性(例如发卡环)和潜在的引物二聚体形成等,且所有的探针组 合在合成前均通过计算机评估其适用性(TIB MOLBIOL,德国柏林)。另外,突 变检测探针的设计避开了已知的包含常见多态点突变例如密码子 2(CAC→CAT) 的 β-珠蛋白基因区域。 两种探针组合(命名为组 A 和组 C)包括两条受体(突变检测)探针和一条 中心供体探针(图 8.3),可根据任何基因分型试验的需要来预测用一条还是两条 受体探针。在组 A 和组 C 中每一条受体探针均用不同的受体荧光基团(Light Cycler Red 640[LC Red 640] 或 Light Cycler Red 705[LC Red 705])标记,在跨越 2 条受体探针之间距离的区域设计中心供体探针,用在 5’端和 3’端均用荧光素(F) 分子标记。组 B 用于筛查一些相邻的突变,其用一条 LC Red 705 标记的突变检 测(受体)探针,同时一条在与受体探针相邻的末端标记了荧光素的供体探针(表 8.1,图 8.3)。所有组合中相对于供体探针突变筛查(受体)探针都设计为具有 更低解链温度(借以确保在解链曲线期间产生荧光信号,这种信号仅能被突变探

针检测),同时所有等位基因特异性探针均与野生型序列互补。

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图 8.3

Lightcycler 杂交探针检测的 β 珠蛋白基因区域

β-珠蛋白基因 PCR 引物见正文。Lightcycler 探针参见 Vrettou 等 2003

[13]

发表的论文,

具体如下: A 组: Ac +20:5’-TTC TGA CAC AAC TGT GTT CAC TAG CA-3’ LC Red; Ac Cd5.6. 8: LC Red 5’-GAC TCC TGA GGA GAA GTC TGC-3’P; A 组供体: FITC 5’-CCT CAA ACA GAC ACC ATG GTG CAC C-3’ FITC. B 组: Ac IVSI-1.5.6: LC Red 5’ -TGT AAC CTT GAT ACC AAC CTG CCC a-3’ P; B 组供体: 5’-TGC CCA GTT TCT ATT GGT CTC CTT AAA CCT GTC-3’ FITC. C 组: Ac IVSI-110:5’-TCT GCC TAT TGG TCT ATT TTC CC-3’ LC Red; Ac Cd 39: LC Red 5’-ACC CTT GGA CCC AGA GGT TCT T-3’ P; C 组供体: FITC 5’-CCC TTA GGC TGC TGG TGG TC-3’ FITC. FITC= 荧光素; P=防止 PCR 的延伸过程而设计的 3’磷酸化。 LC Red=根据实验的需要用 LC Red 640 或 LC Red 705 标记突变检测探针。

8.5.2 PCR 扩增和突变检测 PCR 扩增反应在 LightCyClerT M 玻璃毛细管(Roche 分子生物化学)上完成, 使用约 50 ng 基因组 DNA,总反应体积为 20 μl,包括由供应商(LightCyCler-DNA Master 杂交探针)提供的现成的带 4 mmol/L Mg2+的反应混合液,每条 PCR 引物 0.5 μM,每条荧光探针 0.15 μM。 PCR 扩增包括:第一个变性步骤 95℃ 30 秒,接着是 95℃ 3 秒、58℃ 5 秒、 72℃ 20 秒共 35 个循环,以每秒 20℃的温度斜率进行。在 PCR 期间,发射的荧 光在每次扩增循环退火步骤结束时测定以监测扩增。 在扩增步骤后,立即对探针进行解链曲线分析来确定基因型。这包括将温 度短暂地升高到 95℃,冷却到 45℃两分钟,以达到探针最大限度的杂交,然后

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再以 0.4℃/秒的速率加热至 85℃,在此期间记录解链曲线。发射的荧光被连续测 定(如果需要的话通过通道 F2(640 nm)和 F3(705 nm))以监测被标记荧光 的检测探针从互补 DNA 单链(F/T)中分离开来(F:发射的荧光,T:温度)。 计算机软件自动转换并显示荧光对温度的初始负导数(-dF/dT 对 T 求导),得出 的解链峰使得野生型与突变等位基因之间很容易区别(图 8.1B,图 8.4)。.

图 8.4 各种 β-珠蛋白基因突变的解链曲线图例 A. 利用 Ac20 突变检测探针检测 CAP +20(C→T)多态性与 IVSⅡ-745(C→G)突变连锁。 B. 利用 Ac 5.6.8 突变检测探针检测 HbS (Cd 6 A→T)、 Cd 5(-CT)、 Cd 6(-A)、 Cd 8(-AA)、 Cd 8 / 9(+G)突变。 C. 利用 Ac IVSI-1.5.6 突变检测探针检测 IVS1-1(G→A)、IVSI-5(G→A)、IVSI-6(T→C) 突变。 D. 利用 Ac IVSI-110 突变检测探针检测 IVSI-110(G→A)突变。

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Prevention of Thalassaemias and Other Haemoglobin Disorders, Vol. 2 - Chinese  

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