TSCB, 64

Les ma La Lties deL segLe xxi

editors

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 64, 2013

Jordi Barquinero i Jaume reventós

Il·lustració de la sobrecoberta

Fotomuntatge en què es veu una secció tissular d’un càncer d’endometri, tenyit per immunohistoquímica amb l’anticòs contra un marcador tumoral. Entre les glàndules del tumor apareixen els heatmaps dels microxips resultants de l’anàlisi d’expressió gènica diferencial en aquest tumor quan el comparem amb el teixit endomètric normal.

Autora: Eva Colàs.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

LES MALALTIES DEL SEGLE XXI

VOLUM 64, 2013

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

BARCELONA

2013

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LASOCIETAT CATALANADE BIOLOGIA

Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol.

Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua.

Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP:

—Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats.

—Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint).

—Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc.

Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols.

El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat.

Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

—Títol, escrit en majúscules i negreta.

—Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom.

—Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència

—Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules.

—Paraules clau en català, màxim de cinc.

—Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit).

—Paraules clau en anglès, màxim de cinc.

—Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat.

—Agraïments, si escau.

—Referències, segons el format indicat més endavant.

—Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full.

—Text de peus de figures.

Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright

Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. Acontinuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies.

CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M.(1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70.

MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30.

WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press.

Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 64, 2013

BARCELONA

treballs de la societat catalana de biologia , revista anual de la SCB

Direcció: Dolors Vaqué, vocal de Publicacions

Web de la versió digital: http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

COMITÈ DE PUBLICACIONS

DOLORS VAQUÉ, presidenta, vocal de Publicacions

RICARD ROCA, vocal, SCB

FRANCESC PIFERRER, vocal, Institut de Ciències del Mar

MERCÈ PIQUERAS, vocal, presidenta de l’Associació Catalana de Comunicació Científica RAFAEL ABÓS, vocal, USR Barcelona

© dels autors dels articles

Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona

Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com

Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès

ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B.12164-1963

Les malalties del segle xxi

Jordi Barquinero i Jaume Reventós editors

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 64, 2013

VOLUM 64, 2013

ÍNDEX

Les malalties del segle xxi

Presentació .

J . Barquinero i J . Reventós

La tuberculosi? No s’havia eradicat? Cent anys del bacteri més persistent

P.-J . Cardona

Accions metabòliques de la vitamina D molt més enllà del que podíem imaginar fa uns anys .

A . Rabassa i J . Salas-Salvadó

Seqüenciació de nova generació i salut en el segle xxi

F . Vidal

L’envelliment, aproximació a un procés complex i heterogeni

A . Selva i M . Vilardell

Teràpies avançades: present i futur

J . Barquinero

El VIH, nou gens que han canviat la biologia i el món

M . Curriu, B . Clotet i J . Blanco

Usos de biomaterials i cèŀlules en regeneració de cartílag articular

J . Vives i F . Gòdia

La cardiologia del segle xxi

J . Brugada

La traducció genètica mitocondrial i malalties associades

T . Guitart i L . Ribas de Pouplana

Nanobiotecnologia i nanomedicina

J . Samitier

Les metàstasis o la clau per vèncer el càncer

R . R . Gomis

Biomarcadors de diagnòstic, pronòstic i predicció de resposta a tractaments oncològics

M . Rigau, M . Olivan, M . Llauradó, E . Colás, A . Doll i J . Reventós

PRESENTACIÓ

Jordi Barquinero i Jaume Reventós

Aquest volum 64 de la revista treballs de la scb és el primer que s’edita després de l’any del centenari de la Societat (1912-2012), i precisament l’any en què commemorem cent anys de l’aparició del primer número de la revista (1913) . Des de la SCB vam creure oportú revisitar la nova medicina, el desenvolupament espectacular que s’ha produït en les darreres dècades, que ha anat associat a una sèrie de desenvolupaments tecnològics i un coneixement cada vegada més profund del perquè i del com emmalaltim, i també sobre què podem fer per guarir i prevenir la malaltia . El món actual està patint profunds canvis que se succeeixen d’una manera cada vegada més ràpida i més caòtica . A més, en els darrers anys molts països del que es coneix com a Primer Món estan immersos en una greu crisi econòmica a la qual encara no es veu cap sortida . Les diferències entre els països més rics i els més pobres són cada vegada més grans . En aquests darrers, els avenços no arriben ni s’implementen amb la mateixa velocitat que en els primers . Així, en una gran part del món menys desenvolupat, els principals problemes sanitaris són encara les infeccions . Infeccions que, en la majoria de casos, són tractables o es poden prevenir . Contràriament, en el nostre entorn, un dels canvis més rellevants és l’augment progressiu en l’esperança de vida, que pràcticament s’ha doblat al llarg del darrer segle . Això no solament ha estat degut als avenços mèdics, sinó sobretot a les millores socioeconòmiques i la salut públi-

ca (tractament de les aigües, higiene, campanyes de vacunació, etc .) . Una conseqüència indefectible d’això ha estat el progressiu envelliment de la població, un fenomen que ha comportat un gran augment en la prevalença de càncer i de malalties degeneratives . Si bé és cert que han aparegut algunes malalties noves, el que han comportat els nous avenços i canvis socials ha estat principalment una transformació radical en la manera en què entenem la salut i la malaltia . Potser uns dels més emblemàtics han estat els derivats del coneixement cada vegada més precís del nostre substrat molecular, del nostre genoma . El primer mapa oficial del genoma humà es va fer públic l’any 2003, però els fruits d’aquest coneixement tot just ara comencen a ser visibles, i els canvis pràctics més importants han de produir-se amb tota seguretat en les properes dècades . La possibilitat de seqüenciar un genoma (o la part d’aquest que codifica proteïnes, l’anomenat exoma) humà sencer, o el d’un tumor i les seves metàstasis en molt poc temps i a un preu raonablement baix és ja molt propera i representarà un canvi de paradigma en la nostra visió de la salut i la malaltia . Un exemple del qual actualment es parla força és el que s’anomena medicina personalitzada, que ja s’està aplicant al diagnòstic i el tractament del càncer . D’altra banda, un coneixement apriorístic dels nostres genomes ens ha de permetre conèixer els riscs de transmetre malalties hereditàries a la nostra descendència, fet que a la llarga podria portar-nos a la pràctica eradi-

cació d’aquestes . No oblidem que aquestes malalties, que considerades individualment són rares, en el seu conjunt (n’hi ha més de set mil), afecten més del 5 % de la població mundial (6-8 % a Europa) . En aquest sentit, les perspectives de futur que ens apuntaven en la visionària peŀlícula Gattaca, escrita i dirigida el 1997 per Andrew Niccol, semblen cada vegada més a prop de la ciència i més lluny de la ficció . Pel que fa a les infeccions, no solament representen un greu problema sanitari als països menys desenvolupats . Les vacunes i les campanyes de vacunació han estat un dels avenços més importants que ha conegut la ciència mèdica, però infeccions com ara la tuberculosi o la grip, que han acompanyat els humans des de fa moltíssimes generacions, i que molta gent considera en el seu subconscient «controlades», són encara una amenaça . Altres infeccions, com ara la sida, semblen aparèixer de nou, encara que molt probablement han estat amagades, latents, esperant unes circumstàncies adequades per sortir a la llum . Els capítols dedicats a les malalties infeccioses ens mostren que aquesta idea del control, en molts aspectes i en moltes i extenses àrees del món, és encara un miratge i que les infeccions van i vénen, i que fins i tot als països més avançats constitueixen amenaces potencialment greus per a la nostra salut .

Hi ha molts altres exemples que la idea de progrés en ciència mèdica o en salut és en realitat feble . Ara mateix a l’horitzó s’esbossen desafiaments que indefectiblement afectaran la nostra salut, i que sovint han estat creats per la mà de l’home . La humanitat està patint una exposició a un nombre creixent de toxines ambientals, majoritàriament químiques però també radioactives, de conseqüències a llarg termini en molts casos desconegudes i imprevisibles, assistim a l’alteració o destrucció progressiva del medi ambient, a la contínua desaparició d’espècies vives, amb la consegüent pèrdua de biodiversitat, a un canvi climàtic en el qual cada vegada és més clara la contribució humana a la progressiva medicalització de les nostres vides o a un bioterrorisme globalitzat, entre d’altres exemples . Ateses les limitacions òbvies que té qualsevol intent de fer un recull de capítols sobre la nova medicina o les malalties del segle xxi, no ha estat la nostra intenció ser exhaustius ni tan sols sistemàtics . El que trobareu en aquest nou volum de treballs de la scb són unes simples pinzellades, traçades per especialistes en els diferents àmbits que es tracten, que ens han semblat representatives dels canvis que en aquest nou miŀlenni ja hem començat a veure .

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .131

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 9-18

LA TUBERCULOSI? NO S’HAVIA ERADICAT? CENT ANYS DEL BACTERI MÉS PERSISTENT

Pere-Joan Cardona

Unitat de Tuberculosi Experimental, Institut Germans Trias i Pujol, Universitat Autònoma de Barcelona i Universitat Oberta de Catalunya

Adreça per a la correspondència: Pere-Joan Cardona . Unitat de Tuberculosi Experimental, Institut Germans Trias i Pujol, Edifici Escoles . Crta . de Can Ruti, s/n . 08916 Badalona . Adreça electrònica: pjcardona@igtp.cat .

RESUM

Aquest treball pretén donar una visió de l’estat de la lluita contra la tuberculosi fa cent anys a Catalunya, bo i repassant-ne aspectes epidemiològics, de profilaxi i tractament de la malaltia . Igualment s’aprofundeix en les contribucions d’investigadors catalans en l’estudi de l’etiopatogènia: des de la teoria de la mutabilitat del doctor Ferran que porta al disseny de la vacuna antialfa, passant per la matisació que va donar a la teoria Ravetllat-Pla i la comercialització d’una nova teràpia basada en la utilització d’un sèrum específic contra la «forma d’atac» del bacil tuberculós, i a les observacions del doctor Conrad Xalabarder de les formes sense paret ceŀlular . Igualment es posen de manifest els reptes que encara romanen: el desconeixement del mecanisme d’infecció latent o d’inducció de la lesió més característica, la cavitat pulmonar . En aquest sentit es presenten les contribucions del nostre grup basades en la «hipòtesi dinàmica», que defensa la infecció com un procés continu de reinfecció endògena, que preveu la impossibilitat de generar vacunes que l’evitin, i que ha permès el disseny d’una vacuna terapèutica (la RUTI) per reduir el temps de la quimioteràpia .

Paraules clau: Mycobacterium tuberculosis, infecció tuberculosa latent, hipòtesi, dinàmica, vacuna, RUTI .

TUBERCULOSIS? IT WAS ERADICATED, WASN’T IT? A HUNDRED YEARS OF THE MOST PERSISTENT BACTERIUM

SUMMARY

This work pretends to offer a view on the fight against tuberculosis in Catalonia 100

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

years ago, summarizing aspects on its epidemiology, prophylaxis and treatment . It also explains the contribution of catalonian researchers in the study of its etiopathogenesis: The mutability theory of Dr . Ferran and the design of the anti-alpha vaccine . The refinement of this theory that led to the theory Ravetllat-Pla and the introduction of a new therapy based on the administration of specific serum against the attack form of the bacilli . And the studies of Dr . Conrad Xalabarder on the cell wall deficient forms . Furthermore, it is highlighted the challenges that still remain . The lack of knowledge on the mechanisms that led to latent tuberculosis infection or the induction of the most characteristic lesion: the pulmonary cavity . In this regard the contributions of our group in these fields are summarized . Mainly based in the “dynamic hypothesis”, that considers the infection as a continuous process of endogenous reinfection . This theory supports that the design of vaccines able to avoid it are impossible, and has been the bases for the design of the therapeutic vaccine RUTI, which will allow the reduction of chemotherapy treatment .

Key words: Mycobacterium tuberculosis, latent tuberculosis infection, dynamics, hypothesis, vaccine, RUTI .

LA TUBERCULOSI EL 1912 A CATALUNYA

La tuberculosi era una malaltia innombrable . A la ciutat de Barcelona el 1911 provocava 1 .851 casos de mort, és a dir, en una ciutat de 592 .500 persones, causava la mort del 0,351 % de la població anualment (la mortalitat global era d’un 2,4 %), precisament en el sector més productiu de la població, entre vint i trenta anys (Recolons, 1976) . Per fer-nos càrrec de l’impacte de què parlem, el percentatge de mortalitat que actualment causen les malalties respiratòries (essencialment malalties pulmonars obstructives cròniques, MPOC), és aproximadament un 0,11 % (la mortalitat global és d’un 0,9 %), amb la diferència que aquestes afecten un sector de la població envellida (Borrell et al ., 2011) . Justament quaranta anys després que el professor Robert Koch en pogués demostrar la causa etiològica, la malaltia ja s’havia desprès de l’aurèola romàntica que l’acompanyava, i va esdevenir la malaltia dels pobres i desvalguts, i alhora un instrument de transformació social de primer ordre . Identificat el problema de la transmissió per via aèria, associat

a l’amuntegament, la tuberculosi va esdevenir el motor de l’apertura d’amples avingudes (com la via Laietana), juntament amb la necessitat, és clar, de control policial dels moviments obreristes que podien controlar fàcilment amb barricades els estrets carrerons de Ciutat Vella . És per això que dos anys abans (el 1910) es feia a Barcelona el 1r Congrés Espanyol Internacional de Tuberculosi, on s’exposaren els últims avenços sobre la qüestió (Miret, 2012) . En la vessant més bàsica es discutí sobre la naturalesa del bacil mateix i la importància de les formes sense paret cellular; o l’existència de diferents bacils per a les tuberculosis humana, bovina o aviar . En la terapèutica, romania certa esperança, ja que s’explicà l’observació de lesions curades (fibrosades) en necròpsies de pacients que havien mort per altres causes, però encara hi havia un gran escepticisme quant a fórmules basades en immunoteràpies o quimioteràpies . El control de la malaltia es basava en el control de la transmissió, és a dir, en l’aïllament dels malalts en habitatges a l’aire lliure, i la confiança que la sobrealimentació i el repòs farien la resta . Però, és clar, això el qui s’ho podia permetre,

ja que encara faltava un any perquè el primer sanatori antituberculós a Catalunya, el de Torrebonica, s’inaugurés (1911) (Bàguena, 1992) . Tanmateix, en aquell congrés es proposaren mesures per millorar les condicions de vida dels obrers, habitatges, escoles, fàbriques, tallers . . . amb sol, ventilació, aigua i desaigües, tenint especial cura de la infància, esterilització de la llet, prohibició del treball infantil, colònies infantils, etc ., mesures totes ben acollides però poc operatives, atès que l’Administració no tenia ni estructures ni mitjans . Igualment es féu esment que els grans aliats de la tuberculosi eren l’alcohol, el tabac, la ignorància i la immoralitat de tota classe . A escala terapèutica, en aquell congrés també hi va haver molta participació en relació amb les intervencions quirúrgiques de les formes extrapulmonars . També es féu ressò de la prova de la tuberculina, que feia dos anys que von Piquert, basant-se en les experiències de Koch, havia estandarditzat mitjançant l’aplicació de gotes d’un extracte tuberculínic en escarificacions de la pell, com a una gran eina per diagnosticar els casos de malaltia tuberculosa, fet que posteriorment es va anar matisant en el sentit que no solament s’identificaven malalts sinó que també detectava pacients amb infecció latent . Igualment es va fer esment de la radiografia de tòrax com un mètode diagnòstic i de control del malalt de primer ordre . Aquell mateix any, el notable doctor Jaume Ferran assenyala a la Gaceta Médica Catalana la importància que la població adquireixi una bona immunitat contra la infecció, bo i basant-se en la seva teoria sobre la mutabilitat del Mycobacterium tuberculosis: «Una ciutat que elimini el bacil quedarà sense immunitat i si apareix un tuberculós provocarà una epidèmia . Tampoc no podrà prescindir dels microbis inofensius, que un dia originaran un bacil tuberculós» . I afegeix: «El bacil acidoresistent en

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 9-18

cultiu pur sempre origina una malaltia crònica amb formació de tubercles, mai una forma aguda mortal . Això és perquè el bacteri clàssic, que tots crèiem que era l’agent de la tuberculosi espontània, és només una de les nombroses varietats que conté l’organisme dels tuberculosos, totes derivades d’un sapròfit vulgar, no acidoresistent, de cultiu fàcil, desproveït de la característica resistència a l’àcid del bacil de Koch» . L’autor finalitza l’article amb un vehement «Jo tinc raó», que exemplifica el seu caràcter i augura els problemes que aquest li va provocar (Miret, 2012) . I és que ja el 1897, el doctor Ferran ja havia presentat a l’Acadèmia de Ciències de París la seva teoria sobre l’etiopatogènia de la tuberculosi, basada en l’evolució del bacil per una sèrie de mutacions regressives o ascendents, i identificava un total de cinc d’aquestes varietats baciŀlars . Una d’aquestes, un sapròfit vulgar, que va anomenar bacil alfa, fou la base de la vacuna que ell mateix va desenvolupar l’any 1897, amb la qual va començar a fer els seus primers assajos clínics vint-iun anys després a Alzira (Matilla, 1997; Climent i Cid, 1995) .

El Congrés de 1910, que es feia entre el 16 i el 22 d’octubre, es dugué a terme en els mesos posteriors a la mort del gran professor Robert Koch (el 27 de maig del mateix any), que acabà mig exiliat i progressivament apartat de la societat després de protagonitzar un dels rebomboris més sonats el 1890, durant el Congrés Mundial de Medicina a Berlín, en deixar entreveure que havia descobert un tractament que podria semblar prou eficaç contra la tuberculosi: la tuberculina, o el que llavors es va anomenar la «limfa de Koch» . Posterior ment, i tal com el professor Koch ja havia alertat sense que ningú no el cregués, es va veure que no era tan eficaç, tot i tenir la seva utilitat en formes incipients, i extrapulmonars, i això va fer que s’utilitzés a bastament fins a l’en-

trada dels antibiòtics, cap al 1950 (Vilaplana i Cardona, 2010) . En aquest sentit, mirant concretament el primer volum de treballs de la scb, de l’any 1913, s’observa que una de les comunicacions fou en relació amb la reactivitat cutània experimentada per la teràpia tuberculínica (Darder, 1913) .

I és que només un any després, el 1911, els doctors Jacint Raventós i Lluís Sayé, amb l’ajut del doctor Darder, posaven en marxa el primer dispensari antituberculós a l’Hospital Clínic, on es va començar a practicar la coŀlapsoteràpia, mitjançant l’aparell per fer pneumotòrax del doctor Forlanini . No fou fins l’any 1913 que els doctors Reventós i Sayé publicaven el llibre Tractament de la tuberculosi pulmonar pel pneumotòrax artificial, i van presentar els primers trentaquatre casos tractats per aquest procediment, i el doctor Sayé mateix llegia la seva tesi doctoral El pneumotòrax en el tractament de la tuberculosi . La primera intervenció per tractar la tuberculosi pulmonar, la toracoplàstia, no es va fer a Barcelona fins a l’any 1914, i la va dur a terme el doctor Puig Sureda (Miret, 2012) . Finalment, el 1912 hauria pogut ser transcendental per al control de la tuberculosi, si no fos perquè llavors la capacitat transversal de les ciències, com moltes altres vegades, fallà . Concretament dos estudiants de doctorat txecs, Hans Meyer i Josef Mally, sintetitzaven la molècula més important en el control de la tuberculosi: la isoniazida . Ho feren en un context purament acadèmic, en el pur exercici de la síntesi dels derivats hidrazínics dels acidopiridina-carboxílics . Llàstima que llavors a ningú no se li acudí d’avaluar-ne l’eficàcia contra el M. tuberculosis . Van caldre encara quaranta anys més per descobrir-ne la utilitat! (McDermoth, 1969) .

UNA ESCOLA CATALANA CONTRA LA TUBERCULOSI? DE FERRAN A XALABARDER

Si bé és ben coneguda la feina portada a terme pel doctor Lluís Sayé en la introducció de la vacuna BCG a Catalunya i l’Estat espanyol, juntament amb el doctor Pere Domingo, que es van encarregar de produirla al Laboratori Municipal de Barcelona des del 1924 (Subira, 1998) (producció que el va sobreviure i va durar fins a l’any 1994), es tendeix a menysprear la contribució que podríem qualificar de més genuïnament catalana en la recerca contra la tuberculosi . I probablement això és degut al fet que el seu iniciador, el doctor Jaume Ferran, era el que avui podríem qualificar d’un «mal comunicador», amb una personalitat tirant a irascible . Tal com s’ha assenyalat prèviament, el doctor Ferran va distingir fins a cinc formes del bacil, que va qualificar de sapròfites (de la alfa a la èpsilon, i la forma gamma era el bacil descrit per Koch), i que reflectien una realitat que encara avui no se sap quina importància patogènica pot tenir: la de la pèrdua de la característica resistència a la decoloració àcida d’un percentatge important dels bacils de M. tuberculosis que romanen a les lesions tuberculoses . Aquest és un fet confirmat per diversos autors (Miller, 1932; Mattman, 2000; Beran, 2006; Markova et al ., 2012), i apareix de manera recurrent en la literatura, atès que podria explicar la manca de resposta als antibiòtics, i per tant la dilatació en l’administració temporal, el problema més important en el control d’aquesta malaltia avui dia . La presència de formes no-acidoalcohol resistents als teixits infectats també va intrigar un deixeble del doctor Ferran: el doctor Ravetllat, veterinari de Salt (Bague, 1984) . El doctor Ravetllat distingia tres formes en el cicle vital del bacil tuberculós: el bacil d’atac, l’intermedi o transitori, i el ba-

cil de Koch . Segons Ravetllat, el bacil d’atac era el responsable del procés infecciós, present als teixits infectats i que havia perdut la seva coloració acidoalcohol resistent . Avui dia desconeixem si la forma d’atac i el bacil alfa eren els mateixos; en tot cas, en ambdós casos coincidia la característica del seu bon creixement in vitro, però en diferia la forma . En el cas de Ferran es caracteritzaven com a bacils colitífics (Matilla, 1977), mentre que en el cas de Ravetllat es descrivien com a formes coccàcies, molt més d’acord, val a dir, amb les descripcions que s’han fet posteriorment del bacil que ha perdut la paret ceŀlular, i per tant la seva acidoalcohol resistència (Markova et al., 2012) . Fou cap a l’any 1919 que el doctor Pla i Armengol, metge especialitzat en tuberculosi, i de l’Acadèmia i Laboratori de Barcelona, s’interessà per les investigacions de Ravetllat, van confrontar treballs propis, els van repetir junts i separats, i van acabar fundant la «teoria Ravetllat-Pla» (Bagué, 1984; Pla, 1931) . Com a resultat d’aquests estudis, comencen a treballar en la investigació per obtenir un sèrum a partir de vint-isis cavalls immunitzats amb aquesta forma coccàcia . Malauradament, Ravetllat mor el 1923, com a conseqüència d’un càncer, i deixa inconclusa l’obtenció del sèrum i de l’hemoantitoxina . Els seus hereus van entrar en contacte amb el doctor Pla i van donar peu a crear l’Institut Ravetllat-Pla a Barcelona, que començà amb el trasllat dels vint-i-sis cavalls destinats a l’obtenció del sèrum (Bagué, 1984) .

El doctor Ramon Pla i Armengol, a partir de l’any 1924, un any després de la sobtada mort del doctor Ravetllat, i posteriorment la seva filla, la doctora Núria Pla, des del 1940 al 1980 foren els impulsors d’aquesta teràpia, que va tenir un enorme èxit a Amèrica del sud, a l’Estat espanyol i diversos països europeus, especialment Portugal i Bèlgica . Gran part d’aquest èxit fou l’exemplar rela-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 9-18

ció comercial que van saber teixir amb els metges d’aquests països i el suport que els van proposar per a la realització d’assajos clínics i comunicacions científiques (Lugo, 2012) . Mentrestant, el doctor Conrad Xalabarder, responsable de l’obra antituberculosa de La Caixa, els Dispensaris Blancs, va introduir el primer microscopi electrònic a l’Estat espanyol el 1950, i va contribuir a aquesta línia de recerca bo i comprovant que aquestes formes coccàcies no eren sinó bacils tuberculosos que havien perdut la seva paret ceŀlular i que per això perdien les seves propietats tincionals . Es tractava d’unes formes L ja observades en altres microorganismes sotmesos a ambients estressants, com el que es pot trobar a l’interior d’una lesió tuberculosa (Xalabarder, 1958) . El doctor Xalabarder també es va immergir en el terreny de la quimioteràpia, convençut que les sals de sofre tenien una activitat tuberculicida important . D’aquesta manera preparava les seves pròpies teràpies a base de tiosulfat sòdic, o fins i tot produint la combinació ISE, és a dir, incorporant un radical sulfat a les molècules d’isoniazida i etambutol (Miret, comunicació personal) .

RETORN AL FUTUR:

QUÈ PENSARIEN ELS NOSTRES

PREDECESSORS CIENTÍFICS DE L’ESTAT ACTUAL DE LA TUBERCULOSI?

En primer lloc caldria esperar que demostrarien una gran sorpresa pel caràcter residual, almenys mediàticament, que té la malaltia, en favor del càncer, la sida, o fins i tot la malària! Cal recordar que el 1912 encara hi havia malària a Catalunya, sobretot als aiguamolls de l’Empordà i del delta de l’Ebre . En aquest sentit, una de les grans tasques de la Mancomunitat catalana, que es crearia el 1914, era la de patrocinar la llui-

ta contra l’eradicació de la malària, tasca a bastament més assumible que l’eradicació de la tuberculosi . De fet, la tuberculosi va acabar matant l’honorable Enric Prat de la Riba, president de la Mancomunitat, l’any 1918 . . .

Després mirarien les estadístiques i veurien en primer lloc que aquestes es basen en la incidència de la malaltia, i no en la mortalitat; i fins i tot en aquest cas trobarien que la incidència a Barcelona és terriblement baixa, tan sols 35 de cada 100 .000 habitants . Immediatament, però, s’adonarien que tenim una de les taxes més altes d’Europa . . ., i que en tot cas la malaltia no ha fet sinó augmentar en nombres absoluts a escala mundial . S’adonarien que la gran solució d’aquesta malaltia es basa en una tàctica ben senzilla: el tractament directament observat . Patrocinat per una organització que vetlla per la salut a escala mundial, l’OMS (aquest fet també els interessaria força, atès que l’OMS es va fundar l’any 1948) . Aquesta tàctica fa que calguin molts recursos per assegurar-lo, recursos que no existeixen i que fan ja poc creïble l’objectiu de reduir la incidència fins a un 50 % el 2050 (OMS, 2012) . En tercer lloc veurien que no hi ha sanatoris, ni dispensaris, però veurien com els pneumotòraxs i les toracoplàsties encara s’apliquen, encara que lluny d’aquí, a països com Rússia o l’Índia, on el fenomen de la multiresistència del bacil tuberculós fa estralls . I llavors valorarien l’enorme eficàcia del tractament quimioteràpic: només sis mesos de tractament! I el fet que la gent no ma lalta positiva per a tuberculina també es tracta, durant 6-9 mesos, això sí, només amb un fàrmac . Però també acabarien entenent l’enorme despesa logística que significa i que constitueix una de les raons del fracàs del control d’aquesta malaltia .

En revisar l’estat de la recerca, veurien astorats com un nou tipus de resposta im-

munitària, la ceŀlular, és la responsable del control de la infecció, i com la producció d’anticossos, en la qual tant creien, té un paper molt secundari . Encara que també veurien com la immunitat ceŀlular és força limitant, ja que no és capaç d’evitar que els individus ens infectem . De fet, el perquè d’aquest procés ja el podrien haver deduït, ja que hi ha articles del 1916 (Wang, 1916) a partir dels quals ja es pot intuir que això és degut al fet que el bacil infecta els macròfags alveolars, i com que es divideix molt lentament (cada 24 h), ho fa tan discretament que el macròfag infectat és incapaç de generar la resposta inflamatòria suficient per alertar els limfòcits específics que l’activaran per poder destruir el bacil del seu interior . Només quan s’ajunten un grup suficient d’aquests macròfags, i generen un petit granuloma, és quan aquests limfòcits troben el seu objectiu . Però aleshores la infecció ja ha tingut lloc, ja és massa tard! (Cardona i Ivanyi, 2011) . O sigui, que restarien doblement astorats; en primer lloc de saber que hi ha una resposta immunitària que controla la població baciŀlar que és de tipus ceŀlular; en segon lloc perquè durant noranta anys s’ha aplicat una vacuna, la BCG, que és capaç de generar aquesta resposta, però igualment no s’evita la infecció . Imagineu les seves cares quan sabessin que a més, quan s’ha volgut millorar aquesta vacuna, no ha estat possible superar-la, i que per tant els investigadors actuals tornen la mirada a mecanismes que ells, els científics del segle passat, ja havien estudiat, concretament a la resposta que ara anomenem innata, i que es basa en l’activació inespecífica d’aquests macròfags alveolars . En aquest sentit, el nostre grup de recerca ha volgut contribuir a aquest coneixement, generant la «hipòtesi dinàmica» de la infecció tuberculosa latent (vegeu la figura 1), contraposada a la hipòtesi clàssica (Cardona, 2009), i donant lloc a la formació d’una

Figura 1. Cicle evolutiu de la infecció per Mycobacterium tuberculosis basat en la «hipòtesi dinàmica». L’entrada del bacil a l’alvèol pulmonar es caracteritza per la infecció del macròfag alveolar, on creix, i on, en generar una quasi inexistent resposta inflamatòria, quan en causa la necrosi, els bacils simplement infecten els macròfags dels alvèols adjacents, sense haver de generar cap lesió. Aquesta fase, que hem batejat com a fase uniceŀlular de la infecció (i) permet al bacil una impunitat quasi total quant a provocar noves infeccions o reinfeccions fins i tot en els hostes amb la millor de les respostes immunitàries. Simplement perquè, en no generar una resposta inflamatòria prou important, és impossible de localitzar per als limfòcits específics. Posteriorment, un cop s’ha generat una resposta inflamatòria prou important, a causa de la proximitat de diferents macròfags infectats, ja hi ha una contigüitat entre el compartiment aeri i intersticial de l’alvèol, i per tant hi ha la possibilitat del drenatge de bacils cap al nòdul limfàtic regional, on tindrà lloc la presentació antigènica i la proliferació de limfòcits específics (ii). Aquests limfòcits passaran als vasos eferents i arribaran al costat dret, des d’on passaran al pulmó. En localitzar les lesions gràcies a la resposta inflamatòria, podran activar els macròfags infectats i destruir la majoria dels bacils (vora un 90 %), i la resta quedarà en un estat no replicatiu (iii). Un cop controlat el creixement, s’esdevé la neteja dels detritus ceŀlulars i la transformació consegüent dels macròfags en macròfags alveolars. Aquestes cèŀlules també poden fagocitar bacils no replicatius immergits en el teixit necròtic (iv). D’aquesta manera els drena juntament amb ells mateixos, i formen part del líquid alveolar que és conduït progressivament cap als bronquis superiors, faringe, i posteriorment tracte gastrointestinal, i duen a terme el drenatge definitiu. Ara bé, part d’aquests bacils s’inclouen en els aerosols generats als bronquiols terminals, fet que els permetrà reinfectar de nou el parènquima i refer el cicle (v). Aquest cicle es pot estroncar gràcies a l’encapsulació i aïllament del granuloma, amb la participació dels septes intralobars, i generaran la calcificació posterior del teixit necròtic, i per tant, dels bacils no replicatius del seu interior (iv b); o bé generar-se un recreixement dins dels macròfags escumosos dins del granuloma, fet que comporta l’arribada desmesurada de neutròfils, base per a la inducció de lesions cavitades (ivc). Extret de Cardona (2009) i Cardona i Ivanyi (2011).

companyia biotecnològica (Archivel Farma, SL) que té cura del desenvolupament d’una vacuna terapèutica, la vacuna RUTI, destinada a reduir el temps d’administració del tractament antibiòtic (Vilaplana, 2010) .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 9-18

Quina paradoxa, després de tant de temps, tornar de nou a vacunes terapèutiques (com la tuberculina) per millorar el que ha estat l’autèntica revolució en el control de la tuberculosi: la quimioteràpia . Actualment, la vacuna RUTI es troba a punt per iniciar el final del seu desenvolupament clínic, la fase iii . Valorant aquest cas de transferència de tecnologia, els nostres avantpassats es farien creus de les exigències regulatòries i els elevats estàndards de qualitat necessaris per portar un fàrmac al mercat . Així doncs, quan aprofundissin una mica més veurien que tampoc no sabem massa bé per on anem, ja que encara no sabem explicar de manera fefaent per què es genera la infecció latent, i per què aquesta es pot transformar en tuberculosi activa!

PERÒ, PER QUÈ PATIM TUBERCULOSI?

Per això, els nostres visitants del passat es posarien nerviosos i ens farien la pregunta clau: però, per què patim tuberculosi? En realitat, si el bacil de Koch és capaç de mantenir-se tant de temps als teixits és un problema relatiu . Hi ha molts virus que ja tenen aquesta propietat . El problema és que un 10 % dels pacients amb infecció latent pateixen la malaltia . I aquest no és el principal interrogant . . . En realitat hi ha un 50 o 60 % d’aquests casos en què es pot explicar per què s’ha desenvolupat la malaltia . Una immunodepressió ho fa possible, i depèn de la intensitat d’aquesta que hi hagi més o menys probabilitats que hi hagi aquest creixement baciŀlar i la destrucció de teixits que ocasioni un quadre clínic . Ara bé, hi ha un percentatge important que genera un tipus de lesió típica: la cavitat tuberculosa, paradigma clínic d’aquesta malaltia en l’adult . Paradoxalment, per generar aquesta lesió es requereix una resposta inflamatòria important . En aquest sentit el nostre equip fa anys que intenta entendre aquest procés més enllà del concepte clàssic d’infecció, basat en la presència d’una lesió antiga als lòbuls pulmonars superiors que ressuscita com a conseqüència d’un procés d’immunodepressió local (Cardona, 2009; Cardona i Ivanyi, 2011) . El que sembla clar és el tropisme del bacil pels lòbuls superiors, on hi ha menys irrigació capiŀlar, i això provoca no tan sols un increment en la concentració d’oxigen (a causa del menor intercanvi de gasos), sinó que a més hi hagi menys vigilància immunitària . D’aquesta manera sembla que, en actuar, el sistema immunitari veuria una concentració baciŀlar excessiva, fet que provocaria una resposta inflamatòria desmesurada (Cardona, 2011) . Però en la pràctica no tot és tan senzill, ja que hi ha un problema mecànic important: com

fer que una lesió de 0,5 mm es converteixi en una de 20 mm (vegeu la figura 2) . En aquest sentit som a les beceroles: encara no sabem per què es dóna aquest procés . Actualment, el nostre grup també està treballant activament en l’estudi d’aquest enigma, i almenys disposem d’un model experimental que permet reproduir la generació d’aquesta «superlesió» de manera satisfactòria, per la qual cosa en podem dissecar la fisiopatologia (Marzo, 2012) . Pels resultats preliminars, tot plegat sembla indicar que hi ha un tipus de resposta de l’hoste (per tant, una característica genètica) que provocaria una entrada de neutròfils més important de l’habitual, fet que ocasionaria a la vegada un increment en la formació de macròfags escumosos, que en ser drenats i permetre el recreixement baciŀlar interior a la perifèria de la lesió generaria l’engrandiment del granuloma en qüestió de dies (vegeu la figura 1) . Ara bé, també és cert que cal que hi hagi una acumulació local de diferents lesions per poder fer una lesió tan grossa (vegeu la figura 2) en qüestió de dies . Aquest aspecte es veuria afavorit als lòbuls superiors a causa de la menor irrigació capiŀlar que també ocasionaria menys drenatge de bacils cap als nòduls limfàtics . En tot cas, aquest mecanisme, encara en estudi, s’integra perfectament en el concepte d’«hipòtesi dinàmica» de la infecció latent, basada en la constant reinfecció endògena . Quan aquesta té lloc als espais pulmonars superiors, hi hauria la possibilitat que en donar-se aquestes particularitats (hoste predisposat i acumulació de lesions) es pugui generar aquest tipus de lesió tan gran, i així burlar els mecanismes de fibrosi i encapsulament de les lesions (vegeu la figura 1), que són molt potents a l’hora d’evitar l’engrandiment de les lesions (Cardona i Ivanyi, 2011) .

CONCLUSIÓ: CENT ANYS DE RECERCA EN TUBERCULOSI. ESTEM BÉ, PERÒ NO TANT

Lamentablement, el 2112, la SCB haurà de tornar a demanar un nou article sobre l’estat de la tuberculosi, i un científic que encara no ha nascut farà una valoració prou desapassionada del problema . Segurament es queixarà de la lentitud del bacil . D’aquesta manera no podem anar bé . . . No es pot ser tan lent, tan sigiŀlós . Seguirem tenint una vacuna basada en la immunitat ceŀlular; segurament hi haurà teràpies que en reduiran el temps de tractament basades en la combinació de quimioteràpia, vacunes terapèu-

tiques, i immunomoduladors . Però de nou hi haurà el problema logístic que farà que en algun lloc del món es baixarà la guàrdia per qualsevol crisi que impliqui una reducció de l’atenció sanitària . . ., és a dir, que es considerarà la tuberculosi com una infecció molt difícil d’eradicar, molt persistent, gràcies a la seva discreció, i seguirà causant estranyesa en la gent que es diagnostiqui, que seguirà preguntant:

«Tuberculosi? No s’havia eradicat?»

Tant de bo m’equivoqui! Per molts anys, SCB!

AGRAÏMENTS

A la doctora Cristina Vilaplana per la seva revisió crítica .

BIBLIOGRAFIA

Alomar, J . (1913) . «La fixació del complement en la tuberculosi experimental» . Treb. Soc. Cat. Biol., 1: 240-247 .

Bagué, N . (1984) . «Aproximació a la vida i l’obra de Joaquim Ravetllat i Estech (1872-1923)» . Llull, 7: 3-24 .

Baguena, M . J . (1992) . La tuberculosi i la seva història . Barcelona: Fundació Uriach 1838

0,5 mm, d21 8 mm, d33 2 mm d30 1 mm d28

Figura 2. Inducció de les lesions cavitades. El gran interrogant de la inducció d’aquest tipus de lesions és com un granuloma de 0,5 mm es pot convertir en una cavitat de 20 mm (a). La resposta es troba en el model del ratolí C3HeB/FeJ. En aquest model en 21 dies s’indueixen les lesions de 0,5 mm; aquestes multipliquen la seva grandària per 2 en 7 dies, per 4 en 10 dies i per 8 en 12 dies. La conjunció de diverses lesions juntes fa que acabin desenvolupant-ne una de grossa de 20 mm (b).

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 9-18

Beran, V [et al ] (2006) «Cell wall deficient forms of mycobacteria: a review» Vet. Med., 7: 365-389

Borrell, C [et al ] (2011) Natalitat i mortalitat a la ciutat de Barcelona. Informe 2000-2008 Barcelona: Agència de Salut Pública

Brock, T D (1999) Robert Koch. A life in Medicine and Bacteriology Washington, DC: ASM Press

Cardona, P J (2009) «A dynamic reinfection hypothesis of latent tuberculosis infection» Infection, 37: 80-86

Cardona, P J (2011) «A spotlight on liquefaction: evidence from clinical settings and experimental models in tuberculosis» Clin. Dev. Immunol , 868246

Cardona, P J ; Ivanyi, J (2011) «The secret trups, impelling the pathogenicity of tubercle bacilli» Enf. Infecc. Microbiol. Clin., 29 (supl 1): 14-19

Climent, F . I .; Cid, J . (1995) . Trets biogràfics del Dr. Jaume Ferran i Clua . Tortosa: Fundació Dr . Ferran . Darder, J . (1913) . «Reaccions tuberculíniques cutànies» . Treb. Soc. Cat. Biol., 1: 229-239 .

Lugo, S . (2012) . Ciencia, industria e idelogía desde la Cataluña del siglo xx . La heterodoxia incluyente del Instituto Ravetllat-Pla (1919-1936) . Universitat Autònoma de Barcelona . [Tesi doctoral]

Markova, N . [et al .] (2012) . «Unique biological properties of Mycobacterium tuberculosis L-form variants: impact for survival under stress» . Intern. Microbiol ., 15: 61-68 .

Marzo, E . [et al .] (2012) . «Characterization of a new model of active TB in mice . Usefulness of anti-inflammatorytherapy in thetreatment of TB» . A: Tuberculosis 2012 . París: Institut Pasteur .

Matilla, V . (1977) . Jaime Ferran y su obra . Madrid: Instituto de España .

Mattman, L . H . (2000) . Cell wall deficient forms: Stealth pathogens . Taylor & Francis .

McDermott, W . (1969) . «The story of INH» . J. Infect. Dis ., 119: 678-683 .

Miller, F . R . (1932) . «The induced development of non-acid-fast forms of bacillus tuberculosis and other mycobacteria» . J. Exp. Med., 56: 411-424 .

Miret, P. (2012) . La tuberculosi a Catalunya, des del segon terç del segle xix , a la meitat del segle xx . Universitat de Barcelona . [Tesi doctoral]

OMS (2012) . Global Tuberculosis Control 2011 . Ginebra: OMS .

Pla, R . (1931) . «Die verschiedenen Formen des tuberkuloseerregers» . Beitr. Kin. Tuberk., 77: 47-55 .

Recolons, L . (1976) . La població de Catalunya: Distribució territorial i evolució demogràfica: 1900-1970 . Barcelona: Institut d’Estudis Catalans .

Subirà, M (1998) Pere Domingo: Semblança biogràfica Barcelona: Institut de Estudis Catalans

Vilaplana, C [et al ] (2010) «Double-blind, randomized, placebo-controlled Phase I Clinical Trial of thetherapeutical antituberculous vaccine RUTI» Vaccine, 28: 1106-1116

Vilaplana, C ; Cardona, P J (2010) «Tuberculin immunotherapy: its history and lessons to be learned» Microbes Infect., 12: 99-105

Wang, C Y (1916) «An experimental study of latent tuberculosis» The Lancet, 11: 417-419

Xalabarder, C . (1958) . «Electronmicroscopy of tubercle bacilli» . Excerpta Med. Sect. XV Chest. Dis., 11: 467-473 .

SOBRE L’AUTOR

Pere-Joan Cardona. Metge especialista MIR en microbiologia clínica i doctor en medicina per la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), és cap de la Unitat de Tuberculosi Experimental de l’Institut Germans Trias i Pujol (IGTP) i professor associat del Departament de Genètica i Microbiologia de la UAB des del 2001 . Després de la seva formació a la Colorado State University (1995-1996), es dedica a l’estudi de la tuberculosi en la seva vessant més immunopatològica a través de models experimentals in vitro, in vivo i in silico, i utilitzant teixits d’origen humà . Revisor de diverses revistes especialitzades internacionals, és editor del llibre Understanding tuberculosis; autor de cinc capítols de llibre i de setanta articles revisats per experts (índex h = 21) . Igualment és editor acadèmic de la revista PLOS One des de 2009 . És autor de set patents d’invenció, quatre de les quals es refereixen a la vacuna RUTI, la primera vacuna terapèutica contra la tuberculosi latent . Per desenvolupar aquesta vacuna, va fundar l’any 2000 una escissió a Badalona, Archivel Farma, i hi va coŀlaborar com a director científic i mèdic . Actualment la vacuna RUTI està fent tràmits per iniciar la fase iii de desenvolupament clínic .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 9-18

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .132

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013) , p. 19-28

ACCIONS METABÒLIQUES DE LA VITAMINA D MOLT MÉS ENLLÀ DEL QUE PODÍEM IMAGINAR FA UNS ANYS

Antoni Rabassa 1 i Jordi Salas-Salvadó 1, 2, 3

1 Unitat de Nutrició i Dietètica, Hospital Universitari Sant Joan de Reus, IISPV, Universitat Rovira i Virgili

2 Unitat de Nutrició Humana, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, IISPV, Universitat Rovira i Virgili

3 CIBERobn Fisiopatologia de la Obesitat i Nutrició, Institut de la Salut Carles III

Adreça per a la correspondència . Jordi Salas-Salvadó . Unitat de Nutrició Humana, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili . C . de Sant Llorenç, 21 . 43201 Reus . Tel .: 977 759 313 . Adreça electrònica: jordi.salas@urv.cat .

RESUM

La vitamina D és una peça clau en la regulació de l’homeòstasi mineral, protegeix la integritat de l’os i modula el creixement, i la seva deficiència és un problema de salut pública avui dia . Fora de l’os la vitamina D també ha estat associada amb efectes metabòlics, i s’han publicat en els últims anys múltiples estudis que demostren la relació de nivells baixos de vitamina D i obesitat . La concentració de vitamina D està associada a adipositat, però diversos estudis suggereixen que la deficiència de vitamina D pot ser un factor independent relacionat amb la patogènesi de comorbiditats associades a l’obesitat . En aquest article volem revisar la fisiopatologia de la deficiència de la vitamina D amb la seva associació amb l’obesitat i el paper que en representa el dèficit en les comorbiditats relacionades amb l’obesitat . Paraules clau: vitamina D, obesitat, PTH, síndrome metabòlica .

METABOLIC ACTIONS OF THE VITAMIN D MUCH MORE THAT COULD BE TO IMAGINE A FEW YEARS AGO

SUMMARY

The vitamin D is key in the regulation of the mineral homeostasis, protecting the integrity of the bone and modulating its growth . Its deficiency is currently a public health problem . Out of the bone the vitamin D has been associated with metabolic effects . Recent

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

studies have demonstrated the relation between low levels of vitamin D and obesity . The concentration of vitamin D is associated with adiposity, but several studies suggest that the deficiency of vitamin D can be an independent factor related to the pathogenesis of comorbidities associated with the obesity . In this article, the pathophysiology of vitamin D deficiency and its association with obesity and comorbidities related with obesity are reviewed .

Key words: vitamin D, obesity, PTH, metabolic syndrome .

INTRODUCCIÓ

L’obesitat és una malaltia multifactorial i crònica, de gran transcendència sociosanitària i econòmica, que representa un problema de salut pública . Segons dades de la darrera Enquesta de Salut a Catalunya la meitat dels catalans de 18 a 74 anys té excés de pes (el 36,6 % sobrepès i un 13,9 % obesitat) . El sobrepès i l’obesitat s’associen amb un augment de la morbimortalitat . Aquest increment està relacionat amb el grau d’obesitat, i es detecta en aquests individus un augment del risc de patir diferents malalties, com ara alteracions en el metabolisme dels hidrats de carboni, hipertensió arterial, malaltia coronària, insuficiència venosa, síndrome de l’ovari poliquístic, artrosi, síndrome d’apnea de la son, litiasi biliar, esteatosi hepàtica, augment de prevalença de determinats tipus de neoplàsies, etc .

La vitamina D és una peça clau en la regulació de l’homeòstasi mineral, ja que protegeix la integritat de l’os i en modula el creixement, a més d’estar implicada en la diferenciació ceŀlular en una àmplia varietat de teixits . La seva deficiència podria ser també considerada un problema de salut pública (Mithal et al., 2009) .

La deficiència de vitamina D va ser descoberta com a causa de fractures en individus amb baixa exposició a radiacions ultraviolades i que seguien dietes amb contingut pobre de vitamina D . Aquesta malaltia és encara endèmica a escala mundial i afecta grans àrees geogràfiques del món

(Prentice, 2008) . Està àmpliament demostrat que la suplementació de vitamina D i calci disminueix el risc de fractures degudes a osteoporosi .

Però, fora de l’os, quin paper té la vitamina D? El receptor de la vitamina D està expressat en diferents teixits i òrgans i aproximadament el 3 % del genoma humà està sota control de la 1,25-dihidroxivitamina D (Holick et al., 2007) . Això fa pensar que la vitamina D podria tenir efectes importants fora del teixit ossi, i modula altres funcions metabòliques de l’organisme .

En els últims anys s’han publicat múltiples estudis que demostren la relació entre obesitat i nivells baixos de vitamina D (Goldner et al., 2008; Rodriguez-Rodriguez et al., 2009; Stein et al., 2009) . La concentració de vitamina D està associada a adipositat, però diversos estudis suggereixen que la deficiència de vitamina D pot ser un factor independent relacionat amb la patogènesi de comorbiditats associades a l’obesitat (revisat per Muldowney i Kiely, 2011) .

En aquest article volem revisar la fisiopatologia de la deficiència de la vitamina D amb la seva associació amb l’obesitat i el paper que en representa el dèficit en les comorbiditats relacionades amb l’obesitat .

FISIOPATOLOGIA DE LA VITAMINA D I L’HORMONA PARATIROÏDAL

El calci s’absorbeix fonamentalment al

duodè i el jejú . La capacitat d’absorció està condicionada per la biodisponibilitat del calci present en la dieta i per la quantitat mateixa de calci ingerit . Aquest es troba principalment en làctics i derivats, i també en vegetals, on l’àcid fític i els oxalats es fixen al calci, i en disminueixen la disponibilitat (Marsh et al., 1999) . En circumstàncies normals s’absorbeix un 30 % del calci present en la dieta . Les dietes baixes en calci, el dèficit de vitamina D i malalties que afectin el duodè i jejú són les causes més freqüents de dèficit d’absorció de calci .

La síntesi de vitamina D activa s’inicia amb la radiació ultraviolada sobre la pell, i produeix previtamina D3, que és convertida a vitamina D3 (colecalciferol) . Aquesta vitamina D3 i part de l’absorbida de la dieta són hidroxilades en la posició 25 al fetge per formar 25-hidroxi-D3 o calcidiol, que és la forma principal de vitamina D circulant . El calcidiol és hidroxilat per un enzim renal, estimulat per l’hormona paratiroïdal (PTH), la hipocalcèmia i la hipofosfatèmia, i forma la 1α,25-dihidroxivitamina D (calcitriol), que és la forma més activa de la vitamina D, encara que amb uns nivells plasmàtics molt menors respecte al calcidiol (vegeu la figura 1) .

En el metabolisme de la vitamina D, la PTH té un paper important . La PTH és un polipèptid sintetitzat per les glàndules paratiroides . Dintre de les seves funcions destaca l’estímul per facilitar l’absorció de calci, fosfat i vitamina D al budell, augmentar la resorció de calci de l’os mitjançant l’estímul dels osteoclasts, reduir l’excreció de calci a escala renal, així com induir la formació de calcitriol als ronyons

El calcitriol actua en els mateixos teixits que la PTH, però amb mecanismes d’acció diferents . Al budell el calcitriol estimula la síntesi de proteïna fixadora de calci, i també estimula l’absorció de calci i fosfat (Reichel et al., 1989; Norman et al., 1982) . En augmen-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

tar les concentracions sèriques de calci i fosfat, el calcitriol promou el depòsit d’hidroxiapatita a l’os i de manera paradoxal també mobilitza calci de l’os ja format . El calcitriol inhibeix la síntesi de pre-pro-PTH . Hi ha receptors de calcitriol en nombrosos teixits a més de l’os, ronyó i budell, i se’n troben en glàndules paratiroides, illots pancreàtics, glàndula mamària, fibroblasts i altres teixits que no es coneixen com a diana del calcitriol (DeLuca et al., 1990) . El calcidiol té una vida mitjana llarga i nivells estables en el plasma, amb un rang normal de 38 a 125 nmol/l, per la qual cosa la determinació és d’utilitat clínica major . La principal aplicació de la determinació dels nivells de calcidiol és la valoració del metabolisme de la vitamina D: els valors baixos reflecteixen deficiència de vitamina D o malaltia hepàtica severa, però també es poden trobar en la gestació, l’hipertiroïdisme i durant el tractament amb anticomicials . Hi ha menys experiència amb la determinació de calcitriol . Els seus nivells estan regulats d’una manera diferent que el calci-

Figura 1. Metabolisme de la vitamina D.

diol; l’interval de normalitat està entre 43 i 150 pmol/l i varia en funció de l’estació de l’any (valors més baixos durant l’hivern), l’edat (menor en persones d’edat avançada) i els nivells de calci plasmàtic . La PTH augmenta la concentració de calcitriol quan la funció renal està intacta, de manera que la determinació de calcitriol és útil en el diagnòstic diferencial de la hipercalcèmia (MacIntyre et al., 1987) .

La deficiència de vitamina D (vegeu la taula 1) pot ser conseqüència d’una ingesta insuficient o d’una disminució de l’absorció a escala intestinal . També pot ser deguda a interferències en la seva metabolització per determinats fàrmacs (difenilhidantoïna, fenobarbital o rifampicina) o per falta d’exposició a la llum solar, i aquesta és una de les causes més freqüents de deficiència adquirida de vitamina D en països nòrdics .

L’hiperparatiroïdisme secundari és el resultant de l’adaptació hormonal induïda per una altra malaltia . Per exemple, en la insuficiència renal crònica, hi ha diversos factors que contribueixen a l’estimulació anormal de la funció paratiroïdal . La disminució en la formació de calcitriol produeix menys absorció de calci, i la pèrdua de parènquima renal ocasiona hiperfosfatèmia, i aquesta juntament amb la hipocalcèmia produeix hiperparatiroïdisme . Altres causes menys freqüents d’hiperparatiroïdisme són la resistència renal i òssia a la PTH i els trastorns intestinals que produeixen malabsorció de vitamina D i calci .

VITAMINA D I OBESITAT

La relació entre la deficiència de vitamina D i l’obesitat ha estat sempre relacionada amb les tècniques de cirurgia bariàtrica a què són sotmesos els pacients seleccionats amb obesitat mòrbida . No obstant això, nivells plasmàtics baixos de vitamina D

ja poden aparèixer en el pacient abans de la realització d’un procediment de cirurgia malabsortiva .

Els nivells de vitamina D varien segons l’altitud, latitud i estacionalitat com a resultat de les diferències en l’exposició solar . Per aquest motiu, la troballa de més incidència de malaltia cardiovascular en zones amb menys exposició solar va fer pensar en una possible relació entre els diferents factors de risc cardiovascular i la vitamina D (Michos et al., 2008; Zittermann et al., 2005) . Aquests factors de risc estan també directament relacionats amb l’obesitat, com bé demostren els estudis poblacionals, ja que la mortalitat augmenta de manera exponencial a partir d’un IMC de 25 kg/m 2 i que les persones amb un IMC ≥ 30 kg/m 2 tenen un increment del 50-100 % en la mortalitat total i cardiovascular (Salas-Salvadó et al., 2007) . També s’ha estimat, a partir de l’estudi Framingham, que aconseguir mantenir un pes òptim en el temps contribuiria a reduir en un 25 % la incidència de malaltia coronària i en un 35 % el de malaltia cerebrovascular (Visscher et al., 2001) .

Diferents estudis han mostrat l’existència d’una correlació negativa entre els nivells de vitamina D i IMC, i s’observa que a mesura que augmenta l’IMC, augmenta el percentatge de pacients que presenten un dèficit de vitamina D . La distribució de greix corporal està considerada cada vegada més important en la predicció de morbimortalitat associada a l’adipositat, i la distribució central és la que més s’associa amb increment del risc cardiovascular per la seva relació amb la síndrome metabòlica (SM) (Malnick et al., 2006) . L’estudi NHANES III va mostrar una prevalença de SM del 21,9 % en adults dels Estats Units . Quan es van quantificar les concentracions plasmàtiques de calcidiol, els individus amb SM presentaven uns valors mitjans de 67,1 nmol/l, mentre

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

Dieta insuficient

Manca d’exposició solar

Insuficiència renal crònica

Hepatopatia crònica

Insuficiència pancreàtica amb malabsorció de greixos

Malabsorció intestinal

Fàrmacs

Raquitisme de tipus i i tipus ii dependent de vitamina D

que en els que no presentaven SM eren de 75 nmol/l .

El nostre grup ha analitzat l’associació entre nivells de vitamina D i PTH amb la presència d’obesitat i SM . Durant més de dos anys s’han analitzat de manera retrospectiva els pacients atesos en consultes externes d’obesitat (n = 322), i s’ha mostrat que la prevalença de deficiència o insuficiència de vitamina D s’incrementava amb obesitat: només un 38 % dels individus amb IMC < 30 kg/m 2 tenien dèficit de vitamina D enfront d’un 88-95 % d’individus amb un IMC > 35 kg/m 2, i aquesta deficiència s’associa amb un augment de dislipèmia aterogènica (vegeu la taula 2) .

Les causes d’aquesta deficiència associada a l’obesitat estan per aclarir . En pacients amb obesitat els nivells baixos de vitamina

D poden ser atribuïts a: a) disminució de la biodisponibilitat de la vitamina a causa del segrest del teixit adipós, que actua com a reserva de vitamines liposolubles (Wortsman et al., 2000; Drincic et al., 2012); b) baixa exposició deguda a la limitació a la mobilitat o baixa exposició solar en grans àrees del cos (Kull et al., 2009), o c) una ingesta baixa de calci i vitamina D .

VITAMINA D, MALALTIES CARDIOVASCULARS I HIPERTENSIÓ ARTERIAL

Hi ha una variació racial i geogràfica en la pressió arterial, i s’objectiva un increment de sud a nord a l’hemisferi nord . Una possible explicació per a aquesta associació amb la latitud és l’exposició a la llum solar i, en conseqüència, amb els nivells de vitamina D (Rostand, 1997) . En estudis amb animals, la 1,25-dihidroxivitamina D regula el sistema renina-angiotensina, i es mostra en els ratolins amb deficiència de síntesi de vitamina D hipertensió arterial (HTA) i hipertròfica miocàrdica (Li et al., 2002) .

En individus hipertensos hi ha una associació inversa entre nivells plasmàtics de vitamina D i pressió arterial (Bouillon et al., 2000; Forman et al., 2007) .

Una metaanàlisi de vuit assajos aleatoritzats que van examinar els efectes de la suplementació amb vitamina D sobre la pressió arterial en individus amb HTA (>140/90 mmHg) va mostrar una petita però significativa reducció en la pressió arterial diastòlica (–3,1 mm Hg, 95 % CI –5,5 a –0,6) i una reducció no significativa en la pressió arterial sistòlica en el grup suplementat amb vitamina D respecte al grup placebo (Witham et al., 2009) .

La relació entre vitamina D i malaltia cardiovascular va més enllà de la seva relació amb la HTA . En l’estudi Framingham els pacients que tenien nivells de vitamina D inferiors a 15 ng/ml van tenir més probabilitat de patir una complicació cardiovascular durant els 5,4 anys següents (Wang et al., 2008) . En l’estudi NHANES (National Health and Nutrition Examination Study) la prevalença de malaltia coronària va ser més comuna en adults amb nivells de vitamina D inferiors a 20 ng/ml (Kim et al ., 2008) . En una metanàlisi de sis estudis d’intervenció no es va demostrar benefici so -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

Taula 1. Etiopatogènia de la deficiència de la vitamina D

IMC (kg/m2)

Nivell de vitamina D

Deficient

Insuficient

Hiperparatiroïdisme

* Test de khi quadrat (χ2)

IMC: índex de massa corporal .

Nivell de vitamina D segons la concentració de 25(OH)vitD: deficient (< 25 nmol/l), insuficient (25-75 nmol/l) i òptim (>75 nmol/l) .

Hiperparatiroïdisme: concentració d’hormona paratiroïdal > 6,85 pmol/l .

bre malaltia cardiovascular (incloent-hi infart de miocardi i accident cerebrovascular) amb la suplementació de vitamina D (Elamin et al., 2011) .

Podem, doncs, afirmar que amb l’evidència actual l’associació entre vitamina D i malaltia cardiovascular roman incerta .

VITAMINA D, RESISTÈNCIA

A INSULINA I DIABETIS DE TIPUS 2

Les dues etapes clau en la patogènia de la diabetis de tipus 2 (DM2) són la resistència a la insulina i la disfunció de la cèŀlula β pancreàtica . Proves d’estudi d’investigació bàsica i estudis observacionals han suggerit que el consum de vitamina D podria protegir del desenvolupament de DM2 a través dels efectes possibles que té aquesta vitamina sobre l’homeòstasi de la insulina i la glucosa (Holick et al ., 2004, 2007)

La vitamina D és essencial per a la secreció i acció de la insulina . La vitamina D podria afectar directament la funció de la cèllula β pancreàtica, mitjançant la unió de la 1,25-dihidroxivitamina D circulant al receptor de la vitamina D a la cèŀlula β (Norman et al., 1980) . L’alteració del gen del receptor de la vitamina D en ratolins produeix

un deteriorament de la capacitat secretora d’insulina (Zeitz et al., 2003) i es manté la massa i arquitectura dels illots pancreàtics . L’efecte de la vitamina D sobre la resistència a la insulina podria no ser directa i podria estar relacionat amb els seus efectes beneficiosos sobre l’adipositat . Encara que els mecanismes sobre els nivells de vitamina D i adipositat no són prou coneguts, una possible explicació seria el segrest de vitamina D 25OH del teixit adipós en persones obeses, que n’afecta la biodisponibilitat (Liel et al., 1988; Wortsman et al., 2000) . La vitamina D, com hem comentat, està relacionada amb els nivells de PTH circulant, aquesta estimula el pas de calci a l’interior dels adipòcits, potencia la lipogènesi i inhibeix la lipòlisi, i condueix a una acumulació de greix (Holick et al., 2007) .

Les dades en humans també donen suport a la hipòtesi que els nivells de vitamina D s’associen al deteriorament de la cèŀlula β, resistència a la insulina i intolerància a la glucosa . En estudis transversals en persones no diabètiques s’ha examinat l’associació dels nivells dietètics o plasmàtics de vitamina D amb biomarcadors indirectes de l’homeòstasi de la glucosa com l’hemoglobina A1c (HbA1c), la resistència a la inulina (HOMA-IR) i la funció de la cèŀlula β

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

Taula 2. Nivells de vitamina D i presència d’hiperparatiroïdisme segons l’índex de massa corporal (kg/m2)

(HOMA-B), i es mostra una associació positiva entre els nivells de vitamina i la sensibilitat a la insulina (Liu et al., 2009) .

Encara que la relació entre la vitamina D i la patogènia de la DM2 és bastant clara, com que la majoria dels estudis en humans sobre l’associació de vitamina D amb la DM2 són de tipus observacional, calen assajos aleatoritzats per recomanar suplementació de vitamina D en pacients diabètics i prediabètics .

VITAMINA D I ALTRES EFECTES EXTRAOSSIS

Funció muscular

Hi ha evidència que demostra la relació entre vitamina D i la funció muscular . Diferents estudis han demostrat anomalies en la maduració muscular en ratolins amb deficiència de receptor de la vitamina D, que mostra fibres musculars estriades més curtes (Bouillon et al., 2008) .

Els nens amb deficiència de vitamina D en què hi ha una disminució de síntesi de 1,25-dihidroxivitamina D tenen debilitat muscular que reverteix amb la suplementació amb 1,25-dihidroxivitamina D .

Estudis observacionals mostren la relació entre dietes pobres en 25HOVD i debilitat muscular en nens i adults . Valors inferiors a 20 ng/ml i especialment per sota de 10 ng/ml estan associats a debilitat muscular (Bouillon et al., 2008; Plotnikoff et al., 2003), i demostren que una suplementació correcta amb vitamina D ho millora, i prevé el risc de caigudes en persones d’edat avançada (Bischoff-Ferrari et al., 2004; Gillespie et al., 2009)

Càncer

Entre 1930 i 1940 es va observar que hi havia un risc més elevat de determinades neoplàsies en individus que vivien en latituds elevades (Apperly, 1941), que s’expliquen per la seva relació amb l’exposició a la llum solar .

Estudis in vitro han demostrat que la forma activa de vitamina D pot disminuir la proliferació ceŀlular, i que un gran nombre de gens són activats o inactivats per l’acció de la vitamina D . En estudis amb animals la deficiència de receptor de vitamina D predisposa a lesions precanceroses de mama o budell (Welsh, 2004) .

Estudis observacionals en humans mostren una relació entre el dèficit de vitamina D i el risc de càncer . L’Organització Mundial de la Salut (OMS) assenyala que el càncer de còlon és el que més es relaciona amb nivells baixos de vitamina D (IARC, 2008) . Malgrat tot, els resultats d’estudis d’intervenció són inconsistents . Els estudis en què se suplementa amb vitamina D3 i calci no han demostrat efectes sobre la incidència de càncer colorectal (Wactawski-Wende et al ., 2006) . En altres estudis de suplementació, en què l’objectiu principal era l’observació de risc de fractures, no es van demostrar efectes beneficiosos sobre el risc de càncer (Trivedi et al., 2003; Chlebowski et al., 2008) .

L’evidència actual és insuficient per recomanar la suplementació amb altes dosis de vitamina D per prevenir determinats tipus de neoplàsies .

Sistema immunitari

La vitamina D també té efectes sobre la gran majoria de les cèŀlules del nostre sistema immunitari . Els macròfags, limfòcits T i B expressen el receptor de la vitamina D .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

La forma activa de vitamina D és un inhibidor de les cèŀlules dendrítiques que actua com a modulador de la maduració i funció . La deficiència en vitamina D podria incrementar el risc de malalties autoimmutàries, les quals han estat reportades en models animals (Ponsonby et al., 2002) . Estudis observacionals en humans suggereixen una associació entre la deficiència de vitamina D i la diabetis de tipus 1 (DM1), esclerosi múltiple (EM) i malaltia inflamatòria intestinal (MII) . També alguns estudis d’intervenció mostren que la suplementació amb vitamina D en la infància s’associa a una reducció aproximada del 30 % del risc de patir DM1 (Mathieu et al., 2005) . Hi ha estudis que mostren una associació entre la vitamina D i malaltia aŀlèrgica . Per exemple, la deficiència de vitamina D durant la gestació ha estat associada a un increment del risc de patir asma extrínseca i èczema (Lange et al., 2009; Gale et al., 2008) .

BIBLIOGRAFIA

Apperly, F . L . (1941) . «The relation of solar radiation to cancer mortality in North America» . Cancer. Res., 1: 191-195 .

Bischoff-Ferrari, H A ; Dietrich, T ; Orav, E F (2004) «Higher 25-hydroxyvitamin D concentrations are associated with better lower-extremity function in both active and inactive persons aged > or = 60 years» Am. J. Clin. Nutr., 80: 752-758

Bouillon, R (2009) «Vitamin D as potential baseline therapy for blood pressure control» Am. J. Hypertens., 22: 816-822

Bouillon, R ; Carmeliet, G ; Verlinden, L (2008) «Vitamin D and human health: lessons from vitamin D receptor null mice» Endocr. Rev., 29: 226-276

Chlebowski, R T ; Johnson, K C ; Kooperberg, C (2008) «Calcium plus vitamin D supplementation and the risk of breast cancer» J. Natl. Cancer Inst., 100: 1581

DeLuca, H F ; Krisinger, J ; Darwish, H (1990) «The vitamin D system» Kidney Int., 38 (supl 29): S2-8

Drincic, A T ; Armas, L A ; Diest, E E van; Heaney, R P (2012) «Volumetric dilution, rather than se -

questration best explains the low vitamin D status of obesity» . Obesity. (Silver. Spring), 10 .1038/ oby .2011 .404 . [En premsa]

Elamin .; M . B .; Abu Elnour, N . O .; Elamin, K . B .; Fatourechi, M . M .; Alkatib, A . A .; Almandoz, J . P.; Liu, H .; Lane, M . A .; Mullan, R . J .; Hazem, A .; Erwin, P. J .; Hensrud, D . D .; Murad, M . H .; Montori, V . M . (2011) . «Vitamin D and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis» . J. Clin. Endocrinol. Metab., 96: 1931-1942 .

Forman, J . P.; Giovannucci, E .; Holmes, M . D .; Bischoff-Ferrari, H . A .; Tworoger, S . S .; Willett, W . C .; Curhan, G . C . (2007) . «Plasma 25-hydroxyvitamin D levels and risk of incident hypertension» . Hypertension, 49: 1063-1069 . Gale, C . R .; Robinson, S . M .; Harvey, N . C .; Javaid, M . K .; Jiang, B .; Martyn, C . N .; Godfrey, K . M .; Cooper, C .; Princess Anne Hospital Study Group (2008) . «Maternal vitamin D status during pregnancy and child outcomes» . Eur. J. Clin. Nutr., 62: 68-77 .

Gillespie, L . D .; Roberston, M . C .; Gillespie, W . J . (2009) . «Interventions for preventing falls in older people living in the comunity» . Cocharne Database Syst. Rev., CD007146 .

Goldner, W . S . [et al .] (2008) . «Prevalence of vitamin D insufficiency and deficiency in morbidly obese patients: a comparison with non-obese controls» . Obes. Surg., 18: 145-150 .

Holick, M . F . (2004) . «Vitamin D: importance in the prevention of cancers, type 1 diabetes, heart disease and osteoporosi» . Am. J. Clin. Nutr., 79: 362371 .

Holick, M . F . (2007) . «Vitamin D deficieny» . N. Engl. J. Med., 357: 266-281 .

Kim, D H ; Sabour, S ; Sagar, U N ; Adams, S ; Whellan, D J (2008) «Prevalence of hypovitaminosis D in cardiovascular diseases (from the National Health and Nutrition Examination Survey 2001 to 2004)» Am. J. Cardiol., 102: 154-154

Kull, M ; Kallikorm, R ; Lember, M (2009) «Body mass index determines sunbathing habits: implications on vitamin D levels» Intern. Med. J., 39: 256-258

Lange, N E ; Litonjua, A ; Hawrylowicz, C M ; Weiss, S (2009) «Vitamin, D, the immune system and asthma» Expert. Rev. Lin. Immunol., 5: 693

Li, Y C ; Kong, J ; Wei, M ; Chen, Z F ; Liu, S Q ; Cao, L P (2002) «1,25-dihidroxyvitamin D(3) is a negative endocrine regulator of the renin-angiotensin system» J. Clin. Invest., 110: 229-238

Liel, Y ; Ulmer, E ; Shary, J (1988) «Low circulating vitamin D in obesity» Calcif. Tissue. Int., 43: 199201

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

Liu, E .; Meigs, J . B .; Pittas, A . G . (2009) . «Plasma 25-hydroxyvitamin D is associated with markers of the insulin resistant phenotype in nondiabetic adults» . J. Nutr., 139: 329-334 .

MacIntyre, I .; Alevizaki, M .; Bevis P. J . R .; Zaidi, M . (1987) . «Calcitonin and the peptides from the calcitonine gene» . Clin. Orthop. Relat. Res., 217: 45-55 .

Malnick, S . D .; Knobler, H . (2006) . «The medical complications of obesity» . QMJ, 99: 565-579 .

Marsh, M .; Ryley, S . (1998) . «Enfermedades gastrointestinales y hepáticas» . Panamericana, 87: 1577-1608 .

Mathieu, C .; Gysemans, C .; Giulietti, A .; Bouillon, R . (2005) . «Vitamin D and diabetes» . Diabetologia., 48: 1247 .

Michos, E . D .; Melamed, M . L . (2008) . «Vitamin D and cardiovascular disease risk» . Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 11: 7-12 .

Mithal, A . [et al .] (2009) . «Global vitamin D status and determinants of hypovitaminosis D» . Osteoporos. Int., 20: 1807-1820 .

Muscogiuri, G .; Sorice, G . P.; Ajjan, R .; Mezza, T .; Pilz, S .; Prioletta, A .; Scragg, R .; Volpe, S . L .; Witham, M . D .; Giaccari, A . (2012) . «Can vitamin D deficiency cause diabetes and cardiovascular diseases? Present evidence and future perspectives» . Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis., 22: 81-87 .

Norman, A . W .; Frankel, J . B .; Heldt, A . M .; Grodsky, G . M . (1980) . «Vitamin D deficiency inhibits pancreatic secretion of insulin» . Science, 209: 823-825 .

Norman, A . W .; Roth, J .; Orci, L . (1982) . «The vitamin D endocrin system: steroid metabolism, hormone receptors, and biological response» . Endocr. Rev., 3: 331-366 .

Plotnikoff, G . A .; Quigley, J . M . (2003) . «Prevalence of severe hypovitaminosis D in patients with persistent nonspecific musculoskeletal pain» Mayo Clin. Proc., 78: 1463

Ponsonby, A L ; McMichael, A ; Mei, I van der (2002) «Ultraviolet radiation and autoimmune disease: insights from epidemiological research» Toxicology, 181: 71

Prentice, A (2008) «Vitamin D deficiency: a global perspective» Nutr. Rev., 66: S153

Reichel, H ; Koeffler, H P ; Norman, A W (1989) «The role of the vitamin D endocrine system in health and disease» N. Eng. J. Med., 320: 980-991

Rodriguez-Rodriguez, E ; Navia, B ; Lopez-Sobaler, A M ; Ortega, R M (2009) «Vitamin D in overweight/obese women and its relationship with dietetic and anthropometric variables» Obesity (Silver Spring), 17: 778-782

Rosen, C J ; Adams, J S ; Bikle, D D ; Black, D M ; Demay, M B ; Manson, J E ; Murad, M H ; Kovacs, C S (2012) «The nonskeletal effects of vitamin D:

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

an Endocrine Society scientific statement» . Endocr. Rev., 33: 456-492 . Rostand, S . G . (1997) . «Ultraviolet light may contribute to geographic and racial blood pressure differences» . Hypertension, 30: 150-156 .

Salas-Salvadó, J .; Rubio, M . A .; Barbany, M .; Moreno, B .; Grupo Colaborativo de la SEEDO (2007) . «SEEDO 2007 Consensus for the evaluation of overweight and obesity and the establishment of therapeutic intervention criteria» . Med. Clin. (Barc.), 128: 184-196 . Soares, M . J .; Chan She Ping-Delfos, W .; Ghanbari, M . H . (2011) . «Calcium and vitamin D for obesity: a review of randomized controlled trials» . Eur. J. Clin. Nutr., 65: 994-1004 .

Song, Q .; Sergeev N . (2012) . «Calcium and vitamin D in obesity» . Nutr. Res. Rev., 25: 130-141 .

Trivedi, D . P.; Doll, R .; Khaw, K . T . (2003) . «Effect of four monthly oral vitamin D3 (cholecalciferol) supplementation on fractures and mortality in men and women living in the community: randomised double blind controlled trial» . BMJ, 326: 469 .

Visscher, T . L .; Seidell, J . C . (2001) . «The public health impact of obesity» . Annu. Rev. Public. Health, 22: 355-375 .

Wactawski-Wende, J .; Kotchen, J . M .; Anderson, G . L . (2006) . «Calcium plus vitamin D supplementation and the risk of colorectal cancer» . N. Engl. J. Med., 354: 684 .

Wang, L .; Manson, J . E .; Sesso, H . D . (2012) . «Calcium intake and risk of cardiovascular disease: a review of prospective studies and randomized clinical trials» . Am. J. Cardiovasc. Drugs, 12: 105-116 .

Wang, T . J .; Pencina, M . J .; Booth, S . L .; Jacques, P. F ; Ingelsoon, E ; Lanier, K ; Ramachandran, S (2008) «Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease: a narrative review» Circulation, 117: 503-511

Welsh, J (2004) «Vitamin D and breast cancer: insights from animal models» Am. J. Clin. Nutr., 80: 1721S

Witham, M D ; Nadir, M A ; Struthers, A D (2009) «Effect of vitamin D on blood pressure: a systematic review and meta-analysis» J. Hypertens., 27: 1948-1954

Wortsman, J ; Matsuoka, L Y ; Chen, T C ; Lu, Z ; Holick, M F (2000) «Decreased bioavailability of vitamin D in obesity» Am. J. Clin. Nutr., 72: 690693

Zeitz, U ; Weber, K ; Soegiarto, D W (2003) «Impaired insulin secretory capacity in mice lacking a functional vitamin D receptor» Faseb. J., 17: 509511

Zittermann, A .; Schleithoff, S . S .; Koerfer, R . (2005) . «Putting cardiovascular disease and vitamin D insufficiency into perspective» . Br. J. Nutr., 94: 483492 .

SOBRE ELS AUTORS

Antoni Rabassa (Reus, 1974) va cursar estudis de medicina i cirurgia a la Universitat Rovira i Virgili (1998) i posteriorment va fer l’especialitat de medicina interna a l’Hospital Universitari Sant Joan de Reus (2005) . Des d’aleshores forma part, com a metge adjunt, de la Unitat d’Endocrinologia i Nutrició del Servei de Medicina Interna del mateix hospital . També és professor associat de la Facultat de Medicina i Ciències de la Salut de la Universitat Rovira i Virgili . Jordi Salas-Salvadó (Reus, 1958) va cursar els estudis de medicina i cirurgia a la Universitat Autònoma de Barcelona (1982) i va obtenir el títol de doctor l’any 1985 a la Universitat de Barcelona . Posteriorment va continuar la seva formació i va obtenir el Certificat d’Etudes Supérieures en Nutrition Humaine et Diététique (Universitat de Nancy), el Diplôme de Nutrition et Santé Publique (Centre National des Arts et Metiers, París), i el Diplôme d’Etudes Aprofondis: Biologie et Technologie de la Nutrition Artificielle (Universitat de París V), tots a França entre 1985 i 1987. El 1984 inicia la seva carrera docent a la Facultat de Medicina i Ciències de la Salut de Reus, i és des de

l’any 2007 fins avui dia catedràtic de Nutrició i Bromatologia de la Universitat Rovira i Virgili . Pel que fa a la seva tasca assistencial, des de l’any 1986 esdevé metge consultor de dietètica i nutrició a l’Hospital Universitari Sant Joan de Reus, i des de 1993 és cap clínic de nutrició del Servei de Medicina Interna . Pel que fa a les seves tasques investigadores, és director de la Unitat de Nutrició Humana de la Facultat de Medicina de Reus de la Universitat Rovira i Virgili des de l’any 1999 . Actualment aquest grup investigador reconegut per la Generalitat de Catalunya està integrat en les plataformes o xarxes de recerca més rellevants de l’Estat espanyol que dediquen els seus esforços a la recerca en nutrició, l’alimentació i obesitat . La seva recerca ha rebut finançament de manera continuada, tant de fons públics com privats, durant vint anys, i ha estat autor de més de 220 articles publicats en revistes indexades en el Science Citation Index . És un dels investigadors principals del projecte PREDIMED, un assaig clínic multicèntric sobre la prevenció primària cardiovascular a través de la dieta mediterrània . Actualment el doctor Salas-Salvadó és el president de la Federació Espanyola de Societats Científiques d’Alimentació, Nutrició i Dietètica (FESNAD), director del Centre Català de la Nutrició de l’Institut d’Estudis Catalans (CCNIEC-IEC) i chairman del World Forum for Nutrition Research and Dissemination de la Fundació International Nut and Dried Fruit Foundation .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 19-28

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .133

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 29-47

SEQÜENCIACIÓ DE NOVA GENERACIÓ I SALUT

EN EL SEGLE XXI

Francisco Vidal

Unitat de Diagnòstic i Teràpia Molecular, Divisió de Coagulopaties Congènites, Banc de Sang i Teixits

Adreça per a la correspondència: Francisco Vidal . Edifici Dr . Frederic Duran i Jordà . Pg . de Taulat, 116 . 08005 Barcelona . Tel .: 935 573 500 . Adreça electrònica: fvidal@bst.cat .

RESUM

En la primera dècada del segle xxi l’aparició de les plataformes de seqüenciació massiva de nova generació (NGS) ha produït una autèntica revolució en la seqüenciació del DNA . Aquesta tecnologia permet seqüenciar en paraŀlel milions de molècules de DNA a un preu molt inferior al de la seqüenciació tradicional i s’està traslladant ràpidament des del terreny de la investigació bàsica a l’assistència de capçalera al pacient . El seu extraordinari potencial en diferents especialitats mèdiques afectarà pràcticament tots els aspectes de l’atenció clínica, ja que permetrà fer rutinàriament proves diagnòstiques fins ara inconcebibles . En els propers deu anys probablement apareixeran noves plataformes de NGS per a ús clínic, encara més versàtils, precises, assequibles i fins i tot portàtils, que permetran plantejar la seqüenciació del genoma complet com a mètode universal de diagnòstic genètic . Tot això, unit a la millora del coneixement per predir com una variació genètica afecta la susceptibilitat a la malaltia, l’evolució d’aquesta o la resposta al tractament mèdic, sens dubte tindrà un efecte transformador en l’ús i protagonisme de la informació genètica en la rutina clínica del segle xxi .

Paraules clau: diagnòstic, genètic, genoma, seqüenciació de nova generació, seqüenciació massiva paraŀlela .

NEXT GENERATION SEQUENCING AND HEALTH OF THE 21 ST CENTURY

SUMMARY

In the first decade of the 21st century the emergence of massive Next Generation Sequencing (NGS) platforms has produced a revolution in DNA sequencing . This technol-

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

ogy allows parallel sequencing of millions of DNA molecules at a much lower price than traditional sequencing and it is rapidly moving from the field of basic research to routinely use in clinical practice . Its tremendous potential in several medical specialties will affect virtually all aspects of clinical care, as it will routinely perform diagnostic tests so far inconceivable . In the next ten years probably new NGS platforms for clinical use will appear more versatile, accurate, affordable and even portable that will enable sequencing the whole genome as a universal method of genetic diagnosis . This issue, together with the improved knowledge to predict how genetic variation affects the disease susceptibility, the evolution of illness or the response to medical treatment, will certainly have a transformative effect on the usage and significance of genetic information in the clinical routine of the 21st century .

Key words: diagnostics, genetic, genome, next-generation sequencing, massively parallel sequencing .

INTRODUCCIÓ

Un dels descobriments essencials de la biologia moderna és la identificació, el 1953, de l’estructura en doble hèlix del DNA (Watson i Crick, 1953) . Després d’exposar les característiques de l’estructura, els autors assenyalaven que l’aparellament específic de les cadenes suggeria un possible mecanisme de còpia del DNA i que la seqüència precisa de les bases seria el codi que transportava la informació genètica . En els anys següents diversos investigadors van estudiar la relació entre la seqüència dels àcids nucleics i de les proteïnes amb l’objectiu de desxifrar el codi genètic, mentre que altres van desenvolupar tècniques per seqüenciar el DNA . D’aquesta manera, el 1977, Maxam i Gilbert (Maxam i Gilbert, 1977) i Sanger i coŀlaboradors (Sanger et al., 1977) van desenvolupar simultàniament mètodes per a la determinació de la seqüència de nucleòtids, cosa que va suposar un progrés extraordinari en els camps de la genètica humana i del diagnòstic molecular . El mètode de Sanger, que finalment es va imposar per la seva simplicitat, longitud de lectura i fidelitat de la seqüència proporcionada, s’ha considerat durant anys com el mètode de referència per al genotipatge i per a la de-

tecció de variants i mutacions en gens d’interès clínic com els causants de trastorns monogènics, poligènics i multifactorials . Dues importants fites per al desenvolupament d’aquesta tecnologia van ser l’aparició dels fluorocroms en substitució dels marcatges radioactius i l’automatització del procés amb l’aparició dels seqüenciadors automàtics, especialment aquells que permeten fer una electroforesi capiŀlar . A mitjan anys vuitanta, de l’estudi dels gens es va passar a l’estudi del genoma gràcies a un ambiciós projecte internacional, conegut com a Projecte Genoma Humà (PGH), l’objectiu del qual consistia a seqüenciar i cartografiar el genoma de la nostra espècie . El PGH es va iniciar oficialment el 1990 i van ser necessaris tretze anys i més de 2 .800 científics per dur-lo a terme . L’any 1998 una iniciativa privada va entrar en la carrera per a l’obtenció de la seqüència completa del genoma humà, va encoratjar la competència i va accelerar la consecució de l’objectiu final . Així, al febrer de 2001, les revistes Nature (McPherson et al., 2001) i Science (Venter et al., 2001) publicaven simultàniament dues edicions especials que van proporcionar el primer esborrany de la seqüència del genoma humà . S’ha complert, per tant, la primera dècada d’aquesta transcendental fita que

ha ocupat un paper decisiu en el desenvolupament de la biomedicina i ha donat lloc a productives sinergies entre els investigadors, els clínics i la indústria farmacèutica i biotecnològica . No obstant això, amb les eines disponibles en aquell moment resultava difícil progressar àgilment envers el coneixement detallat de la variabilitat genètica i les implicacions d’aquesta en la salut humana . Tot això està canviant i encara canviarà més durant les pròximes dècades: el desenvolupament de noves tècniques de seqüenciació del DNA aparegudes durant els últims anys propiciaran que genètica i genòmica caminin juntes i la integració de les dades d’ambdues disciplines ens durà a una interpretació millor de l’efecte de la variabilitat genètica sobre els diferents aspectes de la salut humana (Gibbs, 2011) .

LA SEQÜENCIACIÓ DE NOVA GENERACIÓ

A partir de l’any 2005 es produeix una autèntica revolució en les tècniques de seqüenciació del DNA amb l’aparició de les plataformes de seqüenciació massiva de nova generació o NGS (del terme anglès next generation sequencing) . Sense pretendre fer una relació exhaustiva de totes les plataformes en el mercat, podem destacar que a partir d’aquest any comencen a comercialitzar successivament una sèrie d’equips diferents empreses (FLX-GS Roche/454 Life Sciences, Illumina Genome Analyzer i SOLiD™ System de Life Technologies), basades en estratègies diverses amb el denominador comú que totes requereixen una amplificació clonal del DNA abans de procedir a la seqüenciació . Les característiques diferencials principals es posen de manifest en aspectes com la química utilitzada, la longitud de lectura i el nombre de molècules que són capaces de seqüenciar en pa-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

raŀlel . Aquesta tecnologia ha provocat que la seqüenciació del DNA resulti més de dues-centes vegades més ràpida i econòmica que amb la seqüenciació tradicional de Sanger, i ha constituït indubtablement una segona generació tecnològica en aquest camp . Com a exemple de la seva capacitat, cal assenyalar que el 2008 una d’aquestes plataformes (FLX-GS Roche/454 Life Sciences) va permetre seqüenciar en tan sols quatre mesos el genoma complet de James D . Watson (Wheeler et al., 2008), un dels descobridors de l’estructura de doble hèlix del DNA . És destacable que el PGH va invertir tretze anys a assolir aquest objectiu .

Tot això ha posat en relleu el seu extraordinari potencial com a alternativa o complement a la seqüenciació tradicional i, durant els últims anys, l’aplicació més estesa de la NGS ha consistit en la seqüenciació de genomes complets amb l’objectiu d’ampliar el coneixement sobre com les diferències genètiques trobades a escala poblacional afecten la salut o poden provocar una determinada malaltia . De fet, gràcies a aquestes i altres tecnologies d’anàlisi massiva, en els últims anys s’han pogut engegar grans projectes multinacionals impensables fa una dècada . Un és el Projecte 1000 Genomes (http://www.1000genomes.org), que té com a objectiu establir un catàleg exhaustiu de la variabilitat genètica humana . Igualment, altres projectes que ja estaven en marxa s’han beneficiat de manera significativa amb l’entrada en escena de la seqüenciació d’alt rendiment a baix cost . Aquest és el cas del projecte internacional ENCODE (Encyclopedia of DNA elements), l’objectiu del qual és delimitar tots els elements funcionals al llarg de la seqüència del genoma humà (Consortium et al., 2012) .

Tot i les seves virtuts, la NGS no està exempta d’inconvenients tècnics, alguns compartits per les diferents plataformes i altres de particulars de cadascuna . Entre

les principals limitacions hi ha, per exemple, la curta longitud de les seqüències que poden llegir les tecnologies Illumina GA i SOLiD™ System, que provoca dificultats en el procés d’acoblament de novo i en l’alineament enfront de seqüències de referència, en particular en les regions repetitives (Casals et al., 2012) . D’altra banda, no totes les seqüències són processades igualment, i les regions de DNA riques en GC són particularment propenses a una baixa cobertura . Finalment, però no menys important, la introducció d’errors en la seqüència és un tret comú a totes les plataformes: les seqüències més llargues són propenses a tenir errors de lectura, sobretot en els extrems, i les seqüències repetitives i els homopolímers són també motiu d’error en alguns d’aquests seqüenciadors (Hui, 2012) . Ara bé, aquesta revolució tecnològica està lluny d’haver-se aturat i això es veu reflectit en una progressiva reducció dels costos, en la simplificació de la metodologia de treball, en l’augment en la capacitat i velocitat de seqüenciació i, sobretot, en el fet que molts dels problemes assenyalats es van corregint a mesura que evoluciona la tecnologia i apareixen noves versions dels equips i dels reactius .

Seqüenciació de tercera generació

Encara no hem assimilat l’impacte d’aquesta nova generació de seqüenciadors quan ja comença a entrar en escena una tercera generació . La principal novetat d’aquesta tercera generació (anomenada seqüenciació a temps real d’una sola molècula) és que són capaces de detectar la polimerització de molècules individuals de DNA sense necessitat d’una amplificació prèvia (Schadt et al., 2010) . Helicos Biosciences, la primera empresa que va anunciar una tecnologia de seqüenciació d’aquestes característiques, ha desenvolupat la Helicos’ true single mole ­

cule sequencing (tSMS): la seqüenciació detecta la incorporació dels quatre nucleòtids marcats fluorescentment sobre un suport sòlid, i dóna lloc a lectures de 30-45 nucleòtids . Més recentment, Pacific Biosciences ha comercialitzat un sistema de tercera generació basat en la tecnologia de detectors zero-mode waveguide (ZMW): la paraŀlelització d’aquestes estructures nanofotòniques permet la lectura en temps real de la fluorescència de nucleòtids marcats en volums molt reduïts juntament amb temps de carrera molt curts i seqüències de més de mil nucleòtids (Metzker, 2010) . Altres tecnologies de tercera generació, encara no disponibles comercialment, inclouen la detecció de bases de DNA individuals a mesura que passen a través d’un nanopor, que pot ser de naturalesa biològica (Oxford Nanopore) o de naturalesa sintètica (en desenvolupament a partir d’una aliança entre IBM i Roche) . Finalment cal esmentar les tècniques de seqüenciació a partir de la imatge directa de les molècules individuals de DNA mitjançant microscòpia electrònica de transmissió desenvolupades, entre d’altres, per Halcyon Molecular (Casals et al., 2012) i ZS Genetics (Schadt et al., 2010) . Així doncs, el panorama a pocs anys vista és considerablement variable; no obstant això, les tecnologies de seqüenciació de tercera generació a partir d’una sola molècula encara presenten importants limitacions, i actualment el principal problema és la seva elevada taxa d’error (Schadt et al., 2010) .

Noves plataformes NGS de sobretaula

A l’espera que aquesta tercera generació sigui una realitat a tots els nivells, l’evolució de la NGS sembla orientada cap a l’ús clínic rutinari . Per aconseguir aquest objectiu és necessari complir amb una sèrie de requi-

sits com són augmentar la precisió de les tècniques, simplificar els assajos, disposar d’instruments més petits i de baix preu, flexibilitzar-ne el rendiment, reduir els temps de treball i, el més transcendental, aconseguir una anàlisi de les dades simplificada . Des de l’aparició de les primeres plataformes de NGS, s’han produït una sèrie d’avanços tecnològics, com la química de seqüenciació millorada i noves metodologies de detecció de senyals, així com l’optimització dels protocols de preparació de les mostres . Això ha donat com a resultat la disponibilitat de noves plataformes de NGS més petites (també conegudes com a seqüenciadors «de sobretaula») com ara MiSeq (Illumina), 454 Junior GS (Roche) i Ion Torrent PGM (Life Technologies), que suposen una inversió econòmica inicial menor, tenen protocols per a la preparació de les mostres més fàcils, ràpids i automatitzats i, fins i tot, faciliten l’anàlisi de dades per a aplicacions concretes . D’altra banda, algunes de les noves tecnologies de seqüenciació no utilitzen fluorescència o quimioluminescència, cosa que representa un estalvi significatiu de costos per base seqüenciada . Per exemple, Ion Torrent PGM és capaç de detectar i quantificar un senyal elèctric generat pels protons alliberats després de l’addició seqüencial de nucleòtids no marcats en la síntesi de la molècula de DNA . Per tant, aquestes noves plataformes de sobretaula sembla que tenen algunes de les característiques esmentades abans que les fan més adients per a ús clínic . No obstant això, hi ha un consens a dir que encara s’enfronten reptes importants en aquesta transició i, sobretot, s’haurien de simplificar més les eines d’anàlisi de dades per minimitzar la necessitat d’un suport bioinformàtic massa sofisticat (Desai i Jere, 2012) .

APLICACIONS CLÍNIQUES DE LA NGS

No és estrany que la revolució de les tecnologies de seqüenciació suposi un profund impacte en la nostra comprensió de la genètica i la biologia del genoma . En el context de la investigació bàsica, la NGS ha estat àmpliament aplicada per a la seqüenciació de genomes de novo, la reseqüenciació dirigida de gens, la seqüència de transcriptomes i en epigenòmica . Però, indubtablement, una de les contribucions de la NGS que desperta més expectació és l’aplicació clínica . Sense pretendre fer una recopilació exhaustiva, aquestes aplicacions inclouen: la identificació de mutacions causants de malalties genètiques rares a través de la seqüenciació de tot el genoma o de regions discretes del genoma, el diagnòstic molecular de malalties monogèniques causades per múltiples gens, l’estudi de la base genètica de malalties poligèniques comunes, la identificació de variants genètiques rares associades amb trastorns monogènics mendelians, la detecció i caracterització ràpida de microorganismes patògens, la detecció eficient de mutacions hereditàries o somàtiques en els gens relacionats amb el desenvolupament de tumors, el pronòstic i personalització del tractament farmacològic, les proves prenatals invasives i no invasives, la tipificació HLA per a trasplantament d’òrgans i cèŀlules progenitores, etc . Per tant, podem assenyalar que, amb la introducció de les noves plataformes de seqüenciació, les possibilitats de fer estudis genètics per donar resposta a diferents qüestions mèdiques estan augmentant ràpidament . Encara que és impossible descriure totes les aplicacions clíniques potencials de la NGS, dedicarem els apartats següents a fer una breu presentació de les més destacades .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

Diagnòstic de malalties monogèniques amb gens responsables coneguts

La seqüenciació sistemàtica dels gens implicats en malalties mendelianes és l’estratègia emprada habitualment per identificar les mutacions responsables en malalties monogèniques o factors de risc coneguts en malalties complexes . No obstant això, el cost de la seqüenciació tradicional, basada en el mètode de Sanger, segueix sent un important obstacle en moltes aplicacions diagnòstiques i el desenvolupament i optimització de solucions moleculars rendibles per donar suport al diagnòstic clínic són sempre ben rebuts . En aquest sentit, malgrat que la NGS és en molts aspectes superior a la seqüenciació tradicional de Sanger, encara hi ha pocs exemples del seu ús efectiu en el diag nòstic de rutina de malalties monogèniques causades per un gen conegut . Això és degut en part al fet que les plataformes de NGS van ser concebudes originalment per seqüenciar genomes complets i aquest no és habitualment l’objectiu en l’anàlisi de malalties monogèniques, sinó que és necessari, abans de la seqüenciació, la captura i enriquiment de la regió d’interès, que pot ser un gen, un grup de gens o una regió genòmica . En aquesta direcció, s’han desenvolupat estratègies imaginatives, incloent-hi la PCR de llarg abast (LRPCR), la seqüenciació d’amplicons, la captura de seqüències mitjançant xips (per exemple, Nimblegen), la captura de seqüències en solució (per exemple, Agilent Sure Select), etc . Però aquí se’ns planteja un nou problema, ja que si la regió enriquida és molt petita no s’aprofita tota la capacitat del seqüenciador i el preu resultarà prohibitiu . Per tant, un dels reptes més importants en l’aplicació de la NGS a aquestes malalties és la cerca d’estratègies que permetin mesclar un gran nombre de mostres de diferents pacients i seqüenciar-les simultàniament . Ara

bé, després de la seqüenciació en paraŀlel, és necessari poder diferenciar d’alguna manera a quina mostra pertany cada seqüència obtinguda . Per abordar aquesta qüestió, el mètode més estès consisteix a indexar les mostres amb un «codi de barres» molecular (seqüències curtes afegides als extrems dels fragments de DNA) . Aquest procés es fa habitualment durant la construcció de les biblioteques, un pas fonamental en la preparació de la mostra abans de la seqüenciació . Una alternativa desenvolupada recentment, basada en la tecnologia de microfluids (Fluidigm Corporation), s’ha mostrat com una exceŀlent eina per construir les biblioteques a la vegada que s’incorpora el «codi de barres» molecular a cada mostra a un preu raonable (Grossmann et al., 2011) . Aquest detall és particularment important, ja que la preparació de les biblioteques és un dels passos més costosos en el procediment complet de la NGS . En conclusió, i tenint en compte la progressió tecnològica dels últims anys, podem afirmar que es comencen a establir les bases perquè properament el diagnòstic molecular de moltes malalties monogèniques mitjançant la NGS s’incorpori a la rutina clínica i reemplaci, en bona part, la seqüenciació tradicional .

Diagnòstic de malalties monogèniques rares en les quals no es coneix el gen responsable

Des de l’aparició de la NGS, el ritme de la identificació de gens responsables de malalties genètiques rares ha augmentat considerablement, circumstància que previsiblement continuarà durant els pròxims anys . La utilitat de la NGS en la cerca del gen o gens responsables d’aquestes malalties és evident, ja que és una tecnologia que ens permet seqüenciar el genoma o l’exoma de l’individu afectat, encara que aquesta no és

una tasca senzilla . El genoma humà conté al voltant de 23 .000 gens que s’estenen al llarg de 3 .000 milions de parells de bases . Només l’1 % del nostre genoma es tradueix en cadenes d’aminoàcids que donen lloc a les proteïnes, i és aquesta part del genoma, anomenada exoma, on es produeixen la gran majoria de mutacions responsables de les malalties hereditàries que coneixem . Per tant, seqüenciar únicament els trenta milions de bases de l’exoma sembla una estratègia lògica en la recerca inicial dels defectes responsables d’aquest tipus de malalties . Per capturar o enriquir l’exoma s’han adaptat amb èxit sistemes com els esmentats abans que es basen en la hibridació del DNA genòmic fragmentat en oligonucleòtids immobilitzats sobre microxips (Nimblegen) o en solució (Agilent Sure Select) . De fet, aquesta aproximació ha mostrat un considerable èxit en la identificació del gen responsable de malalties mendelianes quan es disposa de més d’un individu afectat no emparentat o l’evidència de lligament en almenys una família . Fins i tot, s’ha aconseguit identificar la causa de malalties molt rares a partir de la seqüenciació de l’exoma de només un pacient (Choi et al., 2009; Vissers et al., 2010) . No obstant això i encara que els resultats són esperançadors, resulta difícil predir la taxa d’èxit que aquesta estratègia pot assolir en un entorn clínic en el qual s’incloguin pacients amb un ampli ventall de manifestacions fenotípiques (Need et al., 2012) .

Diagnòstic de malalties monogèniques causades per múltiples gens

Algunes malalties monogèniques com el retràs mental, la sordesa, la cardiomiopatia familiar i la retinitis pigmentosa, entre d’altres, poden ser causades per mutacions en desenes o centenars de gens diferents .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

El diagnòstic molecular per a aquestes malalties es basa fonamentalment en l’anàlisi seqüencial dels gens potencials implicats mitjançant la tècnica de seqüenciació convencional de Sanger . Atès que això representa un treball feixuc i costós, aquesta estratègia habitualment no és capaç de satisfer les necessitats diagnòstiques d’aquest tipus de trastorns . L’aparició de la NGS ha permès el desenvolupament de mètodes per analitzar simultàniament múltiples gens, i en resulta un diagnòstic a un preu assequible . Malgrat que aquestes aproximacions no han estat incorporades íntegrament en la prestació de serveis clínics, previsiblement s’incorporaran en els propers anys (O’Sullivan et al., 2012) . Com a exemple del potencial i viabilitat de la NGS en el diagnòstic de trastorns genèticament heterogenis en podem destacar l’aplicació a la retinitis pigmentosa . En aquest cas, les proves convencionals són nomes aplicables a una petita part dels pacients amb la malaltia i permeten identificar les mutacions en menys del 25 % dels individus avaluats . En canvi, la seqüenciació simultània mitjançant la NGS de 105 gens, que se sap que han mutat en alguna de les formes de retinitis, augmenta la taxa d’identificació de mutació fins al 50-55 % (O’Sullivan et al., 2012) . D’igual manera, la seqüenciació de l’exoma s’ha plantejat com una alternativa al diagnòstic molecular de rutina en aquest tipus de malalties i podria augmentar encara més l’eficiència en la identificació de la mutació responsable en cada família . La detecció per NGS de variants patogèniques responsables d’un trastorn genèticament heterogeni com la retinitis pigmentosa no és més que el procediment paradigmàtic a seguir en altres malalties causades per múltiples gens . Una vegada posada a punt, l’estratègia és aplicable a la majoria de famílies que pateixen la mateixa malaltia .

Estudi de la base genètica de malalties poligèniques complexes i susceptibilitats

Alguns trastorns, com l’osteoporosi, l’artrosi, la diabetis o la hipertensió arterial, tendeixen a ser més freqüents en determinades famílies, cosa que en reflecteix el component hereditari, encara que el risc de patir-los no s’explica per l’alteració d’un sol gen . Per això la denominació de malalties poligèniques o complexes . Durant els darrers anys, l’aproximació al coneixement de les causes últimes d’aquestes malalties s’ha dut a terme fent ús dels estudis d’associació del genoma complet o GWAS (Genome Wide Association Study), que han permès identificar locus o regions del genoma associats amb trastorns freqüents com ara l’esquizofrènia, la depressió, la hipertensió, el trastorn bipolar, la malaltia de Crohn, l’artritis reumatoide i la diabetis, entre d’altres . En els estudis de GWA s’utilitzen generalment microxips de SNP (single nucleotide polymorphisms) i s’analitzen milers de mostres d’individus diferents . L’enfocament més comú dels estudis GWA és el que compara dos grans grups de persones, un grup control sa i un grup de casos afectats per alguna malaltia . Es fa el genotipatge d’un nombre de SNP variable segons l’estudi, habitualment al voltant del milió, i l’objectiu final és tractar de trobar diferències en les freqüències aŀlèliques dels SNP d’ambdós grups i que això marqui una associació amb un gen o regió genòmica que després s’haurà d’estudiar . Malgrat que els microxips són un potent instrument d’investigació, hi ha una certa resistència a acceptar-los com una eina de diagnòstic a causa de la complexitat en l’anàlisi de les dades, la manca de fiabilitat en la interpretació i la validació insuficient . Fins i tot, la utilització de microxips amb milions de sondes només permet identificar associacions amb variants molt comu-

nes, ja que els SNP utilitzats són els descrits en estudis previs com a més freqüents en les poblacions . A més, els algorismes estadístics per determinar les associacions solament són vàlids utilitzant polimorfismes amb freqüències elevades . A aquest motiu s’ha atribuït que els resultats dels grans estudis de GWA no hagin ofert una informació tan útil com s’esperava . En aquesta etapa pot tenir molt a dir la NGS, ja que la seva naturalesa no esbiaixada i l’alta cobertura que ofereix permeten analitzar no només les variants més comunes, sinó també les variants més rares i no únicament del tipus SNP. Aquests detalls són crucials, ja que avui coneixem que múltiples variacions rares amb un petit efecte actuen conjuntament per donar lloc al fenotip característic . D’altra banda, per als trastorns més comuns, hi ha un ampli ventall de símptomes, susceptibilitats i capacitats de resposta a la teràpia que probablement resulten de la conjunció única del genotip de l’individu i el medi ambient . Únicament tecnologies com la NGS tenen una resolució suficient per detectar les subtils variacions genètiques responsables d’aquests trets diferencials . És en aquest context on la medicina personalitzada propiciada pels sistemes de NGS representa una eina fonamental per poder portar a terme l’anàlisi d’alta resolució per a la identificació dels gens associats a malalties complexes (Desai i Jere, 2012) .

Aplicacions de la NGS en el diagnòstic, pronòstic i teràpia del càncer

Atès que el càncer és una malaltia genètica hereditària o desencadenada per mutacions somàtiques, les noves tecnologies de seqüenciació del DNA tenen un impacte significatiu en la detecció, control i tractament de la malaltia . En aquest sentit, hi ha esforços generalitzats per al desenvolu-

pament de protocols basats en la NGS que permetran catalogar les mutacions responsables de múltiples tipus de càncer, fet que es traduirà en el descobriment de noves dianes diagnòstiques, pronòstiques i terapèutiques . Així mateix, és esperable que en els pròxims anys la informació procedent de la seqüenciació completa de genomes s’incorpori cada vegada més als assajos clínics en oncològica, i els resultats obtinguts mitjançant la investigació genòmica haurien de traduir-se en una millora en la pràctica clínica .

Actualment la NGS ja és una realitat pel que fa al diagnòstic clínic de rutina, com per exemple en la seqüenciació de gens d’alta penetrància en càncer familiar (BRCA1, BRCA2, APC, els gens de reparació del DNA, etc .), que estan indicades en persones considerades d’alt risc per la seva història familiar i clínica . La introducció de la NGS suposa un important estalvi dels costos de diagnòstic gràcies a la seqüenciació simultània de múltiples gens i mostres, que redueix els temps de resposta de mesos a setmanes . Un impacte positiu immediat de la reducció del cost de les proves genètiques per a malalties com el càncer de mama i d’ovari és que molts dels individus, que actualment no compleixen amb els estrictes criteris per a la inclusió en les proves genètiques, podran ser analitzats en un cribratge menys restrictiu . En aquest sentit, cal destacar que amb els criteris actuals al voltant del 30-50 % dels individus amb mutació no tenen una història familiar significativa per justificar la prova (Meldrum et al., 2011) . D’altra banda, els gens menys freqüentment implicats en síndromes de càncer familiar, i que no són testejats amb regularitat, també podrien incloure’s en el cribratge genètic rutinari per conèixer si el risc pot atribuir-se a mutacions en aquests gens .

Un altre paper important de la NGS en

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

oncologia el trobem a escala terapèutica . Actualment hi ha una sèrie de teràpies dirigides per a diversos tipus de càncer com el melanoma, el càncer de pulmó o el càncer colorectal . L’èxit d’aquests tractaments depèn, en un alt grau, del perfil genètic del tumor tractat, i ja es coneixen diverses mutacions en determinats gens predictives de l’èxit o fracàs d’un fàrmac concret . A més, és probable que les mutacions somàtiques, ja siguin primàries o adquirides, també puguin contribuir com un mecanisme de recaiguda de la malaltia . Per exemple, s’ha descrit la mutació p.Thr790Met en el gen EGFR com un factor de resistència per a teràpies dirigides amb potencial per predir la probabilitat de recaiguda . Per tant, el seguiment mitjançant NGS de la resposta de la malaltia a la teràpia, per detectar la resistència emergent, i les proves genètiques concomitants per a la detecció de mutacions de novo, probablement formaran part de moltes estratègies terapèutiques futures (Meldrum et al., 2011) .

D’altra banda, es comencen a conèixer els primers resultats de la utilització clínica de la NGS de panells de múltiples gens en mostres tumorals de pacients . Per exemple, un estudi recent ha reportat l’ús de la seqüenciació massiva paraŀlela de 138 gens específics en mostres de melanoma que ha permès descobrir un nou mecanisme de resistència adquirida en l’inhibidor de RAF PLX4032 (Wagle et al., 2011) . No obstant això, la seqüenciació de mostres tumorals planteja dificultats en la interpretació de les noves troballes en la pràctica clínica, ja que l’anàlisi bioinformàtica de les dades de seqüenciació d’espècimens tumorals és especialment complexa per les característiques inherents de les mostres: aneuploïdia, heterogeneïtat i la contaminació potencial amb teixit normal . Per aquest motiu, l’elaboració de bones bases de coneixement dels gens i les mutacions que confereixin resistència

a un agent diana terapèutic serà transcendental per a la interpretació dels resultats de la seqüenciació i el desenvolupament de teràpies combinades eficaces (Meldrum et al., 2011) . Finalment, encara que aquest capítol està dedicat a les aplicacions clíniques de la NGS, volem fer esment de la importància de l’epigenètica, que, malgrat no tenir una aplicació rutinària, molt probablement en els propers anys gaudirà d’aquest paper en el camp de l’oncologia . El terme epigenètica es refereix normalment a modificacions bioquímiques reversibles del DNA i proteïnes associades (com les histones) que afecten la modulació de l’expressió gènica sense alteració directa de la seqüència del DNA . Entre aquestes, la metilació del DNA és una de les més estudiades i amb més implicacions regulatòries . Les anomalies epigenètiques, com la metilació aberrant de les illes CpG, s’hereten a través de les divisions ceŀlulars i tenen un paper important en la carcinogènesi . L’epigenètica va ser una de les primeres disciplines a treure profit del desenvolupament de la NGS, combinant-la amb mètodes ja establerts per capturar regions genòmiques modificades epigenèticament (Meaburn i Schulz, 2012), i no sols centrant-se en la metilació en CG, sinó analitzant els patrons globals de metilació que permet la NGS . A més dels estudis individuals, la NGS ha permès donar impuls a grans consorcis internacionals com l’International Human Epigenome Consortium (http://www.epigenome.org), que contribuirà al coneixement i la comprensió de les funcions de l’epigenètica subjacents a les malalties humanes . És indiscutible que els estudis epigenètics mitjançant la NGS ja tenen aplicacions múltiples en el terreny de la investigació (Miyamoto i Ushijima, 2005) . Ara bé, probablement les primeres proves rutinàries es desenvoluparan en l’àmbit de l’oncologia per a la detecció de patrons

de metilació aberrants amb distintes aplicacions pràctiques: per detectar les cèŀlules tumorals en mostres de biòpsia o en el DNA lliure en el plasma; per fer un pronòstic de resposta a la quimioteràpia i a l’aparició d’efectes adversos; com a marcador associat amb un risc o susceptibilitat al desenvolupament d’un determinat càncer (Brosnan i Iacobuzio-Donahue, 2012) .

Aplicacions de la NGS en microbiologia

Probablement la microbiologia clínica és una de les especialitats que més rendiment està obtenint de les noves tecnologies de seqüenciació . Comencem per dir que la seqüenciació massiva de microorganismes ha revolucionat la identificació bacteriana i fúngica, i ha permès millorar el diag nòstic de moltes malalties infeccioses, però també té altres aplicacions de diversa naturalesa, com ara la seqüenciació d’alt rendiment de genomes complets, el descobriment de nous bacteris i virus mitjançant aproximacions metagenòmiques, la investigació de les comunitats microbianes en el medi ambient i en el cos humà en contextos de salut i de malaltia, l’anàlisi de la variabilitat del genoma víric en l’hoste, el monitoratge ultrasensible de resistència a fàrmacs antivírics, la recerca de la diversitat vírica i l’avaluació del viroma humà (Barzon et al., 2011) . És impossible descriure totes aquestes aplicacions en poques línies, de manera que ens limitarem a comentar només alguns exemples iŀlustratius . En el camp de la virologia, l’esforç de seqüenciació s’ha centrat essencialment en organismes de gran rellevància clínica, i disset dels vint virus seqüenciats són causants de malalties en els éssers humans . La informació generada té repercussió en diferents àrees de la virologia, que van des del diagnòstic fins a la patogènesi, passant pel

disseny de vacunes (Radford et al., 2012) . Un dels millors exemples de l’aplicació clínica de la seqüenciació massiva en aquest camp és la caracterització de quasiespècies víriques en mostres de pacients infectats . El terme quasiespècie fa referència a la complexitat genotípica de les poblacions víriques deguda a les altes taxes de mutació inherents a la replicació dels virus RNA . Això dóna lloc que diferents versions del genoma del virus, amb només lleugeres variacions en la seqüència, es trobin presents en un mateix individu en un moment determinat . Aquesta naturalesa plural de les poblacions víriques les permet adaptar-se ràpidament als canvis de l’entorn mitjançant la replicació selectiva de variants amb una millor condició per al nou escenari . Per tant, una caracterització precisa de les quasiespècies en mostres de pacients és crítica, ja que de la composició d’aquestes dependrà l’evolució vírica, la virulència, l’evasió enfront la resposta immunitària, el disseny de vacunes i la resistència als fàrmacs antivírics (Barzon et al., 2011) . Prenent com a exemple aquesta darrera característica, podem esmentar que el mètode de referència per detectar la resistència als fàrmacs del VIH deguda a mutacions concretes és la seqüenciació convencional directa de RTPCR . Una limitació important d’aquest mètode és la seva ineficàcia per detectar variants presents en la quasiespècie en menys d’un 20-25 % . Això és especialment negatiu, ja que diversos estudis han demostrat que aquestes variants resistents no detectades són clínicament rellevants i sovint responsables del fracàs d’una nova pauta de tractament antiretrovíric . Per contra, la característica d’amplificació clonal de la NGS, unida a la profunditat de seqüència a la qual pot arribar, permet detectar variants extremament poc representades en la població, fet que la fa idònia per portar a terme la caracterització de les quasies-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

pècies de manera senzilla, ràpida i econòmica . Una altra aplicació pràctica de la NGS, amb un gran impacte en el camp de la microbiologia, és l’estudi de la diversitat microbiana de mostres ambientals i clíniques . El microbioma humà és el conjunt dels microorganismes, els seus genomes i les interaccions d’aquests amb l’ambient en què viuen . Una eina fonamental per estudiarlo és la metagenòmica o l’anàlisi, mitjançant les noves tecnologies de seqüenciació, del genoma dels organismes d’una població sense necessitat d’aïllar i cultivar cadascun d’aquests organismes . L’objectiu en aquest cas no és el d’obtenir informació relativa a la bioquímica o al metabolisme de l’organisme, sinó més aviat l’obtenció d’empremtes específiques que permetin identificar les espècies presents en la mostra, establir-ne el nombre aproximat i deduir la distància genètica que les separa . La metagenòmica serveix també per estudiar la resposta d’una comunitat de microorganismes davant determinats factors i per comprovar com es modifica el conjunt de genomes d’aquesta comunitat en resposta a diferents estímuls o malalties . Per exemple, se sap que els canvis en les comunitats microbianes al cos estan estretament relacionats amb la funció del sistema immunitari, l’obesitat o el càncer . Sobre la base d’aquesta aproximació, el 2007 els instituts nacionals de la salut (NIH) dels Estats Units es van embarcar en el Projecte Microbioma Humà (Human Microbiome Project o HMP) i el 2008 la Comissió Europea i la Xina van crear el seu homòleg, MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract) .

L’objectiu de l’HMP és obtenir un mapa complet del microbioma humà, i per això s’analitzen els gens de la microflora intestinal, la flora de la cavitat bucal i vaginal i els microorganismes que es troben a la pell . Els investigadors ja han pogut

estimar que més de deu mil espècies de microorganismes viuen en associació amb els éssers humans . Anteriorment tan sols uns pocs centenars d’espècies de bacteris havien estat identificats . Tenint en compte que actualment estan en marxa al voltant de mil projectes de seqüenciació de bacteris en diferents graus de desenvolupament, encara estem lluny de cobrir l’amplitud de la diversitat filogenètica del microbioma humà . Així mateix, han posat de manifest que cada indret del cos humà té la seva pròpia «signatura» de microorganismes i que la diversitat taxonòmica i genètica és més gran en les mostres de dents i femta, intermèdia en pell i en la superfície interna de la galta, i baixa en les mostres vaginals . Per la seva banda, el projecte MetaHIT té com a objectiu tractar de trobar associacions entre gens del microbioma intestinal i la malaltia, centrant-se especialment en dues àrees amb un creixent interès clínic a Europa: l’obesitat i la malaltia inflamatòria intestinal . Els primers resultats publicats d’aquest projecte mostren troballes sorprenents . Després d’analitzar la flora intestinal de gairebé dues-centes persones de sis nacionalitats diferents, els investigadors del projecte esperaven trobar diferències en el microbioma segons races, nacionalitats, entorn o tipus de dieta . Per contra, els resultats han agrupat els humans (independentment de la seva procedència) en tres grans grups, segons el bacteri dominant . És aquest bacteri el que determina quines altres espècies hi conviuen i, per tant, quines altres espècies conformen el microbioma d’un individu (Arumugam et al., 2011) . Els resultats d’ambdós projectes representaran un primer pas per a l’enteniment de com el microbioma humà contribueix i es correlaciona amb diferents aspectes de la salut i la malaltia, de manera que, en el futur, l’anàlisi del microbioma de cada individu sigui un paràmetre biomètric d’utilitat clínica .

Diagnòstic prenatal no invasiu

El diagnòstic prenatal no invasiu (DPNI) consisteix a fer el diagnòstic prenatal a partir de mostres de DNA fetal lliure en plasma de dones gestants, i actualment és un dels camps en què la NGS té un potencial extraordinari . El descobriment el 1997 de la presència de DNA fetal lliure en el plasma matern va obrir noves possibilitats per a l’estudi molecular d’aquest DNA o de les cèŀlules fetals mateixes en sang materna (Lo et al., 1997) . Durant els primers anys, la investigació en aquest camp es va centrar en el desenvolupament de proves de determinació de l’Rh del fetus (detecció del gen D) per evitar la malaltia hemolítica del nounat o de determinació del sexe fetal (detecció del cromosoma Y) per a malalties lligades al sexe . El DPNI és un camp d’investigació de gran interès i llarg recorregut i, malgrat que encara està en procés de desenvolupament, en el futur serà una realitat que evitarà el diagnòstic prenatal mitjançant procediments de risc (Lo, 2012; Metzker, 2010) . S’ha iniciat el camí per poder portar a terme el DPNI d’aneuploïdies cromosòmiques i malalties monogèniques mitjançant mètodes basats en la NGS . El 2007 es va demostrar que els mètodes que permeten analitzar i comptabilitzar molècules individuals de DNA són capaces de detectar la presència d’una trisomia fetal, sempre que el nombre de molècules analitzades sigui suficient . Encara que el DNA fetal representa una petita fracció del DNA present en el plasma matern, gràcies al rendiment de la NGS milions de molècules d’una regió de DNA es poden seqüenciar fàcilment de manera individual . D’aquesta manera, és possible detectar directament una aneuploïdia fetal a partir d’una quantificació precisa de les seqüències totals (fetals + maternes) del cromosoma aneuploide i determinar si estan excessivament o insuficientment represen-

tades en comparació amb les seqüències d’altres cromosomes . Amb aquesta aproximació, la NGS ha permès fer DPNI de fetus amb trisomies 13, 18 i 21 .

D’altra banda, tot apunta que la tecnologia de referència per al DPNI de malalties monogèniques es basarà també en mètodes d’anàlisi d’una sola molècula, com ara la PCR digital (Tsui et al., 2011) o la NGS (Lo, 2012) . Per exemple, la NGS es pot aplicar al diagnòstic de malalties monogèniques heretades per via paterna, ja que l’aŀlel fetal procedent del pare portador de la mutació no està present en el genoma matern i es pot diferenciar fàcilment en el plasma de la gestant mitjançant seqüenciació massiva de la regió corresponent . Fins i tot, en els casos més complexos, com són les malalties lligades al sexe, en les quals és la mare la que transmet la mutació al fetus, hi ha aproximacions alternatives . L’estratègia utilitzada en aquest cas és la denominada dosi relativa de mutació (DRM), que es basa en una quantificació molt precisa dels aŀlels mutant i salvatge en el plasma de les dones heterozigotes gestants de fetus masculins . L’aŀlel trobat més freqüentment indicarà quin és el genotip del fetus .

Així doncs, quan la detecció rutinària de mutacions puntuals o aneuploïdies a partir de plasma matern estigui suficientment validada, permetrà obviar l’amniocentesi o la biòpsia de vellositats corials, fet que suposarà una revolució sense precedents en el camp del diagnòstic prenatal .

Tipificació HLA per al trasplantament aŀlogènic d’òrgans i de cèŀlules progenitores

El sistema HLA (human leukocyte antigen) és el sistema genètic més polimòrfic en els éssers humans . Està implicat en el reconeixement immunitari i en la senyalitza-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

ció entre cèŀlules, i la seva tipificació és fonamental per determinar la compatibilitat existent entre el donant i el receptor, condició imprescindible per a l’èxit del trasplantament aŀlogènic d’òrgans i de cèŀlules progenitores . La combinació dels nombrosos polimorfismes dels diferents gens que formen el sistema HLA dóna lloc a milers d’aŀlels, que es classifiquen en grups . La tipificació es pot fer a diferents resolucions en funció de si únicament s’identifica el grup (baixa resolució) o es determina l’a llel individual (alta resolució) . Inicialment la identificació dels polimorfismes de l’HLA es va fer mitjançant l’ús de tècniques serològiques, però a partir del desenvolupament de la PCR els mètodes basats en l’amplificació del DNA han predominat en els laboratoris d’histocompatibilitat . L’anàlisi del DNA genòmic és més exacta i reproduïble, i ofereix més flexibilitat i resolució . Actualment s’empren diverses tècniques basades en el DNA (Dunn, 2011), incloent-hi la PCR de primers específics de seqüència (PCR-SSP), la PCR de sondes d’oligonucleòtids de seqüència específica (PCR-SSOP), la tipificació basada en seqüència (PCR-SBT) i la PCR a temps real (RT-PCR) . Totes són extremament útils, però, alhora, totes tenen desavantatges . És un consens que la tipificació de baixa resolució no és suficient per al trasplantament i resulta en més mortalitat, així com en una malaltia de l’empelt contra l’hoste més aguda, i disminueix les possibilitats d’èxit del trasplantament . Per tant, actualment es persegueix la tipificació d’alta resolució segons dues vies alternatives: una és a partir d’una aproximació preliminar de baixa resolució que després es completa seleccionant sondes i primers específics per al genotipatge d’alta resolució . L’altra és la selecció de la seqüenciació com a mètode inicial, complementant-la a continuació amb PCR-SSP o PCR-SSOP per resoldre les ambigüitats . Per tant, la combi-

nació de tècniques actuals per resoldre les ambigüitats no només és laboriosa sinó també costosa i lenta .

Afortunadament, la recerca de noves maneres de treballar amb el creixent nombre d’aŀlels descrits i la complexitat de la resolució d’aquests aŀlels ha donat lloc a publicacions recents que demostren la utilitat de la NGS en la tipificació HLA d’alta resolució i d’alt rendiment sense els problemes experimentats amb altres mètodes (Gabriel et al., 2011) . Pràcticament tots aquests treballs es basen en l’ús de la plataforma GS-FLX de Roche, fonamentalment a causa de la longitud de lectura aconseguida (200-400 pb), considerablement més gran que l’obtinguda amb les altres plataformes . Aquesta longitud de lectura, juntament amb l’amplificació clonal, permet eliminar gran part de les ambigüitats de fase trobades en la PCRSBT mitjançant el mètode de Sanger . Per tant, és imminent la tipificació de l’HLA per NGS, però encara és necessari introduir algunes millores en el processament, en el programari i en els reactius utilitzats abans que es pugui implementar en el diagnòstic de rutina . En aquest sentit, els nous seqüenciadors de sobretaula esmentats abans sembla que poden ser els més adequats des del punt de vista econòmic i per la possibilitat de dissenyar un procediment de treball totalment automatitzable . De la mateixa manera, la flexibilitat d’aquestes noves plataformes permetrà una transició senzilla des de les aplicacions de seqüenciació ja existents, basades en l’electroforesi capiŀlar (Dunn, 2011) .

ANÀLISI BIOINFORMÀTICA DE LES DADES

No és necessari dir que el desenvolupament que ha experimentat la genètica en les ultimes dècades hauria estat impossible

sense el desenvolupament en paraŀlel de la informàtica . Tampoc no cal esmentar que la ingent quantitat de dades derivada de la seqüenciació massiva d’individus i genomes suposa un problema a l’hora d’emmagatzemar-les, tractar-les i comparar-les . Encara que la discussió detallada de la bioinformàtica necessària associada a la NGS queda fora dels objectius d’aquest capítol, no podem deixar d’esmentar els problemes que suposen alguns dels processos més delicats del circuit d’anàlisi, com són la qualitat de seqüència, l’alineament i l’anotació, entre d’altres . Així mateix, la manipulació dels arxius de sortida característics, incloent tant les lectures individuals com els seus alineaments en seqüències contínues, pot ser un repte a causa de la seva grandària, sobretot quan parlem d’exomes o genomes complets (Radford et al., 2012) . Podria dir-se que ara és fàcil generar molts milions de bases de seqüència que superen la capacitat de còmput de la majoria dels sistemes i que el repte pot ser l’ús eficient . Aquest escenari és molt desitjable en el marc de la investigació bàsica, en què l’atenció se centra en l’obtenció de tanta informació com sigui possible sense la restricció del temps emprat a analitzar les dades per obtenir resultats significatius . Per contra, la gran quantitat de dades generades pot resultar un important obstacle en el trasllat a la rutina clínica .

Des de l’anàlisi de només un gen en el passat recent, passant per l’anàlisi de panells de múltiples gens, fins a la seqüenciació de l’exoma o del genoma complet, hem vist com la complexitat de la tecnologia i la bioinformàtica augmentaven espectacularment i les seves aplicacions clíniques han demostrat ser més complicades del que es plantejava inicialment . El cost de la infraestructura informàtica i de la mà d’obra altament qualificada és enorme i fins i tot inassequible per a petits laboratoris de diag nòstic . El preu d’administrar, emma-

gatzemar i analitzar dades de NGS es dispara fàcilment en centenars de milers d’euros i actualment sembla un obstacle greu per a la implementació de sistemes de NGS en la rutina clínica (Desai i Jere, 2012; Guigó, 2012) . Per tant, en la transició de la NGS cap a la clínica, un dels reptes principals és la simplificació de l’anàlisi de la gran quantitat de dades generades per obtenir informació útil de manera eficient, la simplificació del procés d’identificació de les mutacions/ variacions i també l’aplicació en el laboratori de rutina feta per persones sense una formació bioinformàtica excepcional . Si aconseguim caminar en aquesta direcció, començarem a extreure un benefici extraordinari de les múltiples aplicacions de la NGS en la clínica, incloent-hi la seqüenciació rutinària del genoma .

PERSPECTIVES DE FUTUR

Totes les aplicacions esmentades fins aquí són només el principi . L’impacte de la NGS en el diagnòstic molecular i tot el que comporta en l’àmbit de la salut humana evolucionarà durant les pròximes dècades a una velocitat difícilment predictible ara mateix . Com ja s’ha comentat anteriorment, encara estem assimilant l’impacte de la denominada seqüenciació de nova generació, mentre les plataformes de tercera generació comencen a mostrar les seves potencialitats . D’acord amb les estimacions de la revista Nature, per a finals de l’any 2012 s’espera que en el món s’hauran seqüenciat cent mil genomes humans complets («Human genome: genomes by the thousand», Schadt et al., 2010) . Cal recordar que només ha passat una dècada des de la finalització del Projecte Genoma Humà i abans d’aquesta data el nombre de genomes seqüenciats era zero . Unes poques dotzenes el 2009, 2 .700 l’any 2010 i 30 .000 a la fi de 2011 . A aquest ritme expo -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

nencial, per a l’any 2020 podria ser factible, almenys matemàticament, descodificar el DNA de cada membre de la humanitat en només 12 mesos . Així com qualsevol PC portàtil actual té la capacitat dels grans ordinadors centrals de fa poques dècades, és previsible que la seqüenciació del genoma complet estarà aviat accessible i assequible per a qualsevol persona en el nostre entorn . La capacitat d’emmagatzemar tota aquesta informació de manera eficient ha millorat ostensiblement durant els últims anys . De fet, avui es podria emmagatzemar la informació rellevant del genoma propi en solament unes poques megabases i tenir-la allotjada en el núvol, i és molt probable que en pocs anys la majoria de nosaltres tinguem la nostra pròpia informació genètica en lloc segur per un cost modest . Un problema diferent és la interpretació d’aquestes dades, que de moment resulta extremament complexa quan es tracta d’analitzar malalties i caràcters multifactorials o susceptibilitats i predisposicions genètiques enfront de determinats factors o variables mediambientals . Sens dubte, aquesta interpretació millorarà en els pròxims anys, una vegada que tinguem milions de genomes seqüenciats, a mesura que es vagin coneixent més dades sobre la variabilitat genètica humana i es desenvolupin algorismes apropiats per esbrinar què signifiquen en realitat cadascuna de les variacions poblacionals i individuals (actualment n’hi ha descrites més de vint-i-dos milions) . El repte futur i l’oportunitat per a organismes públics i empreses privades es trobarà en el desenvolupament d’aquests algorismes a mida per a determinades malalties o condicions . Si l’obtenció de la seqüència del genoma és la primera etapa, desxifrar-la és la segona . La gran conseqüència següent serà sens dubte el veritable desenvolupament de la medicina predictiva i personalitzada . Aquests conceptes, dels quals s’ha abu-

sat considerablement en el passat, és molt probable que, ara sí, estiguin a les portes de convertir-se en una realitat; si més no s’estan establint les bases perquè sigui possible des del punt de vista tecnològic . De fet, tal com s’ha apuntat, en especialitats com l’oncologia o la virologia comença a ser una rea litat quan el perfil genètic del pacient o del virus s’utilitza per a la prescripció del fàrmac més adequat en determinats processos tumorals o infecciosos . La seqüenciació de gens individuals i l’ús de xips de DNA en les proves genètiques serà reemplaçat en la pròxima dècada per la seqüenciació del genoma complet, i quan això succeeixi, la medicina predictiva començarà a arribar al seu ple potencial . És evident que la NGS i la seqüenciació de l’exoma o del genoma complet és una eina prometedora amb un gran potencial per millorar l’assistència sanitària i la salut humana en general i, especialment, per prevenir malalties en les persones amb certes predisposicions de base genètica . No obstant això, també planteja importants consideracions ètiques que haurien de tenir-se en compte analitzant-les des de diferents punts de vista . L’estudi genètic d’humans sempre ha estat controvertit des del punt de vista ètic i legal: la preocupació pel consentiment informat, el perill d’estigmatització (és a dir, a ser jutjat o etiquetat com a conseqüència dels resultats de proves genètiques), la privacitat (tant individual com de grup), els interessos d’entitats patronals i asseguradores, la discriminació deguda a les característiques genètiques, etc . Totes les qüestions plantejades per les tecnologies anteriors s’exacerben amb l’aparició de la NGS, i a més planteja noves polèmiques . Encara més, des del moment que es pot arribar a considerar la seqüenciació d’exomes o genomes complets com a mètode de diagnòstic genètic d’aplicació universal, en lloc de la seqüenciació de regions

discretes del genoma . En terme mitjà, cada persona és portadora aproximadament de 250 a 300 variants amb pèrdua de funció en gens anotats i de 50 a 100 variants prèviament descrites com a causants de malalties hereditàries (Genomes Project, 2010) . Per tant, la seqüenciació d’exomes o genomes no només revela la mutació causant de la malaltia, sinó que també pot posar de manifest mutacions causants d’altres malalties monogèniques o factors genètics de risc per a malalties complexes . Atès que és molt probable que en un futur no gaire llunyà aquest tipus d’aproximacions sigui d’aplicació generalitzada en la població, la polèmica clàssica sobre el dret a no saber i a no ser discriminat a causa de les característiques genètiques es torna a plantejar . Una solució a aquesta qüestió implicaria tractar les dades genètiques com qualsevol altre tipus d’informació personal, el propietari de la qual és la pròpia persona . Atès que les dades de seqüència sense una interpretació no tenen valor clínic rellevant, únicament s’haurien d’analitzar les dades corresponents als gens o regions necessaris per portar a terme el diagnòstic requerit en un moment determinat i descartar o emmagatzemar les dades de la seqüència irrellevants, fins a usos futurs amb el consentiment explícit de la persona . No obstant això, es pot presentar una segona polèmica, ja que el dret de la persona a no saber pot desencadenar que la seva descendència pateixi malalties genètiques que es podrien haver evitat en cas d’haver estat informat . Per tant, la nova qüestió és si la informació genètica és propietat de l’individu o de tota la família, incloent-hi els que encara no han nascut . No és l’objectiu d’aquest capítol debatre exhaustivament sobre les diferents qüestions ètiques i legals que es plantejaran, però és necessari posar en relleu que la transició a una nova etapa en la investigació centrada en el genoma en el seu conjunt

comporta qüestions ètiques cada vegada més abundants i més complexes, i els comitès ètics són i continuaran sent cada vegada més cridats a revisar l’ètica de la investigació que implica l’ús d’aquestes tecnologies emergents en la investigació amb éssers humans fins que els legisladors desenvolupin un consens i una orientació ètica consistent (Diamandis, 2009) . Al fil d’aquestes consideracions és difícil no recordar una de les grans peŀlícules del cinema de ciència ficció: Gattaca, d’Andrew Niccol (1997) . El protagonista, Vincent Anton Freeman, és un individu «no vàlid» nascut amb un 99 % de probabilitats de morir per fallada cardíaca i amb una esperança de vida en néixer de trenta anys, segons es desprèn de la interpretació de la seqüència del seu genoma . Per aquest únic motiu, se li nega la possibilitat de ni tan sols intentar convertir-se en pilot espacial . No és previsible que la nostra societat camini en aquesta direcció però cal tenir en compte que el que l’any 1997 semblava molt llunyà des del punt de vista tècnic, està convertint-se avui en una realitat . No obstant els perills potencials, els beneficis que en general suposarà tenir accés a la seqüència genòmica pròpia per a l’ús en la gestió de la salut individual tenen un potencial suficient per fer el treball que sigui necessari per a la resolució dels riscos ètics i les qüestions legals que es puguin plantejar . Superades aquestes consideracions, és inqüestionable que en els pròxims anys les noves tecnologies de seqüenciació tindran un efecte transformador en la utilització i protagonisme de la informació genètica en la rutina clínica que suposarà un impacte en la salut del segle xxi sense precedents .

BIBLIOGRAFIA

Arumugam, M [et al ] (2011) «Enterotypes of the human gut microbiome» Nature, 473: 174-180

Barzon, L .; Lavezzo, E .; Militello, V .; Toppo, S .; Palu, G . (2011) . «Applications of next-generation sequencing technologies to diagnostic virology» . Int. J. Mol. Sci., 12: 7861-7884 . Brosnan, J . A .; I acobuzio-Donahue, C . A . (2012) . «A new branch on the tree: next-generation sequencing in the study of cancer evolution» . Semin. Cell Dev. Biol., 23: 237-242 . Casals, F .; Idaghdour, Y .; Hussin, J .; Awadalla, P. (2012) . «Next-generation sequencing approaches for genetic mapping of complex diseases» . J. Neuroimmunol., 248: 10-22 . Choi, M .; S choll, U . I .; Ji, W .; Liu, T .; Tikhonova, I . R .; Zumbo, P.; Nayir, A .; Bakkaloglu, A .; Ozen, S .; Sanjad, S .; Nelson-Williams, C .; Farhi, A .; M ane, S .; Lifton, R . P. (2009) . «Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106: 1909619101 .

Consortium, E . P.; Bernstein, B . E .; Birney, E .; Dunham, I .; Green, E . D .; Gunter, C .; Snyder, M . (2012) . «An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome» . Nature, 489: 57-74 .

Desai, A . N .; Jere, A . (2012) . «Next-generation sequencing: ready for the clinics?» . Clin. Genet., 81: 503-510 .

Diamandis, E . P. (2009) . «Next-generation sequencing: a new revolution in molecular diagnostics?» . Clin. Chem., 55: 2088-2092 .

Dunn, P. P. (2011) . «Human leucocyte antigen typing: techniques and technology, a critical appraisal» . Int. J. Immunogenet., 38: 463-473 .

Gabriel, C .; Stabentheiner, S .; Danzer, M .; Proll, J . (2011) . «What next? The next transit from biology to diagnostics: next generation sequencing for immunogenetics» Transfus. Med. Hemother., 38: 308317

Genomes Project, C (2010) «A map of human genome variation from population-scale sequencing» Nature, 467: 1061-1073

Gibbs, R A (2011) «Genome-sequencing anniversary Bringing genomics and genetics back together» Science, 331: 548

Grossmann, V ; Kohlmann, A ; Eder, C ; H aferlach, C ; K ern, W ; Cross, N C ; H aferlach, T ; S chnittger, S (2011) «Molecular profiling of chronic myelomonocytic leukemia reveals diverse mutations in > 80% of patients with TET2 and EZH2 being of high prognostic relevance» Leukemia, 25: 877-879

Guigó, R (2012) «Biologia i computació» Treb. Soc. Cat. Biol., 63: 183-198

Hui, P (2012) «Next generation sequencing: chemistry, technology and applications» Top. Curr. Chem. [En premsa]

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

«Human genome: genomes by the thousand» . (2010) . Nature, 467: 1026-1027 .

Lo, Y . M . (2012) . «Non-invasive prenatal diagnosis by massively parallel sequencing of maternal plasma DNA» . Open Biol., 2: 120086 .

Lo, Y . M .; Corbetta, N .; Chamberlain, P. F .; R ai, V .; Sargent, I . L .; R edman, C . W .; Wainscoat, J . S . (1997) . «Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum» . Lancet, 350: 485-487 .

M axam, A . M .; Gilbert, W . (1977) . «A new method for sequencing DNA» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 560-564 .

McPherson, J . D . [et al .] (2001) . «A physical map of the human genome» . Nature, 409: 934-941 .

Meaburn, E .; S chulz, R . (2012) . «Next generation sequencing in epigenetics: insights and challenges» . Semin. Cell Dev. Biol., 23: 192-199 .

Meldrum, C .; Doyle, M . A .; Tothill, R . W . (2011) . «Next-generation sequencing for cancer diagnostics: a practical perspective» . Clin. Biochem. Rev., 32: 177-195 .

Metzker, M . L . (2010) . «Sequencing technologies - the next generation» . Nat. Rev. Genet., 11: 31-46 .

Miyamoto, K .; Ushijima, T . (2005) . «Diagnostic and therapeutic applications of epigenetics» . Jpn. J. Clin. Oncol., 35: 293-301 . Need, A . C .; Shashi, V .; Hitomi, Y .; S choch, K .; Shianna, K . V .; McDonald, M . T .; Meisler, M . H .; Goldstein, D . B . (2012) . «Clinical application of exome sequencing in undiagnosed genetic conditions» . J. Med. Genet., 49: 353-361 .

O ’Sullivan, J .; Mullaney, B . G .; Bhaskar, S . S .; Dickerson, J . E .; H all, G .; O’Grady, A .; Webster, A .; R amsden, S . C .; Black, G . C . (2012) . «A paradigm shift in the delivery of services for diagnosis of inherited retinal disease» J. Med. Genet., 49: 322-326

R adford, A D ; Chapman, D ; Dixon, L ; Chantrey, J ; Darby, A C ; H all, N (2012) «Application of nextgeneration sequencing technologies in virology» J. Gen. Virol., 93: 1853-1868

Sanger, F ; Nicklen, S ; Coulson, A R (1977) «DNA sequencing with chain-terminating inhibitors» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467

S chadt, E E ; Turner, S ; K asarskis, A (2010) «A window into third-generation sequencing» Hum. Mol. Genet., 19: R227-240

Tsui, N B ; K adir, R A ; Chan, K C ; Chi, C ; Mellars, G ; Tuddenham, E G ; Leung, T Y ; Lau, T K ; Chiu, R W ; Lo, Y M (2011) «Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA» Blood, 117: 3684-3691

Venter, J C [et al ] «The sequence of the human genome» Science, 291: 1304-1351

Vissers, L . E .; Ligt, J . de; Gilissen, C .; Janssen, I .; Steehouwer, M .; Vries, P. de; Lier, B . van; Arts, P.; Wieskamp, N .; Rosario, M . del; Bon, B . W . van; Hoischen, A .; Vries, B . B . de; Brunner, H . G .; Veltman, J . A . (2010) . «A de novo paradigm for mental retardation» . Nat. Genet., 42: 1109-1112 . Wagle, N .; Emery, C .; Berger, M . F .; Davis, M . J .; Sawyer, A .; Pochanard, P.; K ehoe, S . M .; Johannessen, C . M .; M acconaill, L . E .; H ahn, W . C .; Meyerson, M .; Garraway, L . A . (2011) . «Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling» . J. Clin. Oncol., 29: 30853096 . Watson, J . D .; Crick, F . H . (1953) . «Molecular structure of nucleic acids, a structure for deoxyribose nucleic acid» . Nature, 171: 737-738 . Wheeler, D . A .; Srinivasan, M .; Egholm, M .; Shen, Y .; Chen, L .; McGuire, A .; He, W .; Chen, Y . J .; M akhijani, V .; Roth, G . T .; Gomes, X .; Tartaro, K .; Niazi, F .; Turcotte, C . L .; Irzyk, G . P.; Lupski, J . R .; Chinault, C .; Song, X . Z .; Liu, Y .; Yuan, Y .; Nazareth, L .; Qin, X .; Muzny, D . M .; M argulies, M .; Weinstock, G . M .; Gibbs, R . A .; Rothberg, J . M . (2008) . «The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing» . Nature, 452: 872876 .

SOBRE L’AUTOR

Francisco Vidal (Villablino, Lleó, 1966) és facultatiu adjunt de Banc de Sang i Teixits . Va estudiar biologia a la Universitat de Barcelona i es va doctorar al Departament de Bioquímica i Biologia Molecular d’aquesta universitat l’any 1996 . Ha desenvolupat la seva trajectòria investigadora al llarg dels últims vint anys en diferents entitats com ara els laboratoris Ferrer Internacional, la Universitat de Barcelona, la Universitat Autònoma de Barcelona i el Centre d’Investigació Cardiovascular (HSCSP-CSIC-ICCC) . L’any 1998 s’incorporà com a investigador al Banc de Sang i Teixits, on, des de 2006, és el responsable del Laboratori de Coagulopaties Congènites . També, és investigador principal del Grup de Diagnòstic i Teràpia Molecular de l’Institut de Recerca Vall d’Hebron . La seva activitat professional

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

actual té un caràcter dual: per una banda, l’activitat assistencial donant suport al diagnòstic molecular, consell genètic i diagnòstic prenatal dels trastorns congènits de la coagulació i altres malalties hereditàries; i per l’altra, la investigació i el desenvolupament de noves aproximacions en el camp del diagnòstic i la terapèutica . Les seves línies principals d’investigació se centren en l’estudi de diversos aspectes bàsics i aplicats de malalties hereditàries de la sang amb elevada rellevància clínica, econòmica i social com ara l’hemofília, la malal-

tia de Von Willebrand i altres coagulopaties minoritàries . Les seves contribucions en l’àmbit de les coagulopaties congènites han merescut el reconeixement del Premi Internacional d’Investigació Duquessa de Sòria i el Premi de la Reial Fundació Victòria Eugènia, entre d’altres . Ha participat en nombrosos projectes nacionals i europeus com a coŀlaborador i com a investigador principal, la seva recerca ha estat finançada de manera continuada durant els darrers anys per entitats públiques i privades i és coautor en més de quaranta publicacions científiques .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 29-47

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .134

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 49-60

L’ENVELLIMENT, APROXIMACIÓ A UN PROCÉS

COMPLEX I HETEROGENI

Albert Selva i Miquel Vilardell

Servei de Medicina, Hospital General Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona

Adreça per a la correspondència: Albert Selva . Servei de Medicina, Hospital General Vall d’Hebron . C . de Siracusa, 12 bis A . 08012 Barcelona . Tel .: 686 093 378 . Adreça electrònica: aselva@vhebron.net .

RESUM

L’envelliment és un procés complex i heterogeni, no tots envellim de la mateixa manera . En els últims anys s’han incorporat nous conceptes clínics i biològics que poden arribar a qüestionar la natura fisiològica del procés . En aquest capítol es defineix el procés i la seva repercussió en la nostra societat, s’incorporen conceptes com ara la fragilitat, la comorbiditat o la discapacitat, que permeten entendre millor i més bé les repercussions de l’envelliment sobre el nostre organisme, i s’analitzen les peculiaritats dels que envelleixen de manera satisfactòria i arriben a centenaris . Es discuteix el concepte anti­ aging des d’una vessant científica i analitzant altres connotacions del concepte . Finalment, s’intenta relacionar l’envelliment del sistema immunitari (immunosenescència) amb algunes malalties autoimmunitàries sistèmiques com ara l’esclerodèrmia i l’arteritis de cèŀlules gegants, i es comenta la progèria i les síndromes progeroides com a models d’estudi de l’envelliment . Paraules clau: envelliment, antienvelliment, immunosenescència, fragilitat .

AGING, AN APPROACH TO A COMPLEX AND HETEROGENEOUS

PROBLEM

SUMMARY

Aging is a complex and heterogeneous process, with relevant differences between subjects . Conceptual, clinic and biological concepts which can challenge the physiologic nature of aging have been incorporated during the last years . In this chapter a proper definition of aging and the social repercussion of the phenomenon is established, and new concepts such as fragility, comorbidity and discapacity which allow a better understanding of aging and related pathology are described . Centenarians and its rationale is also discussed and analyzed, along with the anti-aging phenomenon and its repercussions on ag-

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

ing . Lastly, a possible relationship between some autoimmune systemic diseases such as systemic sclerosis and giant cell vasculitis (Horton’s disease) and immunosenescence, and also the progeroid syndromes as a model of aging are addressed .

Key words: aging, anti-aging, immunosenescence, frailty .

EL PROCÉS DE L’ENVELLIMENT

Els científics de diverses disciplines han experimentat des de sempre una fascinació sobre el pas del temps i la seva repercussió sobre el nostre organisme, és a dir el que seria el procés de l’envelliment . Tot i que amb freqüència s’accepta com un fet irreversible, no és menys cert que des d’àmbits científics i també en el món de la cultura, el cinema, la literatura o el teatre s’ha jugat amb la idea que no necessàriament aquest procés és irreversible i per tant condueix inexorablement a la mort . Peŀlícules com ara Cocoon, de Ron Howard (1985), on éssers humans descobreixen efectes inesperats de rejoveniment en banyar-se en una piscina on havia aterrat una nau extraterrestre, o l’inversemblant fet de l’home que en comptes d’envellir pateix el procés contrari (The curious case of Benjamin Button, de David Fisher, 2008) en són un bon exemple . Tanmateix, el setè art també s’ha adreçat a la situació incòmoda que podria comportar reviure cada dia fets coneguts i repetits, cosa que sens dubte tindria lloc en el cas que el fet vital fos persistent, tal com pateix Bill Murray en la peŀlícula Groundhog day (El dia de la marmota), de Harold Ramis (1993) . Els fets biològics observats en éssers vius menys evolucionats que nosaltres semblen donar suport al fet que es pot incidir sobre el procés de l’envelliment . El model per exceŀlència per estudiar aquest aspecte és el cuc Caenorhabditis elegans (C. elegans), i és en aquest nematode que s’ha aconseguit allargar l’expectativa de vida de l’espècie, el que els anglosaxons anomenen maximum life span, més del 50 % del que s’espera (Ran-

do et al., 2012) . És a dir, extrapolant aquestes dades a l’ésser humà voldria dir que mitjançant la manipulació dels nostres gens es podria aconseguir que el maximum life span de l’ésser humà passes dels teòrics cent vint anys que es considera actualment a la no menyspreable xifra de cent vuitanta anys! Amb les conseqüències socioeconòmiques i polítiques que sens dubte tindria, objecte probablement de noves obres de ciènciaficció .

FRAGILITAT, MALALTIA CRÒNICA

I FAILURE TO THRIVE . NOUS CONCEPTES PER ENTENDRE EL PROCÉS DE L’ENVELLIMENT

Als anys noranta, i especialment arran d’un treball publicat per l’equip de la doctora Linda P. Fried, de l’hospital Johns Hopkins, a Baltimore, EUA, es va introduir en la geriatria el concepte de fragilitat (Fried et al., 2001) . Va ser aquest un fet decisiu per comprendre millor el malalt gran . El mèrit d’aquest grup d’investigació va ser definir, a partir d’una cohort cardiovascular de malalts més grans de 65 anys, quines eren les característiques que definien el vell fràgil, és a dir, el fenotip de la fragilitat . Van observar que aquells subjectes que presentaven una pèrdua de pes no justificada al llarg de l’últim any, alentiment de la marxa, pèrdua de massa muscular, falta de resistència i disminució de l’activitat física tenien un risc molt més alt de mala evolució, discapacitat i fins i tot de mort durant el seguiment (vegeu la taula 1) . Aquest concepte amb posterioritat ha estat útil en altres in-

Taula 1. Fenotip del vell fràgil (agafat de Journal of Gerontology)

A. Característiques de fragilitat

Pèrdua de pes (no intencionada)

Sarcopènia (pèrdua de massa muscular)

Debilitat

Poca resistència, cansament

Lentitud

Poca activitat

B. Mesures del Cardiovascular Health Study

> 4,5 kg de pèrdua no intencionada el darrer any

Força de prensió: 20 % més febles

Cansament (autopercepció)

Caminar 4,5 m: 20 % més lents

kcal/setmana: 20 % pitjors

Homes: < 383 kcal/setmana

Dones: < 270 kcal/setmana

C. Presència de fragilitat

3 criteris: fenotip de fragilitat

1 o 2 criteris: fragilitat intermèdia o prefragilitat

vestigacions sobre subjectes grans, com ara en malalts amb insuficiència renal crònica o amb deteriorament cognitiu .

Des d’un punt de vista fisiològic, parlem de fragilitat quan es produeix una manca d’adaptació del medi intern, de l’homeòstasi, davant de situacions d’estrès o agressions externes (Selva et al., 2005) . És el que alguns autors anomenen «homeostenosi» . En aquestes circumstàncies el vell aparentment sa pot presentar una manca d’adaptació a causa d’una disminució de la reserva fisiològica dels seus òrgans i sistemes que el fa més vulnerable a situacions no necessàriament complexes o greus . Un cas iŀlustratiu seria el d’un vell sa, sense cap malaltia prèvia, que pateix una grip: l’estrès a què és sotmès el seu organisme fràgil (febre, deshidratació, augment de la freqüència cardíaca . . .) pot provocar una pèrdua d’adaptabilitat a causa de la seva escassa reserva fisiològica, i això comportar un mal pronòstic o fins i tot la mort .

Cal no confondre la fragilitat amb dos conceptes també molt útils en geriatria, la comorbiditat i la discapacitat . La comorbiditat fa referència a la presència de dues o més malalties en un individu, i és evident que a més comorbiditat, més fragilitat, però, com hem vist en l’exemple anterior, pot haver-hi fragilitat sense malaltia prèvia .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

D’altra banda hi ha la discapacitat, que és la pèrdua d’una funció, i en els vells, la funció ho és tot (funció física, cognitiva i fins i tot social), però també podem dir que si bé la discapacitat pot comportar fragilitat, pot haver-hi discapacitat important en absència de fragilitat . Un bon exemple seria aquella malalta jove amb artritis reumatoide i dolors articulars a les mans que la discapaciten (no pot escriure o cosir), però en canvi no és una malalta fràgil .

Finalment, hi ha un altre concepte, el failure to thrive, concepte que deriva de la pediatria (aquells nens que no guanyen pes ni creixen) i que podríem traduir com la «síndrome de declinar», i fa referència a aquella situació de fragilitat extrema, ja propera a la mort, en què es considera que tot esforç terapèutic que puguem implementar serà probablement estèril . Concepte conflictiu i discutit per les seves connotacions implícites de nihilisme terapèutic .

ELS

LÍMITS DE LA VIDA:

ELS CENTENARIS, EXPLICACIONS DE PER QUÈ ALGUNS SUBJECTES VIUEN MÉS I MILLOR

És possible que Matusalem hagi estat l’ésser humà que més ha viscut al llarg de

la història —si ens creiem les escriptures bíbliques va arribar a nou-cents anys! Però al marge d’aquest fet, a totes llums qüestionable des del punt de vista científic, n’hi ha d’altres experiències . Al llarg del segle passat diversos estudis han estat encaminats a l’anàlisi dels subjectes que viuen més de cent anys, els centenaris (Hagberg et al., 2008; Wilcox et al., 2008; Balistreri et al., 2012) . Així, als Andes, a la vall de Vilcabamba, a les muntanyes del Caucas, o a la illa d’Okinawa, al Japó, s’han detectat comunitats d’individus centenaris . L’estil de vida, generalment de tipus rural, el reconeixement social o en alguns casos el tipus d’alimentació —consum de iogurt o quefir en la comunitat del Caucas— han estat arguments que fins a cert punt justificaven aquesta longevitat . També al nostre entorn, a la Mediterrània, a l’illa de Sardenya hi ha comunitats centenàries . No obstant això, la manca de registres fiables fa dubtar fins a cert punt sobre algunes d’aquestes comunitats, ja que aquestes dades no sempre han pogut ser confirmades .

És cert que des d’un punt de vista científic és del màxim interès esbrinar quines són les condicions, genètiques o ambientals que poden explicar aquest augment de l’expectativa de vida, per tal d’aprofundir en el coneixement del procés de l’envelliment . L’augment de centenaris al món —es creu que n’hi ha prop de cent mil avui dia— s’ha intentat explicar a partir de dos aspectes fonamentals: la genètica i l’entorn (Murabito et al., 2012) . És evident que uns gens apropiats afavoreixen un envelliment amb èxit i perllongat, però estudis portats a terme amb bessons univiteŀlins demostren que probablement això només explica un 30 % del procés . S’ha intentat sense èxit trobar quins són els gens més rellevants a partir de l’estudi ampliat del genoma humà en centenaris (GWAS, genome wide associations); tan sols el gen de l’apolipoproteïna

E (APOE) implicat en l’envelliment cardiovascular i com a factor de risc de la malaltia d’Alzheimer sembla que hi podria estar relacionat, tot i que fan falta estudis confirmatoris . Quant a l’entorn, cal dir que hi ha estudis adreçats a conèixer quins són els factors mediambientals o relacionats amb la nutrició que poden tenir un paper en l’envelliment . En un ampli estudi sobre vora de mil metges centenaris (Physicians Health Study), es va poder confirmar que els homes que arribaven als setanta anys sense factors de risc cardiovascular, és a dir, no eren diabètics ni hipertensos, no eren fumadors i portaven una vida activa amb exercici físic de manera regular, tenien més del 50 % de possibilitats d’arribar a noranta o cent anys i a més a més en bones condicions físiques i cognitives (Yates et al., 2008) . La dieta mediterrània és ideal per aconseguir un risc cardiovascular menor, cosa que donaria suport als resultats de l’estudi . És més, és ben conegut que una de les accions que al llarg de l’estudi filogenètic demostra de manera constant un benefici quant a l’envelliment és la restricció calòrica . Aquest estudi, no obstant això, es va portar a terme només en homes, i sembla que hi ha unes certes diferències entre homes i dones en relació amb l’envelliment i la manera de produir-se, almenys en edats extremes com en els centenaris .

De la coneguda cohort per a estudi del risc cardiovascular del poblet de Framingham a Massachusetts (EUA), l’any 2011 es va poder analitzar el nombre i les característiques del subjectes que havien arribat a centenaris (Murabito et al., 2012) . Dels individus que inicialment van ingressar en aquesta cohort al 1948, el 55 % eren dones, però quan es va mirar el nombre dels que havien arribat a centenaris, es va veure que hi havia 43 dones i nomes 6 homes . És més, sembla que el perfil entre homes i dones és una mica diferent: els homes

solen arribar a centenaris sense haver passat per gaires malalties, mentre que les dones, que com hem vist arriben amb més freqüència a centenàries, ho fan havent passat per més problemes de salut .

EL FENOMEN ANTI-AGING, ESTEM PARLANT D’UN OXÍMORON?

El Diccionari de la llengua catalana (Institut d’Estudis Catalans) defineix oxímoron com una figura retòrica, variant de l’antítesi, que consisteix a posar de costat mots o unitats sintàctiques de sentit oposat, com ara, per exemple, monstre bonic o els sons del silenci . Així doncs, ens preguntem si el fenomen anti­ aging, és a dir, l’antienvelliment, és un oxímoron, una contradicció, ja que es refereix a un fet biològic aparentment irreversible . El conjunt de mesures encaminades a alentir, aturar i fins i tot revertir els fenòmens biològics associats a l’envelliment, i a perllongar la durada de la vida fins al màxim, podria ser una bona definició d’antienvelliment . No obstant això, aquest fet no és tan clar, i hi ha suficients investigacions per poder qüestionar-ho . Així doncs, estudis sobre la influència de la restricció calòrica en l’envelliment, o en relació amb el consum de certes substàncies com ara el resveratrol, que es troba en el vi negre i el cava i que sembla activar les sirtuïnes, molècules reguladores d’alguns processos biològics fonamentals, o l’administració d’algunes hormones com ara l’hormona del creixement, han qüestionat amb més o menys encert la irreversibilitat de l’envelliment ceŀlular (Gaman et al., 2001) .

Tots aquest avanços van portar que l’any 1993 es constituís una associació als Estats Units, encaminada a implementar estudis i intervencions que aparentment millorarien i retardarien l’envelliment, que es va

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

anomenar el moviment anti­ aging (Domínguez et al., 2009) . Tot i que no va ser reconegut per l’Acadèmia de Ciències Americana, l’impacte sobre la població arreu del món occidental va ser molt gran, i tot i que semblava estar imbuït per un esperit científic, i fins i tot ser una contestació al coneixement gerontològic establert fins ara en universitats, revistes i societats científiques convencionals, va derivar cap a un caire comercial de dubtós rigor científic . Tot això va portar l’any 2002 a la publicació d’un manifest de cinquanta-un metges de reconegut prestigi en el món de la geriatria que qüestionava el model anti­ aging catalogant-lo com a pseudociència i que defensava l’avenç científic basat en l’evidència i el mètode experimental («The truth about human ageing . No truth to the Fountain of Youth», Scientific American, 2002)

Ara bé, hi ha algun motiu per creure que podem parar i fins i tot revertir el rellotge biològic, i per tant aturar i revertir l’envelliment? És cert que des d’un punt de vista estrictament biològic, la reproducció, l’aparició d’un nou ésser viu, és una demostració de «posada a zero» del rellotge biològic, tot i que des d’una perspectiva més individual costi d’entendre o fins i tot d’acceptar . D’altra banda, estudis de clonalitat han demostrat que el nucli ceŀlular de qualsevol cèŀlula somàtica en un ambient adequat, com ara el citoplasma de l’oòcit, pot donar lloc a un ésser viu a temps «zero», fins i tot en animals evolucionats com els mamífers, com és conegut en el cas de l’ovella Dolly . És a dir, aquest nucli ceŀlular ha rejovenit, o sens dubte pot fer-ho, i no genera un envelliment prematur en el nou ésser viu (Rando et al., 2012) .

En qualsevol cas, sembla que un augment en el coneixement dels processos genètics com ara les mutacions del DNA, o epigenètics, és a dir, en la maquinària que regula l’expressió dels gens a partir de la metilació

dels nucleòtids, la modificació de les histones o de l’RNA de transferència, pot ajudar a entendre encara més el procés de l’envelliment i probablement permetrà una modificació i perllongament de la vida, si és això el que volem com a societat i com a individus . No oblidem, però, que seguint un antic aforisme grec, més que viure indefinidament poder seria més desitjable «morir joves, tant tard com sigui possible», ja que la longevitat sense qualitat de vida perd el seu sentit .

ALGUNS FETS CURIOSOS

SOBRE L’ENVELLIMENT D’ALGUN

DELS NOSTRES ÒRGANS

I SISTEMES

Un dels fets que més crida l’atenció quan parlem de persones grans és la pèrdua d’alçada, com si aquell individu s’hagués «encongit» . Això es pot mesurar de manera objectiva, i per tant podem parlar sense por d’errar que «com més grans ens fem, més petits ens tornem» . Quina explicació podem donar a aquest fenomen? Bé, un dels fets que pot contribuir-hi és l’osteoporosi . Especialment en la dona després de la menopausa i en part a causa de la pèrdua d’estrògens i el seu trofisme sobre l’os, es produeix una pèrdua de massa òssia, és a dir, l’osteoporosi . Això també succeeix en l’home, si bé de manera menys acusada, tot i que en edats molt extremes (els anomenats «vells molt vells» o very old o too old pels anglosaxons) s’equipara amb la dona el risc de fractura o aixafament vertebral, principal complicació de l’osteoporosi . Com a conseqüència de tot això es produeix una pèrdua d’alçada . També la pèrdua d’aigua que inexorablement es dóna en envellir fa que el discs intervertebrals se sequin i perdin turgència amb la pèrdua consegüent de volum, i això contribueix, doncs, a fer-nos

més petits . Això fa que la tendència natural de la persona gran sigui envers una pèrdua d’alçada i una certa tendència l’encorbament cap endavant o cifosi .

Ara bé, no tots els ancians que veiem encorbats ho són per un problema estructural de la columna vertebral per osteoporosi o pèrdua de la turgència dels discs intervertebrals, tal com hem comentat, sinó que això pot ser també degut a un problema funcional . Tot sovint, si ens fixem, veiem pel carrer ancians molt encorbats cap endavant, com si el pes dels anys no els deixés mantenir-se drets, i com ara veurem, fins a cert punt és així . Són malalts amb una cifosi dorsal molt important que els impedeix la posició erecta però que d’altra banda no tenen cap dificultat per estirar-se al llit, i quan ho fan desapareix aquesta cifosi (vegeu la figura 1) . Això és degut a una alteració de la musculatura paravertebral, que en condicions normals s’encarrega d’aguantar el pes de la columna vertebral, cosa que ens permet mantenir la posició erecta . El fracàs d’aquesta musculatura dóna lloc al quadre clínic descrit de cifosi dorsal adquirida o camptocòrmia (del grec kamptós, ‘corbat’, i kormós, ‘tronc’) o síndrome de l’esquena doblegada (en anglès, bent spine syndrome) (Sel-

Figura 1. Camptocòrmia (bent spine syndrome) o síndrome de l’esquena doblegada.

va et al., 2010) . Si fem una prova d’imatge, com per exemple una tomografia computada de columna, podrem apreciar que la densitat radiològica d’aquests músculs indica que han degenerat, hi ha atròfia i han estat substituïts per greix . Encara més sorprenent, la pràctica d’una biòpsia dels músculs paravertebrals ens permetrà observar un teixit muscular infiltrat amb greix però també unes infiltracions de cèŀlules rodones i material proteic, com ara l’amiloide, les proteïnes τ o altres proteïnes que són pròpies de processos degeneratius . Aquestes proteïnes es troben en els anomenats cossos d’inclusió, que també es poden observar en els malalts grans amb miositis amb cossos d’inclusió, que és la miopatia adquirida més freqüent a partir de cinquanta anys d’edat, i que alguns autors creuen que es podria considerar com l’Alzheimer del múscul, a causa de la similitud de les proteïnes degeneratives trobades en aquests cossos d’inclusió (com ara l’amiloide β) . Al mateix temps que les persones grans perden alçada, també es dóna un altre fet curiós, i és l’augment dels apèndixs facials, és a dir, el nas i les orelles . Així com el teixit cartilaginós dels ossos es transforma en teixit ossi durant la pubertat i limita el creixement normal dels adolescents, el nas i les orelles de les persones grans, únicament de naturalesa cartilaginosa, creixen sense límits, i és per això que es veuen orelles i nassos molt grans, tant més grans com més vells són els individus . Aquest tret facial és característic dels vells i ha estat recollit també en nombroses pintures i gravats (com el Retrat de cavaller ancià, d’El Greco, 1587-1600) .

Un altre fet lligat a l’envelliment és l’aparició dels cabells blancs . Sembla que es deu a la pèrdua de pigmentació, és a dir, del contingut de melanina del foŀlicle pilós, ja que un excés de radicals d’oxigen lesiona els melanòcits de la zona . Aproximadament

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

el 50 % dels homes i dones presenten aquesta decoloració dels cabells cap a cinquanta anys, però en situacions d’envelliment prematur com les síndromes progeroides, es produeix de manera prematura, tal vegada durant les primeres dècades de vida . Alguns estudis relacionen l’aparició dels cabells blancs amb malalties cardiovasculars o amb l’osteoporosi, i llavors són considerats un marcador extern de l’envelliment (McDonough et al., 2012) .

LES MALALTIES SISTÈMIQUES

AUTOIMMUNITÀRIES COM A PARADIGMA D’INTERACCIÓ INFLAMACIÓ/FIBROSI

I ENVELLIMENT

En el si del coneixement mèdic les malalties sistèmiques autoimmunitàries ocupen un lloc propi . Com el seu nom indica, són malalties que poden afectar nombrosos òrgans i sistemes, des d’òrgans tan importants per al manteniment de l’homeòstasi com el ronyó fins a estructures que permeten la interacció amb l’entorn que ens envolta com pot ser la pell; des de destrucció de cèŀlules de la sang com els eritròcits en forma d’anèmia hemolítica fins a lesió d’òrgans nobles i vitals com els òrgans sensorials o el sistema nerviós . I és per tot això que reben el nom de sistèmiques . Però també hi participa el sistema immunitari, d’una manera o altra . Moltes d’aquestes malalties tenen trastorns de la immunitat que es posen de manifest a partir de la detecció en la sang, sèrum o plasma, d’autoanticossos, com poden ser els anticossos contra el DNA propi o contra estructures intranuclears o citoplasmàtiques . És a dir, es produeix una manca de tolerància a les estructures pròpies, cosa que dóna lloc a la lesió dels nostres teixits amb les conseqüents manifestacions clíniques .

Taula 2. Canvis produïts durant l’envelliment en el sistema immunitari (immunosenescència) (agafat d’Arthritis Research and Therapy)

Immunitat adaptativa

Disminució de les cèŀlules T naïve (vol dir ‘verges’, ‘no estimulades’)

Increment de les cèŀlules T efectores/memòria

Acumulació de cèŀlules T CD8+CD28 –

Menys acumulació de cèŀlules T CD4+CD28 –

Contracció de la diversitat del repertori immunitari

Immunitat innata

Esbiaix de les cèŀlules pluripotencials del sistema hematopoètic cap a la sèrie mieloide

Es manté l’expressió del patró de reconeixement de receptors (per exemple, receptors Toll-like)

Empitjorament de la circulació de les cèŀlules dendrítiques

Disminució de la resposta de les cèŀlules dendrítiques als receptors Toll-like

Factors exògens

Augment de la càrrega infecciosa

Reactivació d’infeccions persistents

També, és ben conegut que amb el pas dels anys amb l’envelliment es produeixen una sèrie de canvis en el sistema immunitari, el que es coneix com a immunosenescència (Pawelec, 2012) . Aquestes modificacions, recollides a la taula 2, poden explicar, si més no en part, algunes situacions clíniques freqüents en els ancians, com la incidència més gran de càncer o d’infeccions més greus a causa de menys immunovigilància, una resposta pitjor a les vacunes que de vegades ha portat fins i tot a qüestionar-ne la utilitat, o la detecció de paraproteïnes de significat incert en la sang d’aquests pacients, paraproteïnes produïdes de manera clonal per les cèŀlules plasmàtiques . Així doncs, la pregunta que es planteja és: pot aquesta immunosenescència tenir un paper en la producció, almenys, d’algunes malalties sistèmiques autoimmunitàries? Entre les diferents malalties conegu-

des, almenys n’hi ha dues que mereixen un comentari: l’arteritis de cèŀlules gegants o de Horton, i l’esclerodèrmia .

L’esclerodèrmia (literalment ‘pell dura’) o esclerosi sistèmica progressiva és un trastorn autoimmunitari que tradicionalment, almenys durant el segle passat, s’havia catalogat com una malaltia en què semblava que es donava, fins a un cert punt, un envelliment prematur . De fet, s’esmenta com a entitat a tenir en compte en el diagnòstic diferencial amb altres malalties d’envelliment prematur com ara les síndromes progeroides (Bes et al., 2010), entre les quals trobem la malaltia de Werner (semblant a la síndrome de Hutchinson-Gilford) .

Tot i que avui dia es coneix molt millor l’etiopatogènia i fisiopatologia d’aquesta entitat, si bé encara de manera insuficient, és cert que el fenotip, l’aspecte extern dels malalts, més aviat malaltes (hi ha una afectació preferent del sexe femení), suggereix un envelliment prematur . La típica fàcies de l’esclerodèrmia (vegeu la figura 2) es caracteritza per la presència d’una pell endurida, envellida i arrugada, que confereix al malalt el típic aspecte d’ocell . L’aparició de plecs al voltant de la boca encara afavoreix més la imatge d’una persona envellida . També, la presència de dipòsits de calci als teixits (calcinosi) o la destrucció de les parts acres de les falanges dels dits (acrosteòlisi) propis d’aquesta malaltia també són fets que es poden observar en l’envelliment prematur com ara en algunes síndromes progeroides .

Dels tres processos que es creu que participen en la fisiopatologia de la malaltia, la lesió vascular i isquèmia (el fenomen de Raynaud o d’isquèmia transitòria de la circulació dels dits n’és característic), el trastorn autoimmunitari vehiculat tant per les cèŀlules T com per les cèŀlules B (la presència d’autoanticossos és un fet freqüent i que ajuda tant al diagnòstic com a la classifi-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

cació d’aquests malalts) i l’activació o disfunció dels fibroblasts, cèŀlules que tenen un paper en l’aparició de fibrosi, és aquest últim el que sembla responsable dels canvis externs que confereixen el fenotip esmentat .

No tan sols l’aspecte físic està alterat sinó que també els òrgans interns poden «envellir» . La fibrosi pulmonar, primera causa de mort en aquests malalts, l’afectació intestinal, i fins i tot de vegades el cor mateix poden expressar aquesta fibrosi, tal vegada a conseqüència d’un procés inflamatori o isquèmic previ . En aquest sentit s’ha implicat el paper d’algunes citocines, com ara la interleucina-6, molècula llargament involucrada en els processos inflamatoris de baix voltatge però persistents (inflammaging) que semblen desenvolupar un paper en el complex procés de l’envelliment . Totes aquestes alteracions de vegades donen lloc a canvis irreversibles que fins i tot poden conduir a la mort .

Acompanyant aquestes anomalies que confereixen el característic aspecte extern

i les ja comentades alteracions dels òrgans interns que es podrien traduir en un envelliment prematur, se n’han descrit d’altres en els fibroblasts de malalts amb esclerodèrmia que posen de manifest una disminució en el seu funcionament i també de la seva vida mitjana, és a dir, el que podríem considerar un envelliment d’aquests fibroblasts . Així mateix, també s’ha trobat que els telòmers dels limfòcits en malalts amb esclerodèrmia estan més escurçats que en la resta de la població (Artlet et al., 1996), i com ja se sap, el telòmers, les seqüències terminals dels cromosomes, tenen les funcions de donar estabilitat a la replicació del cromosoma i protegir de manera natural el DNA ceŀlular . L’envelliment ceŀlular s’ha relacionat clarament amb una disminució de la longitud dels telòmers, i aquesta és una línia de recerca actual en l’àrea de l’envelliment (Hohensinner et al., 2011) .

D’altra banda, la malaltia anomenada arteritis de cèŀlules gegants és una vasculitis típica de la gent gran, és a dir, una inflamació de tipus immunitari que afecta grans vasos . Com totes les vasculitis, s’inscriu en l’ampli grup de les malalties sistèmiques autoimmunitàries, i per arribar al diagnòstic cal la presència d’unes manifestacions clíniques característiques però també la identificació d’un substrat patològic . És a dir, és una entitat clinicopatològica . Aquesta vasculitis, però, té una peculiaritat ben curiosa, i és que afecta únicament i exclusivament persones grans, i com més grans més elevada n’és la incidència . Aquesta relació directa amb l’envelliment sembla que podria explicar-se en part pels trastorns de la immunitat —especialment a escala de les cèŀlules dendrítiques, cèŀlules presentadores d’antígens, localitzades als vasos sanguinis, més concretament de l’artèria temporal— propis de la immunosenescència, i els canvis produïts en l’endoteli i en la resta de la paret vascular pel procés mateix de l’envelliment

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

Figura 2. Fàcies d’una malalta amb esclerodèrmia.

(Mohan et al., 2011) . És, per tant, un bon model de relació entre envelliment i malaltia .

LLIÇONS D’UNA MALALTIA

AFORTUNADAMENT INFREQÜENT:

LA PROGÈRIA, UN ENVELLIMENT ACCELERAT

La síndrome de Hutchinson-Gilford o progèria és una síndrome clínica d’herència autosòmica dominant que cursa amb un envelliment prematur dels subjectes afectats (Merideth et al., 2008) . Tan sols un canvi d’un nucleòtid (glicina GCC a glicina GGT) al codó 608 de l’exó 11 del gen de la làmina A (es pot considerar una laminopatia) dóna lloc a aquest estrany trastorn . Els nens, ja que és una malaltia que apareix a la infància, desenvolupen característiques pròpies de l’envelliment, i així la pell es torna transparent i prima amb els vasos sanguinis molt marcats, especialment les venes, apareix una sordesa neurosensorial similar a la presbiacúsia dels vells, i també artrosi als genolls i als malucs . El fenotip d’aquests malalts recorda, malgrat la seva jove edat,

el dels vells més fràgils (vegeu la figura 3) . Per desgràcia, aquests malalts moren vora els tretze anys, preferentment de malalties cardiovasculars . La fisiopatologia d’aquest trastorn es troba en l’anomalia estructural de la làmina A, que és en aquest cas una proteïna mutada, que rep també el nom de progerina, la qual, mitjançant l’acció de l’enzim farnesil-transferasa (enzim que normalment té un paper en la interacció membranes-proteïnes) queda «ancorada» a la membrana nuclear interna, cosa que ocasiona una desestructuració nuclear i també una expressió deficient d’altres gens importants . Tot això es creu que és el que es tradueix com a expressió clínica en forma d’envelliment accelerat o prematur, que com ja hem dit acaba portant el nen a la mort . És possible que tractaments encaminats a inhibir l’acció d’aquest enzim (farnesil-transferasa) que manté enganxada la progerina a la membrana nuclear interna puguin millorar la situació clínica d’aquests malalts . Hi ha un assaig clínic en curs per explorar aquest tractament . Tanmateix, arran del coneixement de la síndrome de la progèria, hi ha dos aspectes que mereixen una reflexió . En primer lloc, que la causa de mort dels nens que pateixen aquesta malaltia sigui de tipus cardiovascular, i no neoplàsic . Aquesta dada dóna suport al conegut aforisme que diu «tenim l’edat de les nostres artèries», per la qual cosa per tal de mantenir un envelliment saludable hauríem de tenir cura de tots aquells factors modificables que facin patir les nostres artèries, siguin exògens com el tabac, o endògens com la pressió arterial o els valors elevats de colesterol . En segon lloc, no s’escapa que la progèria és un model excellent per a l’estudi de l’envelliment sobre el qual es pot poder intervenir, i de fet s’ha vist que l’envelliment usual, el que podríem anomenar envelliment «fisiològic», cursa també amb alteracions de la làmina A, és

Figura 3. Síndrome de Hutchinson-Gilford (progèria) (agafat de The New England Journal of Medicine).

a dir, els fibroblasts dels ancians expressen mutacions de la làmina A ( progerina) de manera significativa amb més freqüència que els joves . Així doncs, un cop més el coneixement bàsic de malalties poc freqüents pot ajudar a comprendre fets molt més generals i fins ara considerats irreversibles o fisiològics com el cas de l’envelliment .

BIBLIOGRAFIA

Artlet, C . M .; Black, M . C .; Briggs, D . C .; Stevens, C . O .; Welsh, K . I . (1996) . «Telomere reduction in scleroderma patients: A possible cause of chromosome instability» . Br. J. Rheumatol., 35: 732-737 . Balistreri, C . R .; Candore, G .; Accardi, G .; Bova, M .; Buffa, S .; Bulati, M .; Forte, G . I .; Listi, F .; Martorana, A .; Palmeri, M .; Pellicano, M .; Vaccarino, L .; Scola, L .; Lio, D .; Colonna-Romano, G . (2012) . «Genetics of longevity . Data from the studies on Sicilian centenarians» . Immun. Aging, 9: 8 . Bes, C .; Vardi, S .; Güven, M .; Soy, M . (2010) . «Werner’s syndrome: a quite rare disease for differential diagnosis of scleroderma» Rheumatol. Int., 30: 695-698 .

Dominguez, L . J .; Barbagallo, M .; Morley, J . E . (2009) . «Anti-aging medicine: pitfalls and hopes» . Aging Male, 12: 13-20 . Fried, L . P.; Tangen, C . M .; Waltson, J .; Newman, A . B .; Hirsch, C .; Gottdiener, J .; Seeman, T .; Tracy, R .; Kop, W . J .; Burke, G .; Mcburnie, M . A .; Cardiovascular Health Study Collaborative Research Group (2001) «Frailty in older adults: evidence for a phenotype» J. Gerontol., 56: 146-156

Gaman, L ; Stoian, I ; Atanasiu, V (2001) «Can ageing be slowed? Hormetic and redox perspectives» J. Med. Life, 4: 346-351

Hagberg, B ; Samuelsson, G (2008) «Survival after 100 years of age: a multivariate model of exceptional survival in Swedish centenarians» J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci., 63A: 1219-1226

Hohensinner, P J ; Goronzy, J J ; Weyand, C M (2011) «Telomere dysfunction, autoimmunity and aging» Aging and Disease, 2: 524-537

Mcdonough, P H ; Schwartz, R A (2012) «Premature hair graying» Cutis, 89: 161-165

Merideth, M A ; Gordon, L B ; Clauss, S ; Sachdev, V ; Smith, A C M ; Perry, M B ; Brewer, C C ; Zalewski, C ; Kim, H J ; Solomon, B ; Brooks, B P ; Gerber, L H ; Turner, M L ; Domingo, D L ; Hart,

T . C .; Graf, J .; Reynolds, J . C .; Gropman, A .; Yanovski, J . A .; Gerhard-Herman, M .; Collins, F . S .; Nabel, E . G .; Cannon, R . O ., 3rd; Gahl, W . A .; Introne, W . J . (2008) . «Phenotype and course of the Hutchinson-Gilford progeria syndrome» . N. Engl. J. Med. 358: 592-604

Mohan, S . V .; Liao, J . Y .; Kim, J . W .; Goronzy, J . J .; Weyand, C . M . (2011) . «Giant cell arteritis: immune and vascularaging as disease risk factors» . Arthritis Research & Therapy, 13: 231 . Murabito, J . M .; Yuan, R .; Lunetta, K . L . (2012) . «The search for longevity and healthy aging genes: insights from epidemiological studies and samples of long-lived individuals» . J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci., 67A: 470-479 .

Pawelec, G . (2012) . «Hallmarks of human “immunosenescence”: adaptation or dysregulation?» . Immun. Aging, 9: 15 .

Rando, T . A .; Chang, H . Y . (2012) . «Aging, rejuvenation, and epigenetic reprogramming: resetting the aging clock» . Cell, 148: 46 . Selva, A .; Gual, N .; Alegret, A . (2010) . «Miopatías en las personas de edad avanzada» . Año Gerontológico, 23: 67-80 .

Selva, A .; Vilardell, M . (2004) . «Fragilidad, actualización de un concepto relevante en la geriatría moderna» . Año Gerontológico, 18: 53-59 . Willcox, D . C .; Willcox, B . J .; Wang, N . C .; He, Q .; Rosenbaum, M .; Suzuki, M . (2008) . «Life at the extreme limit: phenotypic characteristics of supercentenarians in Okinawa» . J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci., 63A: 1201-1208 . Yates, L .; Djousse, L .; Kurth, T .; Buring, J . E .; Gaziano, J . M . (2008) . «Exceptional longevity in men» . Arch. Intern. Med., 168: 284-290 .

SOBRE ELS AUTORS

Albert Selva és metge adjunt del Servei de Medicina Interna que dirigeix el professor Miquel Vilardell a l’Hospital General Universitari Vall d’Hebron, especialista en medicina interna des de l’any 1990 per la via MIR i especialista en geriatria des de l’any 2002 pel Ministeri d’Educació . Forma part del comitè editorial de la revista biomèdica Medicina Clínica, de la qual és redactor en cap des de l’any 2000, i està acreditat per a la recerca per l’Agència de Qualitat

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

Catalana (AQU) i per l’ANECA . Professor titular de medicina de la Universitat Autònoma de Barcelona des de l’any 2010 . Miquel Vilardell és el cap del Servei de Medicina Interna de l’Hospital General Universitari Vall d’Hebron, especialista

en medicina interna i catedràtic de medicina de la Universitat Autònoma de Barcelona . Editor de la revista biomèdica Medicina Clínica i expresident del Coŀlegi Oficial de Metges de Barcelona .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 49-60

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .135

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 61-75

TERÀPIES AVANÇADES: PRESENT I FUTUR

Jordi Barquinero

Institut de Recerca Vall d’Hebron, Barcelona

Adreça per a la correspondència: Jordi Barquinero . Àrea de Teràpia Gènica i Ceŀlular, Institut de Recerca Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona . Pg . de la Vall d’Hebron, 119-129 . 08035 Barcelona . Tel .: 932 746 726 . Adreça electrònica: jordi.barquinero@vhir.org .

RESUM

Les teràpies avançades (TA) representen una sèrie de noves modalitats terapèutiques que inclouen l’ús de cèŀlules substancialment manipulades, la teràpia gènica (TG) i l’enginyeria de teixits, disciplines que han tingut un desenvolupament espectacular en els darrers vint anys, com a conseqüència d’una millor comprensió de les bases moleculars i cellulars de moltes malalties, de noves eines per modificar genèticament les cèŀlules (vectors) i dels avenços sobre cèŀlules mare . Les TA tenen àmbits d’aplicació molt diversos, des del càncer o les malalties hereditàries (per exemple, en el cas de la TG), a lesions de l’aparell locomotor, malalties autoimmunitàries, degeneratives o el trasplantament, en el cas de les teràpies ceŀlulars (TC) o l’enginyeria de teixits . Tal com passa amb qualsevol tractament, les TA tenen riscos, de vegades molt greus, per la qual cosa és necessari assegurar-se raonablement que els beneficis possibles superin els riscos potencials . D’altra banda, si volem que s’investigui en aquestes noves teràpies i que aquestes arribin aviat als pacients cal evitar un excés de regulació de les agències responsables . Finalment, també cal que els professionals transmetem missatges realistes a la societat per tal d’evitar que es creïn falses expectatives .

Paraules clau: teràpia avançada, teràpia ceŀlular, teràpia gènica, cèŀlula mare, agència reguladora .

ADVANCED THERAPIES: PRESENT AND FUTURE

SUMMARY

Advanced therapies (TAs) are a series of new therapeutic modalities including those using substantially manipulated cells, gene therapy and tissue engineering, fields that have

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

grown dramatically in the last 20 years as due to a better understanding of the molecular and cellular mechanisms of many diseases, new tools for genetic modification of cells (vectors) and advances in stem cells . TAs have many different application areas, ranging from cancer and hereditary diseases (e .g . in the case of gene therapy), musculoskeletal lesions, autoimmune, degenerative or transplants in the case of cells therapies or tissue engineering . As occurs with any treatment, TAs have risks, sometimes very dramatic, so it is reasonably necessary to ensure that potential benefits outweigh the potential risks . On the other hand, if we want that these therapies are investigated and get soon to the patients bedside, over-regulation by the responsible agencies should be avoided . Lastly, health care and media professionals must convey to the society realistic messages to avoid creating false expectations .

Key words: advanced therapy, cell therapy, gene therapy, stem cell, regulatory agency .

ÍNDEX DE SIGLES

AAV: virus adenoassociats

AEMPS: Agència Espanyola de Medicaments i Productes Sanitaris

ATMP: producte medicinal de teràpia avançada (advanced therapy medicinal product)

CAT: comitè de teràpies avançades de l’Agència Europea del Medicament

EMA: Agència Europea del Medicament

FDA: Food and Drug Administration

GMP: bones pràctiques de producció ( good manufacturing practice)

GTMP: producte medicinal de teràpia gènica ( gene therapy medicinal product)

GVHD: malaltia de l’empelt contra l’hoste ( graft versus host disease)

iPSC: cèŀlula amb pluripotencialitat induïda (induced pluripotent stem cell)

MSC: cèŀlula mare mesenquimàtica (mesenchymal stem —or stromal— cell)

sCTMP: producte medicinal de teràpia ceŀlular somàtica (somatic cell therapy medicinal product)

TA: teràpies avançades

TC: teràpia ceŀlular

TEP: producte d’enginyeria tissular (tissue engineered product)

TG: teràpia gènica

INTRODUCCIÓ

Els avenços que s’han produït en els darrers trenta anys en biologia molecular, cellular o fisiopatologia ens ofereixen noves eines, tecnologies i possibilitats terapèutiques que fa tan sols un quart de segle eren inimaginables . Es coneixen com a teràpies avançades (TA) totes les estratègies amb finalitat terapèutica basades en cèŀlules o teixits manipulats, o bé en molècules portadores d’informació genètica . Així, podem dividir les TA fonamentalment en tres disciplines: la teràpia ceŀlular (TC), la teràpia gènica (TG) i l’enginyeria tissular . Aquesta darrera disciplina no serà tractada en aquest capítol, ja que hi ha un capítol específic en aquest mateix volum de treballs de la scb . Tampoc no es tractarà la nanomedicina, especialitat que alguns experts també consideren dins les TA . Un concepte essencial en TA és el que s’anomena producte medicinal de teràpia avançada, o amb les seves sigles en anglès (ATMP), que es defineix com qualsevol producte medicinal basat en la TG, en cèŀlules somàtiques manipulades o en l’enginyeria de teixits . Així doncs, tenim els GTMP ( gene therapy medicinal products), els sCTMP (somatic cell therapy medicinal products) i els TEP (tissue engineered products) . El ràpid creixe-

ment de les TA en els darrers anys ha estat clarament afavorit per les troballes de diferents tipus de cèŀlules mare (stem cells) en la majoria de teixits adults i per una millor comprensió de la biologia d’aquestes cèŀlules, així com per nous desenvolupaments en el coneixement de les cèŀlules embrionàries, i el descobriment de nous paradigmes com ara les cèŀlules amb pluripotencialitat induïda (iPSC) o la transdiferenciació .

Una gran part de la recerca en TA s’orienta a malalties que es consideren incurables o bé a aquelles en les quals les teràpies disponibles no són prou satisfactòries . Malgrat tot, l’àmbit d’aplicació de les TA és potencialment molt ampli, i inclou, en el cas de la TG, des del càncer a un gran nombre de malalties hereditàries i, en el cas de la TC, molts processos degeneratius . De fet, les TA, i en especial les basades en cèŀlules mare, són la base de la medicina regenerativa .

TERÀPIA CEL·LULAR

La TC consisteix en l’ús de cèŀlules amb una finalitat curativa o preventiva . No es considera TC una transfusió d’eritròcits o de plaquetes, ni tan sols un trasplantament hematopoètic convencional, encara que tots aquests procediments es facin amb cèŀlules, ja que el concepte de TC implica necessàriament una manipulació substancial de les cèŀlules (per exemple, cultiu, expansió ex vivo, modificació genètica, exposició a antígens in vitro, etc .) . Tampoc no són TA els trasplantaments d’òrgans sòlids ni de teixits no manipulats, encara que aquests estiguin formats per cèŀlules . La TC implica l’ús de cèŀlules que, bé perquè formen part d’un teixit líquid (per exemple, la sang) o bé perquè s’han disgregat, es troben en suspensió o en cultius adherents . Tenint en compte la procedència de les cèŀlules utilitzades, podem classificar les TC en aquelles

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

que utilitzen cèŀlules de l’individu mateix (autòlogues) o cèŀlules d’un altre donant (a llogèniques) . En el cas que el donant no fos de l’espècie humana, parlaríem de cèŀlules xenogèniques .

Les TC poden funcionar per diferents mecanismes, i no sempre és necessari que les cèŀlules que s’administren siguin cèŀlules que facin la funció pròpia del teixit diana o s’hi converteixin (per exemple, miocardi o os) . Per exemple, algunes cèŀlules de la meduŀla òssia poden fusionar-se amb altres cèŀlules residents en teixits o òrgans lesionats, o bé simplement actuen mitjançant mecanismes paracrins, basats en la secreció de substàncies tròfiques que poden estimular progenitors endògens residents en els teixits lesionats (Gnecchi et al., 2008) . De fet, molts investigadors pensen que un millor coneixement d’aquests efectes paracrins donarà lloc a noves estratègies terapèutiques que podrien evitar en molts casos l’ús de cèŀlules . Els teixits lesionats, per altra banda, generen senyals que atrauen cèŀlules que puguin afavorir la regeneració . Un exemple: en un trasplantament hematopoètic, les cèŀlules mare administrades nien en la meduŀla òssia, però només si aquesta ha estat prèviament condicionada amb un tractament mieloablatiu prou intens (basat en radioteràpia o quimioteràpia) . Un altre exemple: si infonem MSC, aquestes tenen especial predilecció per localitzar-se en àrees lesionades (Kang et al., 2012) . Aquest concepte és molt important i cal tenir-lo en compte a l’hora de dissenyar estratègies de TC, ja que una vegada hagi passat la fase aguda d’una lesió, el teixit lesionat probablement deixarà de generar els senyals per atraure i reclutar cèŀlules amb potencial reparador o regenerador .

Cèŀlules hematopoètiques

La sang (i la meduŀla òssia) és l’únic teixit líquid de l’organisme, en el qual les cèŀlules estan suspeses en el plasma (o bé adherides a altres cèŀlules en el cas de la meduŀla òssia, que és el lloc on té lloc l’hematopoesi, la generació de les cèŀlules sanguínies, incloent-hi totes les que formen el sistema immunitari) . Es poden obtenir aquestes cèŀlules a partir d’una simple mostra de sang o d’aspirat de meduŀla òssia . Per això no és casualitat que siguin els diferents tipus de cèŀlules hematopoètiques les primeres i les que més s’han utilitzat en TC . Com dèiem abans, el trasplantament hematopoètic no es pot considerar una TA si no es fa amb cèŀlules que hagin estat substancialment manipulades, però sí és cert que va ser el primer tractament basat en cèŀlules que es va aplicar a la clínica (excloent-ne les transfusions de sang), i també que és la base de moltes formes de TA, incloent algunes de les de TG que fins aquest moment han estat més reeixides . Aplicat des de fa més de quaranta anys, ha fet possible la curació de milers de casos d’hematopaties malignes i malalties hereditàries, de manera que avui és un procediment rutinari en cents d’hospitals d’arreu del món . Actualment, també s’estan investigant diferents formes de trasplantament hematopoètic per tractar malalties autoimmunitàries, com ara l’esclerosi múltiple o la malaltia inflamatòria intestinal (Snowden et al., 2012) . Els avenços en el coneixement de la biologia de les cèŀlules hematopoètiques i en les tècniques de manipulació han anat sofisticant el procediment i introduint noves variants, com ara els tractaments ex vivo per fer una depleció de cèŀlules malignes en trasplantaments autòlegs (Brugger et al., 1997), la selecció immunomagnètica de progenitors immadurs basada en el marcador CD34, la depleció negativa de cèŀlules T per reduir

el risc de malaltia de l’empelt contra l’hoste (GVHD) en els trasplantaments aŀlogènics (Ho et al., 2001) o l’expansió de progenitors ex vivo per reduir el període d’aplàsia en trasplantaments de sang de cordó umbilical (Dahlberg et al., 2011), una font de progenitors d’exceŀlent qualitat però limitada pel volum escàs i el reduït nombre de cèŀlules mare . La TG ex vivo també es pot considerar una forma de TC, en basar-se en l’ús de cèŀlules que són manipulades genèticament i posteriorment trasplantades; de fet, moltes TA són en realitat una combinació de TC i TG . La immunoteràpia és un terme ampli que inclou aproximacions terapèutiques molt diverses, com ara les vacunes o els trasplantaments hematopoètics aŀlogènics, però també algunes que es poden considerar TA . Com a exemples tenim la generació ex vivo de cèŀlules dendrítiques (CD) madures per induir respostes immunitàries (per exemple, en càncer) (Palucka et al., 2012) o l’expansió i activació de cèŀlules NK o cèŀlules citotòxiques específiques d’antigen per induir o afavorir respostes immunitàries davant infeccions o tumors (Restifo et al., 2012) . D’altra banda, la TC pot utilitzar-se en sentit contrari, per prevenir o frenar respostes immunitàries ja establertes i que siguin perjudicials, com ara les subjacents a algunes malalties autoimmunitàries . En aquest sentit, s’han aplicat CD tolerogèniques a pacients amb diabetis de tipus 1 (Giannoukakis et al., 2011) i està previst aplicar-les a d’altres malalties com l’esclerosi múltiple . El descobriment, l’any 1995, de cèŀlules T amb activitat reguladora natural (Tregs) (Sakaguchi et al., 1995) va permetre incorporar aquestes cèŀlules a l’arsenal terapèutic de la TC . Avui es coneixen diferents tipus de cèŀlules T reguladores, alguns dels quals es poden aïllar i expandir ex vivo i s’han utilitzat terapèuticament i amb èxit en el context del trasplantament hemato -

poètic per tal de reduir la GVHD (Trzonkowski et al., 2009) . Un altre tipus ceŀlular especialment prometedor per a la TC són les anomenades cèŀlules mieloides supressores (MDSC), potencialment útils per inhibir respostes immunitàries no desitjades (en el trasplantament d’òrgans o en la GVHD) (Dilek et al., 2012; Highfill et al., 2010) o bé per induir tolerància en malalties autoimmunitàries (Yin et al., 2010) .

Cèŀlules mesenquimàtiques

Després de les cèŀlules hematopoètiques, unes de les més utilitzades en TC són les cèŀlules estromàtiques mesenquimàtiques, també conegudes com a cèŀlules mare mesenquimàtiques (MSC) . Aquestes cèllules formen part del teixit connectiu, i es poden trobar en molts òrgans, encara que d’on se n’obtenen en més quantitat i amb més facilitat és de la meduŀla òssia i del teixit adipós subcutani . Les MSC són especialment atractives per a la TC i la medicina regenerativa per diversos motius . A més de la seva facilitat d’obtenció, es poden expandir (unes cinquanta divisions) i manipular ex vivo, tenen una gran plasticitat i, en determinades circumstàncies, són potents agents immunosupressors (Wang et al., 2011) . Quant a la plasticitat, són progenitors que poden diferenciar-se en, almenys, quatre tipus ceŀlulars: múscul llis, adipòcits, condròcits i osteoblasts, i probablement també en cardiomiòcits (Xu et al., 2004), hepatòcits (Wu et al., 2012) i neurones (Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000) . Amb aquests antecedents, és fàcil d’entendre que hagin donat bons resultats en la reparació i regeneració de lesions de l’aparell locomotor, com fractures òssies que no consoliden o en lesions del cartílag condral (Mariani et al., 2012) . Respecte a la seva capacitat immunosupressora, només es pro -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

dueix quan les MSC són cultivades i els mecanismes són múltiples, i inclouen des de la secreció de factors solubles com la indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO), la prostaglandina E2 (PGE2) o la interleucina 10 (IL-10), a la inducció de cèŀlules T reguladores (Gebler et al., 2012) . Aquesta vessant immunoreguladora de les MSC ha portat molts clínics a investigar-ne el potencial terapèutic en alguns processos inflamatoris crònics, com ara la GVHD en receptors d’un trasplantament hematopoètic (Tolar et al., 2011) o en pacients amb malaltia inflamatòria intestinal (Garcia-Gomez et al., 2010) .

Regeneració miocàrdica

Una àrea de gran transcendència, per la seva gravetat i l’elevada prevalença en la població, i en la qual molts experts han dipositat moltes esperances, és la regeneració cardíaca, per exemple, després d’un infart de miocardi, tant en la fase aguda com en la d’insuficiència cardíaca crònica (Strauer et al., 2011) . Malgrat aquest enorme interès i que s’han fet molts assaigs clínics, els resultats obtinguts han estat modestos (Clifford et al., 2012), encara que aquesta línia segueix sent motiu d’intensa investigació . Un dels obstacles més importants a l’hora de treure conclusions vàlides dels estudis clínics és el gran nombre de variables que afecten els resultats, i això és especialment patent en aquest àmbit de la regeneració cardíaca . Així, diferents estudis han utilitzat diferents tipus ceŀlulars (cèŀlules mononucleades de meduŀla òssia, cèŀlules CD34+ o CD133+ seleccionades, mioblasts o MSC), diferent manipulació ceŀlular, diferent dosi de cèŀlules, diferents vies d’administració (intravenosa, intracoronària, periinfàrtica), diferents indicacions, pacients d’edat diferent, els tractaments s’han aplicat en diferents moments o estadis evolutius de la malaltia, o direc-

tament en malalties diferents (Dimmeler et al., 2008) . Aquesta enorme heterogeneïtat fa que els resultats obtinguts en els diferents estudis difícilment es puguin comparar entre si, però també ens indica que l’ajust i optimització de totes aquestes variables probablement encara deixa força marge per a la millora . Noves línies de recerca potencialment rellevants per a la regeneració cardíaca inclouen la investigació i l’ús de cèŀlules mare cardíaques, encara molt poc conegudes (Frati et al., 2011) .

Cèŀlules pluripotencials

Una altra font de cèŀlules especialment prometedores per a la TC són les cèŀlules pluripotencials, de les qual n’hi ha dos tipus, les embrionàries (embryonic stem cells, o ESC) i les adultes amb pluripotencialitat induïda (induced pluripotent stem cells, o iPSC) . Les ESC són cèŀlules pluripotencials que es poden aïllar de la massa interna del blastocist, un embrió de 5-6 dies . Des que el 1998 es va descobrir la tècnica per cultivar indefinidament les ESC humanes (Thomson et al., 1998), s’ha descrit un gran nombre de protocols per diferenciar-les en molts dels aproximadament dos-cents diferents tipus ceŀlulars madurs coneguts, amb una clara orientació envers la medicina regenerativa . En teoria, aquestes cèŀlules han de permetre aconseguir cèŀlules madures de qualsevol tipus i en la quantitat que vulguem (per exemple, hepatòcits per regenerar el fetge o neurones per regenerar el sistema nerviós) . El problema és que, deixant de banda els problemes ètics que implica l’ús d’embrions humans, per motius obvis, ningú no disposa de les seves pròpies ESC, que serien les úniques histocompatibles per evitar problemes de rebuig . A més, si no estan completament diferenciades, aquestes cèllules poden produir tumors (teratomes) in

vivo . La solució a alguns d’aquests inconvenients la va proporcionar el descobriment, l’any 2006, de les iPSC . Aquestes són cèŀlules adultes (per exemple, queratinòcits de pell, fibroblasts, monòcits o d’altres) que, gràcies a l’activació forçada de programes genètics de pluripotencialitat, aconseguida normalment amb la transferència d’uns pocs factors de transcripció (de dos a quatre), el seu epigenoma ha estat reprogramat a un estat molt més immadur, indiferenciat, en molts aspectes equivalent al de les ESC (Takahashi et al., 2006), encara que s’han observat algunes diferències en l’expressió gènica, cosa que suggereix que les iPSC podrien no estar completament reprogramades (Saric et al., 2008) . Aquestes iPSC creixen indefinidament en cultiu (vegeu la figura 1) i poden obtenir-se a partir de qualsevol persona adulta, la qual cosa elimina els problemes ètics i els del rebuig potencial, però comparteixen altres inconvenients amb les ESC, com ara l’oncogenicitat potencial . A més, en tractar-se de cèŀlules obtin-

Figura 1. Microfotografies d’una colònia d’iPSC humanes abans i després d’una tinció amb fosfatasa alcalina. Aquestes colònies creixen sobre una capa de cèŀlules de fibroblasts obtinguts de prepuci humà, que tenen un aspecte fusiforme i que no es tenyeixen, mentre que les iPSC adquireixen un color blau (fotos fetes per Sergio López, Laboratori de Teràpia Gènica i Ceŀlular, VHIR, Barcelona).

gudes en molts casos utilitzant vectors integratius i oncogens (com ara MYC), per una banda són portadores d’integracions d’aquests vectors en els seus genomes, cosa que pot donar lloc a transactivació d’oncogens adjacents, i per l’altra, hi ha el risc que els gens utilitzats per a la reprogramació no siguin completament silenciats una vegada reprogramades les cèŀlules . Amb tot, ja s’han utilitzat cèŀlules derivades d’ESC en diferents assaigs clínics, per al tractament de la lesió meduŀlar espinal o la degeneració macular . En el primer cas es van utilitzar progenitors d’oligodendròcits derivats d’ESC, però la companyia californiana que desenvolupava el producte (Geron®) va anunciar fa pocs mesos que abandonava aquesta línia de recerca, sense que s’hagin fet públics els resultats obtinguts .

Transdiferenciació ceŀlular

Una estratègia diferent per aconseguir cèŀlules autòlogues d’un determinat tipus que siguin vàlides per a aplicacions en medicina regenerativa és la transdiferenciació . En aquest cas no es tracta de reprogramar cèŀlules somàtiques a un estat pluripotencial per després rederivar-les a un estadi diferenciat diferent, sinó de forçar una transdiferenciació directa des d’un estat ja diferenciat a un altre . Això es pot aconseguir gràcies al coneixement dels factors de transcripció crítics que determinen el desenvolupament i la diferenciació (Pournasr et al., 2011) . En aquest sentit, s’ha aconseguit, per exemple, generar macròfags a partir de cèŀlules B i T madures (Bussmann et al., 2009; Laiosa et al., 2006), o neurones a partir de fibroblasts (Vierbuchen et al., 2010) . Aquesta estratègia en general és molt ràpida, i permet aconseguir una transdiferenciació molt eficient en molts pocs dies, en lloc de les setmanes o mesos que calen

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

per generar i diferenciar iPSC . Un avantatge potencial addicional és que en no haver de passar per un estat pluripotencial, les cèŀlules que s’obtinguin amb aquestes estratègies podrien tenir menys risc oncogènic .

TERÀPIA GÈNICA

A la dècada dels vuitanta del segle passat es van desenvolupar els primers vectors vírics que permetien introduir material genètic en cèŀlules de mamífer amb una eficiència que a molts els va semblar adequada per aventurar-se a aplicar-los en la clínica . Aquests vectors es basaven en virus modificats genèticament de manera que no es poguessin replicar, però sí introduir el seu material genètic (en aquest cas gens terapèutics) dins les cèŀlules . Alguns, com ara els derivats dels retrovirus, integren aquest gens terapèutics en els genomes de les cèllules hoste, mentre que d’altres com els derivats d’adenovirus o dels virus adenoassociats (AAV) són de tipus no integratiu . Els primers solen utilitzar-se en estratègies anomenades ex vivo, en les quals l’exposició de les cèŀlules diana al vector es fa fora de l’individu (cosa que fa necessari que aquestes cèŀlules siguin trasplantables), mentre que els segons, que es poden concentrar fins a títols molt alts, de 1012 partícules/ml o més, es fan servir principalment en estratègies in vivo, en què els vectors són administrats directament al pacient (vegeu la figura 2) .

Primeres experiències

Els primers assaigs en humans van començar l’any 1990, però globalment els resultats van ser decebedors, en gran part per la baixa eficiència dels procediments i

per la inducció de respostes immunitàries contra components del vector o del producte mateix del transgèn terapèutic . L’any 2000 es va publicar el primer èxit en forma de curacions en nens afectats d’una forma d’immunodeficiència combinada severa lligada al cromosoma X i deguda a defectes en el gen que codifica la molècula γc (la subunitat gamma comuna de receptors d’interleucines) (Cavazzana-Calvo et al., 2000) . No és casual que aquesta teràpia utilitzés com a teixit diana cèŀlules mare hematopoètiques, com tampoc ho és el fet que aquestes cèŀlules s’haguessin utilitzat en una de les formes més reeixides de trasplantament aŀlogènic, el de medulla òssia o de progenitors hematopoètics, tal com s’ha esmentat abans . Aquest èxit, però, es va veure enterbolit pocs anys després per l’aparició de leucèmies en cinc dels setze nens tractats (entre els tractats a França i al Regne Unit), i que estaven causades per insercions del vector retrovíric en seqüències adjacents a oncogens, en la majoria de casos el LMO2, i que van afavorir la transformació cancerosa (Hacein-Bey-Abina et al., 2003; Wu et al., 2011) . També han estat

Figura 2. Esquema de les diferents formes de TG, depenent d’on tingui lloc la transducció de les cèŀlules diana, fora de l’individu (TG ex vivo, dreta) o dins, amb administració prèvia dels vectors (TG in vivo, esquerra).

reeixits altres assaigs clínics en altres formes d’immunodeficiència com la deguda a la deficiència de l’enzim adenosina-desaminasa (ADA) (Aiuti et al., 2002) o la síndrome de Wiskott-Aldrich (Boztug et al., 2010) . En aquest darrer assaig també s’ha observat transformació leucèmica en un dels deu nens tractats . Aquest tipus de complicació, tot i ser molt greu, és curable en la majoria de casos utilitzant quimioteràpia i, ocasionalment, un trasplantament aŀlogènic de progenitors hematopoètics . Amb tot, en aquestes situacions, la relació risc/benefici cal sospesar-la individualment amb molta cura, però en molts casos probablement és decanta a favor de la TG, tenint en compte que es tracta de malalties mortals en les quals l’única alternativa és sovint el trasplantament hematopoètic d’un donant no emparentat, un procediment que sol tenir més riscos i més greus que la TG mateixa . Aquests assaigs en aquestes tres formes d’immunodeficiència primària han tingut a favor seu dos factors que probablement han estat crucials per a l’èxit terapèutic . Per una banda, la immunodeficiència mateixa impedeix que es generin respostes immunitàries i fa que les cèŀlules transduïdes no puguin ser rebutjades, i per l’altra, l’enorme avantatge selectiu de les cèŀlules «corregides» genèticament respecte a les no corregides quant a supervivència i capacitat proliferativa in vivo, cosa que fa innecessària o permet reduir dràsticament la dosi de tractament mieloablatiu (condicionament) previ al trasplantament . En altres malalties hereditàries, de fet per a la immensa majoria, la situació és molt diferent, ja que la modificació genètica de les cèŀlules corregides no es preveu que hagi de conferir cap avantatge selectiu, de manera que, en el cas d’utilitzar cèŀlules hematopoètiques ex vivo, teòricament seria necessari aconseguir una alta eficiència de transducció i un bon empelt . Alguns exemples són la malaltia gra-

nulomatosa crònica, la β-talassèmia, la leucodistròfia metacromàtica o l’adrenoleucodistròfia . De fet, s’han publicat resultats d’estudis clínics en aquestes malalties en alguns casos positius, però que han estat força controvertits; per exemple, en la malaltia granulomatosa crònica . El problema és que part de l’èxit es deu a expansions clonals de cèŀlules transduïdes, motivades no per la recuperació funcional deguda a la correcció genètica sinó per l’activació transcripcional d’oncogens propers als punts d’inserció del vector (Cartier et al., 2012; Cavazzana-Calvo et al., 2010; Ott et al., 2006), un factor que en podria afavorir la transformació cancerosa . Per si tot això fos poc, molt recentment s’ha comprovat que les insercions dels vectors integratius en els genomes de les cèŀlules hoste també alteren amb molta freqüència l’empalmament (splicing) del transgèn i dels gens adjacents, un factor addicional que també podria contribuir a l’oncogènesi (Cesana et al., 2012; Moiani et al., 2012) .

Resultats actuals

Malgrat tots aquests obstacles, després de dues dècades de grans expectatives alimentades en gran part pels mitjans de comunicació, la teràpia gènica ha anat avançant, lentament però amb fermesa, fins que en aquests moments podem afirmar que estem davant un horitzó força esperançador . Ja hem esmentat alguns dels assaigs clínics reeixits en els darrers anys i alguns problemes associats a l’ús de vectors integratius i la teràpia gènica ex vivo (Deakin et al., 2009) . En aquest sentit s’estan fent molts progressos, com són els vectors SIN (self inactivating), en els quals s’ha eliminat una seqüència potenciadora de la transactivació, o l’adreçament (targeting) dels vectors a regions segures del genoma . D’altra banda, els assaigs amb vectors no integratius tam-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

bé estan donant resultats prometedors . En aquest sentit, un tipus de vectors particularment efectius són els derivats de l’AAV, virus dels quals ara mateix se’n coneixen més de deu serotips, amb diferents tropismes per als diferents teixits diana (Grieger et al., 2012) . De fet, una teràpia que ja ha funcionat després de molts anys d’anar superant obstacles ha estat la que utilitza AAV dirigits a fetge en l’hemofília B (Nathwani et al., 2011) . En aquest cas es va utilitzar un vector AAV serotip 8 que codificava el factor 9 (F9) de la coagulació sota un promotor específic d’hepatòcits, i que es va injectar per via sistèmica a un total de sis pacients (dos van rebre una única dosi de 2 × 1011 vectors/kg; dos, una dosi tres vegades més alta i, dos més, una dosi deu vegades més alta) . La resposta terapèutica obtinguda va ser dosidependent, en el darrer cas els pacients van assolir nivells de F9 entre el 2 i l’11 % dels valors normals, suficients per convertir una hemofília greu en una lleu-moderada, i aquests nivells es van mantenir un mínim de sis mesos . Tenint en compte que el preu d’aquests vectors és aproximadament d’uns 20 .000 $ per pacient, es pot deduir que l’estalvi (només econòmic) en F9 recombinant a llarg termini pot ser enorme . La resposta immunitària contra antígens del vector, que havia limitat la tècnica en el passat i que es va observar en els dos pacients que havien rebut la dosi més alta del vector, es va controlar utilitzant una simple pauta d’esteroides . També s’han utilitzat AAV per tractar amb èxit una rara forma de ceguesa anomenada amaurosi congènita de Leber, produïda per defectes en el gen RPE65 (Simonelli et al., 2010) . En aquest cas el vector es va administrar directament a la cambra posterior de l’ull, cosa que va permetre dirigir el vector al teixit diana amb molta precisió i utilitzant uns volums d’injecció molt petits, i es va aprofitar el fet que aquesta localitza-

ció anatòmica és especialment immunoprivilegiada .

Aplicacions potencials en oncologia

La TG també s’ha aplicat, encara que amb menys èxit, a diferents tipus de càncer . Una de les primeres aproximacions que es van investigar va ser la del gens suïcides, com ara el de la timidina-cinasa del virus de l’herpes simple, que confereix sensibilitat al fàrmac ganciclovir, encara que en general els resultats en els assaigs clínics no han estat gaire positius . En canvi, aquest tipus de TG sí que va funcionar relativament bé en el tractament de la GVHD, en el context del trasplantament hematopoètic (Lupo-Stanghellini et al., 2010) . Una de les estratègies més prometedores en la TG del càncer és la viroteràpia, que utilitza adenovirus o d’altres tipus de virus que han estat dissenyats per multiplicar-se en un cicle lític específicament en cèŀlules portadores d’alteracions genètiques concretes, com ara la inactivació de p53 o d’altres gens supressors com passa en molts tumors (Alemany, 2009) .

REGULACIÓ I FUTUR DE LES TA

Al nostre país, les TA estan regulades pel Comitè Espanyol de Teràpies Avançades, dependent de l’Agència Espanyola de Medicaments i Productes Sanitaris (AEMPS), amb una normativa que s’emmarca dins el que dictamina el Comitè per a les TA (CAT), un comitè d’experts multidisciplinari dependent de l’Agència Europea del Medicament (EMA), i que té com a principal objectiu avaluar i garantir la qualitat, seguretat i eficàcia dels ATMP, i de seguir tots els desenvolupaments científics dins d’aquesta àrea (podeu trobar més infor ma-

ció a www.aemps.gob.es/investigacionClinica/ terapiasAvanzadas/home.htm) . A la Unió Europea, els ATMP estan regulats per la normativa (EC) núm . 1394/2007 (http://ec.europa. eu/health/files/eudralex/vol-1/reg_2007_1394/ reg_2007_1394_es.pdf ), que és d’aplicació obligatòria des de desembre de 2008, encara que cada país membre té la seva pròpia agència reguladora amb uns marges de maniobra relativament amplis . En general, la normativa vigent actualment a la Unió Europea, tal com passa també als Estats Units (que en aquest terreny segueix les normes dictades per l’omnipotent Food and Drug Administration, o FDA), estableix una regulació molt estricta, similar a la dels fàrmacs convencionals, en la qual prima la seguretat, fet que molts investigadors consideren un impediment per al desenvolupament adequat de les TA . Sota la normativa actual, qualsevol forma d’ATMP, abans de poder ser comercialitzada, ha de demostrar, seguint tots els passos d’avaluació preclínica i clínica (fases i, ii i iii), que és adequat quant a eficàcia, seguretat i relació cost/benefici per tractar una malaltia determinada . Un dels problemes és que el gruix de la investigació sobre TA no l’està fent la indústria farmacèutica, sinó grups relativament petits que treballen en institucions acadèmiques, hospitals o centres públics de recerca, i aquests grups generalment no tenen capacitat per portar els seus ATMP a la clínica . És cert que la indústria farmacèutica dóna suport o coŀlabora amb molts d’aquests grups, però en general fins ara les grans companyies no han demostrat un gran interès en les TA . Un exemple molt clarificador és la TG per a l’hemofília . El pes de la recerca per aconseguir una cura definitiva per a aquesta malaltia, incloent-hi la majoria dels assaigs clínics que s’han fet, l’han duta a terme grups acadèmics . Com abans s’ha esmentat, l’any 2011 es va publicar una sèrie curta de pacients amb hemofí-

lia B en els quals la TG havia estat reeixida . El problema és que els beneficis que genera el mercat de factors de coagulació biotecnològics, en aquest cas el tractament substitutiu que els pacients hemofílics han de rebre per vida, és enormement més gran que el que pot costar curar definitivament aquests pacients, i això fa que les grans compa nyies prefereixin invertir en medicaments convencionals abans que en TA, molt menys rendibles econòmicament . Una limitació addicional és que moltes de les aplicacions de les TA són per a malalties minoritàries, de vegades extremament rares, cosa que fa que difícilment pugui ser rentable desenvolupar un ATMP específic, independentment que pugui arribar a curar la malaltia en qüestió .

Els ATMP tenen una sèrie de particularitats que els fan molt diferents dels medicaments convencionals . La normativa actual especifica que els ATMP s’han de produir en unitats especialitzades que s’anomenen sales blanques i en condicions GMP ( good manufacturing practice), que n’asseguren la qualitat . Les sales blanques són instaŀlacions preparades per fer les manipulacions necessàries dels productes de TA i minimitzar els riscos de contaminació d’aquests . Aquestes sales blanques estan dotades de sistemes filtres HEPA (high efficiency particulate air), que garanteixen un nombre màxim de partícules per volum d’aire (LopezHolgado et al., 2012) . Un fàrmac aconseguit per síntesi química és un producte relativament homogeni que té unes propietats ben definides, es pot produir i emmagatzemar de forma que se’n conservin les propietats, de manera que un comprimit o vial d’aquell medicament fet aquí serà idèntic a un de fet al Japó . Pel que fa als ATMP, la cosa no resulta tan fàcil . En el cas dels vectors de TG, encara s’hi pot acostar, però en els productes de TC la cosa es complica molt més, ja que hem de tenir en compte el gran nombre

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

de variables que poden influir en la qualitat i les propietats del producte final (font cellular, fons genètic, condicions de la manipulació, factors estocàstics, etc), que en conjunt fan que sigui pràcticament impossible aconseguir un producte de TC comercial que sigui homogeni i mantingui sempre unes propietats definides, cosa que limita enormement la validesa dels estudis comparatius . Les agències reguladores haurien de tenir en compte aquestes particularitats de TA i ser més flexibles a l’hora de regular, ja que molts investigadors creuen que amb la normativa actual es corre el risc de frenar el desenvolupament i la translació a la clínica de moltes TA potencialment efectives (Sethe, 2010) . Per una banda és comprensible que es vulguin evitar els efectes indesitjables greus i fins i tot mortals com els que s’han esmentat; no s’ha d’oblidar la vella màxima primum non nocere (‘el primer és no fer mal’), atribuïda a Hipòcrates . El que passa és que hi ha malalties greus per a les quals no hi ha cap tractament efectiu, o bé els que hi ha comporten riscos importants . En aquests casos parlem millor de relació risc/benefici, un paràmetre basat moltes vegades en dades estadístiques . Vegem-ne un exemple imaginari relacionat amb la TG . Estem davant un nen afectat d’una immunodeficiència severa per a la qual tenim, a priori, dues opcions terapèutiques: una TG que té un 90 % de probabilitats de curació, però també un risc del 30 % de produirli una leucèmia com a efecte secundari, o un trasplantament hematopoètic d’un germà compatible (disponible en menys del 25 % dels casos), o bé d’un donant no emparentat, un procediment que, en funció del grau d’histocompatibilitat i l’edat del pacient pot tenir un risc de mortalitat proper al 50 % . Quina alternativa és millor?

En societats com les que tenim a la majoria de països del Primer Món, on la població està cada vegada més envellida i les ma-

lalties degeneratives són cada vegada més prevalents, moltes de les promeses de la medicina regenerativa sonen a cant de sirenes que alguns veuen com una mena d’elixir de l’eterna joventut . Un coneixement profund sobre les cèŀlules mare pot revolucionar la medicina i les nostres vides, però és important que no perdem el rigor ni la visió crítica . Només cal introduir al cercador Google algunes paraules clau com stem cells i therapy i obtindrem desenes de milions d’entrades . Entre les quinze primeres, sense comptar les que són publicitat pagada per companyies privades (clíniques, bancs de sang de cordó umbilical, etc .), gairebé la tercera part correspon a companyies que ofereixen tractaments basats en cèŀlules mare, que moltes vegades no han passat cap mena de control ètic ni científic i que sovint s’aprofiten de la desesperació de pacients o de les seves famílies . De fet, alguns experts ja han donat el crit d’alarma sobre aquest nou fenomen social que s’ha anomenat turisme de cèŀlules mare (Eurordis, 2010) . Els riscos de sucumbir a aquests reclams són imprevisibles i quasi sempre seran molt més grans que els possibles beneficis . En el millor dels casos només es perdrà temps, diners i la confiança, però d’altres vegades poden apareixen complicacions clíniques greus, com el cas, ben documentat, d’un pacient afectat d’atàxia-telangièctasi que, entre els nou i els dotze anys d’edat, va rebre un tractament, en una clínica russa, basat en injeccions repetides, intratecals i intracerebeŀloses de cèŀlules mare neuronals cultivades procedents del sistema nerviós de fetus humans i que li van provocar l’aparició de tumors cerebrals i espinals quatre anys més tard (Amariglio et al., 2009) . Aquest cas anecdòtic és iŀlustratiu d’un risc real de producció de tumors provocat per cèŀlules mare adultes, i també de la manca de control que hi ha en alguns països sobre les TA . Pel que fa a les ESC i les iPSC, el risc de pro -

duir teratomes també es considera elevat, i de fet la producció de teratomes in vivo és una de les proves que es fan servir per demostrar-ne l’estat pluripotencial . En canvi, la llarga experiència amb l’ús d’altres tipus de cèŀlula mare adulta, com ara les hematopoètiques o les MSC, ha demostrat que tenen un exceŀlent perfil de bioseguretat . En el futur es dibuixen bones perspectives per a les TA, però cal que l’avenç es faci amb rigor, cal que es reguli amb la justa prudència, ni massa ni massa poc, cal lluitar contra el frau amb fermesa, i hem d’evitar, el professionals i els mitjans de comunicació, transmetre falses expectatives a la societat, ja que a la llarga empitjoraríem la percepció que aquesta té sobre uns tractaments que poden revolucionar la medicina .

AGRAÏMENTS

L’autor està parcialment finançat pel programa Miguel Servet de l’Institut de Salut Carles III (ISCIII), el Ministeri d’Economia i Competitivitat (MEC), i per la Generalitat de Catalunya, i els projectes de recerca del seu grup estan finançats per ajuts de la Unió Europea (ERANET, e-RARE-2), el Pla E (MEC), i el Fons d’Investigació Sanitària, ISCIII, MEC .

BIBLIOGRAFIA

Aiuti, A ; Slavin, S ; Aker, M ; Ficara, F ; Deola, S ; Mortellaro, A ; Morecki, S ; Andolfi, G ; Tabucchi, A ; Carlucci, F ; Marinello, E ; Cattaneo, F ; Vai, S ; Servida, P ; Miniero, R ; Roncarolo, M G ; Bordignon, C (2002) «Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning» Science, 296: 2410-2413

Alemany, R (2009) «Designing adenoviral vectors for tumor-specific targeting» Methods. Mol. Biol., 542: 57-74

Amariglio, N ; Hirshberg, A ; Scheithauer, B W ; Cohen, Y ; Loewenthal, R ; Trakhtenbrot, L ; Paz, N ;

Koren-Michowitz, M .; Waldman, D .; Leider-Trejo, L .; Toren, A .; Constantini, S .; Rechavi, G . (2009) . «Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient» . PLoS Med., 6: e1000029 .

Boztug, K .; Schmidt, M .; Schwarzer, A .; Banerjee, P. P.; Diez, I . A .; Dewey, R . A .; Bohm, M .; Nowrouzi, A .; Ball, C . R .; Glimm, H .; Naundorf, S .; Kuhlcke, K .; Blasczyk, R .; Kondratenko, I .; Marodi, L .; Orange, J . S .; Kalle, C . von; Klein, C . (2010) . «Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome» . N. Engl. J. Med., 363: 1918-1927 . Brazelton, T . R .; Rossi, F . M .; Keshet, G . I .; Blau, H . M . (2000) . «From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice» . Science, 290: 1775-1779 .

Brugger, W .; Scheding, S .; Bock, T .; Ziegler, B .; Kanz, L . (1997) . «Purging of peripheral blood progenitor cell autografts and treatment of minimal residual disease» . Stem Cells, 15 (supl . 1): 159-165 .

Bussmann, L . H .; Schubert, A .; Vu Manh, T . P.; Andres, L . de; Desbordes, S . C .; Parra, M .; Zimmermann, T .; Rapino, F .; Rodriguez-Ubreva, J .; Ballestar, E .; Graf, T . (2009) . «A robust and highly efficient immune cell reprogramming system» . Cell. Stem Cell., 5: 554-566 . Cartier, N .; Hacein-Bey-Abina, S .; Bartholomae, C . C .; Bougneres, P.; Schmidt, M .; Kalle, C . V .; Fischer, A .; Cavazzana-Calvo, M .; Aubourg, P. (2012) . «Lentiviral hematopoietic cell gene therapy for Xlinked adrenoleukodystrophy» . Methods. Enzymol., 507: 187-198 .

Cavazzana-Calvo, M .; Hacein-Bey, S .; Saint Basile, G . de; Gross, F .; Yvon, E .; Nusbaum, P.; Selz, F .; Hue, C .; Certain, S .; Casanova, J . L .; Bousso, P.; Deist, F . L ; Fischer, A (2000) «Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease» Science, 288: 669-672

Cavazzana-Calvo, M ; Payen, E ; Negre, O ; Wang, G ; Hehir, K ; Fusil, F ; Down, J ; Denaro, M ; Brady, T ; Westerman, K ; Cavallesco, R ; Gillet-Legrand, B ; Caccavelli, L ; Sgarra, R ; Maouche-Chretien, L ; Bernaudin, F ; Girot, R ; Dorazio, R ; Mulder, G J ; Polack, A ; Bank, A ; Soulier, J ; Larghero, J ; Kabbara, N ; Dalle, B ; Gourmel, B ; Socie, G ; Chretien, S ; Cartier, N ; Aubourg, P ; Fischer, A ; Cornetta, K ; Galacteros, F ; Beuzard, Y ; Gluckman, E ; Bushman, F ; Hacein-Bey-Abina, S ; Leboulch, P (2010) «Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia» Nature, 467: 318-322

Cesana, D ; Sgualdino, J ; Rudilosso, L ; Merella, S ; Naldini, L ; Montini, E (2012) «Whole transcriptome characterization of aberrant splicing events

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

induced by lentiviral vector integrations» . J. Clin. Invest., 122: 1667-1676 . Clifford, D . M .; Fisher, S . A .; Brunskill, S . J .; Doree, C .; Mathur, A .; Watt, S .; Martin-Rendon, E . (2012) . «Stem cell treatment for acute myocardial infarction» . Cochrane Database Syst. Rev., 2: CD006536 .

Committee For Advanced Therapies (2010) . «Use of unregulated stem-cell based medicinal products» . Lancet, 376: 514 .

Dahlberg, A .; Delaney, C .; Bernstein, I . D . (2011) . «Ex vivo expansion of human hematopoietic stem and progenitor cells» . Blood, 117: 6083-6090 .

Deakin, C . T .; Alexander, I . E .; Kerridge, I . (2009) . «Accepting risk in clinical research: is the gene therapy field becoming too risk-averse?» . Mol. Ther., 17: 1842-1848 .

Dilek, N .; Vuillefroy De Silly, R .; Blancho, G .; Vanhove, B . (2012) . «Myeloid-derived suppressor cells: mechanisms of action and recent advances in their role in transplant tolerance» . Front. Immunol., 3: 208 .

Dimmeler, S .; Leri, A . (2008) . «Aging and disease as modifiers of efficacy of cell therapy» . Circ. Res., 102: 1319-1330 .

Frati, C .; Savi, M .; Graiani, G .; Lagrasta, C .; Cavalli, S .; Prezioso, L .; Rossetti, P.; Mangiaracina, C .; Ferraro, F .; Madeddu, D .; Musso, E .; Stilli, D .; Rossini, A .; Falco, A .; Angelis, A . D .; Rossi, F .; Urbanek, K .; Leri, A .; Kajstura, J .; Anversa, P.; Quaini, E .; Quaini, F . (2011) . «Resident cardiac stem cells» . Curr. Pharm. Des., 17: 3252-3257 .

Garcia-Gomez, I .; Elvira, G .; Zapata, A . G .; Lamana, M . L .; Ramirez, M .; Castro, J . G .; Arranz, M . G .; Vicente, A .; Bueren, J .; Garcia-Olmo, D . (2010) . «Mesenchymal stem cells: biological properties and clinical applications» Expert. Opin. Biol. Ther., 10: 1453-1468

Gebler, A ; Zabel, O ; Seliger, B (2012) «The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells» Trends. Mol. Med., 18: 128-134

Giannoukakis, N ; Phillips, B ; Finegold, D ; Harnaha, J ; Trucco, M (2011) «Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients» Diabetes Care, 34: 2026-2032

Gnecchi, M ; Zhang, Z ; Ni, A ; Dzau, V J (2008) «Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy» Circ. Res., 103: 1204-1219

Grieger, J C ; Samulski, R J (2012) «Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications» Methods. Enzymol., 507: 229-254

Hacein-Bey-Abina, S ; Kalle, C von; Schmidt, M ; Mccormack, M P ; Wulffraat, N ; Leboulch, P ; Lim, A ; Osborne, C S ; Pawliuk, R ; Morillon, E ;

Sorensen, R .; Forster, A .; Fraser, P.; Cohen, J . I .; Saint Basile, G . de; Alexander, I .; Wintergerst, U .; Frebourg, T .; Aurias, A .; Stoppa-Lyonnet, D .; Romana, S .; Radford-Weiss, I .; Gross, F .; Valensi, F .; Delabesse, E .; Macintyre, E .; Sigaux, F .; Soulier, J .; Leiva, L . E .; Wissler, M .; Prinz, C .; Rabbitts, T . H .; Deist, F . le; Fischer, A .; Cavazzana-Calvo, M . (2003) . «LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCIDX1» . Science, 302: 415-419 .

Highfill, S . L .; Rodriguez, P. C .; Zhou, Q .; Goetz, C . A .; Koehn, B . H .; Veenstra, R .; Taylor, P. A .; Panoskaltsis-Mortari, A .; Serody, J . S .; Munn, D . H .; Tolar, J .; Ochoa, A . C .; Blazar, B . R . (2010) . «Bone marrow myeloid-derived suppressor cells (MDSC) inhibit graft-versus-host disease (GVHD) via an arginase-1-dependent mechanism that is up-regulated by interleukin-13» . Blood, 116: 57385747 .

Ho, V . T .; Soiffer, R . J . (2001) . «The history and future of T-cell depletion as graft-versus-host disease prophylaxis for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation» . Blood, 98: 3192-3204 .

Kang, S . K .; Shin, I . S .; Ko, M . S .; Jo, J . Y .; Ra, J . C . (2012) . «Journey of mesenchymal stem cells for homing: strategies to enhance efficacy and safety of stem cell therapy» . Stem. Cells. Int., 2012: 342968 .

Laiosa, C . V .; Stadtfeld, M .; Xie, H .; Andres-Aguayo, L . de; Graf, T . (2006) . «Reprogramming of committed T cell progenitors to macrophages and dendritic cells by C/EBP alpha and PU .1 transcription factors» . Immunity, 25: 731-744 .

Lopez-Holgado, N .; Lopez-Villar, O .; Sanchez-Guijo, F . M .; Canizo, M . C . del (2012) . «Cell-production units for stem cell clinical research: basic aspects for their development and optimization» Med. Clin. (Barc.), 138: 31-36

Lupo-Stanghellini, M T ; Provasi, E ; Bondanza, A ; Ciceri, F ; Bordignon, C ; Bonini, C (2010) «Clinical impact of suicide gene therapy in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation» Hum. Gene. Ther., 21: 241-250

Mariani, E ; Facchini, A (2012) «Clinical applications and biosafety of human adult mesenchymal stem cells» Curr. Pharm. Des., 18: 1821-1845

Mezey, E ; Chandross, K J ; Harta, G ; Maki, R A ; Mckercher, S R (2000) «Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow» Science, 290: 1779-1782

Moiani, A ; Paleari, Y ; Sartori, D ; Mezzadra, R ; Miccio, A ; Cattoglio, C ; Cocchiarella, F ; Lidonnici, M R ; Ferrari, G ; Mavilio, F (2012) «Lentiviral vector integration in the human genome in-

duces alternative splicing and generates aberrant transcripts» . J. Clin. Invest., 122: 1653-1666 . Nathwani, A . C .; Tuddenham, E . G .; Rangarajan, S .; Rosales, C .; Mcintosh, J .; Linch, D . C .; Chowdary, P.; Riddell, A .; Pie, A . J .; Harrington, C .; O’beirne, J .; Smith, K .; Pasi, J .; Glader, B .; Rustagi, P.; Ng, C . Y .; Kay, M . A .; Zhou, J .; Spence, Y .; Morton, C . L .; Allay, J .; Coleman, J .; Sleep, S .; Cunningham, J . M .; Srivastava, D .; Basner-Tschakarjan, E .; Mingozzi, F .; High, K . A .; Gray, J . T .; Reiss, U . M .; Nienhuis, A . W .; Davidoff, A . M . (2011) . «Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B» . N. Engl. J. Med., 365: 2357-2365 . Ott, M . G .; Schmidt, M .; Schwarzwaelder, K .; Stein, S .; Siler, U .; Koehl, U .; Glimm, H .; Kuhlcke, K .; Schilz, A .; Kunkel, H .; Naundorf, S .; Brinkmann, A .; Deichmann, A .; Fischer, M .; Ball, C .; Pilz, I .; Dunbar, C .; Du, Y .; Jenkins, N . A .; Copeland, N . G .; Luthi, U .; Hassan, M .; Thrasher, A . J .; Hoelzer, D .; Kalle, C . von; Seger, R .; Grez, M . (2006) . «Correction of X-linked chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1» . Nat. Med., 12: 401-409 .

Palucka, K .; Banchereau, J . (2012) . «Cancer immunotherapy via dendritic cells» . Nat. Rev. Cancer, 12: 265-277 .

Pournasr, B .; Khaloughi, K .; Salekdeh, G . H .; Totonchi, M .; Shahbazi, E .; Baharvand, H . (2011) . «Concise review: alchemy of biology: generating desired cell types from abundant and accessible cells» . Stem Cells, 29: 1933-1941 .

Restifo, N . P.; Dudley, M . E .; Rosenberg, S . A . (2012) . «Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response» . Nat. Rev. Immunol., 12: 269281

Sakaguchi, S ; Sakaguchi, N ; Asano, M ; Itoh, M ; Toda, M (1995) «Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25) Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases» J. Immunol., 155: 1151-1164

Saric, T ; Hescheler, J (2008) «Stem cells and nuclear reprogramming» Minim. Invasive Ther. Allied Technol., 17: 64-78

Sethe, S C «The implications of “advanced therapies” regulation» (2010) Rejuvenation. Res., 13: 327-328

Simonelli, F ; Maguire, A M ; Testa, F ; Pierce, E A ; Mingozzi, F ; Bennicelli, J L ; Rossi, S ; Marshall, K ; Banfi, S ; Surace, E M ; Sun, J ; Redmond, T M ; Zhu, X ; Shindler, K S ; Ying, G S ; Ziviello, C ; Acerra, C ; Wright, J F ; Mcdonnell, J W ; High, K A ; Bennett, J ; Auricchio, A (2010) «Gene ther-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

apy for Leber’s congenital amaurosis is safe and effective through 1 . 5 years after vector administration» . Mol. Ther., 18: 643-650 .

Snowden, J . A .; Saccardi, R .; Allez, M .; Ardizzone, S .; Arnold, R .; Cervera, R .; Denton, C .; Hawkey, C .; Labopin, M .; Mancardi, G .; Martin, R .; Moore, J . J .; Passweg, J .; Peters, C .; Rabusin, M .; Rovira, M .; Laar, J . M . van; Farge, D .; Party, E . A . D . W .; Paediatric Diseases Working, P. (2012) . «Haematopoietic SCT in severe autoimmune diseases: updated guidelines of the European Group for Blood and Marrow Transplantation» . Bone Marrow Transplant., 47: 770-790 .

Strauer, B . E .; Steinhoff, G . (2011) . «10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice» . J. Am. Coll. Cardiol., 58: 1095-1104 .

Takahashi, K .; Yamanaka, S . (2006) . «Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors» . Cell, 126: 663-676 .

Thomson, J . A .; Itskovitz-Eldor, J .; Shapiro, S . S .; Waknitz, M . A .; Swiergiel, J . J .; Marshall, V . S .; Jones, J . M . (1998) . «Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts» . Science, 282: 11451147 .

Tolar, J .; Villeneuve, P.; Keating, A . (2011) . «Mesenchymal stromal cells for graft-versus-host disease» . Hum. Gene. Ther., 22: 257-262 .

Trzonkowski, P.; Bieniaszewska, M .; Juscinska, J .; Dobyszuk, A .; Krzystyniak, A .; Marek, N .; Mysliwska, J .; Hellmann, A . (2009) . «First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127– T regulatory cells» Clin. Immunol., 133: 22-26

Vierbuchen, T ; Ostermeier, A ; Pang, Z P ; Kokubu, Y ; Sudhof, T C ; Wernig, M (2010) «Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors» Nature, 463: 1035-1041

Wang, S ; Qu, X ; Zhao, R C (2011) «Mesenchymal stem cells hold promise for regenerative medicine» Front. Med., 5: 372-378

Wu, C ; Dunbar, C E (2011) «Stem cell gene therapy: the risks of insertional mutagenesis and approaches to minimize genotoxicity» Front. Med., 5: 356-371

Wu, X B ; Tao, R (2012) «Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells» Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 11: 360-371

Xu, W ; Zhang, X ; Qian, H ; Zhu, W ; Sun, X ; Hu, J ;

Zhou, H .; Chen, Y . (2004) . «Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro» . Exp. Biol. Med. (Maywood), 229: 623-631 .

Yin, B .; Ma, G .; Yen, C . Y .; Zhou, Z .; Wang, G . X .; Divino, C . M .; Casares, S .; Chen, S . H .; Yang, W . C .; Pan, P. Y . (2010) . «Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models» . J. Immunol., 185: 5828-5834 .

SOBRE L’AUTOR

Jordi Barquinero (Reus, 1959) va fer la residència de medicina interna a l’Hospital Universitari Vall d’Hebron i es va doctorar a la Universitat Autònoma de Barcelona amb premi extraordinari . Els seus treballs van contribuir a la descripció d’una nova malaltia, la síndrome antifosfolipídica primària . Va fer estades a la Universitat de Louisville i al Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, EUA) . Ha estat coŀlaborador en els suplements científics de La Vanguardia i ha escrit llibres de divulgació científica . El 1995 s’incorporà com a investigador a l’Institut de Recerca Oncològica, i des de 2001 és el responsable de l’Àrea de Teràpia Gènica i Ceŀlular de l’Institut de Recerca Vall d’Hebron . Les seves línies de recerca actuals són els models preclínics de teràpia gènica per a malalties hereditàries i per induir tolerància en malalties autoimmunitàries . Els seus treballs han contribuït a entendre millor el paper de la mieloablació en l’empelt de cèllules hematopoètiques transduïdes, els factors que determinen la immunogenicitat d’aquestes, i l’efecte tolerogènic de cèŀlules mieloides supressores que es generen en els cultius hematopoètics . La seva recerca ha rebut finançament de manera continuada durant els darrers divuit anys i ha estat autor o coautor en més de setanta publicacions científiques .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 61-75

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .136

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 77-92

EL VIH, NOU GENS QUE HAN CANVIAT LA BIOLOGIA I EL MÓN

Marta Curriu, Bonaventura Clotet i Julià Blanco

Institut de Recerca de la Sida-Caixa, IrsiCaixa-HIVACAT, Institut de Recerca en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol (IGTP), Hospital Germans Trias i Pujol

Adreça per a la correspondència: Julià Blanco . IrsiCaixa/IGTP, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol . Ctra . del Canyet, s/n . 08916 Badalona . Tel .: 934 656 374 . Adreça electrònica: jblanco@irsicaixa.es .

RESUM

El virus de la immunodeficiència humana (VIH), el retrovirus causant de la síndrome d’immunodeficiència adquirida o sida, ha representat un dels principals reptes científics en els darrers anys i ha demostrat la capacitat de resposta de la ciència als problemes de la societat . Tant és així que en els trenta anys d’història d’aquesta malaltia hem aconseguit que la sida, que va ocupar ràpidament el centre d’atenció mediàtica, hagi estat oblidada gairebé a la mateixa velocitat en els països desenvolupats . De fet, només dos anys després de la descripció dels primers casos de sida se’n va identificar l’agent etiològic, el VIH, i uns anys més tard arribaren els primers fàrmacs, que no van aconseguir una plena eficàcia fins a mitjans dels anys noranta . En aquest article revisarem el camí recorregut en el coneixement del VIH, i com aquest coneixement ha impactat en el camp de la virologia, la immunologia i la medicina . També recollirem el gran repte que encara queda pendent, l’eradicació del virus i de la malaltia, que aconseguirem només amb el desenvolupament d’una vacuna eficaç . Aquest gran objectiu ens ha de permetre evitar que la sida continuï sent una malaltia mortal per a milions de persones en els països no desenvolupats .

Paraules clau: retrovirologia, malaltia infecciosa, immunodeficiència, antiretrovíric, vacuna .

HIV, NINE GENES THAT CHANGED THE BIOLOGY AND THE WORLD

SUMMARY

The Human Immunodeficiency virus (HIV), the retrovirus that causes the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has been one of the major scientific challenges over the last years and has demonstrated how science may respond to human needs . Indeed, in

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

most developed countries, 30 years after its description, AIDS has been rapidly forgotten although it was the most famous disease . Only two years were needed to identify the etiologic agent of AIDS, the HIV, and only some years after, the first line of antiviral drugs was available, although they were not completely efficient to block HIV replication in vivo until middle 90’s . We will summarize the pathway towards the knowledge of HIV and how HIV research has shed light to several fields, such as virology, immunology and medicine . We will also recapitulate the big remaining challenges, namely the eradication of the virus and the disease, which probably rely in the development of a protective vaccine . This big goal will be the best tool to stop the mortal effects of AIDS in millions of people living in developing countries .

Key words: retrovirology, infectious disease, immunodeficiency, antiretroviral, vaccine .

LA RETROVIROLOGIA I EL VIH EN TRES PREMIS NOBEL

L’enorme impacte social i econòmic de la infecció pel VIH va ser el revulsiu d’un esforç científic sense precedents que va dotar la recerca en retrovirologia d’un nombre important de recursos, i ha permès l’expansió d’aquest camp en els últims anys . Les aportacions de l’estudi del VIH no s’han restringit a la retrovirologia sinó que han impactat terrenys com la medicina (teràpia gènica), l’evolució (retrovirus endògens), la biologia ceŀlular (replicació vírica), la immunologia (respostes innates i adaptatives) i, òbviament, la virologia i la microbiologia en general .

La definició del terme retrovirus, i per tant el naixement formal de la retrovirologia, data de l’any 1974 (Baltimore, 1975) i ha viscut un interès creixent fins als nostres dies . Però el camí fins a aquest punt no va ser fàcil, ja que la retrovirologia va haver de trencar dogmes sòlids de la biologia . Podríem situar el seu inici a finals del segle xix i principis de segle xx amb el descobriment de diferents malalties animals transmissibles (Vallée i Carré, 1904) que avui sabem que són causades per retrovirus . És remarcable la identificació de Peyton Rous (premi Nobel de Medicina o Fisiologia el 1966) de la transmissibilitat de tumors i la defini-

ció dels virus de tumors o oncovirus (Rous, 1911), el paradigma dels quals va ser el virus del sarcoma de Rous (VSR) . El treball continu amb aquests virus va permetre identificar l’RNA com el seu material genètic (Crawford i Crawford, 1961) i la sorprenent presència d’un intermediari de DNA que podia romandre integrat en les cèŀlules infectades (Sambrook et al., 1968) . La hipòtesi, quasi subversiva en aquell moment, que aquests virus tenien la capacitat de fer una còpia de DNA a partir del seu RNA i integrar-la a la cèŀlula infectada, va ser generada per Howard Temin i va prendre forma concreta amb la caracterització definitiva de l’activitat transcriptasa inversa establerta per David Baltimore (Baltimore, 1970) . Aquests treballs van donar a Renato Dulbecco, Howard Temin i David Baltimore el Premi Nobel de Medicina o Fisiologia l’any 1975 . Aquests moments van significar grans salts qualitatius en la biologia i van marcar la continuació del camí envers la retrovirologia humana . Així, l’any 1980 s’identificà el primer retrovirus en humans, el virus del limfoma de cèŀlules T en humans (VLTH), gràcies als treballs de Robert Gallo (Poiesz et al., 1980) . Poc després va irrompre l’actor que va posar la retrovirologia al centre de la recerca biomèdica, el virus de la immunodeficiència humana (VIH), descobert per

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

Luc Montagnier i Françoise Barré-Sinoussi el 1983 (Barré-Sinoussi et al., 1983), per la qual cosa van ser guardonats amb el Premi Nobel l’any 2008 .

L’APARICIÓ DE LA SIDA

I EL DESCOBRIMENT DEL VIH. LES CASUALITATS NO EXISTEIXEN

L’any 1981 el Center for Disease Control (CDC) dels Estats Units va recollir el diagnòstic de cinc casos de pneumònies causades per Pneumocystis carinni (actualment jiroveci) en cinc joves de Los Angeles (Califòrnia) (Centers for Disease Control, 1981) . Era un fet sorprenent, ja que es tractava de cinc homes aparentment sans i en canvi aquesta malaltia era poc freqüent i es considerava restringida a individus que presenten una forta immunodeficiència . A més, la mateixa institució va detectar també un increment en la incidència del sarcoma de Kaposi (Durack, 1981), la limfoadenopatia crònica (Centers for Disease Control, 1982) i posteriorment els limfomes no hodgkinians (Ziegler et al., 1984) en el coŀlectiu homosexual . Finalment, l’associació d’aquestes malalties amb un estat d’immunodeficiència de causa desconeguda (Siegal et al., 1981) va portar a utilitzar per primera vegada el terme síndrome d’immunodeficiència adquirida, o sida .

Les proves que aquesta immunodeficiència era causada per un agent transmissible van portar els principals grups de retrovirologia, ja madurs en aquells moments, a avaluar la possible implicació d’un retrovirus en la malaltia . Tot i que la cursa entre els diferents grups va ser intensa i esquitxada de polèmiques atiades pels interessos científics i econòmics, l’equip francès de Luc Montagnier (Barré-Sinoussi et al., 1983; Chermann et al., 1983) es va avançar a Robert Gallo (Gallo et al., 1983) . Òbviament, el

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

descobriment de Luc Montagnier no hauria estat possible sense el treball previ de Robert Gallo, però finalment el reconeixement científic ha quedat merescudament a les seves mans . Malgrat això, els beneficis econòmics, convertits en assumpte d’estat per França i els Estats Units, van ser repartits entre ambdós grups en una llarga negociació . Independentment de la polèmica associada al descobriment del VIH, el fet més rellevant és que només van passar dos anys entre la descripció dels primers casos d’una possible nova malaltia i la identificació del seu agent etiològic . Aviat va estar disponible un equip de detecció d’anticossos que va permetre quantificar l’elevada extensió de la pandèmia, estesa ja arreu del món . De fet, el primer cas de sida conegut a Catalunya data del 1981 mateix (Vilaseca, 1982) . Malgrat que aquests èxits inicials i la recerca posterior van salvar moltes vides, més de 25 milions de persones han mort a causa de la infecció pel VIH, i ha constituït un dels principals problemes de salut pública a escala mundial (UNAIDS/OMS, 2010) . A més, la pandèmia ha fet palesa la diferència existent entre els països desenvolupats i la resta del món . Actualment, s’estima que uns 34 milions de persones viuen infectades pel VIH a escala global . La regió subsahariana d’Àfrica continua sent la més afectada, ja que dels 34 milions globals, 22,5 (un 68 %) es concentren en aquesta zona, i a més és on es produeix un nombre més gran de noves infeccions (1,8 milions, un 69 %) i de morts atribuïbles a l’epidèmia (1,3 milions, un 72 %) segons estimacions fetes per l’OMS l’any 2009 . Tot i que durant el període 2001-2009 es va observar, en termes generals, una tendència envers la disminució de la incidència de la infecció, fruit de les campanyes de prevenció i d’accés als antiretrovírics, en certs països d’Europa de l’Est o del centre d’Àsia la incidència conti-

nua augmentant . Durant l’any 2009 es van produir 2,6 milions de noves infeccions arreu del món, la gran majoria (97 %) en països de rendes baixes i mitjanes (UNAIDS/ OMS, 2010) .

Com la majoria de retrovirus, les principals vies de transmissió del VIH són el contacte sanguini i el sexual, que impacten de manera diferent en funció de la zona geogràfica . A l’Àsia i als països d’Europa de l’Est la transmissió es produeix més freqüentment entre usuaris de drogues injectables . A Amèrica del Nord i la resta d’Europa, en canvi, són les relacions homosexuals desprotegides el principal motiu de transmissió . I, finalment, a l’Àfrica subsahariana, on més del 60 % de persones que viuen infectades pel VIH són dones, la via principal de transmissió són les relacions heterosexuals sense protecció (UNAIDS/ OMS, 2010) .

EL CONEIXEMENT

El virus de la immunodeficiència humana (VIH). Un retrovirus més...

El virus de la immunodeficiència humana (VIH) és un retrovirus complex dins de la família Retroviridae pertanyent al gènere Lentivirus . Se’n coneixen dos tipus, el VIH-1 i el VIH-2, els quals, al seu torn, es divideixen en diversos grups i subtipus (Shapiro, 2011) . El VIH-1 presenta una elevada patogenicitat i una àmplia distribució geogràfica, i és el principal causant de la pandèmia de sida a escala mundial . El VIH-2, en canvi, és menys patogènic i la seva distribució geogràfica es concentra, principalment, en països de l’Àfrica occidental com Guinea Bissau o el Senegal . Ambdós tipus de VIH difereixen, a més, en l’organització del seu genoma i la seva relació filogenètica

amb altres lentivirus de primats (Shapiro, 2011) . Tot i que tant el VIH-1 com el VIH-2 es van descobrir fa menys de trenta anys —els anys 1983 (Barré-Sinoussi et al., 1983) i 1986 (Clavel et al., 1986), respectivament—, s’ha estimat que ambdós es van originar per zoonosi a principis del segle xx . Concretament, l’ancestre comú més recent per al VIH-1 s’ha situat a l’Àfrica central cap a l’any 1908 (rang 1884-1924); i per al VIH-2, s’estima que data de l’any 1932 (1906-1955) i es va originar a Guinea Bissau . Pel que fa a l’origen dels virus, sembla que el VIH-1 es va originar per transmissió del virus de la immunodeficiència de simis (VIScpz) des d’una subespècie particular de ximpanzés (Pan troglodytes troglodytes) als humans, i el VIH-2 per transmissió del SIVsm des d’una altra espècie de primats no humans, els mangabeis de collaret blanc, a l’Àfrica central i occidental, on eren molt freqüents la convivència, la caça i la ingesta d’aquestes espècies de primats no humans (Hahn et al., 2000; Tebit i Arts, 2011) .

El genoma del VIH-1, format per dues molècules de RNA de cadena senzilla i polaritat positiva d’unes 9,2 kb, codifica un total de nou gens, dels quals tres ( gag, pol i env) originaran, respectivament, les proteïnes estructurals, els enzims vírics i les proteïnes de l’embolcall comunes a tots els virus de la família Retroviridae i que defineixen els retrovirus simples . Els sis gens restants (vif, vpr, vpu, rev, tat i nef ) originaran les anomenades proteïnes reguladores o accessòries (vegeu la figura 1a i la taula 1), que distingeixen el VIH d’altres retrovirus .

A més, a ambdós extrems del genoma víric trobem els LTR (de l’anglès long terminal repeats), els quals participen en la integració del DNA víric dins del genoma de la cèllula hoste i constitueixen llocs d’unió per a factors de transcripció ceŀlulars que regulen l’expressió gènica .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

Taula 1. Els productes dels diferents gens del VIH

Gen Precursor Proteïnes madures Funció Referència

gag P55 Gag Matriu MAp17

Càpsida Cap24

Nucleocàpsida NCp7

Proteïnes menors (p6, p2 i p1)

pol

env Glicoproteïna d’embolcall gp160

Proteasa PR o p10

Transcriptasa inversa TI o p55 i p61

Integrasa IN o p31

Glicoproteïna de superfície gp120

Glicoproteïna transmembrana gp41

tat Tat

rev Rev

nef

Nef

vpu Vpu

vpr Vpr

vif Vif

Estructural, recobreix la membrana interna del virus

Estructural Forma la càpsida vírica que conté el material genètic

Estructural . Recobreix l’interior de la càpsida .

Processament de gag i pol Maduració vírica

Conversió de l’RNA víric en DNA de doble cadena

Integració del DNA víric al genoma ceŀlular

Unió virus-cèŀlula

Interacció amb CD4

Fusió de membranes vírica i ceŀlular

Activació de la transcripció vírica

Sortida dels RNA vírics del nucli

Internalització de CD4 i MHC .

Bloqueig de teterina

Acció sobre el cicle ceŀlular

Erickson-Viitanen et al., 1989

Schneider i Kent, 1988

Cheng et al., 1987

Engelman et al., 1991

Wyatt i Sodroski, 1998

Romani et al., 2010

Miller et al., 2000

Schwartz et al., 1996

Schubert et al., 1998

Kogan i Rappaport, 2011

Bloqueig d’APOBEC3G Malim i Bieniasz, 2012

El gens principals ( gag, pol i env) codifiquen un precursor poliproteic que donarà lloc a les diferents proteïnes madures. Els gens accessoris (tat, rev, nef, vpu , vpr i vif ) codifiquen proteïnes amb funcions específiques en el cicle víric. Les funcions de les diferents proteïnes es descriuen breument.

Morfològicament, el VIH s’ajusta a la definició clàssica dels retrovirus . Els virions madurs del VIH-1 tenen una morfologia aproximadament esfèrica i un diàmetre de 145 ± 25 nm (Briggs et al., 2003) . A la seva part més externa trobem l’embolcall víric, una bicapa lipídica originària de la cèŀlula hoste, de la qual sobresurten formant espícules les glicoproteïnes de l’embolcall (Env,

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

de l’anglès envelope) . A la part interna de l’embolcall es troba la matriu formada per la proteïna MAp17, la qual forma una cavitat on s’acomoda la càpsida vírica . Aquesta càpsida de forma troncocònica (Briggs et al., 2003) està formada per la proteïna CAp24 i conté dins el seu interior el genoma víric, els enzims vírics proteasa (PR), transcriptasa inversa (TI) i integrasa (IN), i les pro -

Figura 1. Estructura i cicle vital del VIH. a) Esquema del genoma i l’estructura del VIH-1. Els gens principals ( gag, pol i env, en negre) i accessoris (tat, rev, nef, vif, vpr i vpu, en gris) es distribueixen en les tres pautes de lectura del genoma (indicades pels diferents nivells) i estan flanquejats pels long terminal repeats o LTR. Els gens principals codifiquen les proteïnes estructurals, enzimàtiques i d’embolcall que formaran la partícula vírica, esquematitzada en la part inferior. b) El cicle de replicació del VIH en una cèŀlula T CD4 s’inicia per la fusió de les membranes vírica i ceŀlular, l’alliberament de l’RNA al citoplasma i la retrotranscripció a una doble cadena de DNA. Un cop al nucli el DNA necessita integrar-se en el genoma de la cèŀlula diana per poder ser transcrit. Els diferents productes de transcripció permetran l’assemblatge de les proteïnes estructurals, accessòries i l’RNA genòmic per formar una partícula vírica immadura que serà processada per la proteasa vírica per general virus madurs infecciosos. Una coŀlecció completa de material gràfic es pot trobar a la pàgina web de divulgació d’IrsiCaixa (www.irsicaixa.es).

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

teïnes accessòries Vif, Vpr i Nef . El genoma víric, a més, està embolcallat per una estructura anomenada nucleocàpsida formada per la proteïna NC7.

El cicle vital del VIH-1, que es troba iŀlustrat a la figura 1b, segueix l’esquema general dels retrovirus, format per una fase primerenca (compresa entre l’entrada del virus a la cèŀlula i la integració del provirus) i una fase tardana (compresa entre la transcripció dels gens vírics i la formació dels nous virions) . El procés d’entrada del virus a la cèŀlula diana (principalment limfòcits T CD4+ i en menys mesura macròfags i cèŀlules dendrítiques) s’inicia per la unió d’alta afinitat entre gp120 i la molècula CD4, que actua com a receptor, i un receptor de quimiocines (generalment CCR5 o CXCR4) que actua com a coreceptor (Wyatt i Sodroski, 1998) . Aquestes unions provoquen la inserció d’una regió altament hidrofòbica de gp41 (anomenada pèptid de fusió) a la membrana de la cèŀlula diana (Wyatt i Sodroski, 1998), es fusiona la membrana ceŀlular i la del virió i s’allibera la càpsida vírica a l’interior del citoplasma ceŀlular, on es produeix la desencapsidació i l’alliberació del material genètic i de diverses proteïnes víriques . Un cop s’ha produït la desencapsidació, la TI del virió procedeix a la síntesi de DNA de doble cadena . En primer lloc se sintetitza una cadena de DNA utilitzant com a motlle l’RNA víric, i es forma un híbrid DNA/ RNA . Posteriorment l’RNA és degradat per l’activitat RNAsaH de la TI i finalment se sintetitza la cadena de DNA complementària (Peliska i Benkovic, 1992; Starnes i Cheng, 1989) . Un cop finalitzada la transcripció inversa, el DNA s’inclou en un complex proteic, anomenat complex de preintegració, que és transportat fins a l’interior del nucli ceŀlular . Tot seguit, la IN vírica catalitza el procés d’integració que culmina amb la unió covalent del DNA víric i el DNA ceŀlular (Engelman et al., 1991) . Un cop in-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

tegrat, el material genètic del virus (anomenat provirus) pot romandre en estat latent durant un període de temps de durada variable .

La transcripció del DNA províric depèn de la maquinària de transcripció de la cèllula hoste, com l’RNA-polimerasa ii, però està regulada per les proteïnes víriques Tat i Rev amb l’ajuda de nombrosos factors de transcripció ceŀlulars presents en les cèŀlules activades (Romani et al., 2010) . L’RNA obtingut és processat mitjançant un procés de tall i unió (en anglès splicing) que origina diferents transcrits vírics: molècules de RNA senceres, molècules resultants d’un sol procés de tall i unió i molècules en què aquest procés ha succeït diverses vegades . Aquests últims transcrits són transportats al citoplasma a través de mecanismes cellulars, mentre que Rev dirigeix el transport dels transcrits que han patit un o cap procés de tall i unió (Miller et al., 2000) . Posteriorment tindrà lloc, al citoplasma ceŀlular, el procés de traducció als diferents precursors de les proteïnes víriques . Aquests precursors de Gag i Gag/Pol són transportats cap a la membrana plasmàtica, on es produirà l’assemblatge juntament amb dues molècules senceres de l’RNA víric per formar el nou virió . El procés de gemmació de les noves partícules víriques immadures es dóna en aquelles regions de la membrana plasmàtica on s’expressen les proteïnes de l’embolcall . Durant la gemmació, la nova partícula vírica incorpora a la seva superfície tant les glicoproteïnes de l’embolcall com proteïnes ceŀlulars que li facilitaran la infecció posterior d’una nova cèŀlula (Wyatt i Sodroski, 1998) . Finalment, la PR indueix la proteòlisi dels precursors de les proteïnes codificades pels gens gag i pol, provoca canvis morfològics al virió i forma les partícules víriques madures que adquireixen la capacitat d’iniciar un nou cicle de replicació .

El VIH... més que un retrovirus?

Quina diferència entre el VIH i els altres retrovirus ha permès al VIH disseminar-se de manera devastadora entre la població humana? Probablement, la resposta a aquesta pregunta l’hem de buscar, entre d’altres, en tres particularitats destacables del VIH com són la seva variabilitat, les seves cèŀlules diana i les seves proteïnes accessòries . La variabilitat del VIH és molt superior a la d’altres virus i és determinada per una TI propensa a cometre errors de transcripció i que fa viure el VIH en el llindar de l’eficiència biològica, però que li confereix una enorme capacitat d’adaptació . La TI comet un error cada 2 .000-5 .000 nucleòtids a causa de la seva manca d’activitat correctora .

Aquesta taxa d’error se situa entre les més elevades de les diferents polimerases conegudes . Considerant que la TI catalitza el pas de RNA a DNA així com la síntesi de la segona còpia del DNA, es poden incorporar entre 5 i 10 errors en cada cicle de replicació (Basavapathruni i Anderson, 2007) . Tot això, en un context en què es poden produir uns 1010 virions per dia, provoca que el concepte de quasiespècie, definit pel conjunt de seqüències diferents que constitueixen una població vírica, sigui paradigmàtic en el cas del VIH (Briones i Domingo, 2008), i li ofereix una plasticitat capaç de superar la pressió farmacològica o immunitària amb relativa facilitat (Domingo et al., 1997) . Un altre fet important és la relació del VIH amb les cèŀlules T CD4+ . EL VIH, com els seus ancestres de primats, està perfectament adaptat a la replicació en cèŀlules limfoides, les quals li proporcionen una mobilitat addicional (Murooka, 2012) i li permeten aprofitar les estructures sinàptiques del sistema immunitari per a una disseminació eficient (Izquierdo-Useros et al., 2010; Puigdomènech et al., 2009) . A més, a

diferència d’altres retrovirus, la replicació vírica produeix la destrucció de les cèŀlules diana . Sabem que les cèŀlules T CD4+ infectades tenen una vida mitjana curta a causa dels efectes citopàtics directes de la replicació del VIH (Varbanov et al., 2006), però el nombre de cèŀlules infectades en un individu, una per cada 103 -104 cèŀlules CD4+ en infecció aguda (Wood et al., 1993), és notablement inferior al nombre de cèŀlules T CD4+ que desapareix durant la infecció . Per tant, el VIH no repercuteix tan sols sobre les cèllules T CD4+ infectades, sinó que afecta també la població de cèŀlules T CD4+ no infectades per un mecanisme de lisi per proximitat (Blanco et al., 2004; McCune, 2001) . De fet, en teixit limfoide l’apoptosi es produeix principalment en les cèŀlules T CD4+ que no estan infectades (Finkel et al., 1995) que moren a causa de l’estat d’hiperactivació immunitària, de l’activitat lítica de les cèŀlules CTL, NK i macròfags o del dany progressiu dels òrgans limfoides primaris i secundaris (Douek et al., 2009) . Una característica addicional que presenten les cèŀlules T CD4+ és la seva capacitat d’expansió i contracció . Aquest fet permet al virus replicar-se de manera enormement eficient en cèŀlules activades i alhora mantenir-se en estat latent, és a dir, integrat en el genoma sense transcriure’s, en les cèŀlules en repòs . Finalment, és destacable el paper de les proteïnes reguladores en el context de la infecciositat i citopaticitat vírica . De fet, aquestes proteïnes han representat una veritable caixa de sorpreses per als retroviròlegs . La seves funcions augmenten la infecciositat de les partícules víriques, però els seus mecanismes han romàs foscos fins fa pocs anys . Ara sabem que a més de les múltiples accions de Vpu i Nef, que modulen el trànsit intraceŀlular de la molècula CD4 i del complex d’histocompatibilitat principal de classe i i n’afavoreixen la degradació (Schubert et al., 1998; Schwartz et al., 1996), o

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

de Vpr, que indueix la parada del cicle ceŀlular (Kogan i Rappaport, 2011), les proteïnes reguladores tenen com a missió el bloqueig de tot un armament ceŀlular destinat al control de les infeccions víriques o els retrovirus endògens . Així, noves molècules com la teterina, Trim5a, APOBEC3G o SAMHD1 han adquirit una nova rellevància en el funcionament ceŀlular (Malim i Bieniasz, 2012; Schubert et al., 1998; Schwartz et al., 1996) i han permès establir un cens exhaustiu de les diferents peces que participen en la batalla molecular que es lliura a l’interior d’una cèŀlula infectada .

Història natural de la infecció pel VIH

El nostre coneixement molecular del VIH ens ha ajudat a entendre la història natural de la infecció (vegeu la figura 2a), que és un punt d’intensa recerca, per les seves implicacions en l’optimització de la teràpia i el desenvolupament de vacunes . La primoinfecció pel VIH dóna lloc a una fase aguda en la qual el virus es dissemina principalment pel teixit limfoide associat a l’intestí (en anglès, gut-associated lymphoid tissue, GALT), els ganglis limfàtics i altres teixits com el sistema nerviós . La disseminació del virus és ràpida, destrueix la majoria de limfòcits intestinals i estableix el reservori víric, el conjunt de cèŀlules que porten integrat el genoma víric sense expressar-lo, el qual ja no podrà ser eradicat (Blankson et al., 2002) . De totes maneres, l’individu infectat roman asimptomàtic, excepte en alguns casos en els quals s’observa l’anomenat síndrome retrovíric agut, que sol tenir una duració d’una a dues setmanes, i es caracteritza per febre, letargia, astènia o faringitis, entre d’altres símptomes . Durant aquesta fase hi ha una gran replicació vírica, i s’arriba a un punt màxim després de 21-28 dies postinfecció, i la càrrega vírica (CV) i la

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

proporció de limfòcits T CD4+ infectats són molt elevades . Concomitantment es produeix una marcada davallada en el nombre de cèŀlules T CD4+ circulants . Posteriorment, es genera la resposta immunitària específica en forma d’anticossos contra quasi totes les proteïnes reguladores i estructurals del virus, procés anomenat seroconversió, i també de l’expansió clonal dels limfòcits T CD8+ específics per al VIH amb activitat citotòxica (vegeu la figura 2 a) . Aquesta resposta immunitària provoca una dràstica davallada de la CV i de la proporció de limfòcits T CD4+ infectats així com la recuperació parcial del nombre de cèŀlules T CD4+ . S’estableix, doncs, un punt d’equilibri entre el virus i el sistema immunitari que donarà pas a la fase crònica . Durant la fase crònica, que té una duració de diversos anys en funció de l’individu, la replicació vírica persisteix però a nivells baixos, ja que és parcialment controlada per la forta resposta immunitària generada . Principalment la replicació vírica es duu a terme als òrgans limfoides, on la CV és entre 10 i 100 .000 vegades superior a la present en plasma . Aquesta fase es caracteritza també per una latència clínica, ja que la majoria dels pacients romanen asimptomàtics . Tot i això, no es tracta d’una fase estàtica, ja que la contínua estimulació antigènica i la destrucció/repoblació de cèŀlules T CD4+ resulta en un esgotament de la capacitat de regeneració del sistema immunitari, el qual acabarà perdent la seva capacitat de control de la replicació del VIH . Així entrem en la fase crítica o sida, en què l’activitat replicativa del virus s’incrementa notablement, gràcies a la pèrdua de pressió immunitària, de manera que la CV circulant i la CV dels òrgans limfoides s’iguala i es produeix una forta depleció de limfòcits T CD4+ circulants en sang perifèrica . Clínicament es fa palesa la greu alteració de l’estat general del pacient, amb l’aparició

d’infeccions oportunistes i altres manifestacions com poden ser alteracions del sistema nerviós central, caquèxia, fallada renal

o, eventualment, la mort (vegeu la figura 2a) . Durant els primers anys de la pandèmia, aquest va ser un ineludible final per a a TARGA

Anys

Anys

Àfrica subsahariana

Figura 2. Impacte individual i global de la infecció pel VIH i efecte del TARGA. a) Representació del curs de la infecció pel VIH on es mostra el nivell de virèmia plasmàtica (línia contínua negra), el recompte de cèŀlules T CD4+ en sang perifèrica (línia discontínua grisa) o en GALT (línia discontínua negra) i la resposta immunitària (línia puntejada). El curs natural de la infecció es descriu en el panell esquerre, mentre que l’efecte de la introducció del TARGA (àrea ombrejada) es descriu en el panell dret. b) Impacte del VIH en la mortalitat en els països desenvolupats (Europa i els Estats Units, línia grisa) i a l’Àfrica subsahariana (línia negra). L’efecte de la introducció del TARGA el 1995 és clar en la mortalitat per sida en els països desenvolupats.

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

Setmanes

Setmanes

moltes persones, fins que la recerca en nous tractaments va permetre el desenvolupament d’una teràpia eficaç contra el VIH .

L’APLICACIÓ DEL CONEIXEMENT

El tractament de la infecció per VIH

La recerca de fàrmacs actius contra el VIH comença immediatament després de l’associació amb la sida . Els retroviròlegs van revisar els arxius d’antiretrovírics que s’havien desenvolupat fins aquell moment contra altres retrovirus, bàsicament anàlegs de nucleòsids actius contra la TI . El primer fàrmac aprovat contra el VIH va ser l’azidotimidina (AZT), que s’havia provat contra algunes variants del virus de la leucèmia murina (Ostertag et al., 1974) . Malgrat la seva activitat in vitro i el seu efecte beneficiós a curt termini in vivo, ràpidament es va comprovar que no tenia activitat suficient per controlar el VIH a llarg termini, ja que la capacitat d’adaptació del virus el feia ràpidament resistent al fàrmac . Nous inhibidors de la TI van aparèixer ben aviat, però presentaven les mateixes limitacions . No va ser fins a mitjans dels anys noranta, amb la introducció dels inhibidors de la proteasa, que va canviar l’estratègia del tractament antiretrovíric . La combinació de diferents fàrmacs, coneguda com a TARGA (tractament antiretrovíric de gran activitat, o HAART per les seves sigles en anglès) redueix la CV a nivells indetectables i permet una recuperació (parcial) de les cèŀlules T CD4 circulants, tot i que no recupera els nivells d’aquestes cèŀlules en GALT (vegeu la figura 2a) . Aquest efecte va aconseguir canviar el curs natural de la infecció, va reduir dràsticament la mortalitat i va augmentar de manera significativa l’esperança de vida dels individus infectats; almenys, nova-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

ment, en els països desenvolupats (vegeu la figura 2b) .

En poc menys de vint anys, hem arribat a disposar de més de vint antiretrovírics amb els quals es poden establir pautes combinades d’alta activitat . Els antiretrovírics s’agrupen en diferents famílies segons les dianes que utilitzen per inhibir la infecció: ITIAN (inhibidors de la TI anàlegs de nucleòsids), ITINAN (inhibidors de la TI no anàlegs), IP (inhibidors de la PR), inhibidors de la fusió, inhibidors de la IN i inhibidors de l’entrada o antagonistes del CCR5 (Broder, 2010) .

Tot i la seva gran efectivitat, el TARGA no està exempt de problemes . Necessita una administració permanent, ja que les interrupcions del tractament acaben amb un rebrot víric que empitjora l’evolució de la malaltia . A més hi ha un risc de manca d’adherència al tractament que indueix l’aparició de virus multiresistents amb el fracàs conseqüent en el control del VIH i la manca d’alternatives terapèutiques, agreujat per la toxicitat del tractament antiretrovíric a llarg termini pel que fa al risc cardiovascular i lipodistròfia . Un últim factor important és l’elevat cost del tractament antiretrovíric (fins a uns 10 .000 €/any), amb un augment constant que en qüestiona la sostenibilitat a llarg termini fins i tot en països desenvolupats . Però la principal limitació del TARGA és que només és actiu contra els virus que es repliquen activament i és incapaç d’actuar sobre el reservori víric . Així aconsegueix reduir el nivell de virus circulant però no el virus integrat en cèŀlules latentment infectades, les quals desapareixen en funció de la seva vida mitjana . De fet, els models actuals suggereixen que un tractament òptim continuat durant tota la vida seria insuficient perquè aquesta lenta desaparició del reservori fos total (Blankson et al., 2002) . Finalment, hem de recordar que el tractament és només accessible de mane-

ra generalitzada als països desenvolupats, és a dir, a una proporció excessivament petita del total d’afectats .

L’eradicació. El gran repte pendent

Considerant les limitacions del TARGA, el pobre impacte de les polítiques de prevenció i les dimensions socials, econòmiques i de salut global que la sida encara té avui dia, el desenvolupament d’estratègies d’eradicació del virus és crucial i ha reunit nous esforços en els últims anys . Aquestes estratègies impliquen, si seguim la història de les malalties infeccioses com la verola o la pòlio, el desenvolupament d’una vacuna eficaç, però també la recerca de l’eliminació completa del reservori víric en els individus infectats . Tanmateix, el VIH presenta una variabilitat que ha impossibilitat fins al moment el primer objectiu, i el nostre coneixement de la latència vírica és encara limitat per assolir-ne el segon . Ambdós objectius representen dos dels principals reptes en termes de dimensions científiques i econòmiques als quals la comunitat científica s’ha hagut d’enfrontar mai . Malgrat això, tenim a favor tota la tasca feta; per tant, el camí ja és obert i la direcció sembla clara . La recerca d’una vacuna contra el VIH ha viscut paraŀlela al desenvolupament de nous fàrmacs, però amb una trajectòria sense èxits, marcada per la manca d’un model de protecció natural i, per tant, de bons marcadors de protecció . Les aproximacions inicials van demostrar la dificultat de generar anticossos neutralitzants o protectors contra l’Env, la principal diana de la resposta humoral contra el VIH (Wyatt i Sodroski, 1998) probablement a causa de la seva capacitat immunosupressora . A més, en els casos en què s’aconseguien, fins i tot en humans, els anticossos generats bloquejaven el virus utilitzat com a immunogen però en

cap cas no presentaven una activitat àmplia contra les diferents variants víriques circulants en la població infectada (Belshe et al., 1994) . De nou, el problema de la variabilitat es va fer evident de manera immediata . Aquest fet,i els progressos en la caracterització de la resposta immunitària en individus infectats que apuntaven a un paper preponderant de la resposta ceŀlular en el control de la replicació del VIH in vivo (Kiepiela et al., 2007), van donar pas a una etapa en la qual la recerca de la vacuna contra el VIH estava dominada pel disseny d’immunògens i vectors capaços de generar aquest tipus de resposta . Aquesta etapa va finalitzar de manera sobtada amb l’estudi STEP, un dels grans estudis de vacunes contra el VIH en humans (tres mil voluntaris), que va haver de ser aturat prematurament, ja que una anàlisi intermèdia va demostrar més sensibilitat a la infecció en els individus vacunats que en el grup placebo (Pantaleo, 2008) . Després d’aquest fracàs, la balança es va tornar a decantar cap a l’anàlisi de la resposta humoral, sobretot després de la publicació de les dades d’un segon gran estudi de vacuna combinada, inductora d’immunitat humoral i ceŀlular amb setze mil voluntaris que va demostrar un baix però significatiu nivell de protecció (34 %) correlacionat amb la presència d’anticossos contra Env (Alter i Moody, 2010) . Així, en els últims anys hem viscut un esclat de nous epítops involucrats en la protecció contra la infecció, de mecanismes de neutralització del virus per anticossos, de dissenys de proteïnes que poden ser utilitzades com a immunògens (Koff, 2012), o de noves tecnologies per immunitzar individus en absència del que podem anomenar vacunació clàssica, com és el cas de la vacunació passiva, que utilitza cèŀlules musculars com a productores d’anticossos mitjançant teràpia gènica i permet evitar el problema fins ara no resolt de

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

la generació d’una resposta humoral protectora mitjançada per cèŀlules B (Balazs et al., 2012) . Tots aquests avenços amb els nous dissenys d’immunògens i vectors millorats per generar una resposta ceŀlular han de ser assajats en els propers anys . Hem de recordar que la complexitat del problema és enorme i requereix un esforç científic i econòmic de proporcions inabastables per a un laboratori o centre de recerca . La constatació de la necessitat d’un abordatge conjunt a escala internacional ha donat lloc a una iniciativa coŀlaborativa anomenada Global HIV Vaccine Enterprise, que garanteix un equilibri entre els interessos científics, econòmics i el dret de l’accés a la vacuna per a la població dels països no desenvolupats (Klausner et al., 2003) . En paraŀlel, altres iniciatives globals amb l’objectiu d’eradicar la infecció del VIH han anat prenent forma (Deeks et al., 2012) . Tenim, per tant, les eines científiques i organitzatives que ofereixen una perspectiva optimista per al futur més proper .

AGRAÏMENTS

IrsiCaixa és una fundació privada sense ànim de lucre finançada pel Departament de Salut de la Generalitat de Catalunya i la Fundació La Caixa . La tasca de recerca és també possible gràcies a Gala contra la Sida 2011 i «Les nostres cançons contra la sida 2012» .

El programa HIVACAT, participat per IrsiCaixa i l’Hospital Clínic, té el suport del Departament d’Economia i Coneixement i el Departament de Salut de la Generalitat de Catalunya, la Fundació La Caixa, la Fundació Clínic i els Laboratoris Esteve .

BIBLIOGRAFIA

Alter, G .; Moody, M . A . (2010) . «The humoral response to HIV-1: new insights, renewed focus» . J. Infect. Dis., 202 (supl . 2): S315-S322 . Balazs, A . B .; Chen, J .; Hong, C . M .; Rao, D . S .; Yang, L .; Baltimore, D . (2012) . «Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis» . Nature, 481: 81-84 . Baltimore, D . (1970) . «RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses» . Nature, 226: 1209-1211 . Baltimore, D . (1975) . «Tumor viruses: 1974» . Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol., 39: 1187-1200 .

Barré-Sinoussi, F . [et al .] (1983) . «Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)» . Science, 220: 868-871 .

Basavapathruni, A .; Anderson, K . S . (2007) . «Reverse transcription of the HIV-1 pandemic» . FASEB J., 21: 3795-3808 .

Belshe, R . B .; Graham, B . S .; Keefer, M . C .; Gorse, G . J .; Wright, P.; Dolin, R .; Matthews, T .; Weinhold, K .; Bolognesi, D . P.; Sposto, R . (1994) . «Neutralizing antibodies to HIV-1 in seronegative volunteers immunized with recombinant gp120 from the MN strain of HIV-1 . NIAID AIDS Vaccine Clinical Trials Network» . JAMA, 272: 475-480 .

Blanco, J .; Barretina, J .; Clotet, B .; Esté, J . A . (2004) . «R5 HIV gp120-mediated cellular contacts induce the death of single CCR5-expressing CD4 T cells by a gp41-dependent mechanism» . J. Leukoc. Biol., 76: 804-811 .

Blankson, J . N .; Persaud, D .; Siliciano, R . F . (2002) . «The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection» Annu. Rev. Med., 53: 557-593

Briggs, J A G ; Wilk, T ; Welker, R ; Kräusslich, H G ; Fuller, S D (2003) «Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores» EMBO J., 22: 1707-1715

Briones, C ; Domingo, E (2008) «Minority report: hidden memory genomes in HIV-1 quasispecies and possible clinical implications» AIDS Rev., 10: 93-109

Broder, S (2010) «The development of antiretroviral therapy and its impact on the HIV-1/AIDS pandemic» Antiviral Res., 85: 1-18

Centers for Disease Control (CDC) (1981) «Pneumocystis pneumonia—Los Angeles» MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep., 30: 250-252

Centers for Disease Control (CDC) (1982) «Persistent, generalized lymphadenopathy among homo -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

sexual males» . MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep., 31: 249-251 .

Cheng, Y . C .; Dutschman, G . E .; Bastow, K . F .; Sarngadharan, M . G .; Ting, R . Y . (1987) . «Human immunodeficiency virus reverse transcriptase . General properties and its interactions with nucleoside triphosphate analogs» . J. Biol. Chem., 262: 2187-2189 .

Chermann, J . C .; Barré-Sinoussi, F .; Dauguet, C .; Brun-Vezinet, F .; Rouzioux, C .; Rozenbaum, W .; Montagnier, L . (1983) . «Isolation of a new retrovirus in a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome» . Antibiot. Chemother., 32: 48-53 .

Clavel, F .; Guétard, D .; Brun-Vézinet, F .; Chamaret, S .; Rey, M . A .; Santos-Ferreira, M . O .; Laurent, A . G .; Dauguet, C .; Katlama, C .; Rouzioux, C . (1986) . «Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS» . Science, 233: 343-346 .

Crawford, L . V .; Crawford, E . M . (1961) . «The properties of Rous sarcoma virus purified by density gradient centrifugation» . Virology, 13: 227-232 .

Deeks, S . G . [et al .] (2012) . «Towards an HIV cure: a global scientific strategy» . Nat. Rev. Immunol., 12: 607-614 .

Domingo, E .; Menéndez-Arias, L .; Quiñones-Mateu, M . E .; Holguín, A .; Gutiérrez-Rivas, M .; Martínez, M . A .; Quer, J .; Novella, I . S .; Holland, J . J . (1997) . «Viral quasispecies and the problem of vaccine-escape and drug-resistant mutants» . Prog. Drug Res., 48: 99-128 .

Douek, D . C .; Roederer, M .; Koup, R . A . (2009) . «Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS» . Annu. Rev. Med., 60: 471-484 .

Durack, D . T . (1981) . «Opportunistic infections and Kaposi’s sarcoma in homosexual men» . N. Engl. J. Med., 305: 1465-1467

Engelman, A ; Mizuuchi, K ; Craigie, R (1991) «HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer» Cell, 67: 1211-1221

Erickson-Viitanen, S ; Manfredi, J ; Viitanen, P ; Tribe, D E ; Tritch, R ; Hutchison, C A ; Loeb, D D ; Swanstrom, R (1989) «Cleavage of HIV-1 gag polyprotein synthesized in vitro: sequential cleavage by the viral protease» AIDS Res. Hum. Retroviruses., 5: 577-591

Finkel, T H ; Tudor-Williams, G ; Banda, N K ; Cotton, M F ; Curiel, T ; Monks, C ; Baba, T W ; Ruprecht, R M ; Kupfer, A (1995) «Apoptosis occurs predominantly in bystander cells and not in productively infected cells of HIV- and SIV-infected lymph nodes» Nat. Med., 1: 129-134

Gallo, R C [et al ] (1983) «Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS)» Science, 220: 865-867

Hahn, B . H .; Shaw, G . M .; Cock, K . M . de; Sharp, P. M . (2000) . «AIDS as a zoonosis: scientific and public health implications» . Science, 287: 607-614 .

Izquierdo-Useros, N .; Naranjo-Gómez, M .; Erkizia, I .; Puertas, M . C .; Borràs, F . E .; Blanco, J .; Martinez-Picado, J . (2010) . «HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse?» . PLoS Pathog., 6: e1000740 .

Kiepiela, P. [et al .] (2007) . «CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load» . Nat. Med., 13: 46-53 . Klausner, R . D . [et al .] (2003) . «Medicine . The need for a global HIV vaccine enterprise» . Science, 300: 2036-2039 .

Koff, W . C . (2012) . «HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem» . Vaccine, 30: 4310-4315 . Kogan, M .; Rappaport, J . (2011) . «HIV-1 accessory protein Vpr: relevance in the pathogenesis of HIV and potential for therapeutic intervention» . Retrovirology, 8: 25 .

Vilaseca, J .; Arnau, J . M .; Bacardi, R .; Mieras, C .; Serrano, A .; Navarro, C . (1982) «Kaposi’s sarcoma and toxoplasma gondii brain abscess in a Spanish homosexual» . Lancet, 319: 572 .

McCune, J . M . (2001) . «The dynamics of CD4+ T-cell depletion in HIV disease» . Nature, 410: 974-979 .

Malim, M . H .; Bieniasz, P. D . (2012) . «HIV restriction factors and mechanisms of evasion» . Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2: a006940 .

Miller, R . J .; Cairns, J . S .; Bridges, S .; Sarver, N . (2000) . «Human immunodeficiency virus and AIDS: insights from animal lentiviruses» . J. Virol., 74: 7187-7195 .

Murooka, T T ; Deruaz, M ; Marangoni, F ; Vrbanac, V D ; Seung, E ; Andrian, U H von; Tager, A M ; Luster, A D ; Mempel, T R (2012) «HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination» Nature, 490: 283-287

Ostertag, W ; Roesler, G ; Krieg, C J ; Kind, J ; Cole, T ; Crozier, T ; Gaedicke, G ; Steinheider, G ; Kluge, N ; Dube, S (1974) «Induction of endogenous virus and of thymidine kinase by bromodeoxyuridine in cell cultures transformed by Friend virus» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 4980-4985

Pantaleo, G (2008) «HIV-1 T-cell vaccines: evaluating the next step» Lancet Infect. Dis., 8: 82-83

Peliska, J A ; Benkovic, S J (1992) «Mechanism of DNA strand transfer reactions catalyzed by HIV-1 reverse transcriptase» Science, 258: 1112-1118

Poiesz, B J ; Ruscetti, F W ; Gazdar, A F ; Bunn, P A ; Minna, J D ; Gallo, R C (1980) «Detection and isolation of type C retrovirus particles from

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7415-7419 .

Puigdomènech, I .; Massanella, M .; Cabrera, C .; Clotet, B .; Blanco, J . (2009) . «On the steps of cellto-cell HIV transmission between CD4 T cells» . Retro virology, 6: 89 . Romani, B .; Engelbrecht, S .; Glashoff, R . H . (2010) . «Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1» . J. Gen. Virol., 91: 1-12 . Rous, P. (1911) . «A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor cells» . J. Exp. Med., 13: 397-411 .

Sambrook, J .; Westphal, H .; Srinivasan, P. R .; Dulbecco, R . (1968) . «The integrated state of viral DNA in SV40-transformed cells» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 1288-1295 .

Schneider, J .; Kent, S . B . (1988) . «Enzymatic activity of a synthetic 99 residue protein corresponding to the putative HIV-1 protease» . Cell, 54: 363-368 .

Schubert, U .; Antón, L . C .; Bacík, I .; Cox, J . H .; Bour, S .; Bennink, J . R .; Orlowski, M .; Strebel, K .; Yewdell, J . W . (1998) . «CD4 glycoprotein degradation induced by human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein requires the function of proteasomes and the ubiquitin-conjugating pathway» . J. Virol., 72: 2280-2288 .

Schwartz, O .; Maréchal, V .; Le Gall, S .; Lemonnier, F .; Heard, J . M . (1996) . «Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein» . Nat. Med., 2: 338-342 .

Shapiro, S . (2011) . «HIV sequence compendium 2011» [en línia] . http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ HIV/COMPENDIUM/2011compendium.html .

Siegal, F P ; Lopez, C ; Hammer, G S ; Brown, A E ; Kornfeld, S J ; Gold, J ; Hassett, J ; Hirschman, S Z ; Cunningham-Rundles, C ; Adelsberg, B R (1981) «Severe acquired immunodeficiency in male homosexuals, manifested by chronic perianal ulcerative herpes simplex lesions» N. Engl. J. Med., 305: 1439-1444

Starnes, M C ; Cheng, Y C (1989) «Human immunodeficiency virus reverse transcriptase-associated RNase H activity» J. Biol. Chem., 264: 7073-7077

Tebit, D M ; Arts, E J (2011) «Tracking a century of global expansion and evolution of HIV to drive understanding and to combat disease» Lancet Infect. Dis., 11: 45-56

UNAIDS/OMS (2010) «Report on the global AIDS Epidemic 2010» Report on the global AIDS Epidemic 2010. http://www.unaids.org/globalreport/global_ report.htm

Vallée, H ; Carré, H (1904) «Sur la nature infec-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

tieuse de l’anémie du cheval» . Comp. Rend. Acad. Sci., 139: 331-333 .

Varbanov, M .; Espert, L .; Biard-Piechaczyk, M . (2006) . «Mechanisms of CD4 T-cell depletion triggered by HIV-1 viral proteins» . AIDS Rev., 8: 221236 .

Wood, R .; Dong, H .; Katzenstein, D . A .; Merigan, T . C . (1993) . «Quantification and comparison of HIV-1 proviral load in peripheral blood mononuclear cells and isolated CD4+ T cells» . J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., 6: 237-240 .

Wyatt, R .; Sodroski, J . (1998) . «The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens» . Science, 280: 1884-1888 .

Ziegler, J . L .; Beckstead, J . A .; Volberding, P. A .; Abrams, D . I .; Levine, A . M .; Lukes, R . J .; Gill, P. S .; Burkes, R . L .; Meyer, P. R .; Metroka, C . E . (1984) . «Non-Hodgkin’s lymphoma in 90 homosexual men . Relation to generalized lymphadenopathy and the acquired immunodeficiency syndrome» . N. Engl. J. Med., 311: 565-570 .

SOBRE ELS AUTORS

Marta Curriu és llicenciada en biologia humana per la Universitat Pompeu Fabra (2007) i doctora en immunologia per la Universitat Autònoma de Barcelona (2012) . Ha centrat la seva tesi doctoral en els mecanismes de destrucció de les cèŀlules CD4 pel VIH-1 en el Grup de Virologia i Immunologia Ceŀlular de l’Institut de Recerca de la Sida IrsiCaixa . Específicament ha contribuït a descriure nous mecanismes citopàtics associats a la glicoproteïna d’embolcall en els quals participen les cèŀlules NK . Bonaventura Clotet, MD, PHD, és responsable de la Unitat de VIH i director de l’Institut de Recerca de la Sida IrsiCaixa a l’Hospital Universitari Germans Trias i Pujol de Badalona i codirector del projecte HIVACAT, un programa de recerca pioner per al desenvolupament de la investigació de vacunes contra el VIH a Catalunya . Llicenciat en medicina i cirurgia per la Universitat Autònoma de Barcelona el 1976 i doctor el 1981 per les seves investigacions

sobre marcadors per malalties del teixit connectiu . Des de 1979 és professor associat de la Facultat de Medicina de la UAB . Ha publicat més de cinc-cents treballs científics internacionals de prestigi, nombrosos capítols, llibres i guies de retrovirologia clínica i és revisor de les principals revistes del camp . És codirector de la revista AIDS Cyber Journal, integrada en el marc del programa de formació mèdica continuada sobre la sida a través d’Internet . El doctor Clotet va ser nomenat co ­ chair del Track B del Congrés Mundial de la Sida a Barcelona l’any 2002, és membre del Governing Council de l’IAS i organitzador del proper congrés AIDS Vaccine de 2013 .

Julià Blanco és el responsable del Grup de Virologia i Immunologia Ceŀlular de l’Institut de Recerca de la Sida i investigador de l’IGTP. És llicenciat en ciències químiques per la UB (1989) i doctor en ciències químiques (bioquímica, 1994) per la mateixa universitat amb un treball sobre el metabolisme purínic renal . La seva etapa postdoctoral al Departament SIDA-Retrovirus de l’Institut Pasteur a París li va servir per entrar en el terreny del VIH, on s’ha especialitzat en els aspectes immunitaris de la infecció, específicament en els mecanismes de destrucció de cèŀlules CD4 i en la resposta humoral contra la glicoproteïna de l’embolcall víric . És professor associat de la UAB, autor de més de vuitanta publicacions científiques, membre de l’IAS i del consell editorial de diferents revistes internacionals .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 77-92

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .137

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 93-105

USOS DE BIOMATERIALS I CÈL·LULES EN REGENERACIÓ DE CARTÍLAG ARTICULAR

Joaquim Vives1 i Francesc Gòdia 2

1 Divisió de Teràpies Avançades/XCELIA, Banc de Sang i Teixits

2 Grup d’Enginyeria Ceŀlular i Tissular, Departament d’Enginyeria Química, Escola d’Enginyers, Universitat Autònoma de Barcelona

Adreça per a la correspondència: Joaquim Vives . Divisió de Teràpies Avançades/XCELIA, Banc de Sang i Teixits, Edifici Dr . Frederic Duran i Jordà . Pg . de Taulat, 116 . 08005 Barcelona . Tel .: 935 573 500 . Adreça electrònica: joaquim.vives@gmail.com.

RESUM

Molts teixits del cos humà (entre aquests la pell, la sang i l’os) presenten cert grau de regeneració, però els danys que van més enllà d’aquest potencial reparador intrínsec es poden beneficiar d’intervencions terapèutiques dissenyades per recuperar la funcionalitat dels teixits . El gold standard en molts d’aquest tractaments involucra l’autotrasplantament, bo i que l’extracció de teixit sa d’altres zones del cos s’associa amb l’augment de la morbiditat i amb limitacions en la quantitat del material de partida . Per adreçar la demanda de teixit donant, l’enginyeria de teixits es presenta com una alternativa terapèutica amb molt de potencial, ja que fa ús no només de biomaterials, sinó també de cèŀlules i factors de senyalització en diverses combinacions que faciliten la regeneració de teixits danyats . Els avenços més recents en aquest camp han fet augmentar la demanda de nous biomaterials naturals en origen, biodegradables i biocompatibles, amb propietats mecàniques millorades, que són utilitzats en la fabricació de matrius i constructes que combinen matriu amb cèŀlules i que imiten el teixit que es vol substituir . En aquest capítol es descriu l’aplicació de biomaterials en la regeneració de cartílag articular com a exemple del potencial dels nous biomaterials en medicina regenerativa . Les lesions del cartílag articular són molt comunes i difícils de tractar . La combinació de biomaterials i progenitors ceŀlulars suposen una alternativa terapèutica de medicines immunitàriament compatibles . Paraules clau: biomaterial, medicina regenerativa, enginyeria tissular, biomecànica, cartílag .

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

USES OF BIOMATERIALS AND CELLS IN ARTICULAR CARTILAGE REGENERATION

SUMMARY

Many tissues in the body (including skin, blood and bone) can undergo self-repair to varying extents . However, injuries beyond the reparative threshold may benefit from therapeutic interventions to facilitate healing . The gold standard for many of these treatment strategies involves the use of autografts, but harvesting healthy tissue from other sites within the body is typically constrained by donor site morbidity and limited supply . To address this demand for donor tissue, tissue engineering has been recognised as an alternative therapeutic option, since it involves not only the use of biomaterials, but also cells and bioactive factors in various combinations to facilitate the regeneration of lost or injured tissue . This chapter focuses on cartilage tissue engineering as an example of the potential that novel biomaterials hold in regenerative medicine . Articular cartilage injuries are common in humans and are difficult to manage with current treatment options . The combination of novel biomaterials and expanded progenitor cells provide a source of therapeutic and immunologically compatible medicines that can be of interest in regenerative medicine . Key words: biomaterial, regenerative medicine, tissue engineering, biomechanical properties, cartilage .

L’enginyeria tissular és un camp interdisciplinari que aplica els principis de l’enginyeria i de les ciències de la vida per al desenvolupament de substituts biològics que recuperin, mantinguin o millorin la funció natural dels teixits a través de la reposició física del teixit lesionat per un de nou, biocompatible i integrat al seu nínxol corresponent (Caplan, 2003; Langer et al., 1993; Vacanti et al., 1993) . Aquesta disciplina científica neix de la necessitat de restablir la funcionalitat d’òrgans que han degenerat a causa de l’edat, malalties o accidents . Els components clau involucrats en l’enginyeria tissular i la medicina regenerativa són els materials biocompatibles (ja siguin d’origen natural o sintètic), les cèŀlules, els factors de senyalització ceŀlular o la combinació orquestrada de tots . Amb aquestes eines la medicina regenerativa té com a objectiu millorar la qualitat de vida dels pacients

i reduir les despeses hospitalàries derivades d’admissions repetides o perllongades i inactivitat laboral dels afectats . S’hi inclouen, per exemple, des d’aplicacions en cirurgia ortopèdica fins a vàlvules per al cor o dispositius per a l’alliberament controlat de medicaments . En aquest capítol revisarem els avenços fets en biomaterials i matrius fabricades a partir d’aquests, amb especial atenció a l’ús prometedor en aplicacions per a la regeneració de cartílag articular .

BIOMATERIALS, BASE PER A LA FABRICACIÓ DE PRODUCTES D’ENGINYERIA TISSULAR

Els principals paràmetres que cal tenir en compte en l’elecció d’un biomaterial per a la fabricació de matrius o de constructes

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

que combinin matriu i cèŀlules per a usos terapèutics són: la biocompatibilitat entre el material escollit i el teixit que es vol reparar; les seves característiques estructurals, que permetin la difusió de nutrients i subproductes del metabolisme ceŀlular; la font, que determinarà el grau de bioreabsorbilitat, amb una cinètica de degradació que hauria de ser semblant a la de formació del neoteixit; la puresa, contaminants i esterilitat; les propietats físiques i mecàniques; les característiques cinètiques de les cèŀlules que hi interaccionaran per ancorar-s’hi, migrar, proliferar i diferenciar-se; els subproductes del seu metabolisme, tot i evitant l’ús de biomaterials que alliberin substàncies capaces de generar toxicitat local o sistèmica o provocar una resposta inflamatòria (Athanasiou et al., 2009) . L’arquitectura d’aquestes matrius té també un efecte en les propietats mecàniques dels constructes formats per matriu i cèŀlules, la distribució de la colonització ceŀlular (ja sigui en bioreactors in vitro o de cèŀlules presents en el teixit sa que envolta la lesió) i les característiques de difusió . Així, s’ha demostrat que la porositat és necessària tant per a la difusió de nutrients en matrius amb alta densitat de cèŀlules (Freed et al., 1999), com per a l’eliminació de subproductes del metabolisme ceŀlular (Woodfield et al., 2002) . Per tant, un dels principals objectius en el disseny de les matrius és satisfer els requisits de transferència de matèria per a l’acumulació correcta de nova matriu extraceŀlular, de manera que es formi l’estructura funcional que s’intenta regenerar en cada cas (Vunjak-Novakovic et al., 1998) . Altres factors a considerar dependran de la immediatesa de l’ús, o bé si les matrius han de ser cultivades in vitro abans de la implantació en pacients . En cas que s’implantin directament, cal que les matrius tinguin les característiques mecàniques adequades al teixit a regenerar, de manera que puguin supor-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

tar càrregues, que mantinguin la integritat estructural per protegir les cèŀlules de les forces a les quals es veuran sotmeses . Les matrius que es cultiven in vitro no necessiten el mateix nivell d’integritat estructural, ja que en el transcurs del cultiu es podrà generar un pseudoteixit que hauria de proporcionar les característiques mecàniques desitjades del teixit diana .

APLICACIÓ DE BIOMATERIALS I CÈL·LULES EN LESIONS DE CARTÍLAG ARTICULAR

El cartílag és un teixit conjuntiu del sistema esquelètic compost per condròcits embolcallats en una matriu extraceŀlular d’aspecte cartilaginós, formada principalment per fibres d’elastina i coŀlagen . Hi ha diferents tipus de cartílag, que es distingeixen per la seva composició: cartílag hialí (per exemple, cartílag articular), cartílag elàstic (per exemple, pavelló auricular) i fibrocartílag (per exemple, menisc) . El cartílag hialí és el més abundant dels tres i el trobem a les superfícies articulars dels ossos, a les plaques de creixement d’ossos llargs, cartílags costals, esquelet nasal i com a teixit de suport a les vies respiratòries (a la laringe i la tràquea) . Es tracta d’un teixit avascular, amb una organització ceŀlular columnar, compost per fibres de coŀlagen de tipus ii que reforcen l’estructura i de glucosaminoglicans, que confereixen resistència a la deformació per compressió, faciliten la retenció d’aigua i la difusió de petites molècules i gasos dins del cartílag (vegeu la figura 1) . Les lesions en el cartílag articular són freqüents en la població i sovint deriven en osteoartrosi i altres malalties relacionades, que resulten en canvis degeneratius que comporten dolor, deformitats, i reducció de moviments (Schindler, 2011) . La resposta del nostre cos a aquestes malalties depèn

de l’extensió i de la profunditat de la lesió, però el potencial d’autoregeneració és molt limitat . En aquest escenari, només les lesions osteocondrals acaben per reomplir-se de manera natural amb un teixit de cicatrització format per fibrocartílag, amb unes característiques biomecàniques i bioquímiques inferiors a les del cartílag hialí (Alford et al., 2005) . Les teràpies actuals en el tractament de defectes focals de cartílag articular (resumides en la taula 1) no són del tot satisfactòries i la medicina regenerativa ha incorporat l’ús de cèŀlules del pacient mateix per colonitzar matrius fabricades amb biomaterials que contribueixen a l’adhesió cellular, la proliferació, la diferenciació i la integració amb el teixit sa que l’envolta, per facilitar així la generació de nou cartílag (Jubel et al., 2008) . Molts dels estudis in vitro es basen en l’ús de matrius cilíndriques amb unes dimensions entre 3 i 10 mm de diàmetre i 5-10 mm de gruix, amb un volum que es troba en el rang 0,007-0,39 cm3 (Vunjak-Novakovic et al., 1999) . La mida de porus òptima per a la regeneració de cartílag articular es troba entre 100 i 200 μm (Agrawal et al., 2001; Freyman et al., 2001) . Els biomaterials com l’àcid polilàctic-coglicòlic (PLGA) poden ser modificats químicament amb altres polímers o pèptids per canviar-ne les característiques mecàniques

i funcionals . En el treball publicat per Chen i coŀlaboradors es descriu que la modificació del PLGA amb coŀlagen aporta hidrofobicitat, tot millorant l’ancoratge ceŀlular, atrau més cèŀlules i augmenta així l’eficiència de la colonització (Chen et al., 2003) . Altres intents per millorar la matriu de PLGA i les seves propietats per a la regeneració de cartílag articular són el recobriment amb molècules o polímers com el sulfat de condroïtina i l’hialorunat, en una aproximació estructural per facilitar el procés de generació de matriu extraceŀlular i estabilitzar la matriu dintre del seu ambient (Fan et al., 2006) .

En la regeneració del cartílag articular cal seleccionar biomaterials segons la seva robustesa, que hauria de ser similar al teixit que es vol substituir i suportar les forces de compressió, de torsió o d’estirament que es donen en l’entorn de la lesió a regenerar, però també per resistir-ne la manipulació dins de quiròfan sense perdre les propietats, ja que el mètode d’elecció preferit dels traumatòlegs és la implantació artroscòpica . Un dels paràmetres que defineix millor la robustesa del material és el mòdul d’elasticitat . Aquesta constant està relacionada de manera directa amb els canvis de longitud que experimenta el material quan és sotmès a forces de tracció i compressió, i

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

Figura 1. Organització del cartílag articular.

Taula 1. Teràpies actuals per al tractament de defectes focals de cartílag articular amb els inconvenients que comporten

Mètode Tècnica

Rentat artroscòpic

Desbridament

Condroplàstia tèrmica

Abrasió / Microfractura

Trasplantament autòleg

Trasplantament aŀlogènic

Trasplantament autòleg de condròcits

Basat en Jaiswal et al., 2010.

Irrigació de l’articulació amb solucions de NaCl, Ringer o Ringer lactat

Desbridament mecànic del teixit cartilaginós danyat

Desbridament amb calor o radiofreqüència

Accés quirúrgic a l’os subcondral amb reparació espontània induïda

Reemplaçament del cartílag perdut per empelt propi

Reemplaçament del cartílag perdut per empelt d’un donant

Biòpsia del pacient

Cultiu in vitro de cèŀlules i reimplantació en el defecte sota una capa de periosti

cal tenir-la en compte en l’elecció dels biomaterials . S’han descrit una gran varietat de matrius per a la regeneració de cartílag, fabricats a partir de biomaterials que se solen dividir entre polímers naturals i sintètics (vegeu les taules 2 i 3, amb la descripció dels biomaterials més emprats), encara que també es poden classificar segons altres propietats com són la biodegradabilitat, la geometria i l’estructura (per exemple, gels, esponges poroses, fibres, mida de porus, connectivitat, distribució) (Vunjak-Novakovic et al., 1999) .

En les articulacions sanes, el cartílag i l’os subcondral constitueixen una unitat funcional, on cada component té un paper únic en la seva funció de suportar el pes corporal i permetre una gran varietat de moviments tot mantenint la lubricació i estabi-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

Inconvenients

Remissió del dolor durant poc temps sense evidència clínica ni biològica de reparació

Inestabilitat de l’articulació i recidiva

Necrosi per dany tèrmic

Teixit de reparació fibrocartilaginós; mobilitat restringida

Baixa fixació de l’empelt; mobilitat restringida per inflamació; poca disponibilitat de material i morbiditat del pacient

Rebuig immunitari; transmissió de malalties; manufactura i conservació del teixit

És un tractament car que requereix dues cirurgies amb possible afectació al cartílag adjacent; integració ceŀlular reduïda i degeneració a llarg termini

litat adequades (Swieszkowski et al., 2007) . Així, mentre que l’os subcondral proporciona el suport mecànic al cartílag articular, aquest protegeix l’os i facilita moviments de l’articulació amb baixa fricció (Swieszkowski et al., 2007) . Actualment, en tècniques de mosaïcoplàstia, s’utilitzen empelts osteocondrals, tant d’origen autòleg com aŀlogènics procedents de bancs de teixits (Gomoll et al., 2010; Martin et al., 2007) . Totes dues estratègies tenen inconvenients, com són la morbiditat associada a l’extracció i la limitació del material, en el cas dels empelts autòlegs, i la limitació en el proveïment, en el cas dels aŀlogènics (Gomoll et al., 2010) . L’enginyeria de teixits té aquí l’oportunitat d’oferir matrius en la quantitat i amb les especificacions requerides en la regeneració de defectes osteocondrals (Martin et al.,

Taula 2. Biomaterials sintètics utilitzats en medicina regenerativa de cartílag

Biomaterial

Poliglicols (PGA), polilàctids (PLA) i copolímers (PLGA)

Polietilenglicol (PEG) i Policaprolactona (PCL)

Característiques

Llarga tradició en aplicacions mèdiques per les nombroses possibilitats quant a la forma i arquitectura de les matrius que s’hi poden fabricar (ja siguin estructures poroses o malles trenades) El més utilitzat en enginyeria tissular de cartílag és el PGA, la degradació total del qual pot trigar entre 4 i 12 mesos, bastant més ràpid que el PLA (triga entre 1 i 2 anys) La pèrdua de les propietats mecàniques és prèvia a la degradació, algunes vegades fins i tot en les primeres setmanes La porositat i la interconnectivitat poden ser controlades en el procés de producció, i permet optimitzar la difusió dels nutrients i l’eficiència de la colonització ceŀlular a través del constructe Alguns experiments evidencien una producció de matriu extraceŀlular idònia per a la regeneració de cartílag i corbes de degradació que el fan un candidat exceŀlent Es comercialitzen matrius produïdes en qualitat GMP amb diferents formulacions, geometries, i porositats

El PCL presenta temps de degradació superiors als PLA/PGA i és més resistent, i això el fa més atractiu per a aplicacions ortopèdiques . La modificació de la hidrofilicitat/hidrofobicitat del PEG amb altres molècules permet controlar l’ancoratge de cèŀlules i proteïnes a la matriu . Així es pot dificultar l’adsorció de proteïnes i protegir de l’adsorció d’anticossos, fet que previndria d’una resposta immunitària adversa . El PEG necessita ser copolimeritzat amb altres materials per ser degradat fisiològicament i representa un valor afegit a altres polímers que no pas un material que per si mateix serveixi en la regeneració de cartílag .

Referències

Athanasiou et al., 2009; Daniels et al., 1990; Freed et al., 1994; Grande et al., 1997; Kretlow et al., 2010

Honda et al., 2004; Suggs et al., 1999; Zimmermann et al., 2000

PLA: àcid polilàctic; PGA: àcid poliglicòlic; PLGA: àcid polilàctic­ coglicòlic; PEG: polietilenglicol; PCL: policaprolactona.

2007), com ara les matrius de fibres de coŀlagen de tipus i combinades amb nanopartícules d’hidroxiapatita, que ja han estat provades amb èxit en humans (Kon et al., 2011) . En defectes en què la lesió es limita a la zona condral, sense arribar a l’os subcondral, l’ús de matrius podria no ser l’estratègia més efectiva a causa de la dificultat d’obtenir una bona integració de l’implant amb el teixit sa que l’envolta (Mano et al., 2007) . En canvi, la integració en la interfa-

se os-os és més ràpida i efectiva, de manera que una possible estratègia que millori la fixació és la de crear quirúrgicament una lesió osteocondral que penetri a través de la capa de cartílag fins arribar a l’os subcondral i la implantació subseqüent del substitut osteocondral, que hauria de consistir en una doble capa per afavorir la regeneració simultània de cartílag i os (Goldberg et al., 1999; Mano et al., 2007) . Altres tècniques quirúrgiques en el tractament de defectes

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

Taula 3. Biomaterials d’origen natural utilitzats en medicina regenerativa de cartílag

Biomaterial Característiques Referències

Coŀlagen És la proteïna més abundant en els teixits de mamífers i el principal component de les matrius extraceŀlulars Hi ha almenys dinou tipus de coŀlàgens diferents amb una estructura bàsica de tres cadenes polipeptídiques entrellaçades En la polimerització del coŀlagen es poden introduir unions químiques creuades i combinar-ho amb altres polímers Es pot produir també a partir de coŀlagen d’espècies animals compatibles amb els humans (per exemple, coŀlagen equí)

Àcid hialurònic És el glicosaminoglicà més simple i es troba en gairebé tots els teixits de mamífers És un polisacàrid lineal format per la repetició d’un disacàrid de β-D-àcid glucorònic i N-acetil-β-Dglucosamina Aquest biomaterial és metabolitzat de manera natural per les hialuronidases, de manera que la velocitat de degradació dependrà de la concentració de substrat i enzim presents a la zona de la lesió que es vol tractar Algunes matrius comercial incorporen aquest biomaterial, com és el cas de l’Hyalograft ®, ja utilitzat en assaigs clínics

Alginat A causa de la seva baixa toxicitat i fàcil polimerització amb agents poc agressius és utilitzat en gran varietat d’aplicacions mèdiques . És un polisacàrid lineal format pel copolímer d’àcids D-manurònic i α-L-glucurònic . Es pot obtenir a partir d’algues i bacteris i la polimerització es produeix per la interacció dels monòmers amb cations bivalents (Ca 2+, Ba 2+, Sr2+), formant ponts iònics entre les diferents cadenes del polímer . La degradació del polímer es produeix a mesura que es dissocien els cations bivalents de les cadenes de monòmers, de manera que la velocitat de degradació dependrà de la concentració tant de l’ió bivalent com d’alginat .

condrals (com és el cas de la microfractura, vegeu la taula 1) es basen també en la generació de defectes osteocondrals amb la finalitat d’afavorir el reclutament de progenitors ceŀlulars i factors de senyalització presents en el moll d’os (O’Driscoll, 1998) . Si bé l’ús de condròcits és l’única teràpia ceŀlular aprovada per a l’ús en clínica, el seu principal inconvenient és la necessitat d’aïllar condròcits del pacient mateix i expandir-los ex vivo (vegeu les taules 4 i 5, amb un resum d’estudis preclínics i de productes per a clínica humana) . En aquest tipus de teràpia, no només hi ha el risc de la morbiditat en la zona d’extracció del teixit de partida, sinó també el repte d’obtenir la dosi te-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

Schoof et al., 2001; Tan et al., 2001; Vickers et al., 2006

2003

Cohen et al., 2003; Smidsrod et al., 1990

rapèutica i el fenotip adequat del producte d’expansió ceŀlular (Mano et al., 2007) . Les cèŀlules mare mesenquimàtiques (MSC, de l’anglès mesenchymal stromal cells) són una alternativa terapèutica interessant pel seu potencial per diferenciar els llinatges osteocondrals (Ashhurst et al., 1990; Ashton et al., 1980; Friedenstein et al., 1987) (vegeu la taula 6) . Aquestes cèŀlules es poden aïllar fàcilment a partir de moll d’os o de teixit adipós i retenen les seves característiques fenotípiques i potencial de diferenciació a tipus cellular del teixit conjuntiu, com ara condròcits i osteoblasts (Caplan, 2005) .

Pavesio et al.,

Taula 4. Estratègies avaluades en models animals preclínics i que combinen l’ús de matrius i cèŀlules per a la regeneració de cartílag

Matriu Font ceŀlular Referències

Malla de PGA no trenada

Malla de PGA no trenada

Malla de PGA no trenada

Malla de PGA no trenada

Malla de PGA no trenada

Esponja de coŀlagen tipus I/GAG; Esponja de coŀlagen tipus II/GAG

Matriu de coŀlagen tipus I/GAG; Matriu de coŀlagen tipus II/GAG

Malla de PGA no trenada

Esponja de PLGA

Esponja de PLGA

Esponja de PLGA

β-TCP

Cartílag boví

Cartílag boví

Cartílag lapí

Cartílag lapí

Cartílag boví

Cartílag caní

Cartílag caní

Cartílag boví

Cartílag boví

Moll d’os lapí

Cartílag murí

Cartílag oví

Freed et al., 1994

Puelacher et al., 1994

Vacanti et al., 1994

Dunkelman et al., 1995

Freed et al., 1997

Nehrer et al., 1998

Lee et al., 2000

Gooch et al., 2001

Sato et al., 2001

Uematsu et al., 2005

Emin et al., 2008

Guo et al., 2004

GAG: glucosaminoglicans; PGA: àcid pliglicòlic; PLGA: àcid polilàctic­ coglicòlic; TCP: tricalcifosfat.

FABRICACIÓ DE PRODUCTES D’ENGINYERIA DE TEIXITS PER A ÚS EN CLÍNICA HUMANA

Quant al processament i la manufactura dels biomaterials, cal seguir amb la reglamentació establerta per a l’ús de noves teràpies ceŀlulars, i complir amb les normes de fabricació correcta (o good manufacture practice, GMP) en l’obtenció d’un producte d’ús humà . Aquest procés de producció porta associat un registre i la caracterització de lots per assegurar l’esterilitat, la puresa i altres característiques essencials que defineixen el producte final i la traçabilitat dins el procés productiu (Lee et al., 2010) . La caracterització mecànica de les matrius és un factor essencial i que inclou proves per a la determinació de propietats com el mòdul elàstic, compressió/tensió, fatiga o abrasió, per determinar la indicació clínica de les matrius . Entre els diferents tipus de matrius biocompatibles que han arribat al mercat, algunes contenen proteïnes, carbohidrats, materials sintètics o, fins i tot, teixit humà processat .

La seva eficàcia regeneradora es pot avaluar indirectament a través de la viabilitat ceŀlular, les cinètiques de creixement, la potència del producte i la seva estabilitat, parant especial atenció a la interacció entre la matriu i el teixit sa que l’envolta . Per tot això, hi ha guies elaborades per les autoritats regulatòries per a la realització de tests que permeten avaluar el grau de biocompatibilitat i seguretat abans d’usar-lo com a medicament humà (FDA, 1999) . Un exemple de matriu comercial fabricada amb biomaterials és l’àcid polilàctic-coglicòlic (PLGA), que consisteix en la copolimerització de dos monòmers, els dímers cíclics dels àcids glicòlic i làctic, per formar un compost biodegradable i biocompatible que, depenent de la relació d’aquests dos components, permet l’obtenció de diverses formulacions del polímer, amb característiques físiques i mecàniques particulars (Panyam et al., 2003; Shive et al., 1997) . Alguns dels més utilitzats són el PLGA 75:25 (75 % d’àcid làctic i 25 % d’àcid glicòlic) (Sato et al., 2001), 50:50 (Park et al., 2005) i el 90:10 (Chen et al., 2003) . Així,

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

Taula 5. Productes per a la regeneració de lesions osteocondrals, en fase de comercialització o d’assaig clínic, que utilitzen cèŀlules procedents de cartílag articular del pacient

Producte Empresa Disseny Estat Referències

Carticel Genzyme 12 × 106 cèŀlules/vial Comercialitzat www.genzyme.com

MACI Genzyme 15 × 106 cèŀlules en matriu de coŀlagen tipus i/iii Cultiu durant 4 setmanes

ChondroCelect TiGenix

Chondrosphere Co don

Bioseed-C BioTissue technologies

Biocart II Prochon

0,8-1,0 × 106 cèŀlules/ cm 2 d’extensió de la lesió

Generació de microesferes amb cèŀlules expandides

Cèŀlules en matriu PLA/PGA i polidioxanona

Cèŀlules en matriu d’àcid hialurònic i fibrina . Cultiu de 2 a 4 setmanes amb FGF i sèrum humà

CaReS ARS Arthro AG 20 × 106 cèŀlules en matriu de coŀlagen tipus i Cultiu durant 14 dies

Chondron Cellontech Co >12 × 106 cèŀlules per cada 0,4 ml

Cartipatch TBF Genie Tissulaire

ChondroArt 3D Educell

Cèŀlules en hidrogel d’agarosa i alginat

Cèŀlules en hidrogel d’agarosa i alginat

Fase iii

NCT01251588*

Fase iii

Comercialitzat a Europa

Fase iii

NCT00414700*

NCT01222559*

Comercialitzat a Alemanya www.biotissue.de Kreuz et al., 2009

Fase clínica ii Comercialitzat a Israel

Comercialitzat a Alemanya i Turquia

Fase i

Fase iii

NCT00729716*

www.arsarthro.com.tr Schneider et al., 2011

NCT01218945*

NCT00945399*

Comercialitzat a Eslovènia www.educell.si

* Referència d’identificació d’assaig clínic a la web de l’Institut de Salut Americà, http://clinicaltrials.gov

per exemple, una formulació que contingui un elevat percentatge de PLA es degradarà més lentament que no pas una amb més proporció de PGA . Un polímer de PLGA 75:25 es degrada entre 4 i 5 mesos; en canvi, en una formulació 50:50 es redueix el temps a 1 o 2 mesos (Middleton et al., 2000) . Aquesta degradació dóna com a productes molècules que, sota condicions fisiològiques normals, són incorporades a vies metabòliques actives del cos humà, i això resulta en un producte reabsorbible i biocompatible

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

(Eid et al., 2001) . Aquest ús s’ha descrit en múltiples models animals (Lee et al., 1994; Uematsu et al., 2005) no només en regeneració de cartílag, sinó també per a la regeneració de nervis (Wen et al., 2006) o teixit ossi (Thomson et al., 1996) . El PLGA és un dels biomaterials més utilitzats en medicina regenerativa i està aprovat per la FDA per a productes terapèutics en humans (Holland et al., 1986; Jain, 2000) .

Taula 6. Assaigs clínics per al tractament de defectes osteocondrals que utilitzen com a font ceŀlular cèŀlules mare adultes aïllades de moll d’os (MSC)

Procediment

MSC en matriu de coŀlagen de tipus i

Massa de MSC recoberta per periosti

MSC b en matriu comercial c

MSC en matriu d’hidroxiapatita: coŀlagen

Estat

Referència a

Fase clínica i NCT00850187

Fase clínica ii-iii NCT00891501

Fase clínica i NCT00885729

Fase clínica i NCT01159899

a Referència d’identificació d’assaig clínic a la web de l’Institut de Salut Americà, http://clinicaltrials.gov.

b En aquest estudi també s’inclou una branca de tractament amb cèŀlules procedents de cartílag hialí.

c Sense detalls de la composició de la matriu.

CONCLUSIONS

Si bé s’han fet molts progressos en el camp de l’enginyeria de teixits, es fa necessari enfocar la investigació en l’elecció dels biomaterials, la determinació de la font ceŀlular òptima per a cada aplicació terapèutica, el disseny de les matrius i de bioreactors, i el desenvolupament de tecnologia per a la microfabricació en tres dimensions . Precisament són les qüestions relacionades amb la tecnologia les que requereixen una estreta coŀlaboració entre disciplines científiques, i això fa que cirurgians, enginyers, químics i biòlegs treballin plegats . Un cop superats aquests reptes, el desenvolupament de biomaterials requereix tant una caracterització exhaustiva in vitro com estudis no clínics en models in vivo que es poden perllongar durant anys abans que les autoritats reguladores donin l’aprovació per usar-ho en clínica . Perquè aquests nous tractaments siguin traslladats de manera àgil i efectiva als pacients, calen esforços en l’estandardització d’assajos i de models experimentals, que en permetin determinar amb fermesa la seguretat i eficàcia in vitro i in vivo .

AGRAÏMENTS

Aquest treball ha estat finançat amb el projecte MEDCEL (PSE-010000-2007-4) del

Ministeri d’Educació i Ciència . Els autors estem agraïts a J . J . Cairó i I . Vives per la lectura crítica del manuscrit i els seus comentaris i suggeriments .

BIBLIOGRAFIA

Agrawal, C . M .; Ray, R . B . (2001) . «Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering» . J. Biomed. Mater. Res., 55: 141-150 . Alford, J . W .; Cole, B . J . (2005) . «Cartilage restoration . Part 1: Basic science, historical perspective, patient evaluation, and treatment options» . The American Journal of Sports Medicine, 33: 295 . Ashhurst, D . E .; Ashton, B . A .; Owen, M . E . (1990) . «The collagens and glycosaminoglycans of the extracellular matrices secreted by bone marrow stromal cells cultured in vivo in diffusion chambers» J. Orthop. Res., 8: 741-749

Ashton, B A ; Allen, T D ; Howlett, C R ; Eaglesom, C C ; Hattori, A ; Owen, M (1980) «Formation of bone and cartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo» Clin. Orthop. Relat. Res., 294-307

Athanasiou, K A ; Darling, E M ; Hu, J C (2009) «Articular cartilage tissue engineering» Synthesis Lectures on Tissue Engineering, 1: 1-182

Caplan, A I (2003) «Embryonic development and the principles of tissue engineering» Novartis Found. Symp., 249: 17-25 [Discussió: 25-33, 170-174, 239-141]

Caplan, A I (2005) «Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics» Tissue Eng., 11: 1198-1211

Chen, G ; Sato, T ; Ushida, T ; Hirochika, R ; Shirasaki, Y ; Ochiai, N ; Tateishi, T (2003) «The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness» . J. Biomed. Mater. Res. A., 67: 1170-1180 .

Cohen, S . B .; Meirisch, C . M .; Wilson, H . A .; Diduch, D . R . (2003) . «The use of absorbable co-polymer pads with alginate and cells for articular cartilage repair in rabbits» . Biomaterials, 24: 2653-2660 .

Daniels, A . U .; Chang, M . K .; Andriano, K . P. (1990) .

«Mechanical properties of biodegradable polymers and composites proposed for internal fixation of bone» . J. Appl. Biomater., 1: 57-78 . Dunkelman, N . S .; Zimber, M . P.; Lebaron, R . G .; Pavelec, R .; Kwan, M .; Purchio, A . F . (1995) . «Cartilage production by rabbit articular chondrocytes on polyglycolic acid scaffolds in a closed bioreactor system» . Biotechnol. Bioeng., 46: 299-305 . Eid, K .; Chen, E .; Griffith, L .; Glowacki, J . (2001) . «Effect of RGD coating on osteocompatibility of PLGA-polymer disks in a rat tibial wound» . J. Biomed. Mater. Res., 57: 224-231 .

Emin, N .; Koc, A .; Durkut, S .; Elcin, A . E .; Elcin, Y . M . (2008) . «Engineering of rat articular cartilage on porous sponges: effects of tgf-beta 1 and microgravity bioreactor culture» . Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol., 36: 123-137 .

Fan, H .; Hu, Y .; Zhang, C .; Li, X .; Lv, R .; Qin, L .; Zhu, R . (2006) . «Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a PLGA-gelatin/chondroitin/hyaluronate hybrid scaffold» . Biomaterials, 27: 4573-4580 .

Freed, L . E .; Marquis, J . C .; Langer, R .; Vunjak-Novakovic, G . (1994) . «Kinetics of chondrocyte growth in cell-polymer implants» . Biotechnol. Bioeng., 43: 597-604 .

Freed, L . E .; Martin, I .; Vunjak-Novakovic, G . (1999) . «Frontiers in tissue engineering In vitro modulation of chondrogenesis» Clin. Orthop. Relat. Res., S46-58

Freed, L E ; Vunjak-Novakovic, G (1997) «Microgravity tissue engineering» In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 33: 381-385

Freyman, T M ; Yannas, I V ; Gibson, L J (2001) «Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering» Progress in Materials Science, 46: 273-282

Friedenstein, A J ; Chailakhyan, R K ; Gerasimov, U V (1987) «Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers» Cell Tissue Kinet., 20: 263-272

Goldberg, V M ; Caplan, A I (1999) «Biologic restoration of articular surfaces» Instr. Course. Lect., 48: 623-627

Gomoll, A H ; Madry, H ; Knutsen, G ; Dijk, N van; Seil, R ; Brittberg, M ; Kon, E (2010) «The subchondral bone in articular cartilage repair: cur-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

rent problems in the surgical management» . Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 18: 434-447 .

Gooch, K . J .; Blunk, T .; Courter, D . L .; Sieminski, A . L .; Bursac, P. M .; Vunjak-Novakovic, G .; Freed, L . E . (2001) . «IGF-I and mechanical environment interact to modulate engineered cartilage development» . Biochem. Biophys. Res. Commun., 286: 909915 .

Grande, D . A .; Halberstadt, C .; Naughton, G .; Schwartz, R .; Manji, R . (1997) . «Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts» . J. Biomed. Mater. Res., 34: 211-220 .

Guo, X .; Wang, C .; Zhang, Y .; Xia, R .; Hu, M .; Duan, C .; Zhao, Q .; Dong, L .; Lu, J .; Qing Song, Y . (2004) . «Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model» . Tissue Eng., 10: 1818-1829 .

Holland, S . J .; Tighe, B . J .; Gould, P. L . (1986) . «Polymers for biodegradable medical devices . 1 . The potential of polyesters as controlled macromolecular release systems» . Journal of Controlled Release, 4: 155-180 .

Honda, M . J .; Yada, T .; Ueda, M .; Kimata, K . (2004) . «Cartilage formation by serial passaged cultured chondrocytes in a new scaffold: hybrid 75:25 poly(L-lactide-epsilon-caprolactone) sponge» . J. Oral. Maxillofac. Surg., 62: 1510-1516 .

Jain, R . A . (2000) . «The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactideco-glycolide) (PLGA) devices» . Biomaterials, 21: 2475-2490 .

Jaiswal, P. K .; Wong, K .; Khan, W . S . (2010) . «Current cell-based strategies for knee cartilage injuries» . J. Stem Cells, 5: 177-185 .

Jubel, A ; Andermahr, J ; Schiffer, G ; Fischer, J ; Rehm, K E ; Stoddart, M J ; Hauselmann, H J (2008) «Transplantation of de novo scaffoldfree cartilage implants into sheep knee chondral defects» Am. J. Sports. Med., 36: 1555-1564

Kon, E ; Delcogliano, M ; Filardo, G ; Busacca, M ; Di Martino, A ; Marcacci, M (2011) «Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial» Am. J. Sports. Med., 39: 1180-1190

Kretlow, J D ; Spicer, P P ; Jansen, J A ; Vacanti, C A ; Kasper, F K ; Mikos, A G (2010) «Uncultured marrow mononuclear cells delivered within fibrin glue hydrogels to porous scaffolds enhance bone regeneration within critical-sized rat cranial defects» Tissue Eng. Part A, 16: 3555-3568

Kreuz, P C ; Muller, S ; Ossendorf, C ; Kaps, C ; Erggelet, C (2009) «Treatment of focal degenerative cartilage defects with polymer-based autologous

chondrocyte grafts: four-year clinical results» . Arthritis Res. Ther., 11: R33 .

Langer, R .; Vacanti, J . P. (1993) . «Tissue engineering» . Science, 260: 920-926 .

Lee, C . R .; Breinan, H . A .; Nehrer, S .; Spector, M . (2000) . «Articular cartilage chondrocytes in type I and type II collagen-GAG matrices exhibit contractile behavior in vitro» . Tissue Eng., 6: 555-565 .

Lee, M . H .; Arcidiacono, J . A .; Bilek, A . M .; Wille, J . J .; Hamill, C . A .; Wonnacott, K . M .; Wells, M . A .; Oh, S . S . (2010) . «Considerations for tissue-engineered and regenerative medicine product development prior to clinical trials in the United States» . Tissue Eng. Part B Rev., 16: 41-54 .

Lee, S . C .; Shea, M .; Battle, M . A .; Kozitza, K .; Ron, E .; Turek, T .; Schaub, R . G .; Hayes, W . C . (1994) . «Healing of large segmental defects in rat femurs is aided by RhBMP-2 in PLGA matrix» . J. Biomed. Mater. Res., 28: 1149-1156 .

Mano, J . F .; Reis, R . L . (2007) . «Osteochondral defects: present situation and tissue engineering approaches» . J. Tissue Eng. Regen. Med., 1: 261-273 .

Martin, I .; Miot, S .; Barbero, A .; Jakob, M .; Wendt, D . (2007) . «Osteochondral tissue engineering» . J. Biomech., 40: 750-765 .

Middleton, J . C .; Tipton, A . J . (2000) . «Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices» . Biomaterials, 21: 2335-2346 .

Nehrer, S .; Breinan, H . A .; Ramappa, A .; Hsu, H . P.; Minas, T .; Shortkroff, S .; Sledge, C . B .; Yannas, I . V .; Spector, M . (1998) . «Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model» . Biomaterials, 19: 2313-2328 .

O’Driscoll, S . W . (1998) . «The healing and regeneration of articular cartilage» . J. Bone Joint. Surg. Am., 80: 1795-1812

Panyam, J ; Dali, M M ; Sahoo, S K ; Ma, W ; Chakravarthi, S S ; Amidon, G L ; Levy, R J ; Labhasetwar, V (2003) «Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactideco-glycolide) nano- and microparticles» J. Control Release, 92: 173-187

Park, G E ; Pattison, M A ; Park, K ; Webster, T J (2005) «Accelerated chondrocyte functions on NaOH-treated PLGA scaffolds» Biomaterials, 26: 3075-3082

Pavesio, A ; Abatangelo, G ; Borrione, A ; Brocchetta, D ; Hollander, A P ; Kon, E ; Torasso, F ; Zanasi, S ; Marcacci, M (2003) «Hyaluronan-based scaffolds (Hyalograft C) in the treatment of knee cartilage defects: preliminary clinical findings» Novartis Found. Symp., 249: 203-217 [Discussió: 229233, 234-208, 239-241]

Puelacher, W C ; Kim, S W ; Vacanti, J P ; Schloo,

B .; Mooney, D .; Vacanti, C . A . (1994) . «Tissue-engineered growth of cartilage: the effect of varying the concentration of chondrocytes seeded onto synthetic polymer matrices» . Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 23: 49-53 . Sato, T .; Chen, G .; Ushida, T .; Ishii, T .; Ochiai, N .; Tateishi, T . (2001) . «Tissue-engineered cartilage by in vivo culturing of chondrocytes in PLGA–collagen hybrid sponge» . Materials Science and Engineering: C, 17: 83-89 . Schindler, O . S . (2011) . «Current concepts of articular cartilage repair» . Acta Orthop. Belg., 77: 709-726 . Schneider, U .; Rackwitz, L .; Andereya, S .; Siebenlist, S .; Fensky, F .; Reichert, J .; Loer, I .; Barthel, T .; Rudert, M .; Noth, U . (2011) . «A prospective multicenter study on the outcome of type I collagen hydrogel-based autologous chondrocyte implantation (CaReS) for the repair of articular cartilage defects in the knee» . Am. J. Sports. Med., 39: 25582565 . Schoof, H .; Apel, J .; Heschel, I .; Rau, G . (2001) . «Control of pore structure and size in freeze-dried collagen sponges» . J. Biomed. Mater. Res., 58: 352-357 . Shive, M . S .; Anderson, J . M . (1997) . «Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres» . Adv. Drug. Deliv. Rev., 28: 5-24 . Smidsrod, O .; Skjak-Braek, G . (1990) . «Alginate as immobilization matrix for cells» . Trends Biotechnol., 8: 71-78 .

Suggs, L . J .; Shive, M . S .; Garcia, C . A .; Anderson, J . M .; Mikos, A . G . (1999) . «In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels» . J. Biomed. Mater. Res., 46: 22-32 .

Swieszkowski, W .; Tuan, B . H .; Kurzydlowski, K . J .; Hutmacher, D W (2007) «Repair and regeneration of osteochondral defects in the articular joints» Biomol. Eng., 24: 489-495

Tan, W ; Krishnaraj, R ; Desai, T A (2001) «Evaluation of nanostructured composite collagen—chitosan matrices for tissue engineering» Tissue Eng., 7: 203-210

Thomson, R C ; Yaszemski, M J ; Powers, J M ; Mikos, A G (1996) «Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone» Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 7: 23-38

Uematsu, K ; Hattori, K ; Ishimoto, Y ; Yamauchi, J ; Habata, T ; Takakura, Y ; Ohgushi, H ; Fukuchi, T ; Sato, M (2005) «Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a three-dimensional poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold» Biomaterials, 26: 4273-4279

Vacanti, C A ; Kim, W ; Schloo, B ; Upton, J ; Vacanti, J P (1994) «Joint resurfacing with cartilage

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

grown in situ from cell-polymer structures» . Am. J. Sports. Med., 22: 485-488 .

Vacanti, C . A .; Kim, W .; Upton, J .; Vacanti, M . P.; Mooney, D .; Schloo, B .; Vacanti, J . P. (1993) . «Tissue-engineered growth of bone and cartilage» . Transplant. Proc., 25: 1019-1021 .

Vickers, S . M .; Squitieri, L . S .; Spector, M . (2006) . «Effects of cross-linking type II collagen-GAG scaffolds on chondrogenesis in vitro: dynamic pore reduction promotes cartilage formation» . Tissue Eng., 12: 1345-1355 .

Vunjak-Novakovic, G .; Freed, L . E . (1998) . «Culture of organized cell communities» . Adv. Drug. Deliv. Rev., 33: 15-30 .

Vunjak-Novakovic, G .; Martin, I .; Obradovic, B .; Treppo, S .; Grodzinsky, A . J .; Langer, R .; Freed, L . E . (1999) . «Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage» . J. Orthop. Res., 17: 130-138 .

Wen, X .; Tresco, P. A . (2006) . «Fabrication and characterization of permeable degradable poly(DLlactide-co-glycolide) (PLGA) hollow fiber phase inversion membranes for use as nerve tract guidance channels» . Biomaterials, 27: 3800-3809 . Woodfield, T . B .; Bezemer, J . M .; Pieper, J . S .; Blitterswijk, C . A . van; Riesle, J . (2002) . «Scaffolds for tissue engineering of cartilage» . Crit. Rev. Eukaryot Gene Expr., 12: 209-236 . Zimmermann, J .; Bittner, K .; Stark, B .; Mulhaupt, R . (2002) . «Novel hydrogels as supports for in vitro cell growth: poly(ethylene glycol)- and gelatine-based (meth)acrylamidopeptide macromonomers» . Biomaterials, 23: 2127-2134 .

SOBRE ELS AUTORS

Joaquim Vives Armengol és llicenciat i doctor en bioquímica per la Universitat Autònoma de Barcelona . Ha desenvolupat la seva activitat investigadora en el camp de la biotecnologia en centres de recerca internacionals . Es va especialitzar en desenvolupament embrionari i cultiu de cèŀlules mare a l’Institute for Stem Cell Research de la University of Edinburgh (Escòcia, Regne Unit) i posteriorment va explotar aquests coneixements en el desenvolupament d’aplicacions amb cèŀlules mare per a la indústria farmacèutica, en el seu pas per l’empresa biotecnològica Stem Cell Sciences Ltd (Cambridge, Anglaterra, Regne Unit) . Actualment és facultatiu al Banc de Sang i Teixits, on s’encarrega del disseny i execució d’estudis no clínics en la Divisió de Teràpies Avançades/XCELIA .

Francesc Gòdia Casablancas és llicenciat i doctor en ciències químiques per la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) . Actualment és catedràtic del Departament d’Enginyeria Química de la Universitat Autònoma de Barcelona, on fa la seva tasca docent i investigadora en el camp de l’enginyeria bioquímica, la tecnologia de cultiu de cèŀlules animals, i els sistemes de suport de vida a l’espai . És membre del Comitè Executiu de la European Society for Animal Cell Technology, i del Consell Directiu de la European Federation of Biotechnology . Ha estat vicerector de projectes estratègics de la UAB i president de la Sociedad Española de Biotecnología .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 93-105

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .138

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 107-112

LA CARDIOLOGIA DEL SEGLE XXI

Josep Brugada

Hospital Clínic, Universitat de Barcelona

Adreça per a la correspondència: Josep Brugada . Hospital Clínic . C . de Villarroel, 170 . 08036 Barcelona . Tel .: 932 275 703 . Adreça electrònica: jbrugada@clinic.ub.es .

RESUM

Les malalties cardiovasculars, juntament amb el càncer, són dos dels àmbits en què s’han concentrat més els recursos sanitaris els darrers anys . Pel que fa a la cardiologia, hi ha hagut grans avenços en àrees com l’intervencionisme, l’electrofisiologia, el diagnòstic i la cirurgia, i això ha creat tot un seguit d’eines terapèutiques que han fet evolucionar molt el tractament de les malalties cardiovasculars . Pel que fa al futur, la cardiologia s’espera que evolucioni envers una medicina més personalitzada, preventiva, predictiva i participativa, en què el pacient serà un actor ple en la diagnosi de la seva malaltia . Tot això ens portarà a l’anomenada medicina de sistemes .

Paraules clau: cardiologia, medicina de sistemes, medicina P4 .

CARDIOLOGY IN THE 21 ST CENTURY

SUMMARY

Cardiovascular diseases, along with cancer are two of the areas where health resources are more involved in recent years . As for cardiology, there have been major advances in areas such as intervention, electrophysiology, diagnosis and surgery, and this has created a series of therapeutic tools that have make evolve the treatment of cardiovascular diseases . Regarding the future of cardiology, is expected to evolve towards a more personalized, preventive, predictive and participatory medicine, where the patient is a full actor in the diagnosis of the disease . All this leads to the so-called systems medicine . Key words: cardiology, systems medicine, P4 medicine .

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

La cardiologia ha estat sens dubte una de les especialitats mèdiques més afortunades des del punt de vista de les inversions i recursos destinats al seu desenvolupament en les últimes dècades . Les raons per a aquesta millora substancial en la inversió per fomentar-ne el creixement i expansió han estat dues: per un cantó la gran incidència que les malalties cardiovasculars tenen en el benestar i longevitat de la població bàsicament occidental, i, en segon lloc, per les possibilitats que aquesta població globalment rica té de pagar-ne els costos .

La lluita contra les malalties cardiovasculars i el càncer són els dos grans àmbits en què s’han concentrat els recursos en les darreres dècades en la societat occidental per millorar la supervivència de la població . Efectivament això s’ha aconseguit de manera més que satisfactòria i l’esperança de vida s’ha anat incrementant de manera clara en les darreres dècades gràcies a tractaments molt efectius per al control tant de les cardiopaties com dels processos cancerígens . Això ens ha portat a una altra situació, que és la cronificació dels processos en pacients amb malalties cardiovasculars i tumorals . Al contrari, no hi ha hagut la mateixa tendència a millorar de manera tan espectacular el pronòstic dels processos neurodegeneratius (demències, Alzheimer, etc .) i ens trobem amb pacients ben cuidats des del punt de vista cardiovascular però absolutament dependents des del punt de vista neurològic .

La llista d’avenços en les darreres dècades en el camp cardiovascular ha estat espectacular i possiblement paraŀlela a la quantitat de recursos que s’hi han destinat, i al mateix temps depèn de la capacitat del món occidental per pagar-ne els costos . Així podem destacar en el camp dels tractaments farmacològics els nous antihipertensius i els reguladors del metabolisme lipídic, els tractaments betabloquejadors o

els antiagregants plaquetaris i anticoagulants . És cert, en canvi, que en el camp, per exemple, de les arítmies cardíaques, el desenvolupament s’ha centrat molt més en els tractaments invasius i molt poc en el descobriment de nous fàrmacs, possiblement provocat per l’aparició i conscienciació sobre els no desitjats efectes proarítmics que condicionen en gran mesura la possibilitat de comercialització de noves molècules . En l’àrea de l’intervencionisme hem assistit al desenvolupament de l’angioplàstia coronària (Grüntzig et al ., 1977), que ràpidament va donar lloc a l’aparició dels stents coronaris, primer metàŀlics i posteriorment recoberts de fàrmacs per evitar-ne l’oclusió i la reestenosi (Sigwart et al ., 1987) . Molt important ha estat la demostració que quan abans destapem l’artèria closa en cas d’infart agut de miocardi, millor resultat obtindrem a llarg termini . Això ha portat a canvis organitzatius importants amb dispositius anomenats «codi infart», que permeten el tractament urgent immediat i d’aquest manera eviten el dany irreparable al múscul cardíac . Més recentment ha aparegut el concepte d’intervencionisme estructural amb la possibilitat de tancar per via percutània defectes als septes cardíacs, reparar insuficiències mitrals severes utilitzant els anomenats clips mitrals, i sobretot implantar vàlvules cardíaques percutànies o transapicals i evitar així la cirurgia directa (Piazza et al ., 2008) .

En l’àmbit de l’electrofisiologia és on potser més novetats han aparegut en les darreres dècades, amb l’aparició de l’ablació amb radiofreqüència com a tècnica de tractament curatiu de la majoria de taquicàrdies paroxístiques (Kuck i Schlüter, 1991), la implementació dels sistemes de navegació tridimensionals per poder abordar substrats complexos com les taquicàrdies ventriculars o la fibriŀlació auricular (Haïssaguerre et al ., 1998), el desenvolupament i la genera-

lització de la utilització dels desfibriŀladors implantables per prevenir la mort sobtada (Mirowski et al ., 1978), la sofisticació dels marcapassos cardíacs per acabar simulant l’activació cardíaca el més normal possible, i finalment, i en coŀlaboració amb els especialistes de la insuficiència cardíaca, la descripció i la implementació del concepte de la resincronització elèctrica cardíaca com a tractament de la disfunció ventricular esquerra (Auricchio i Spinelli, 2000) .

En l’àrea del diagnòstic l’evolució ha estat també espectacular, amb la utilització de l’ecocardiografia i totes les variants que han anat apareixent, com l’eco Doppler, l’eco bidimensional i tridimensional, o més recentment l’anàlisi espectral . La utilització de la ressonància magnètica per definir criteris funcionals i estructurals del múscul cardíac, o l’aparició del TAC coronari com a mitjà de visualització no invasiu de les artèries coronàries, han estat avenços considerables en la manera com els pacients són diagnosticats . La cirurgia cardíaca ha estat sens dubte un dels motors de l’evolució dels tractaments i la millora de la supervivència en les malalties cardiovasculars . La cirurgia de revascularització amb totes les seves variants i millores constants en els darrers anys, els recanvis valvulars, la cirurgia reparadora valvular, la cirurgia de les anomalies aòrtiques i vasculars perifèriques, tots han contribuït a demostrar la possibilitat de curació de molts d’aquests trastorns . És cert que en paraŀlel el desenvolupament de tècniques menys invasives en cadascun d’aquests àmbits ha fet que els cirurgians hagin hagut d’anar evolucionant i buscant noves maneres també menys agressives i més efectives de tractament invasiu . Capítol apart mereix el trasplantament cardíac, amb molts anys ja amb exceŀlents resultats, i el desenvolupament de dispositius alternatius de suport hemodinàmic com el cor

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 107-112

artificial, que han permès millorar de manera espectacular el pronòstic de pacients fins fa poc sense pràcticament alternatives . I si hem avançat tant en la capacitat de diag nòstic i tractament de les malalties cardiovasculars, quina és la cardiologia que viurem al segle xxi? Un cop tenim les eines diagnòstiques i terapèutiques actuals, queden coses per fer o hem arribat al màxim de les nostres possibilitats?

La medicina en general i la cardiologia en particular s’estan movent cap a nous conceptes . No podem imaginar que continuarem tractant la malaltia quan aquesta estigui establerta amb més tractaments cada cop més sofisticats i cars i difícilment abordables des del punt de vista econòmic per a una població cada cop més envellida, i per tant amb necessitats creixents d’assistència mèdica . Alguns experts han descrit aquesta evolució envers una medicina que s’ha anomenat la P4 . Personalitzada, preventiva, predictiva i participativa .

Medicina personalitzada, ja que cada cop és més evident que cada individu té el seu propi risc, que n’és una combinació del perfil genètic, allò que ha heretat dels seus pares, i el seu perfil personal que ell ha anat acumulant en funció del seu estil de vida . El coneixement del perfil personal de cada individu serà possible en els propers anys . Les anàlisis genètiques han evolucionat d’una manera espectacular (Brugada i Brugada, 1992) . En dues dècades hem passat de poder analitzar uns centenars de bases del nostre DNA en un dia i a trigar diversos anys en un esforç coŀlaboratiu internacional per desxifrar el genoma humà, a poder fer un genoma complet de diversos milers de milions de bases en unes hores i per uns milers d’euros . No està gaire lluny el moment en què podrem segons l’anàlisi genètica saber exactament els perills que un individu concret té en els propers anys quant al seu estat cardiovascular . Podrem

saber quina és la seva predisposició a patir una hipertensió, diabetis o alteracions en el seu metabolisme lipídic o quin és el risc que les seves artèries pateixin arteriosclerosi de manera precoç . Podrem igualment saber quin és el seu perfil nutricional amb un coneixement avançat del seu metabolisme, i per tant li podrem aconsellar quin tipus d’aliment és més aconsellable o quina despesa calòrica és la millor en el seu cas concret . Amb tota aquesta informació podrem clarament individualitzar no solament el seu risc sinó també els tractaments més adequats dependents del seu perfil genètic . Això ens obre la porta al segon concepte, el de la medicina predictiva .

Si som capaços de saber quin és el perfil de risc d’un individu concret podem preveure les conseqüències que el seu organisme patirà en els propers anys . Això ens obre la porta a tractar de manera agressiva totes aquelles circumstàncies que el puguin empitjorar, i per tant fer medicina preventiva . Així, si un individu té un risc elevat de patir una arteriosclerosi coronària, podem fer els controls necessaris per detectar-la el més aviat possible i de manera programada durant la seva vida, però al mateix temps podem prendre totes les mesures per evitar-ne la progressió mitjançant el control de tots els altres factors no directament lligats a la genètica sinó a l’actitud individual . Així, en aquest cas concret evitar el tabac, el sobrepès, el tractament i control estricte de la diabetis, la hipertensió i tots els altres factors de risc seran fonamentals per evitar que s’acumulin els efectes negatius i finalment l’individu desenvolupi la malaltia . I aquí és on apareix la medicina participativa . La medicina del segle xxi ja no serà la medicina paternalista en què el metge diagnostica, tracta i decideix pel pacient . L’individu s’haurà de fer càrrec de la seva salut, serà responsable de tot el que faci referència al seu estat físic . El coneixement de les se-

ves característiques personals el farà actor en primera persona . Evitar la malaltia, més que no pas tractar-la, passarà a ser l’objectiu principal i fomentar la salut de les persones en serà l’eina .

Quines malalties seran les més prevalents en els propers anys en el camp cardiovascular?

Sens dubte totes les polítiques lligades a la medicina P4 tardaran molts anys a tenir un efecte visible en la salut de la població i mentrestant els pacients continuaran existint i necessitant noves tecnologies i tractaments per fer front a la malaltia . És cert que ja hem assistit a una disminució molt significativa de totes aquelles malalties lligades a processos infecciosos, però seria iŀlusori pensar que l’envelliment de la població no s’acompanyarà, com ja passa actualment, d’un increment de totes aquelles malalties que estan lligades al que podríem anomenar desgast físic . Els materials biològics dels quals està format el nostre aparell cardiovascular —múscul, teixit vascular, vàlvules, etc .— pateixen el pas del temps i per tant poden començar a fallar en el seu funcionament precisament a causa d’aquest desgast fisiològic lligat a l’envelliment . La tecnologia continua incrementant el seu potencial per desenvolupar noves eines que són cada cop més efectives i segures per tractar disfuncions físiques . Igualment el coneixement científic continua aportant nous conceptes per millorar el funcionament del nostre aparell cardiovascular i ajudar en casos que l’organisme no ho pugui fer adequadament . Així, estem assistint en aquests moments a l’explosió de l’anomenada medicina de sistemes . El concepte neix del coneixement de les interaccions al nostre organisme entre diferents àmbits aparentment no relacionats . Hi hauria zones en el nostre DNA que serien el lloc de comunicació de diferents aspectes fisiològics i que explicarien

per què existeixen els anomenats malalts fràgils amb multimorbiditat, que requereixen una atenció molt especial, o per què un individu amb arítmies cardíaques té al mateix temps disfuncions hemodinàmiques o trastorns de la son, per exemple . Aquest és un camp ara mateix en plena evolució i sens dubte en els propers anys contribuirà de manera clara a millorar el nostre coneixement i potser ens ajudarà a la identificació i tractament adequat d’aquests pacients complexos . La tecnologia continuarà evolucionant de manera imparable; és obvi que si els principals problemes es derivaran del desgast del nostre aparell físic per envelliment, la tecnologia podrà cada cop més suplir aquests mecanismes defectuosos amb substituts fabricats específicament per a cada cas concret . Estem ja assistint als primers implants de stents biològics que reparen l’artèria coronària afectada i s’autodestrueixen un cop feta la seva feina, estem veient com els marcapassos no necessitaran cables sinó que s’implantaran directament al lloc desitjat i amb capacitat d’autogeneració d’energia per fer-los funcionar de manera permanent . Veurem sistemes de localització automatitzada de les àrees que produeixen arítmies cardíaques i mitjançant equipaments robotitzats arribarem al lloc d’origen per destruir-lo de manera definitiva i evitar així els símptomes i fins i tot la possibilitat de mort sobtada . Veurem el perfeccionament de les vàlvules percutànies amb la pràctica desaparició de la cirurgia oberta en aquest camp . Veurem noves tècniques quirúrgiques mínimament invasives que permetran reparar vàlvules defectuoses o artèries amb dany complex no abordable percutània ment . Viurem l’aplicació de la teràpia ceŀlular en alguna de les seves varietats en els pacients amb grans zones de miocardi sense funcionament per recuperar-ne la contractilitat (Orlic et al ., 2001) .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 107-112

És possible que vegem en els propers anys el desenvolupament de marcapassos naturals a partir de cèŀlules mare en pacients amb trastorns del ritme . El coneixement de les malalties amb base genètica permetrà també que en algun moment, potser encara molt llunyà, es desenvolupin teràpies que modifiquin aquests gens en cèŀlules determinades responsables de la malaltia . De moment, i esperant que això arribi, podrem continuar utilitzant la selecció genètica d’embrions per evitar l’aparició de malalties fatals i intentar així extingir-les .

El desenvolupament de cors artificials mecànics o biològics obrirà el debat sobre els límits de la ciència i els límits de la vida humana . És lícit intentar viure de manera infinita? Hi ha un límit al qual l’home pot arribar per continuar vivint? Podem continuar intentar allargant la vida indefinidament? En definitiva, la cardiologia del segle xxi serà una combinació de medicina preventiva amb gran participació del pacient en la presa de decisions i en el foment propi de la salut individual, però al mateix temps la tecnologia i el coneixement ens permetran tractar de manera molt efectiva totes aquelles malalties que es derivaran de l’envelliment de la població amb els trastorns que això proporcionarà a un sistema fet potser per no durar tants anys com els humans voldríem .

BIBLIOGRAFIA

Auricchio, A ; Spinelli, J (2000) «Cardiac resynchronization for heart failure: present status» Congest. Heart Fail , 6: 325-329

Brugada, P ; Brugada J (1992) «Right bundle branch block, persistent ST segment elevation and sudden cardiac death: a distinct clinical and electrocardiographic syndrome A multicenter report» J. Am. Coll. Cardiol , 20: 1391-1396

Grüntzig, A ; Schneider, H J (1977) «The percutaneous dilatation of chronic coronary stenoses,

experiments and morphology» . Shweiz Med. Wochenschr ., 107: 1588 .

Haïssaguerre, M .; Jaïs, P.; Shah, D . C .; Takahashi, A .; Hocini, M .; Quiniou, G .; Garrigue, S .; Mouroux, A . le; Métayer, P. le; Clémenty, J . (1998) . «Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins» . N. Engl. J. Med., 339: 659-666 .

Kuck, K . H .; Schlüter, M . (1991) . «Single-catheter approach to radiofrequency current ablation of left-sided accessory pathways in patients with Wolff-Parkinson-White syndrome» . Circulation, 84: 2366-2375 .

Mirowski, M .; Mower, M . M .; Langer, A .; Heilman, M . S .; Schreibman, J . (1978) . «A chronically implanted system for automatic defibrillation in active conscious dogs . Experimental model for treatment of sudden death from ventricular fibrillation» . Circulation, 58: 90-94

Orlic, D .; Kajstura, J .; Chimenti, S .; Jakoniuk, I .; Anderson, S . M .; Li, B .; Pickel, J .; McKay, R .; NadalGinard B .; Bodine, D . M .; Leri, A .; Anversa, P. (2001) . «Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium» . Nature, 410: 701-705 .

Piazza, N .; Grube, E .; Gerckens, U .; Heijer, P. den; Linke, A .; Luha, O .; Ramondo, A .; Ussia, G .; Wenaweser, P.; Windecker, S .; Laborde, J . C .; Jaegere, P. de; Serruys, P. W . (2008) . «Procedural and 30-day outcomes following transcatheter aortic valve implantation using the third generation (18 Fr) core valve revalving system: results from the multicentre, expanded evaluation registry 1-year following CE mark approval» . EuroIntervention, 4: 242-249 . Sigwart, U .; Puel, J .; Mirkovitch, V .; Joffre, F .; Kappenberger, L . (1987) . «Intravascular stents to prevent occlusion and restenosis after transluminal angioplasty» N. Engl. J. Med , 316: 701-706

SOBRE L’AUTOR

Josep Brugada Terradellas, llicenciat en medicina i cirurgia i doctor en medicina (cum laude) per la Universitat de Barcelona, especialista en cardiologia (Universitat de Montpeller I), especialitat en biologia i medicina de l’esport (Universitat de Montpeller I), màster en direcció de serveis integrats de salut (ESADE Business School), professor del Departament de Medicina de la Universitat de Barcelona des de 1998 . Ha estat cap del Servei de Cardiologia i director de l’Institut del Tòrax a l’Hospital Clínic de Barcelona i actualment és director mèdic del mateix centre hospitalari . Ocupa també els càrrecs de cap de la Secció d’Arít mies de l’Hospital Pediàtric Sant Joan de Déu i director de la Unitat d’Arítmies de l’Institut Cardiovascular Sant Jordi - El Pilar de Barcelona . És expresident de la Societat Europea d’Arítmies Cardíaques i exvicepresident de la Societat Espanyola de Cardiologia . Fins avui ha publicat més de quatre-cents articles originals en revistes especialitzades . És membre de nombroses societats científiques i ha revisat articles per a les revistes nacionals i internacionals de més prestigi en la seva àrea i va ser nomenat el 2009 deputy editor de la principal revista europea de cardiologia, European Heart Journal.

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 107-112

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .139

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 113-130

LA TRADUCCIÓ GENÈTICA MITOCONDRIAL

I MALALTIES ASSOCIADES

Tanit Guitart 1, 3 i Lluís Ribas de Pouplana 1, 2

1 Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona), Barcelona

2 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Barcelona

3 Adreça actual: Centre de Regulació Genòmica (CRG), Barcelona

Adreça per a la correspondència: Lluís Ribas de Pouplana . Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats . Passeig de Lluís Companys, 23 . 08010 Barcelona . Tel .: 934 034 868 . Adreça electrònica: lluis.ribas@irbbarcelona.org.

RESUM

En humans, com en la majoria d’organismes eucariotes, la síntesi proteica té lloc simultàniament al citoplasma i en orgànuls que posseeixen un genoma propi . Els mitocondris requereixen una maquinària traduccional pròpia per sintetitzar els tretze polipèptids, codificats al genoma mitocondrial, que formen part dels complexos de la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa responsables de proporcionar energia a la cèŀlula . Els elements que componen aquesta maquinària es troben codificats tant al genoma mitocondrial com al nuclear i participen de manera coordinada en la traducció genètica . Mutacions en els gens que codifiquen aquests factors de l’aparell de traducció genètica mitocondrial desencadenen un ampli ventall de malalties greus en humans, caracteritzades per símptomes heterogenis que en dificulten el diagnòstic i tractament . Hi ha malalties mitocondrials humanes causades per mutacions en el DNA mitocondrial que afecten específicament els tRNA i rRNA i, a més, s’han descrit mutacions en proteïnes mitocondrials codificades en el genoma nuclear, entre les quals es troben mutacions en factors de traducció, enzims de processament i modificació dels tRNA, proteïnes mitoribosòmiques i aminoacil-tRNA-sintetases mitocondrials . La complexitat de les malalties mitocondrials, la varietat de símptomes que causen i la dificultat de manipular genèticament el DNA mitocondrial compliquen la recerca relacionada amb aquestes malalties i justifiquen la generació de models animals que permetin caracteritzar-les i desenvolupar noves estratègies terapèutiques . Paraules clau: traducció genètica, malaltia mitocondrial, aminoacil-tRNA-sintetasa .

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

MITOCHONDRIAL GENE TRANSLATION AND RELATED DISEASES

SUMMARY

In humans, as in the majority of eukaryotic organisms, protein synthesis occurs simultaneously in the cytoplasm and in those organelles that possess their own genome . Mitochondria require its own translational machinery in order to synthesize the 13 polypeptides, encoded in the mitochondrial genome, which are part of the respiratory chain and the oxidative phosphorylation complexes, responsible for supplying energy to the cell . The elements that compose this machinery are encoded both in the mitochondrial and the nuclear genome, and participate in gene translation in a coordinate manner . Mutations in genes that code for these factors of the gene translation apparatus trigger a wide range of severe pathologies in humans, characterized by heterogeneous symptoms that difficult their diagnostic and treatment . There exist human mitochondrial diseases caused by mutations in the mitochondrial DNA which specifically affect tRNA and rRNA and, additionally, mutations in nuclear encoded mitochondrial proteins have been described, among which are mutations in translation factors, enzymes involved in tRNA processing and modification, mitoribosomal proteins, and aminoacyl-tRNA synthetases . The complexity of mitochondrial pathologies, the variety of symptoms they cause, and the difficulty to manipulate mitochondrial DNA complicate the research related to these diseases and justify the generation of animal models that allow their characterization and the development of new therapeutic strategies .

Key words: gene translation, mitochondrial disease, aminoacyl-tRNA synthetase .

La traducció genètica és un procés universal que té lloc en tots els organismes eucariotes i procariotes, i que consisteix en la descodificació consecutiva de la informació continguda en molècules de mRNA (àcid ribonucleic missatger) en forma de cadena polipeptídica, tot seguint escrupolosament les normes establertes pel codi genètic . El codi genètic estàndard, amb algunes excepcions, és utilitzat per tots els éssers vius, i consisteix en la correlació dels diferents triplets de nucleòtids de mRNA, anomenats codons, amb la vintena d’aminoàcids usats en la síntesi de proteïnes . La traducció genètica requereix la participació de nombroses proteïnes i molècules de RNA que funcionen de manera coordinada . Els codons de mRNA no reconeixen directament els aminoàcids que es-

pecifiquen, sinó que ho fan a través d’unes molècules adaptadores que relacionen minuciosament cada triplet de mRNA amb l’aminoàcid corresponent . Els tRNA (RNA de transferència) són aquestes molècules adaptadores . A la cèŀlula hi ha almenys un tRNA per a cada aminoàcid, però, en molts casos, diversos isoacceptors tenen l’habilitat de reconèixer els diferents codons que assignen un mateix aminoàcid, de manera única o redundant . Els tRNA són aminoacilats específicament amb l’aminoàcid assignat mitjançant les aminoacil-tRNA-sintetases (aaRS) . Aquesta família d’enzims consta d’almenys vint proteïnes, una per a cada aminoàcid del codi genètic estàndard (Ribas de Pouplana i Schimmel, 2001) . La traducció genètica, tant procariota com eucariota, es pot dividir en dos estadis

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

principals: l’aminoacilació dels tRNA i la traducció ribosòmica . El primer estadi es basa en el reconeixement específic i l’activació de l’aminoàcid feta per l’aaRS, i en la incorporació d’aquest a l’extrem 3´ del tRNA adient . Un cop el tRNA és aminoacilat, és dirigit mitjançant els factors d’iniciació o elongació cap al ribosoma, un complex format per proteïnes associades a molècules de rRNA (RNA ribosòmic), on té lloc la mecànica d’interacció entre els tRNA aminoacilats i els triplets de mRNA, i constitueix la peça central de la síntesi de proteïnes .

EL MITOCONDRI

Els mitocondris són orgànuls presents en totes les cèŀlules nucleades eucariotes que transformen energia per impulsar reaccions ceŀlulars, i per això la integritat mitocondrial és essencial per a la vida, i el trastorn de la seva funció pot veure’s traduït en malaltia . Tot i que l’origen de la cèŀlula eucariota és, encara, motiu de controvèrsia, nombrosos estudis filogenètics donen suport a la teoria que aquesta és el producte d’una sèrie de processos endosimbiòtics produïts a través d’evolució horitzontal, per la fusió, o fusions, entre una cèŀlula arqueobacteriana i una cèŀlula eubacteriana (Sagan, 1967; Margulis, 1981; Cavalier-Smith, 1987; Margulis, 1993) . En general, es considera que el mitocondri actual té un origen monofilètic, que prové d’un ancestre eubacterià de vida lliure (protomitocondri) que va ser captat per una cèŀlula hoste; tot i així, l’origen d’aquesta última encara està en ple debat (Gray et al., 1999; Davidov i Jurkevitch, 2009) . Diferents hipòtesis intenten explicar com l’ancestre mitocondrial va envair i evitar l’eliminació de l’hoste . Algunes d’aquestes teories postulen que l’origen dels eucariotes i dels mitocondris es donà de manera

simultània, quan un arqueobacteri metanogen es fusionà amb un α-proteobacteri metanòtrof amb l’objectiu d’obtenir compostos essencials per al metabolisme en condicions d’anòxia, com l’hidrogen (Martin i Muller, 1998) . Una altra teoria proposa que la simbiosi tingué lloc entre un proteobacteri aerobi i un hoste anaerobi per sobreviure a la presència d’oxigen (Andersson et al., 2003) . Posteriorment, tingué lloc un segon procés d’endosimbiosi, en què l’eucariota mitocondriat captà un cianobacteri ancestral, que constitueixen els plastidis dels organismes fotosintètics actuals (Dyall et al., 2004) .

Pel seu estat en endosimbiosi, els protomitocondris van anar reduint progressivament el contingut del seu genoma, mitjançant la transferència de molts dels seus gens al genoma nuclear de l’hoste i l’eliminació d’enzims redundants (Gray et al., 1999) . Actualment, la majoria de les proteï nes mitocondrials estan codificades al genoma nuclear, mentre que el DNA mitocondrial (mtDNA) tan sols conserva un reduït nombre de gens que codifiquen proteïnes involucrades en la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa (OXPHOS), alguns tRNA i rRNA . Els mitocondris actuals són estructures intraceŀlulars delimitades per un sistema de doble membrana, format per la MME (membrana mitocondrial externa) i la MMI (membrana mitocondrial interna), que s’associen formant xarxes complexes . Les dues membranes mitocondrials delimiten dos compartiments diferents: la matriu mitocondrial, que conté un elevat nombre d’enzims relacionats amb el metabolisme mitocondrial, proteïnes implicades en l’expressió de l’mtDNA, tRNA, rRNA i nombroses còpies del genoma mitocondrial; i l’espai intermembrana, que conté proteïnes involucrades amb la fisiologia, amb la mort ceŀlular o amb la producció d’energia . El genoma mitocondrial és un DNA cir-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

cular de cadena doble similar al DNA bacterià primitiu (Leblanc et al., 1997), que es troba en un elevat nombre de còpies formant agrupacions de DNA anomenades nucleoides . Aquestes estructures no estan protegides per histones, però s’han identificat proteïnes associades a aquestes que tenen un paper essencial en el manteniment de l’mtDNA, com ara Twinkle (Spelbrink et al., 2001) o el factor de transcripció mtTFA (Diffley i Stillman, 1991; Larsson et al., 1998) . Generalment, el genoma mitocondrial es transmet per herència materna, no presenta introns ni extenses regions intergèniques, té gens superposats, utilitza un codi genètic diferent de l’universal (Clayton, 2000) i, en animals, codifica 22 tRNA, 2 rRNA (12S i 16S) i 13 polipèptids estructurals que formen part del sistema OXPHOS . Com s’ha esmentat anteriorment, gran part de les proteïnes mitocondrials són codificades al genoma nuclear; entre aquestes, totes les proteïnes involucrades en la traducció genètica mitocondrial (vegeu la figura 2) . El transport correcte d’aquestes proteïnes a l’orgànul és essencial per a la biogènesi i funció mitocondrials .

Des d’un punt de vista funcional els mitocondris són orgànuls que aprofiten l’energia amb finalitats biològiques, mitjançant el procés d’acoblament quimiostàtic que té lloc gràcies a la cadena transportadora d’electrons, també anomenada cadena respiratòria, localitzada a la membrana mitocondrial interna (Berg et al., 2007) . La cadena respiratòria consta de quatre grans complexos proteics formats per diverses subunitats, codificades tant al genoma nuclear com al mitocondrial . Tres d’aquests complexos són capaços de transportar electrons i bombar protons a l’espai intermembrana . El quart complex, que forma part del cicle de Krebs, és codificat al nucli i no té la capacitat d’impulsar protons . En el transport entre complexos també intervenen trans-

portadors electrònics, com ara el coenzim Q (ubiquinona) o el citocrom c . La fosforilació oxidativa (OXPHOS) és el procés mitjançant el qual es forma ATP com a resultat del gradient electroquímic entre la MMI i l’espai intermembrana, fruit de la transferència d’electrons a través de la cadena respiratòria fins al O2 i de l’impuls de protons a través de la MMI (Mitchell, 1961) . Es genera una força protomotriu que consisteix en un gradient de pH, i el flux de protons que són retornats a la matriu mitocondrial impulsa la síntesi d’ATP. Com a conseqüència d’aquesta activitat el mitocondri és una de les principals fonts de ROS (reactive oxygen species; espècies reactives d’oxigen o radicals lliures) . L’acumulació de ROS provoca danys a les membranes ceŀlulars i al DNA, molt especialment a l’mtDNA, que no està proveït d’histones que el protegeixin, i per això el mitocondri posseeix defenses antioxidants, com ara el glutatió, una variant de la superòxid-dismutasa o la catalasa, que actuen per eliminar l’excés de ROS (Duchen, 2004) .

A part de la cadena respiratòria i l’OXPHOS, el mitocondri acull el cicle de Krebs, també anomenat cicle dels àcids tricarboxílics o cicle de l’àcid cítric, que subministra substrats reduïts a la cadena transportadora d’electrons . Aquesta via consta d’un seguit d’enzims, la majoria dels quals estan situats a la matriu mitocondrial, que converteixen l’acetil-CoA, que procedeix d’hidrats de carboni i de lípids, en diòxid de carboni (CO2) i GTP. El cicle de Krebs, a més, proporciona precursors per a processos de biosíntesi de nucleòtids, proteïnes i grups hemo (Berg et al., 2007) .

Amb l’objectiu de garantir la síntesi correcta de tots els components essencials d’aquestes vies metabòliques que romanen codificades al genoma mitocondrial és necessari un sistema de traducció genètica independent del sistema citoplasmàtic .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

Per tal que la traducció genètica mitocondrial tingui lloc, cal, per una banda, que l’mtDNA sigui correctament mantingut, replicat i transcrit i, per l’altra, que els diferents elements codificats en l’nDNA (DNA nuclear) que participen en la traducció genètica en aquest orgànul siguin correctament sintetitzats i transportats des del citoplasma (Smits et al., 2010) .

LA TRADUCCIÓ CITOPLASMÀTICA I MITOCONDRIAL

La traducció ribosòmica citoplasmàtica eucariota consta de quatre fases: iniciació, elongació, terminació i reciclatge (Pestova et al., 2001; Kapp i Lorsch, 2004; Dale i Uhlenbeck, 2005; Hernández et al., 2010) (vegeu la figura 1) . La fase d’iniciació comença amb el reconeixement del Met-tRNAi (metioniltRNA d’iniciació) feta per l’eIF (eukaryotic initiation factor; factor d’iniciació eucariòtic) 2, i acaba quan aquest Met-tRNAi s’acomoda al lloc P de la subunitat 40S del ribosoma . Durant la fase d’elongació, el factor d’elongació eucariòtic 1A forma un complex ternari amb GTP amb un nou aminoaciltRNA (aa-tRNA), i es dirigeix fins al lloc A del ribosoma . Un cop l’aa-tRNA s’ha assentat al lloc A, el centre peptidil-transferasa ribosòmic catalitza la formació d’un enllaç peptídic entre l’aminoàcid incorporat i el peptidil-tRNA . Un cop format l’enllaç peptídic, el tRNA desacilat se situa ara al lloc E del ribosoma i el peptidil-tRNA abandona el lloc A per acomodar-se al lloc P. L’alliberament del tRNA al lloc E acaba aquest cicle, el qual es repeteix fins que es detecta un codó de terminació a l’mRNA .

La fase de terminació té lloc en resposta a la presència d’un dels tres codons de terminació eucariotes (UGA, UAA o UAG) al lloc A del ribosoma . El factor de terminació

eucariòtic 1, juntament amb el factor eRF3 que hidrolitza l’enllaç èster entre el tRNA del lloc P i la cadena polipeptídica, alliberen el polipèptid complet del ribosoma (Pisarev et al., 2007) .

La traducció genètica als mitocondris té moltes similituds amb la traducció genètica procariota, fet que està en consonància amb l’origen endosimbiòtic d’aquests orgànuls . Tot i així, la traducció mitocondrial presenta certes particularitats que difereixen tant del sistema de traducció citoplasmàtic eucariota com del procariota . La traducció genètica mitocondrial, igual que la traducció procariota i la citoplasmàtica eucariota, està dividida en dos estadis: l’aminoacilació del tRNA i la traducció ribosòmica, que alhora està subdividida en quatre fases: iniciació, elongació, terminació i reciclatge, les quals requereixen la participació dels ribosomes mitocondrials (mitoribosomes) i de diversos factors de traducció .

MALALTIES MITOCONDRIALS HUMANES DE TRADUCCIÓ GENÈTICA

Un elevat nombre de malalties humanes són causades per alteracions en components involucrats en la traducció gènica . Les mutacions que afecten proteïnes de l’aparell de traducció genètica citoplasmàtica donen lloc a un ampli ventall de malalties que mostren un grau d’afectació variable segons el teixit o l’òrgan (Scheper et al., 2007b) . En aquesta revisió ens centrarem, però, en les malalties causades per components de la maquinària mitocondrial de traducció gènica .

Les malalties hereditàries mitocondrials són un grup heterogeni de desordres causats per mutacions en gens de l’mtDNA o de l’nDNA que codifiquen proteïnes, tRNA o rRNA relacionats amb la funció mito -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

condrial . Les característiques clíniques d’aquestes malalties són molt variables, fet que en dificulta el diagnòstic i tractament . Les primeres malalties mitocondrials huma nes descrites, l’any 1988, van ser la KSS (Kearns-Sayre syndrome; síndrome de Kearns-Sayre), causada per extenses delecions de mtDNA (Holt et al., 1988), i la LHON (Leber hereditary optic neuropathy; neuropatia òptica hereditària de Leber), fruit de mutacions puntuals en el genoma mitocondrial (Wallace et al., 1988) . Des d’a leshores, s’han identificat centenars de mutacions relacionades amb malalties mitocondrials, tant en l’mtDNA com en l’nDNA (Ruiz-Pesini et al., 2007) (vegeu la figura 2) .

Les malalties associades a mutacions en tRNA i rRNA mitocondrials es veuen influenciades per l’heteroplàsmia, és a dir, per la coexistència de poblacions de mtDNA wt (wild-type; de tipus salvatge) i de mtDNA mutant . Durant la divisió ceŀlular els mitocondris es distribueixen a l’atzar entre les cèŀlules filles, de manera que la proporció de mtDNA mutant pot variar entre teixits d’un mateix individu . Les mutacions somàtiques de l’mtDNA apareixen en molts casos per l’efecte dels ROS, i la manca de mecanismes eficients de reparació fa que aquestes s’acumulin amb l’edat . Durant l’oogènesi les molècules de mtDNA són repartides en oòcits i es genera un ventall d’heteroplàsmia, fet que té implicacions importants en la transmissió de l’mtDNA mutant, així com en el grau d’expressió clínica de la malaltia en la descendència (Schapira, 2006) . La manifestació de la malaltia té lloc quan el nombre de còpies de mtDNA mutant és el suficient per impedir el metabolisme energètic que permet el funcionament correcte d’un teixit, fenomen conegut com a efecte llindar . Per això, tot i que els defectes de l’mtDNA poden afectar tot tipus de teixits, perjudiquen especialment aquells que tenen un alt requisit energètic, com el múscul, el cor o el

sistema nerviós . La connexió genotip-fenotip en les malalties de l’mtDNA és complexa, atès que una malaltia pot ser deguda a diferents mutacions i una mutació pot correlacionar amb diverses malalties .

Els tRNA i rRNA mitocondrials tenen un paper clau en la traducció de les proteï nes mitocondrials que formen part de la cadena respiratòria; per això, en molts casos, mutacions en aquestes molècules estan connectades amb disfuncions metabòliques (vegeu la taula 1) . Més del 50 % de mutacions relacionades amb malalties humanes es concentren en gens de tRNA, tot i que aquests gens només representen un 10 % del genoma mitocondrial . Les mutacions més prevalents són l’A3243G en el tRNALeu (UAA), que provoca el 80 % dels casos de MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes; miopatia mitocondrial, encefalopatia, acidosi làctica i episodis similars a l’ictus) i l’A8344G en el tRNALys, que és responsable del 80-90 % de casos de MERRF (myoclonic epilepsy and ragged red fibers; epilèpsia mioclònica associada a fibres roges trencades) .

La substitució A3243G en el gen del tRNALeu (UAA) n’afecta l’estructura, l’estabilitat i l’eficiència d’aminoacilació (Park et al., 2003) i indueix la formació de complexos dimèrics que impedeixen l’associació adequada del tRNA a proteïnes . A part, la mutació inhibeix el processament correcte de l’intermediari RNA19, que conté els transcrits de l’rRNA 16S, el tRNALeu (UAA) i l’mRNA del gen ND1 . Es postula que l’intermediari de processament RNA19 mutant seria incorporat als mitoribosomes i en provocaria el blocatge . La simptomatologia de la malaltia associada a la mutació A3243G es pot explicar per l’ús de codons de l’mRNA ND6, que codifica una subunitat del complex I . El canvi, A3243G impedeix la síntesi de la modificació taurina a la posició wobble del tRNALeu (UAA), la qual

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

cosa dificulta el reconeixement del codó UUG . L’mRNA ND6 conté un 42,1 % de codons leucina UUG, i per consegüent, s’especula que la mutació impediria la traducció correcta de la subunitat ND6 i, per tant, es veuria reduïda l’abundància de complex i a la cadena respiratòria, fet que concorda amb el fenotip associat a MELAS (Scheper et al., 2007b; Scaglia i Wong, 2008) . En una soca de llevat amb mutacions en el tRNALeu (UAA) equivalents a les responsables de la malaltia MELAS en humans, els fenotips aberrants són complementats quan se sobreexpressa el factor mtEFTu (Feuermann et al., 2003) . A més, la mu-

tació A3243G també és complementada per la LRS (leucil-tRNA-sintetasa) mitocondrial humana sobreexpressada en cíbrids transmitocondrials que contenen l’mtDNA mutant (Li i Guan, 2010) . Aquests són dos exemples d’estudis que suposen un avenç en la recerca d’intervencions terapèutiques per a malalties mitocondrials .

La substitució A8344G en el gen del tRNALys n’afecta el nivell d’aminoacilació (Enríquez et al., 1995) i impedeix la formació de la modificació taurina del nucleòtid wobble de l’anticodó (Yasukawa et al., 2001), fet que es tradueix en una dèbil interacció codó-anticodó al ribosoma que desemboca

Figura 1. La traducció genètica citoplasmàtica eucariota. Representació esquemàtica de les quatre fases de la traducció ribosòmica: iniciació, elongació, terminació i reciclatge.

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

Taula 1. Malalties causades per mutacions en gens de rRNA i de tRNA

Gen RNA Exemples de mutacions

Malalties associades

MT-TA tRNA Ala G5591A i G5650A MM

MT-TN tRNA Asn G5703A

CPEO i MM

MT-TR tRNA Arg G10406A; A10438G MM; PEM

MT-TD tRNA Asp A7526G MM

MT-TC tRNACys G5783A Sordesa

MT-TQ tRNAGln G4332A MELAS i encefalopatia

MT-TE tRNAGlu T14709C DMDF+MM

MT-TG tRNAGly GT10010C PEM

MT-TH tRNAHis G12147A

MELAS/MERRF

MT-TI tRNAIle G4298A; A4300G CPEO; MICM

MT-TK tRNALys A8344G i T8356C MERRF

MT-TL1 tRNALeu (UAA) A3243G C3256T i T3271C A3260G i C3303T

MT-TL2 tRNALeu (UAG) G12315A

MELAS, LS, CPEO, DMDF i MM MELAS MMC

CPEO i KSS

MT-TM tRNA Met T4409C i G4450A MM

MT-TF tRNAPhe G583A MELAS i MM+EXIT

MT-TP tRNA Pro C15990T; A15965G MM; susceptibilitat a PD

MT-TS1 tRNASer (UGA) A7475G i 7472insC G7497A SNHL MM i EXIT

MT-TS2 tRNASer (GCU) C12258A G12207A DMDF i SNHL MELAS/MERRF

MT-TT tRNAThr G15950A Susceptibilitat a PD

MT-TW tRNATrp 5537insT i T5523G T5523G i G5521A LS MM

MT-TY tRNATyr T5874G EXIT

MT-TV tRNAVal G1606A AMDF

MT-RNR1 rRNA 12S A1555G i C1494T DEAF

MT-RNR2 rRNA 16S C3093G MELAS

Informació recopilada de MITOMAP (Ruiz­Pesini et al., 2007). Abreviacions: AMDF (ataxia, myoclonus and deafness; atàxia, mioclonia i sordesa), CPEO (chronic progressive external ophtalmoplegia; oftalmoplègia externa progressiva crònica), DEAF (maternally inherited deafness; sordesa d’herència materna), DMDF (diabetes mellitus + deafness; diabetis + sordesa), EXIT (exercise intolerance; intolerància a l’exercici), ins (inserció), KSS (Kearns-Sayre syndrome; síndrome de Kearns-Sayre); LS (Leigh syndrome; síndrome de Leigh), MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes; miopatia mitocondrial, encefalopatia, acidosi làctica i episodis similars a l’ictus), MERRF (myoclonic epilepsy and ragged red fibers; epilèpsia mioclònica associada a fibres roges trencades), MICM (maternally inherited cardiomyopathy; cardiomiopatia d’herència materna), MM (miopatia mitocondrial), MMC (maternal myopathy and cardiomyopathy; miopatia materna i cardiomiopatia), PD (Parkinson’s disease; malaltia de Parkinson), PEM ( progressive encephalopathy; encefalopatia progressiva) i SNHL (sensorineural hearing loss; pèrdua auditiva neurosensorial).

en la terminació prematura de la traducció . Amb l’objectiu de desenvolupar possibles tractaments per a la malaltia, la mutació A8344G s’ha aconseguit complementar

parcialment mitjançant el transport des del citoplasma de derivats del tRNALys citoplasmàtic de llevat . El tRNALys exogen és aminoacilat, transportat, utilitzat en el pro -

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

cés de traducció mitocondrial i és capaç de restaurar parcialment les funcions mitocondrials afectades (Kolesnikova et al., 2004) . Pel que fa al sistema de serilació mitocondrial humà, nombroses mutacions en tots dos isoacceptors mitocondrials de tRNASer s’han vinculat amb malalties, especialment les mutacions en el gen del tRNASer (UGA) . La majoria de canvis puntuals en aquest gen desencadenen la malaltia SNHL (sensorineural hearing loss; pèrdua auditiva neurosensorial); per exemple: les mutacions situades al límit entre el gen CO1 i l’extrem 3´ del tRNASer (UGA) comprometen l’estructura secundària del lloc 3´ de processament del tRNA (Yan et al., 2006); o la inserció 7472insC trastorna la síntesi i l’aminoacilació del tRNASer (UGA) (Toompuu et al., 2002), la qual es pot manifestar en forma de SNHL, de fenotips similars a MERRF o de miopatia . La mutació G7497A en el mateix gen no causa SNHL sinó MM (miopatia mitocondrial) i EXIT (exercise intolerance; intolerància a l’exercici) (Jaksch et al., 1998; Grafakou et al., 2003) . En el gen del tRNASer (GCU) s’han determinat les substitucions: C12246A, que genera pseudoobstrucció intestinal crònica amb miopatia i oftalmoplègia (Lauber et al., 1991), C12258A, que, a part de produir SNHL, està relacionada amb el fenotip DMDF (diabetes mellitus + deafness; diabetis + sordesa) (Lynn et al., 1998) i G12207A, que provoca fenotips similars a MELAS/MERRF (Wong et al., 2006) . Com ja s’ha esmentat anteriorment, el nucli codifica un ampli grup de proteïnes que funcionen al mitocondri, entre les quals hi ha nombrosos components del metabolisme mitocondrial, les proteïnes de transport, els elements de manteniment, replicació i transcripció de l’mtDNA i totes les proteïnes implicades en la traducció a l’orgànul . Relacionades amb la traducció genètica mitocondrial, hi ha diverses mutacions

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

associades a malalties en gens que donen lloc a factors de traducció de mRNA específics, enzims de modificació dels tRNA mitocondrials, proteïnes dels mitoribosomes, factors de traducció generals i aminoaciltRNA-sintetases .

Entre els factors que participen en la traducció de mRNA específics hi ha l’LRPPRC, que està involucrat en la traducció i l’estabilització de l’mRNA COX1 . La mutació A354V en la LRPPRC desencadena una variant de la síndrome de Leigh, fruit d’una expressió de proteïnes mitocondrials limitada i d’uns nivells baixos dels mRNA de COXI i COXIII (Xu et al., 2004) . Un altre exemple és la inserció d’un nucleòtid en el gen TACO1, que codifica un factor activador de la síntesi de COXI, la qual provoca fenotips similars a la síndrome de Leigh i deficiència de l’activitat de la citocrom c-oxidasa (Weraarpachai et al., 2009) .

Pel que fa a enzims de modificació dels tRNA, s’han descrit les mutacions R116W (Bykhovskaya et al., 2004) i E220X (Fernández-Vizarra et al., 2007) en la pseudouridina-sintetasa humana (PUS1), que s’associen amb la malaltia MLASA (mitochondrial myopathy, lactic acidosis and sideroblastic anemia; miopatia mitocondrial, acidosi làctica i anèmia sideroblàstica) . La manca de pseudouridilació d’un o més tRNA mitocondrials sembla el mecanisme patogènic més plausible . Alguns individus amb insuficiència renal i acidosi làctica posseeixen diverses mutacions en el gen TRMU, que codifica un enzim que catalitza la 2-tiouridilació de tRNA mitocondrials (Zeharia et al., 2009) . En relació amb la formació dels mitoribosomes, s’ha detectat la mutació R111X en la proteïna MRPS16 (Miller et al., 2004), i la mutació letal R170H en la proteïna MRPS22 (Saada et al., 2007) . Totes dues proteïnes, en condicions normals, s’associen amb l’rRNA 12S i formen part de la subunitat petita dels mitoribosomes . Les mutacions causen feno -

tips molt severs amb disfunció de la cadena respiratòria deguda a la inhibició de la traducció dels mRNA mitocondrials . Les proteïnes ribosòmiques mitocondrials (MRP) mutants provoquen una disminució de la quantitat de rRNA 12S i un acoblament incorrecte de la subunitat petita del mitoribosoma (Haque et al., 2008) . La paraplegina és una proteasa involucrada en l’escissió de la preseqüència de senyalització mitocondrial de la proteïna ribosòmica MRPL32 . La paraplegia espàstica hereditària està provocada per mutacions en la paraplegina, que impliquen el processament inadequat de la MRPL32 i l’agrupament incorrecte dels mitoribosomes (Casari et al., 1998) .

Alguns individus que pateixen malalties severes molt variables simptomàticament i de mortalitat primerenca mostren mutacions en gens que codifiquen els factors d’elongació . La primera mutació identificada en l’mtEF-G1 (N174S) (Coenen et al., 2004) afecta un residu conservat i essencial per a

Figura 2. Procedència dels elements de traducció genètica mitocondrial associats a malalties humanes. Esquema de components de síntesi proteica mitocondrial codificats en l’mtDNA (en gris clar) i de l’nDNA (en gris fosc) alterats en malalties mitocondrials humanes.

la unió de GTP. Es prediu que la substitució té un efecte dràstic en la unió al nucleòtid i, en conseqüència, una pèrdua de la funció enzimàtica . Posteriorment, s’han identificat altres mutacions en aquest factor, com ara la substitució S321P, una deleció de dos nucleòtids (Antonicka et al., 2006), el canvi R47X i la substitució M496R (Valente et al., 2007) . El factor mtEF-Tu, encarregat d’acompanyar l’aa-tRNA fins al mitoribosoma durant la fase d’elongació, pot presentar la mutació R336Q (Valente et al., 2007), que inactiva completament la capacitat d’unir l’aa-tRNA per tal de formar el complex ternari (Valente et al., 2009) . Se suggereix que la mutació R312W en el factor mtEF-Ts (Smeitink et al., 2006), que regenera l’mtEF-Tu·GDP a mtEFTu·GTP, podria produir una reducció en la capacitat d’unió a l’mtEF-Tu i generar defectes en l’intercanvi nucleotídic (Akama et al., 2010) . D’altra banda, el polimorfisme C798T en el gen que codifica el factor d’iniciació mtIF3 presenta associació aŀlèlica amb la malaltia de Parkinson, i això suggereix que es tracta d’un factor de vulnerabilitat a la malaltia (Abahuni et al., 2007) . Recentment, en alguns subjectes afectats d’encefalopatia, s’han trobat delecions d’un nucleòtid en el gen C12orf65, que codifica un possible membre de la família dels factors de terminació mitocondrials . Les delecions indueixen l’aparició d’un codó de terminació prematur (Antonicka et al., 2010) .

L’any 2005 es va conèixer el primer cas en què mutacions en aaRS mitocondrials codificades al nucli es podien relacionar amb malalties humanes . El treball publicava una possible vinculació entre algunes variants del gen larS2, que codifica la leucil-tRNA-sintetasa mitocondrial humana (LARS2), amb la susceptibilitat a patir diabetis de tipus 2 . Es van determinar vuit polimorfismes en individus malalts, dels quals un (H324Q) semblava potenciar el risc de patir la malaltia, tot i que l’estu-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

di estadístic no assolia nivells de significació suficients (Hart et al., 2005) . Recentment, s’ha publicat un estudi més ampli, de poder estadístic més gran, que refuta l’associació entre les variants de la LARS2 i la diabetis de tipus 2 (Reiling et al., 2010) . L’any 2007 van sortir a la llum les dues primeres publicacions que connectaven directament mutacions en gens d’aaRS mitocondrials amb diverses malalties hereditàries:

— La malaltia humana autosòmica recessiva LBSL (leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and elevated lactate; leucoencefalopatia amb implicació del tronc cerebral i la meduŀla espinal amb lactat elevat) es diagnostica per detecció d’un ventall d’anormalitats en imatges i espectroscòpia de ressonància magnètica, i es caracteritza per atàxia cerebeŀlosa, espasticitat, discapacitat cognitiva variable i nivells elevats de lactat en la matèria blanca (Knaap et al., 2003) . El primer estudi publicat revelava que la LBSL pot ser causada per nombroses mutacions en el gen DARS2, que codifica l’aspartil-tRNA-sintetasa mitocondrial humana (DARS2) . La mutació més freqüent (R76SfsX5) afecta el lloc d’empalmament de l’intró 2, que provoca la deleció de l’exó 3, un canvi de pauta de lectura i la terminació prematura de la proteïna . Les mutacions són letals en homozigosi i afecten l’activitat d’aminoacilació de la DARS2 . Tanmateix, aquesta limitació no afecta la funció mitocondrial de fibroblasts, limfoblasts, ni teixit muscular . Aquesta observació planteja dues hipòtesis: que el desencadenament de la malaltia sigui conseqüència d’una activitat de la DARS2 mutant per sota d’un llindar específic per a les cèŀlules neuronals, o bé que la malaltia sigui causada per defectes subtils en el mitocondri (Scheper et al., 2007a) .

— La PCH ( pontocerebellar hypoplasia; hipoplàsia pontocerebeŀlosa) engloba un

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

grup heterogeni d’afeccions caracteritzades per una reducció notable de la mida del cerebel i del tronc cerebral (Barth, 1993) . Els individus malalts són homozigots per a dues variants del gen RARS2, que dóna lloc a l’arginil-tRNA-sintetasa mitocondrial humana (RARS2): un canvi R291K i una substitució (L13RfsX3) en el lloc d’empalmament de l’intró 2, que produeix l’escissió de l’exó 2 i un canvi de pauta de lectura . Com a conseqüència de les mutacions, s’observa una davallada del nivell d’Arg-tRNAArg en fibroblasts de pacients, tot i que presenten una activitat residual atribuïda a un romanent de transcrits processats correctament (Edvardson et al., 2007) . En contrast amb el cas de la DARS2, el múscul i la pell de subjectes amb PCH mostren defectes evidents en la funció mitocondrial, encara que els símptomes clínics de la malaltia només es manifestin al cervell .

L’establiment d’una relació directa entre mutacions en gens d’aaRS i diverses malalties ha fet d’aquests gens nous candidats per a malalties humanes d’etiologia desconeguda . D’aquesta manera, en els dos darrers anys, ha crescut exponencialment el nombre de malalties mitocondrials humanes causades per mutacions en aaRS mitocondrials: individus afectats per la malaltia MLASA presenten una mutació en la tirosil-tRNA-sintetasa mitocondrial (YARS2) (Riley et al., 2010); mutacions en el gen que codifica la seril-tRNA-sintetasa mitocondrial (SARS2) causen la síndrome HUPRA (hyperuricemia, pulmonary hypertension, renal failure in infancy and alkalosis; hiperuricèmia, hipertensió pulmonar, insuficiència renal infantil i alcalosi) (Belostotsky et al., 2011); substitucions en el gen de la histidiltRNA-sintetasa mitocondrial (HARS2) estan relacionades amb la síndrome de Perrault (Pierce et al., 2011); canvis en el gen que codifica l’alanil-tRNA-sintetasa mitocondrial (AARS2) provoquen cardiomiopa-

tia mitocondrial infantil (Götz et al., 2011); s’han trobat rearranjaments en el gen que codifica la metionil-tRNA-sintetasa mitocondrial (MARS2) en pacients d’ARSAL (autosomal recessive spastic ataxia with leukoencephalopathy; atàxia espàstica autosòmica recessiva amb leucoencefalopatia) (Bayat et al., 2012); mutacions en la glutamil-tRNAsintetasa mitocondrial (EARS2) estan involucrades en malalties com la LTBL (leukoencephalopathy with thalamus and brain stem involvement and high lactate; leucoencefalopatia amb implicació del tàlem i del tronc cerebral i lactat elevat) (Steenweg et al., 2012) o la malaltia multisistèmica infantil (Talim et al., 2012) .

MODELS DE MALALTIES DE TRADUCCIÓ GENÈTICA MITOCONDRIAL

La impossibilitat de manipular genèticament el genoma mitocondrial ha suposat un greu inconvenient a l’hora d’estudiar les relacions entre mutacions en els tRNA i rRNA mitocondrials i els fenotips clínics en animals model . Inicialment, molts processos bioquímics i ceŀlulars conseqüència de mutacions en l’mtDNA s’han analitzat mitjançant cèŀlules cíbrides transmitocondrials, és a dir, línies ceŀlulars humanes immortalitzades de les quals s’ha extret l’mtDNA (ρ°) repoblades amb mitocondris que procedeixen del pacient (King i Attardi, 1989) . Aquesta eina ha permès confirmar la patogenicitat de mutacions en l’mtDNA, determinar els mecanismes que provoquen determinats desordres mitocondrials, demostrar l’efecte llindar causat per nivells concrets d’heteroplàsmia i avaluar la importància del fons genètic nuclear a l’hora de determinar la segregació de mutacions heteroplàsmiques . Les cèŀlules cíbrides, però, provenen de cultius derivats de tumors

que presenten inestabilitat genètica a llarg termini, fet que impedeix la reproducció dels trets propis de cèŀlules diferenciades (Jacobs, 2001) .

Saccharomyces cerevisiae és un dels sistemes model emprats per entendre la significació fisiològica de mutacions als tRNA mitocondrials . La similitud entre el tRNALeu (UAA) de llevat i d’humà i la disponibilitat de tècniques de transformació mitocondrial en aquest organisme han permès la construcció de soques que posseeixen algunes de les mutacions en el tRNALeu (UAA) associades amb la malaltia MELAS . Aquests llevats tenen problemes de creixement en substrats respiratoris, exhibeixen una morfologia mitocondrial aberrant i acumulen delecions en l’mtDNA (Feuermann et al., 2003) . Els inconvenients d’aquest organisme són, per una banda, les diferències estructurals d’alguns tRNA respecte als d’humans i, per altra banda, que moltes de les propietats de biogènesi i metabolisme mitocondrials i aspectes propis d’organismes multiceŀlulars no són reproduïbles en llevats . Tot i la manca de models apropiats amb mutacions en tRNA o rRNA mitocondrials, s’ha progressat notablement en el desenvolupament de ratolins amb delecions o mutacions patogèniques en l’mtDNA . Després de diversos intents fallits, fa uns deu anys que es van aconseguir els primers models de ratolí transmitocondrial heteroplasmàtics, amb signes evidents de disfunció a l’orgànul i capaços de transmetre l’mtDNA mutant a les generacions següents (Marchington et al., 1999; Sligh et al., 2000) . Els ratolins transmitocondrials es van obtenir per fusió de cèŀlules mare embrionàries de femelles, amb cèŀlules anucleades amb un mtDNA que confereix resistència a l’inhibidor de mitoribosomes cloramfenicol, a causa d’una mutació puntual propera a l’extrem 3´ del gen de l’rRNA 16S (Blanc et al.,

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

1981) . Posteriorment, s’ha emprat aquest sistema per generar ratolins model heteroplasmàtics per a mutacions en l’mtDNA que afecten gens de la cadena respiratòria, com ara el ND6, o el CO1, que mostren alteracions en la respiració mitocondrial, dany tissular i anormalitats estructurals als mitocondris (Fan et al., 2008) . Addicionalment, s’ha construït un ratolí model transmitocondrial amb una extensa deleció de mtDNA que elimina sis tRNA i, en conseqüència, aboleix la síntesi proteica i desencadena trets similars als de la síndrome de Kearns-Sayre (Inoue et al., 2000) .

La generació de models enfocats a l’estudi de gens nuclears de funció mitocondrial té l’avantatge que no ha d’afrontar les limitacions tècniques relacionades amb la manipulació genètica de l’mtDNA . L’invertebrat Caenorhabditis elegans s’ha emprat com a model de desordres mitocondrials causats per la depleció de proteïnes de la cadena respiratòria codificades al nucli com, per exemple, la subunitat citocrom b560 del complex ii (Ishii et al., 1998), d’una proteïna fèrrica del complex i (Kayser et al., 1999) o la subunitat catalítica FMN del complex i (Grad i Lemire, 2004); i també s’ha utilitzat com a model de deficiència d’elements de replicació i manteniment de l’mtDNA, com la DNA-polimerasa γ o la SSBP1 (Addo et al., 2010) . Hi ha nombrosos ratolins model de malalties mitocondrials generats per manipulació de gens nuclears essencials per a la funció a l’orgànul (Chinnery i Turnbull, 2000) . Entre d’altres, s’han generat ratolins genoanuŀlats per als gens de: l’ANT1, que pateixen el blocatge del transport d’ATP/ADP i una superproducció de ROS; la superòxiddismutasa mitocondrial, que presenten una acumulació de ROS i disfunció de la cadena respiratòria; la frataxina, que afecta la cadena respiratòria; o el citocrom c, que mostren mortalitat in utero . També, s’ha creat un

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

model de la malaltia de LHON mitjançant l’expressió aŀlotípica de la subunitat ND4 del complex i de la cadena transportadora d’electrons amb la mutació R340H (Qi et al., 2007) . A més, s’ha generat un ratolí transgènic genomodificat que posseeix una mutació puntual al gen NDUFS4 que compromet específicament el funcionament del complex i de la cadena respiratòria (Ingraham et al., 2009) . Hi ha escassos models animals de malalties mitocondrials causades per mutacions en gens nuclears que codifiquen proteïnes de traducció genètica mitocondrial . Un d’aquests és el ratolí genoanuŀlat per al factor de transcripció mitocondrial mtTFA, que exhibeix una reducció en el nombre de còpies de mtDNA i, en conseqüència, una disfunció de la cadena respiratòria . El genoanuŀlat específic de la línia germinal produeix: mortalitat embrionària, retard en el desenvolupament neuronal, absència de cor i disc òptic i apoptosi (Larsson et al., 1998) . La manca de mtTFA específica de cor provoca: cardiomiopatia, blocatge de la conducció atrioventricular i apoptosi (Wang et al., 1999; Li et al., 2000); en cèŀlules β: diabetis i deficiència a la insulina (Silva et al., 2000); i en neurones: estrès oxidatiu, neurodegeneració i mort ceŀlular massiva (Sorensen et al., 2001) . Un altre model animal és el technical knockout (tko) de Drosophila melanogaster, que presenta una mutació puntual en el gen nuclear MRPS12 que afecta un residu conservat de la proteïna ribosòmica mitocondrial S12 (L85H), la qual genera fenotips de sordesa i retard en el desenvolupament . La mutació provoca: la inhibició de la síntesi proteica mitocondrial, la reducció de l’activitat enzimàtica redox i la davallada dels nivells de rRNA, que es tradueix en la inestabilitat de la subunitat petita del mitoribosoma (Toivonen et al., 2001) . Drosophila melanogaster també s’ha utilit-

zat com a model per reproduir els símptomes de la malaltia ARSAL causada per alteracions en el gen MARS2 (Bayat et al., 2012) .

Cal desitjar que de la creixent acumulació de nous models animals per a malalties mitocondrials, i de les dades resultants de l’anàlisi d’aquestes, apareguin aviat estratègies curatives o paŀliatives per a aquestes malalties majoritariàment intractables .

AGRAÏMENTS

Aquest treball ha estat finançat parcialment pel projecte BIO2009-09776 del Ministeri d’Investigació i Ciència .

BIBLIOGRAFIA

Abahuni, N .; Gispert, S .; Bauer, P.; Riess, O .; Kruger, R .; Becker, T .; Auburger, G . (2007) . «Mitochondrial translation initiation factor 3 gene polymorphism associated with Parkinson’s disease» . Neurosci. Lett., 414: 126-129 .

Addo, M . G .; Cossard, R .; Pichard, D .; Obiri-Danso, K .; Rotig, A .; Delahodde, A . (2010) . «Caenorhabditis elegans, a pluricellular model organism to screen new genes involved in mitochondrial genome maintenance» . Biochim. Biophys. Acta, 1802: 765-773 .

Akama, K ; Christian, B E ; Jones, C N ; Ueda, T ; Takeuchi, N ; Spremulli, L L (2010) «Analysis of the functional consequences of lethal mutations in mitochondrial translational elongation factors» Biochim. Biophys. Acta, 1802: 692-698

Andersson, S G ; Karlberg, O ; Canback, B ; Kurland, C G (2003) «On the origin of mitochondria: a genomics perspective» Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 358: 165-177 [Discussió: 177-179]

Antonicka, H ; Ostergaard, E ; Sasarman, F ; Weraarpachai, W ; Wibrand, F ; Pedersen, A M ; Rodenburg, R J ; Knaap, M S van der; Smeitink, J A ; Chrzanowska-Lightowlers, Z M ; Shoubridge, E A (2010) «Mutations in C12orf65 in patients with encephalomyopathy and a mitochondrial translation defect» Am. J. Hum. Genet., 87: 115-122

Antonicka, H ; Sasarman, F ; Kennaway, N G ; Shoubridge, E A (2006) «The molecular basis for tissue specificity of the oxidative phosphorylation defi-

ciencies in patients with mutations in the mitochondrial translation factor EFG1» . Hum. Mol. Genet., 15: 1835-1846 . Barth, P. G . (1993) . «Pontocerebellar hypoplasias . An overview of a group of inherited neurodegenerative disorders with fetal onset» . Brain Dev., 15: 411422 .

Bayat, V .; Thiffault, I .; Jaiswal, M .; Tetreault, M .; Donti, T .; Sasarman, F .; Bernard, G .; Demers-Lamarche, J .; Dicaire, M . J .; Mathieu, J .; Vanasse, M .; Bouchard, J . P.; Rioux, M . F .; Lourenco, C . M .; Li, Z .; Haueter, C .; Shoubridge, E . A .; Graham, B . H .; Brais, B .; Bellen, H . J . (2012) . «Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans» . PLoS Biol., 10: e1001288 . Belostotsky, R .; Ben-Shalom, E .; Rinat, C .; BeckerCohen, R .; Feinstein, S .; Zeligson, S .; Segel, R .; Elpeleg, O .; Nassar, S .; Frishberg, Y . (2011) . «Mutations in the mitochondrial seryl-tRNA synthetase cause hyperuricemia, pulmonary hypertension, renal failure in infancy and alkalosis, HUPRA syndrome» . Am. J. Hum. Genet., 88: 193-200 . Berg, J . M .; Tymoczko, J . L .; Stryer, L . (2007) . Biochemistry. Nova York: W . H . Freeman and Company . Blanc, H .; Adams, C . W .; Wallace, D . C . (1981) . «Different nucleotide changes in the large rRNA gene of the mitochondrial DNA confer chloramphenicol resistance on two human cell lines» . Nucleic Acids Res., 9: 5785-5795 . Bykhovskaya, Y .; Casas, K .; Mengesha, E .; Inbal, A .; Fischel-Ghodsian, N . (2004) . «Missense mutation in pseudouridine synthase 1 (PUS1) causes mitochondrial myopathy and sideroblastic anemia (MLASA)» Am. J. Hum. Genet., 74: 1303-1308

Casari, G ; Fusco, M de; Ciarmatori, S ; Zeviani, M ; Mora, M ; Fernández, P ; Michele, G de; Filla, A ; Cocozza, S ; Marconi, R ; Durr, A ; Fontaine, B ; Ballabio, A (1998) «Spastic paraplegia and OXPHOS impairment caused by mutations in paraplegin, a nuclear-encoded mitochondrial metal loprotease» Cell, 93: 973-983

Cavalier-Smith, T (1987) «The simultaneous symbiotic origin of mitochondria, chloroplasts, and microbodies» Ann. NY Acad. Sci., 503: 55-71

Chinnery, P F ; Turnbull, D M (2000) «Mitochondrial DNA mutations in the pathogenesis of human disease» Mol. Med. Today, 6: 425-432

Clayton, D A (2000) «Vertebrate mitochondrial DNA—a circle of surprises» Exp. Cell. Res., 255: 4-9

Coenen, M J ; Antonicka, H ; Ugalde, C ; Sasarman, F ; Rossi, R ; Heister, J G ; Newbold, R F ; Trijbels,

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

F . J .; Heuvel, L . P. van der; Shoubridge, E . A .; Smeitink, J . A . (2004) . «Mutant mitochondrial elongation factor G1 and combined oxidative phosphorylation deficiency» . N. Engl. J. Med., 351: 2080-2086 .

Dale, T .; Uhlenbeck, O . C . (2005) . «Amino acid specificity in translation» . Trends Biochem. Sci., 30: 659665 .

Davidov, Y .; Jurkevitch, E . (2009) . «Predation between prokaryotes and the origin of eukaryotes» . Bioessays., 31: 748-757 .

Diffley, J . F .; Stillman, B . (1991) . «A close relative of the nuclear, chromosomal high-mobility group protein HMG1 in yeast mitochondria» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7864-7868 .

Duchen, M . R . (2004) . «Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology» . Mol. Aspects Med., 25: 365-451 .

Dyall, S . D .; Brown, M . T .; Johnson, P. J . (2004) . «Ancient invasions: from endosymbionts to organelles» . Science, 304: 253-257 .

Edvardson, S .; Shaag, A .; Kolesnikova, O .; Gomori, J . M .; Tarassov, I .; Einbinder, T .; Saada, A .; Elpeleg, O . (2007) . «Deleterious mutation in the mitochondrial arginyl-transfer RNA synthetase gene is associated with pontocerebellar hypoplasia» . Am. J. Hum. Genet., 81: 857-862 .

Enríquez, J . A .; Chomyn, A .; Attardi, G . (1995) . «MtDNA mutation in MERRF syndrome causes defective aminoacylation of tRNA(Lys) and premature translation termination» . Nat. Genet., 10: 47-55 .

Fan, W .; Waymire, K . G .; Narula, N .; Li, P.; Rocher, C .; Coskun, P. E .; Vannan, M . A .; Narula, J .; Macgregor, G . R .; Wallace, D . C . (2008) . «A mouse model of mitochondrial disease reveals germline selection against severe mtDNA mutations» Science, 319: 958-962

Fernández-Vizarra, E ; Berardinelli, A ; Valente, L ; Tiranti, V ; Zeviani, M (2007) «Nonsense mutation in pseudouridylate synthase 1 (PUS1) in two brothers affected by myopathy, lactic acidosis and sideroblastic anaemia (MLASA)» J. Med. Genet., 44: 173-180

Feuermann, M ; Francisci, S ; Rinaldi, T ; Luca, C de; Rohou, H ; Frontali, L ; Bolotin-Fukuhara, M (2003) «The yeast counterparts of human ‘MELAS’ mutations cause mitochondrial dysfunction that can be rescued by overexpression of the mitochondrial translation factor EF-Tu» EMBO Rep., 4: 53-58

Götz, A ; Tyynismaa, H ; Euro, L ; Ellonen, P ; Hyotylainen, T ; Ojala, T ; Hamalainen, R H ; Tommiska, J ; Raivio, T ; Oresic, M ; Karikoski, R ; Tammela, O ; Simola, K O ; Paetau, A ; Tyni, T ;

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

Suomalainen, A . (2011) . «Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy» . Am. J. Hum. Genet., 88: 635-642 .

Grad, L . I .; Lemire, B . D . (2004) . «Mitochondrial complex I mutations in Caenorhabditis elegans produce cytochrome c oxidase deficiency, oxidative stress and vitamin-responsive lactic acidosis» . Hum. Mol. Genet., 13: 303-314 .

Grafakou, O .; Hol, F . A .; Otfried Schwab, K .; Siers, M . H .; Ter Laak, H .; Trijbels, F .; Ensenauer, R .; Boelen, C .; Smeitink, J . (2003) . «Exercise intolerance, muscle pain and lactic acidaemia associated with a 7497G>A mutation in the tRNASer(UCN) gene» . J. Inherit. Metab. Dis., 26: 593-600 . Gray, M . W .; Burger, G .; Lang, B . F . (1999) . «Mitochondrial evolution» . Science, 283: 1476-1481 . Haque, M . E .; Grasso, D .; Miller, C .; Spremulli, L . L .; Saada, A . (2008) . «The effect of mutated mitochondrial ribosomal proteins S16 and S22 on the assembly of the small and large ribosomal subunits in human mitochondria» . Mitochondrion, 8: 254-261 . Hart, L . M . t; Hansen, T .; Rietveld, I .; Dekker, J . M .; Nijpels, G .; Janssen, G . M .; Arp, P. A .; Uitterlinden, A . G .; Jorgensen, T .; Borch-Johnsen, K .; Pols, H . A .; Pedersen, O .; Duijn, C . M . van; Heine, R . J .; Maassen, J . A . (2005) . «Evidence that the mitochondrial leucyl tRNA synthetase (LARS2) gene represents a novel type 2 diabetes susceptibility gene» . Diabetes, 54: 1892-1895 . Hernández, G .; Altmann, M .; Lasko, P. (2010) . «Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes» . Trends Biochem. Sci., 35: 63-73 .

Holt, I J ; Harding, A E ; Morgan-Hughes, J A (1988) «Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies» Nature, 331: 717-719

Ingraham, C A ; Burwell, L S ; Skalska, J ; Brookes, P S ; Howell, R L ; Sheu, S S ; Pinkert, C A (2009) «NDUFS4: creation of a mouse model mimicking a Complex I disorder» Mitochondrion, 9: 204-210

Inoue, K ; Nakada, K ; Ogura, A ; Isobe, K ; Goto, Y ; Nonaka, I ; Hayashi, J I (2000) «Generation of mice with mitochondrial dysfunction by introducing mouse mtDNA carrying a deletion into zygotes» Nat. Genet., 26: 176-181

Ishii, N ; Fujii, M ; Hartman, P S ; Tsuda, M ; Yasuda, K ; Senoo-Matsuda, N ; Yanase, S ; Ayusawa, D ; Suzuki, K (1998) «A mutation in succinate dehydrogenase cytochrome b causes oxidative stress and ageing in nematodes» Nature, 394: 694697

Jacobs, H . T . (2001) . «Making mitochondrial mutants» . Trends Genet., 17: 653-660 .

Jaksch, M .; Klopstock, T .; Kurlemann, G .; Dorner, M .; Hofmann, S .; Kleinle, S .; Hegemann, S .; Weissert, M .; Muller-Hocker, J .; Pongratz, D .; Gerbitz, K . D . (1998) . «Progressive myoclonus epilepsy and mitochondrial myopathy associated with mutations in the tRNA(Ser(UCN)) gene» . Ann. Neurol., 44: 635-640 .

Kapp, L . D .; Lorsch, J . R . (2004) . «The molecular mechanics of eukaryotic translation» . Annu. Rev. Biochem., 73: 657-704 .

Kayser, E . B .; Morgan, P. G .; Sedensky, M . M . (1999) . «GAS-1: a mitochondrial protein controls sensitivity to volatile anesthetics in the nematode Caenorhabditis elegans» . Anesthesiology, 90: 545-554 .

King, M . P.; Attardi, G . (1989) . «Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation» . Science, 246: 500-503 .

Knaap, M . S . van der; Voorn, P. van der; Barkhof, F .; Coster, R . van; Krageloh-Mann, I .; Feigenbaum, A .; Blaser, S .; Vles, J . S .; Rieckmann, P.; Pouwels, P. J . (2003) . «A new leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement and high lactate» . Ann. Neurol., 53: 252-258 .

Kolesnikova, O . A .; Entelis, N . S .; Jacquin-Becker, C .; Goltzene, F .; Chrzanowska-Lightowlers, Z . M .; Lightowlers, R . N .; Martin, R . P.; Tarassov, I . (2004) . «Nuclear DNA-encoded tRNAs targeted into mitochondria can rescue a mitochondrial DNA mutation associated with the MERRF syndrome in cultured human cells» . Hum. Mol. Genet., 13: 2519-2534 .

Larsson, N . G .; Wang, J .; Wilhelmsson, H .; Oldfors, A .; Rustin, P.; Lewandoski, M .; Barsh, G . S .; Clayton, D A (1998) «Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice» Nat. Genet., 18: 231-236

Lauber, J ; Marsac, C ; Kadenbach, B ; Seibel, P (1991) «Mutations in mitochondrial tRNA genes: a frequent cause of neuromuscular diseases » Nucleic Acids Research, 19: 1393-1397

Leblanc, C ; Richard, O ; Kloareg, B ; Viehmann, S ; Zetsche, K ; Boyen, C (1997) «Origin and evolution of mitochondria: what have we learnt from red algae?» Curr. Genet., 31: 193-207

Li, H ; Wang, J ; Wilhelmsson, H ; Hansson, A ; Thoren, P ; Duffy, J ; Rustin, P ; Larsson, N G (2000) «Genetic modification of survival in tissuespecific knockout mice with mitochondrial cardiomyopathy» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 34673472

Li, R ; Guan, M X (2010) «Human mitochondrial leucyl-tRNA synthetase corrects mitochon-

drial dysfunctions due to the tRNALeu(UUR) A3243G mutation, associated with mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike symptoms and diabetes» . Mol. Cell. Biol., 30: 2147-2154 .

Lynn, S .; Wardell, T .; Johnson, M . A .; Chinnery, P. F .; Daly, M . E .; Walker, M .; Turnbull, D . M . (1998) . «Mitochondrial diabetes: investigation and identification of a novel mutation» . Diabetes, 47: 18001802 .

Marchington, D . R .; Barlow, D .; Poulton, J . (1999) . «Transmitochondrial mice carrying resistance to chloramphenicol on mitochondrial DNA: developing the first mouse model of mitochondrial DNA disease» . Nat. Med., 5: 957-960 . Margulis, L . (1981) . Symbiosis in cell evolution . San Francisco: Freeman . Margulis, L . (1993) . «Origins of species: acquired genomes and individuality» . Biosystems, 31: 121-125 . Martin, W .; Muller, M . (1998) . «The hydrogen hypothesis for the first eukaryote» . Nature, 392: 3741 .

Miller, C .; Saada, A .; Shaul, N .; Shabtai, N .; BenShalom, E .; Shaag, A .; Hershkovitz, E .; Elpeleg, O . (2004) . «Defective mitochondrial translation caused by a ribosomal protein (MRPS16) mutation» . Ann. Neurol., 56: 734-738 . Mitchell, P. (1961) . «Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism» . Nature, 191: 144-148 . Park, H .; Davidson, E .; King, M . (2003) . «The pathogenic A3243G mutation in human mitochondrial tRNALeu(UUR) decreases the efficiency of aminoacylation» . Biochemistry, 42: 958-964 .

Pestova, T . V .; Kolupaeva, V . G .; Lomakin, I . B .; Pilipenko, E V ; Shatsky, I N ; Agol, V I ; Hellen, C U (2001) «Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 7029-7036

Pierce, S B ; Chisholm, K M ; Lynch, E D ; Lee, M K ; Walsh, T ; Opitz, J M ; Li, W ; Klevit, R E ; King, M C (2011) «Mutations in mitochondrial histidyl tRNA synthetase HARS2 cause ovarian dysgenesis and sensorineural hearing loss of Perrault syndrome» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 6543-6548

Pisarev, A V ; Hellen, C U ; Pestova, T V (2007) «Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes» Cell, 131: 286-299

Qi, X ; Sun, L ; Lewin, A S ; Hauswirth, W W ; Guy, J (2007) «The mutant human ND4 subunit of complex I induces optic neuropathy in the mouse» Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48: 1-10

Reiling, E ; Jafar-Mohammadi, B ; Riet, E van ‘t; Weedon, M N ; Vliet-Ostaptchouk, J V van;

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

Hansen, T .; Saxena, R .; Haeften, T . W . van; Arp, P. A .; Das, S .; Nijpels, G .; Groenewoud, M . J .; Hove, E . C . van; Uitterlinden, A . G .; Smit, J . W .; Morris, A . D .; Doney, A . S .; Palmer, C . N .; Guiducci, C .; Hattersley, A . T .; Frayling, T . M .; Pedersen, O .; Slagboom, P. E .; Altshuler, D . M .; Groop, L .; Romijn, J . A .; Maassen, J . A .; Hofker, M . H .; Dekker, J . M .; Mccarthy, M . I .; Hart, L . M . t (2010) . «Genetic association analysis of LARS2 with type 2 diabetes» . Diabetologia, 53: 103-110 . Ribas de Pouplana, L .; Schimmel, P. (2001) . «Two classes of tRNA synthetases suggested by sterically compatible dockings on tRNA acceptor stem» . Cell, 104: 191-193 . Riley, L . G .; Cooper, S .; Hickey, P.; Rudinger-Thirion, J .; Mckenzie, M .; Compton, A .; Lim, S . C .; Thorburn, D .; Ryan, M . T .; Giege, R .; Bahlo, M .; Christodoulou, J . (2010) . «Mutation of the mitochondrial tyrosyl-tRNA synthetase gene, YARS2, causes myopathy, lactic acidosis, and sideroblastic anemia— MLASA syndrome» . Am. J. Hum. Genet., 87: 52-59 . Ruiz-Pesini, E .; Lott, M . T .; Procaccio, V .; Poole, J . C .; Brandon, M . C .; Mishmar, D .; Yi, C .; Kreuziger, J .; Baldi, P.; Wallace, D . C . (2007) . «An enhanced MITOMAP with a global mtDNA mutational phylogeny» . Nucleic Acids Res., 35: D823-8 .

Saada, A .; Shaag, A .; Arnon, S .; Dolfin, T .; Miller, C .; Fuchs-Telem, D .; Lombes, A .; Elpeleg, O . (2007) . «Antenatal mitochondrial disease caused by mitochondrial ribosomal protein (MRPS22) mutation» . J. Med. Genet., 44: 784-786 . Sagan, L . (1967) . «On the origin of mitosing cells» . J. Theor. Biol., 14: 255-274 . Scaglia, F .; Wong, L . J . (2008) . «Human mitochondrial transfer RNAs: role of pathogenic mutation in disease» Muscle Nerve, 37: 150-171

Schapira, A H (2006) «Mitochondrial disease» Lancet, 368: 70-82

Scheper, G C ; Klok, T van der; Andel, R J van; Berkel, C G van; Sissler, M ; Smet, J ; Muravina, T I ; Serkov, S V ; Uziel, G ; Bugiani, M ; Schiffmann, R ; Krageloh-Mann, I ; Smeitink, J A ; Florentz, C ; Coster, R van; Pronk, J C ; Knaap, M S van der (2007a) «Mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase deficiency causes leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and lactate elevation» Nat. Genet., 39: 534539

Scheper, G C ; Knaap, M S van der; Proud, C G (2007 b) «Translation matters: protein synthesis defects in inherited disease» Nat. Rev. Genet., 8: 711723

Silva, J P ; Kohler, M ; Graff, C ; Oldfors, A ; Magnuson, M A ; Berggren, P O ; Larsson, N G (2000)

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

«Impaired insulin secretion and beta-cell loss in tissue-specific knockout mice with mitochondrial diabetes» . Nat. Genet., 26: 336-340 .

Sligh, J . E .; Levy, S . E .; Waymire, K . G .; Allard, P.; Dillehay, D . L .; Nusinowitz, S .; Heckenlively, J . R .; Macgregor, G . R .; Wallace, D . C . (2000) . «Maternal germ-line transmission of mutant mtDNAs from embryonic stem cell-derived chimeric mice» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 14461-14466 .

Smeitink, J . A .; Elpeleg, O .; Antonicka, H .; Diepstra, H .; Saada, A .; Smits, P.; Sasarman, F .; Vriend, G .; Jacob-Hirsch, J .; Shaag, A .; Rechavi, G .; Welling, B .; Horst, J .; Rodenburg, R . J .; Heuvel, B . van den; Shoubridge, E . A . (2006) . «Distinct clinical phenotypes associated with a mutation in the mitochondrial translation elongation factor EFTs» . Am. J. Hum. Genet., 79: 869-877 .

Smits, P.; Smeitink, J .; Heuvel, L . van den (2010) . «Mitochondrial translation and beyond: processes implicated in combined oxidative phosphorylation deficiencies» . J. Biomed. Biotechnol., 2010: 737385 . Sorensen, L .; Ekstrand, M .; Silva, J . P.; Lindqvist, E .; Xu, B .; Rustin, P.; Olson, L .; Larsson, N . G . (2001) . «Late-onset corticohippocampal neurodepletion attributable to catastrophic failure of oxidative phosphorylation in MILON mice» . J. Neurosci., 21: 8082-8090 .

Spelbrink, J . N .; Li, F . Y .; Tiranti, V .; Nikali, K .; Yuan, Q . P.; Tariq, M .; Wanrooij, S .; Garrido, N .; Comi, G .; Morandi, L .; Santoro, L .; Toscano, A .; Fabrizi, G . M .; Somer, H .; Croxen, R .; Beeson, D .; Poulton, J .; Suomalainen, A .; Jacobs, H . T .; Zeviani, M .; Larsson, C . (2001) . «Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria» Nat. Genet., 28: 223-231

Steenweg, M E ; Ghezzi, D ; Haack, T ; Abbink, T E ; Martinelli, D ; Berkel, C G van; Bley, A ; Diogo, L ; Grillo, E ; Water Naude, J te; Strom, T M ; Bertini, E ; Prokisch, H ; Knaap, M S van der; Zeviani, M (2012) «Leukoencephalopathy with thalamus and brainstem involvement and high lactate ‘LTBL’ caused by EARS2 mutations» Brain, 135: 1387-1394

Talim, B ; Pyle, A ; Griffin, H ; Topaloglu, H ; Tokatli, A ; Keogh, M J ; Santibanez-Koref, M ; Chinnery, P F ; Horvath, R (2012) «Multisystem fatal infantile disease caused by a novel homozygous EARS2 mutation» Brain.

Toivonen, J M ; O’dell, K M ; Petit, N ; Irvine, S C ; Knight, G K ; Lehtonen, M ; Longmuir, M ; Luoto, K ; Touraille, S ; Wang, Z ; Alziari, S ; Shah, Z H ; Jacobs, H T (2001) «Technical knockout, a Dro -

sophila model of mitochondrial deafness» . Genetics, 159: 241-254 .

Toompuu, M .; Yasukawa, T .; Suzuki, T .; Hakkinen, T .; Spelbrink, J . N .; Watanabe, K .; Jacobs, H . T . (2002) .

«The 7472insC mitochondrial DNA mutation impairs the synthesis and extent of aminoacylation of tRNASer(UCN) but not its structure or rate of turnover» . J. Biol. Chem., 277: 22240-22250 .

Valente, L .; Shigi, N .; Suzuki, T .; Zeviani, M . (2009) .

«The R336Q mutation in human mitochondrial EFTu prevents the formation of an active mt-EFTu . GTP.aa-tRNA ternary complex» . Biochim. Biophys. Acta, 1792: 791-795 .

Valente, L .; Tiranti, V .; Marsano, R . M .; Malfatti, E .; Fernández-Vizarra, E .; Donnini, C .; Mereghetti, P.; Gioia, L . de; Burlina, A .; Castellan, C .; Comi, G . P.; Savasta, S .; Ferrero, I .; Zeviani, M . (2007) .

«Infantile encephalopathy and defective mitochondrial DNA translation in patients with mutations of mitochondrial elongation factors EFG1 and EFTu» . Am. J. Hum. Genet., 80: 44-58 .

Wallace, D . C .; Singh, G .; Lott, M . T .; Hodge, J . A .; Schurr, T . G .; Lezza, A . M .; Elsas, L . J ., 2nd; Nikoskelainen, E . K . (1988) . «Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy» . Science, 242: 1427-1430 . Wang, J .; Wilhelmsson, H .; Graff, C .; Li, H .; Oldfors, A .; Rustin, P.; Bruning, J . C .; Kahn, C . R .; Clayton, D . A .; Barsh, G . S .; Thoren, P.; Larsson, N . G . (1999) . «Dilated cardiomyopathy and atrioventricular conduction blocks induced by heart-specific inactivation of mitochondrial DNA gene expression» . Nat. Genet., 21: 133-137 .

Weraarpachai, W .; Antonicka, H .; Sasarman, F .; Seeger, J .; Schrank, B .; Kolesar, J . E .; Lochmuller, H ; Chevrette, M ; Kaufman, B A ; Horvath, R ; Shoubridge, E A (2009) «Mutation in TACO1, encoding a translational activator of COX I, results in cytochrome c oxidase deficiency and late-onset Leigh syndrome» Nat. Genet., 41: 833-837

Wong, L J ; Yim, D ; Bai, R K ; Kwon, H ; Vacek, M M ; Zane, J ; Hoppel, C L ; Kerr, D S (2006) «A novel mutation in the mitochondrial tRNA(Ser(AGY)) gene associated with mitochondrial myopathy, encephalopathy, and complex I deficiency» J. Med. Genet., 43: e46

Xu, F .; Morin, C .; Mitchell, G .; Ackerley, C .; Robinson, B . H . (2004) . «The role of the LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat cassette) gene in cytochrome oxidase assembly: mutation causes lowered levels of COX (cytochrome c oxidase) I and COX III mRNA» . Biochem. J., 382: 331-316 . Yan, H .; Zareen, N .; Levinger, L . (2006) . «Naturally occurring mutations in human mitochondrial pretRNASer(UCN) can affect the transfer ribonuclease Z cleavage site, processing kinetics, and substrate secondary structure» . J. Biol. Chem., 281: 3926-3935 . Yasukawa, T .; Suzuki, T .; Ishii, N .; Ohta, S .; Watanabe, K . (2001) . «Wobble modification defect in tRNA disturbs codon-anticodon interaction in a mitochondrial disease» . Embo J., 20: 4794-4802 . Zeharia, A .; Shaag, A .; Pappo, O .; Mager-Heckel, A . M .; Saada, A .; Beinat, M .; Karicheva, O .; Mandel, H .; Ofek, N .; Segel, R .; Marom, D .; Rotig, A .; Tarassov, I .; Elpeleg, O . (2009) . «Acute infantile liver failure due to mutations in the TRMU gene» . Am. J. Hum. Genet., 85: 401-407 .

SOBRE L’AUTORA

Tanit Guitart, nascuda a Barcelona l’any 1982, es llicencià en biologia per la Universitat de Barcelona l’any 2005 . El mateix any s’incorpora al Laboratori de Traducció Genètica de l’Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona com a estudiant de doctorat, sota la direcció del doctor Lluís Ribas de Pouplana . La seva tesi doctoral, defensada l’any 2010, se centra en l’estudi dels mecanismes de traducció genètica mitocondrials, i la generació de models de malalties mitocondrials humanes en Drosophila . Des de l’any 2011 és investigadora postdoctoral al Centre de Regulació Genòmica, sota la direcció de la doctora Fàtima Gebauer .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 113-130

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .140

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 131-138

NANOBIOTECNOLOGIA I NANOMEDICINA

Josep Samitier

Laboratori de Nanobioenginyeria, Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC). Centre de Recerca Biomèdica en Xarxa de Bioenginyeria, Biomaterials i Nanomedicina (CIBER-BBN). Departament d’Electrònica, Universitat de Barcelona

Adreça per a la correspondència: Josep Samitier . Institut de Bioenginyeria de Catalunya . C . de Baldiri i Reixac, 10-12 . 08028 Barcelona . Tel .: 934 039 706 . Adreça electrònica: jsamitier@ibecbarcelona.eu.

RESUM

La nanobiotecnologia és la confluència entre la nanotecnologia i la biotecnologia . Inclou tots els mètodes i tècniques a nanoescala (10 –9 m) que poden servir per controlar i caracteritzar la matèria biològica . Aquestes tècniques són emprades actualment per estudiar i modificar biomolècules i cèŀlules . A més de l’aplicació per estudiar biosistemes, els investigadors també aprenen de la biologia per crear nous dispositius a micronanoescala i per comprendre els processos relacionats amb la vida a l’escala nanomètrica . La nanotecnologia aplicada a la salut —usualment denominada nanomedicina— és una de les tecnologies clau per aconseguir sistemes de diagnosi precoç més precisos (quan més aviat es diagnostica, les opcions i eficiència dels tractaments augmenten), tractaments més orientats a les dianes terapèutiques (que disminueixen efectes secundaris) i millor seguiment de la teràpia . És evident que la nanomedicina serà un instrument fonamental per al desenvolupament d’una medicina personalitzada i sostenible . Paraules clau: nanotecnologia, nanomedicina, tecnologia mèdica, alliberament de fàrmacs, diagnòstic, medicina regenerativa .

NANOBIOTECHNOLOGY AND NANOMEDICINE

SUMMARY

Nanobiotechnology represents the convergence between nano- and biotechnology and includes all methods and techniques at the nanoscale (10 –9 m) that can serve to control and characterize biological matter . These techniques are therefore used to study and modify biomolecules and cells . Besides the application to study biosystems, researchers also learn

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

from biology to create new micro-nanoscale devices and better understand life processes at the nanoscale . Nanotechnology applied to healthcare —usually called nanomedicine— is one of the key enabling technologies to achieve and enable earlier and more precise, individual diagnosis (the sooner, the better the treatment), better targeted therapies (fewer side effects) and better therapy monitoring . Thus, nanomedicine is understood to be a fundamental instrument for personalized and sustainable medicine .

Key words: nanotechnology, nanomedicine, medical technology, drug delivery, diagnostic, regenerative medicine .

INTRODUCCIÓ

La nanotecnologia és la recerca i la innovació en materials i dispositius a escala atòmica i molecular . Això vol dir que continguin estructures o presentin propietats amb dimensions característiques que estiguin entre 1 i 100 nm, és a dir, entre 1 i 100 milionèsimes de miŀlímetre . Per fer-nos una idea de l’ordre de magnitud que representa això, si tenim per referència el nostre planeta Terra, l’hem de reduir deu milions de vegades perquè ens quedi de la mida d’una pilota de futbol . Doncs per tenir la mida d’una molècula típicament «nano» hem de reduir la mida de la nostra pilota de futbol mil milions de vegades més . Llavors aconseguirem una petita nanopartícula amb la mida d’un fuŀlerè, una molècula amb seixanta àtoms de carboni .

Aquest fet va ser destacat l’any 1959 pel premi Nobel de Física Richard Feymann i un dels precursors de la nanotecnologia en indicar en una conferència feta el 29 de desembre d’aquell any que «allà baix hi havia molt d’espai», remarcant que veritablement el món «nano» de les molècules i els àtoms era immens . A més, va afirmar que no hi havia cap principi físic que no ens permetés manipular i construir coses àtom a àtom . La importància de les afirmacions de Feymann és que es van fer quan encara no teníem instruments capaços de visualitzar o treballar amb àtoms i molècules individuals . Fins a l’any 1981 no es va construir

el microscopi d’efecte túnel i el 1986 les microscòpies de forces atòmiques, per poder tenir eines que ens permetessin treballar amb mides de la matèria tan petites . Fins llavors teníem microscopis electrònics que permetien ampliar i veure com era la morfologia i estructura de la matèria però sense poder manipular-la .

L’aplicació de la nanotecnologia a la medicina es coneix com a nanomedicina (Kim et al., 2010), i comprèn un àmbit d’investigació científic i tecnològic interdisciplinari que pretén millorar el diagnòstic, tractament i prevenció de malalties i lesions traumàtiques, així com preservar i millorar la salut i qualitat de vida . Això implica millorar el coneixement i comprensió del cos humà a escala molecular a fi de poder analitzar, supervisar, controlar, reparar, reconstruir i millorar qualsevol sistema biològic humà .

La primera vegada que es va fer servir la paraula nanomedicina, segons recull la base de dades de publicacions biomèdiques PubMed, va ser el 1999 amb D . O . Weber en el Journal Health Forum, i el gener de l’any 2000 la revista Newsweek publicava un article titulat «The war on disease goes miniature . Nanomedicine: drugs and cancer tests, cell by cell» . Des de llavors les publicacions que tenen a veure amb els descobriments i les aplicacions de la nanotecnologia a la biomedicina s’han incrementat exponencialment .

La nanomedicina estudia les interaccions a la nanoescala (1 a 100 nm) i per a això de-

senvolupa i utilitza dispositius, sistemes i tecnologies que inclouen nanoestructures capaces d’interactuar a escala molecular i que s’interconnecten amb microsistemes per interaccionar a escala ceŀlular o subcellular (Duncan i Gaspar, 2001) .

Des del punt de vista de les seves aplicacions, la nanomedicina en aquests moments es focalitza en tres grans eixos transversals: millora del diagnòstic tant in vivo com in vitro, desenvolupament de nous sistemes més efectius de subministrament i dosificació de fàrmacs, i desenvolupament de tecnologies per a l’enginyeria tissular i la medicina regenerativa . La nanomedicina constitueix un paradigma d’investigació translacional, ja que requereix des de la investigació fonamental que prové de la química, física o biologia a la investigació aplicada de ciència i tecnologia de materials, farmacologia, bioelectrònica i enginyeria biomèdica, així com la investigació mèdica clínica . Aquest fet implica noves necessitats de formació dirigides no només a estudiants, investigadors o professionals del sector sanitari, sinó també al públic en general, perquè assoleixi un coneixement suficient tant de les perspectives com de les limitacions o riscs assumibles que en aquest moment tenen les diferents línies d’investigació . En aquest sentit, considerem molt rellevant la implicació dels agents reguladors de les tecnologies sanitàries en el desenvolupament d’aquesta àrea . Així mateix, la nanomedicina requereix el desenvolupament d’un sector industrial que permeti que els avenços cientificotecnològics es transformin en tecnologies per a la salut que puguin millorar la qualitat de vida a la vegada que disminueixin el cost sanitari . Es tracta d’un àmbit econòmic que inclou sectors com el farmacèutic, les tecnologies mèdiques o la biotecnologia . És obvi que la nanomedicina està encara en una fase inicial, en què preval la tas-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 131-138

ca d’investigació bàsica i orientada, malgrat que ja comencen a aparèixer els primers resultats clínics . Així, per exemple, l’any 2012 es va publicar a la revista Science Translational Medicine, amb l’epígraf nanomedicine, el primer resultat clínic en què es feia servir una nanopartícula polimèrica combinada amb el fàrmac docetaxel per tractar tumors sòlids . Són resultats obtinguts per investigadors del MIT i la Harvard Medical School juntament amb altres hospitals americans (Hrkach et al., 2012) .

Però és en els pròxims 10-15 anys quan els resultats d’aquesta investigació han de transferir-se a aplicacions que siguin plenament operatives dintre del sistema sanitari tant en la prevenció i diagnòstic com en la teràpia .

El nanodiagnòstic possibilita la identificació de malalties o de la predisposició a aquestes a escala ceŀlular o molecular mitjançant la utilització de nanodispositius . Sota aquest concepte s’unifica la necessitat social i clínica, juntament amb la capacitat tecnològica, per detectar malalties en l’estat més primerenc possible, així com la necessitat de detectar potencials efectes indesitjables dels fàrmacs abans de la prescripció . Per assolir aquest objectiu, totes les activitats han d’estar encaminades a augmentar l’eficàcia del diagnòstic . I en aquest sentit, la nanotecnologia ofereix eines per millorar la sensibilitat, especificitat i fiabilitat . També

Figura 1. Tractament amb un nanofàrmac amb docetaxel (Hrkach et al., 2012).

ofereix la possibilitat de fer mesures de diferents paràmetres en paraŀlel o d’integrar diverses etapes del procés d’anàlisi, des de la preparació de la mostra fins a la detecció en un simple dispositiu miniaturista . Gràcies a la nanotecnologia, els dispositius futurs seran prou inteŀligents, atès tant el seu caràcter informatitzat com el seu caire robust, per ser utilitzats pel pacient mateix i subministrar una multitud de dades al metge . Es tracta, en definitiva, de satisfer les necessitats no cobertes actualment que beneficiaran tant el pacient com el sistema sanitari . En aquest sentit el desenvolupament dels dispositius anomenats lab on a chip o point of care són en aquests moments l’objectiu a assolir (Mir et al., 2009) . De sistemes com aquests que permetin fer una detecció de múltiples biomarcadors d’una determinada malaltia, actualment en tenim prototips per poder diagnosticar malalties infeccioses respiratòries en uns 30 min a partir d’una mostra de mucositat, i que permeten poder distingir entre infeccions bacterianes o víriques (Samitier et al., 2004) .

Els diagnòstics in vitro es poden dur a terme mitjançant biosensors o dispositius integrats amb molts sensors (www.theraedge. com) . Un biosensor conté un determinat receptor biològic, com pot ser un enzim o un anticòs, capaç de detectar la presència o concentració d’una substància de manera específica i traduir aquesta interacció a través d’un transductor que transforma el senyal bioquímic en un senyal quantificable . Entre aquest tipus de dispositius poden esmentar-se nanoestructures fabricades mitjançant tècniques litogràfiques, que poden ser revestides amb biomolècules capaces d’unir-se a substrats específics (proteïnes, DNA complementari a una determinada seqüència genètica i, en general, molècules que participen en fenòmens d’adhesió i de reconeixement receptor-lligam), dispositius nanomètrics capaços de servir com a

plataforma de diagnòstic per poder detectar biomarcadors amb més sensibilitat de la que es pot obtenir amb els mètodes actuals, o nanocristalls de material semiconductor (quantum dots), que units a un anticòs o una altra biomolècula són capaços d’interaccionar amb la molècula d’interès .

La imatge molecular es defineix com la mesura, caracterització i diagnòstic in vivo de processos biològics ceŀlulars o moleculars a través d’imatges generades mitjançant la utilització conjunta de nous agents moleculars i tècniques d’imatge mèdica tradicionals . Per visualitzar molècules específiques in vivo és necessari que es compleixin una sèrie de requisits: a) disponibilitat de nanodispositius d’alta afinitat per a la molècula amb una farmacodinàmica adequada; b) capacitat d’arribar a l’objectiu en una concentració i durant un temps suficient; c) utilització d’estratègies químiques o biològiques d’amplificació, i d ) disponibilitat de tècniques d’imatge amb suficient sensibilitat, resolució i velocitat . Avui dia, per aconseguir teràpies efectives i eficaces no només és necessari disposar de molècules amb activitat farmacològica (molècula activa o fàrmac), sinó que el vehicle, suport o sistema en el qual aquestes molècules van incorporades desenvolupa un paper fonamental en l’èxit final del medicament . En aquest sentit, els nous sistemes d’alliberament de fàrmacs (drug delivery systems) han permès que disposem actualment de tractaments més selectius i potents que milloren la ràtio eficàcia/toxicitat de l’actual i del futur arsenal terapèutic (Duncan i Gaspar, 2011) . El concepte de sistema d’alliberament de fàrmacs va sorgir en la dècada dels setanta de manera coincident amb el de alliberament controlat de fàrmacs . Aquesta idea va ser conseqüència del reconeixement de les possibilitats de millora de les propietats terapèutiques dels fàrmacs en virtut de la seva incorporació a un sis-

tema que en permeti l’alliberament a la velocitat adequada i en l’entorn adequat . Per tant, la idea de sistema d’alliberament es va desvincular des dels seus inicis del concepte tradicional de forma farmacèutica, forma de dosificació o forma d’administració, que fan referència a la forma o condicionament final del fàrmac (comprimit, càpsula, injectable, supositori, etc .) . Amb el pas del temps, els importants avenços en el disseny de nous sistemes d’alliberament han donat lloc a una ampliació d’aquest concepte . Quan la nanotecnologia s’aplica al disseny i desenvolupament de sistemes d’alliberament de fàrmacs sorgeix una àrea d’investigació l’objectiu de la qual és la generació de nanosistemes terapèutics . Aquesta àrea de la nanomedicina es defineix com la ciència i tecnologia de sistemes complexos de grandària entre 1-1 .000 nm formats per almenys dos components, un dels quals és un principi actiu (Zhang et al., 2008) . El sistema desenvolupat així està especialment dissenyat per tractar, prevenir o diagnosticar malalties . En sentit ampli es podrien incloure aquí aquells sistemes formats per un únic component però que han estat sotmesos a un procés que els transforma en nanomètrics (per exemple, mitjançant tecnologia de fluids supercrítics) .

La medicina regenerativa és una àrea emergent que cerca la reparació o reemplaçament de teixits i òrgans mitjançant l’aplicació de mètodes procedents de teràpia genètica, teràpia ceŀlular i enginyeria tissular . L’enginyeria tissular combina la utilització de cèŀlules vives i biomaterials que actuen com a estructures de suport en la reconstrucció del teixit, i fan les funcions de la matriu extraceŀlular . Els biomaterials utilitzats en enginyeria tissular han sofert una clara evolució . Van començar essent materials inerts per a l’organisme (biomaterials de primera generació: període 1960-1970), per passar després a ser materials bioactius o

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 131-138

biodegradables (biomaterials de segona generació: període 1980-1990) . Actualment, els materials que s’utilitzen són els denominats de tercera generació, aquells capaços de mimetitzar respostes ceŀlulars específiques a escala molecular . Gràcies al desenvolupament de tecnologies a escala nanomètrica, aquesta generació de materials té el potencial d’interaccionar amb components cellulars, dirigir la proliferació i diferenciació ceŀlular i la producció i organització de la matriu extraceŀlular . En els últims anys la possibilitat de combinar nanotecnologia i cèŀlules mare permet predir que en el futur serà possible obtenir resultats que podran ser transferits a la teràpia clínica .

TERANÒSTIC: DIAGNÒSTIC COMBINAT AMB TERÀPIA

La combinació d’agents de contrast amb fàrmacs en una mateixa nanopartícula permet fer un seguiment de tres aspectes molt importants vinculats a la teràpia (Lee et al ., 2012; Lammer et al., 2011; Doane i Burda, 2012) .

Figura 2. Miceŀles multifuncionals que incorporen un radionucli (188Re) i una partícula sensible a la radiació infraroja per detectar i tractar cèŀlules tumorals en un model animal.

— La distribució del fàrmac en l’organisme . — El procés d’eliminació del fàrmac en l’organisme . — L’eficàcia del fàrmac en l’organisme . Així mateix aquesta combinació de característiques en una mateixa nanopartícula pot ajudar a incrementar la concentració del fàrmac en els teixits d’interès així com l’activació local controlada . Per exemple, la incorporació de radionuclis a un conjugat copolimèric amb doxorubicina va servir per observar de manera no invasiva l’acumulació i biodistribució de sistemes de transport polimèric en diferents tipus de tumor, i així permetre’n l’optimització . Com a exemple, una nanopartícula multifuncional que inclou un agent fluorescent infraroig i un radionucli ha estat emprada com a sistema de diagnòstic a la vegada que possibilitava l’aplicació d’una teràpia fototèrmica, en irradiar en aquest cas el model animal amb radiació infraroja (Peng et al., 2011) .

NANOMEDICINA I CÀNCER

La combinació de la nanotecnologia amb la biotecnologia ha permès estendre els límits actuals del diagnòstic molecular . Aquest fet permet millorar dia a dia la detecció en fases inicials de cèŀlules tumorals («Cancer nanotechnology: opportunities and challenges», 2005; Balco et al., 2011; Jain, 2010) . Les nanopartícules d’or no són tòxiques per a les cèŀlules humanes, i combinades amb anticossos monoclonals poden reconèixer cèŀlules cancerígenes específiques . Per exemple, nanopartícules d’or que inclouen en la seva superfície molècules que detecten receptors específics s’adhereixen sobre les cèŀlules cancerígenes amb un 600 % més d’afinitat que sobre les cèŀlules normals . A més d’emprar nanopartícules per al

diag nòstic per la imatge, com hem indicat anteriorment, s’està investigant en la detecció de les cèŀlules tumorals circulants mitjançant nanopartícules per prevenir el procés de metàstasi .

Des del punt de vista de la teràpia s’han desenvolupat sistemes d’alliberament de fàrmacs basats en l’ús de nanopartícules, des que l’any 1995 la FDA acceptés l’ús d’una formulació amb liposomes del fàrmac doxorubicina per al tractament del sarcoma de Kaposi . Aquesta formulació va demostrar que produïa una notable disminució de la cardiotoxicitat del fàrmac a la vegada que n’augmentava la farmacocinètica des de 10 min fins a 50 h . A partir d’aquí van aparèixer altres formulacions basades

Figura 3. Tractament de glioblastoma (Namiki, 2010) amb partícules magnètiques. a, b) Imatge del cervell abans del tractament per MRI, c, d ) Imatge de tomografia computacional que mostra l’acumulació de nanopartícules magnètiques. Les ratlles isotèrmiques indiquen la temperatura calculada de 40 °C (blau) i 50 °C (vermell). La ratlla marró representa l’àrea ocupada pel tumor. e, f ) Reconstrucció de les imatges de MRI i CT que mostra el tumor (marró), el fluid magnètic (blau) i el catèter (verd).

en liposomes . Els liposomes són nanopartícules esfèriques d’aproximadament 100 nm formades per una membrana bilipídica de fosfolípids . En el seu interior aquós es poden encapsular un gran nombre de principis actius . A més, la part externa de la membrana, en ser hidrofòbica, permet incloure fàrmacs hidrofòbics (Namiki, 2010) .

Les miceŀles polimèriques són també nanoestructures esfèriques entre 10 i 100 nm formades per l’autoassemblatge de copolímers amfifílics en sistemes aquosos . Aquestes partícules també serveixen per incorporar fàrmacs lipofílics a la vegada que es poden funcionalitzar amb biomarcadors per detectar les cèŀlules tumorals .

Des del punt de vista de teràpia la utilització de siRNA lligat a nanopartícules presenta resultats prometedors des que l’any 2008 es va fer el primer estudi clínic en pacients amb tumors sòlids (Chen et al., 2010) .

La magnetotèrmia o l’ús de nanopartícules magnètiques que s’acumulen en la regió tumoral, a la vegada que el pacient és sotmès a un camp magnètic osciŀlant, permet que es produeixi un escalfament local de la regió que presenta dues accions terapèutiques . Si l’augment de temperatura és suficient es produeix l’apoptosi ceŀlular, i si l’augment és inferior es produeix un increment de la permeabilitat de la membrana ceŀlular als tractaments de quimioteràpia .

CONCLUSIONS: EVOLUCIÓ DE LA NANOMEDICINA EN ELS PROPERS ANYS

La nanomedicina és un àmbit de gran creixement per a la indústria de tecnologies mèdiques, biotecnologia i farmacèutica (Juanola-Feliu et al., 2011) . Un informe recent dels mercats a set països (els Estats Units, el Japó, Alemanya, França, el Regne Unit, Itàlia i Espanya) elaborat pel BCC Research in-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 131-138

dica que l’any 2010 el mercat de la nanomedicina va arribar als 63 .800 .000 .000 dòlars i que l’any 2011 la xifra fou de 72 .800 .000 .000 dòlars . S’espera que l’any 2016 aquesta xifra arribi als 130 .900 .000 .000 dòlars amb un creixement anual del 12,5 % entre 2011 i 2016 . Per àmbits d’aplicació destaquen les aplicacions en càncer: 25 .200 .000 .000 el 2010 i 28 .000 .000 .000 el 2011, per arribar el 2016 als 46 .700 .000 .000 amb un creixement del 10,8 % anual .

Respecte a la investigació en nanomedicina al món, la figura obtinguda mitjançant el web GoPubMed assenyala el mapa de la investigació mundial en nanomedicina .

Aquesta anàlisi ens porta a destacar que de tots els articles referenciats a la base de dades PubMed sota l’epígraf de nanomedicina, Espanya ocupa la tercera posició mundial darrere dels Estats Units i la Xina . Així mateix Barcelona apareix en segona posició darrere de Boston i per davant de Houston quant a la producció científica en nanomedicina .

Els propers anys seran fonamentals per al desenvolupament de la nanomedicina i la seva utilització tant per millorar la comprensió dels mecanismes fisiològics i biològics de moltes malalties, com de la prevenció, diagnòstic i teràpia (Hamburg, 2012; Sanha et al., 2008; Juliano, 2012) . Iniciatives com la recent aliança Bionanomed de Catalunya (www.bionanomedcat.org) ens han de permetre consolidar-nos com un en-

Figura 4. Mapa de la nanomedicina al món obtinguda a partir del web GoPubMED, http://www.gopubmed.org/ web/gopubmed

torn capdavanter amb projecció internacional en el desenvolupament de la nanomedicina .

BIBLIOGRAFIA

Blanco, E . [et al .] (2011) . «Nanomedicine in cancer therapy: Innovative trends and prospects» . Cancer Sci ., 102: 1247-1252 . «Cancer nanotechnology: opportunities and challenges» (2005) . Nature Review 2005, vol . 5, març, p . 161 .

Chen, Y . [et al .] (2010) . «Targeted nanoparticles deliver siRNA to melanoma» . J. Invest. Dermatol ., 130: 2790-2798 .

Doane, T . L .; Burda, C . (2012) . «The unique role of nanoparticles in nanomedicine: imaging, drug delivery and therapy» . Chem. Soc. Rev ., 41: 2885-2911 . Duncan, R .; Gaspar, R . (2011) . «Nanomedicine(s) under the microscope» . Molecular Pharmaceutics, 8: 2101-2141 .

Hamburg, M . A . (2012) . «FDA’s approach to regulation of products of nanotechnology» . Science, 336: 299 .

Hrkach, J . [et al .] (2012) . «Preclinical development and clinical translation of a PSMA-targeted docetaxel nanoparticle with a differentiated pharmacological profile» . Sci. Transl. Med ., 4: 128ra39 .

Jain, K . K . (2010) . «Advances in the field of nanooncology» . BMC Medicine, 8: 83 .

Juanola-Feliu, E . [et al .] (2011) . «Market challenges facing academic research in commercializing nano-enabled implantable devices for in-vivo biomedical analysis» Technovation, doi:10 1016/ j technovation 2011 09 007

Juliano, R L (2012) «The future of nanomedicine: promises and limitations» Science and Public Policy, 39: 99-104

Kim, B Y S [et al ] (2010) «Nanomedicine» The New England Journal of Medicine, 363: 2434-2443

Lammers, T [et al ] (2011) «Theranostic nanomedicine» Accounts of Chemical Research, 44: 1029-1038

Lee, D E [et al ] (2012) «Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis» Chem. Soc. Rev , 41: 2656-2672

Maier-Hauff, K [et al ] (2011) «Efficacy and safety of intratumoral thermotherapy using magnetic ironoxide nanoparticles combined with external beam radiotherapy on patients with recurrent glioblastoma multiforme» J. Neurooncology, 103: 317-324

Mir, M [et al ] (2009) «Integrated electrochemical

DNA biosensors for lab-on-a-chip devices» . Electrophoresis, 30: 3386-3397 . Namiki, Y . (2010) . «Nanomedicine for cancer: lipidbased nanostructures for drug delivery and monitoring» . Accounts of Chemical Research, 44: 10801093 .

Peng, C . L . [et al .] (2011) . «Multimodal image-guided photothermal therapy mediated by 188re-labeled micelles containing a cyanine-type photosensitizer» . ACS Nano, 5: 5594-5607 .

Samitier, J . [et al .] (2004) . «Nanoelectromechanical system» . A: Nalwa, H . S . [ed .] . Encyclopedia of nanoscience and nanotechnology, vol . 6, p . 643-663 .

Sanha, R . [et al .] (2008) . «Seven challenges for nanomedicine» . Nature Nanotechnology, 3: 242-244 .

Zhang, L . [et al .] (2008) . «Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments» . Clin. Pharmacol. Ther ., 83: 761-769 .

SOBRE L’AUTOR

Josep Samitier i Gomis és nascut a Barcelona el 1960 . Director de l’Institut de Bioenginyeria de Catalunya . Catedràtic d’electrònica de la Facultat de Física de la Universitat de Barcelona . Director del HUBc, campus d’exceŀlència en salut de la UB . Investigador principal del Laboratori de Nanobioenginyeria de l’IBEC . Ha exercit de cap d’estudis d’enginyeria electrònica i director del Departament d’Electrònica, de coordinador del màster d’enginyeria biomèdica, d’avaluador de l’ANEP, AQU i de SISE de titulacions, departaments i centres de recerca . Expert en metodologia d’avaluació de la qualitat universitària . És membre de l’Institut de Nanociència i Nanotecnologia de la UB . Ha dirigit 24 tesis doctorals . És coordinador de la Plataforma Tecnològica Espanyola de Nanomedicina des de la seva fundació . Premi Ciutat de Barcelona l’any 2003 en la categoria d’innovació tecnològica . Ha estat vicerector de Política Internacional i vicerector d’Innovació i Programes Internacionals de Recerca a la UB . Des del 21 d’abril de 2008 fins al novembre de 2008 va ser rector en funcions de la UB.

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 131-138

DOI: 10 .2436/20 .1501 .02 .141

Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed .) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013) , p. 139-151

LES METÀSTASIS O LA CLAU PER VÈNCER EL CÀNCER

Roger R. Gomis

Programa d’Oncologia, Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona, Institut Català de Recerca i d’Estudis Avançats (ICREA)

Adreça per a la correspondència: Roger R . Gomis . Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona . C . de Baldiri i Reixac, 10 . 08028 Barcelona . Telèfon: 934 039 959 . Adreça electrònica: roger.gomis@irbbarcelona.org .

RESUM

En les últimes dècades s’ha observat un increment continuat dels nous casos de càncer a escala mundial . D’aquests pacients, fins a un 20 % desenvolupen formes metastàtiques de la malaltia que en tumors sòlids acabaran causant la mort del malalt . Per tant, la identificació i la introducció de teràpies més efectives per resoldre aquest problema han esdevingut prioritàries . El procés de metàstasi consisteix en una sèrie d’interaccions dinàmiques entre les cèŀlules tumorals i el seu ambient que els permet sortir de l’entorn primari on s’ha desenvolupat la malignitat i establir una lesió distant . El procés de metàstasi s’esdevé de manera no lineal, no és passiu i està ple de sistemes constants, retroalimentats entre les cèŀlules tumorals i les cèŀlules hoste del microambient tumoral . La qüestió que continua pendent és identificar la millor finestra o oportunitat terapèutica, quins gens o vies de senyalització estan implicats en el creixement metastàtic i com podem actuar contra aquestes vies en el context clínic en l’absència de bons marcadors predictius . Per tant, cal donar noves solucions a aquests nous reptes que es plantegen en un camp que està clarament en expansió .

Paraules clau: metàstasi, càncer, càncer de mama, estroma tumoral .

METASTASIS OR THE KEY TO BEAT CANCER

SUMMARY

In the past decades, there has been a constant increase in cancer incidence worldwide . Among those patients, 20% of them will develop metastatic forms of the disease, which in solid tumors will eventually cause patients’ death . To this end, the identification and implementation of more effective therapies to tackle this problem has become a priority . The

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

metastasis process is a multistep process based on a series of dynamic interactions between tumor cells and their environment, allowing them to exit the primary malignant site and develop a distant lesion . The metastatic process occurs in a non-lineal fashion, is not passive and relies on several constant systems, including feedback-loops between tumor cells and the tumor host microenvironment cells . Among the remaining questions in the field, a better understanding of the therapeutic window opportunities and the genes and signaling pathways relevant for the metastatic process and how we can interfere with them in the clinical context in the absence of reliable predictive biomarkers are pending . In summary, new solutions are needed to address the challenges that arise in a field that is clearly in expansion .

Key words: metastasis, cancer, breast cancer, tumor stroma .

INTRODUCCIÓ

En les últimes dècades s’ha observat un increment continuat dels nous casos de càncer a escala mundial . D’aquests pacients, fins a un 20 % desenvolupen formes metastàtiques de la malaltia que en tumors sòlids acabaran causant la mort del malalt . Per tant, la identificació i la introducció de teràpies més efectives per resoldre aquest problema han esdevingut prioritàries . Durant la darrera dècada s’han concentrat grans esforços en el descobriment de gens diana que regulen la metàstasi o actuen com a marcadors del procés . S’han generat diverses firmes gèniques per dividir els diferents tipus de càncer, inclosos els diferents subgrups de cadascun, associats a una resposta clínica concreta . Tanmateix, la rellevància funcional d’aquests gens i el seu paper en aquestes signatures en relació amb l’etiologia de la malaltia o la progressió metastàtica encara romanen en termes generals desconegudes, així com, en particular, les seves aplicacions terapèutiques potencials .

La progressió tumoral cap a la metàstasi es retrata sovint com un procés de diverses etapes en les quals les cèŀlules malignes s’escampen des del tumor d’origen cap als òrgans distants que, finalment, se-

ran colonitzats . Tanmateix, els passos bàsics succeeixen en el context de diferents òrgans, apareixen amb cinètiques distintes i són clínicament gestionats de maneres diferents en funció del tipus de càncer . Per tant, actualment ens trobem davant del repte d’incorporar l’heterogeneïtat biològica del procés clínic en els models d’investigació del procés metastàtic .

Els esdeveniments recents indiquen que els gens que faciliten els processos de metàstasi estan associats funcionalment a l’activació tant de l’estroma local (dintre del tumor) com del distant (per exemple, l’os), alhora que faciliten la progressió tumoral (Erler i Weaver, 2009) . La interacció amb aquest entorn, entre d’altres, pot explicar en les metàstasis l’habilitat de diferents tipus de tumors per colonitzar el mateix o diferents òrgans (Fidler, 2003; Paget, 1889) . Aquest fet ha despertat un gran interès en la comunitat científica per donar resposta a això i tractar d’identificar aquells gens que afavoreixen les metàstasis en òrgans concrets (Kang et al., 2003; Minn et al., 2007; Minn et al., 2005; Yin et al., 2003) . Encara és poc clar com els diferents tumors utilitzen aquests gens per fer metàstasi al mateix òrgan . Endemés alguns tumors tenen un espectre de metàstasi més restringit que d’altres . Per exemple, en càncer de pròstata es

troben majoritàriament restringides a l’os (Edlund et al., 2004) i les del melanoma ocular majoritàriament al fetge (Triozzi et al., 2008) . Una segona dimensió clau en el procés metastàtic és la seva evolució temporal . Així, els adenocarcinomes de mama o pulmó acostumen a colonitzar el mateix tipus d’òrgans; per exemple, l’os, el pulmó, el fetge i el cervell (Hess et al., 2006), encara que el procés temporal de les metàstasis entre els dos tipus de tumors és molt diferent . En el càncer de mama s’observen esdeveniments metastàtics al cap d’anys o dècades de l’esdeveniment primari (Schmidt-Kittler et al., 2003) i, en canvi, en el de pulmó les metàstasis s’observen al cap de poc temps de la diagnosi (Hoffman et al., 2000) . Aquestes observacions clíniques indiquen que la competència de les cèŀlules canceroses per infiltrar-se en els òrgans distants no sempre va acompanyada d’una determinada competència per colonitzar-los . L’espai temporal que s’observa entre la infiltració de l’òrgan i la seva colonització s’ha definit com a període de latència .

El procés de latència metastàtica és un fenomen clínic que ha estat reconegut des de fa molts anys . Aquest fenomen és responsable de la natura indestructible dels processos malignes associats amb els tumors sòlids, atès que els facilita un mecanisme per tal que escapin dels tractaments que curen els tumors primaris detectats des de l’inici . En els últims anys, i amb l’aparició de tractaments menys tòxics i més específics contra les cèŀlules tumorals, que poden ser utilitzats durant períodes més llargs de temps, s’ha introduït el concepte de la teràpia llarga, per tal de prevenir recurrències tardanes del càncer . Simultàniament, els investigadors s’esforcen a definir i conèixer els mecanismes que permeten l’existència de les cèŀlules tumorals en estat latent i que finalment poden tornar a créixer . Ens trobem en una nova era on cal

considerar conceptes que permetin identificar dianes terapèutiques per controlar els processos de latència i potenciar les estratègies clíniques .

EL PROCÉS DE METÀSTASI

El procés de metàstasi consisteix en una sèrie d’interaccions dinàmiques entre les cèŀlules tumorals i el seu ambient que els permet sortir de l’entorn primari on s’ha desenvolupat la malignitat i establir una lesió distant . El procés de metàstasi s’esdevé de manera no lineal, no és passiu i està ple de sistemes constants, retroalimentats entre les cèŀlules tumorals i les cèŀlules hoste del microambient tumoral . Una vegada s’inicia el creixement tumoral, aquest és comparable al que succeeix en un procés de cicatrització crònic pel fet que la proliferació iŀlimitada de les cèllules tumorals desregula l’homeòstasi local, com una situació d’acidosi, d’hipòxia, d’alteració sistèmica i pressió local (Fidler et al., 2007) . En un intent per compensar aquests canvis, l’hoste activa mecanismes de reparació i cicatrització que inclouen la vascularització, per facilitar a la neoplàsia l’accés a nutrients, l’eliminació dels residus i, indirectament, una via d’escapada per a les cèŀlules metastàtiques . Simultàniament, l’estrès físic de les lesions creixents inicia un procés de resposta inflamatòria que mobilitza les cèŀlules derivades del moll de l’os i d’altres leucòcits cap al tumor primari i als òrgans receptors potencials de les metàstasis . Aquesta barreja no natural de cèŀlules crea un microambient reactiu amb deposició d’un ampli espectre de factors de creixement, citocines i proteïnes de matriu extraceŀlular (Liotta i Kohn, 2001) . La inflamació en processos aguts es resol ràpidament . Tanmateix, en un tumor no es produeix estimulant la implicació de

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

les cèŀlules del sistema immunitari, que fracassen en la resposta antitumoral immunitària . La remodelació de la matriu extraceŀlular de l’espai intersticial és necessària entre els càncers invasius (Iacobuzio-Donahue et al., 2002) . L’activació de proteases i oxidoreductases, entre altres, altera la topologia de la matriu extraceŀlular i ajuda en la invasió de la cèŀlula tumoral via l’alliberació de pèptids estimuladors de la migració i de l’exposició de llocs que faciliten l’adhesió i la migració (Werb, 1997) . La combinació de la interacció entre els receptors d’adhesió de les cèŀlules tumorals i la matriu extraceŀlular modificada facilita l’activació de les vies de senyalització intraceŀlular i indueix la invasió a través de l’estroma i, finalment, l’arribada al sistema de circulació limfàtic o sanguini . Una vegada en circulació, les cèŀlules canceroses han de resistir l’estrès físic causat per la pèrdua d’adhesió i les fortes turbulències vasculars abans de poder aferrar-se al llit dels capiŀlars distants . Durant aquest trànsit, les cèŀlules tumorals poden formar agregacions juntament amb plaquetes que les protegeixen de la pressió externa i en faciliten la resposta a gradients de quimiocines (McCarty et al ., 2000; Muller et al ., 2001) . Mitjançant una combinació d’obstrucció física, adhesió a través de contactes complementaris i gradients de quimiocines atractius, el bolus tumoral queda atrapat als capiŀlars dels llocs metastàtics distants . A partir d’aquest punt, les cèŀlules tumorals atrapades poden créixer a la manera d’una metàstasi intravascular (un tumor metastàtic que s’inicia en l’espai intersticial de la vasculatura del teixit diana) o poden reactivar un mecanisme migratori i proteolític per extravasar i colonitzar el teixit . Molts estudis han demostrat que en la majoria de pacients, algunes cèŀlules tumorals tenen la capacitat d’acomplir els passos

descrits anteriorment; tanmateix, moltes altres cèŀlules moriran en poc temps (MacDonald et al., 2002) . Ara bé, la llarga latència entre les primeres intervencions terapèutiques i l’aparició de formes de metàstasi avançades de la malaltia, que representa un comportament típic del càncer de mama positiu per a receptors d’estrògens (ER), demostra que algunes cèŀlules tumorals poden resistir en estat latent durant molts anys o dècades . Per exemple, en un estudi concret una tercera part dels pacients amb càncer de mama sense evidència clínica de la malaltia, que eren examinats entre set i vint-i-dos anys després de la diagnosi, tenen cèŀlules tumorals circulants (CTC) que segueixen en estat quiescent (1-2 cèŀlules per 12 ml de sang) (Uhr i Pantel, 2011) . Aquestes cèŀlules circulants tenen un temps de vida mitjà no superior a les tres hores, la qual cosa suggereix que les cèŀlules tumorals disseminades (DTC) són responsables de propagar lentament aquesta població . La latència tumoral ha estat reconeguda com un fenomen clínic en nombrosos tipus de càncers . Aquest terme ha estat utilitzat de manera laxa durant molts anys per descriure l’estat hipotètic en què les cèŀlules canceroses resten entre el període posterior al tractament del tumor primari, el creixement subsegüent i la recurrència clínica . Un fenomen que és responsable de la naturalesa intractable de moltes malignitats i és el mecanisme pel qual molts càncers són capaços de vèncer els tractaments contra el tumor primari . Per això, els especialistes clínics han intentat actuar contra aquest fenomen allargant els tractaments contra el càncer mitjançant l’ús de les noves teràpies menys tòxiques i més específiques que poden ser usades durant períodes de temps més llargs, i la idea d’allargar les teràpies per tal de prevenir les recurrències ha començat a guanyar predicament . De manera paraŀlela, la recerca ha facili-

tat la definició i la comprensió de la biologia de les cèŀlules canceroses . Entre d’altres, ara podem afirmar que existeix l’estat dorment o latent i el seu creixement subseqüent és el que fa les metàstasis clínicament detectables .

El procés metastàtic implica múltiples etapes i, entre aquestes, algunes de comunes com les descrites anteriorment . Ara bé, els últims d’aquests passos bàsics s’esdevenen en un context propi de diferents òrgans, emergeixen en diferents cinètiques i són gestionats clínicament d’una manera diferent segons el tipus de càncer, la qual cosa ratifica l’heterogeneïtat de la biologia del procés de metàstasi .

Una propietat intrínseca dels diferents tipus de tumors és la seva capacitat per colonitzar un mateix o diferents òrgans . Encara que aquesta habilitat ha estimulat la identificació de gens que faciliten processos de metàstasi específiques de teixit (Paget, 1889), no queda clar si diferents tumors, que colonitzen el mateix teixit, utilitzen els mateixos mediadors . Un altre aspecte important del procés metastàtic és l’evolució temporal d’aquest . Per exemple, els adenocarcinomes de mama o de pulmó típicament colonitzen el mateix ventall d’òrgans, inclosos l’os, el pulmó, el cervell i el fetge . Ara bé, la cinètica de colonització d’ambdós tumors és diferent . El càncer de mama presenta un patró de recurrències que normalment es detecten al cap d’anys o de dècades des de la detecció de la malaltia (SchmidtKittler et al., 2003), mentre que el càncer de pulmó estableix metàstasis mesurables al cap de pocs mesos després de la diagnosi . Per tant, la competència per infiltrar els teixits distants no sempre està lligada a la competència per colonitzar-los . El temps establert entre el procés d’infiltració dels teixits i la colonització és el que coneixem com a latència metastàtica . En resum, la seqüència d’esdeveniments

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

que se succeeixen per colonitzar un òrgan representa la primera dimensió del procés de metàstasi, la cinètica d’aquesta progressió metastàtica la segona, i l’òrgan diana a colonitzar i les seves barreres d’entrada en defineixen la tercera . Les barreres per infiltrar cadascun dels teixits i la composició del seu microambient són únics per a cada òrgan . Per això els passos del procés metastàtic poden ser els mateixos per a tots els tumors, però les metàstasis en diferents teixits requereixen diferents conjunts de funcions específiques per tal d’infiltrar-los i colonitzar-los, les quals poden ser requerides de manera temporal .

La infiltració d’òrgans distants de les cèŀlules canceroses circulants també implica activitats especialitzades que requereixen que les cèŀlules tumorals passin a través de les parets capiŀlars i sobrevisquin en el nou parènquima . Les cèŀlules malignes alliberades del tumor han de ser capaces d’infiltrar els teixits distants i, per tant, han d’explotar funcions que fins aquell moment podien no necessitar . Aquestes funcions poden ser exercides a través de l’adquisició de gens en el tumor primari que poden tenir una funció rellevant en el tumor o només en la metàstasi distant . També en el tumor primari aquests gens poden desenvolupar funcions diferents de les que tindran en el teixit secundari . Per exemple, l’estructura i composició de les parets dels capiŀlars sanguinis i del parènquima subjacent pot ser diferent en funció del teixit metastàtic diana . Per tant, l’expressió de gens concrets en el tumor primari pot ser responsable de les metàstasis de manera específica per a òrgan i esdevenir marcadors que prediguin, en funció de la seva expressió en el tumor primari, una metàstasi específica per a teixit . Finalment, també trobem una tercera categoria de gens que confereixen activitats essencials per a la colonització de determinats òrgans, l’expres-

sió dels quals només és detectable en cèŀlules canceroses que metastatitzen en aquests teixits . La seva expressió accentua la tendència de les cèŀlules disseminades que han superat els múltiples passos, descrits més amunt, de colonitzar un determinat teixit . Un exemple, podria ser l’expressió del factor mobilitzador d’osteoclasts, PTHRP (Kang et al., 2003; Yin et al., 2003), que no dóna cap avantatge a les cèŀlules de càncer de mama en el tumor primari, però facilita l’establiment de metàstasis osteolítiques a l’os . L’expressió d’aquest tipus de gens metastàtics resulta d’alteracions estocàstiques en el context propi de la inestabilitat genòmica de la cèŀlula transformada, i en conseqüència l’expressió d’aquest gen esdevé un avantatge selectiu a les cèŀlules malignes en un microambient particular . El diferent comportament temporal de les metàstasis en els diversos tipus de càncer i poblacions és un fet . La cinètica de la progressió de la malaltia i les distintes barreres fisiològiques dicten la latència entre les etapes d’infiltració i la colonització de la metàstasi . Cada procés clínic té diferents implicacions per a l’evolució selectiva d’òrgan de les poblacions metastàtiques . En càncer de mama positiu per a receptor d’estrògens, en el càncer de pròstata, en el melanoma ocular, la metàstasi es pot manifestar dècades després de l’extirpació de la petita lesió maligna primària . L’absència de recurrència clínica immediata implica que aquestes cèŀlules tumorals no són completament competents per colonitzar els òrgans immediatament després de la infiltració . Un període de latència pot facilitar la futura evolució maligna de la població de cèŀlules metastàtiques disseminades, del seu microambient, i ambdues com a elements necessaris perquè la colonització continuï . En altres tipus de càncer, la metàstasi segueix un curs expansiu molt més ràpid i pliotròpic, que deixa molt poc espai per a la selecció de

poblacions metastàtiques específiques per a teixit, com és el cas del càncer de pulmó, el càncer de pàncrees i altres . En tumors de ràpida progressió, l’adquisició de trets metastàtics en el tumor primari obvia la necessitat d’una adaptació extensiva ulterior en els diferents òrgans distants durant el procés de disseminació . Per exemple, s’estima que en el càncer de còlon la majoria d’alteracions per a la metàstasi són adquirides durant la progressió a l’estadi de carcinoma invasiu, i pocs esdeveniments genètics addicionals són requerits per a la formació de metàstasis distants al fetge . Per tant, els càncers de còlon i recte progressen de manera lenta cap a carcinomes invasius, però de manera molt ràpida des d’aquest estadi fins a la fase metastàtica .

RELACIÓ AMB L’HOSTE

La metàstasi és un procés amb múltiples etapes, incloses interaccions dinàmiques entre les cèŀlules i les cèŀlules hoste tumorals . Encara que aquest procés es pot definir de manera lineal, aquest és clarament no lineal, no és passiu i està integrat per una sèrie de processos de retroalimentació entre les cèŀlules tumorals i les cèŀlules hoste pròpies del microambient tumoral . Les cèŀlules tumorals no funcionen com a unitats autònomes; al contrari, requereixen interaccions dinàmiques amb l’estroma per créixer i fer metàstasi . L’estroma inclou diferents tipus de cèŀlules hoste que resideixen en el microambient del tumor, i que inclouen cèŀlules endotelials dels sistemes vascular i limfàtic, fibroblasts, cèŀlules neuronals i leucòcits . Morfològicament, l’estroma que infiltra els tumors s’ha definit com a desmoplàsia . Les cèŀlules estromàtiques es troben barrejades i disposades en un complex de proteïnes fibriŀlars i glicoproteïnes que formen la matriu extraceŀlu-

lar . Les cèŀlules del tumor són capaces d’activar els components ceŀlulars estromàtics, la qual cosa resulta en un procés d’inflamació crònic . L’alliberament de citocines i proteases de les cèŀlules estromàtiques activades promou el creixement dels tumors i ajuda en el procés de metàstasi . Una vegada les cèŀlules tumorals han metastatitzat, desenvolupen resistència a les quimioteràpies convencionals, i amb això contribueixen a la pobre prognosi en el cas dels pacients amb malaltia disseminada .

Quan es pensa en les noves teràpies és, doncs, pertinent considerar les cèŀlules hoste més enllà de les cèŀlules tumorals, ja que és menys probable que els teixits hoste desenvolupin resistència als fàrmacs, a causa de la seva estabilitat genòmica . A mesura que el nostre coneixement de la contribució estromàtica creix (Calon et al., 2012), els gens diana per a la teràpia, propis de l’estroma, comencen a ser aparents, però cal tenir present que probablement seran diferents del tumor primari i de les metàstasis als òrgans distants .

Angiogènesi i limfoangiogènesi

El requisit dels processos d’angiogènesi i limfoangiogènesi per promoure el creixement tumoral i facilitar una ruta que n’afavoreixi la disseminació és ben coneguda i ha estat objecte de molts estudis (Carmeliet i Jain, 2011) . Actualment tenim molts compostos farmacèutics l’eficàcia dels quals es fonamenta en el procés d’angiogènesi —bevacizumab, etc . (Folkman, 2007) . L’objectiu d’aquests fàrmacs és bloquejar el procés que coneixem com a angiogenic switch, pel qual el tumor és capaç d’activar els processos de neovascularització d’una massa que altrament esdevindria necròtica i indirectament facilitaria el creixement tumoral descontrolat i la progressió i disseminació .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

Fibroblasts

Els fibroblasts són el tipus ceŀlular més representatiu implicat en el dipòsit de proteïnes de matriu extraceŀlular i de proteases que les poden remodelar . Com a tal, els fibroblasts tenen un paper prominent en els processos de cicatrització, on s’activen per assistir a la reparació de l’àrea lesionada . Molts estudis han demostrat que els fibroblasts o els precursors de les cèllules mesenquimàtiques activades faciliten el procés de progressió tumoral i metàstasi . Per exemple, la signatura genètica derivada dels gens de resposta al sèrum en fibroblasts pot predir el comportament clínic dels pacients amb un tumor de mama (Chang et al., 2005) o de còlon (Calon et al., 2012) . Per tant, els fibroblasts poden ser una bona diana per a la teràpia, tot i que els nostres rudimentaris coneixements d’aquests i dels factors involucrats en la seva relació amb les cèŀlules tumorals encara són una limitació per al desenvolupament .

Cèŀlules del sistema immunitari

Inicialment es va assumir que les cèllules del sistema immunitari, incloses les cèŀlules inflamatòries, com els monòcits i macròfags, tenien un paper com a agents antitumorals . Tanmateix, encara que les cèŀlules T CD4+ i CD8+ i les cèŀlules NK (natural killers) tenen activitat antitumoral, moltes altres cèŀlules del sistema immunitari tenen activitat promotora del creixement tumoral . De fet, molts tipus de càncer (per exemple, el d’estómac o cèrvix) són causats en gran mesura per una infecció crònica i per la inflamació que l’afecta . Monòcits, neutròfils, cèŀlules T regulatòries i cèŀlules supressores, derivades mieloides, són atretes als tumors, on segreguen diferents citocines que activen el creixement tu-

moral i suprimeixen l’activitat antitumoral d’altres cèŀlules immunitàries com els limfòcits T citotòxics (Coussens i Werb, 2002) . De fet, hi ha molts tipus de leucòcits que són necessaris en tots els passos de la progressió tumoral, des de la invasió, la supervivència en circulació i la colonització de nous òrgans distants (Erez i Coussens, 2011) .

El nínxol premetastàtic

Hi ha cada vegada més evidències que suggereixen que les cèŀlules derivades del moll de l’os tenen un paper en la promoció de la metàstasi via l’establiment del que coneixem com el nínxol premetastàtic . Diferents estudis recents han reforçat el concepte que determinades línies ceŀlulars de l’hoste, en resposta a factors segregats pel tumor primari, tenen el potencial d’establir-se anticipadament en els llocs de metàstasi i creen un microambient receptiu per a les DTC (Erler i Weaver, 2009; Kaplan et al., 2005) i que factors derivats de tumors com el VEGFA, el PGF, el TNF, el TGFb i la lisil-oxidasa estimulen l’expressió de proteïnes com la S100A8, S100A9, MMP9 i la fibronectina en teixits distants com el pulmó, i això afavoreix l’atracció de les cèllules progenitores hematopoètiques i mieloides CD11b+ de la meduŀla òssia . Les cèllules tumorals poden activar l’expressió de CCL17 of CCL21 en el pulmons de manera anticipada per facilitar l’atracció de les cèllules immunitàries i tumorals a través de la quimiotaxi ajudada pel receptor CXCR4 (DD73) .

TERÀPIES

CONTRA EL CÀNCER METASTÀTIC: CÀNCER DE MAMA

Les estratègies principals per tractar el

càncer metastàtic es focalitzen a atacar el tumor en diferents etapes de la seva progressió . Més enllà de la resecció mitjançant cirurgia, les teràpies les podem classificar d’ampli espectre o específiques de diana i en alguns pacients aquestes són efectives . Per continuar la discussió ens centrarem en el càncer de mama .

Les teràpies d’ampli espectre (per exemple la quimioteràpia) són dissenyades per tal de prevenir el recreixement del tumor, una vegada extirpat, mitjançant la mort de les cèŀlules que es divideixen activament, i, per exemple, són l’única teràpia sistèmica possible en determinats tipus de càncer de mama, com és el cas dels tipus triple negatiu (ER, PR i HER2 negatius), per als quals les teràpies contra una diana no existeixen . L’ús d’aquest tipus de teràpia és efectiu, com ho demostra l’increment en un 15 % que s’observa en l’índex de supervivència dels pacients tractats amb aquesta teràpia en comparació amb els no tractats . Ara bé, les metàstasis encara ocorren en un grup rellevant de pacients . Això indica que aquests fàrmacs ajuden a prolongar la supervivència dels pacients de càncer de mama, però encara no tenen cap capacitat de prevenir metàstasis secundàries d’una manera sistemàtica . L’èxit limitat d’aquestes teràpies contra la proliferació per prevenir les metàstasis es pot explicar per l’habilitat de les cèŀlules metastàtiques de mantenir-se latents o en estat dorment en lloc de fer metàstasis distants, i esquiven així el principi terapèutic del tractament .

Diverses són les oportunitats potencials, terapèutiques i específiques d’una diana molecular descrites en els últims anys . Algunes d’aquestes dianes que faciliten la invasió i la intravasació estan presents en el tumor primari; en canvi, d’altres dianes — moltes relacionades amb l’estroma— estan presents en els llocs tumorals secundaris . Actualment les úniques teràpies de càncer

específiques de cèŀlula que s’utilitzen en la rutina clínica són contra el receptor d’estrogen (ER), contra el factor de creixement epidèrmic 2 (ERBB2 o també conegut com a HER2) i contra l’aromatasa . Endemés, hi ha diverses teràpies contra línies ceŀlulars de l’estroma en desenvolupament que poden bloquejar la dispersió del tumor i que en controlen la metàstasi . En són un exemple el bevacizumab (que uneix el VEGF), que bloqueja l’angiogènesi del tumor primari i prevé la disseminació, o el denosumab (que uneix el lligand del receptor activat per NF-kB), que s’ha mostrat com el fàrmac més potent en el control de processos metastàtics a l’os àmpliament utilitzat en la pràctica clínica . D’altres fàrmacs es troben en aquests moments en desenvolupament preclínic o en etapes primerenques d’assajos clínics, i és ben cert que ens trobem en una època prometedora per l’existència d’una fornada de nous compostos amb l’objectiu de controlar la disseminació i l’expansió de la malaltia metastàtica . La inhibició de la poli-ADP-ribosa-polimerasa (PARP) representa una altra diana prometedora . Fins avui, s’ha demostrat efectiva en un petit grup de pacients de càncer de mama amb mutacions de la proteïna tipus 1 (BRCA1) o en la BRCA2 (Iglehart i Silver, 2009) . Cal tenir present que aquest tipus de mutacions són freqüents en els pacients amb un fenotip triple negatiu . Tanmateix, en els pacients triple negatiu que no tenen aquesta mutació l’eficàcia d’aquests inhibidors no és clara, ni la seva combinació amb altres agents citotòxics (Gelmon et al., 2011) . Per tot plegat, aquest darrer grup de pacients darrerament s’ha convertit en un àmbit molt actiu d’investigació .

LLIÇONS APRESES DE LES TERÀPIES DIRIGIDES EN CÀNCER I METÀSTASI

També apareixen múltiples teràpies prometedores o se n’estan provant d’altres en nous assajos clínics . Per desgràcia l’eficàcia de molts d’aquests agents s’ha demostrat només en el tumor primari; en canvi la seva utilitat en el càncer metastàtic és limitada . Cal, doncs, identificar aquells pacients que podran beneficiar-se de tractaments farmacològics específics per a dianes moleculars a llarg termini si ens volem assegurar que siguin efectius més enllà del tumor primari . Per descobrir noves dianes moleculars o utilitzar teràpies existents per prevenir el creixement de tumors metastàtics en càncer de mama, serà imperatiu que es conegui, a més de la biologia del procés de metàstasi, les diferències entre aquest i el que és propi de la iniciació tumoral . Avui dia, és clar que les anàlisis dels tumors primaris no han estat suficients per predir i monitorar els beneficis de les teràpies específiques de metàstasi . Durant el procés de metàstasi, pot aparèixer una població de cèŀlules que tenen un genotip i un fenotip diferent d’aquelles del tumor primari (Welch, 2004) . Per exemple, cèŀlules DTC que poden residir al moll de l’os i expressar menys anormalitats que aquelles que podem trobar en el tumor del qual deriven (Poplawski et al., 2010) . Per això és important d’assegurar que qualsevol diana terapèutica que seleccionem està basada en característiques del tumor primari presents en les metàstasis finals o en les DTC, i que és requerida per al creixement metastàtic, així com per al procés de latència (propi del context de tractament adjuvant) .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

CAP A ON ANEM?

Atesa la relativa facilitat d’accedir al seu perfil d’expressió i monitorar-ne el creixement, la majoria de les teràpies moleculars són, normalment, més efectives contra els tumors primaris que contra les metàstasis . La qüestió que continua pendent és identificar la millor finestra o oportunitat terapèutica, quins gens o vies de senyalització estan implicats en el creixement metastàtic i com podem actuar contra aquestes vies en el context clínic en l’absència de bons marcadors predictius . En funció del paper que tinguin en la cascada metastàtica, les proteïnes i els gens que les codifiquen són catalogats en diferents grups, segons si actuen en processos d’iniciació, de progressió o d’estímul del creixement, tal com ja hem establert a l’inici d’aquest assaig . Els gens importants en etapes primerenques del procés, quan les cèŀlules no han sortit del tumor primari, no són dianes vàlides per bloquejar la metàstasi si no tenen una altra funció més tardana i pròpia del procés metastàtic . Cal pensar que l’eliminació del tumor feta pel cirurgià farà inútil qualsevol tractament contra aquest escenari . En canvi, sí que poden ser una bona diana aquells gens que fomenten la infiltració, supervivència i la colonització dels òrgans distants encara que s’expressin en el tumor primari, i per tant, puguin esdevenir marcadors predictius de metàstasis específiques de teixit (Nguyen et al., 2009) .

En l’altre extrem trobem gens que són específics del procés de metàstasi en un teixit concret . Molts d’aquests gens no són necessaris en el context del tumor primari i per tant no contribueixen a la predicció dels esdeveniments, ni tampoc no formen part de les signatures que tan àmpliament han estat publicades a la bibliografia . Un bon exemple d’aquest tipus de gens pot ser la

proteïna relacionada amb l’hormona paratiroïdal (PTHrP) . Aquesta hormona està expressada en metàstasi a l’os, on estimula la reabsorció d’aquest i el creixement tumoral . En canvi, la seva expressió en tumors primaris està associada a una bona prognosi (Fleming et al., 2009) .

La rellevància dels gens i els corresponents marcadors predictius depenen de manera primordial del context del tractament clínic . En el context neoadjuvant els gens de progressió metastàtica són els més indicats com a diana, especialment pel fet que el tumor encara es troba present i sobretot en el cas dels gens que poden tenir un paper clau en la supervivència de les DTC . La capacitat d’eliminar les cèŀlules DTC latents o, almenys, de poder-les mantenir en un estat de latència indefinida, seria un gran avenç amb vista a prevenir el creixement dels tumors després dels tractaments intensius, a fi que les DTC no proliferin ni, per tant, escapin probablement de les quimioteràpies convencionals . A la pràctica, és important utilitzar gens diana que estiguin involucrats en la progressió tumoral i en el creixement metastàtic distant . Per exemple, l’os és un lloc recurrent de metàstasi en els casos de càncer de mama . El bloqueig de funcions pròpies de la interacció de les cèŀlules tumorals amb aquest teixit podria prevenir-ne el creixement en l’os . Ara bé, caldria veure si això també evita el creixement de metàstasis secundàries en altres teixits tous . Per exemple, les CTC disseminades des de l’os podrien accedir a un fenotip metastàtic específic d’un altre teixit i acabar-lo colonitzant . En aquest cas, com que la majoria de les metàstasis no s’operen, disposar d’un mecanisme per mesurar-ne l’evolució fóra un pas endavant . Aquest escenari és útil en càncers amb una llarga latència (anys o fins i tot dècades), però cal recordar que en alguns càncers, com els de pulmó o còlon,

amb una latència curta en què la metàstasi succeeix mesos o pocs anys després de la detecció del tumor primari, l’efectivitat es redueix . En aquests últims, la relació li neal que es pot establir entre el tumor primari i la metàstasi permet de pensar que l’ús de tècniques per identificar els patrons genètics dels tumors pot servir per revelar dianes terapèutiques capaces de bloquejar les metàstasis . En tumors amb llarga latència, l’ús de cèŀlules circulants (CTC) o disseminades (DTC) pot esdevenir un marcador pronòstic important (REF Uhr Pantel) .

La caracterització molecular de les DTC i la seva correlació amb la prognosi pot oferir una important informació mecanística de la progressió metastàtica i permetre el desenvolupament de noves teràpies moleculars . Per això cal que es facin estudis a gran escala per investigar la biologia de les micrometàstasis i així poder identificar noves dianes terapèutiques, capaces de prevenir el creixement metastàtic .

CONCLUSIONS

Si volem enfrontar-nos al repte que suposa desenvolupar noves teràpies per controlar i evitar els processos metastàtics és clau el fet de tenir una comprensió detallada de com i on s’adquireixen o s’activen els gens que afavoreixen la progressió metastàtica . Entre els grans esculls que encara hi ha amb vista a entendre el procés biològic de la metàstasi hi ha la formació dels nínxols premetastàtics i el concepte de latència metastàtica . Aquest darrer és decisiu per entendre com pot ser que s’observi una metàstasi en un pacient que va patir un càncer de mama fa més de vint anys . L’ús de les teràpies actuals i de les noves que puguin sorgir requereix un monitoratge més efectiu, el qual probablement s’assolirà mesurant l’existència de CTC en pacients in-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

dividuals al principi del tractament, i per mitjà de l’aplicació en una sèrie de mesures ràpides de funcionament i, del canvi, en cas que fos necessari . Tanmateix, és molt important que es tingui clar que les estratègies clíniques utilitzades per a l’aprovació de fàrmacs actuals només són útils per a molècules que actuen en el tumor primari, però no ho són a l’hora de tractar o prevenir les metàstasis . Per tant, caldrà donar noves solucions a aquests nous reptes que es plantegen en un camp que està clarament en expansió .

BIBLIOGRAFIA

Calon, A . [et al .] (2012) . «Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation» . Cancer Cell, 22: 571584 . Carmeliet, P.; Jain, R . K . (2011) . «Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis» . Nature, 473: 298-307 .

Chang, H . Y . [et al .] (2005) . «Robustness, scalability, and integration of a wound-response gene expression signature in predicting breast cancer survival» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 3738-3743 .

Coussens, L . M .; Werb, Z . (2002) . «Inflammation and cancer» . Nature, 420: 860-867 .

Edlund, M .; Sung, S . Y .; Chung, L . W . (2004) . «Modulation of prostate cancer growth in bone microenvironments» J. Cell. Biochem , 91: 686-705

Erez, N ; Coussens, L M (2011) «Leukocytes as paracrine regulators of metastasis and determinants of organ-specific colonization» Int. J. Cancer, 128: 2536-2544

Erler, J T ; Weaver, V M (2009) «Three-dimensional context regulation of metastasis» Clin. Exp. Metastasis, 26: 35-49

Fidler, I J (2003) «The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited» Nat. Rev. Cancer, 3: 453-458

Fidler, I J ; Kim, S J ; Langley, R R (2007) «The role of the organ microenvironment in the biology and therapy of cancer metastasis» J. Cell Biochem , 101: 927-936

Fleming, N I ; Trivett, M K ; George, J ; Slavin, J L ; Murray, W K ; Moseley, J M ; Anderson, R L ; Thomas, D M (2009) «Parathyroid hormone-re -

lated protein protects against mammary tumor emergence and is associated with monocyte infiltration in ductal ca rc inoma in situ» . Cancer Res ., 69: 7473-7479 .

Folkman, J . (2007) . «Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery?» Nat . Rev. Drug. Discov ., 6: 273-286 .

Gelmon, K . A . [et al .] (2011) . «Olaparib in patients with recurrent high-grade serous or poorly differentiated ovarian carcinoma or triple-negative breast cancer: a phase 2, multicentre, open-label, nonrandomised study» . Lancet Oncol ., 12: 852-861 . Hess, K . R .; Varadhachary, G . R .; Taylor, S . H .; Wei, W .; Raber, M . N .; Lenzi, R .; Abbruzzese, J . L . (2006) . «Metastatic patterns in adenocarcinoma» . Cancer, 106: 1624-1633 .

Hoffman, P. C .; Mauer, A . M .; Vokes, E . E . (2000) . «Lung cancer» . Lancet, 355: 479-485 .

Iacobuzio-Donahue, C . A .; Argani, P.; Hempen, P. M .; Jones, J .; Kern, S . E . (2002) . «The desmoplastic response to infiltrating breast carcinoma: gene expression at the site of primary invasion and implications for comparisons between tumor types» . Cancer Res ., 62: 5351-5357 .

Iglehart, J . D .; Silver, D . P. (2009) . «Synthetic lethality—a new direction in cancer-drug development» . N. Engl. J. Med ., 361: 189-191 .

Kang, Y .; Siegel, P. M .; Shu, W .; Drobnjak, M .; Kakonen, S . M .; Cordon-Cardo, C .; Guise, T . A .; Massague, J . (2003) . «A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone» . Cancer Cell, 3: 537-549 .

Kaplan, R . N . [et al .] (2005) . «VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche» . Nature, 438: 820-827 .

Liotta, L A ; Kohn, E C (2001) «The microenvironment of the tumour-host interface» Nature, 411: 375-379

MacDonald, I C ; Groom, A C ; Chambers, A F (2002) «Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models» Bioessays, 24: 885-893

McCarty, O J ; Mousa, S A ; Bray, P F ; Konstantopoulos, K (2000) «Immobilized platelets support human colon carcinoma cell tethering, rolling, and firm adhesion under dynamic flow conditions» Blood, 96: 1789-1797

Minn, A J [et al ] (2007) «Lung metastasis genes couple breast tumor size and metastatic spread» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 6740-6745

Minn, A J ; Gupta, G P ; Siegel, P M ; Bos, P D ; Shu, W ; Giri, D D ; Viale, A ; Olshen, A B ; Gerald, W L ; Massague, J (2005) «Genes that mediate breast cancer metastasis to lung» Nature, 436: 518-524

Muller, A . [et al .] (2001) . «Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis» . Nature, 410: 50-56 . Nguyen, D . X .; Bos, P. D .; Massague, J . (2009) . «Metastasis: from dissemination to organ- specific colonization» . Nat. Rev. Cancer, 9: 274-284 .

Paget, S . (1889) . «The distribution of secondary growths in cancer of the breast» . Lancet, 1: 571-573 .

Poplawski, A . B . [et al .] (2010) . «Frequent genetic differences between matched primary and metastatic breast cancer provide an approach to identification of biomarkers for disease progression» . Eur. J. Hum. Genet ., 18: 560-568 .

Schmidt-Kittler, O . [et al .] (2003) . «From latent disseminated cells to overt metastasis: genetic analysis of systemic breast cancer progression» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 7737-7742 . Triozzi, P. L .; Eng, C .; Singh, A . D . (2008) . «Targeted therapy for uveal melanoma» . Cancer Treat. Rev ., 34: 247-258 .

Uhr, J . W .; Pantel, K . (2011) . «Controversies in clinical cancer dormancy» . Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 108: 12396-12400 . Welch, D . R . (2004) . «Microarrays bring new insights into understanding of breast cancer metastasis to bone» . Breast Cancer Res ., 6: 61-64 . Werb, Z . (1997) . «ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology» . Cell, 91: 439-442 . Yin, J . J .; Mohammad, K . S .; Kakonen, S . M .; Harris, S .; Wu-Wong, J . R .; Wessale, J . L .; Padley, R . J .; Garrett, I . R .; Chirgwin, J . M .; Guise, T . A . (2003) . «A causal role for endothelin-1 in the pathogenesis of osteoblastic bone metastases» . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 10954-10959 .

SOBRE L’AUTOR

Roger R. Gomis dirigeix des del 2007 la seva pròpia línia de recerca a l’Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB) com a investigador i professor de la Institució catalana de Recerca i Estudis Agraris (ICREA) . Mogut pel seu interès en el problema de la metàstasi, causa del 90 % de les morts per càncers sòlids, va abraçar la possibilitat de crear un laboratori multidisciplinari dedicat a la recerca de la metàstasi a l’IRB Barcelona . Utilitzant noves metodologies que va desenvolupar durant la se-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

va estada postdoctoral al Memorial SloanKettering Cancer Center (MSKCC, EUA) . El treball de Roger Gomis persegueix la comprensió dels mecanismes moleculars i genètics de les metàstasis . En particular, Roger Gomis es focalitza en la identificació i la validació funcional de gens i mecanismes que faciliten la colonització de llocs metastàtics clínicament rellevants de les cèŀlules de càncer de mama i la seva organització en pautes coordinades . Part dels seus estudis inicials a Catalunya deriven dels seus treballs anteriors en el camp del TGFβ . En concret, dedica amplis esforços a l’anàlisi del programa citostàtic del TGFβ i la seva evasió en el càncer de mama metastàtic . Els seus treballs mostren com canvis en les isoformes de factor de transcripció C/EBPβ són clau per entendre el canvi de la resposta ceŀlular al TGFβ, que facilita l’evasió de la parada de cicle ceŀlular induïda per la citocina, així com l’evasió de processos de control de la progressió tumoral com la senescència induïda per oncogens . L’aprofundiment en aquesta temàtica va permetre mostrar com la perversió de l’ús del TGFβ en el tumor primari és clau per explicar

mecanismes de metàstasi com l’extravasació en el pulmó . Actualment, la seva recerca es concentra en l’estudi dels processos de metàstasis específiques de teixit del càncer de mama i colon, així com en els processos de latència metastàtica . Tècnicament, Roger Gomis aplica una aproximació científica àmplia i diversa al problema: combina models ceŀlulars in vitro, anàlisis bioinformàtiques, bioquímica, i biologia molecular amb tècniques de bioimatge en models animals . També té una vasta experiència en l’anàlisi de perfils d’expressió gènica i la comparació de poblacions metastàtiques, canceroses i sanes, així com en la purificació i caracterització de poblacions de cèŀlules metastàtiques de càncer de mama . Conceptualment, aquesta recerca s’aixeca en la confluència entre les àrees de la biologia i la genètica del càncer . A causa de la naturalesa clínica del seu projecte, el seu grup té estrets lligams amb diversos oncòlegs clínics . Aquesta aproximació innovadora del laboratori per entendre la metàstasi del càncer de mama ha permès progressos importants per desemmascarar els mecanismes que la dirigeixen .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 139-151

DOI: 10 2436/20 1501 02 142 Les malalties del segle xxi ISSN (paper): 0212-3037 (Jordi Barquinero i Jaume Reventós, ed ) http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB

Treballs de la SCB. Vol. 64 (2013), p. 153-164

BIOMARCADORS DE DIAGNÒSTIC, PRONÒSTIC I PREDICCIÓ DE RESPOSTA A TRACTAMENTS ONCOLÒGICS

Marina Rigau, Mireia Olivan, Marta Llauradó, Eva Colás, Andreas Doll i Jaume Reventós

Institut de Recerca Vall d’Hebron, Departament d’Oncologia Translacional i Pediàtrica

Adreça per a la correspondència: Jaume Reventós . Institut de Recerca Vall d’Hebron . Edifici Collserola, Laboratori 209 . Pg . de la Vall d’Hebron, 119-120 . Barcelona 08035 . Tel .: 934 894 052 . Adreça electrònica: jaume.reventos@vhir.org.

RESUM

La necessitat d’identificar nous biomarcadors que aportin una millora significativa del diagnòstic, pronòstic i del seguiment de teràpia de moltes malalties fa que avui dia la cerca de nous biomarcadors sigui un camp de la ciència increïblement explorat . Alhora, l’avenç tecnològic en el camp de la biomedicina ha fet que avui, més que mai, el nombre de nous candidats a biomarcadors hagi crescut de manera exponencial . No obstant això, en els últims anys, tot i l’elevat nombre de publicacions en aquest àmbit, només uns pocs marcadors han arribat a ser emprats en la pràctica clínica . Això es deu principalment a dues raons: els biomarcadors validats no compleixen amb les exigències de la clínica, i la fallida de molts d’aquests en la llarga i feixuga etapa de validació . El nou pipeline de cerca de biomarcadors, que afegeix etapes intermèdies en aquest procés, comporta que el percentatge d’èxit millori significativament; dit en altres paraules, que les possibilitats que aquestes noves troballes siguin incorporades a la rutina hospitalària i millorin la pràctica clínica siguin més elevades . Aquesta millora en el diagnòstic, pronòstic i seguiment de teràpia, que cada vegada més és específica del pacient que pateix la malaltia, fa que pas a pas ens trobem més a prop del que es coneix com a medicina personalitzada .

Paraules clau: biomarcador, biofluid, diagnòstic, pronòstic i seguiment de teràpia .

BIOMARKERS OF DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND TARGETED THERAPY IN ONCOLOGY

SUMMARY

Better biomarkers are urgently needed to improve diagnosis, prognosis, and targeted

R ebut: 26/02/2013. Acceptat: 03/06/2013.

therapy across a wide range of diseases . Currently, scientists are moving forward to solve this problem . New developments in research help to discover many more biomarkers than ever before . However, although the number of articles that have been published in this area is increasing, only few biomarkers have been implemented in the clinical practice . This is mainly due to two reasons: biomarkers fail to meet the demands of the clinic; and false discoveries fail during the long way that represents the validation phases . The new biomarker pipeline, which currently includes new phases in the middle of the process, has significantly increased the percentage of success . In other words, the chances that the new findings are incorporated into routine clinical practice and improve the patient care are higher than before . This improvement in diagnosis, prognosis and targeted therapy, which is increasingly more specific for each patient who suffers a certain disease, brings us step by step closer to what is known as personalized medicine . Key words: biomarker, biofluid, diagnosis, prognosis and target therapy .

QUÈ ÉS UN BIOMARCADOR?

L’Institut Nacional del Càncer defineix el concepte biomarcador com a ‘una molècula biològica que es pot trobar a la sang, en fluids biològics o en teixits, la presència o absència de la qual és un signe d’un procés normal o anòmal o bé d’una condició de malaltia’. Alhora, un biomarcador ha de poder ser mesurat de manera objectiva com un indicador d’un estat, procés, progrés de malaltia o de resposta a una determinada teràpia (Biomarkers Definition Working Group, 2001) .

Els biomarcadors poden agafar diferents formes (DNA, RNA, micro-RNA, proteïna, etc .), i conseqüentment, hi ha un ampli ventall de tecnologies que permeten el descobriment d’aquestes molècules . Clàssicament, els estudis de transcriptòmica i metilació han estat els més emprats; no obstant això, avui dia, fruit del gran creixement tecnològic al voltant de totes les «òmiques», la utilització de tècniques d’elevat rendiment, com ara la genòmica, transcriptòmica, proteòmica, metabolòmica, etc ., permeten dur a terme anàlisis molt sofisticades amb mostres molt complexes, i alhora, incrementen les possibilitats de cerca de nous biomarcadors .

El descobriment de nous biomarcadors es basa en la comparació d’un estat fisiològic concret, d’un fenotip o de les diferències entre casos i controls per a una malaltia concreta (Gerszten i Wang, 2008) . D’aquests mètodes, el més utilitzat és la comparació entre mostres procedents de pacients cas i control; per tant, les molècules que presentin diferències estadísticament significatives capaces d’identificar i prioritzar la malaltia seran considerades biomarcadors potencials . Teòricament cada malaltia ha de poder ser detectada i caracteritzada per un biomarcador únic . No obstant això, atesa l’heterogeneïtat i multifocalitat de les malalties, avui dia hi ha la tendència de cercar panells de biomarcadors sobreexpressats o infraexpressats que difereixin entre l’estat normal i malalt (Boja et al., 2010; Anderson, 2005) .

Una de les qüestions clau en l’estudi de biomarcadors és el tipus i accessibilitat d’una matriu d’alta qualitat biològica, la mostra . Els experiments clàssics de cerca de biomarcadors utilitzen els teixits afectats mateixos; no obstant això, l’obtenció d’aquests és sovint complicada i limitant . Avui dia hi ha una tendència envers la utilització de biofluids proximals als òrgans afectats, que també poden proporcionar in-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

formació valuosa de la malaltia en qüestió, i alhora, representen un sistema no invasiu per detectar-los . La sang és el fluid biològic més utilitzat, encara que n’hi ha d’altres, com ara l’orina, la saliva, els aspirats uterins, etc . Per contra, l’elevada complexitat d’aquest tipus de mostres, les quals sovint presenten rangs dinàmics molt elevats, elevada heterogeneïtat, una baixa concentració de les molècules d’interès, etc ., fa que la utilització sigui encara avui dia limitada . És per això que en la cerca de biomarcadors, els factors preanalítics, com ara la recollida, el processament, l’emmagatzematge i la distribució de les mostres biològiques, tinguin un paper molt important . La planificació convencional per a la cerca de nous biomarcadors implica una etapa de descobriment en una cohort reduïda i controlada de mostres, seguida d’una etapa de validació en una cohort més àmplia de mostres, per arribar finalment a l’aplicació clínica . Malgrat l’elevat interès i la gran inversió en aquest camp, pocs biomarcadors nous s’han introduït amb èxit en la pràctica clínica (Gutman i Kessler, 2006) . Les principals raons d’aquest fracàs són el llarg i difícil camí que hi ha entre la fase de descobriment del biomarcador candidat fins a arribar a l’assaig clínic en què aquest es valida (Rifai et al., 2006) . En els últims anys s’ha plantejat una nova planificació per a la cerca de nous biomarcadors, que representa una millora sobre l’anterior en termes d’èxit, i que es defineix per seguir les etapes que es detallen a continuació (vegeu la figura 1) . a) El procés s’inicia amb l’etapa de descobriment, que és el pas inicial per analitzar semiquantitativament el contingut molecular de les mostres biològiques per tal d’identificar, seleccionar i prioritzar aquells biomarcadors relacionats amb la malaltia (Boja et al., 2010) . Aquesta etapa pot emprar diferents sistemes model (models in vitro o

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

in vivo) o una varietat reduïda de mostres humanes, com ara teixits, biofluids, etc ., i en general, comprèn una comparació binària entre els estats de malaltia i no malaltia (control), considerant com a factors d’exclusió, entre d’altres, la presència d’estats patològics diferents a l’estudiat en cada cas (Rifai et al., 2006) . El producte de la fase de descobriment consisteix en una llista llarga de candidats a biomarcadors, expressats diferencialment, que presenten una taxa de fals descobriment molt elevada, és a dir, que molts no superaran les fases posteriors del procés de confirmació (Rifai et al., 2006) . En general, aquests estudis se centren en un sol tipus de comparació, mitjançant un únic tipus de tecnologia, però és també interessant fer comparacions a diferents nivells (RNA, proteïna, etc .) de la mateixa mostra biològica, ja que genera una informació complementària que ajuda molt en la selecció dels millors candidats . Aquesta «llista de possibles biomarcadors», alhora, pot ser complementada amb candidats procedents de la bibliografia . Hi ha bases de dades contrastades i sense contrastar d’experiments de la fase de descobriment ja publicats que amaguen llistes enormes d’aspirants a biomarcadors que poden afegir-se en aquest punt a les fases següents de validació dels candidats .

b) El pas següent, l’etapa de qualificació, s’utilitza per confirmar que els candidats a biomarcadors poden ser detectats utilitzant un mètode objectiu alternatiu, i alhora per confirmar l’expressió diferencial en una comparació simplificada entre mostres cas i control (Rifai et al., 2006) .

c) En la fase següent, l’etapa de verificació, l’anàlisi s’estén a un nombre més gran de mostres . L’etapa de verificació es defineix com el pont entre el descobriment i la validació, i és el procés de comprovació dels biomarcadors candidats seleccionats en la fase de descobriment . Per a aquesta etapa

s’utilitzen mètodes analítics robustos, reproduïbles i quantitatius (com per exemple, la PCR quantitativa —qPCR— per a l’anàlisi de RNA), que permeten una anàlisi dirigida dels biomarcadors candidats en un nombre de mostres amb rellevància clínica . Els biomarcadors acreditats que superin aquesta etapa es consideren biomarcadors verificats, que són de gran valor per a la translació a estudis de validació clínica a gran escala (Boja et al., 2010) . d ) Finalment, l’etapa de validació, que representa una avaluació exhaustiva dels biomarcadors candidats, i que en permetrà la incorporació a la pràctica clínica . Una vegada s’han identificat uns biomarcadors candidats, els quals han estat verificats, aquests han de ser avaluats per a una indicació clínica específica . Idealment, els biomarcadors han de ser validats de manera anàloga,

en un estudi clínic prospectiu, ben controlat i en una sèrie de pacients de diverses institucions que compleixin els estàndards establerts per a cada una de les etapes del procés (Ludwig i Weinstein, 2005) . Malgrat això, aquestes condicions ideals poques vegades s’apliquen .

Abans d’enviar un biomarcador perquè l’aprovi l’EMA (European Medicines Agency) o la FDA (Food and Drug Administration), es necessita la confirmació analítica i clínica del biomarcador . Després de l’aprovació de la FDA, el CMS (Center for Medicare and Medicaid Service) ha de concloure que aquest biomarcador és essencial per a la millora clínica en la cura del pacient (vegeu la figura 1) .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

Figura 1. Nova planificació per al descobriment de biomarcadors. Adaptat de Rifai et al. (2006) i Madu et al. (2010).

TIPUS DE BIOMARCADORS

Els biomarcadors són indicadors a escala molecular, bioquímica o ceŀlular, que es modifiquen quan s’ha produït una situació concreta . Qualsevol molècula no és vàlida com a biomarcador, sinó que ha de reu nir determinades condicions . La majoria dels biomarcadors estudiats actualment es basen en la possibilitat que siguin útils des del punt de vista del diagnòstic/pronòstic, encara que s’ha de tenir en compte que un biomarcador ideal alhora hauria de constituir una diana terapèutica . D’altra banda, hi ha biomarcadors que no tenen un valor diagnòstic ni terapèutic però que proporcionen informació sobre la gènesi del trastorn que observem . El biomarcador ideal hauria de fer el següent:

a) Permetre una detecció primerenca de la malaltia .

b) Fer un cribratge de pacients candidats a rebre tractament .

c) Identificar subgrups de pacients que puguin respondre al tractament . d ) Monitorar el tractament .

e) Avaluar la progressió/regressió de la malaltia .

Hi ha dos grups principals de biomarcadors: biomarcadors d’exposició, aquells que s’utilitzen en la predicció del risc, i biomarcadors de la malaltia, que s’utilitzen en el cribratge, diagnòstic i el seguiment de la progressió de la malaltia; conseqüentment, la classificació dels biomarcadors és variable segons diferents paràmetres . Tenint en compte l’aplicació es poden classificar en els tipus següents:

Biomarcadors de cribratge: s’utilitzen per predir l’aparició potencial d’una malaltia concreta en pacients asimptomàtics .

Biomarcadors de diagnòstic: s’utilitzen per fer prediccions en pacients en què hi ha sospita d’una malaltia . Un biomarcador de

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

diag nòstic ha de ser capaç de determinar una malaltia concreta de manera inequívoca, particularment en aquells pacients que no presenten símptomes . Els biomarcadors de diagnòstic han de complir els criteris exposats a la taula 1 .

Biomarcadors de pronòstic: s’utilitzen per preveure l’evolució d’un pacient que pateix una malaltia concreta; per tant, indica el curs clínic futur del pacient pel que fa a algun resultat clínic específic en absència d’intervenció terapèutica . Biomarcadors de resposta a teràpia: s’utilitzen per preveure la reacció d’un pacient que pateix una malaltia concreta quan se li administra un fàrmac determinat contra aquesta malaltia . Identifica els pacients que són relativament susceptibles a un efecte específic del fàrmac, enfront dels pacients menys susceptibles . Actualment disposem de diferents tipus de marcadors, com ara biomarcadors cardiovasculars, fonamentalment relacionats amb el desenvolupament i ruptura de la placa arterioscleròtica, la isquèmia cardíaca o l’infart; biomarcadors tumorals per al diagnòstic primerenc, resultat del tractament i seguiment de la malaltia en el càncer de mama, pulmó, còlon, ovari, fetge, tiroide, bufeta, etc . També hi ha biomarcadors vinculats amb la remodelació òssia relacionats amb l’osteoporosi o la reabsorció òssia; vinculats a la funció muscular per a miositis o malalties degeneratives; al dany cerebral (demència, Alzheimer, trombosi . . .) o al metabolisme de la glucosa útil en pacients diabètics .

A continuació s’exemplifiquen els tipus més comuns de biomarcadors de malaltia, en malalties comunes com són el càncer de pròstata, d’endometri i d’ovari . Tots són càncers hormonodependents que avui dia afecten un elevat percentatge de població i són una causa important de mort per malaltia oncològica .

Taula 1.

Criteris per a biomarcadors de diagnòstic

Específic Per a una determinada malaltia (baixa taxa de falsos positius)

Sensible Baixa taxa de falsos positius

Predictiu Rellevant per a la progressió de la malaltia o el tractament

Estandarditzat Procés consistent i reproduïble

Sòlid Procediment ràpid, senzill i econòmic

Estable Les mateixes concentracions a qualsevol hora del dia

No invasiu Quantificable en un fluid o mostra biològica fàcilment accessible

Rellevància preclínica i clínica

Vàlid en models animals/ ceŀlulars i humans

EXEMPLE DE BIOMARCADORS DE CRIBRATGE. EL PSA COM A MARCADOR DE CRIBRATGE EN EL CÀNCER DE PRÒSTATA. NOUS DESCOBRIMENTS

El càncer de pròstata (CP) és la segona causa de mort per malaltia oncològica en els homes del món occidental (Jemal et al., 2011) . S’estima que un de cada sis homes desenvoluparà un càncer d’aquest tipus al llarg de la seva vida . El diagnòstic actual del CP es basa en una tríada diagnòstica que consta de l’anàlisi dels nivells de PSA ( prostate specific antigen o antigen específic de la pròstata) en sèrum, el tacte rectal (TR) i finalment la biòpsia prostàtica (BP) . Quan els nivells de PSA en sèrum se situen per sobre de 4 ng/ml o el TR és sospitós, l’uròleg pot estimar quina és la probabilitat que el pacient estigui afectat per un CP, i per tant decidir la necessitat de practicar o no una BP, que permetrà establir el diagnòstic definitiu . La introducció del test del PSA, a finals

dels anys vuitanta, s’ha traduït en una millora del diagnòstic precoç del CP, moment en el qual les opcions de tractament són eficaces . No obstant això, i malgrat aquesta detecció primerenca, la mortalitat per CP no ha disminuït significativament en els últims anys . El principal problema del PSA com a marcador de cribratge és que aquest presenta un nivell d’especificitat baix (30 % aproximadament) i alhora, un valor predictiu negatiu baix . Això es tradueix en el fet que al voltant d’un terç de tots els homes sotmesos a una BP seran positius per a CP. Com a resultat dels seus persistents nivells sèrics de PSA, però els resultats negatius de la BP, aquests homes se sotmeten a diverses biòpsies . Tot i els importants avenços en la investigació de biomarcadors de CP, alguns homes encara estan sobrediagnosticats de CP «indolent», mentre que d’altres moren de malaltia agressiva diagnosticada tardanament . Aquesta situació es coneix com el «dilema diagnòstic» .

És per tot això que el CP es beneficiaria de l’existència de nous biomarcadors de cribratge més específics i alhora d’un diagnòstic menys invasiu . Aquesta millora evitaria un gran nombre de biòpsies innecessà ries i conseqüentment un important estalvi econòmic en el cost sanitari actual . La recerca de nous marcadors en el CP suposa un camp de treball important en la detecció precoç d’aquest tipus de càncer .

Atesa la situació de la pròstata en l’organisme, sota la bufeta i envoltant la uretra, les secrecions i fins i tot les cèŀlules prostàtiques mateixes, ja siguin normals o malignes, poden trobar-se presents en l’orina . És per això que considerem l’orina com una font important d’informació, a través de la qual es podria arribar a determinar quina situació s’està donant en l’òrgan en qüestió . Hi ha estudis que evidencien l’existència de biomarcadors potencials en l’orina que podrien ajudar en la millora del diagnòstic del

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

CP, com ara PCA3 ( prostate cancer antigen 3) (Schalken et al., 2003; Hessels et al., 2003; Groskopf et al., 2006) . Alhora, en el nostre grup s’han descrit panells de biomarcadors que milloren la detecció del CP en aquest tipus de mostra (Rigau et al., 2010, 2011) . Tal com s’ha comentat anteriorment, atesa la multifocalitat i heterogeneïtat del CP, el fet de multiplexar diferents biomarcadors permet incrementar l’especificitat sense perdre sensibilitat en el diagnòstic del CP. Mitjançant una anàlisi transcriptòmica per qPCR, de 154 (37 % amb CP) mostres de sediments d’orines de pacients obtingudes després d’un massatge prostàtic, vam determinar la utilitat de tres biomarcadors: PSMA ( prostate specific membrane antigen), PSGR ( prostate specific G-coupled receptor) i PCA3, per a la detecció de CP en orina utilitzant una anàlisi de multi receiver operating curve (multiROC) . Els resultats demostren que quan fixem la sensibilitat al 96 %, l’especificitat del model per als tres biomarcadors conjunts (3M) manté una especificitat del 34 %, mentre que aquesta especificitat no supera el 17 % quan mirem els biomarcadors de manera individual . El comportament dels 3M millora notablement quan estudiem una subpoblació de l’estudi que presenta nivells de PSA en sang entre 4-10 ng/ml i no té informació d’una biòpsia prèvia («zona grisa del PSA») on, fixant la sensibilitat al 96 %, l’especificitat és del 50 % . Els resultats obtinguts demostren que la combinació de diferents biomarcadors proporciona més especificitat a la prova diagnòstica sense comprometre el valor de sensibilitat del test . Expressat en el nombre de biòpsies que s’haurien pogut estalviar, els valors se situen al voltant del 34 % . Aquesta prova de cribratge, juntament amb els valors de PSA en sang i del TR, podria ajudar a determinar amb una millor especificitat quins pacients s’hauran de sotmetre al cribratge definitiu de CP, mitjançant la BP, fet

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

que es traduiria en un cribratge més acurat, que alhora permetria una reducció en el nombre de biòpsies molt important (34 %), cosa que es traduiria en una millora important per a la qualitat de vida del pacient, ja que el procediment de BP és dolorós i provoca un malestar important en el pacient, així com en un estalvi econòmic molt important per al sistema de salut .

EXEMPLE DE BIOMARCADORS DE DIAGNÒSTIC. GynEC-Dx

COM A BIOMARCADOR

DIAGNÒSTIC EN CÀNCER

D’ENDOMETRI

El càncer d’endometri (CE) és el tumor maligne més freqüent del tracte genital femení en els països desenvolupats i el segon més freqüent en països en via de desenvolupament, per sota del càncer de cèrvix . Mundialment es diagnostiquen 287.100 casos anuals, xifra que representa una incidència global de nou casos per cada cent mil dones i un risc de desenvolupar-lo al llarg de la seva vida de l’1,2 % (Jemal et al ., 2011) . Tot i així, el CE és considerat un càncer de bon pronòstic gràcies al fet que aproximadament el 70 % (Siegel et al., 2011) de les pacients es diagnostiquen en estadis inicials de la malaltia, moment en el qual és altament curable mitjançant tractament quirúrgic . Quan el tumor es diagnostica en estadis avançats i s’ha disseminat, o bé, quan recidiva després del tractament, el pronòstic empitjora de manera considerable . És per això que el diagnòstic precoç del CE és un punt clau a l’hora de millorar la supervivència de les pacients . Davant d’aquest escenari, en què el 30 % de les pacients es diagnostiquen amb una malaltia avançada, associada a un elevat nombre de recurrències, i en general, a un mal pronòstic, cal destacar que avui dia no

hi ha un mètode de cribratge poblacional a causa de la manca de biomarcadors moleculars suficientment específics i sensibles per al diagnòstic precoç del CE . Amb l’objectiu de millorar la detecció precoç i el control clínic del CE, hem ampliat recentment el nostre camp d’investigació per desenvolupar noves aproximacions encaminades a la millora dels mètodes actuals de diagnòstic . Des de fa vint anys, el nostre grup s’ha centrat en la identificació de perfils moleculars en el CE (Planaguma et al., 2004, 2005), els quals han donat lloc a extensos treballs en la caracterització dels processos d’invasió miomètrica (Doll et al., 2001; Monge et al ., 2007, 2009a, 2009b; Planaguma et al., 2006) . Més recentment, hem fet una anàlisi de l’expressió gènica, mitjançant xips de cDNA, en 52 mostres de teixit tumoral i 10 mostres de teixit normal, seguit d’una sèrie de qualificació, mitjançant qPCR, en 19 mostres aparellades de teixit normal i tumoral, i una sèrie de verificació, mitjançant qPCR, en 50 mostres d’aspirats uterins provinents de pacients normals i pacients amb CE . Aquesta anàlisi demostra que les alteracions trobades a escala del teixit extret de la cavitat uterina es correlacionen perfectament amb l’aspirat uterí, i alhora descriuen un total de vint biomarcadors a escala de RNA que permeten diagnosticar el CE en aspirats uterins amb una elevada especificitat i sensibilitat (Colas et al., 2011) . Enguany, gràcies al finançament de GEADIC, SA (aliança entre les empreses del món biotecnològic i Farma, Oryzon Genomics i Reig Jofre), aquest estudi es va validar a escala multicèntrica en catorze hospitals del territori espanyol, incloent-hi un total de 514 pacients de manera prospectiva i doble cec . Aquesta última fase de validació ha donat lloc a un perfil de biomarcadors que, en combinació amb el mètode actual de diagnòstic patològic de les biòpsies d’aspirat uterí, permet aconseguir una

sensibilitat (91 %) i especificitat (97 %) millors per diagnosticar aquelles pacients amb CE (Pérez-Sanchez et al., 2013) . Aquests resultats han comportat la concessió d’una patent i la sortida al mercat d’un equip comercial, GynDx, que actualment s’està introduint en els hospitals d’Espanya . Per davant de tot, el resultat perseguit presenta un impacte clínic important, amb l’objectiu d’accelerar el procés de diagnòstic, d’incrementar la sensibilitat i especificitat del procés diagnòstic, i d’evitar l’ús de les costoses i invasives histeroscòpies .

EXEMPLE DE BIOMARCADORS DE PROGRESSIÓ TUMORAL (PRONÒSTIC) EN CÀNCER D’OVARI

Actualment, el càncer d’ovari (CO) explica el 3 % dels nous casos de càncer diagnosticats en dones del països occidentals . En termes de mortalitat, aquest esdevé la cinquena causa de mort per càncer i la primera causa de mort per càncer ginecològic (Jemal et al., 2011) . Encara que més del 80 % de les pacients presenten algun símptoma, el CO ha estat anomenat «l’assassí silenciós» . Això és degut al fet que els seus símptomes són sovint compartits per altres condicions no necessàriament patològiques del tracte gastrointestinal, genitourinari o ginecològic que en dificulten la diagnosi inicial . Per aquest motiu, més del 70 % de les pacients amb CO són diagnosticades en estadis avançats de la malaltia (estadis iii-iv) . Com a conseqüència de la falta d’especificitat dels símptomes i de la diagnosi inicial tardana, la supervivència als cinc anys de les pacients diagnosticades amb CO avançat és inferior al 20 % (Aletti et al., 2007) . Contràriament a aquests casos, la taxa de curació del CO en pacients diagnosticades en estadis inicials de la malaltia (estadi i) se situa al voltant del 90 % .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

Actualment, els mètodes de cribratge que es fan servir per detectar la presència o no de CO són els següents: l’examinació pelviana, l’ecografia abdominal, i l’anàlisi del marcador sèric CA-125 . Els dos primers mètodes serveixen per detectar la presència d’una massa ovàrica anormal, i per tant sospitosa, però no permeten discriminar entre una massa ovàrica benigna o maligna . La detecció del marcador CA-125 en sang per a valors superiors a 35 U/ml indica la possible presència de CO; no obstant això, el diagnòstic definitiu es fa mitjançant cirurgia i només una de cada deu pacients operades n’està afectada .

Malauradament, l’ús d’aquest únic marcador, descobert ja fa més de trenta anys, presenta limitacions importants en la detecció del CO, com una baixa sensibilitat en els estadis inicials de la malaltia (menys del 50 % dels casos el sobreexpressen), així com en els estadis avançats de la malaltia (el 20 % de les pacients no el sobreexpressen); i una baixa especificitat, ja que l’augment en sang pot anar associat a altres condicions fisiològiques i patològiques (com embaràs, hepatitis, endometriosi, càncer de mama, etc .) diferents del CO (Huhtinen et al., 2009; Bast et al., 1998) . Finalment, els nivells sanguinis de CA-125 no semblen fiables en les dones amb alt risc de desenvolupar CO a causa de la seva història familiar (Amant et al., 2005; American Cancer Society, 2010) .

D’altra banda, el fet que inicialment el 80 % de les pacients responguin al tractament quimioterapèutic estàndard (basat en una combinació de paclitaxel i carboplatí), no evita que només el 10-15 % de les pacients aconsegueixi mantenir una resposta completa a aquest tipus de quimioteràpia (Aletti et al., 2007) .

La presència d’aquest escenari fortament suggereix que la detecció del CO en estadis inicials així com la incorporació de nous

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

tractaments quimioterapèutics aportaria un gran benefici a la nostra societat .

Amb la intenció d’identificar marcadors associats a la progressió tumoral en CO, necessaris per ser utilitzats en la fase de generació d’una nova teràpia molecular dirigida, vam decidir analitzar una sèrie de mostres aparellades de pacients amb CO avançat (estadi iiic) que va consistir en: el tumor primari d’ovari (teixit), l’ascites (fluid), i un implant peritoneal o metàstasi (teixit) .

L’anàlisi de l’RNA extret de les tres mostres procedents de cinc pacients es va fer mitjançant la tecnologia de microxips de cDNA i va permetre identificar una sèrie de gens significativament alterats en cada tipus de mostra respecte de l’altra, i alhora comuna en totes les pacients analitzades . D’aquesta manera, s’ha aconseguit identificar un perfil gènic propi de cada comparació —ascites respecte a tumors primaris, metàstasi respecte a ascites, i metàstasi respecte a tumors primaris— que facilita la cerca de noves dianes terapèutiques contra la ràpida progressió i disseminació del CO . En aquests moments s’han seleccionat sis possibles marcadors per ser verificats en la fase experimental següent . L’objectiu final és el d’identificar marcadors que indiquin progressió de la malaltia, abans que aquesta sigui no abordable, i marcadors que puguin ser utilitzats com a eines terapèutiques, ja sigui mitjançant el bloqueig de l’expressió o acció (en el cas d’oncògens), o bé a través de la sobreexpressió (en el cas de supressors tumorals) .

REFLEXIÓ

Les grans inversions en les tècniques d’elevat rendiment han generat una nova oportunitat per aconseguir avenços significatius en la investigació biomèdica i en especial en el camp del càncer . Alhora, la mi-

llora en el disseny experimental, així com l’estandardització de protocols de recollida i anàlisi de mostres, i no menys important, el creixement de la bioinformàtica que acompanya tot el procés experimental, han permès facilitar el descobriment de nous biomarcadors amb més taxa d’èxit que anys enrere .

Les nostres dades demostren que es poden identificar nous biomarcadors per al CP, CE i CO, cosa que constitueix un pas important en l’avenç del diagnòstic específic, no invasiu i també en el pronòstic de la malaltia, que actualment representa un progrés en la nostra capacitat de curar els pacients . Així doncs, la consecució dels projectes presentats i la validació d’aquells resultats més prometedors podria representar una millora important en la pràctica clínica d’aquests càncers, beneficiar els pacients mitjançant la incorporació d’aquests resultats en la rutina hospitalària . A més, en un futur no gaire llunyà, la integració de les dades generades en aquest tipus d’anàlisi juntament amb la combinació de dades clíniques rellevants del pacient ens acostaran encara més al que es coneix com la biomedicina de sistemes, que representa un pas molt important en la curació d’aquests càncers .

Motivats per aquestes noves troballes, animats per l’ànsia d’exploració de nous mons i alhora havent viscut ja una experiència d’èxit propera, va sorgir la idea d’un projecte empresarial que va néixer el 2007 amb el nom de TransBioMed, impulsat per quatre emprenedors: el doctor Miguel Abal, Raimon Forés, el doctor Andreas Doll i el doctor Jaume Reventós . TransBioMed sorgeix en el context hospitalari de l’Hospital de la Vall d’Hebron, i és la primera escissió de l’Institut de Recerca Vall d’Hebron de Barcelona amb una clara vocació translacional, mitjançant el desenvolupament i la valorització de la investigació en biomedici-

na, i amb la missió de traduir-la en productes diagnòstic i pronòstic de diferents malalties com el CP, CE i CO, així com altres malalties predominants . El valor tecnològic dels projectes de l’empresa se centra principalment a millorar la selectivitat i especificitat dels sistemes de diagnòstic i pronòstic actuals per a aquestes malalties . L’estratègia es basa principalment en la combinació de diferents marcadors, perfils de marcadors, que permeten millorar els nivells d’especificitat mantenint valors de sensibilitat del 95-100 % . Les empreses amb capacitat de desenvolupar i comercialitzar els equips a escala multinacional són els principals clients per llicenciar aquesta propietat industrial .

BIBLIOGRAFIA

Aletti, G . D .; Long, H . J .; Podratz, K . C .; Cliby, W . A . (2007) . «Is time to chemotherapy a determinant of prognosis in advanced-stage ovarian cancer?» . Gynecol. Oncol., 104: 212-216 . Amant, F . [et al.] (2005) . «Endometrial cancer» . Lancet, 366: 491-505 . American Cancer Society (2010) . Cancer Facts. Figures 2010 . Atlanta: American Cancer Society . Anderson, L . (2005) . «Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease» J. Physiol., 563: 23-60

Bast, R C , Jr [et al.] (1998) «CA 125: the past and the future» Int. J. Biol. Markers, 13: 179-187

Biomarkers Definition Working Group (2001) «Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework» Clin. Pharmacol. Ther., 69: 89-95

Boja, E [et al.] (2010) «Evolution of Clinical Proteomics and its Role in Medicine» J. Proteome Res., doi:10 1021/pr100532g

Colas, E [et al.] (2011) «Molecular markers of endometrial carcinoma detected in uterine aspirates» International Journal of Cancer. Journal International du Cancer.DOI:10 1002/ijc 25901

Doll, A [et al.] (2009) «An orthotopic endometrial cancer mouse model demonstrates a role for RUNX1 in distant metastasis» International Jour ­

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

nal of Cancer. Journal International du Cancer, 125: 257-263 .

Gerszten, R . E .; Wang, T . J . (2008) . «The search for new cardiovascular biomarkers» . Nature, 451: 949952 .

Groskopf, J . [et al.] (2006) . «APTIMA PCA3 molecular urine test: development of a method to aid in the diagnosis of prostate cancer» . Clin. Chem., 52: 1089-1095 .

Gutman, S .; Kessler, L . G . (2006) . «The US Food and Drug Administration perspective on cancer biomarker development» . Nat. Rev. Cancer., 6: 565-571 . Hessels, D . [et al.] (2003) . «DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer» . Eur. Urol., 44: 8-15 . [Discussió: 15-16]

Huhtinen, K . [et al.] (2009) . «Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts» . Br. J. Cancer, 100: 1315-1319 .

Jemal, A . [et al.] (2011) . «Global cancer statistics» . CA Cancer J. Clin., 61: 69-90 .

Ludwig, J . A .; Weinstein, J . N . (2005) . «Biomarkers in cancer staging, prognosis and treatment selection» . Nat. Rev. Cancer, 5: 845-856 .

Madu, C . O .; Lu, Y . (2010) . «Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer» . J. Cancer, 1: 150-177 .

Monge, M . [et al.] (2007) . «ERM/ETV5 up-regulation plays a role during myometrial infiltration through matrix metalloproteinase-2 activation in endometrial cancer» . Cancer Research, 67: 67536759 .

Monge, M . [et al.] (2009a) . «Proteomic approach to ETV5 during endometrial carcinoma invasion reveals a link to oxidative stress» . Carcinogenesis, 30: 1288-1297 .

Monge, M [et al.] (2009b) «Subtractive proteomic approach to the endometrial carcinoma invasion front» Journal of Proteome Research, 8: 4676-4684

Planaguma, J [et al.] (2004) «A differential gene expression profile reveals overexpression of RUNX1/ AML1 in invasive endometrioid carcinoma» Cancer Research, 64: 8846-8853

Planaguma, J [et al.] (2005) «Up-regulation of ERM/ ETV5 correlates with the degree of myometrial infiltration in endometrioid endometrial carcinoma» The Journal of Pathology, 207: 422-429

Planaguma, J [et al.] (2006) «The up-regulation profiles of p21WAF1/CIP1 and RUNX1/AML1 correlate with myometrial infiltration in endometrioid endometrial carcinoma» Human Pathology, 37: 1050-1057

Rifai, N ; Gillette, M A ; Carr, S A (2006) «Protein biomarker discovery and validation: the long and

uncertain path to clinical utility» . Nat. Biotechnol., 24: 971-983 .

Rigau, M . [et al.] (2010) . «PSGR and PCA3 as biomarkers for the detection of prostate cancer in urine» . Prostate., 70: 1760-1767 .

Rigau, M . [et al.] (2011) . «A Three-Gene panel on urine increases PSA specificity in the detection of prostate cancer» . Prostate . DOI:10 .1002/pros .21390 .

Schalken, J . A ., Hessels, D .; Verhaegh, G . (2003) . «New targets for therapy in prostate cancer: differential display code 3 (DD3(PCA3)), a highly prostate cancer-specific gene» . Urology, 62: 34-43 .

Siegel, R .; Ward, E .; Brawley, O .; Jemal, A . (2011) . «Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths» . CA Cancer J. Clin., 61: 212-236 .

SOBRE ELS AUTORS

Marina Rigau és llicenciada en biologia per la Universitat de Barcelona i doctora en biomedicina per la Universitat Autònoma de Barcelona . Durant la seva tesi va fer una estada de formació internacional, a Luxemburg, en l’àmbit de la proteòmica . D’altra banda, ha participat des de primera línia en la primera empresa d’escissió dintre del sistema públic de salut de Catalunya, Transbiomed, SL . Actualment està duent a terme una formació postdoctoral a la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron . Mireia Olivan, biòloga per la Universitat de Barcelona, va fer la seva tesi doctoral al Departament de Bioquímica i Biologia Molecular de la mateixa universitat . Posteriorment, va treballar com a investigadora durant un any a la Universitat de São Paulo i, actualment, forma part des de fa dos anys del Grup de Càncer de Pròstata de la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron . Marta Llauradó és llicenciada en biologia per la Universitat de Barcelona . Poste-

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

riorment, es va doctorar en biomedicina per la Universitat Autònoma de Barcelona . Desprès de fer la tesi i un any de formació postdoctoral a la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron, va incorporar-se a la Facultat de Medicina de la Universitat de British Columbia (Vancouver, Canadà), on continua les seves investigacions en càncers hormonodependents . Eva Colás, biòloga per la Universitat de Barcelona, va fer la seva tesi doctoral a la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron . És aquí on va començar els seus estudis en càncer d’endometri, que ara continua com a investigadora postdoctoral del mateix grup . Durant la seva carrera, la doctora Eva Colás ha fet diverses etapes formatives a l’estranger (Noruega, Anglaterra i França) i ha participat en projectes amb empreses (Innovest, SA, Oryzon Genomics, SA i Transbiomed SL) . Andreas Doll, biòleg humà per la Universitat de Marburg, Alemanya, va fer la seva tesi doctoral en genètica humana . Posteriorment va dur a terme una etapa postdoctoral al Departament de Biologia Ceŀlular de la Universitat de Marburg . El 2007 va

iniciar la seva carrera com a investigador independent en la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron . És soci fundador de l’empresa de biotecnologia Transbiomed, SL, i és professor conferenciant de biologia molecular a la Universitat Internacional de Catalunya (UIC) . Jaume Reventós és doctor en medicina i cirurgia per la Universitat Autònoma de Barcelona . Té experiència de recerca durant tres anys a l’INSERM de Lió, i sis com a postdoctorand, primer a la Universitat Rockefeller, de Nova York, i després com professor associat al Mount Sinai, també de Nova York . Des de 1990 és el director de la Unitat de Recerca Biomèdica i Oncologia Translacional de l’Institut de Recerca de l’Hospital Vall d’Hebron . Dirigeix un grup de recerca de trenta investigadors dedicats a les bases moleculars i al diagnòstic dels càncers d’endometri, d’ovari i de pròstata . És soci fundador de l’empresa de base tecnològica Transbiomed SL, primera empresa d’escissió dintre del sistema públic de salut de Catalunya . És graduat del Programa de Desenvolupament Directiu de l’Escola de Negocis IESE, de la Universitat de Navarra .

Treb. Soc. Cat. Biol., 64: 153-164

ÍNDEX D’AUTORS

Barquinero, J

Blanco, J

Brugada, J

Cardona, P.-J

Clotet, B

Colás, E

Curriu, M

Doll, A

Gòdia, F

Gomis, R

R

Guitart, T

Llauradó, M

7, 61

77

107

9

77

153

77

153

93

113

153

Olivan, M

Rabassa, A

Reventós, J

Ribas de Pouplana, L

Rigau, M

Salas-Salvadó, J

Samitier, J

Selva, A

Vidal, F

Vilardell, M

Vives, J

153

19

7, 153

113

153

19

131

49

29

49

93

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

Consell Directiu

President

Vicepresidenta 1a

Vicepresident 2n

Secretari general

Vicesecretàries

Tresorer

Vocal de Sessions

Vocal d’Acció Territorial

Vocal de Publicacions i Lexicografia

Vocal de Comunicació

Vocals d’Ensenyament

Vocal de Promoció

Vocal d’Estudiants

Lluis Tort Bartolet

Àurea Navarro Sabaté

Jordi Barquinero Mañez

Josep Clotet Erra

Marina Rigau Resina i Eva Colàs Ortega

Marc Martí-Renom

Albert Jordan Vallés

Oriol Cabré Fabre

Dolors Vaqué Vidal

Joan Duran Ferrer

Carles Giménez Esteban i Rosa Pérez Roura

Francesc Piferrer Circuns

Oriol Iborra Egea

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

Seccions especialitzades

Biologia Molecular

Aqüicultura

Biofísica

Biologia del Desenvolupament

Biologia Evolutiva

Biologia i Indústria

Biologia Molecular

Biologia Molecular del Càncer

Biologia de Sistemes

Biologia i Societat

Biologia de la Reproducció

Ecologia Aquàtica

Ecologia Terrestre

Ensenyament

Estudiants

Fisiologia Vegetal

Genòmica i Proteòmica

Microbiologia

Neurobiología Experimental

Senyalització Cel·lular i Metabolisme

Virologia

SCB a Alacant

SCB a les Illes Balears

SCB a Lleida

SCB al Pallars

SCB a València

SCB a Vic

Secció conjunta de Biologia

Computacional i Matemàtica

Secció SCB al Vallès

Albert Jordan

Josep Planas

Pere Garriga

Jordi Garcia

Montse Papaceit

Ramon Roca

Albert Jordan

Gabriel Capellà

Albert Sorribas

Cristina Junyent

Enric Ribes

Ramon Massana

Josep Maria Espelta

Carles Giménez

Marta Llauradó

Anna Caño

Mario Cáceres

Mercedes Berlanga

Josep Saura

Francesc Vinyals

Miguel Ángel Martínez i Ana Angulo

Ivan Quesada

Balbina Nogales

M . Angeles de la Torre

Xavier Castells

Lluís Pascual

Julita Oliveras

Roderic Guigó (provisional)

Jordi Barbé

NORMES DE PUBLICACIÓ PER ALS

AUTORS

DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

La revista Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) és editada per la Societat Catalana de Biologia (SCB), i publicada per l’Institut d’Estudis Catalans. És de periodicitat anual.

Abast. Treb. Soc. Cat. Biol. publica monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat. Des del volum 1, corresponent a les sessions científiques dels anys 1912 i 1913, fins ben entrats els anys vuitanta del segle passat, s’hi publicaven articles de recerca, presentats a la sessions científiques de la SCB. De manera consistent a partir de la meitat dels anys noranta, atès que la majoria d’autors publicava la seva recerca en revistes d’abast més internacional (sobretot en anglès) s’adoptà el format actual de monografia, principalment amb articles de revisió. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que vulguin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per a dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol.

Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua.

Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Per figurar com a autor s’han de complir almenys un dels requisits següents: haver contribuït substancialment a la concepció i disseny de l’article, a l’adquisició de dades o a l’anàlisi i la interpretació posterior; haver escrit l’esborrany de l’article. Tots els autors han d’haver aprovat la versió que finalment es remet. Els autors entenen que, des del moment de la publicació, la seva obra es llicencia segons la llicència Creative Commons «Reconeixement - No comercial - Sense obres derivades 3.0». Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iec.cat), adreçat al vocal de Publicacions. Cal enviar els arxius següents, preferentment empaquetats amb ZIP:

― Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: portada, índex, presentació, els capítols en l’ordre en què apareixeran, amb les taules, si n’hi ha, i la llista de peus de figura al final de cada capítol. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la portada. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. Aquest arxiu no podrà contenir figures ni objectes incrustats.

― Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint).

― Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a original imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc.

Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Comitè de Publicacions de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols.

El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Els revisors anònims (que podran ser ordinaris o requerits específicament per a temes concrets) poden rebutjar un article o suggerir canvis si consideren que no compleix amb la qualitat científica requerida o hi ha errors detectables de contingut.

Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà aquest ordre pel que fa als diferents components:

― Títol, que ha de ser descriptiu, escrit en majúscules i negreta.

― Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom.

― Afiliació de tots els autors, adreça postal i correu electrònic de l’autor corresponent.

― Resum descriptiu en català, d’un màxim de dues-centes paraules.

― Paraules clau en català, màxim de cinc.

― Resum descriptiu en anglès (haurà de ser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit).

― Paraules clau en anglès, màxim de cinc.

― Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure els apartats «Introducció», «Materials i mètodes», «Resultats» i «Discussió». No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat.

― Agraïments, si escau.

― Bibliografia, segons el format indicat més endavant.

― Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb xifres aràbigues. Una taula per full.

― Text de peus de figures. Aniran numerats correlativament amb xifres aràbigues.

Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades

poden ser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix el procés editorial, es recomana que no se n’incloguin més de dues per article. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright

Bibliografia. Totes les referències bibliogràfiques, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran de ser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els cognoms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per citar articles, capítols o monografies.

Codina, C.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Llabrés, J. M. (1989). “Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics”. Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70.

Mellado, R. P. (1987). “Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes”. A: Vicente, M.; Renart, J. (ed.). Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. Wolffe, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press.

Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per corregir-les, i aquestes proves hauran de ser retornades per correu electrònic a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c. de Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iecat.net) dins el termini màxim d’una setmana. S’accepta la introducció de canvis en el contingut, si hi ha lloc, després de la revisió, i, de canvis en l’estil del manuscrit, per part de l’equip de redacció de la revista. Un cop publicat l’article, es lliurarà a l’autor un exemplar del volum sense càrrec.

Versió electrònica i indexació. Treb. Soc Cat. Biol. té una versió electrònica, que es troba al web de l’IEC: http://revistes.iec.cat/index.php/TSCB. En aquesta web hi ha la versió en PDF, de descàrrega lliure. Actualment, la revista és indexada a RACO, Dialnet, CSICICYT, Latindex, Dulcinea i Hispana.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

The journal Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) [Works of the Catalan Society of Biology] is edited by the Societat Catalana de Biologia (SCB), and published by the Institut d’Estudis Catalans [Academy of Catalan Studies]. It is published annually.

Scope. Treb. Soc. Cat. Biol. publishes monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society. Since volume 1, corresponding to the scientific sessions of the years 1912 and 1913, until well into the 80s of the last century, this journal published research papers presented at the scientific sessions of the SCB. Consistently since the mid 90s, and since most authors used to publish their research papers in international journals (mostly in English) the current format consisting of monographic volumes, mostly with review papers, was adopted.

Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. To qualify as an author at least one of the following requirements must be satisfied: to have substantially contributed to the conception and design of the paper, the acquisition, analysis or interpretation of data, or have written the draft of the paper. All authors must approve the submitted version. Authors acknowledge that upon publication, their work becomes licensed under the Creative Commons License “Recognition - No commercial - Without derived works 3.0”. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iec.cat addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed:

― A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables, if any, as well as the figure legends at the end of the chapter. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects.

― One file for each figure named Figure_[figure number]_[last name of the first author] Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint).

― A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations.

― Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the

font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters.

The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. The anonymous referees (which can be ordinary or specifically required for a given subject) can reject submitted manuscripts or ask for changes if they consider that they are not adequate in terms of scientific quality or that there are obvious errors in content.

Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure:

― Title, written in capitals and bold case.

― Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after his or her last name.

― Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author.

― Abstract, maximum two hundred words.

― Keywords, maximum five.

― Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted.

― Acknowledgments, if appropriate.

― References (see format below).

― Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page.

― Figure legends.

Figures. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width × 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights.

References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author

followed by et al. will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively.

Codina, C.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Llabrés, J. M. (1989). “Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics” Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70.

Mellado, R. P. (1987). “Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes”. A: Vicente, M.; Renart, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30.

Wolffe, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press.

Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by email to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c. de Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. After revision, changes in contents are acceptable if deemed needed. Changes in the style of the manuscript can be introduced by the journal’s editorial team. Once published, authors will receive one volume free of charge.

Electronic version and indexation. Treb. Soc. Cat. Biol. is also published electronically and PDFs can be downloaded free of cost from the IEC webpage: http://revistes.iec.cat/ index.php/TSCB. Currently, this journal is indexed in RACO, Dialnet, CSIC-ICYT, Latindex, Dulcinea and Hispana.

INFORMACIÓ PER A EDITORS DE VOLUMS

MONOGRÀFICS DE TREBALLS

DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

Aquest document té com a objectiu donar informació útil i ajudar els editors de volums monogràfics de Treballs de la Societat Catalana de Biologia (d’ara en endavant, Treballs).

Plantejament global del contingut dels monogràfics. Un cop una persona accepta ser l’editor d’un volum de Treballs, i independentment de la seva temàtica, és la responsabilitat de l’editor procurar que els continguts siguin els adients. En aquest sentit, cal recordar que, com s’estableix en la seva missió, la raó de ser de la SCB és «promoure i difondre la recerca, la docència i la comunicació de la biologia, així com llur projecció social, dins l’àmbit territorial de les terres de parla catalana».

Així mateix, entre d’altres, en els objectius de la SCB trobem «contribuir a mantenir la llengua catalana com a vehicle de dinamització i transmissió de la ciència biològica de nivell internacional» i també «intervenir en el debat social al voltant de conceptes i aplicacions que sorgeixen del desenvolupament de la biologia».

La qualitat científica sempre ha de prevaler a l’hora de triar els col·laboradors per a un volum de Treballs. A més, és convenient que Treballs reflecteixi el treball en biologia que es fa a les terres de parla catalana ara, i si pot ser, fet per socis de la SCB, i per això l’editor haurà de procurar que la participació d’autors forans no sigui majoritària.

El contingut de Treballs ha de ser científicament rigorós, ha de reflectir el consens sobre un tema o, si no, ha de mostrar les diferents visions sobre aquest, amb informació actualitzada i de caràcter entenedor per a un públic format però no necessàriament especialista en un tema concret, amb esperit informatiu i divulgatiu. Per a publicacions especialitzades de recerca, la SCB ja té les publicacions de jornades organitzades per les seccions.

Aquests preceptes s’haurien de tenir en compte a l’hora de seleccionar continguts i l’editor els pot transmetre als autors que hagi triat per a un volum monogràfic.

Idioma. En les normes de publicació s’estableix que «Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua». A més, el Consell Directiu de la SCB en reunió extraordinària el 6 i 7 de juliol de 2006 va aprovar el següent: 1) els autors que treballen en institucions del domini lingüístic català (DLC) hauran de presentar obligatòriament les seves contribucions a Treballs en català, 2) per a aquells autors amb llengua no catalana que treballin en institucions del DLC, es determinarà si han de traduir les contribucions o, si al contrari, la SCB se’n fa càrrec de la traducció, i 3) els autors que treballin fora del DLC podran presentar les seves contribucions en castellà o anglès, independentment de la seva adscripció geogràfica.

Sense perjudici del que s’acaba d’esmentar, i segons l’aprovat pel Comitè de Publicacions (CP) de la SCB l’11 de maig de 2006: 1) per a Treballs no s’acceptarà cap altra llengua que no sigui el català, castellà o anglès, i 2) en qualsevol cas en un volum de Treballs la suma de pàgines escrites en llengua no catalana serà, com a màxim, un terç del nombre

total de pàgines. És a dir, que les pàgines escrites en català representaran, com a mínim, dos terços del total de pàgines.

Procés de revisió dels originals. L’editor rep dels autors els manuscrits i fa una primera comprovació que s’ajustin a les normes de publicació de Treballs. En cas contrari, retorna els originals als autors. Un cop tots els originals s’ajusten en forma i contingut a les normes de publicació, l’editor crea un únic arxiu i l’envia a la SCB, i aquesta al president del CP. Aquest contacta amb altres membres del CP experts en la matèria perquè suggereixin possibles revisors. El president del CP envia a aquests revisors (cada revisor pot rebre un o diversos articles i, en principi, cada article és revisat per un o, si es considera oportú, més revisors) els articles. Als revisors els demanem que estableixin si els originals compleixen les normes de publicació i examinen el contingut científic dels originals. Els comentaris es tornen al president del CP, que els passa a l’editor perquè ho comuniqui als autors. El procés de revisió és anònim.

Un cop es comuniquen als autors els comentaris dels revisors, els requisits, errors i mancances, etc., els autors i l’editor en comú esmenaran o modificaran en el termini màxim de dues setmanes el que sigui necessari, i el text que presentaran es considerarà definitiu pel que fa al contingut. Sobre aquest text començarà el procés de correcció, durant el qual els autors rebran el text corregit dues vegades: la primera vegada l’original corregit sense maquetar (en Word), i la segona en forma de galerada, ja maquetat. La primera vegada els autors podran esmenar parts petites del contingut, per tal de corregir lapsus, omissions involuntàries i errors d’interpretació del corrector, però no podran afegir fragments llargs de contingut nou. La segona vegada (la galerada) només es permeten esmenes ortogràfiques o detalls de les figures, etc., però no canvis de contingut, tot entenent que el text ja és definitiu.

Els originals corregits i les galerades es trametran en format electrònic (Word i PDF). En la primera tramesa (els originals) el corrector podrà fer ressaltar fragments de text, que representaran dubtes que han sorgit en la correcció, que hauran de solucionar els autors o l’editor. Tots els canvis que introdueixin els autors en l’original corregit s’hauran de fer ressaltar amb el control de canvis del processador de text o amb algun altre mètode que permeti distingir-los del text corregit. En la segona tramesa (PDF) els autors podran fer servir les eines de dibuix de l’editor de PDF per indicar esmenes, o l’eina de notes, etc.

La via de comunicació entre els autors i el corrector és directa: el corrector disposa de les adreces electròniques de tots els autors, i ell mateix envia els originals i les galerades a aquests, amb duplicat per a l’editor. Tanmateix, si l’editor vol revisar cada capítol abans d’enviar-ho als autors, pot quedar d’acord amb el corrector perquè els enviï només a ell.

TREBALLS DE LASOCIETAT CATALANADE BIOLOGIA

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections.

Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed:

—Asingle file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects.

—One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint).

—Asingle PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations.

Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCBPublications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters.

The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications.

Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure:

—Title, written in capitals and bold case.

—Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

—Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author.

—Abstract, maximum two hundred words.

—Keywords, maximum five

—Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted.

—Acknowledgments, if appropriate

—References (see format below)

—Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page

—Figure legends

Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights.

References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively.

CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M.(1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70.

MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30.

WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press.

Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

VOLUM 64, 2013

ÍNDEX

Les ma La Lties deL segLe xxi

Presentació 7

J. Barquinero i J. reventós

La tuberculosi? No s’havia eradicat? Cent anys del bacteri més persistent

P.-J. Cardona

Accions metabòliques de la vitamina D molt més enllà del que podíem imaginar fa uns anys 19 a raBassa i J. salas-salvadó

Seqüenciació de nova generació i salut en el segle xxi

F. vidal

L’envelliment, aproximació a un procés complex i heterogeni 49 a selva i M. vilardell

Teràpies avançades: present i futur

J. Barquinero

El VIH, nou gens que han canviat la biologia i el món 77 M. Curriu, B. Clotet i J. BlanCo

Usos de biomaterials i cèŀlules en regeneració de cartílag articular

J. vives i F. Gòdia

La cardiologia del segle xxi 107 J. BruGada

La traducció genètica mitocondrial i malalties associades

t. Guitart i l. riBas de PouPlana

Nanobiotecnologia i nanomedicina 131 J. saMitier

Les metàstasis o la clau per vèncer el càncer

r. r. GoMis

Biomarcadors de diagnòstic, pronòstic i predicció de resposta a tractaments oncològics 153 M. riGau, M. olivan, M. llauradó, e. Colás, a doll i J. reventós