332 • Kapittel 10
Nobelprisen i kjemi i 1993 ble tildelt Kary Mullis og Michael Smith for deres arbeider knyttet til DNA og PCR-syntese av det. Men en norsk forsker, Kjell Kleppe, la grunnlaget for metoden allerede i 1970-årene. Han hadde da vist de grunnleggende prinsippene i metoden, at et lite, syntetisk DNA ble duplisert ved bruk av to primere og DNA-polymerase. Deretter ble reaksjonsblandingen varmet opp, og ny primer og nytt enzym ble tilsatt. Kleppe døde i 1988, men flere forskningsmiljøer både i Norge og i verden for øvrig reagerte på at hans navn ikke ble trukket fram ved tildelingen.
PCR er en prosess som blir repetert flere ganger. Repetisjonene kaller vi sykluser. Det er tre hovedtrinn i prosessen som gjentas i 25–35 sykluser i det samme reaksjonsrøret. Hovedtrinnene har en forhåndsprogrammert varighet, og temperaturen kan forhåndsbestemmes av den som programmerer maskinen. Den sykliske prosessen er denne: 1 Denaturering: DNA-dobbelttråden blir varmet opp (til ca. 95 °C) og blir til to enkelttråder. Dobbelttråden må skilles fra hverandre for at den enkelte DNA-tråden kan leses og kopieres. Hver av de opprinnelige DNA-trådene blir brukt som original for å lage en ny. 2 Påsetting av primere: Blandingen blir kjølt ned til ca. 60 °C. Primerne eller oppstarterne «limer» seg til hvert sitt startområde på DNA-tråden som skal kopieres. Dette skjer ved komplementær baseparing. 3 Forlengelse av DNA-tråden ut fra primerne: Blandingen blir varmet opp til 72 °C. Dette er en temperatur hvor den tilsatte DNA-polymerasen jobber best. Fra hver primer lages en ny DNA-tråd ved hjelp av varmestabil DNApolymerase og nukleotider. Polymerasereaksjonen, PCR, trinn for trinn. PCR er en rask og automatisert prosess for å kopiere opp en mengde DNA i et rør. Prosessen er tredelt, se teksten i figuren, og repeteres omtrent hvert 2–3 minutt. Veksten av DNA er eksponentiell, så prosessen er svært effektiv.
DNA
1
2
Primer
3
Et DNA-fragment er skilt fra hverandre ved høy temperatur
DNA-et kjøles, og primere binder seg til enden av DNA-fragmentene
1. syklus gir 2 molekyler DNA polymerase syntetiserer en komplementær tråd fra hvert nye adskilte DNA-fragment
2. syklus gir 4 molekyler, 22
3. syklus gir 8 molekyler, 23