Atlas espana by RCP di Consiglio Riccardo

Dr. Andrea Ciapini CON LA PARTICIPACIÓN DE: Prof. Bruno Milanesi Prof. Barbara Mroczko - Dr. Fangyin Zeng - Dr. Maurizio Cortesi Dr. Edmondo Adorisio - E.B.C. Guadalupe Valenzo Valencia

ATLAS DE ELECTROFORESIS DE SEROPROTEÍNAS E INMUNOFIJACIÓN EN SUERO, ORINA Y CRIOGLOBULINAS

ATLAS DE ELECTROFORESIS

ÍNDICE

1. 2. 3.

PREFACIO.............................................................. INTRODUCCIÓN.................................................... LA INSPECCIÓN Y LA SEMIÓTICA ELECTROFORÉTICA DE LOS PATRONES PROTEICOS........................

PATRONES SEROPROTEICOS DE CADA PROTEÍNA ESPECÍFICA Y METABOLITOS COMIGRANTES......... 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16

PROTEÍNA prealbúmina/transtiretina....................... PROTEÍNA albúmina............................................... PROTEÍNA albúmina/condición analbuminémica..... PROTEÍNA albúmina............................................... PROTEÍNA alfa lipoproteína (APO A)...................... PROTEÍNA alfa 1 glicoproteína ácida...................... PROTEÍNA alfa 1 antitripsina................................... TRIGLICÉRIDOS....................................................... PROTEÍNA GC componente grupo específico........... PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina............................ PROTEÍNA haptoglobina......................................... PROTEÍNA fibronectina........................................... C3 ACTIVADO IN VITRO......................................... PROTEÍNA betalipoproteína (APO B)....................... PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea...................................................... PROTEÍNA transferrina............................................

Electroforesis

Pg. >>

I XIII

>> >> >> >> >> >> >> >> >> >> >> >> >> >> >>

5 7 11 14 15 23 25 27 32 34 37 43 46 49 50

>> >>

53 58

4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 4.22 4.23 4.24 4.25 4.26 5.

7. 8. 9. 10.

CRIOGLOBULINA.................................................... PROTEÍNA complemento fracción 4.......................... PROTEÍNA complemento fracción 3.......................... PROTEÍNA C1q inhibidor........................................ PROTEÍNA B2 microglobulina.................................. PROTEÍNA fibrinógeno............................................ PROTEÍNA PCR....................................................... INMUNOGLOBULINA IgG....................................... INMUNOGLOBULINA IgA....................................... INMUNOGLOBULINA IgM...................................... DISPOSICIÓN POLICLONAL DE LAS INMUNOGLOBULINAS EN EL MARCO DE LOS VALORES DE REFERENCIA...............................................................

>> >> >> >> >> >> >> >> >> >>

63 67 69 73 73 77 79 81 82 83

DISPOSICIÓN POLICLONAL DE LAS INMUNOGLOBULINAS EN EL LÍMITE O POR DEBAJO DE MARCO DE REFERENCIA: hipogammaglobulinemia...............

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA: hipergammaglobulinemia

>> >>

101 113

165

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL Y LOS COMPONENTES MONOCLONALES.................................... LOS COMPONENTES MONOCLONALES................ SEMIÓTICA DE ALGUNOS PERFILES SEROPROTEICOS......................................................................

11.

PROTEÍNAS PRESENTES EN LA MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA Y QUE SIMULAN LA PRESENCIA DE UN CM....................................................................

12.

ATLAS DE CUADROS CRIOGLOBULINÉMICOS INMUNOFIJADOS.......................................................

13. 14.

LAS INMUNOFIJACIONES...................................... VALORACIÓN: la disposición policlonal en pacientes con componentes monoclonales................................

15. 16. 17.

18.

19. 20. 21. 22. 23.

24.

LAS PROTEINURIAS: la inspección y la semiótica electroforética......................................................... EPÍLOGO................................................................ APÉNDICE PRIMERO: Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales..................................................... APÉNDICE SEGUNDO: El perfil urinario ETF y la concentración de los líquidos biológicos en la práctica de los laboratorios de química clínica.................. APÉNDICE TERCERO: Las crioglobulinas................... APÉNDICE CUARTO: La indispensabilidad de la inspección de los perfiles proteínicos en electroforesis.... APÉNDICE QUINTO: La determinación de los componentes monoclonales............................................ APÉNDICE SEXTO: La proteína de Bence Jones......... APÉNDICE SÉPTIMO: Notas sobre las inmunoglobulinas humanas: Bases celulares, estructurales, inmunoquímicas y funcionales......................................... BIBLIOGRAFÍA........................................................

Electroforesis

173

>> >>

183 193

>> >>

237 251

263

279

>> >>

285 323

327

>> >>

353 375

>> >>

391 419

PREFACIO

interpretación, debido a las numerosas interacciones y al posible solapamiento de confusiones, y de la semiología proteínica que impide, salvo raras excepciones, obtener conclusiones diagnósticas fiables sin la ayuda del médico. Asimismo, estos últimos, deben ser conscientes del potencial, pero también de las limitaciones y de las posibles causas de error, que tienen los métodos de estudio utilizados. La verdad es que no podemos atribuir con simpleza al estudio de las proteínas separadas mediante electroforesis, ¡sólo la tarea de detectar componentes monoclonales! A partir de estos supuestos nace la arquitectura del atlas, con el que sólo se quiere destacar, mediante imágenes y comentarios breves, el potencial de la electroforesis que, si es “interpretada visualmente” como las radiografías y los ecocardiografías, da al laboratorista la oportunidad de proporcionar al médico información útil sobre los equilibrios proteínicos de los pacientes sin querer prevaricar el deber propio del médico. Todo lo antedicho se sitúa en la perspectiva de las recomendaciones del Instituto de Medicina (1992) que establece la siguiente pauta: "Todo tipo de documento dirigido al médico debe indicarle que opciones diagnosticoterapéuticas pueden adoptarse en circunstancias clínicas especificas." Incluso el comentario anexo a una separación electroforética, a fin de un dictamen integral, tiene igual importancia respecto a otros dictámenes en el marco de la medicina de laboratorio, tal y como indica la norma ISO 15189:2003, punto 3.8:

A pesar de los años, quizá demasiados ya, la pasión por el estudio de las proteínas del plasma ha perdurado en mis intereses profesionales. Por decenios se ha discutido sobre los métodos de separación en el ámbito electroforético, de las disoluciones amortiguadoras, de los soportes, de las tinciones, del grado de resolución, de la focalización, de la sensibilidad y de la precisión y exactitud. De ello que a veces, en un intento de perfección exagerada, se ha querido atribuir a estos métodos una potencialidad que va más allá de sus límites constitutivos. Pero el hecho es que, tal y como lo afirma Robert F. Ritchie (Clinical chemistry & laboratory medicine 2001, vol. 39, nº11, pg. 1045-1053): “Las seroproteínas tienen una característica única que pocos análisis tienen, están relacionadas entre sí, o dicho con otras palabras, el efecto sobre una, afecta a las demás. El análisis de las seroproteínas es de hecho una prueba multiuso, no un conjunto de pruebas independientes. En consecuencia, la medición de una sola proteína, por ejemplo, la haptoglobina para detectar hemolisis, disminuye tremendamente la capacidad diagnóstica.” De esto se desprende que para utilizar del todo el potencial diagnóstico que ofrecen los análisis de las proteínas del plasma, es indispensable la colaboración estrecha entre el laboratorista y el médico y que ambos tengan conocimientos suficientes de los campos recíprocos de interés. Nuestra intención es sensibilizar al laboratorista sobre la complejidad de la

Electroforesis

1) La valoración semicuantitativa 2) La valoración cualitativa: 3) La valoración de la monoclonalidad, que es el más adecuado de los tres objetivos. A. Burlina, 1992 Muchos lectores considerarán inadecuada la definición de Electroforesis semicuantitativa, al creer que sólo deben confiar en las pruebas nefelométricas y turbidimétricas para calcular la concentración de proteínas específicas. ¡Están absolutamente en lo cierto! Lo que los autores entienden por Electroforesis semicuantitativa, no es más sino la consideración de que buen sistema electroforético, automatizado y bajo control estadístico, puede proporcionar, a través del tiempo, datos comparables y homogéneos estadísticamente. Esta situación permitirá la aceptación, con un alto grado de probabilidad estadística, de los datos electroforéticos ponderales como indicadores de valores normales, aumentados o disminuidos. A los métodos específicos, el deber de calcular la ponderalidad real. Todo lo mencionado se encuentra en los siguientes subcapítulos: a) Sistema electroforético automatizado y bajo control estadístico:

“El laboratorio de análisis clínicos es aquel para el análisis biológico, microbiológico, inmunológico, químico, inmunohematológico, hematológico, biofísico, citológico, anatomopatológico y demás del material de origen humano, a fin de proporcionar información para el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades, o bien, para valorar la salud del hombre…y que además, puede proporcionar un servicio de consulta que comprende todos los aspectos de la investigación de laboratorio, incluida la interpretación de resultados y la sugerencia de estudios diagnósticos apropiados”. También: “El laboratorio, además de la responsabilidad de proporcionar respuestas precisas, tiene que asegurarse lo más posible de que se interpreten y apliquen en el mejor interés del paciente.” “Acciones especializadas en la selección e interpretación de pruebas forman parte del servicio del laboratorio.” C6.3 Anexo C: Ética en el laboratorio de medicina Norma ISO 15189:2033(E) Estas definiciones de la norma ISO sustentan la definición de aplicabilidad del examen electroforético: “adecuada es la prueba cuyo resultado responde a la interrogante clínica y que permite adoptar una decisión o emprender una acción” Price CP, 2000: “adecuado es todo lo que puede beneficiar al paciente” “en una medicina cada vez más compleja, debemos evitar que algunos pacientes no reciban la intervención que necesitan, y que otros reciban la que no necesitan” R.H. Brook, 1994: La electroforesis de las proteínas del suero y orina es una prueba que tiene como objetivo:

Electroforesis

Idoneidad: adecuado y conveniente ….adecuada es la prueba capaz de proporcionar una respuesta a un problema clínico y que permite tomar una an decisión o emprender una acción. CP Price 2000 Prueba

Interrogante

Resultado

Informe Exhaustivo

Risposta al problema Respuesta

Eficacia diagnóstica

El significado de la eficacia diagnóstica

MLB y su realización La práctica de la MLBE requiere la integración de la experiencia clínica personal con la mejor evidencia de laboratorio derivada de investigaciones sistemáticas.

¿Enfermedad? Malattia ?

Diagnóstico

Patologia Patología conocida nota

Esito positivo

Tratamiento Cura

Éxito positivo

Norma de oro global EBLM

EBM

Norma de oro personal

D. D.Giavarina Giavarina2004 2004

Cualitativo: modificaciones químicas y físicas a cargo de C3, Hpt. Y C.M.

Electroforesis

Valoración cuantitativa

Valoración cualitativa

Norma de oro separada

Norma de oro personal

La finalidad de la eficacia diagnóstica en ETF

Búsqueda de la monoclonalidad

Norma de oro independiente

Norma de oro global

Cuantitativo: Condiciones heterocigotos y homocigotos a cargo de Alb., AAT, Trf, C3 y Hpt.

Norma de oro personal

A. Burlina 1992

Norma de oro independiente

Norma de oro separada

Desarrollo cognoscitivo individual: formación continua.

III

¿Cómo debe llevarse a cabo el control de calidad en ETF?

Norma de oro independiente Norma de oro global Norma de oro personal

Norma de oro independiente

• ¡Cosas pequeñas y simples para obtener grandes resultados!

Norma de oro separada

El control de calidad

Dirigido en primer instancia a la mejor evidencia posible. Ejemplo: Esempio: La ejecución de las proteínas urinarias debe pasar por el soporte de agarosa y por un colorante sensible.

Los valores de referencia deben ser establecidos por cada laboratorio y para la población correspondiente.

Norma de oro separada Norma de oro separada Norma de oro personal

Norma de oro independiente

Los valores de referencia del fabricante contra el laboratorio

Norma de oro separada

Postura sin prejuicios y centrada en la completa colaboración entre técnicos y médicos de laboratorio con el fin de responder a las siguientes preguntas: a) ¿La prueba es precisa y reproducible? ¿Será ejecutada e interpretada correctamente? b) ¿Cuál es la predictividad previa a la prueba? c) ¿La probabilidad pos prueba modificará la gestión de la enfermedad? d) ¿La significatividad de la respuesta y del dictamen será evaluada positivamente por médico?

Electroforesis

Áreas electroforéticas

Fabricante X Densitómetro A Valores en %

Fabricante X Densitómetro B Valores en %

Albúmina Gamma

56/ 61/ 66 10/41/18

60/65.5/71 8.5/12.2/16

Valores del laboratorio en % n = 7700 56/61/66 11/15.5/20

Comentarios sobre los valores de referencia: los densitómetros A y B fueron producidos por el mismo fabricante y ambos leen el mismo soporte de agarosa. Resulta fácil considerar, a la luz de los valores expresados por el fabricante contra los elaborados en el laboratorio, la necesidad de que cada laboratorio debe estimar sus propios valores de referencia.

Fig. 1: Prueba ideal o patognomónica, de sensibilidad y especificidad clínica total y de potencia diagnóstica absoluta. Fig. 2: Prueba inútil, de sensibilidad y especificidad clínica del 50%. Es como tirar una moneda al aire. Fig. 3: Prueba habitual, pues presenta un área característica de superposición. La sensibilidad y la especificidad clínica son intermedias y, por consecuencia, la potencia diagnóstica.

El control de calidad

La precisión: control mensual de la misma muestra.

Funciones de la prueba de Tonks A= Pacientes sanos B= Pacientes enfermos C= La superposición de las colas de las dos áreas anteriores y su amplitud delimita el sector 2, que comprende los falsos positivos y negativos.

La prueba de Tonks propone el valor máximo de CV% dentro del cual los datos siguen siendo significativos. Albúmina Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 Beta 2 Gamma

CV% Máx.= 2 CV% Máx.= 6 CV% Máx.= 5 CV% Máx.= 4 CV% Máx.= 4 CV% Máx.= 6

El uso sistemático, semanal, de la prueba de Tonks contrae y mantiene bajo control la zona C.

Porcentaje de errores clínicos aplicando la prueba de Acland Lipton a los datos de Tonks

Tonks DB: Clin Chem 9:217 1963

Albúmina: Tonks Máx.= 2% Albúmina: Rango normal = 56-66%

El significado diagnóstico de una prueba

Con un valor de 54%, ¿qué probabilidad posee de ser normal por error de reproducibilidad?

Probabilidad= 1.5%

Electroforesis

Porcentaje de errores clínicos aplicando la prueba de Acland Lipton a los datos de Tonks

Porcentaje de errores clínicos aplicando la prueba de Acland Lipton a los datos de Tonks Gamma: Rango normal = 11-20% Con un valor de 13%, ¿cuánta probabilidad posee de ser anormal por error de reproducibilidad? Gamma Tonks = 4% Probabilidad = 2.5 %

Gamma: Tonks Máx.= 6% Gamma: Rango normal = 11-20% Con un valor del 13%, ¿qué probabilidad posee de ser anormal por error de reproducibilidad? Probabilidad = 5%

b) Los datos electroforéticos como indicadores, de un modo significativo, de normalidad, aumento y disminución. • Materiales y métodos: • Selección de 20 sueros para el emparejamiento de albúminas electroforéticas con nefelométricas. • Doce muestras de suero con una concentración de IgA policlonales que oscila entre los 100 mg/dl y los 600 mg/dl. • Cien muestras séricas, tanto normales como patológicas, de 55 mujeres y 45 hombres entre los 18 y 75 años. • Método de Biuret y muestra blanco para la determinar las proteínas totales. • Nefelómetro de Behring para la determinación de proteínas específicas de las cien muestras de suero. • Sistema Microgel de electroforesis en placas de gel agarosa y tinción azul ácido. • Inspección por dos expertos y valoración proteínica con adjetivaciones correspondientes a los números del 1 al 5. • La prueba de Kolmogorov y Smirnov y la de paralelismo para el estudio de las poblaciones de datos electroforéticos (adjetivaciones traducidas en números del 1 al 5) y nefelométricos (g/l). • En los gráficos las curvas verdes corresponden a los datos electroforéticos y

Conclusiones de los datos de Tonks Albúmina

CV% Máx.= 2

Alfa 1

CV% Máx.= 6

Alfa 2

CV% Máx.= 5

Beta 1

CV% Máx.= 4

Beta 2

CV% Máx.= 4

Gamma

CV% Máx.= 6

Electroforesis

Cualquier reducción de los valores de Tonks conducirá a una menor probabilidad de que los datos puedan pasar de normal a patológico y viceversa: véase la siguiente dispositiva.

las rojas, a los nefelométricos.

Dinámica electroforética de hasta 49 g/l Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

Dinámica electroforética de hasta 3.8 g/l

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

Dinámica electroforética de hasta 3.5 g/l Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

Electroforesis

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

Dinámica electroforética de hasta 4.9 g/l

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

VII

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

La diferencia promedio entre los valores para inmunoglobulinas de los dos métodos oscila entre los 2 g/l y los 3 g/l menos en relación con la electroforesis. Esta diferencia se debe a dos factores: 1) La diferente afinidad entre anticuerpos y color por las clases inmunoglobulínicas. Esto es evidente vista la estequiometria entre colorantes y aminoácidos. 2) El porcentaje de IgA electroforéticas que no se calculó porque migro por debajo del C3 y la transferrina. Respecto al punto 2, se realizó un estudio mediante trazador cúbico ecuación de tercer grado - aplicado a los puntos gráficos que dibujan la zona gamma. Pero, visto que el trazador cúbico es una ecuación de regresión polinomial, pudo haberse solicitado, basándose en la inclinación de la curva gamma hacia el C3 y la transferrina, la tendencia de regresión a la línea de base del gráfico, si el punto cero fuese el mínimo entre C3 y gamma, y luego entre transferrina y gamma. El primer gráfico pone de relieve que un porcentaje de inmunoglobulinas migró bajo el C3, así como hasta el comienzo de la transferrina.

Dinámica electroforética de hasta 1.7 g/l Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

Dinámica electroforética de hasta 26 g/l Nivel de significatividad > 0.05 Población con la misma distribución

Electroforesis

Prueba de paralelismo positivo F calculado < 3.96 F estadístico

VIII

El segundo gráfico pone de relieve que la muestra hipogammaglobulinémica debe reconsiderarse a la luz del gran porcentaje de inmunoglobulinas que migro bajo el C3 y más allá del mínimo densitométrico.

Cantidad total no calculada por el densitómetro en mg/dl

Cantidad no calculada bajo C3 en mg/dl

Cantidad no calculada bajo Tf en mg/dl

600

184

500

136

400

108

300

200

100

Los datos demuestran que un sistema electroforético “bajo control”, automatizado y en régimen estadístico, proporciona datos semicuantitativos adecuados para establecer una correlación congruente con los datos nefelométricos. Esto significa que un “sistema bajo control” puede ser un buen indicador para determinar la normalidad, aumento o diminución de proteínas específicas, dejando a la nefelometría y turbidimétria la confirmación y la determinación ponderal “verdadera”. A fin de llevar a cabo las tres valoraciones siguientes: 1) La valoración semicuantitativa: Condiciones heterocigotas y homocigotas a cargo de albúmina, la alfa 1 antitripsina, la transferrina, el C3 y la haptoglobina. 2) La valoración cualitativa: Modificaciones fisicoquímicas a cargo del C3, el complejo hemoglobinahaptoglobina y el componente monoclonal. 3) La valoración de la monoclonalidad (“el objetivo más adecuado de los tres”, Burlina 1992): Es fundamental que todo laboratorio examine su sistema electroforético a la luz de las recomendaciones especificadas en el contexto de la Medicina Factual (MBE) y de la Medicina de Laboratorio Basada en el Evidencia (MLBE). Medicina Factual (EBM) “Es el uso consciente, manifiesto y sensato de la mejor evidencia actual para la toma de decisiones en relación con el manejo del paciente”.

El tercer gráfico pone de relieve que un porcentaje signifcatvo de inmunoglobulinas migro bajo el C3 y la transferrina.

El trazador cúbico permitió elaborar la siguiente tabla de recuperación de inmunoglobulinas que el densitómetro no calculó por la colocación incorrecta del mínimo en el fondo del valle.

Electroforesis

Contenido de IgA en mg/dl

Incluso esta definición de Sackett y cols. incluye de forma específica al laboratorio como parte integral del proceso de toma de decisiones por el médico. Cabe señalar que la MBE se definió también como el proceso de formación personal de por vida. De lo anterior se desprende que la medicina es un campo en continuo descubrimiento, evolución y cambio, por lo que es importante asegurarse de que la práctica se base en la mejor evidencia disponible y que nos sea posible adoptar métodos nuevos, cuyo beneficio este demostrado. Medicina de laboratorio basada en la evidencia (MLBE): La práctica de la MLBE implica la integración de la experiencia clínica individual con la mejor evidencia de laboratorio resultante de estudios sistemáticos. Medicina de laboratorio basada en la evidencia (MLBE) y el método de referencia: Integrar los principios de la medicina de laboratorio basada en la evidencia, significa iniciar un proceso continuo de identificación de los análisis que, por un lado, ofrezcan la mejor eficacia y fiabilidad diagnóstica (método de referencia) y, por el otro, que provoquen menos riesgos y molestias al paciente, por no hablar del ahorro de trabajo, tiempo y dinero. Método de referencia El concepto de método de referencia está en constante cambio, es decir, no puede y no debe conocer la fase entálpica. Es un concepto en constante búsqueda de la mejor verdad - método - disponible, para un apoyo objetivo y eficaz de los verdaderos beneficiados finales de esta acción, los pacientes. El método de referencia actual en el marco electroforético lo representa la placa de gel de agarosa. Esto lo certifican algunos organismos y simposios en orden cronológico: 1. Archives of pathology & laboratory medicine. Vol. 123, pg. 123, febrero de 1999. 2. XXXVI Congreso Nacional de la Sociedad Italiana de Bioquímica y Biología Molecular, Padova 2004.

Electroforesis

3. XV edición del curso CEFAR “Le proteine: dal laboratorio alla clínica”, 2006. 4. American Journal of Clinical Pathology, 2008; 129:451-458. “Performance comparison of capillary and agarose gel electrophoresis for the identification and characterization of monoclonal immunoglobulins.”. 5. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2009; 47: 1021-1022 2009. Si el metanálisis es una “integración estructurada y sistemática de información derivada de diferentes estudios sobre un determinado problema…entonces, quizás, el procedimiento analítico de las proteínas séricas y urinarias en gel de agarosa, es capaz de lograr los objetivos que les son útiles al médico para mejorar el enfoque diagnóstico y/o el tratamiento. Sin embargo, el empleo del mejor método disponible no aminora el deber del laboratorio. El enfoque de los métodos electroforéticos, como procedimiento de diagnóstico, debe considerar una fase descriptiva y una interpretativa: a) La inspección visual del cuadro proteínico: Fase descriptiva redactada en términos moleculares, indicando la ausencia y presencia de proteínas supernumerarias, así como el aumento o reducción más adjetival de cada proteína especifica. En la fase descriptiva, el laboratorio debe identificar los componentes M y detectar proteínas de BJ. También puede cuantificar las proteínas específicas a fin de confirmar la inspección. b) La fase de “semiótica electroforética”: Fase interpretativa redactada en relación con los cuadros fisiopatológicos y asociaciones clínicas. Es deseable la adquisición de información biomédica. c) Dictamen completo La inspección del cuadro proteínico: Magnífica metodología para identificar cambios proteínicos, individuales o en conjunto, respecto al cuadro fisiológico: “Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales”

David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch. Pathol. Lab. Med. 1999;123:106–107) "El interprete deberá examinar directamente el gel...tanto de la electroforesis de suero, como de orina". En las siguientes imágenes se puede apreciar la nulidad de la lectura densitométrica sin la intervención de la interpretación:

Directrices: asociaciones clínicas Prealbúmina

Nefrosis

Albúmina

Inexistente

Alfa 1 antitripsina Alfa 2 macroglobulina

Efecto estrogénico, inflamación, necrosis, heteroplasia, hepatopatías

Necrosis, hepatopatía, diabetes, 3er trimestre del embarazo, infancia, senilidad Necrosis, heteroplasia, inflamación Anemia sideropénica, hepatitis, embarazo Obstrucciones biliares, inflamaciones no recientes Cirrosis hepática y biliar, alcoholismo, infecciones crónicas, hepatitis crónica, enfermedades autoinmunes Directrices: asociaciones clínicas

Prealbúmina

La pequeña banda homogénea del proteinograma (flecha) no fue detectada por la lectura densitométrica.

Albúmina

Hepatopatías, nefropatías, inflamaciones, caquexias, enteropatías dispersantes, heteroplasias

Alfa 1 antitripsina

Defectos genéticos

Alfa 2 macroglobulina

Fibrinólisis, artritis reumatoide, eclampsia, frecuente-

Haptoglobina

mente carece de significado Defectos congénitos, hepatopatías, hemolisis intravascular, eritropoyesis insuficiente

Transferrina

Hepatopatías, nefropatías, infecciones crónicas

Enfermedades autoinmunes, hepatopatías

Gammaglobulina

Inmunodeficiencia congénita o adquirida

c) Dictamen completo Proporciona una respuesta integral a la interrogante médica, para adoptar las medidas adecuadas de acción en el paciente. En este sentido, es necesario que el informe sugiera el resultado. Esto es que la prueba sea útil tanto una sola vez (1), como en el seguimiento (2):

La migración electroforética pone de relieve dos bandas homogéneas, de las cuales, la más catódica no existe en el gráfico (flechas). b) La fase “semiótica electroforética” que proporciona, a través de “arquetipos cognitivos”, conclusiones sobre el estado de la disposición proteínica.

Electroforesis

Inflamaciones, heteroplasias, hepatopatías

para un paciente determinado o para un grupo de pacientes, cambiar el enfoque clínico respecto al diagnóstico o el tratamiento. Por tal motivo el laboratorio debe: - Dar homogeneidad a los resultados. - Mejorar la eficacia de los métodos. - Proporcionar información sobre nuevas metodologías. El proceso diagnóstico se articula en torno a cuatro modelos de referencia: Deberes del laboratorio. 1) Identificación analítica del cuadro. Deberes del médico. 1) Reconocimiento del cuadro. 2) Razonamiento fisiopatológico. 3) Diagnóstico probable. Todo esto debe hacerse en pleno respeto de cada competencia, para lograr el concepto de globalidad del método de referencia: a) Personal: crecimiento cognoscitivo individual y formación continua. b) Independiente: dirigido en primer lugar a la mejor evidencia posible. c) Por separado: actitud sin prejuicios y centrada en la plena cooperación entre técnicos y clínicos de laboratorio para responder las siguientes preguntas: a) ¿La prueba es precisa y reproducible?, ¿se efectuará e interpretará correctamente? b) ¿Cuál es la previsibilidad de la prueba? c) La probabilidad posterior a la prueba, ¿modificará el tratamiento de la enfermedad? d) ¿La importancia del resultado y del dictamen será valorada de forma adecuada por el médico? La elaboración de este atlas tiene como objetivo principal proporcionar al lector un material iconográfico claro y completo de cada proteína específica y cuadros inmunofijativos, detectables con métodos electroforéticos en gel de agarosa. A. Ciapini

Modificado por C.P. Price. El método de referencia global En el laboratorio se aceptan diversos tipos de pruebas: - Los datos del desempeño analítico. - Los datos del control de la calidad interno y externo. - Los datos relativos a la especificidad y sensibilidad de las pruebas. Es raro, pero se tiene evidencia de que una prueba de laboratorio puede,

Electroforesis

XII

INTRODUCCIÓN

Los cambios tanto de cada proteína, como de un conjunto, deben interpretarse siempre sin olvidar la síntesis, la distribución, el catabolismo y, por tanto, los procesos fisiopatológicos que pueden modificar uno o más de estos momentos metabólicos. Asimismo, la inspección visual y, por consecuencia, la semiótica electroforética, deben hacer referencia a los conocimientos derivados del estudio de los mecanismos proteínicos. La siguiente tabla muestra los aspectos morfológicos y las funciones de las proteínas detectables en la electroforesis zonal: Proteínas especificas detectables:

difusa, a veces ondulante Alfa 1 glicoproteína ácida

41000

En concentraciones > 200 mg/dl, genera una banda difusa

Fase aguda

Alfa 1 antitripsina genotipo FF

54000

Banda nítida

Inhibidor de las proteasas

Alfa 1 antitripsina genotipo MM

54000

Banda marcada

Inhibidor de las proteasas

67000

Incrementos de la banda alfa 1 antitripsina genotipo MM pueden orientarnos a su determinación

Análogo fetoembrional de la albúmina

ZONA ALBÚMINA (del ánodo al cátodo) Proteína especifica

P.M. en D

Aspecto morf. y/o posición

Funciones

Prealbúmina

55000

Banda tenue

Transporte

Albúmina

66000

Banda intensa

Transporte y función oncótica

Alfa 1 Fetoproteína

ZONA INTER ALFA 1 ANTITRIPSINA-ALFA 2 MACRO (ánodo-cátodo)

ZONA INTER ALBUMINA-ALFA 1 ANTITRIPSINA (ánodo-cátodo) Proteína especifica

Apo A

Electroforesis

P.M. en D

30000

Aspecto morf. y/o posición

Banda por lo general

teico de la HDL

Funciones

Componente pro-

XIII

Proteína especifica

P.M. en D

Aspecto morf. y/o posición

Funciones

Alfa 1 antitripsina genotipo MS

5400

Dos bandas, una central y otra hacia alfa 2 macro

Inhibidor de la proteasa

54000

Dos bandas, una central y otra cerca de alfa 2 macro

Inhibidor de la proteasa

Alfa 1 antitripsina genotipo SS

54000

Banda descentrada hacia alfa 2 macro

Inhibidora de las proteasas

Alfa 1 antitripsina genotipo ZZ

54000

Banda cerca de alfa 2 macro

Inhibidora de las proteasas

170000

Bandas débiles de contornos difusos situadas en la zona genotipos de alfa 1 antitripsina

Inhibidora de las proteasas

Componentes grupo específicos

Banda débil de contornos difusos situada en la zona genotipos de alfa 1 antitripsina.

Trasportador de proteínas

Haptoglobina fenotipo 1 de 1

Banda débil que suele cubrir la zona de la inter alfa inhibidora, su frente catódico está muy cerca de alfa 2 macro

Alfa 1 antitripsina genotipo MZ

Inter alfa inhibidora de la tripsina

80000

Alfa 2 macroglobulina

Electroforesis

Fija la Hb, posee propiedad peroxidásica

160000

Catódica respecto a la alfa 2 macroglobulina

Fija la Hb, posee propiedad peroxidásica

Apo B

250000

Puede migrar anódica o catódicamente a la transferrina. Cuando es visible, tiene una morfología ondulante o extremos curvados.

Componente proteico de la LDL y la VLDL

C3c

180000

Por activación in vitro o en vivo puede ser anódica a la transferrina

Activación del C3 en la cascada del complemento.

Haptoglobina fenotipo 2 de 2

ZONA INTER TRANSFERRINA-INMUNOGLOBULINA (ánodo-cátodo) Fija la Hb, posee propiedad peroxidásica

Proteína especifica

ZONA INTER ALFA 2 MACRO-TRANSFERRINA (ánodo-cátodo) Proteína especifica

120000

Migra en gran parte sobre la alfa 2 macroglobulina

Haptoglobina fenotipo 1 de 2

P.M. en D

Aspecto morf. y/o posición

Funciones

800000

En relación con las posiciones de los fenotipos haptoglobínicos puede estar mal definida.

Inhibidor de las proteasas y de los factores de la coagulación, fibrinólisis y del complemento.

Transferrina

Crioglobulina

XIV

P.M. en D

Aspecto morf. y/o posición

Funciones

80000

Se presenta como una banda diferente. Se evidencian variantes lentas y rápidas. Las formas heterocigotas se presentan como dos bandas diferentes de igual intensidad.

Proteína principal para la fijación y transporte de hierro.

Variable

De ligeros a signos marcados de depósito. A veces, si está presen-

Crioglobulinemia

te, un CM puede migrar en la zona gamma (por lo general una IgM)

Fibrinógeno o PDF

185000

Se presenta como una banda distinta

Anafotoxina c3a, opsonización cb3, Quimiotaxis C3B, etc.

200000

Puede localizarse anódicamente al C3 como una banda tenue durante los procesos inflamatorios

Cuarto componente de la cascada del complemento

340000

Puede presentarse como una banda tenue entre el C3 y el inicio de la zona gamma por una coagulación incompleta o por la muestra de suero con liberación de PDF por el coágulo.

Inmunoglobulina

Electroforesis

P.M. en D

Aspecto morf. y/o posición

De 160000 a 970000

Zona larga y difusa de extremo anódico en la zona beta y catódico hasta las retromigraciones.

135000

Banda leve o distinta en la zona gamma central

Activador del complemento

Componentes monoclonales

De fragmentos de cadenas ligeras libres a IgM hexaméricas

Bandas leves o distintas por lo regular en la zona gamma, pero que pueden migrar de la zona alfa 1 a la zona postgamma.

Mieloma micromolecular Mieloma múltiple

Variable

Se observan bandas distintas, normalmente dos, en la zona gamma.

¿Crioglobulinemia?

Inmunocomplejos

Para que el lector comprenda mejor el significado de las imágenes en el atlas, tenemos dos proteinogramas de suero para ejemplificar que clases proteínicas son las más frecuentes y cuales menos.

Precursor de la fibrina

Prealbúmina Albúmina

ZONA INMUNOGLOBULINAS (ánodo-cátodo) Proteína especifica

Proteína C reactiva

Funciones

Alfa 1 glicoproteína ácida

Alfa 1 antitripsina heterocigota

Haptoglobina fenotipo 1:1 Haptoglobina fenotipo 2:1 Haptoglobina fenotipo 2:2

Alfa 2 macroglobulina

IgA

IgM

Fibronectina Transferrina Complemento fracción C3 Fibrinógeno o PDF

IgG

Anticuerpos.

Componentes proteínicos más frecuentes

Prealbúmina

Proteína

Albúmina

Desviación de la “norma”

Posible causas por confirmar

Disminución

Masa hepática celular baja Reacciones inflamatorias Malnutrición Heteroplasia Nefrosis

Alfa lipoproteína Alfa 1 antitripsina heterocigota Antiquimiotripsina Globulina Gc Ceruloplasmina IgA

Hemopresina Complemento fracción C4

Inhibidor de la inter alfa-tripsina Alfa 2 macroglobulina Haptoglobina Crioglobulina insoluble Beta lipoproteína Transferrina Complemento fracción C3 Fibrinógeno o PDF

IgM

IgG

Prealbúmina

PCR CM

Aumento

CM post gamma

Componentes proteínicos menos frecuentes Las proteínas pueden identificarse mediante inmunofijación y antisueros específicos. Así, podremos memorizar cada proteína como modelos mentales por su posición y morfología.

Disminución

Reacciones inflamatorias Formas tumorales Malnutrición Pérdida de peso Retención hídrica Hepatopatía Nefropatía Enteropatías dispersantes Caquexia

Aumento

Deshidratación

Albúmina

Por último, presentamos un ejemplo sobre cómo el conocimiento de las proteínas integrado a la “inspección visual” de la electroforesis, puede generar una propuesta de "semiótica de electroforesis” para el médico, con el objetivo de proporcionar elementos de apoyo que pueden ayudarle en la de definición de sus diagnósticos.

Electroforesis

Alfa lipoproteína

XVI

Puente anódico difuso Disminución de la intensidad Aumento de la intensidad

Medicinales Daño hepático Nivel incrementado de estrógeno Postmenopausia

Proteína

Alfa 1 antitripsina

Desviación de la “norma”

Posible causas por confirmar

Polimorfismo Disminución Aumento

Variantes genéticas Defectos genéticos Efecto estrogénico Inflamaciones Necrosis Heteroplasia Hepatopatías

Disminución Alfa 2 macroglobulina Aumento

Disminución Haptoglobina Aumento

Electroforesis

Proteína

Desviación de la “norma”

Polimorfismo Disminución Transferrina

Aumento

Fibrinólisis Artritis reumatoide Eclampsia A menudo sin razón Nefrosis Hepatopatías Diabetes Tercer trimestre del embarazo Infancia Senilidad

Beta lipoproteína

Aumento Movilidad

Disminución Complemento 3

Aumento Movilidad

Defectos congénitos Hepatopatías Hemolisis intravascular Eritropoyesis insuficiente Inflamaciones Heteroplasia Necrosis

Disminución Inmunoglobulinas Policlonales Aumento

XVII

Posible causas por confirmar

Variantes genéticas Hepatopatías Nefropatías Infecciones crónicas Malnutrición Anemia sideropénica Hepatitis Embarazo Estrógenos Hipercolesterolemia Movilidad disminuida por obstrucción biliar Enfermedades autoinmunes Hepatopatías Glomerulonefritis membranoproliferativa Inflamaciones pasadas Obstrucciones biliares Conversión in vivo/vitro: 1C a 1A Inmunodeficiencia congénita y adquirida Infancia Infecciones crónicas Alcoholismo Cirrosis hepática Hepatitis crónicas Enfermedades autoinmunes Cirrosis biliar

En definitiva, el enfoque del cuadro electroforético se desarrolla en dos etapas: 1) Primera etapa: obtención del proteinograma mediante métodos que faciliten migraciones electroforéticas de tipo “correcto”. “Recomendación oficial de la Comisión SIBioC, 2005 – Gior. IT. Chim. Clin. 15(1), 1990” A continuación se muestra una migración electroforética “correcta” de suero:

Banda prealbumínica tenue

Posible heterocigosis de alfa 1 antitripsina

o puede terminar bajo el C3 (véase el gráfico de las tres clases inmunoglobulínicas).

Zona alfa 2 con extremos catódico y anódico distinguibles Zona beta dividida en dos bandas: transferrina y C3

Zona gamma extendida y una sensibilidad de al menos 1 g/l en el ámbito policlonal

Recordemos que la zona gamma no termina en la banda de la proteína específica C3. De hecho, como puede apreciarse en la siguiente imagen, las inmunoglobulinas policlonales pueden migrar hasta cubrir parcialmente la zona alfa 2 (inmunofijación de electroforesis de las inmunoglobulinas policlonales de una muestra normal):

Electroforesis

2) Segunda etapa: en función de las conclusiones interpretativas del cuadro electroforético, se procede a determinar cada proteína, o los “cuadros proteínicos” de interés clínico para el caso, o a validar los resultados interpretados visualmente siempre que el sistema electroforético garantice los requisitos de reproducibilidad y correlación con la nefelometría, y que todas las proteínas especificas de interés estén representadas conforme al siguiente esquema:

XVIII

PROCESO INFLAMATORIO AGUDO: PCR, AAG, Hp, C3. Este “cuadro” permite la valoración cuantitativa y la determinación de la “edad de la fase aguda”, así como una posible hemolisis intravascular. La haptoglobina y la alfa 1 glicoproteína ácida aumentan y disminuyen con simultaneidad en el proceso inflamatorio y tras un aumento de estrógenos, respectivamente. El aumento de haptoglobina normal y alfa 1 glicoproteína ácida sugiere la presencia de hemolisis. ANEMIA: Hpt, Tf, AAG. La transferrina aumenta en la anemia ferropénica, y disminuye en la hemolisis intravascular. En el proceso inflamatorio agudo, se observan cambios contrarios de ambas proteínas. La alfa 1 glicoproteína es un indicador útil del proceso inflamatorio agudo, porque, como sabemos, aumenta. PERFIL INMUNOLÓGICO: IgG, IgA, IgM, C3, C4, AAG. La determinación de la alfa 1 glicoproteína es útil para la detección de una respuesta inflamatoria aguda, que puede estimular la síntesis de C3 y C4, ocultando una reducción por consumo. ENFERMEDADES AUTOINMUNES: C3, C4, IgA, Hpt y AAG La haptoglobina y la alfa 1 glicoproteína son útiles para identificar una hemolisis intravascular (véase el proceso inflamatorio agudo). ENFERMEDADES RENALES: ALB, AMG, C3, C4, Trf, IgG. La determinación de la transferrina y las IgG en suero, así como en orina, es útil para valorar la selectividad de la proteinuria. La determinación de la albúmina y la alfa 2 macroglobulina también es útil para valorar la perdida proteínica y la selectividad. ENFERMEDADES HEPÁTICAS: AAT, AGG, Hpt, C3, IgG, IgA, IgM. La alfa 1 antitripsina es útil para evidenciar una deficiencia congénita. En los procesos inflamatorios hepatocelulares, la alfa 1 antitripsina aumenta, pero la alfa 1 glicoproteína ácida y la haptoglobina disminuyen. En los procesos inflamatorios de los conductos biliares hay una respuesta clásica de la APR. El C3 aumenta en la obstrucción de las vías biliares; la IgA, en la cirrosis alcohólica; la IgM, en la cirrosis biliar primaria; la IgG, en la hepatopatía crónica agresiva.

Electroforesis

CUADROS MONOCLONALES: Sobre la base de los conocimientos actuales, los componentes M o paraproteínas pueden definirse como moléculas inmunoglobulínicas completas o fragmentos (cadenas pesadas y/o ligeras) producidos en exceso por una población celular que deriva de un sólo clon inmunitario; reconocibles en el proteinograma electroforético por la presencia de una banda homogénea completa, expresión de su homogeneidad estructural. Aunque a menudo carecen de la actividad biológica de la clase a la que pertenecen, la inmunoglobulina monoclonal no debe considerarse necesariamente un componente M de significado anticorporal. La amplia difusión del estudio electroforético de tamizado ha permitido el reconocimiento de un número de casos cada vez mayor en los que el componente M parece ser “benigno” en individuos aparentemente sanos. El término “gammapatía monoclonal”, introducido por Waldenstrom, suele utilizarse para indicar todas las condiciones asociadas con alteraciones inmunoglobulínicas monoclonales. El empleo de la técnica de inmunofijación, hoy en día el método de elección, es indispensable para las siguientes tipificaciones: EN TODOS LOS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS DE INTERÉS: 1) Para la identificación de inmunoglobulinas monoclonales en una baja concentración. 2) Para la identificación de inmunoglobulinas monoclonales ocultas por las bandas de migración electroforética normal. 3) Para la identificación de las cadenas ligeras monoclonales. 4) Para la identificación de la clase de las inmunoglobulinas monoclonales detectadas en electroforesis. 5) Para la identificación de todas las proteínas específicas. Todos los trabajos publicados hasta la fecha refieren que la IFE (inmunofijación) debe considerarse como el método de referencia actual. Así que, nada ha cambiado desde que el CAP (Colegio Estadounidense de Patólogos) declaró que:

XIX

Por tanto, los de más difícil identificación son los que migran coincidiendo con las fraccionas proteínicas normales, por ejemplo: • Los aumentos injustificados de haptoglobina, de transferrina, o del complemento, así como una hipogammaglobulinemia marcada, que hacen sospechar la presencia de componentes M ocultos. • En tal caso lo indicado es determinar las proteínas implicadas mediante el método inmunoquímico, o bien, se aconseja proceder directamente a la tipificación. • La morfología del componente M puede adoptar formas particulares: • Las IgD monoclonales pueden originar bandas difuminadas por degradación postsintética in vivo o in vitro. • La enfermedad por cadenas pesadas puede presentar componentes M difíciles de identificar por dos razones: en proporciones variables dependiendo de la clase inmunoglobulínica implicada, que van del 50% en las alfa, al 75% en las mu, a menudo no pueden observarse cambios significativos a la electroforesis. Segundo, cuando se presentan, adoptan casi siempre la forma de una banda de base amplia y márgenes difusos, simulando un aumento de tipo policlonal. • Esto se debe a que son cadenas delta, de masa molecular variable de paciente a paciente e inferior a las contrapartes normales, que, en más, tienden a formar dímeros de alto contenido en carbohidratos. • Los componentes monoclonales IgM pueden ocasionar problemas específicos en relación con la electroforesis y, por tanto, con la inmunofijación, por su estructura polimérica y tendencia a formar complejos que no migran del punto de deposición o que originan distorsiones en el proteinograma. • Esto es más habitual con los soportes de acetato, puesto que tienen poros más pequeños respecto a los de la agarosa. • El hallazgo nada raro de múltiples bandas anormales corresponde a la proliferación anómala de múltiples clones de plasmocitos o a modificaciones postsintéticas como la polimerización, o incluso debido a la presencia simultánea de inmunoglobulinas completas y de cadenas ligeras libres del mismo tipo. • Asimismo, se hace referencia a los cuadros de gammapatías oligoclonales,

“La electroforesis de inmunofijación (IFE) es el método de elección para identificar los componentes monoclonales”. David F. Keren, MD Archivos de Patología Clínica y Ciencias de Laboratorio Clínico, vol. 123, febrero de 1999. Caracterización de la inmunofijación de gammapatías monoclonales, pág. 129, párrafo primero. No obstante, es una buena idea adquirir dos equipos de antisueros de compañías diferentes para amplificar el espectro policlonal de los antisueros. Pues la probabilidad de tipificar un mayor número de componentes monoclonales será mayor. Los problemas que enfrenta el laboratorista para el estudio de los componentes monoclonales pueden esquematizarse en los siguientes puntos: • Identificación de la anomalía sospechada • Interpretación de los resultados • Proteinuria de Bence Jones • Identificación de la anomalía sospechada La detección del componente M puede ser un hallazgo casual (como suele ocurrir durante la electroforesis rutinaria) o la confirmación de laboratorio de la sospecha clínica. En el caso de un hallazgo ocasional, el prerrequisito básico para no perder los componentes M, es disponer de un sistema electroforético adecuadamente resolutivo (SIBioC: electroforesis correcta). Los componentes M pueden presentarse de formas diversas en el proteinograma electroforético, tanto por localización como por aspecto morfológico. De hecho, los podemos encontrar en posiciones que suelen estar libres de otras proteínas visibles, condición que no plantea problemas de detección, sobre todo al tratarse de concentraciones elevadas del componente M y/o en combinación con una disminución de las gammaglobulinas policlonales. En cuanto a la velocidad de migración, los componentes M pueden situarse en cualquier lugar de la zona alfa 1 (véase la iconografía del atlas) a la zona gamma catódica, rara vez con retromigración.

Electroforesis

debidos, quizá, a la estimulación antigénica prolongada. Ahora examinemos las anomalías cualitativas del proteinograma no atribuibles al componente M. Nos referimos en concreto a la presencia de polimorfismos genéticos, tales como: • La aloalbuminemia, la heterocigosis de la alfa 1 antitripsina, de la transferrina y del C3. Proteínas distintas de las inmunoglobulinas dan lugar a bandas delgadas: • La α fetoproteína, en caso de una concentración elevadísima. • El complejo α1 antitripsina y proteasa. • Los complejos haptoglobina y hemoglobina o hemoglobina libre, por hemolisis in vitro. • El C3 convertido, en caso de sueros no frescos. • El fibrinógeno, en caso de una coagulación muy lenta. • La lisozima en las leucemias mielomonocíticas y monoblásticas. • La proteína C reactiva, sobre todo en ciertas disoluciones amortiguadoras no barbitúricas. • Gammapatías monoclonales: sus cuadros clínicos. A) Formas clínicamente ocultas: asintomáticas o presintomáticas Gammapatías monoclonales de significado indeterminado (GMSI), asociadas con: • Inflamaciones crónicas y procesos infecciosos, por ejemplo, osteomielitis, tuberculosis, infecciones biliares crónicas, pielonefritis, artritis reumatoide, etc. • Sarcoma de Karpof y SIDA. • Neoplasias no reticulares, en particular, tumores intestinales, del tracto biliar y de las mamas. • Lipodistrofia, en particular con enfermedad de Gaucher, hipercolesterolemia familiar y xantomatosis. Gammapatías monoclonales transitorias, asociadas con: • Hipersensibilidad a los fármacos; difenilhidantoína y sulfonamidas. • Infecciones virales.

Electroforesis

• Cardiocirugías: prótesis valvulares. B) Formas clínicamente manifiestas vinculadas a la proliferación del clon neoplásico • Mieloma múltiple • Mieloma solitario • Plasmocitoma extramedular • Leucemia plasmacelular • Macroglobulinemia de Waldenstrom • Enfermedad por cadenas pesadas gamma • Enfermedad por cadenas pesadas alfa • Enfermedad por cadenas pesadas mu • Enfermedad por cadenas pesadas y ligeras delta C) Formas clínicamente manifiestas por los efectos patológicos del compuesto M: • Amiloidosis AL • Enfermedad por depósito de inmunoglobulinas o cadenas • Liquen mixedematoso (mucinosis papular) • Síndrome de Fanconi del adulto • Polineuropatías • Síndrome POEMS • Síndrome de extravasación capilar Dificultades en el laboratorio para la detección de algunos componentes M. 1) Amiloidosis AL Es necesario un estudio detallado de la orina concentrada para la detección de cadenas ligeras libres o sus fragmentos, sobre todo de cadenas lambda. Depósitos organizados en láminas beta, birrefringentes a la luz polarizada. 2) Enfermedad por depósito de cadenas ligeras Se diferencia de la amiloidosis AL debido a que los depósitos de cadenas ligeras no están organizados en láminas beta, birrefringentes a la luz polarizada, sino como depósitos amorfogranulares. Las cadenas ligeras kappa son más frecuentes a diferencia de la amiloidosis

XXI

AL. Los sitios de deposición son similares en ambas formas. La concentración de cadenas ligeras libres en la orina suele ser muy baja. El diagnóstico se basa por lo general en los resultados de la determinación de los depósitos de cadenas ligeras mediante la inmunofluorescencia de la biopsia renal. 3) Síndrome de Fanconi del adulto Puede asociarse con una gammapatía monoclonal IgGK, son raros los casos de IgGL, y proteinuria de Bence Jones k. El síndrome de Fanconi, acompañado por glicosuria, fosfaturia, etc., puede preceder en años a la detección de la gammapatía monoclonal, que, por lo general, evoluciona lentamente. Se presume que las cadenas ligeras libres kappa son tóxicas para el túbulo contorneado proximal. 4) Anemias hemolíticas por crioanticuerpos (crioaglutininas) Suelen ser IgM monoclonales, presentes en una concentración baja, identificables después de la adsorción y elución de los eritrocitos. 5) Enfermedad por cadenas pesadas En el caso de cadenas pesadas alfa no se aprecia un pico monoclonal. La detección de cadenas pesadas libres suele realizarse por indicación del médico, o bien, se debe a la comparación entre la determinación de las inmunoglobulinas y el cuadro electroforético, puesto que, frente a un nivel elevado de IgA, no se aprecia ningún pico en el proteinograma. Las cadenas pesadas gamma y mu pueden, pero no siempre, originar un pico electroforético. 6) Liquen mixedematoso (mucinosis papular) Se asocia con frecuencia a compuestos M IgG lambda de escasa cuantía en el extremo catódico. 7) Síndrome POEMS Una rara variante de discrasia plasmacelular caracterizada por: • Polineuropatía con endocrinopatía

Electroforesis

• • • • • •

Osteoesclerosis Policitemia Hepatoesplenomegalia Linfadenopatía Pigmentación cutánea Hipertricosis El componente M es pequeño, más frecuente IgG que IgA, con un gran predominio de las cadenas ligeras lambda. En estos casos la evolución de la enfermedad es típicamente indolente. 8) Polineuropatías Es cada vez más frecuente la descripción de polineuropatía crónica progresiva (sensitiva, motriz o mixta) asociada con G y M. Asimismo, pueden estar asociadas con mieloma múltiple, macroglobulinemia o amiloidosis, aunque la polineuropatía puede ser la única y más importante manifestación clínica. 9) Síndrome de extravasación capilar Es un síndrome poco frecuente, se han reportado 9 casos, caracterizado por IgG kappa o lambda y episodios periódicos de extravasación vascular que resultan en un choque hipovolémico y angioedema generalizado. Problemas específicos de interpretación Hay ciertos casos que plantean problemas de interpretación en relación con la lectura de la inmunofijación. Un ejemplo típico es la presencia de crioglobulinas en el suero. Tipología de las crioglobulinas Continuamos con una serie de indicaciones sobre la tipología de las crioglobulinas: Crioglobulinemia I de Brouet • Macroagregado por interacciones electrostáticas intramoleculares. • Inmunoglobulinas monoclonales que tienden a formar consigo mismas, por razones fisicoquímicas, complejos de alto peso molecular. • Es más frecuente la clase M tipo kappa.

XXII

• Las clase G y las subclases IgG1, G2, G3 son menos frecuentes. • Raramente la clase A. • Organización del crioprecipitado: Amorfa; sin organización supramolecular. Tubular; organizada y muy hidratada. Cristalina; organización muy compacta. La organización más dañina es la IgG3 en criocristales. Crioglobulinemia II variante “a” de Brouet • Inmunocomplejos. • La génesis formativa presenta actividad biológica de inmunoglobulina. • Inmunoglobulinas monoclonales, por lo general M, de actividad anticorporal dirigida contra las IgG policlonales, rara vez contra las IgA. • Tendencia a formar complejos con inmunoglobulinas policlonales y factores reumatoides. • El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. • Los factores reumatoides monoclonales resultan de la proliferación anómala de un clon de plasmocitos. Crioglobulinemia II variante “b” de Brouet • Inmunocomplejos. • La génesis formativa presenta actividad biológica de inmunoglobulina. • Inmunoglobulinas oligoclonales, por lo general M, de actividad anticorporal contra IgG policlonales, raramente contra las IgA. • Tendencia a formar complejos con las inmunoglobulinas policlonales y factores reumatoides. • El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. • Los factores reumatoides monoclonales resultan de la proliferación anómala de un clon de plasmocitos. Crioglobulinemia III de Brouet • Inmunoglobulinas policlonales

Electroforesis

• Se compone de una o más inmunoglobulinas. • Los factores reumatoides implicados resultan de la perturbación y magnificación del proceso fisiológico de inmunomodulación durante la respuesta al antígeno. Crioglobulinemias “microheterogéneas” de Musset • Presencia de dos o más componentes monoclonales ligeros. • Presencia de un entorno policlonal. • Es más frecuente el tipo G y M. Crioglobulinemia II/III y II/III v de Tissot • Presencia de M monoclonales y policlonales. • Asociación de las M con IgG policlonales. • Presencia de M oligoclonales. • Asociación con trazas de inmunoglobulinas policlonales. Clínicamente se distinguen: a) Las crioglobulinemias secundarias o asociadas con distintas patologías: • Patologías linfoproliferativas: mieloma de Waldenstrom, LLC y linfomas. • Patologías autoinmunes: LES, artritis reumatoide, panarteritis nodosa, etc. • Patologías infecciosas: hepatitis viral, mononucleosis infecciosa, sífilis, malaria, etc. • Patologías crónicas de etiología incierta: hepatitis crónica, glomerulonefritis crónica. b) La crioglobulinemia mixta esencial no asociada con otra patología Se caracteriza por un cuadro sintomatológico relacionado con la acción dañina del crioprecipitado, representado por purpura, manifestaciones de tipo Raynaud, artralgias y alteraciones renales. ¿Cómo se distribuyen las inmunoglobulinas policlonales y monoclonales en la electroforesis? • Inmunoglobulinas policlonales Las inmunoglobulinas G, A, M, D, E y tipo k o l se denominan policlonales, ya que son el producto de múltiples clones de idiotipo y punto isoeléctrico diferente.

XXIII

Sometidas a un proceso electroforético, migran en distintos puntos del soporte y producen, después de la tinción, una zona gamma larga y difusa:

Albúmina

Cadenas pesadas IgA

Distribución de las inmunoglobulinas policlonales

Punto isoeléctrico de 5 a 6.6 Vector campo eléctrico Punto isoeléctrico de 8 a 5 Vector campo eléctrico

b) Algunos componentes M, aunque son producto del mismo clon, pueden presentarse como bandas múltiples tras la migración electroforética debido a la polimerización. Dicho fenómeno es más común para las IgA (monómeros, dímeros, y trímeros), para las IgM (trímeros, pentámeros y hexámeros) y para las proteínas de Bence Jones:

• Inmunoglobulinas monoclonales Estas inmunoglobulinas, producto de un sólo clon discrásico, se caracterizan por una cadena pesada (G, A, M, D o E) y por un tipo de cadena ligera (k o l). Por tanto, tienen un solo idiotipo y el mismo punto isoeléctrico. Sometidas a un proceso electroforético migran en un mismo punto del soporte y producen, después de la tinción, una zona estrecha (banda homogénea) en el ámbito de las inmunoglobulinas policlonales:

Dímero Monómero Trímero

Ig monoclonales Ig policlonales Vector campo eléctrico Punto isoeléctrico 7

c) Algunos componentes M, aunque son producto del mismo clon, se presentan como dos bandas tras la migración electroforética, una constituida sólo por cadenas pesadas y la otra por cadenas ligeras libres.

Vector campo eléctrico

Todo lo dicho puede tener excepciones: a) Enfermedad por cadenas pesadas (generalmente IgA). En estos casos vemos una agregación de cadenas pesadas y sus fragmentos, sin la cadena ligera correspondiente. Si la muestra se somete a la migración electroforética, producirá una banda larga e intensa:

CM de cadenas pesadas CM de cadenas ligeras libres

Vector campo eléctrico

Electroforesis

XXIV

La determinación de los componentes monoclonales De todos los problemas relacionados con el sistema inmunofijativo, el más apremiante es el relativo a la determinación de los componentes M. Todos los componentes M ocasionales son de significado incierto, y sólo tras 4 años de control se podrá discriminar entre las formas estacionarias y las evolutivas. Visto que no hay una prueba confiable para diferenciar las formas benignas de las malignas, la progresión clínica biohumoral (determinación densitométrica) es el criterio diferencial más válido. Durante el control de los pacientes, ¿cuánto debe variar el componente M para afirmar que está en una etapa evolutivo-progresiva? De todas las comisiones operantes de siempre en el sector electroforético, sólo el C.A.P. (Colegio Estadounidense de Patólogos) en 1998, durante el congreso XXXII de Chicago, a través de una revisión colosal del tema, estableció el valor porcentual de incremento del componente M, que puede considerarse significativo durante el seguimiento del paciente. Dicho valor del 20%, se confirmó en los documentos que siguieron al congreso: “Regístrese cualquier incremento o disminución del componente M respecto a la determinación anterior. Pues, en nuestro laboratorio, es significativo un incremento o una disminución del 20% respecto a la determinación anterior”. Procedimientos para la valoración de los componentes monoclonales David F. Keren, MD Archivos de Patología Clínica y Ciencias de Laboratorio Clínico, vol. 123, febrero de 1999. Pág. 132: Control de calidad para la valoración de un componente M. Como todos sabemos, hoy en día, la determinación del componente M parte del cálculo de proteínas totales, seguida de la electroforesis de las muestras y, por último, tras la delimitación del componente M con mínimos, se obtiene su determinación como porcentaje del valor en gramos de proteínas totales. Ahora analicemos los errores que afectan el proceso de determinación. 1) Un método electroforético en gel de agarosa tiene una variabilidad entre

Electroforesis

días que respeta el principio de Tonks. El error es del 6%. 2) La determinación de proteínas totales se ve afectada por un error comprendido entre el 3% y el 6%. 3) La determinación de proteínas totales es inespecífica. Hemos demostrado experimentalmente y presentado a la CEFAR 2005 los siguientes resultados de los métodos Biuret y turbidimétrico: • La adición de 0.5 g/l de albúmina no fue detectada. • La adición de 1 g/l de albúmina fue detectada como un incremento entre 0.1 g/l y 0.2 g/l; la de 2.5 g/l, entre 0.5 g/l y 0.8 g/l. • La adición de 0.5 g/l de IgG, IgA e IgM no fue detectada. • La adición de 0.5 g/l y de 1.0 g/l de IgG, IgA e IgM fue detectada como un incremento de 0.3 g/l. • Las adiciones de 1.0 g/l y 2.5 g/l de IgG, IgA e IgM fueron detectadas como incrementos de 0.3 g/l y 1.5 g/l. Así que, las variaciones proteínicas inadvertidas, manteniendo el valor de proteinemia total, provocan errores en el cálculo porcentual del componente M, iguales a una media, determinada experimentalmente, del 2%. 4) La colocación de mínimos en torno al componente M es un grave factor de errores. Demostramos experimentalmente (CEFAR 2005) el tipo de error que comete uno o varios operadores al delimitar un pequeño componente M; véase la siguiente imagen:

XXV

El programa Trazador cúbico transforma los 512 puntos de la lectura del gráfico en 10688 puntos, que permiten una búsqueda mucho más sensible de variaciones en la tendencia (perfil) de la curva gráfica. Esta función es un apoyo en el análisis de los componentes M y no sustituye la inspección visual que, de cualquier modo, debe ser efectuada por un operador experto. La secuencia de operaciones que el laboratorio debe realizar es: 1) Determinar, solo la primera vez que se identifica la muestra como positiva, las proteínas totales de la muestra portadora del componente monoclonal. 2) Ejecutar la electroforesis. 3) Examinar la migración electroforética e identificar la zona donde está el componente monoclonal.

• El mismo operador delimita el componente M en diferentes momentos. El error es del 15%. • Distintos operadores circunscriben el componente M. El error es del 28%. El error total, calculado del punto 1 al 4 con el teorema del error global, es del 21.45%. Dicho valor supera al que el C.A.P. considera suficiente para hablar de un cambio significativo del componente monoclonal. Por tal motivo, con el objetivo de implementar la importancia clínica de la determinación del componente monoclonal, iniciamos un estudio relativo a la posibilidad de reducir un 15% tal error. El desarrollo matemático de un algoritmo capaz de identificar la previsión estadística de la curva representativa del componente M, disperso en inmunoglobulinas policlonales, permitió eliminar los errores de los puntos 2, 3 y 4, salvo el error de repetibilidad del 6%, correspondiente al sistema electroforético. Ig monoclonales

4) Examinar el gráfico densitométrico para identificar la zona donde se vio el componente monoclonal:

Ig policlonales

Punto isoeléctrico 7 Vector campo eléctrico

En la actualidad, todos los instrumentos de Interlab ya cuentan con el programa informático, presentado en la CEFAR 2005, trazador cúbico. Este cuenta con una búsqueda automática de base neuronal, para detectar modificaciones en la tendencia del gráfico que pueden conducir a suponer la presencia de una banda homogénea (componente M). Esta función es una herramienta de apoyo para la detección de los componentes monoclonales y no sustituye a la inspección directa de la migración electroforética, que, de cualquier modo, la debe efectuar un experto. El programa cuenta con una búsqueda automática, en una base neuronal, para la búsqueda de cambios en la forma de la curva gráfica que puedan sugerir la presencia de una banda homogénea (CM).

Electroforesis

XXVI

Delimitarla más o menos con dos mínimos y solicitar el cálculo al programa.

6) El valor integral es la piedra angular del sistema, y no es otro sino la D.O. - densidad óptica o número de fotones absorbidos por la tinción asociado con la monoclonalidad - del componente monoclonal. 7) En el archivo del paciente positivo para el componente M, se registrarán los valores: porcentual, gr/l e integral. 8) En el control del paciente que se presenta de nuevo para el seguimiento y saber si el componente M es estable o no, el laboratorio realizará sólo la electroforesis. 9) Se leerá la migración electroforética con el densitómetro y solicitará al programa informático calcular el componente M (trazador cúbico). El operador deberá controlar sólo el valor integral. Si este se encuentra dentro + o - del 5% del valor integral anterior, el componente M es estable. Pero si supera esta oscilación, se considerará en progresión, o en remisión si disminuye. 10) Si dicho valor varía por arriba o abajo del 5%, una simple proporción entre los valores integrales - relación entre el penúltimo y el último valor integral, multiplicado por el primer valor en g/l - dará el valor actual del componente M en g/l. 11) Otra posibilidad es que el laboratorio determine las proteínas totales y compare los datos clásicos con los del valor integral. Con este sencillo procedimiento eliminamos 15% del error global, calculado con el teorema del error global, introducido por:

5) El programa buscará los puntos de inflexión que circunscriben al componente M, así como cualquier otro pico.

Calculará la tendencia estadística de las pendientes de cada flanco, describirá la curva y dará el valor porcentual, en g/l y el integral del área del componente M.

Electroforesis

XXVII

1) La determinación de proteínas totales como error de reproducibilidad. 2) La determinación de proteínas totales como insensibilidad a las variaciones inmunoglobulínicas y de otras proteínas. 3) La variabilidad del operador u operadores en la colocación de los mínimos en torno al componente M. Ejemplo práctico: la inspección de la electroforesis evidenció una banda homogénea en la zona gamma central. El barrido densitométrico de la muestra en estudio es solicitado; se coloca un mínimo a la derecha y otro a la izquierda de la zona en cuestión. El programa identifica los puntos de inflexión del componente M y, basándose en las pendientes - coeficientes angulares - del componente M, describe la superficie (verde) ocupada por el componente M: 7.6% del área total x 70 g/l de P. Tot. = 5.0 g/l del CM; Integral = 454 (véase la siguiente figura).

Electroforesis

Calcúlese sólo el valor integral del paciente durante el seguimiento. Podemos distinguir tres casos diferentes: 1) Valor integral estable, comprendido entre 430 y 478 (+/- 5% de 454). El componente M es estable en 5.0 g/l. 2) Valor integral modificado a 590: CM en progresión. Cálculo del CM en g/l: 590/454 = 1.3; 1.3 x 5.0 g/l de la primera determinación = 6.5 g/l, nueva determinación. 3) Valor integral modificado a 300: CM en remisión. Calculo del CM en g/l: 300/454 = 0.66; 0.66 x 5.0 g/l de la 1a determinación = 3.30, nueva determinación. Con el procedimiento descrito se evitan los errores de los puntos 1, 2 y 3. Como primera conclusión de este ejemplo, en función del nuevo e innovador método para determinar el CM, queremos demostrar la inalterabilidad del valor integral (valor del CM) a los cambios de la disposición proteínica. Supongamos que el paciente del caso anterior presenta una reducción progresiva de las inmunoglobulinas policlonales, que simularemos con la eliminación de un área del gráfico. Con los métodos normales de cálculo, vista la insensibilidad de los métodos para determinar proteínas totales en los ejemplos presentados al comienzo del informe, el valor de proteínas totales permanece inalterado, pero disminuye la cantidad de inmunoglobulinas policlonales. Así, el CM ocupará un mayor valor porcentual y, de esta manera, parecería que aumentó, pero es el mismo. En esta simulación eliminamos un área de gamma.

XXVIII

Como se puede ver, el porcentaje del componente monoclonal aumentó de 7.1 a 7.7, mientras que el valor integral es siempre de 454. Esto indica que el valor integral no fue afectado por ningún parámetro y, por lo tanto, es un valor absoluto. Como segunda y última conclusión, presentamos la determinación de un componente monoclonal con el método convencional, o bien, la colocación de los mínimos a discreción. El primer operador determino que el componente M era igual a 5.3%, tal y como se muestra en la siguiente imagen.

El lector intuirá, basándose en la falsedad del método, a discreción e interpretación personal, cuánto varía la concentración dependiendo del criterio de quien valora. La enorme ventaja de utilizar el trazador cúbico se relaciona con la reproducibilidad de los datos. Ejemplo El primer operador coloca los dos mínimos en torno al componente M graficado:

El segundo operador determinó que era igual a 3.4%.

Electroforesis

El componente M se calculó de forma ponderal, resultando igual a 3 g/l.

XXIX

El segundo operador coloca los mínimos en torno al componente M graficado:

Diferencia máx.

Aproximadamente 1

Ejemplo 2 Mínimos manuales

Ejemplo 1 N= 10 Operador 1 Operador 2 Operador 3

Media CM g/l 2.10 1.24 1.23

Electroforesis

CV% 15.1 33.2 34.5

Trazador Cúbico Media CM g/l 2.41 2.41 2.41

CV% 7.82 7.82 7.82

Operador 1 Operador 2 Operador 3 Diferencia máx.

13.0 11.1 9.0 4.0

CV% 6.14 12.8 5.58

Media CM g/l 10.28 10.28 10.28 0

CV% 2.49 2.49 2.49

CV% Promedio Integral 587 3.5 3.5 3.5

Resulta evidente deducir que en ambos casos al cambiar de operador, el valor ponderal del componente M resulta en crecimiento, calculado con el método tradicional y, por consecuencia, en progresión. Recordemos que la muestra biológica es siempre la misma y que las variables son el operador y la repetición de la prueba. Por el contrario, las determinaciones ponderales obtenidas con el trazador cúbico no sólo son las mismas al cambiar el operador, sino que también no cabe duda de que el componente M siempre tiene la misma concentración. Por primera vez en el panorama internacional electroforético, Interlab ha desarrollado un programa informático “trazador cúbico” capaz de armonizar los resultados en el laboratorio y, potencialmente, entre laboratorios donde se utilice la misma instrumentación. Otra fuente de errores conexa a la determinación de la concentración del componente M comprende las situaciones relacionadas con la inmunofijación y el exceso de antígenos. En estos casos es inevitable que el operador deba diluir la muestra, para la tipificación, y que repita la prueba a fin de establecer la clase y tipo del componente M, así como para detectar los componentes M que migraron cerca de la forma con exceso de antígenos, que pudieran quedar ocultos por la redisolución de los agregados participantes en la tipificación del componente M pri-

Aún cuando la posición de los mínimos en torno al componente M es diferente, el trazador cúbico restablece el valor ponderal igual a 3 g/l. La verdad es que esta función llegará al mismo resultado, sea quien fuere el usuario. Como ejemplo presentamos dos tablas de datos experimentales, relativos a la reproducibilidad de la función mencionada. Durante 10 días se repitió la electroforesis (simulación del seguimiento), luego tres operadores se alternaron (al azar) en la inserción de los mínimos para obtener la determinación del componente M. Los siguientes valores estadísticos incluyen la variabilidad del sistema electroforético.

Mínimos manuales

N= 10

Media CM g/l

Trazador Cúbico

CV% Medio Integral 166 6.2 6.2 6.2

XXX

De esto deriva que el antisuero y los antígenos están o no en equilibrio (curva Heidelberger-Kendall):

mario. En función del índice de dilución, se calculará entonces la concentración del componente M. Dicho procedimiento implica siempre un gran margen de error por la respuesta no lineal de la relación que vincula proteínas-anticuerpos que reaccionan con el colorante y por la cantidad de colorante fijado a las proteínas en relación con el tamaño estérico del colorante mismo y con los espacios ahora permeables por la reacción en relación con la cantidad reducida de CM por unidad de volumen de gel. Para solucionar estos problemas y para evitar repeticiones de pruebas que implican tiempo de trabajo y costes de material, Interlab ha desarrollado un tipo de inmunofijación que funciona “al revés”, partiendo del estudio de: A. Ciapini, C. Ciaiolo, G. Marietti, R. Deiana, G. Marletto, Bioquímica Clínica, vol. 12, julio de 1988.” Según el método clásico de inmunofijación descrito por Alper C. A. y Johnson A.M. Electroforesis de inmunofijación: una técnica para el estudio del polimorfismo de las proteínas. Vox Sang 1969; 17: 445-452 y cambios posteriores. El antisuero se estratifica sobre toda la superficie de las proteínas que migran en la electroforesis. El color sólo representa mejor lo que se está explicando:

Electroforesis

Zona de medición

Zona de equivalencia

Zona de exceso de antígeno

Punto crítico:

Punto crítico dez

Señal de turbidez

Nivel de antígenos que puede ocasionar resultados erróneos si no se señala de manera adecuada.

Incremento del nivel de antígenos

Si no hay equilibrio, se deriva, por ejemplo, un exceso de antígenos con redisolución de los agregados. En el sistema Interlab, la estratificación del antisuero se efectúa sobre un frente de menor longitud respecto al ocupado por la migración electroforética.

XXXI

El antisuero, por tanto, tendrá distintas velocidades de propagación según y cómo se propague en la parte media (máxima concentración) o terminal del componente M (mínima concentración). Véase la imagen con los vectores a y b:

Por consiguiente, el antisuero se propaga de tal forma (inmunodifusión radial simple de Mancini) sobre las proteínas subyacentes, que se autodiluye activamente: Distribución ponderal del CM IgK

A b s o r c i ó n

Concentración máxima

Concentración mínima

En caso de que el antisuero se encuentre en equilibrio, la precipitación de los agregados será tangente al arco de difusión, generando así una precipitación puntiforme convexa que producirá geometrías precipitativas globales en arco (véase la imagen anterior a la derecha). El efecto final estará compuesto por una precipitación en equilibrio de forma clepsídrica. En caso de que el equilibrio se encuentre en los extremos derecho e izquierdo del componente M, tendremos la clásica forma de clepsidra:

Milímetros

A la vez que el antisuero se propaga, este fluye y penetra entre las proteínas que se encuentran en concentraciones decrecientes, entre su punto medio interno (pico del gráfico) y los extremos catódico y anódico (concentración mínima): Distribución ponderal del CM IgK

A b s o r c i ó n

Concentración máxima

Concentración mínima

Cuando el equilibrio no existe, por la concentración elevada del componente M, entonces la inmunoprecipitación tendrá lugar en los extremos catódico y anódico del componente M:

Milímetros

Electroforesis

XXXII

Diluciones-IgG

Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgG Estudio de los valores integrales

El término "inmunofijación reversa” deriva de toda esta situación. En dicha inmunofijación tenemos dos signos patognomónicos indicativos de la presencia del componente M: La barra central y la forma clepsídrica lateral. Respecto a los componentes M pequeños, se formará solo la barra con una clepsidra prácticamente invisible. En la siguiente imagen se puede apreciar la plasticidad de la inmunofijación reversa. De hecho, la presencia simultánea de dos componentes M de gran diversidad de concentración, generó dos formas precipitativas:

Diluciones-IgG Diluciones-IgG

Valor ponderal de un componente M IgG expresado linealmente hasta los 35 g/L.

1) La IgGK expresada con inmunoprecipitado en forma de “clepsidra”. 2) La IgMK expresada con inmunoprecipitado en forma de “barra”

Diluciones-IgA

Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgA

Diluciones-IgA Diluciones-IgA Diluciones-IgG

El efecto final será no tener que diluir las muestras con valores elevados de componente M hasta una concentración, determinada experimentalmente, de:

Electroforesis

Valor ponderal de un componente M IgA expresado linealmente hasta los 27 g/L.

XXXIII

IgA IgM Alfa 1 glicoproteína ácida Ceruloplasmina C4 Proteína C reactiva

Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgM Estudio de los valores integrales

Los valores ponderales de referencia en relación con los “métodos de referencia” Ahora presentamos una cuadro donde se expresan los valores ponderales de las proteínas que se esperan (valores de referencia atribuidos a las proteínas con los métodos de determinación apropiados) en una población sana.

Diluciones-IgM Diluciones-IgM

Proteínas en el suero

Valor ponderal de un componente M IgM expresado linealmente hasta los 30 g/L. Valores ponderales de referencia. Respecto a los valores de referencia para los cuadros electroforéticos siempre es necesario que todo laboratorio establezca sus propios valores de referencia basándose en el tipo de pacientes remitidos - presentamos en el siguiente cuadro los valores ponderales (ejecución nefelométrica) recomendados por la OMS, basados en la preparación internacional de referencia CRM 470. Proteínas en el suero

Intervalos de referencia en g/l (SI)

Prealbúmina Albúmina Alfa 1 antitripsina Alfa 2 macroglobulina Haptoglobina Transferrina C3 ( en muestras frescas) IgG

0.2-0.4 35-52 0.9-2.0 1.3-3.0 0.3-2.0 2.0-3.6 0.9-1.8 7.0-16.0

Electroforesis

0.7-4.0 0.4-2.3 0.5-1.2 0.2-0.6 0.1-0.4 De hasta 0.005

Prealbúmina

Albúmina

Alfa 1 antitripsina

XXXIV

Rango de referencia en g/l (SI)

Inferior o igual a 4 años - 0.2 Mayor a 4 años 0.2 0.4 Neonatos 38 - 42 Adultos 35 - 50 Menores a 3 años 0.8-2.0 Sobre los tres años 0.9-2.0

Alfa 2 macroglobulina

1.3 - 3-0

Haptoglobina

Adultos fenotipo independiente 0.30 2.0 Hp 1 - 1; 0.7 - 2.30 Hp 2-1 0.9 - 3.60

Método de determinación

Referencia a CRM 470

Verde Bromocresol Material de referencia CRM 470 Inmunoturbidimetría y CRM 470

Nefelometría

Transferrina

C3 (en muestras frescas)

IgG

Electroforesis

Hp 2 - 2 0.6 - 2.90 2 semanas 1.03-3.23 6 meses 1.52-3.52 1 año 2.15-3.99 2-14 años 2.40-3.60 Adultos 2.0-4.0 1.3-3.6 Menor a 3 meses 0.6-1.5 Entre 4 y 6 meses 0.7-1.6 Mayor a tres meses 0.9-1.8 Neonatos 7.0-16.0 De 1 a 3 meses 2.5-7.5 De 4 a 6 meses 1.8-8.0 De 7 a 12 meses 3.0-10.0 2 años 3.5-10.0 De 3 a 5 años 13.0 De 6 a 9 años 6.0-13.0

Nefelometría

IgA Material de referencia CRM 470

Material de referencia CRM 470 IgM

XXXV

De 10 a 13 años 7.0-14.0 Adultos 7.0-16.0 Neonatos No determinable 1-3 meses 0.05-0.5 4-6 meses 0.8 7-12 meses 1.4 2 años 1.2 3-5 años 0.4-1.8 6-9 años 0.6-2.2 10-13 años 0.7-2.3 Adultos 7.0-4.0 Neonatos 11.0-0.35 1-3 meses 0.12-0.87 4-6 meses 0.25-1.20 7-12 meses 0.36-1.04 6 años 0.55-1.20 11 años

Material de referencia CRM 470

Nefelometría

Los factores que pueden alterar los resultados; de ahí la necesidad de adquirir valores de referencia propios. 1) Edad del paciente (véase: "Los valores ponderales de referencia en relación con los métodos de referencia"). 2) Sexo (véase: "Los valores ponderales de referencia en relación con los métodos de referencia"). 3) La postura: sucede que en sujetos sanos que están de pie, o bien, en ortostatismo, la concentración proteínica (sérica, plasmática o de sangre total) puede ser un 10% mayor respecto a los sujetos en clinostatismo. En sujetos con tendencia a enfermedades edematosas, tales diferencias pueden ser mayores. Las muestras de sangre, siempre que sea posible, deberán tomarse siempre de pacientes en posición supina o, como alternativa para el seguimiento, siempre en la misma postura. 4) Torniquete: una estasis prolongada (5 minutos) conlleva un aumento de la concentración proteínica de hasta un 20%. Los torniquetes deberán aplicarse durante tiempos cortos (1 minuto), con una tención que cause una presión aproximada de 60 mmHg. 5) Actividad física: tal condición puede elevar la concentración proteínica entre un 10% y un 15%. 6) Alimentación: un desayuno ligero no implica alteraciones en la determinación de las proteínas. 7) Los ritmos circadianos y los factores funcionales: en el caso de estudios de control proteínico, se recomienda repetir la toma de muestra a la misma hora. Por ejemplo, la concentración de proteínas totales es menor en el mañana. La recolección de orina extemporánea, para determinar la proteinuria de Bence Jones, resulta mejor si se realiza entre las 9 horas y las 13 horas (segunda micción). 8) Los ritmos circanuales: la concentración de albúmina es mayor en el otoño (3%) que en al verano. 9) Influencia de la altitud: los pacientes que viven en la montaña presentan aumentos significativos de alfa 1 antitripsina, alfa 2 macroglobulina, proteína C reactiva y transferrina.

0.66-1.55 Adultos Mujeres 0.60-3.70 Hombres 0.50-3.20 Alfa 1 glicoproteína ácida

0.5-1.2

Ceruloplasmina

0.15-0.60

0.20-0.50

Proteína C reactiva

<0.005

Proteínas totales

66-87

Material de referencia CRM 470 Nefelometría Material de referencia CRM 470 Material de referencia CRM 470 Método de Biuret

Las interferencias más comunes: A fin de una eficacia mayor en la interpretación de los cuadros electroforéticos, presentamos un cuadro explicativo sobre las concentraciones de los interferentes más comunes. Proteína

Prealbúmina Alfa 1 antitripsina Alfa 1 glicoproteína ácida Haptoglobina Transferrina C3 C4 PCR IgG IgA IgM Cadenas ligeras

Electroforesis

No hay interferencia hasta mg/dl…

Hemolisis 400 500

Triglicéridos 400 1500

Bilirrubina 500 250

600

1500

650

150 1600 300 100 1000 1100 1100 1100 400

700 1800 300 150 5000 2000 1500 1500 800

600 850 400 300 700 350 300 400 450

XXXVI

10) El tabaco: los sujetos adictos al tabaco experimentan un aumento significativo de alfa 1 glicoproteína ácida, proteína C reactiva, albúmina urinaria, y ferritina, así como una disminución de la concentración de albúmina, IgG e IgA. 11) El embarazo: se observan concentraciones elevadas de alfa 1 antitripsina, alfa 2 macroglobulina, C3, IgD, C4, ceruloplasmina, albúmina urinaria y transferrina, así como una diminución significativa de alfa 1 glicoproteína ácida, prealbúmina, albúmina, IgG, IgA y ferritina. Por ejemplo, la sideremia presenta un ritmo circadiario con acrofase de 10.26, y una disminución de la concentración entre el 50% y el 60% de las 7 a las 8 de la mañana. 12) Postmenopausia: en estos pacientes la concentración de alfa 1 glicoproteína ácida y haptoglobina aumenta incluso en un 50%. 13) Anticonceptivos orales: los estrógenos suelen reducir la concentración de alfa 1 glicoproteína ácida y haptoglobina, pero también incrementan la concentración de ceruloplasmina, prealbúmina, transferrina, alfa 2 macroglobulina y alfa 1 antitripsina. 14) Soluciones para perfusión: los derivados de la gelatina reaccionan como proteínas en la determinación proteínica con el método de Biuret, así como el sorbitol y mantinol. El polivinilpirrolidon no causa interferencias; el amino hidroxietil y el destrano en la electroforesis, causan un gradiente catódico (distorsión de la zona gamma) e interfieren con la tinción negro amido. La estabilidad de las muestras de suero y orina a temperaturas distintas

Albúmina Alfa 1 antitripsina Alfa 2 macroglobulina Haptoglobina Transferrina C3 C4 Bence Jones K-L IgG IgA IgM IgD IgE

-20°C

4-8°C

20-25°C

Tiempo de conservación

3 semanas

3 días

1 día

Proteínas totales

Proteínas totales Albúmina Alfa 1 microglobulina Alfa 2 macroglobulina inmunoglobulinas Bence Jones K-L

Proteínas del suero Proteínas

-20°C

4-8°C

20-25°C

Estabilizadores

Proteínas totales

1 día

1 año

4 semanas

6 días

Electroforesis

3 meses 3 meses

1 semana 7 días

2 meses

1 mes

7 días

3 meses 6 meses 8 días 1 mes 5 meses

3 días 8 días 8 días 4 días 2 meses

4 días 8 días 4 días 4 días 7 días

6-12 meses 6-8 meses 6 meses 6 meses 6 meses

3 meses 3 meses 3 meses 10 días 7 días

3 meses 3 meses 7 días 7 días 7 días

-20°C

4-8°C

20-25°C

1 mes

7 días

5 días

3 meses

1 mes

6 meses

1 mes

7 días

3 meses

7 días

Inestables

5 meses

1 mes

6 meses

1 mes

7 días

EDTA Heparina

Proteínas de la orina:

La electroforesis del suero: Electroforesis de las proteínas

3 meses 3 meses

XXXVII

Estabilizadores

Azida de sodio 0.1%

LA INSPECCIÓN Y LA SEMIÓTICA ELECTROFORÉTICA DE LOS PATRONES PROTEICOS

Prealbúmina Albúmina Alfa lipoproteína Heterocigosis de alfa 1 antitripsina Antiquimiotripsina Globulina Gc Ceruloplasmina IgA

Hemopresina Complemento fracción C4

Inhibidor de la inter alfa-tripsina Alfa 2 macroglobulina Haptoglobina Crioglobulina insoluble Beta lipoproteína Transferrina Complemento fracción C3 Fibrinógeno o PDF

IgM PCR IgG

CM post gamma

Las seroproteínas específicas más frecuentes e identificables a la inspección.

Prealbúmina Albúmina Alfa 1 antitripsina Alfa 2 PFR macroglobulina Transferrina Beta 2 microglobulina K o L libre Ig policlonales Cistatina C Lisozima

Representación gráfica de la migración electroforética y la posición de las proteínas específicas.

Proteinograma de orina en agarosa teñido con violeta ácido Posición de cada proteína plasmática separada por una carga eléctrica neta.

ATLAS ICONOGRÁFICO DE LOS PROTEINOGRAMAS DE SUERO Y DE ORINA EN GEL DE AGAROSA

PATRONES SEROPROTEÍCOS DE CADA PROTEÍNA ESPECÍFICA Y METABOLITOS COMIGRANTES

PROTEÍNA prealbúmina/transtiretina

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Organismos: Homo sapiens Helix pomatia Gallus gallus Streptococcus Brassica napus Finegoldia magna

Importancia clínica: con un tenor elevado de triptófano, una semivida breve (2 días) y una baja concentración, la prealbúmina es un buen y rápido indicador de la inflamación, desnutrición (junto con PCR) y diminución del parénquima hepático. Además, de las más de 50 variantes genéticas identificadas, algunas son amiloidogénicas. ▲ Tratamiento corticoesteroideo, esteroides anabolizantes, enfermedad de Hodgkin, alcoholismo, acromegalia. ▼ APR, hepatopatías, nefropatías, trastornos de la nutrición, amiloidosis hereditaria, hiperestrogenismo, hipertiroidismo, administración intravenosa de líquidos.

Molécula de prealbúmina fijada a triyodotironina

Electroforesis

PROTEÍNA prealbúmina/transtiretina

Gráfico no. 21

Las tinciones de uso común, tal y como el azul ácido, negro amido y rojo de Ponceau S, tienen una afinidad baja por esta proteína. Un excelente densitómetro, por consecuencia, es aquel capaz de detectar incluso cantidades pequeñas de prealbúmina fijada a las tinciones aniónicas mencionadas. Este es quizá el único caso en que el instrumento puede reemplazar la inspección electroforética

Electroforesis

Aι Aι

pre

α1

α2

β1 β2

Aι Aι

pre

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA prealbúmina/transtiretina

Gráfico no. 3

Electroforesis

Aι

pre

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA prealbúmina/transtiretina

El empleo de tinciones más afines, por ejemplo, violeta ácido, nos permite detectar la transtiretina.

ID 30010

Muestra con un nivel normal de transtiretina.

Electroforesis

ID 30011

Muestra con un nivel bajo de transtiretina.

PROTEÍNA albúmina

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Organismos: Homo sapiens Helix pomatia Gallus gallus Streptococcus Brassica napus Fidegnolia magna

Electroforesis

Importancia clínica: históricamente ha sido el indicador general del estado proteínico del organismo. Sin embargo, su fiabilidad está comprometida por: • una larga semivida de 19 días • una disminución de su síntesis durante la mayor parte de los procesos inflamatorios. Hasta la fecha: tiene un valor pronóstico, particularmente en pacientes crónicos. ▲ Hemoconcentración. ▼ APR, hepatopatías, síndromes nefróticos, trastornos de la nutrición, embarazo, neonatos prematuros, analbuminemia congénita.

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

A la izquierda, paciente con un nivel bajo de albúmina. A la derecha, muestra con un nivel normal de albúmina.

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1

β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

Hipoalbuminemia en posición supina. Muestra de la izquierda: pacientes hospitalizados y postrados en cama presentan hipoalbuminemia por redistribución de albúmina en los espacios extravasculares.

ID 00313

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1

β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA albúmina, condición analbuminémica

Gráfico no. 12

ID 00311

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 21

Gráfico no. 20

A la derecha, muestra con albúmina que transporta fármacos.

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

016

A la izquierda, la deshidratación es el único factor que provoca un incremento de la albúmina.

ID 80

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

ID 70017

A la izquierda, sobrecarga de la función de transporte de la albúmina con aspecto de albúmina “rápida” por ensanchamiento anódico debido a la presencia de bilirrubina (muestra ictérica), Además, en la zona beta anódica se aprecia una pequeña convexidad compuesta por bilirrubina.

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 12

Gráfico no. 13

ID 60018

A la derecha, muestra con aloalbuminemia heterocigota variante rápida de transmisión autosómica dominante.

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 2

Gráfico no. 3

A la derecha, muestra con aloalbuminemia heterocigota variante lenta de transmisión autosómica dominante.

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 17

Gráfico no. 18

A la izquierda, muestra con aloalbuminemia heterocigota variante lenta de transmisión autosómica dominante.

Electroforesis

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

ID 12021

Bisalbuminemia rápida por una pancreatitis confirmada o fármacos.

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA albúmina

Gráfico no. 12

Gráfico no. 13

Bisalbuminemia rápida por fármacos.

Electroforesis

PROTEÍNA alfa lipoproteína (APO A)

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Archaea Organismos: Homo sapiens Mus musculus Bos taurus Rattus norvegicus Escherichia coli Gallus gallus Torpedo californica

Electroforesis

La electroforesis de lipoproteínas es un método sencillo y útil para el estudio de las dislipidemias. Su diferenciación en función de la movilidad electroforética, es la base de la clasificación de Fredrickson. Las alfas lipoproteínas o HDL (lipoproteína de alta densidad) son la fracción más rápida. Representan la mayor parte de las lipoproteínas y migran a la zona comprendida entre la albúmina y la alfa 1 antitripsina.

PROTEÍNA alfa lipoproteína (APO A)

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

SPE ApoA IgA IgM

A la derecha, muestra libre de Apo A A la izquierda, muestra con un fondo discreto (Apo A) en la zona comprendida entra la albúmina y la alfa 1 antitripsina

Electroforesis

PROTEÍNA alfa 1 glicoproteína ácida

Importancia clínica: es útil tanto para el seguimiento precoz de la APR (24 horas), como para el diagnóstico diferencial entre procesos inflamatorios y los efectos de la terapia estrogénica. Taxonomía: Eucariotas Virus Bacterias Organismos: Homo sapiens Virus de la hepatitis C subtipo 1b Virus de la hepatitis C BK Virus de la hepatitis C HC-J4 Torpedo californica Camelus dromedarius

Electroforesis

▲ APR entre 2 y 4 veces, AR, neumonía, neoplasias (renales, pulmonares, etc.), insuficiencia renal crónica, tratamiento con corticoesteroides, uso de andrógenos. ▼ síndrome nefrótico, embarazo, terapia estrogénica, neonatos, hepatopatía, trastornos de la nutrición.

PROTEÍNA alfa 1 glicoproteína ácida

Gráfico no. 1

Muestra en el estadio inicial de la inflamación (tinción azul ácido), libre de AGP. Las tinciones de uso común, tal y como el azul ácido, negro amido y rojo Ponceau S, tienen una afinidad baja por esta proteína. Aún así, esta proteína se detecta en concentraciones hemáticas superiores a los 150 mg/dl. El uso de tinciones más afines, como la violeta ácida, permite su detección aún en concentraciones bajas.

8026

ID 0

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 1 antitripsina

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Archaeas Organismos: Homo sapiens Bos taurus Rattus norvegicus Hirudo medicinalis Escherichia coli Fusarium oxisporum

Electroforesis

Importancia clínica: su deficiencia congénita se asocia al desarrollo de hepatomegalia, cirrosis juvenil, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfisema; en individuos de origen noreuropeo se observa un incremento de la incidencia de hepatomas. Es de utilidad realizar los estudios genéticos familiares para valorar el riesgo (fenotipos MZ, SS, SZ, ZZ). ▲ APR cuatro veces mayor por 10 horas, embarazo, terapia estrogénica o androgénica, hepatitis aguda, hepatopatía aguda (incluido el alcoholismo), neoplasias. ▼ deficiencia congénita, síndrome nefrótico, hepatopatía o pancreoptia terminal, trastornos de la nutrición y caquexia.

PROTEÍNA alfa 1 antitripsina

Gráfico no. 26

A la derecha, muestra con niveles normales de AAT. A la izquierda, muestra con AAT heterocigota variante lenta. Las formas heterocigotas no indican ninguna patología, pero son útiles para valorar el poder resolutivo del sistema electroforético. ID 07028

Electroforesis

Gráfico no. 25

Proteína específica

Alfa Alfa Alfa Alfa

P.M. D

1 antitripsina genotipo 1 antitripsina genotipo 1 antitripsina genotipo 1 antitripsina genotipo

Aι

α1

α2

MS MZ SS ZZ

β1 β2

54000 54000 54000 54000

Aspecto morfológico y/o posición

Dos bandas, una central y la otra hacia alfa 2 macro Dos bandas, una central y la otra cerca de alfa 2 macro Banda descentralizada hacia alfa 2 macro Banda cerca de alfa 2 macro

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 1 antitripsina

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

529

A la derecha, muestra con niveles normales de AAT. A la izquierda, muestra con AAT heterocigota rápida. Las formas heterocigotas no incidan ninguna patología, pero son útiles para valorar el poder resolutivo del sistema electroforético. ID 67

Electroforesis

Aι

α1

29 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 1 antitripsina

Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

A la derecha, muestra con niveles normales de AAT. A la izquierda, muestra con un déficit total de AAT.

ID 33330

Electroforesis

Aι

α1

30 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 1 antitripsina

Gráfico no. 14

Gráfico no. 15

A la izquierda, muestra con un nivel normal de la AAT. A la derecha, muestra con un ligero aumento de la AAT.

ID 71031

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

TRIGLICÉRIDOS

Los distintos estudios para comprobar la existencia de una asociación entre los niveles plasmáticos de triglicéridos (TG) y el desarrollo de arteriopatías coronarias (AC), ya sean estos prospectivos o de caso y control, han aportado resultados discrepantes en parte entre sí. Aunque es cierto que los niveles de TG están relacionados con la incidencia de AC, no siempre son predictivos de nuevos episodios cardiovasculares cuando se consideran otros riesgos importantes, tales como la hipertensión, el tabaquismo, la hipercolesterolemia y los niveles bajos de colesterol HDL. No obstante, el papel clave de la determinación de los TG recae en el diagnóstico de las hiperlipemias familiares y en el diagnóstico y control de la hiperlipoproteinemia familiar combinada. Por otro lado, está claro que los estudios electroforéticos no conllevan claridad o aportan diagnóstico a este capítulo de las ciencias de laboratorio clínico. En la electroforesis, el aumento de triglicéridos puede identificarse como una coloración de fondo entre la zona alfa 1 y alfa 2 macroglobulínica.

Electroforesis

TRIGLICÉRIDOS

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

A la derecha, muestra libre de TG. A la izquierda, muestra con TG entre la zona alfa 1 y alfa 2 macroglobulínica.

ID 87033

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA Gc componente grupo específico

Taxonomía: Homo sapiens Organismos: Eucariotas

Importancia clínica: el Gc es el transportador de la vitamina D. En pacientes con trastornos vasculares, así como en tratamiento heparínico, se observan niveles elevados. Es denominado también como la proteína del sistema extracelular depuradora de actina G, pues impide que polimerice a actina F. Sin embargo, en los fenómenos necróticos, si no es detenido dicho mecanismo, es dañino para el citoesqueleto. Por otro lado, tiene un efecto antitrombótico en la modulación de la trombosis intravascular.

Molécula de Gc (color blanco) que ha secuestrado a otra molécula.

Electroforesis

PROTEÍNA Gc componente grupo específico

Gráfico no. 18

Gráfico no. 17

A la derecha, muestra con Gc sobre la zona alfa 2 (nótese su forma típica, levemente ganchosa en los extremos y deprimida en el centro). A la izquierda, muestra libre de Gc.

ID 11135

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1 α2 β1 β2

PROTEÍNA Gc componente grupo específico

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

68036

A la izquierda, muestra con Gc sobre la zona alfa 2 (nótese la típica forma levemente ganchada en los extremos y deprimida en el centro), en un paciente tratado con heparina por un día. A la derecha, el mismo paciente al tercer día de tratamiento con migración de Gc entre la alfa 2 macroglobulina y la transferrina. ID

Electroforesis

Aι

α1

36 α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens Bos taurus

Importancia clínica: desempeña un papel clave para el control rápido y para la supresión temprana de las proteasas activadas en la circulación (cascada de coagulación, fibrinólisis, complemento, colagenasas leucocitarias, catepsinas lisosomales, etc.). Participa en el trasporte de las citoquinas, hormonas y metales (zinc, en especial). Asimismo, es un indicador de la permeabilidad de membrana en el suero y otros líquidos corporales. ▲ Síndrome nefrótico (marcado), diabetes mellitus, cirrosis hepática (moderada), embarazo, tratamiento estrogénico. ▼ En pacientes terminales (marcado), pancreatitis aguda, fibrinólisis (tratamiento con uroquinasas y estreptoquinasas), estrés, postquirúrgico, hepatopatías, artritis reumatoide, preeclampsia, inicio de la pubertad (marcado).

Electroforesis

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

A la izquierda, muestra con un nivel normal de la alfa 2 macroglobulina. A la derecha, muestra con un ligero incremento del nivel de la alfa 2 macroglobulina.

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

A la izquierda, muestra con un nivel normal de la alfa 2 macroglobulina. A la derecha, muestra con una reducción promedio del nivel de la alfa 2 macroglobulina.

ID 12439

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

A la izquierda, muestra con un nivel normal de la alfa 2 macroglobulina. A la derecha, muestra alfa 2 macroglobulina disminuida y presencia de componente específico de grupo entre la zona alfa 1 antitripsina y la alfa 2 macroglobulina.

ID 91040

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Gráfico no. 10

Gráfico no. 11

A la izquierda, muestra con un aumento marcado del nivel de la alfa 2 macroglobulina. A la derecha, muestra con un nivel normal de la alfa 2 macroglobulina.

ID 44041

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA alfa 2 macroglobulina

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

24042

A la izquierda, muestra con un aumento marcado del nivel de la alfa 2 macroglobulina. A la derecha, muestra con un nivel normal de la alfa 2 macroglobulina.

Electroforesis

Aι

α1

α2 β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA haptoglobina

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens Bos taurus

Importancia clínica: una eritropoyesis ineficaz y la hemólisis intravascular causan un consumo rápido de haptoglobina. La interpretación de los niveles de haptoglobina junto con los de la alfa 1 glicoproteína ácida permite valorar los casos en que la APR y la hemólisis coexisten. ▲ APR por 24 horas, obstrucción biliar, nefritis, colitis ulcerosa, anemia aplásica, tratamiento corticoesteroideo, uso de andrógenos. ▼ Eritropoyesis ineficaz, hemólisis intravascular, haptoglobinemia congénita, neoplasias hepáticas y medulares, hepatopatías graves, embarazo, tratamiento con estrógenos, neonatos.

Receptor de unión haptoglobínico.

Electroforesis

PROTEÍNA

Gráfico no. 25

haptoglobina

Gráfico no. 25

Gráfico no. 24

A la izquierda, muestra con niveles normales de haptoglobina. Al centro, muestra con una disminución ligera del nivel de haptoglobina. A la derecha, muestra con un aumento moderado del nivel de haptoglobina.

Aι

ID 44444

Electroforesis

Aι

α1 44

α2

β1 β2

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA haptoglobina

Gráfico no. 24

Gráfico no. 23

A la izquierda, muestra con niveles normales de haptoglobina. A la derecha, muestra con haptoglobina carente del fenotipo intermedio 2:1 y aumento del lento 1:1.

ID 44445

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1 α2 β1 β2

PROTEÍNA fibronectina

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens

Importancia clínica: La fibronectina se encuentra en el plasma, sangre y trombocitos y tiene de un peso molecular de 440000 D. Media la adhesión intracelular y la retracción del coagulo de fibrina. En el endotelio vascular y en los macrófagos se observa una mayor concentración. Además, se fija al C1q y forma parte de los inmunocomplejos.

Estructura cristalina tridimensional de los tres primeros dominios en complejo con el estafilococo aureus.

Electroforesis

PROTEÍNA fibronectina

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

A la izquierda, muestra con fibronectina (banda no muy nítida sobre la transferrina).

ID 74047

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA

Gráfico no. 11

fibronectina

Gráfico no. 12

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra con fenotipos haptoglobínicos. Al centro, muestra de referencia. A la derecha, muestra con fibronectina (véase la posición más catódica respecto a los fenotipos haptoglobínicos de la primera muestra a la izquierda). ID 67048

Electroforesis

Aι

α1 α2 β1 β2 48

Aι

α1

α2 β1 β2

C3 ACTIVADO IN VITRO

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

90049

Muestra de la izquierda: muestra de suero refrigerada por tres días con reducción del C3 y activación parcial del mismo, identificable por una banda tenue sobre la Tf. Muestra de la derecha: muestra de suero refrigerada por cinco días con una reducción marcada del C3 y activación del mismo, identificable por una banda tenue sobre la Tf. En ambos casos, la activación in vitro del C3 simula la presencia de un componente M. ID

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

0γ

PROTEÍNA beta lipoproteína (APO B)

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens Mus musculus Saccharomyces cerevisiae Ichtyomyzon unicuspis Locusta migratoria

Electroforesis

Importancia clínica: la electroforesis de las lipoproteínas es un método sencillo y útil para el estudio de la dislipidemia. Su diferenciación en función de la movilidad electroforética, es la base de la clasificación de Fredrickson y está permite elaborar rápidamente un tratamiento dietético o terapéutico. La beta lipoproteína o LDL (lipoproteínas de baja densidad) suelen migrar al ánodo o cátodo de la beta 1 globulina. Se le puede ver cuando el componente proteínico alcanza el nivel de sensibilidad de la tinción.

PROTEÍNA beta lipoproteína (APO B)

Gráfico no. 23

Gráfico no. 26

La muestra a la izquierda presenta lipoproteínas beta en posición catódica respecto de la transferrina. La presencia de lipoproteínas beta puede identificarse por su forma de corchete o zigzagueante. La muestra a la derecha está libre de lipoproteínas beta.

ID 03451

Electroforesis

Aι

α1

51 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA beta lipoproteína (APO B)

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

La muestra a la derecha está libre de lipoproteínas beta. La muestra a la izquierda presenta lipoproteínas beta en posición catódica respecto a la transferrina, simulando la presencia de un componente M.

ID 04552

Electroforesis

Aι

α1

52 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens Rattus norvegicus Myrothecium verrucaria

Electroforesis

Importancia clínica: la presencia de bilirrubina en el sitio de deposición de la muestra biológica, es un hallazgo raro y se asocia a, por ejemplo, neoplasias hepáticas, litiasis biliar, etc. En tales casos, la saturación de la capacidad transportadora de la albúmina implica la aparición de una banda anormal formada por bilirrubina metacatabólica en el sitio de deposición de la muestra sérica.

PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea

Gráfico no. 1

Neoplasia hepática La bilirrubina total es de 18.5 mg/dl

ID 18012

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 54β2

PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

975

A la izquierda, paciente con litiasis biliar. La bilirrubina total es de 11.8 mg/dl; la conjugada, de 6.9 mg/dl. A la derecha, el mismo paciente tras la resolución de la litiasis. La bilirrubina total es de 1.9 mg/dl; la conjugada, de 1.1 mg/dl. ID 01

Electroforesis

Aι α1

α2

β1

β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea

Gráfico no. 22

Gráfico no. 21

La muestra a la izquierda presenta una banda homogénea entre la transferrina y el C3, debido a la presencia de bilirrubina. La morfología de la banda bilirrubínica es reconocible por la ligera curvatura derecha e izquierda y por la forma redondeada. A la derecha, muestra libre de bilirrubina.

ID 00456

Electroforesis

Aι

α1

56 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PRESENCIA DE BILIRRUBINA que simula una banda ETF homogénea

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

La muestra de la derecha presenta una banda homogénea contigua al extremo catódico de la transferrina, debido a una concentración elevada de bilirrubina. En dicho caso, esta última es reconocible por el extremo catódico brillante e irregular. La muestra de la izquierda está libre de bilirrubina. ID 00657

Electroforesis

Aι

α1

57 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA transferrina

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Organismos: Homo sapiens Gallus gallus Staffilococco aureo Actinobacillo pleuropneumonie Machupo virus Camelus dromedarius Anatra platirinco

Electroforesis

Importancia clínica: glicoproteína transportadora de hierro, que suele tener un tercio de su capacidad de fijación saturada. En la sideropénia, su incremento precede a la anemización en días o meses. Útil en el diagnóstico diferencial de las anemias y en la valoración de pacientes con riesgo de sobrecarga férrica. ▲ sideropénia, hepatitis aguda, embarazo y tratamiento estrogénico, hipotiroidismo ▼ APR, neoplasias, hepatopatías, síndrome nefrótico, trastornos de la nutrición, condiciones de sobrecarga férrica, atransferrinemia congénita, pacientes sometidos a diálisis, insuficiencia renal crónica

PROTEÍNA transferrina

Gráfico no. 12

Gráfico no. 13

A la izquierda, niveles normales de transferrina. A la derecha, disminución de la transferrina.

ID 00590

Electroforesis

Aι

α1

59 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA transferrina

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

00608

A la izquierda, niveles normales de transferrina. A la derecha, aumento de la transferrina.

Electroforesis

Aι

α1

60 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA transferrina

Gráfico no. 2

Gráfico no. 8

A la izquierda, niveles normales de transferrina. A la derecha, muestra con una reducción importante de la transferrina.

ID 00001

Electroforesis

Aι

α1

61 β1 β2 α2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA transferrina

Gráfico no. 6

ID 70062

Electroforesis

Gráfico no. 7

A la izquierda, niveles normales de transferrina. A la derecha, muestra con una reducción importante de la transferrina y presencia de lipoproteínas beta en el extremo anódico. Las lipoproteínas beta están ocultas parcialmente por la transferrina remanente, pero son reconocibles por su extremo anódico ondulado y extremos derecho e izquierdo curvados.

Aι

α1

62 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

CRIOGLOBULINA

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens

El síndrome crioglobulinémico (SC), resultado de un estímulo antigénico prolongado, es un signo de desequilibrio inmunitario, cuya etiología parece ser multifactorial, pues lo acompañan patologías muy diversas. En los últimos años se ha demostrado de forma generalizada la estrecha relación entre la infección por el virus de la hepatitis C (VHC), la presencia de crioglobulinas mixtas (CM) y el desarrollo del SC, y se ha aclarado la base etiopatogénica del síndrome: una vasculitis leucocitoclástica sistémica, mediada por inmunocomplejos crioprecipitantes; inmunocomplejos que, sometidos a electroforesis, precipitan sobre la malla del soporte durante la etapa de aplicación de la muestra biológica. Este acontecimiento determina la aparición de una banda homogénea colapsada cerca del punto de aplicación. La morfología de la banda es reconocible por sus bordes nítidos y bien definidos y su forma es siempre muy compacta sobre el eje ánodo-cátodo y la intensidad del color es oscura y brillante.

Estructura cristalina del Fab glicosilado por una crioglobulina IgM

Electroforesis

CRIOGLOBULINA

Gráfico no. 1

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra libre de inmunocomplejos. A la derecha, muestra con inmunocomplejos crioglobulinémicos.

ID 32064

Electroforesis

Aι

α1

64 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2 γ

CRIOGLOBULINA

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

ID 50065

La disgregación de la muestra sérica implica la migración de los componentes crioglobulinémicos conforme a su carga eléctrica neta. Respecto a la tipificación del tipo de crioglobulinemia, será preciso solicitar una segunda muestra conservada a 37°C

Electroforesis

Aι

α1

65 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

CRIOGLOBULINA

Ejemplo de muestras crioglobulinémicas disgregadas y movilizadas electroforéticamente. La disgregación de la muestra sérica implica la migración de los componentes crioglobulinémicos conforme a su carga eléctrica neta. Respecto a la tipificación del tipo de crioglobulinemia, será preciso solicitar una segunda muestra conservada a 37°C.

Electroforesis

PROTEÍNA complemento fracción 4

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Organismos: Homo sapiens Staphilococcus aureus Mus musculus Cepa Edmonston del sarampión Bos taurus Adenovirus humano

Importancia clínica: el C4 es parte de la vía clásica C3-convertasa y por ello su importancia diagnóstica coincide con la del C3. El C4 es una beta 1 globulina de 206 Kd, compuesta por tres cadenas impares unidas entre sí por puentes disulfuro. La serinaesterasa elimina un péptido biológicamente activo (C4a) y, por consiguiente, la molécula remanente (C4b) adquiere la capacidad de adherirse a las membranas celulares o a las paredes bacterianas.

Complejo tridimensional del C4 y Staffilococco aureus

Electroforesis

PROTEÍNA complemento fracción 4

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

ID 54368

A la izquierda, muestra libre de C4, con un consumo fuerte de C3. A la derecha, muestra con C4 entre una transferrina elevada y un C3 muy reducido. Catódicamente al C3 se puede apreciar el C1q inhibidor.

Electroforesis

Aι α1

68 α2

β1

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA complemento fracción 3

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Archaeas Organismos: Homo sapiens Vaccinia virus Staphylococcus aureus Mus musculus Rattus norvegicus Escherichia coli

Importancia clínica: niveles reducidos sugieren la activación del complemento, síntesis disminuida, pérdida proteínica o consumo, tal y como en diversas patologías autoinmunes. La deficiencia total o parcial del C3 se asocia con infecciones recurrentes y un aumento del riesgo de LES. Útil en el control de la progresión y/o de la actividad clínica de algunas enfermedades autoinmunes, por ejemplo, glomerulonefritis aguda. ▲ APR (tardía), obstrucción biliar, síndrome ictérico obstructivo, diabetes mellitus, gota, enfermedades del tejido conectivo (incluido LES). ▼ Enfermedades autoinmunes, enfermedad por inmunocomplejos, crioglobulinemia mixta, hepatopatía avanzada, insuficiencia renal crónica, síndrome hemolítico urémico familiar, púrpura trombocitopénica trombótica, deficiencia congénita.

Estructura cristalográfica del C3c y C3b inhibidores fijados a un estafilococo.

Electroforesis

PROTEÍNA complemento fracción 3

Gráfico no. 3

Gráfico no. 4

A la izquierda, muestra con un incremento del C3. A la derecha, muestra con un nivel normal de C3.

ID 77070

Electroforesis

Aι

α1

70 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA complemento fracción 3

Gráfico no. 11

Gráfico no. 12

A la derecha, muestra con reducción del C3. A la izquierda, muestra con un aumento ligero del C3.

ID 89071

Electroforesis

Aι

α1

71 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA complemento fracción 3

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

272

A la izquierda, muestra con reducción del C3 por consumo. A la derecha, muestra con un nivel normal del C3.

ID 13

Electroforesis

Aι

α1

72 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA C1 q inhibidor

Taxonomía: Eucariotas Organismos: Homo sapiens Mus musculus Bos taurus

El C1 es uno de los factores conocidos del sistema del complemento y se compone por tres subunidades C1q, C1r y C1s. El C1 es una glicoproteína con una masa relativa de 750.000. En cambo, el C1q, con una masa relativa de 410.00, es la unidad de reconocimiento de la etapa inicial de activación clásica, pues fija los activadores a las partes globulares carboxiterminales.

Estructura cristalográfica de la cabeza globular del C1q

Electroforesis

PROTEÍNA C1 q inhibidor

Gráfico no. 25

Gráfico no. 11

A la izquierda, muestra libre de C1q inhibidor. A la derecha, muestra con C1q inhibidor (banda catódica al C3).

ID 33974

Electroforesis

Aι

α1

74 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

PROTEÍNA 2 microglobulina

Taxonomía: Eucariotas Bacterias

Esta proteína ha despertado un gran interés por dos razones: por su extraordinaria homología de secuencia respecto a las inmunoglobulinas y por su asociación con los antígenos de histocompatibilidad HL-A. Tiene un peso molecular de unos 11.812 D.

Organismos: Homo sapiens Podospora ansetina Escherichia coli

Estructura cristalina del dominio

Electroforesis

PROTEÍNA 2 microglobulina

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

LIPO

9876

A la izquierda, muestra libre de beta 2 microglobulina. A la derecha, muestra con beta 2 microglobulina (banda catódica en la zona beta 2).

ID 0

Electroforesis

Aι

α1 Gc α2 β β1 β2

PROTEÍNA fibrinógeno

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Organismos: Homo sapiens Gallus gallus Bos taurus Hiduro medicinalis Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus subsp. au.

Estructura cristalina de la cadena alfa

Electroforesis

En el estudio de detección sistemática, el uso de muestras de plasma tomadas de forma correcta, permite obtener, en comparación con el suero, una mayor cantidad de información de interés clínico, debido a que el fibrinógeno es un indicador muy sensible de la inflamación. A menudo, durante el estudio panorámico de los proteinogramas, la intensidad de la banda del fibrinógeno es lo que sugiere un síndrome inflamatorio. Clínicamente, la valoración visual del proteinograma ofrece ventajas respecto a la determinación aislada del fibrinógeno. El incremento de esta proteína, libre de signos electroforéticos de inflamación, puede deberse a afecciones de extravasación capilar. Por el contrario, el hallazgo de una banda tenue del fibrinógeno en un proteinograma con signos evidentes de un síndrome inflamatorio, debe hacernos suponer la existencia de inflamaciones agudas o subagudas acompañadas de consumo o fibrinólisis elevada. En determinados casos las peculiaridades morfológicas de la banda del fibrinógeno pueden tener un significado diagnóstico. Es el caso, por ejemplo, de la pancreatitis aguda, donde la banda normal puede ser sustituida por una zona difusa de límites indistinguibles. Asimismo, en relación con la hiperamilasemia, la alteración del frente de migración de la albúmina puede simular una variante genética.

PROTEÍNA fibrinógeno

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra de suero libre de fibrinógeno. A | la derecha, muestra de plasma con fibrinógeno.

Electroforesis

PROTEÍNA PCR

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Archaeas

Aumenta de manera precoz en varios cuadros inflamatorios, tales como, meningitis meningocócica, ITU, traumatismos, quemaduras, necrosis neoplásica, etc. Tiene un valor de predicción negativo muy bueno en la apendicitis aguda e infecciones intrauterinas tras la rotura del saco amniótico, así como en relación con el incremento de la ferritina. Útil en el diagnóstico diferencial entre LES en estado activo e infecciones concomitantes.

Organismos: Homo sapiens mus musculus Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Mycobacterium tubercolosis Cryptosporidium parvum Neisseria polysaccharea

Estructura tridimensional de la PCR fijada a la fosfoetanolamina

Electroforesis

PROTEÍNA PCR

Gráfico no. 6

Gráfico no. 7

A la izquierda, muestra libre de PCR. A la derecha, muestra con PCR, observable como un “engrosamiento” de la tinción en la zona gamma catódica.

ID 10080

Electroforesis

INMUNOGLOBULINA IgG

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Virus Archaeas Organismos: Homo sapiens Mus musculus Staphylococcus aureus Streptococcus sp. “grupo G” Streotococcus sp. G148

Importancia clínica: Las IgG representan entre el 75% y el 80% de las inmunoglobulinas totales, fijan el complemento mediante la vía clásica (IgG 1, IgG 2, IgG 3) y alternativa (IgG 4) y constituyen la respuesta inmune específica. Son las únicas Inmunoglobulinas que atraviesan la placenta. La deficiencia de IgG se asocia con infecciones recurrentes graves. ▲ Enfermedades autoinmunes (LES, artritis reumatoide, esclerosis sistémica, síndrome de Sjögren, etc.), hepatopatía crónica, infecciones recurrentes o crónicas, sarcoidosis, ciertas parasitosis, dispositivos anticonceptivos intrauterinos. Oligoclonales: neoplasias linfoides y no linfoides, infecciones virales y enfermedades autoinmunes. Monoclonales: mieloma IgG, GMSI y linfomas. ▼ Infancia, embarazo (moderado), hipogammaglobulinemia, agammaglobulinemia, síndrome nefrótico, mielomas no IgG.

Representaciones de la plasticidad anticorporal ante el objetivo antigénico.

Electroforesis

INMUNOGLOBULINA IgA

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Organismos: Homo sapiens Thermus thermofilus HB8 Escherichia coli Mus muculus Thermus thermofilus Thermo thermofilus HB27 Staphylococcus aureus subsp. Au.

Importancia clínica: Las IgA fijan el complemento por vía alternativa. Los aumentos policlonales de IgA pueden presentarse en cuadros inflamatorios crónicos de las vías respiratorias y del tracto gastroentérico, incluyendo el hígado. Cerca de un 1/4 de los pacientes con deficiencia de IgA tienen anticuerpos anti-IgA y corren el riesgo de reacciones anafilácticas graves en respuesta a trasfusiones de sangre o plasma. ▲ Hepatopatía crónica, cirrosis, infecciones respiratorias crónicas, neoplasia del tracto final del intestino, enfermedades del aparato gastroentérico (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, etc.), artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, neuropatía, síndrome de Wiskott-Aldrich; mieloma IgA, GMSI (monoclonales). ▼ Infancia, deficiencia selectiva de IgA (aprox. 1/700), síndromes prótido-dispersantes, macroglobulinemia o mieloma no IgA.

Monómero y dímero

Electroforesis

INMUNOGLOBULINA IgM

Taxonomía: Eucariotas Bacterias Organismos: Homo sapiens Staphylococcus aureus Rattus norvegicus Escherichia coli Finegoldia magna

Importancia clínica: Las IgM fijan el complemento mediante la vía clásica y constituyen la respuesta primaria contra las infecciones. La presencia de IgM antivirales específicas en neonatos se debe a infecciones congénitas (no atraviesan la placenta). ▲ Infecciones virales, parasitosis, hepatopatía crónica, cirrosis biliar primitiva, colangitis primaria esclerosaste; monoclonal: macroglobulinemia de Waldenstrom, linfomas malignos, reticulosis, crioglobulina, crioaglutinina. ▼ Infancia, inmunodeficiencia (síndrome de Wiskott-Aldrich), mieloma no IgM.

También existen agregados triméricos y hexaméricos.

Electroforesis

DISPOSICIÓN POLICLONAL DE LAS INMUNOGLOBULINAS EN EL MARCO DE LOS VALORES DE REFERENCIA

DISPOSICIÓN POLICLONAL NORMAL

Gráfico no. 19

Gráfico no. 20

ID 20087

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL NORMAL Gráfico no. 21

Muestra No. 19: disposición completa de inmunoglobulinas normales, pero con una ligera disminución de la heterogeneidad catódica de la IgG subclase I. Muestra No. 20: disposición con un ligero incremento normal de IgA e IgG subclase IV y una ligera diminución de la heterogeneidad catódica de la IgG subclase I. Muestra No. 21: disposición normal de las inmunoglobulinas policlonales.

Aι

α1

α2

Electroforesis

β1 β2

γ 88

DISPOSICIÓN POLICLONAL DE LAS INMUNOGLOBULINAS EN EL LÍMITE O POR DEBAJO DEL MARCO DE REFERENCIA hipogammaglobulinemia

DISPOSICIÓN POLICLONAL DENTRO DE LOS LIMITES DEL MARCO DE REFERENCIA

Gráfico no. 4

Gráfico no. 3

Gráfico no. 25

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco bajo de referencia. Al centro, muestra con disposición policlonal de las inmunoglobulinas dentro del límite promedio del marco de referencia. A la derecha, muestra con disposición policlonal de las inmunoglobulinas dentro del límite suID 30091 perior del marco de referencia, pero con reducción de las subclases Ig I y III.

Electroforesis

Aι

α191 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL hipogammaglobulinémica

Gráfico no. 2

Gráfico no. 3

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. La segunda muestra tiene una disposición policlonal hipoglobulinémica media a baja

ID 40092

Electroforesis

Aι

α1

92 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL hipogammaglobulinémica

Gráfico no. 2

Gráfico no. 3

La muestra a la izquierda tiene una disposición policlonal hipogammaglobulinémica. La muestra a la derecha tiene una disposición policlonal con inmunoparesia electroforética de las tres clases inmunoglobulínicas.

ID 50093

Electroforesis

Aι

α1

93 α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA hipergammaglobulinemia

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA hipergammaglobulinemia Gráfico no. 2

Gráfico no. 3

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal predominante normal, pero las subclases IgG I y III están reducidas. A la derecha, muestra con un ligero aumento de la disposición policlonal.

ID 60097

Electroforesis

Aι

α1

α2 97

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA hipergammaglobulinemia

Gráfico no. 16

Muestra con un incremento de la disposición policlonal, así como de la IgG subclases II, III, y de la IgA.

ID 70098

Electroforesis

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA hipergammaglobulinemia Gráfico no. 3

ID 80099

Electroforesis

Gráfico no. 4

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal normal y una representación media a alta de las IgA. La muestra a la derecha tiene una disposición policlonal más elevada y un puente beta-gamma. Notas: la muestra presenta una reducción de la heterogeneidad policlonal para la clase G con engrosamiento de la subclase III y su incremento ponderal. Las otras subclases G presentes, con aumento ponderal e incremento simultaneo de la clase M. La clase A, reducida en heterogeneidad e incrementada.

Aι

α1

α2 99

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

DISPOSICIÓN POLICLONAL POR ARRIBA DEL MARCO DE REFERENCIA hipergammaglobulinemia Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra de disposición policlonal normal. La segunda muestra tiene una disposición policlonal incrementada, pero con reducción de las IgA, IgM y subclases IgG II y IV y con heterogeneidad reducida de las policlonales G. ID 00100

Electroforesis

Aι

α1

α2 100 β1

Aι

α1

α2 β1

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL Y LOS COMPONENTES MONOCLONALES

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

La importancia del proteinograma policlonal en el control de pacientes con componentes M. CAP (Colegio Estadounidense de Patólogos) "También deberá tomarse en cuenta toda reducción de las gammaglobulinas en el suero no implicadas, por debajo del rango normal para el laboratorio, respecto al último estudio." Procedimientos para la valoración de los componentes monoclonales. David F. Keren, Archivos de Patología Clínica y del Laboratorio Clínico, vol. 123, febrero de 1999, pág. 132. Garantía de calidad de la valoración un componente monoclonal.

Electroforesis

102

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. A la derecha, muestra con una banda electroforética homogénea, quizá por un componente M, en la zona gamma central, y una disposición policlonal conservada.

ID 00103

Electroforesis

Aι

α1

103 α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL

Gráfico no. 11

su importancia

Gráfico no. 10

Gráfico no. 12

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal hipogammaglobulinémica. Al centro, muestra con una banda electroforética homogénea, quizá por un componente M, cerca de la zona gamma catódica y una disposición policlonal reducida. A la derecha, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. ID 00104

Aι

Electroforesis

α1 104

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. A la derecha, muestra con una banda homogénea, quizá por un componente M, cerca de la zona gamma catódica y una disposición policlonal muy por debajo del límite inferior de referencia con implicación de las tres clases inmunoglobulínicas. ID 00105

Electroforesis

Aι

105

β2

Aι

α1

α2

β1

β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia y reducción de la policlonalidad IgA. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas, quizá por un componente M, de las cuales, una está sobre la proteína especifica C3 y la otra, por debajo del complemento. Disposición policlonal muy por debajo del límite inferior de referencia, con afectación de las tres clases de inmunoglobulinas (la clase menos afectada es la IgA). ID 00106

Electroforesis

Aι

α1

106 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 2

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. A la derecha, muestra con tres bandas homogéneas pequeñas, atribuibles quizá a un componente M, de las cuales, una se sitúa en la zona baja complementaria, la otra, en la zona gamma intermedia, y la tercera, cerca de la zona gamma catódica. Disposición policlonal por debajo del límite inferior de referencia con afectación de las tres clases inmunoglobulínicas. ID 00107

Electroforesis

Aι

α1 107 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

A la derecha, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia, pero con una reducción parcial de la heterogeneidad policlonal. A la izquierda, muestra con múltiples bandas homogéneas, atribuibles quizá a un componente M, diseminadas entre el C3 y el extremo catódico de la zona gamma; de disposición policlonal un poco por debajo del límite inferior de referencia, con afectación de las tres clases de inmunoglobulinas. ID 00108

Electroforesis

Aι

α1

108 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 19

Gráfico no. 18

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas, atribuibles quizá a un componente M; una se sitúa cerca de la zona gamma central y la otra, en el extremo catódico; de disposición policlonal por debajo del límite inferior de referencia, con afectación marcada de las tres clases de inmunoglobulinas. ID 00109

Electroforesis

Aι

α1

109 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1

β2

LA DISPOSICIÓN POLICLONAL su importancia

Gráfico no. 11

Gráfico no. 12

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco de referencia. A la derecha, muestra con una banda homogénea media, atribuible quizá a un componente M, situada en la zona gamma catódica. La disposición policlonal de las IgG está parcialmente conservada (véase la zona catódica) respecto a la banda homogénea, con reducción de las clases M y A. ID 00110

Electroforesis

Aι

α1

110 α2

β1

Aι

α1

α2

β1

LISOZIMA

Taxonomía: Batteri Eucarioti Archea Virus

Organismos:

Es una proteína de bajo peso molecular (15,000 KD). Puede considerarse un componente importante del mecanismo de defensa natural, pues hidroliza un monosacárido de la pared bacteriana. Se encuentra en todas las secreciones (lágrimas, saliva, mucosidad bronquial, etc.). Su cuota plasmática mayor deriva de la lisis de los granulocitos neutrófilos. En particular, las células sanguíneas ricas en lisozima son los gránulos primarios y secundarios de los neutrófilos, los promielocitos, los mielocitos, los monocitos y los macrófagos tisulares. Puede producirse lisozimuria cuando hay un daño tubular en individuos con lisozimemia normal, o cuando hay un bloqueo del sistema de trasporte tubular activo por una concentración elevada de la enzima en la preorina de individuos con lisozimemia elevada. Así que, su determinación sérica y urinaria es de gran interés tanto para la nefropatía, como para las enfermedades hematológicas.

Homo Sapiens

El primer “antibiótico”. Bos taurus Escherichi co Saccharomices cerevisiae Thermotoga maritima Bacteroides thetaiotamicron Gallus gallus

Electroforesis

111

LISOZIMA

Gráfico no. 2

Gráfico no. 3

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal dentro del marco bajo de referencia. A la derecha, muestra con un tenor bajo de inmunoglobulinas policlonales y una banda homogénea pequeña retromigrada: lisozima confirmada mediante inmunofijación. ID 00112

Electroforesis

Aι

α1

112

α2

β1 β2

Aι α1

α2 β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES su posición en la migración ETF

CÉLULA ESTAMINAL Cadena pesada µ Cadena ligera

Ontogénesis B

IgM

COMPARTIMIENTO PRE-B Cadena pesada δ IgM

IgD

B-virgen IgM

IgG

Hematoblasto

Médula ósea

producción de

Plasmocito

cadenas pesadas

IgE

Órganos linfáticos periféricos

IgA

Definición de componente monoclonal: clon de linfocitos B en expansión.

Electroforesis

B-linfoplasmocitoide

ANTÍGENO

Conversión de la

IgD

Antígeno

113

LOS COMPONENTES MONOCLONALES su posición en la migración ETF

Plasmocito

Blastocito intacto

Plasmocito inmaduro

Linfocito B

Inmunoglobulinas de superficie IgD e IgM

Contacto con el antígeno

Cambio de la cadena pesada IgM de superficie y secretora

De gammapatías monoclonales; Aguzzi, Bienveniu, Jones, Whicher.

Electroforesis

115

IgA o IgM de superficie y secretora

Luego del estímulo antigénico, el clon se expande con rapidez, acompañado por un cambio morfológico y por un pequeño linfocito, transformándose en un plasmocito maduro con aparato de Golgi y retículo endoplasmático. En las divisiones celulares posteriores, la región V es constante, sin embargo, la región H se diferencia en D, M, G o A.

LOS COMPONENTES MONOCLONALES su frecuencia porcentual en relaci贸n con la posici贸n en la migraci贸n ETF

El estudio se realiz贸 en 1654 muestras con componentes M. En la zona gamma, como se puede observar, migra el 88% de los componentes M.

A. Ciapini; Le proteine dal laboratorio alla Clinica; Desenzano del Garda13-14 Gennaio 2006

Electroforesis

116

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona alfa 1

Gráfico no. 7

La IFE revela la presencia de un componente M de tipo lambda libre.

Gráfico no. 8

En la muestra a la izquierda, la zona alfa 1 se encuentra más hacia el ánodo que la proteína homóloga de la muestra a la derecha.

ID 00117

Electroforesis

Aι

α1

117

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona alfa 2

Gráfico no. 19

Gráfico no. 18

La muestra a la izquierda es normal. La muestra de la derecha presenta un componente M IgA k en zona alfa 2 anódica

ID 00118

Electroforesis

Aι

α1

118 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona alfa 2

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta un componente M IgA λ entre las zonas alfa 2 y transferrina.

ID 00119

Electroforesis

Aι α1

119 β1 β2 α2

Aι

α1 α2 β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona alfa 2

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

La muestra a la derecha presenta un aumento de la alfa 2 y una disminución de la haptoglobina. La muestra a la izquierda presenta un componente M IgA K entre las zonas alfa 2 y transferrina.

ID 00120

Electroforesis

Aι

120 β1 β2 α1 α2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma inter alfa 2-transferrina Gráfico no. 23

Gráfico no. 22

La muestra a la derecha es normal. La muestra a la izquierda presenta una banda electroforética homogénea IgA ʎ en medio de las zonas alfa 2 y transferrina.

ID 00121

troforesi

Aι

α1

121

α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona transferrínica

Gráfico no. 2

ID 00122

Electroforesis

Gráfico no. 3

La muestra a la derecha es normal, libre de anomalías atribuibles a la presencia de bandas homogéneas. La muestra a la izquierda presenta una zona transferrínica muy lenta y una banda homogénea, atribuible a un componente monoclonal ʎ libre, en el espacio entre la transferrina y el C3. Reducción de albúmina, C3 e hipogammaglobulinemia.

Aι

α1 122 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona transferrínica

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

La muestra a la derecha presenta un aumento de transferrina, pero sin anomalías atribuibles a la presencia de bandas homogéneas. La muestra a la izquierda presenta una zona transferrinica anódicamente más amplia, con un perfil morfológico difuminado por la presencia de cadenas ligeras libres monoclonales λ.

ID 00123

Electroforesis

Aι

α1

123 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona transferrínica

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

La muestra a la izquierda presenta Gc (componente específico de grupo). La muestra a la derecha presenta un incremento de transferrina y coloración intensa, de posición más catódica por la presencia de componentes monoclonales IgA k con carga eléctrica neta similar. ID 00124

Electroforesis

Aι

α1 124 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona (gamma) inter transferrina-C3

Gráfico no.

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta una transferrina más amplia, con el extremo catódico difuminado por la presencia de cadenas ligeras libres monoclonales k.

ID 00125

Electroforesis

Aι

α1

125 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona (gamma) inter transferrina-C3

Gráfico no. 3

Gráfico no. 4

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta una banda electroforética homogénea (IgA k) en posición anódica respecto al C3, que fue desplazado físicamente y retromigrado hacia el cátodo por el efecto estérico del componente M. ID 00126

Electroforesis

Aι

α1

126 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1

β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona (gamma) inter transferrina-C3

Gráfico no. 3

Gráfico no. 4

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta una banda electroforética homogénea (IgA λ) en posición anódica respecto al C3, que aparece con poca intensidad sobre el extremo catódico, y presencia simultánea de beta 2 lipoproteína contigua al extremo anódico del componente M. ID 00127

Electroforesis

Aι

α1

127 α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona C3

Gráfico no. 19

Gráfico no. 18

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta una banda electroforética homogénea (IgA λ) en posición anódica respecto al C3, que aparece reducido, difuminado y anódico-asimétrico.

ID 00128

Electroforesis

Aι

α1

128 α2 β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona C3

Gráfico no. 8

Gráfico no. 9

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta un componente monoclonal situado exactamente sobre el C3 (IgA k).

ID 00129

Electroforesis

Aι

α1

129 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona C3

Gráfico no. 17

Gráfico no. 16

La muestra a la derecha es normal. La muestra a la izquierda presenta un C3 disminuido y más amplio en sentido anódico por la presencia de componentes M ligeros libres k.

ID 00130

Electroforesis

Aι

α1 130 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona C3

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

La muestra a la izquierda es normal. La muestra a la derecha presenta una banda electroforética homogénea (componente M IgG k) en posición catódica al C3.

ID 00131

Electroforesis

Aι

α1

131 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica al C3

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda electroforética homogénea IgG k, contigua al C3.

ID 00798

Electroforesis

Aι

α1

132 α2 β1 β2

Aι

α1

α2 β1

β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica al C3

Gráfico no. 19

Gráfico no. 18

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda electroforética homogénea IgG λ en una zona poco separada y catódica al C3.

ID 00798

Electroforesis

Aι

α1

133 α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no. 6

ID 00134

Electroforesis

Gráfico no. 7

A la derecha, muestra normal. A la izquierda, muestra con reducción de albúmina y C3, de disposición hipogammaglobulinémica con disminución de la heterogeneidad de las inmunoglobulinas y presencia de dos concentraciones casi homogéneas en zona gamma central, atribuibles, como tipificación, a dos componentes M IgG k.

134β1 β2 Aι α1 α2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no. 7

A la izquierda, muestra con reducción de la policlonalidad de inmunoglobulinas. A la derecha, muestra hipogammaglobulinémica con una banda electroforética homogénea en la zona gamma central.

ID 00135

Electroforesis

Aι

α1

135 α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra hipogammaglobulinémica con una banda homogénea nítida en zona gamma central.

ID 00136

Electroforesis

Aι

α1

136 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no.

137

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda homogénea, difuminada catódicamente por la presencia de estadios diferentes de agregación coexistentes (IgM K) en zona gamma central.

ID 00

Electroforesis

Aι

α1

137 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no. 26

Gráfico no. 25

A la izquierda, muestra con una disposición policlonal media a alta. A la derecha, muestra con una banda homogénea en la zona gamma central: observe que el lado anódico es más concentrado y zigzagueante respecto al catódico, característico del componente M clase M en distintos estadios de agregación, con precipitación desordenada en el gel durante la migración. ID 00138

Electroforesis

Aι

α1 138 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra hipogammaglobulinémica con una banda homogénea muy débil en zona gamma central-anódica.

ID 00139

Electroforesis

Aι

α1

139 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma central

Gráfico no.

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda electroforética homogénea débil en zona gamma centralcatódica.

ID 00140

Electroforesis

Aι

α1

140 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda electroforética homogénea débil en zona gamma catódica.

ID 00141

Electroforesis

Aι

α1

141 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica

Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda homogénea débil dispersa en un ámbito policlonal incrementado, en particular, a cargo de la clase G, en zona gamma catódica.

ID 00142

Electroforesis

Aι

α1

142 β1 β2 α2

Aι α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

00143

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda homogénea débil en zona gamma catódica, dentro de un ámbito policlonal incrementado a cargo de la clase G.

Electroforesis

Aι

α1

143 α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica

Gráfico no. 25

Gráfico no. 24

A la izquierda, muestra con un aumento moderado de la policlonalidad. A la derecha, muestra con una banda homogénea en zona gamma catódica de un individuo con hipogammaglobulinemia consistente.

ID 00144

Electroforesis

Aι

α1 144 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica Gráfico no. 24

Gráfico no. 23

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda homogénea retromigrada en zona gamma catódica y reducción de la policlonalidad IgG subclase I y de la heterogeneidad policlonal, está última a cargo de las subclases IgG II y III.

ID 00145

Electroforesis

Aι

α1

α2

145

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica retromigrada

Gráfico no. 4

Gráfico no. 5

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una banda homogénea medianamente retromigrada en la zona gamma catódica y una hipogammaglobulinemia importante.

ID 00146

Electroforesis

Aι

α1

146 α2 β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES la zona gamma catódica retromigrada

Gráfico no. 20

Gráfico no. 19

A la izquierda, muestra con un incremento heterogéneo medio de la policlonalidad. A la derecha, muestra con una banda homogénea en zona gamma catódica ligeramente retromigrada y una hipogammaglobulinemia severa, en particular de la clase G.

ID 00147

Electroforesis

Aι

α1

147 α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

LOS COMPONENTES MONOCLONALES

Gráfico no. 1

la zona gamma catódica retromigrada

Gráfico no. 7

A la derecha, muestra normal. A la izquierda, muestra con una banda homogénea en zona gamma catódica muy retromigrada y una fuerte hipogammaglobulinemia. ID 00148 ID 00148

Electroforesis

148

Aι

α1

α2 β1

β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no.

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con tres bandas homogéneas en zona gamma anódica-central y catódica.

ID 00149

Electroforesis

Aι α1

149

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 23

Gráfico no. 22

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en zona gamma con un fondo policlonal relativamente conservado.

ID 00150

Electroforesis

Aι

α1

150

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 21

Gráfico no. 20

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con tres bandas homogéneas en zona gamma con un fondo policlonal medianamente conservado

ID 00151

Electroforesis

Aι

α1

151

α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 22

Gráfico no. 21

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en zona gamma catódica, de las cuales, una está muy retromigrada con un fondo policlonal deprimido.

ID 00152

Electroforesis

Aι

α1

152

α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 7

Gráfico no. 8

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en la zona gamma catódica con un fondo policlonal deprimido.

ID 00153

Electroforesis

Aι

α1

153

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 1

Gráfico no. 2

0154

A la izquierda, muestra hipogammaglobulinémica. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas. La primera se sitúa sobre el C3, la otra, más débil, es un poco catódica a la primera. Un fondo policlonal totalmente deprimido en pacientes hipoalbuminémicos. ID 0

Electroforesis

Aι

α1

154

α2

β1

Aι

α1

α2

β1

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 3

Gráfico no. 4

A la izquierda, muestra normal con betalipoproteínas. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en zona gamma catódica. Un fondo policlonal medianamente deprimido. También se observa la presencia de betalipoproteínas e hipoalbuminemia. ID 00155

Electroforesis

Aι α1

155

α2

β1

Aι

α1

α2 β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 6

ID 00156

Electroforesis

Gráfico no. 7

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en la zona gamma central y cerca de la catódica. Un fondo policlonal muy deprimido. Se observa la presencia de hipoalbuminemia y una disminución fuerte de la alfa 1 antitripsina.

Aι

α1

156

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra normal con una reducción ligera de la policlonalidad. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas en zona gamma anódica y catódica. Un fondo policlonal conservado. Se observa una hipoalbuminemia ligera ID 00157

Electroforesis

Aι

α1

157

α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 9

Gráfico no. 10

A la derecha, muestra hipogammaglobulinémica. A la izquierda, muestra con dos bandas homogéneas. La primera, sobre el C3 (IgA k) y la segunda, sobre un fondo policlonal IgA-IgG, catódica al C3 (IgA lambda). Un fondo policlonal ligeramente conservado. ID 00158

Electroforesis

Aι

α1

158

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 11

Gráfico no. 12

A la izquierda, muestra normal con una reducción ligera de la policlonalidad. A la derecha, muestra con dos bandas homogéneas. La primera, apenas perceptible en la zona gamma central; la segunda, catódica retromigrada. Un fondo policlonal deprimido e hipoalbuminemia ID 00159

Electroforesis

Aι

α1

159

α2

β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 19

Gráfico no. 18

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con tres bandas electroforéticas homogéneas; la primera, sobre la transferrina (obsérvese la intensidad y la morfología del lado catódico transferrínico) y las otras dos, en zona gamma central y gamma catódica. Un fondo policlonal comprometido. ID 00160

Electroforesis

Aι

α1

160

α2 β1 β2

Aι

α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 20

Gráfico no. 19

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con tres bandas homogéneas. La primera es muy tenue y se sitúa en zona gamma central; las otras dos, en zona gamma catódica. Un fondo policlonal escasamente representado.

ID 00161

Electroforesis

Aι

α1

161

α2

β1 β2

Aι α1

α2

β1 β2

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 5

Gráfico no. 6

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con cuatro bandas homogéneas. La primera, en zona gamma central hacia el C3, y las otras tres, una sobre la otra, en zona gamma central hacia la región catódica. Un fondo policlonal moderadamente representado ID 00162

Electroforesis

Aι

α1

162

α2

β1

Aι

α1

α2

β1

COMPONENTES M MÚLTIPLES

Gráfico no. 2

Gráfico no. 10

A la izquierda, muestra normal. A la derecha, muestra con una disposición policlonal reducida y cuatro bandas homogéneas. La más anódica se sitúa por debajo el C3; las otras tres, una sobre otra, de la zona gamma anódica y hasta la catódica. ID 00163

Electroforesis

163

Aι

α1

α2

β1 β2

Aι

α1

α2 β1 β2

LAS CINCO REGLAS DE HARVEY Electrofisiología

Exploración física Anamnesis

Anamnesis

Rx área cardíaca Exámenes especiales

Análisis del paciente

6a semiótica ETF

SEMIÓTICA DE ALGUNOS PATRONES SEROPROTEICOS

SEMIĂ&#x201C;TICA de algunos cuadros seroproteicos

Presencia de los tres fenotipos haptoglobĂnicos

Electroforesis

Bisalbuminemia

Heterocigosis de alfa 1 antitripsina

167

SEMIÓTICA de algunos cuadros seroproteicos

Síndrome nefrótico

Electroforesis

Hipertransferrinemia por anemia

168

Componentes monoclonales en zona beta

SEMIÓTICA de algunos cuadros seroproteicos

Analbuminemia

Electroforesis

Hemólisis intravascular

Perfil oligoclonal

169

SEMIÓTICA de algunos cuadros seroproteicos

Hipergammaglobulinemia

Electroforesis

Componentes M en un paciente hipogammaglobulinémico

170

Componentes monoclonales en un paciente con una conservación media de las inmunoglobulinas policlonales.

SEMIĂ&#x201C;TICA de algunos cuadros seroproteicos

Hipogammaglobulinemia

Electroforesis

Perfil biclonal

Paciente con deficiencia de alfa 1 antitripsina

171

SEMIÓTICA de algunos cuadros seroproteicos

Puente beta-gamma

Electroforesis

Cuadro inflamatorio agudo

172

Cuadro inflamatorio crónico

PROTEÍNAS PRESENTES EN LA MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA Y QUE SIMULAN LA PRESENCIA DE UN CM

INTER ALBÚMINA ALFA 1

alfa 1 antitripsina heterocigosis

alfa fetoproteína

SPE

AAT

IgA

IgM

A la izquierda, muestra con un aumento ligero de la AAT. A la derecha, muestra con una banda homogénea entre la albúmina y la AAT: 1) No puede ser heterocigosis de AAT, pues las dos bandas son de entidad y morfología diferente. 2) Podría ser un componente M. La IFE determinó que la banda corresponde a la alfa fetoproteína en un sujeto con hepatoma. Alfa fetoproteína: es raro encontrarla en el proteinograma, pues tiene un valor ponderal bajo.

ID 2030175

Electroforesis

175

INTER ALFA 1-ALFA 2

alfa 1 glicoproteína ácida

SPE

AAG

IgA

IgM

alfa fetoproteína

ID 00176

La globulina Gc es una proteína del sistema de inhibición de la actina extracelular (EASS), pues impide la polimerización de la actina G a F, que, si llegase a polimerizar, haría crítica la dinámica del citoesqueleto y la modulación de la trombosis intravascular. En caso contrario, la Gc actuaría como factor antitrombótico.

Electroforesis

176

SPE ID 00176

IgA

IgM

INTER ALFA 2-TRANSFERRINA

fibronectina

C3 activado in vitro

SPE Fibronectina IgA

IgM

魏

位

SPE

ID 200177

Electroforesis

ID 100177

177

IgA

IgM

魏

位

INTER TRANSFERRINA-C3

beta lipoproteína (APO B)

Electroforesis

178

INTER C3-GAMMA

C1 q inhibidor

fibrin贸geno

Electroforesis

179

INTER C3-GAMMA

2 microglobulina

PCR

Electroforesis

180

INTER C3-GAMMA lizosima

SPE

Lisozima

IgA

IgM

魏

位

ID 200181

Electroforesis

181

ATLAS DE CUADROS CRIOGLOBULINÉMICOS INMUNOFIJADOS

CRIOGLOBULINAS

Definición: grupo de inmunoglobulinas que precipitan con el frío y se disuelven, por lo regular, si se llevan a una temperatura de 37°C. Lerner A.B. y col., 1947 Tipos de crioglobulinemias: I, II, III y mixtas (II, III) de Brouet, así como microheterogéneas de Musset. Por otra parte, el fibrinógeno crioprecipitante puede confundirse con una crioglobulinemia. En caso de que se sospeche tal desorden, deberá realizarse una toma de muestras tanto de suero, como de plasma, y el procedimiento seguirá el mismo curso. Si ambas pruebas resultasen positivas, se tratará de una crioglobulinemia. En tanto que la positividad de sólo la muestra de plasma, indicará la presencia de criofibrinógeno.

Electroforesis

185

CLASIFICACIÓN SEGÚN BROUET

Tipo I: inmunoglobulina monoclonal Tipo II a y b: inmunoglobulina monoclonal y componentes policlonales Tipo II a = inmunoglobulina M con actividad de factor reumatoide sobre las inmunoglobulinas policlonales Tipo II b = inmunoglobulina oligoclonal con actividad de factor reumatoide sobre las inmunoglobulina policlonales Tipo III: inmunoglobulina policlonal Existen también las crioglobulinemias mixtas tipo II/III El porcentaje de pacientes con una crioglobulinemia mixta durante una infección crónica por VHC es muy variable en la gran cantidad de estudios publicados, que va del 20% al 60%. En Italia, España y Francia, y quizá también en otros países de la cuenca del mediterráneo, la prevalencia del síndrome crioglobulinémico es alta (del 30% al 50% de los pacientes infectados con VHC), pero en los países anglosajones (Reino Unido y EUA) tal prevalencia es muy baja (de casi el 2%).

Electroforesis

186

CLASIFICACIÓN SEGÚN MUSSET

Microheterogéneas: a) Inmunoglobulinas monoclonales incompletas b) Inmunoglobulinas monoclonales completas y cadenas ligeras libres c) Cadenas ligeras libres d) a + b + c

Electroforesis

187

ATLAS

crioglobulinas inmunofijadas

SPE

IgG

IgA

IgM

魏

crioglobulinas inmunofijadas

位

SPE

ID 200188

Crioglobulinas de la clase I de Brouet (IgG k) y ausen-

IgA

IgM

魏

位

Crioglobulinas de la clase II de Brouet (IgM FR) e IgG policlonales

cia de inmunoglobulinas policlonales.

Electroforesis

IgG

ID 100188

188

ATLAS

crioglobulinas inmunofijadas

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE

ID 200189

Crioglobulinas de la clase III de Brouet (inmunoglobulinas policlonales).

Electroforesis

IgG

IgA

IgM

ID 100189

Crioglobulinas de la clasificación de Musset (IgG k e inmunoglobulinas policlonales + IgM k + κ libres + λ policlonales).

189

ATLAS criofibrin贸geno inmunofijado

A la izquierda, muestra de suero negativa para crioglobulinemias. A la derecha, muestra de plasma positiva para crioglobulinemias.

Electroforesis ID 200190

190

ATLAS inmunofijaci贸n del criofibrin贸geno negativa

A la izquierda, muestra de suero con crioglobulinemia tipo I de Brouet. A la derecha, muestra de plasma con crioglobulinemia tipo I de Brouet.

Electroforesis

191

LAS INMUNOFIJACIONES

ATLAS inmunofijaciones séricas negativas

Proteinogramas de IFE negativos para componentes M.

Electroforesi s SPE IgG ID 200197

ID 200195

IgA

IgM

SPE ID 200195

IgG

195 IgA

IgM

ATLAS inmunofijaciones séricas negativas

Proteinogramas negativos para la presencia de componentes M. La IFE a la izquierda revela una disminución de la heterogeneidad policlonal para la clase G y subclase I. Las clases A y M son normales. La IFE a la derecha revela una disminución media de la policlonalidad G (incuso en el ámbito de referencia) y ausencia de la A.

ID 200198

Electroforesi s SPE IgG ID 200196

IgA

IgM

196

λ ID 200196

ATLAS inmunofijaciones séricas: clase G

Diferentes muestras séricas

Presencia de un componente M de clase IgG tipo λ, de gran tamaño. Policlonalidad disminuida.

ID 200198

Electroforesis ID 200197

Presencia de un componente M clase IgG tipo K, de tamaño medio. Ausencia de policlonalidad.

197

Presencia de un componente M clase IgG tipo λ, de tamaño medio. Ausencia de policlonalidad.

ATLAS Inmunofijaciones séricas: clase G

Presencia de dos componentes M de clase IgG tipo k. El catódico tiene una concentración baja, y el anódico, situado en zona transferrínica, es de concentración media.

SPE ID 200198

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

198

ATLAS inmunofijaciones séricas: clase G

Diferentes muestras séricas

Presencia de dos componentes M clase IgG y tipo k, con una buena conservación de las policlonales.

ID 200198

SPE

IgG

Electroforesis ID 200199

Presencia de dos componentes M clase IgG y tipo k, con una conservación discreta de las policlonales G y ausencia de las A y M.

IgA

Presencia de dos componentes M de clase IgG y tipo k, con una conservación baja de las policlonales G.

IgG

199

IgA

IgM

ATLAS inmunofijaciones séricas: clase G

Diferentes muestras

Presencia de un pequeñísimo componente M clase IgG, tipo λ. La concentración elevada de las policlonales k puede inducir a error en la determinación del tipo de cadena ligera.

ID 200198

SPE

IgG

Electroforesis ID 200200

Presencia de un componente M clase IgG, tipo λ.

Presencia de dos componentes M de clase IgG y tipo k, con una disminución fuerte de las policlonales.

IgG

200

IgA

IgM

ATLAS inmunofijaciones séricas: clase G

Presencia de dos componentes M de clase IgG y tipo lambda. El catódico tiene una concentración baja. El anódico, una inferior. Obsérvese la gran reducción de la heterogeneidad policlonal del inmunofijado IgA (más anódico respecto al componente M anódico), que simula una banda compatible con la morfología “monoclonal“.

SPE ID 200198 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

201

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clase A

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE

ID 200202

Presencia de tres componentes M clase IgA, tipo lambda. En la zona gamma catódica se aprecia un componente M tipo lambda, que fue confirmado con un antisuero anticadenas ligeras libres como positivo para Bence Jones. Respecto a la clase A, es útil disgregar la muestra y determinar el número de clones secretados.

ID 200198 200201

Electroforesis

IgG

IgA

IgM

ID 100202

La muestra presenta un componente M clase A, tipo λ. Obsérvese la diversa reactividad del antisuero (afinidad y avidez) respecto a la clase y el tipo.

202

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clase A

inmunofijaciones séricas: clase M

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200203

Muestra con dos componentes monoclonales IgA λ en

ID 200198 200201

IgM

Muestra con dos componentes M de clase IgM y tipo k y λ respectivamente, en posición gamma central.

posición gamma anódica-C3.

Electroforesis

IgA

ID 100203

203

ATLAS inmunofijaciones séricas: clase M

Muestra con un componente M clase IgM, tipo k.

SPE ID 200198 200204 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

204

ATLAS inmunofijaciones sĂŠricas: clase M

La muestra de la izquierda presenta un componente monoclonal clase IgM, tipo k. La muestra de la derecha presenta dos componentes M clase IgM, tipo k.

SPE ID 200198 200205 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

205

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clase M

SPE

IgG

IgA

IgM

inmunofijaciones séricas: clase D

SPE IgG

ID 200206

Muestra con un componente M de clase M, tipo k.

ID 200198 200201

Electroforesis

IgA

IgD

ID 100206

Muestra con un componente M de clase D, tipo λ.

206

ATLAS inmunofijaciones s茅ricas: clase E

Muestra con un componente M clase E, tipo 位.

SPE ID 200198 200207 200201

IgG

Electroforesis

207

ATLAS inmunofijaciones séricas: cadenas ligeras libres monoclonales k

Muestra con un componente M tipo k, tal vez libre, en posición C3. El empleo de un antisuero kappa libre permitió su tipificación como BJ k libre.

SPE ID 200198 200208 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

SPE ID 200208

208

ATLAS inmunofijaciones séricas: cadenas ligeras libres monoclonales k

Muestra con un componente M tipo k, confirmada como positiva para Bence Jones por un antisuero anticadenas ligeras libres k.

SPE ID 200198 200209 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

209

ATLAS inmunofijaciones séricas: cadenas ligeras libres monoclonales 

A la izquierda, muestra con un componente M tipo λ, confirmada como positiva para Bence Jones por un antisuero anticadenas ligeras libres λ. A la derecha, muestra con dos componentes M λ, confirmada como positiva para Bence Jones por un antisuero anticadenas ligeras libres λ.

SPE ID 200198 200210 200201

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

λ ID 200210

210

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES su presencia en el suero y orina

Una vez determinada la presencia de la proteína de BJ (en este caso de tipo k) en el suero y orina, será obligatorio informar no solo la situación, sino también la determinación de los dos componentes M por separado.

SPE

IgG

Electroforesis ID 200213

IgA

IgM

λ ID 200213

211

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES

su presencia en el suero y orina

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

IgM

La muestra presenta un componente monoclonal clase

La muestra presenta un componente M de clase IgA,

IgA, tipo λ. Además, se aprecia una proteína BJ tipo k

tipo λ. Además, se aprecia una proteína BJ de tipo λ

confirmada.

Electroforesis ID 200213

IgA

ID 100212

ID 200212

212

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES su presencia en el suero y orina

Muestra con un componente M doble tipo λ, confirmada como Bence Jones por IFE de orina.

SPE

IgG

Electroforesis ID 200213

IgA

IgM

λ ID 200213

213

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES Su presencia en el suero y orina

La muestra presenta una IgA de tipo λ junto con un consumo casi equitativo de anticuerpos, así como una IgM de tipo k y una lambda libre, confirmada como BJ.

SPE

IgG

Electroforesis ID 200213 200214

IgA

IgM

214

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES su presencia en el suero y orina

La muestra presenta un componente M de clase IgG tipo k y otro quizá k libre. La IFE de orina confirmo la presencia de una IgG k y de una doble cadena k monoclonal (BJ). El dictamen deberá considerar la suma de la ponderalidad de los componentes M.

SPE

IgG

Electroforesis ID 200213 200215

IgA

IgM

215

LA PROTEÍNA DE BENCE JONES su presencia en el suero y orina

La IFE a la izquierda revela un componente M de clase G, tipo k. La consiguiente búsqueda de una proteinuria BJ, la IFE al centro, revela el paso de la IgG k a la orina. En estos casos, se recomienda emplear antisueros anticadenas libres para confirmar la presencia de una cadena ligera libre monoclonal, que migró coincidiendo con la inmunoglobulina completa.

SPE

IgG

Electroforesis ID 200213 200216

IgA

IgM

216

ATLAS inmunofijaciones séricas: diferentes clases coexistentes

La muestra a la izquierda presenta un componente M de clase IgG, tipo λ y otro de clase IgA, tipo λ y dos más de clase IgM, tipo k. La muestra a la derecha presenta un componente M de clase IgG, tipo λ, otro de clase M, tipo λ y, por último, una cadena λ libre, confirmada como BJ por IFE.

SPE ID 200217

IgG

Electroforesis ID 200213

IgA

IgM

217

ATLAS inmunofijaciones séricas: diferentes clases coexistentes

La muestra a la izquierda es de un paciente hepatotransplantado. Presencia de dos IgG λ a la altura de la alfa 1 antitripsina, una IgG λ muy débil en posición C3, una cadena pesada de tipo G y dos cadenas ligeras libres monoclonales k. La muestra a la derecha presenta dos componentes M de clase IgG, tipo λ y uno de clase IgM, tipo λ. Presencia de beta lipoproteína entre la Tf y el C3.

SPE ID 200218

IgG

Electroforesis ID 200213

IgA

IgM

218

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clases y tipos coexistentes

Inmunofijaciones séricas: diferentes clases coexistentes

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200219

La muestra presenta un componente M de clase IgG k

IgM

Muestra con un componente M doble. El más catódico es de clase IgG k y el más anódico, IgA k.

y otro IgA λ.

Electroforesis

IgA

ID 100219

219

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clases y tipos coexistentes

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200220

Muestra con un componente M IgG λ y una cadena

IgM

Muestra con un componente M IgA k y otro k libre

ligera λ libre, confirmado como positivo para Bence

monoclonal, confirmado como positivo para Bence Jo-

Jones por un antisuero anticadenas ligeras libres.

Electroforesis

IgA

ID 100220

nes por un antisuero anticadenas ligeras libres.

220

ATLAS

inmunofijaciones séricas: clases y tipos coexistentes

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200221

Muestra con dos componentes M de clase G y M so-

IgM

Muestra con dos componentes M de clase IgG, tipo k

bre una cadena ligera de tipo k.

y otro de clase M, tipo k.

Electroforesis

IgA

ID 100221

221

ATLAS

inmunofijaciones séricas: casos particulares

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200222

Muestra de un paciente hepatotransplantado Presencia de dos componentes M IgG λ a la altura de alfa 1 antitripsina, otro de clase IgG, tipo λ muy débil en posición C3, de una cadena pesada G y dos más ligeras libres monoclonales k.

Electroforesis

IgA

IgD

ID 100222

Muestra de un individuo con un componente M IgD λ.

222

ATLAS inmunofijaciones séricas: casos especiales

Se observan dos cadenas libres monoclonales lambda, sin ninguna reacción con los antisueros G, A y M.

SPE ID 200223

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

Los antisueros antitipo confirmaron la presencia de una sola proteína de BJ.

ELP

GAM

223

Los antisueros anti D y E confirmaron la presencia de un componente M IgD lambda.

SPE ID 200223

IgD

IgE

ATLAS

inmunofijaciones séricas: casos especiales

inmunofijaciones séricas: casos particulares

SPE

IgG

IgD

IgE

SPE IgG

ID 200224

IgA

IgM

ID 100224

Muestra de un paciente con IgE λ.

Muestra de un individuo con un componente M λ libre en posición alfa 1 antitripsina. El informe debe sugerir que se efectué la inspección de la migración electroforética en toda su extensión.

ID 200223

Electroforesis

224

ATLAS

inmunofijaciones séricas: casos especiales

inmunofijaciones séricas: casos particulares

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200225

Paciente con enfermedad por cadenas pesadas IgA,

confirmada mediante electroinmunodifusión de inmu-

noselección.

ID 200223

IgM

Paciente con enfermedad por cadenas pesadas IgG,

confirmada mediante electroinmunodifusión de inmu-

Electroforesis

IgA

ID 100225

noselección.

225

ATLAS

inmunofijaciones séricas: casos especiales

inmunofijaciones séricas: casos particulares

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE IgG

ID 200226

Paciente con enfermedad por cadenas pesadas IgM, munoselección.

ID 200223

IgM

Paciente con crioglobulinemia. En este caso debe efectuarse una segunda toma de muestra y mantenerla a 37° C para determinar una crioglobulinemia. Es esencial conservar la cadena del calor de la muestra durante la deposición y electroforesis.

confirmada mediante electroinmunodifusión por in-

Electroforesis

IgA

ID 100226

226

ATLAS inmunofijaciones séricas: casos especiales

En este caso, la migración de referencia no se trató con un agente reductor. En algunos textos se mencionan ejemplos similares: la muestra previa se trató con un agente reductor como beta mercaptoetanol o ditiotreitol. La nueva IFE demostró la presencia de una IgMK. Este no es el procedimiento adecuado, pues sólo sirve para decir que el depósito está constituido por IgM y todo parece indicar que casos similares se resuelven de esta manera. El procedimiento correcto consiste en repetir la toma de muestra y conservarla caliente para el posible diagnóstico de una crioglobulinemia; diagnóstico muy distinto de aquel que confirma la presencia de IgM monoclonales.

SPE ID 200227

ID 200223

Electroforesis

227

IgG

IgA

IgM

ATLAS inmunofijaciones séricas: casos especiales

Del ejemplo anterior, se tomo de nuevo la muestra y se conservo caliente. La detección de una crioglobulinemia resultó positiva: tipo II de Brouet. Si hubiésemos confiado en el resultado de la desagregación, habríamos diagnosticado erróneamente una gammapatía monoclonal IgM k.

SPE ID 200223 200228

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

SPE

IgG

IgA

228

IgM

ATLAS inmunofijaciones séricas: casos especiales

Una muestra crioglobulinémica tendría una crioprecipitación en todas las líneas de deposición de la muestra biológica prediluida para IFE. En este caso la ausencia de precipitación en tres líneas podría deponer la presencia de IgM viscosas (trímeras, pentámeras y hexámeras) en múltiples estados de agregación. La solución real consiste en tomar una muestra y conservarla caliente para la detección de una crioglobulinemia que, en caso de confirmarse, depondría el primer diagnóstico.

SPE ID 200223 200229

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

229

ATLAS inmunofijaciones séricas de casos especiales: la desagregación

La muestra a la izquierda se trató con ditiotreitol para conocer si los dos componentes M IgM k son producto de clones independientes o de un sólo clon. La IFE a la derecha revela dos componente M contenidos en una sola banda monoclonal homogénea; un sólo clon secretor.

SPE ID 200223 200230

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

230

ATLAS inmunofijaciones séricas de casos especiales: la desagregación

La muestra a la izquierda se trató con ditiotreitol para saber si los dos componentes M IgG k son producto de clones independientes o de un sólo clon. La IFE de la derecha revela dos componentes M contenidos en una sola banda monoclonal homogénea; un sólo clon secretor y una sola subclase IgG involucrada.

SPE ID 200223 200231

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

231

ATLAS inmunofijaciones séricas de casos especiales: la desagregación

Más de un componente M migró en el mismo punto a causa de una movilidad electroforética similar (gel de la izquierda). La muestra se trató con ditiotreitol y luego se hizo migrar. Es posible identificar tres componentes M: uno de clase IgG, tipo k, otro de clase IgM, tipo k y una cadena libre λ.

SPE ID 200223 200232

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

232

ATLAS inmunofijaciones séricas de casos especiales: el tiempo de reacción de los antisueros

A través del antisuero anticadenas libres λ no se pudo detectar el componente M. Por otra parte, la negatividad de los antisueros anti D y E descarta que el componente M este vinculado a una clase inmunoglobulínica. El problema se debe a la baja reactividad (afinidad, avidez y título) del antisuero anticadenas libres λ por el componente. Así que, para demostrarlo, aumentamos el tiempo de incubación del antisuero a 20 minutos y obtuvimos el resultado esperado: positivo para λ libre.

SPE IgG Electroforesi s ID 200223

ID 200233

IgA

IgM

233

ELP

GAM

ATLAS

inmunofijaciones séricas de casos especiales: las hipogammaglobulinemias

inmunofijaciones séricas: casos particulares

SPE

IgG

IgA

IgM

SPE

ID 200234

Suele ser que la IFE de muestras hipogammaglobulinémicas no revela la presencia del componente M. Esto es debido a que están ausentes en pacientes sin sintomatología clínica. En tales casos se recomienda diluir menos la muestra y prolongar el tiempo de incubación de los antisueros en un 50%.

ID 200223

Electroforesis

IgG

IgA

IgM

ID 100234

Otras veces, las hipogammaglobulinemias revelan luego de la IFE pequeñísimos componentes monoclonales; al igual que en el caso presentado: componente M de clase IgG, tipo k.

234

ATLAS inmunofijaciones séricas de casos especiales: las hipogammaglobulinemias y el mieloma no secretor

Por último, se dan casos en que la hipogammaglobulinemia es la única anomalía proteínica en presencia de mieloma no secretor. La determinación adicional de la beta 2 microglobulina puede ayudar en ausencia del marcador patognomónico normal. Debido a que el componente M no es secretado por las células inmunocompetentes, es indetectable en los líquidos biológicos y, por tanto, sólo el estudio de los plasmocitos medulares puede establecer el diagnóstico correcto.

ID 200223

Electroforesis ID 200235

SPE

IgG

235

ATLAS

Inmunofijaciones séricas de casos especiales: oligoclonalidad en pacientes VIH positivos

inmunofijaciones séricas de casos especiales: la alfa fetoproteína

El tropismo selectivo del VIH contra los linfocitos T4 (CD4+), cuya acción es de gran importancia en la regulación de la respuesta inmune, determina su disminución gradual y, por tanto, una regulación anormal de los linfocitos B. En estos pacientes se dan con frecuencia infecciones virales oportunistas (EBV, CMV) concomitantes con síndromes linfoproliferativos. Asimismo es común la detección de cuadros oligoclonales.

SPE ID 200236

ID 200223

SPE

IgG

Electroforesis ID 200236

IgA

IgM

236

Alfa

IgA

IgM

VALORACIÓN La disposición policlonal en pacientes con componentes monoclonales

ID 200223

Electroforesis

237

VALORACIÓN La disposición policlonal de pacientes con componentes monoclonales

XXXII Conferencia del Colegio Americano de Patólogos. Directrices para la valoración, diagnóstico y control de laboratorio de gammapatías monoclonales Chicago, III, Mayo 29-31, 1998 Arch. Pathol. Lab. Med. Vol. 123 February 1999 “La determinación de proteínas monoclonales requiere una electroforesis de alta resolución (basada en gel…) e inmunofijación…” "El interprete debe examinar de forma directa el gel...tanto en la electroforesis de suero como de orina". "Asimismo, deberá tenerse en cuenta toda reducción de las gammaglobulinas séricas no implicadas respecto al último estudio, por debajo del rango normal establecido en el laboratorio."

ID 200223

Electroforesis

239

LA PREDILUCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

Para el control del paciente portador de un componente monoclonal, la valoración de la disposición policlonal debe prever la comparación entre los resultados de la inmunofijación. Por lo tanto, es necesaria la predilución de las muestras biológicas a lo largo del tiempo para obtener inmunofijaciones homogéneas. Por otro lado, los sistemas IFE más sofisticados prevén una predilución fija al variar la concentración del componente monoclonal o, dicho de otra manera, evitan el exceso de antígenos hasta las concentraciones que figuran en las imágenes siguientes.

ID 200223

Electroforesis

240

LA PREDILUCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA relación entre tipología de estratificación del antisuero, concentración del CM y colorante Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgG

Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgA

Estudio de los valores integrales

Diluciones-IgG

Diluciones-IgA

Estudio de los valores integrales

Diluciones-IgA

Diluciones-IgG Diluciones-IgG

Valor ponderal de un componente M IgG expresado linealmente hasta 35 g/L.

ID 200223

Linealidad de fijación de la tinción frente a las IgM

Electroforesis

Diluciones-IgA

Valor ponderal de un componente M IgA expresado linealmente hasta 27 g/L.

241

Diluciones-IgM Diluciones-IgM

Valor ponderal de un componente M IgM expresado linealmente hasta 30 g/L.

LA PREDILUCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA relación entre tipología de estratificación del antisuero y concentración del CM

El sistema Interlab efectúa la estratificación del antisuero sobre un frente de menor longitud respecto al de la migración electroforética.

ID 200223

Electroforesis

Por consiguiente, el antisuero tendrá velocidades de propagación distintas según y cómo se distribuya en la parte media (concentración máxima) o terminal del componente M (concentración mínima). Véase la imagen con los vectores a y b.

242

LA PREDILUCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA relación entre tipología de estratificación del antisuero y concentración CM

Representación de la difusión radial del antisuero sobre el componente M.

Representación graficodensitométrica de un componente M.

ID 200223

Electroforesis

243

LA PREDILUCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA relación entre tipología de estratificación del antisuero y concentración CM

El antisuero se autodiluye al propagarse y, cuando se equilibra, la precipitación de los agregados es tangencial al arco de difusión y genera una precipitación puntiforme convexa que da geometrías precipitativas completas de arco. El efecto final estará constituido por una precipitación en equilibrio con forma clepsídrica. Pero, si el equilibrio se encuentra en los extremos derecho e izquierdo del componente monoclonal, tendremos la clásica forma de clepsidra.

ID 200223

Electroforesis

244

Respecto a las concentraciones máximas del componente monoclonal expresadas como respuesta lineal al sistema (véanse los gráficos tridimensionales), se evitará el fenómeno de “exceso de antígenos” y, por consiguiente, la posible comparación de la “inspección visual” efectuada en las IFE durante el seguimiento del paciente. En desequilibrio, por la concentración elevada del componente monoclonal, la inmunoprecipitación ocurrirá sobre los bordes catódico y anódico.

VALORACIÓN la disposición policlonal en pacientes con componentes monoclonales

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales” Disposición normal de las inmunoglobulinas policlonales.

ID 200223

Electroforesis

245

VALORACIÓN

la disposición policlonal de pacientes con componente monoclonales

SPE

IgG

IgA

IgM

i la disposición policlonal de pacientes con componentes monoclonales

SPE IgG

ID 200246

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales” Disposición policlonal a cargo de las tres clases aumentadas. Muestra hipogammaglobulinémica.

ID 200223

Electroforesis

IgA

IgM

ID 100246

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales” Disposición policlonal a cargo de las tres clases disminuidas. Muestra hipogammaglobulinémica.

246

VALORACIÓN

la disposición policlonal de pacientes con componente monoclonales

SPE

IgG

IgA

IgM

la disposición i policlonal de pacientes con componentes monoclonales

SPE IgG

ID 200247

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales”

ID 200223

IgM

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales” Disposición policlonal de las tres clases: IgG con policlonales en los límites de la normalidad, con heterogeneidad disminuida. IgA con policlonales disminuidas. IgM con policlonales normales.

Disposición policlonal de las tres clases: IgG con policlonales normales en los límites inferiores IgA con policlonales normales IgM con policlonales normales.

Electroforesis

IgA

ID 100247

247

VALORACIÓN la disposición policlonal en pacientes con componentes monoclonales

“La inspección de la disposición policlonal en pacientes sin componentes monoclonales” Disposición policlonal de las tres clases: IgG con policlonales en los límites inferiores de la normalidad IgA con policlonales disminuidas. IgM con policlonales disminuidas

SPE ID 200223 200248

IgG

Electroforesis

IgA

IgE

248

VALORACIÓN la disposición policlonal en pacientes con componentes monoclonales

Seguimiento: la misma muestra se estudió a los 6 meses. No se aprecian diferencias de posición, cambios de la concentración, o algún componente monoclonal adicional, pero si una disminución de las IgG policlonales, que debe informarse en el dictamen.

SPE 200249 ID 200223

IgG

Electroforesis

IgA

IgM

249

LAS PROTEINURIAS la inspección y la semiótica electroforética

Cuadro proteínico de la orina en gel de agarosa teñida con violeta ácido: la posición de cada proteína del plasma separada por un carga eléctrica neta

LAS PROTEINURIAS

Partiendo del probable origen de las proteínas en la orina, se han propuesto distintas clasificaciones, entre las cuales, presentamos la de Boylan (para más información y detalles consulte el segundo apéndice).

1) Proteinurias de origen plasmático a) Glomerular selectiva y no selectiva b) Tubular incompleta y completas c) Prerrenales 2) Proteinurias de origen tisular a) Nefrogenéticas

3) Proteinurias post renales

ID 200223

Electroforesis

253

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS

Electroforesis de orinas no concentradas: Muestra 1: proteinuria glomerular no selectiva en fase inicial Muestra 3: proteinuria glomerular no selectiva y tubular incompleta Muestra 8: proteinuria nefrogen茅tica con presencia de uromucoide Muestras 11 y 12: proteinuria fisiol贸gica

ID 200223

Electroforesis ID 72254

254

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS

Electroforesis de orinas no concentradas (las muestras 4 y 5 fueron concentradas 4 veces): Muestra 1: proteinuria glomerular no selectiva y tubular incompleta con presencia de proteinuria de Bence Jones (plasmática prerrenal por sobre flujo). Muestra 4: proteinuria glomerular no selectiva y tubular completa con presencia de proteinuria de Bence Jones (plasmática prerrenal por sobre flujo) beta 2 microglobulina y alfa 1 microproteína. Muestra 6: proteinuria glomerular no selectiva en fase inicial y tubular incompleta por la presencia de la proteína fijadora de retinol. Muestra 10: proteinuria tubular incompleta por presencia de beta 2 microglobulina, cuyo cálculo arrojó una concentración de 2.34 mg/L (realizar IFE de orina para detectar Bence Jones). Véase la IFE anterior. Muestra 13: suero de referencia diluido

ID 200223

Electroforesis ID 30255

255

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS

La IFE de orina revel贸 una proteinuria de Bence Jones de tipo k. Asimismo, la muestra de suero mostr贸 una hipogammaglobulinemia. Este signo anuncia con frecuencia des贸rdenes inmunoproliferativas.

ID 200223

Electroforesis ID 200256

ELP

256

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS directrices para la búsqueda de la proteína de Bence Jones

Véase el sexto apéndice

ID 200223

Electroforesis

257

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS

Electroforesis de orinas no concentradas: Muestra 2: proteinuria glomerular selectiva y tubular incompleta con presencia de proteinuria de Bence Jones (plasmática prerrenal por sobre flujo) Muestra 6: proteinuria glomerular no selectiva y tubular completa con proteinuria de Bence Jones (plasmática prerrenal por sobre flujo), dos bandas, beta 2 microglobulina. Proteína fijadora de retinol y alfa 1 microproteína. Muestra 11: proteinuria tubular incompleta con Bence Jones (plasmática prerrenal por sobre flujo)

ID 200223

Electroforesis ID 39258

258

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS iconografías

ID 200223

Electroforesis ID 50259

259

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS iconografías

ID 50987

ID 200223

Electroforesis

ID 11260

ID 74260

260

LAS PROTEINURIAS EN ELECTROFORESIS iconografĂas

Proteinuria HR: muestras cuatro veces concentradas

ID 200223

Electroforesis ID 44261

261

EPÍLOGO

de las proteasas. 3) Enfermedades y síndromes hemorrágicos por deficiencias congénitas o adquiridas de la coagulación. 4) Hipogammaglobulinemia y disgammaglobulinemia primaria y secundaria 5) Gammapatías monoclonales 6) Crioglobulinemias 7) Síndromes proteínicos reactivos de la fase aguda 8) Disproteinemia hepatopática 9) Síndromes por pérdida proteica 10) Enfermedades por deficiencia de lipoproteínas y dislipidemias La electroforesis, vista dentro del panorama global, aún es el mejor método rutinario pese al número limitado de proteínas valoradas, pues nos informa sobre el estado general de los principales órganos de síntesis proteínica extracelular y posibles condiciones de pérdida proteínica. La interpretación de las migraciones electroforéticas puede seguir dos caminos del todo diferentes, donde la visual ocupa un lugar predominante, en tanto que el barrido densitométrico, más allá de los valores numéricos, es a veces de gran ayuda. El objetivo de este epílogo es demostrar que sin la inspección visual pueden perderse relieves relativos a componentes monoclonales, así como hallazgos "semióticos".

La electroforesis de suero puede documentar una serie de trastornos graves como los que se dan en las inmunoglobulinemias monoclonales, en las linfopatías agammaglobulinémicas constitucionales o adquiridas, en las hepatopatías crónicas, en las colagenopatías, en las graves pérdidas proteínicas renales e intestinales y, además, pone de relieve algunas anomalías genéticas conexas a fenómenos patológicos. Por consiguiente, se distingue una problemática de semiótica referente a las proteínas plasmáticas basada en el estudio de los distintos sistemas funcionales en los que están implicadas. Disertación de los sistemas funciónales desde un punto de vista fisiopatológico: 1) Proteínas transportadoras 2) Proteínas de la inflamación 3) Proteínas de la coagulación y de la fibrinólisis 4) Enzimas plasmáticas específicas (lisozima). 5) Anticuerpos 6) El sistema del complemento 7) Lipoproteínas Disertación de los sistemas funcionales desde un punto de vista clínico: 1) Enfermedades congénitas o adquiridas por la deficiencia de proteínas transportadoras. 2) Enfermedades congénitas o adquiridas por la deficiencia de inhibidores

ID 200223

Electroforesis

263

Pero antes de demostrar lo que se planteó como objetivo del capítulo, queremos recordarle al lector que las comisiones internacionales defienden la necesidad de la inspección los resultados electroforéticos: 1) Comm.05 SIBioC Giorn. It. Chim. Clin., vol. 15, no. 1, 1990. Revista italiana de bioquímica, pg. 51-52 “En 1972 durante el octavo Congreso Internacional de Bioquímica Clínica, un grupo de expertos recomendó eliminar la densitometría alegando que el químico clínico proporciona datos fisiopatológicos en lugar de números.” En 1983 se aportó una prueba consistente de esto en relación con el gel de agarosa: Merlini G. y col. Identificación de las proteínas del plasma por inmunosustracción tras su electroforesis en gel de agarosa. J. Clin. Chem. Biochem., 21, 841, 1983 Los siguientes trabajos ejemplifican la necesidad de la interpretación visual: 2) Aguzzi y col. Interpretación de la electroforesis de suero La Ricerca Clin. Lab., 8 (suppl. 1), 171, 1978 3) Blomabaeck B. y col. Proteínas del plasma, Chichester, 1979 4) Aguzzi y col. La importancia clínica de la interpretación molecular de la electroforesis de suero en acetato de celulosa Electrophoresis’79, pg. 811 Ed. Walter de Gruyter, Berlin, 1980. 5) Aguzzi y col. La electroforesis en acetato de celulosa frente al gel de agarosa y la inspección visual frente a la densitometría. Clin. Chem., 27, 1944, 1981. 6) Colegio Estadounidense de Patólogos (CAP)

ID 200223

Electroforesis

Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A. Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106–107) "El interprete deberá examinar directamente el gel...tanto en la electroforesis de suero como de orina". En base a dichas recomendaciones, el enfoque de la electroforesis exige el siguiente proceso: a) interpretación visual b) semiótica electroforética c) una posible lectura densitométrica (determinación del componente M, de la albumina, etc.) d) informe detallado Estos cuatro puntos constituyen el vínculo con el médico. La lectura densitométrica y la interpretación visual. Se seleccionaron 30 muestras con uno o varios componentes M tipificados por inmunofijación. Todas ellas, teñidas con azul ácido, se hicieron migrar con el sistema Interlab G26 y luego se cuantificaron por densitometría. La tabla 1 muestra los valores ponderales de los componentes M calculados por densitometría. Tabla 1

264

Número progresivo

Tipificaciones IFE

Conc. g/l densitometría

IgG L

0.5

IgG k

1.0

2 IgM L

7.0

ID 200223

IgG k

0.6

3 IgGK

2.2

IgM k

0.4

IgGK

0.15

IgGL

0.2

2 IgGK

1.0 \ 3.0

IgAK + IgGL

2.2 \ 5.5

IgGK

4.2

IgGK + IgAL

0.2 \ 1.0

3 IgGK

4.5 \ 2.0 \ 1.2

IgGK

6.0

IgGK

4.4

3 IgGK

9.5

IgGK

0.7

IgMK

8.5

IgGK

1.9

IgGL

1.1

2 IgGK

4.5 \ 12

IgGK + IgA k

1.0 \ 1.9

IgM k

6.0

2IgGL

0.8 \ 2.0

2 IgMK

0.4 \ 1.8

2 L libere

2.0 \ 1.1

3 IgGK

9.0 \ 1.5 \ 3.2

IgGK

7.0

IgGL

15.0

IgGL

1.6

Electroforesis

A dos expertos se les entrego las migraciones electroforéticas en diferentes momentos, así como los gráficos densitométricos de las 30 electroforesis para la detección de componentes M. La siguiente tabla resume lo obtenido: Tabla 2

265

Número progresivo

Detección visual de C.M.

Detección densitométrica de C.M.

Conc. g/l densitometría

1 C.M. - IgGL

NEGATIVA

0.5

1 C.M. - IgGK

C.M.

1.0

2 C.M. - 2 IgML

C.M.

7.0

1 C.M. - IgGK

NEGATIVA

0.6

1 C.M. - IgMK

NEGATIVA

0.4

1 C.M. - IgGL

C.M.

0.2

2 C.M. - IgAK + IgGL

C.M.

2.2 \ 5.5

3 C.M. - 3 IgGK

C.M.

4.5 \ 2.0 \ 1.2

2 C.M. - IgGK + IgAL

C.M

0.2 \ 1.0

1 C.M. - IgGK

C.M.

4.4

1 C.M. - IgGK

C.M.

6.0

1 C.M. - IgGK

DUDOSA

0.7

3 C.M. - 3 IgGK

C.M.

9.5

1 C.M. - IgGK

DUDOSA

1.9

1 C.M. - IgMK

C.M.

8.5

1 C.M. - IgGL

C.M.

1.1

2 C.M. - 2 IgGK

C.M.

4.5 \ 12

2 C.M. IgGK + IgAK

NEGATIVA

1.0 \ 1.9

1 C.M. - IgMK

C.M.

6.0

2 C.M. - 2 IgGL

NEGATIVA

0.8 \ 2.0

2 C.M. - 2 IgMK

NEGATIVA

0.4 \ 1.8

2 C.M. - 2 L libere

C.M.

2.0 \ 1.1

3 C.M. - 3 IgGK

C.M.

9.0 \ 1.5 \ 3.2

1 C.M. - IgGK

C.M.

7.0

1 C.M. - IgGL

C.M.

15.0

1 C.M. - IgGL

NEGATIVA

1.6

3 C.M. - 3 IgGK

C.M.

2.2

1 C.M. - IgGK

C.M.

0.15

2 C.M. - 2 IgGK

C.M.

1.0 \ 3.0

1 C.M. - IgGK

C.M.

4.2

ID 200223

Electroforesis

Leyenda: Negativa: la tendencia gráfica de las inmunoglobulinas policlonales oculta un componente M. Sospechosa: la tendencia gráfica revela un relieve pequeño. Las conclusiones que podemos deducir, se ajustan a los requerimientos de las diversas comisiones nacionales e internaciones sobre el tema. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA LECTURA VISUAL Y DE LA FOTODENSITOMÉTRICA DE LAS MIGRACIONES ELECTROFORÉTICAS El proteinograma electroforético, aunque no es un preparado anatómico, se utiliza para comparaciones visuales, definidas de descripción y de interpretación. En la comparación visual entre lo normal y lo patológico, el fraccionamiento de las proteínas de los líquidos biológicos presenta numerosas y significativas variaciones, cuya interpretación exige conocimientos de fisiopatología proteica. Sobre todo frente a una patología, las variaciones pueden ser tan notables y fácilmente identificables, que llevan al intérprete a realizar clasificaciones tipológicas tentativas. En este sentido, los expertos en protidología se han esforzado en clasificar los diferentes “cuadros seroproteínicos” e interpretar la importancia real de cada proteína específica, ya sea a través de una correlación entre los resultados y las condiciones fisiopatológicas o de un análisis molecular profundo. La lectura del cuadro proteínico gira en torno a los siguientes puntos básicos:

266

1) Comparar el aumento o disminución de la intensidad de cada proteína específica con lo “normal”. Por ejemplo, hipoalbuminemia.

3) Aparición de bandas supernumerarias. Por ejemplo, presencia del componente específico de grupo.

2) Ausencia de proteínas específicas que están presentes de manera normal. Por ejemplo, deficiencia de la alfa 1 antitripsina.

4) Aumento o diminución del ancho de cada banda respecto a lo “normal”. Esto es señal de una heterogeneidad u homogeneidad molecular incrementada. Por ejemplo, incremento de la homogeneidad en zona gamma.

ID 200223

Electroforesis

267

5) La fusión de una o más bandas. Esto es señal de un aumento regular de especies moleculares.

7) Reconocer los fenómenos debidos al transporte de sustancias exógenas o endógenas. Por ejemplo, transporte de fármacos.

6) El desdoblamiento de una o más bandas respecto a lo “normal”. Por ejemplo, aloalbuminemia heterocigota variante rápida.

8) Desnaturalizaciones proteínicas. Por ejemplo, desnaturalización de la orina por un almacenamiento prolongado.

ID 200223

Electroforesis

268

9) Artefactos por errores o manipulaciones incorrectas. Comprobar la presencia de crioglobulinas, disgregar la muestra y tipificar. Para esto, es necesario solicitar una muestra conservada caliente para una tipificación adecuada.

ción con el área de propagación: de hecho, son comunes las situaciones en que la cantidad de proteínas por volumen unitario de soporte (fase de deposición) exceden la cantidad más allá de la cual el fenómeno de fijación del colorante es parcialmente inhibido por la dificultad de entrada y unión a la proteína, debido al excesivo número de moléculas proteínicas que evitan estéricamente la función específica de la tinción. No obstante, los perfiles fotodensitométricos más difusos expresan gráficamente los valores ponderales de cada área en relación con el valor de proteínas totales y, a la vez, los valores porcentuales de cada área en relación con el área total de toda la curva descrita. La incorporación de la normalización del gráfico ( densitómetros modernos) consiste en llevar el pico de la proteína de mayor representación en el gráfico a valor máximo de escala. En consecuencia, las otras proteínas del gráfico son amplificadas proporcionalmente. La ventaja de un tipo de lectura como la descrita es de dos formas: 1) Cualquiera que sea la cantidad de color fijado, siempre se obtiene una curva sin cambios en términos de altura. Factor que facilita la comparación entre curvas “normales” y “anormales” de la misma muestra repetida. 2) Se evita en parte que la fracción mayor se sature en lectura debido a coloraciones muy intensas (linealidad instrumental) y que las fracciones más débiles se vean menos afectadas por el ruido instrumental (ruido óptico, electrónico, mecánico), salvo el generado por la ampliación normalizada. Las desventajas de la normalización también se presentan en dos formas: 1) La altura sin cambios impide apreciar realmente: a) la superficie total de la fracción normalizada (albúmina) en relación con las otras. Ejemplo: Se pueden perder gráficamente algunas hipoalbuminemias. b) se pierde la relación real de superficie ocupada por la albúmina y las globulinas.

Además de la lectura directa, puede utilizarse la fotodensitométrica para valorar la semicuantitativad de los resultados. Pero, sin duda alguna, ¡la densitometría no está en condiciones de sustituir a la directa! Los fotodensitómetros elaboran una curva de extinción - cada punto tiene dos coordenadas, una relativa al valor en mm sobre el eje x, y otra al valor en absorción sobre el eje y - constituida por todo tipo de curvas (meso, plato y leptocúrticas) de base y altura variables. El área bajo cada curva guarda proporción con la cantidad de colorante fijado a las proteínas. La cantidad de colorante fijada a la matriz proteínica guarda relación directa con la cantidad de la misma. Sin embargo, cuando varía la proteína, se producen cambios en la coloración que son, de igual manera, directamente proporcionales a la cantidad de proteína. Otro fenómeno de no linealidad entre color y cantidad o calidad de proteínas, tiene que ver con el volumen de muestra depositado en el soporte en rela-

ID 200223

Electroforesis

269

Ejemplo: Cuando la superficie de las gammaglobulinas guarda relación con dos albúminas diferentes, da porcentajes y superficies gráficas de gamma diferentes, con una cierta pérdida de relieves hipogammaglobulinémicos. 2) La saturación del densitómetro en densidad óptica, podría reducir algunos picos de albúmina y frente a eso: a) Tendríamos un gráfico poco suavizado con pérdida de pequeños relieves atribuibles a pequeños o pequeñísimos componentes monoclonales. Éste es uno de los problemas de la endeble fiabilidad de la inspección del gráfico frente a la inspección visual. Ejemplo: Muestra con un valor porcentual de las gamma cercano a los límites de una hipogammaglobulinemia (gráfico normalizado).

La búsqueda de componentes monoclonales, a través del trazador cúbico en el gráfico normalizado de la misma muestra, revela la presencia de uno pequeño:

Los valores del gráfico de la misma muestra, pero expresados en densidad óptica. Aquí es posible apreciar un relieve sobre la pendiente de las gammaglobulinas hacia la zona beta:

ID 200223

Electroforesis

Además, existe otro problema relativo a la lectura densitométrica, es decir, la separación de cada área. Si consideramos el problema haciendo referencia a dos situaciones distin-

270

tas: 1) Proteína específica pura. 2) Proteína específica pura y proteínas de bordes más heterogéneos de migración intermedia (situación real en la mayoría de los casos). Y teniendo en cuenta el poder resolutivo y de histéresis gráfica, podemos concluir que: En el caso de la proteína específica pura, el gráfico será muy similar a una distribución Gaussiana, con una relativa facilidad de medición instrumental para la definición los límites de la curva - colocación de mínimos - más cercanos a la línea de base y un pequeño error de valoración, por ejemplo, albúmina.

línea de base, introduce otro error vinculado con las áreas subtendentes de las curvas de interés, produciéndose así incrementos semiponderales y porcentuales. Obsérvense las áreas de sobreproducción y las áreas falsas calculadas porcentualmente en relación con las curvas de color.

Por tanto, estamos frente al completo fracaso de la lectura densitométrica en materia de interpretación, no sólo por la imposibilidad de distinguir cada proteína específica, sino por el hecho de que no se tiene sólo un aumento o una disminución de las clases moleculares en los casos de variaciones genéticas o en las patologías, las cuales conservan su identificación electroforética, pues la composición de las zonas también puede variar de manera importante. Visto todo esto, un procedimiento matemático exacto de seguimiento de las curvas para obtener una fase parcialmente interpretativa, también puede fracasar allí donde se busca la identificación molecular proteínica. No obstante, es conveniente admitir que ciertas deformaciones evidentes, señal de heterogeneidad molecular, pueden ser importantes para fines diferenciales. De hecho, la forma de la curva fotodensitométrica refleja de manera más o menos perceptible las variaciones cualitativas de las pistas, pero el sólo cálculo

En cambio, en el caso de las proteínas específicas que migran en zonas inmediatas, acompañadas de proteínas heterogéneas de velocidad intermedia, el problema se complica en relación con las distribuciones de la curva, pues ya no son de tipo gaussiano. En estos casos el mayor problema es la colocación aleatoria de los mínimos instrumentales, pues las áreas se dividen en relación con los puntos de inflexión de las curvas y no en relación con la inclinación de cada relieve representativo de los frentes de toda la curva. Además, el regreso de los mínimos cerca de la

ID 200223

Electroforesis

271

3) La inspección valora las variaciones cuantitativas, no sólo comparando la intensidad de una banda respecto a otra y con el modelo estándar arquetípico de lo “normal”, sino también contra cualquier ampliación, contracción, extensión de los márgenes morfológicos, etcétera, respecto con lo “normal”. La lectura densitométrica lee con detenimiento la intensidad del color de las bandas y calcula los valores porcentuales de cada área, así como los valores semiponderales. Las ventajas reales de la lectura fotodensitométrica La lectura fotodensitométrica combinada con el trazador cúbico tiene la ventaja de: 1) tener información rápida y fiable sobre la concentración de la albúmina, si no se tiene un dato inmunométrico. 2) obtener una vista rápida del cuadro proteínico general y relaciones entre proteínas. 3) determinar una hipogammaglobulinemia o hipergammaglobulinemia en un gran número de muestras con buena fiabilidad y bajo costo. 4) tener información relativa a las poblaciones inmunoglobulínicas del cuadro electroforético, a través del trazador cúbico. En el gráfico pueden observarse las IgG (marrones), las IgM (verde claro) y las IgA (verde oscuro).

automático de las áreas puede resultar insuficiente para señalar ciertas alteraciones. Puesto que, como se sabe, no basta con señalar el aumento de una fracción respecto a lo normal, también debe señalarse si el área observada posee características morfológicas diferentes, tal y como una base más o menos amplia, pendientes desiguales, tendencia leptocúrtica y posibles engrosamientos del color o tendencia a desdoblarse. Así pues, los valores numéricos de la lectura, ¡non son el resultado electroforético! A través de las lecturas semicuantitativas es posible establecer un marco de variaciones normales para cada fracción. Sin embargo, es necesario comprobar sí los hallazgos cuantitativos del gráfico patológico, correspondan a fracciones que mantienen su separación y morfología habitual. Lo que nos interesa es distinguir, con la mayor precisión posible, los cuadros “normales” de aquellos con tendencia, y de los francamente patológicos. Muchos especialistas afirman que un examen complementario, integrado por un análisis interpretativo y visual acompañado de uno relativo al densitograma, constituye una mayor certeza de tender a una definición más completa de todos los posibles cuadros. En conclusión, las diferencias entre la inspección visual y lectura densitométrica pueden resumirse en los siguientes puntos: 1) La inspección valora la migración electroforética a lo largo y a lo ancho. La densitométrica, los cambios de la intensidad del color a lo largo de una línea longitudinal de amplitud igual a la del haz de luz de barrido (de 2 a 4 mm). 2) La inspección es mayormente decisiva en la búsqueda y hallazgo de posibles subfracciones ocultas en el subfondo de las proteínas policlonales o por las proteínas especificas. En cambio la densitométrica, traduce las formas de las bandas y posibles subfracciones en alteraciones del perfil de la curva, por no olvidar las alteraciones de los perfiles de las curvas causadas por la baja resolución de las impresoras, del monitor, la velocidad de barrido y todas las afectaciones del ruido instrumental.

ID 200223

Electroforesis

272

5) Valorar proteínas en caso de que sospeche un aumento o una disminución, cuando estas, bajo observación, fueron bien calculadas en relación con el poder resolutivo gráfico: Ejemplo de la valoración con el trazador cúbico del aumento real de transferrina y C3, junto con la del componente monoclonal, en zona gamma deprimida:

Así, un error del laboratorio por un mero cambio interpretativo de las inflexiones que definen al componente M, puede perjudicar al paciente: El primer operador dictaminó que el componente M era del 4% el 1º de enero de 2010.

6) La determinación de los componentes monoclonales con el trazador cúbico: Ya hemos mencionado al lector sobre las funciones y ventajas de esta herramienta en el prólogo. Sólo añadimos que el trazador cúbico les facilita a todos los operadores, por igual, la determinación de la concentración del componente M, incluso aún cuando su geometría espacial, dentro de las policlonales, hace su identificación difícil de definir con los mínimos, sobre todo en el lado anódico de las gamma. Recordemos que la determinación exacta de la concentración de un componente monoclonal es esencial para las decisiones del médico que controla al paciente: ¿estabilidad o progresión del componente M?

ID 200223

Electroforesis

El segundo operador dictaminó que el CM era del 5.6% el 7 de enero de 2010; es decir, una diferencia del 40 % respecto al primero.

273

no sólo tiene su importancia, sino que también tiene una historia definida de probable progresión. Evolución clínica y pronóstico del mieloma múltiple latente o asintomático Robert A. Kyle, M.D., Ellen D. Remstein, M.D., Terry M. Therneau, Ph.D., Angela Dispenzieri, M.D., Paul J. Kurtin, M.D., Janice M. Hodnefield, M.S., Dirk R. Larson, M.S., Matthew F. Plevak, B.S., Diane F. Jelinek, Ph.D., Rafael Fonseca, M.D., Lee Joseph Melton, III, M.D., and S. Vincent Rajkumar, M.D. Revista de medicina de Nueva Inglaterra Volumen 356:2582-2590

14 % 25 % 41 % 49 % 64 %

El trabajo de R. Kyle demuestra que toda concentración del componente M

ID 200223

GMSI

Estudio sobre la probabilidad de progresión del mieloma asintomático o gammapatía de significado indeterminado a mieloma múltiple activo o a amiloidosis en 276 pacientes A menudo en los congresos o al leer publicaciones advertimos noticias respecto al poco valor que se atribuye a la determinación de un componente monoclonal, o bien, poco importa si es de 3 g/l o de 5 g/l, o si en el seguimiento no se discrimina entre estos dos valores. Sin embargo, también vemos que... Criterios diagnósticos de las gammapatías monoclonales de significado Incierto (GMSI) • Plasmocitos medulares < 10 %

Febrero 21, 2002 Número 8 Riesgo porcentual de progresión a mieloConcentración inicial del C.M. ma después de 20 años

Electroforesis

Mieloma múltiple asintomático

Años después del diagnóstico

Volumen 346:564-569

0.5 g/dl 1.5 g/dl 2.0 g/dl 2.5 g/dl 3.0 g/dl

Número 25

(%)

Probabilidad de progresión (%)

¿El paciente tiene un componente M estable o en progresión? Tengamos en cuenta que todos los componentes M tienen la misma “gravedad” y es importante identificar cada uno de ellos para garantizar un mejor seguimiento y calidad de vida del paciente. Pues todos los componentes M son potencialmente peligrosos para la salud del portador. Estudio a largo plazo sobre el pronóstico de las gammapatías monoclonales de significado incierto Robert A. Kyle, M.D., Terry M. Therneau, Ph.D., S. Vincent Rajkumar, M.D., Janice R. Offord, B.S., Dirk R. Larson, Revista de medicina de Nueva Inglaterra

Junio 21, 2007

274

• Componente monoclonal IgG < 3 g/dl • IgA < 2 g/dl y proteinuria de Bence Jones < 1 g/24h • No hay osteólisis, anemia, insuficiencia renal e hipercalcemia • El componente monoclonal permanece estable a lo largo del tiempo. • No hay evidencia clínica ni de laboratorio de amiloidosis y/o enfermedad por depósitos de cadenas ligeras. The Hematology Journal 2003 4,379-398; BMG Durie y col.

GMSI, salvo que la concentración sérica del componente M es de 3 g/dl, y la de los plasmocitos medulares, del 10%. El riesgo de progresión a mieloma múltiple asintomático o a amiloidosis primaria es alrededor del 10% anual durante los primeros 5 años después del diagnóstico, de casi el 3% anual durante los siguientes 5 años y del 1% anual durante los siguientes 10 años. Por tanto, la probabilidad total de progresión es del 73% durante 15 años. Los médicos pueden estimar con mayor precisión el riesgo de progresión de las GMSI a mieloma múltiple, basándose en tres factores clave: los casos con componentes M IgG, tienen menor probabilidad de progresión que aquellos con CM IgA o IgM, aquellos con una concentración del CM por debajo de 1.5 g/dl, tienen menos probabilidad que aquellos con niveles mayores, y sujetos con una concentración normal de cadenas ligeras libres, tienen menos probabilidades que aquellos con un cociente anormal (imagen 1A). Sin embargo, el riesgo real es menor cuando se incluyen factores de muerte concurrentes.

Progresión a mieloma múltiple: subclasificación de riesgos del GMSI o MML Las GMSI y las MML son asintomáticas. Ambas conllevan un potencial muy diferente de progresión a mieloma múltiple. Por definición, los pacientes con GMSI tienen una concentración sérica del componente M por debajo de los 3 g/dl y una concentración de plasmocitos medulares por debajo del 10%. No presentan hipercalcemia, anemia, lesiones osteolíticas o fallo múltiple de órganos. El riesgo general de progresión a mieloma múltiple u otros procesos proliferativos plasmocíticos tratables, es del 1% anual. Los hallazgos clínicos y de laboratorio del MML son los mismos que los de la

ID 200223

Electroforesis

275

Los médicos también pueden valorar la progresión a mieloma múltiple de pacientes diagnosticados con MML basándose en la asignación a un grupo de riesgo. Estos se clasifican según la proporción de mielohemocitoblastos y la concentración de proteínas monoclonales (imagen 1B). Además, con un rango más amplio de lo normal para cadenas ligeras libres, se puede refinar el pronóstico de progresión del MML.

insuficiencia renal, concentración anormal de cadenas ligeras libres, leucemia plasmocítica y enfermedad plasmablástica. Tabla 4 Sistema de estadiaje del mieloma múltiple Sistema

Estadio I

Durie-Salmon

Todo lo siguiente:

Estadio II Estadio III Entre el estadio I Uno o más de los siguieny II tes:

Hemoglobina > 10 g/dl Hemoglobina <8.5 g/dl Calcio sérico < 12 mg/dl Calcio sérico >12 mg/dl Estudio radiográfico del esqueleto normal o plasmocitoma solitario Cantidad muy baja de proteínas monoclonales IgG <5 g/dl IgA <3 g/dl Bence Jones < 4g/24h Internacional

ID 200223

Gran cantidad de proteínas M IgG >7 g/dl IgA >5 g/dl Bence Jones >12 g/24h

β2 microglobulina < 3.5 Entre el estadio I β2 microglobulina >5.5 y II mg/l y albúmina sérica > mg/l 3.5 g/dl

que es necesario clasificar al paciente y saber si el componente monoclonal es de 3 g/l o 5 de g/l. En conclusión: • Se deben identificar todos los componentes monoclonales. • Todos son importantes. • Incluso aquellos por debajo de un 1 g/l pueden tener un mal pronóstico para el paciente. • Debemos utilizar el método de referencia, es decir, gel de agarosa.

Estratificación pronostica del mieloma múltiple Hoy en día contamos con dos sistemas de estadiaje para estratificar el pronóstico del mieloma múltiple: el sistema Durie-Salmon (DSS) y el sistema internacional de estadiaje (ISS) (Cuadro 4). Ambos predicen la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global. Así mismo, otros factores que indican un riesgo mayor son LDH elevado, isotipo IgA, enfermedad extramedular,

Electroforesis

>3 de lesiones osteolíticas

276

• No debemos utilizar los métodos que dan falsos negativos respecto al método de referencia (gel de agarosa). • No debemos utilizar métodos con menor sensibilidad que la del método de referencia (gel de agarosa). En ciertas ocasiones, la práctica diagnostica sobrevive a sí misma, y en otras, con el tiempo, se aclaran sus posibilidades semióticas reales, pero sin que este conocimiento llegue a difundirse lo suficiente para minar las viejas costumbres. Vista tal consideración, la electroforesis “correcta”, o bien, todo lo comentado en el Atlas, debe encontrar un lugar digno dentro del conjunto de instrumentos semiológicos, por el amplio abanico de datos clínicos que aporta. Los autores esperan haber contribuido de forma positiva con la elaboración de este Atlas y les desean éxito a todos los profesionales del sector electroforético para minar los factores entrópicos coexistentes con la toma de decisiones en el laboratorio que perjudican a los auténticos beneficiarios de nuestro trabajo, los pacientes.

ID 200223

Electroforesis

277

APÉNDICE PRIMERO

“Esta guía establece las recomendaciones de un grupo de expertos para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con sospecha de una condición clínica que produce proteínas monoclonales en el suero u orina. Las recomendaciones describen las condiciones clínicas en las que debe buscarse una proteína monoclonal, la secuencia óptima de los estudios para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes, y los procedimientos de laboratorio más eficaces”. (Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106–107)

ID 200223

Electroforesis

279

las proteínas monoclonales y la secuencia óptima de los estudios clínicos y de laboratorio para el control de dichos pacientes. Las condiciones clínicas asociadas con la presencia de un componente monoclonal en el suero u orina pueden clasificarse como plasmacíticas, linfocíticas, proteínas infiltrativas o mixtas (véase la tabla 2). Tabla 2 Gammapatías monoclonales

1 Criterios diferenciales y directrices Para completar el panorama relativo a la detección y al control del componente M en pacientes con gammapatía monoclonal, presentamos las directrices del comité. La tabla 1 muestra un cuadro sinóptico para diferenciar el mieloma asintomático de la GMSI (gammapatía monoclonal de significado incierto). Imagen 1 Criterio diferencial entre mieloma asintomático y GMSI

Condición clínica

Desordenes plasmacelulares: Plasmocitoma solitario Mieloma múltiple Mieloma múltiple asintomático Síndrome POEMS Desordenes linfociticos: Macroglobulinemia de Waldenstrom Enfermedad de cadenas pesadas Enfermedades de proteínas infiltrativas y de depósitos: Amiloidosis (AL)

Los siguientes cuadros muestran las directrices y recomendaciones para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con riesgo de una posible situación clínica de producción de proteínas monoclonales en el suero u orina. Las recomendaciones establecen las condiciones clínicas en las que se detectan

ID 200223

Electroforesis

280

Semivida/año

Semivida normal de 3 años

5 años Datos incompletos

1 año

Depósitos de Ig Mezcla de desordenes: G.M. (MGUS) G.M. de trasplantes

Datos incompletos

diados con electroforesis de alta resolución o correcta, de suero y orina. La electroforesis debe interpretarse visualmente. La concentración de proteínas monoclonales debe determinarse por densitometría. Evítese el uso de métodos electroforéticos de baja resolución.

Duración de la vida normal

Las características clínicas que acompañan al mieloma múltiple se describen en la tabla 3.

Cuadro 5 Directriz no. 2

Tabla 3 Características clínicas comunes asociadas con el mieloma múltiple. Manifestaciones clínicas

Efectos recurrentes

Dolores óseos

Fracturas patológicas Anemia (normocítica normocrómica) Posible amiloide Hipercalcemia Daño renal Disminución de las Ig no involucradas Compresión de la medula ósea Hiperviscosidad (rara, excepto para proteínas monoclonales < 50 g/l) Trombocitopenia Tumores plasmacelulares Depósitos Amiloideos (AL) en órganos blanco

Fatiga Nauseas, confusión y poliuria Nauseas y fatiga Infecciones recurrentes Paraplejia Confusión y vista nublada Hemorragias Nódulos de la piel Manifestaciones clínicas de amiloidosis

Directriz no. 2 La inmunofijación es el método para tipificar las proteínas monoclonales. Cuando se sospeche la presencia de una patología plasmacelular, aunque la electroforesis "correcta" sea negativa, debe realizarse la inmunofijación. La inmunofijación no está indicada para gammapatías monoclonales verdaderas. En caso de asimetrías por un aumento de las gammaglobulinas policlonales, la inmunofijación puede ser útil tras una entrevista entre el intérprete del proteinograma y el médico. Evítese la electroforesis de inmunofijación. Cuadro 6 Directriz no. 3 Directriz no. 3 Contrólese la concentración de proteínas monoclonales mediante densitometría, excepto en casos de inadecuación densitométrica (pequeñísimos componentes monoclonales dispersos en policlonales o componentes monoclonales ocultos por proteínas específicas). La inmunofijación no deberá repetirse hasta que el componente monoclonal resulte constante, no cambie su movilidad electroforética, haya un pico extra, aumente su concentración por encima del 20%, o se confirme su completa remisión durante el tratamiento farmacológico.

Por último, en los siguientes cuadros se muestran las directrices. Cuadro 4 Directriz no. 1 Directriz no. 1 Todos los pacientes con una presunta patología plasmacelular deben ser estu-

ID 200223

Electroforesis

281

Cuadro 7 Directriz no. 4

- Si padece GMSI, será anual. Cuadro 10 Directriz no. 7

Directriz no. 4 La determinación nefelométrica de las inmunoglobulinas está indicada en todos los pacientes con discrasias plasmacelulares para definir el nivel de inmunoglobulinas no involucradas. No debe utilizarse la determinación nefelométrica de las inmunoglobulinas como el único medio para estudiar a los pacientes con proteínas M. Se desaprueba la técnica de inmunodifusión radial.

Directriz no. 7 El síndrome de hiperviscosidad requiere un recambio de plasma dependiendo de las manifestaciones clínicas. Determínese el valor de viscosidad y de electroforesis antes del recambio de plasma para relacionar el nivel de proteínas M con los síntomas del paciente. Dicha correlación puede utilizarse para prever como las proteínas M se aproximan al nivel asociado con la hiperviscosidad en repetidos recambios de plasma.

Cuadro 8 Directriz no. 5 Directriz no. 5 Todos los pacientes con mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, amiloidosis AL y desordenes relacionados, deben estudiarse para la presencia, tipo y excreción diaria de cadenas ligeras libres monoclonales. Debe recolectarse la orina de las 24 horas con un conservante. Ejecútese la tipificación, tras una concentración de hasta cien veces, y si existe un pico, determínese su concentración por densitometría. Se desaprueba del todo el uso de tiras reactivas para el examen general de orina, ácido sulfosalicílico o acidificación por calor de la orina.

Cuadro 11 Directriz no. 8 Directriz no. 8 La detección de crioglobulinas debe efectuarse para todos los pacientes con proteínas M y complicaciones específicas relacionadas con la sensibilidad al frío, sobre todo, en pacientes con proteínas M de clase M. Tómese una muestra de sangre de 10 ml y manténgala a 37°C durante su transporte. Separase el suero y consérvelo a 4°C durante 7 días. Si presenta un criogel cuantifíquelo, lávelo, y caracterícelo inmunológicamente.

Cuadro 9 Directriz no. 6

Cuadro 12 Directriz no. 9

Directriz no. 6 Si durante el seguimiento se detecta un aumento de las proteínas M en el suero u orina, debemos controlar al paciente mediante electroforesis de alta resolución con regularidad: - Si padece mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom o amiloidosis primaria, cada 1 o 2 meses.

ID 200223

Electroforesis

Directriz no. 9 Las técnicas actuales recomendadas para la estimación de las proteínas M son la electroforesis correcta en gel de agarosa o capilar y la inmunofijación para documentar los casos de enfermedad por cadenas pesadas. La inmunosustracción es una nueva técnica prometedora.

282

2 El seguimiento del paciente con síndrome de hiperviscosidad La tabla 13 muestra las directrices del CAP para el paciente asintomático. Cuadro 13 El seguimiento del paciente asintomático

4 El seguimiento en orina Los cuadros 15, 16 y 17 muestran el seguimiento en orina. Cuadro 15 Directriz no. 1 para el seguimiento en orina

Cuadro 16 Directriz no. 2 para el seguimiento en orina

3 El seguimiento del paciente con síndrome de hiperviscosidad El cuadro 14 muestra el control para el paciente con síndrome de hiperviscosidad. Cuadro 14 Seguimiento del paciente con hiperviscosidad

ID 200223

Electroforesis

283

cualquier concentración, ameritan un seguimiento exhaustivo, teniendo en cuenta el aspecto clínico y de laboratorio. Este enfoque debe mantenerse a lo largo del seguimiento, evitando confiar sólo en el componente M. Cuadro 17 Directriz no. 3 para el seguimiento en orina

Conclusiones del apéndice 1 Si un individuo con un componente M permanece asintomático y con un cuadro biohumoral constante durante cuatro años, su condición puede considerarse benigna ya que el riesgo de manifestar una condición maligna en los siguientes 20 o 30 años es muy bajo, probablemente de entre el 1% o el 3%. Teniendo en cuenta esto, es preciso limitarse a un seguimiento clínico preciso y a estudios de laboratorio simples, tales como: 1) la determinación de los componentes monoclonales del suero y/o orina. 2) hemograma completo 3) calcemia 4) creatininemia Conviene repetirlos cada año o con mayor regularidad si existen signos de progresión. Es importante puntualizar que todos los pacientes con componentes M, en

ID 200223

Electroforesis

284

APÉNDICE SEGUNDO

EL PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO DE ORINA Y LA CONCENTRACIÓN DE LOS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS EN LA PRACTICA DE LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA CLÍNICA. Arteriola eferente

Arteriola aferente

Túbulo distal

Túbulo contorneado proximal

LA NEFRONA: unidad funcional del riñón

Glomérulo

Espacio capsular Capa parietal de la cápsula glomerular (Bowman)

Cápsula de Bowman Arteriola aferente

Túbulo proximal

Glomérulo (lecho capilar) Arteriola aferente

Arteriola eferente

Túbulo contorneado proximal

Cápsula de Bowman

Conducto colector

Podocitos

Corteza renal Células yuxtamedulares

Médula renal Vaso recto

Pedicelo

Asa de Henle

Vasos rectos

Rama descendente de Henle

Conducto colector Endotelio glomerular

Arteriola eferente

Asa de Henle

a) Electroforesis de orina b) La concentración de los líquidos biológicos

ID 200223

Electroforesis

Túbulo contorneado distal

El sistema renal

El glomérulo

285

El túbulo

Rama ascendente de Hacia la vejiga y al Henle exterior

cretadas por el riñón y por las vías urinarias. La electroforesis de la orina que Tidstrom realizó en papel por primera vez en 1963, ha progresado de forma notable al empleo de nuevos sustratos proporcionados por la tecnología al laboratorista: del papel se pasó al gel de almidón, al agar, al acetato de celulosa, a la acrilamida, a la agarosa y, finalmente, al método capilar. La tabla 1 muestra la historia de las principales técnicas electroforéticas.

¿Concentrar o no concentrar?, y si es así, ¿cómo?, ¡he ahí la cuestión! INTRODUCCIÓN La importancia del estudio de la proteinuria se confirma por la enorme cantidad de literatura al respecto. Su asociación con nefropatías fue demostrada de manera clara por Richard Bright hace unos 150 años atrás. Pese a que en el pasado se estudió la función del riñón respecto a la conservación y el metabolismo de las proteínas del plasma, ha sido objeto de numerosos estudios en las dos últimas décadas. El interés por el estudio de las proteinurias se deriva de su frecuencia en la mayoría de las nefropatías, que va del desarrollo de métodos bioquímicos para el estudio cualitativo de las proteínas de la orina, a un conocimiento más preciso de los procesos fisiológicos de la filtración glomerular y reabsorción tubular de las proteínas en condiciones normales y patológicas. Consideramos útil recordar que la presencia de proteinuria no implica necesariamente la existencia de una nefropatía (pues los pacientes normales presentan una proteinuria “fisiológica”) y que los estudios electroforéticos son los adecuados para definir una proteinuria como patológica, puesto que detectan tanto proteínas del plasma en la orina que no atraviesan la barrera glomerular en condiciones normales, como proteínas por la inhibición total de la función de reabsorción del túbulo, plasmaproteínas anormales en la orina y proteínas se-

ID 200223

Electroforesis

Tabla 1 Principales técnicas ETF usadas en la clínica, para el análisis del proteinograma de los distintos líquidos biológicos Sustrato

Papel de filtro

Gel de agar

286

Investigador

Año

Konig Cremer y Tiselius Durrum Grassman Wunderly* Gordon Grabar y Williams Wieme

1937 1950 1950-1955 1950-1954 1954 1949 1953 1956-1959

Gel de almidón Acetato de celulosa

Smithies Kohn Raymond y Weintraub Davis y Ornstein

1955 1957 1959 1964

Gel de acrilamidaagarosa

Uriel

1966

Gel de agarosa

Laurell Johansson

1965 1972 2001

Gel de poliacrilamida

Capilar

Beta 2 microglobulina Inmunoglobulinas Proteína ligada al retinol Enzimas PROTEÍNAS DE ORIGEN RENAL aprox. 40 \ 30 % Uromucoide aprox. 50 mg \ 24 ore

En el paciente normal, la eliminación diaria de proteínas en la orina es de unos 150 mg. La tabla 2 muestra las principales proteínas comunes en la orina normal.

Uroquinasa IgA secretora Enzimas tubulares

Tabla 2 Proteinuria total 24 horas = 130 mg ( 80 \ 240 )

Las proteínas del plasma constituyen entre el 60% y el 70%, donde unos 15 mg de estas son atribuibles a la albúmina, en tanto que otras proteínas o polipéptidos se presentan en cantidades mínimas o en trazas; basta con decir que con técnicas ultrasensibles, como la electroforesis bidimensional, se ponen de relieve entre 500 y 600 puntos. La proteína endógena renal que predomina en la orina es el uromucoide o proteína de Tamm-Horsfall. Es una proteína de gran PM (7.000.000 D), pero con posibilidad de agregados que pueden alcanzar los 23.000.000 D o más. Es una proteína polimérica de un tenor glúcido elevado (30%), cuyos monómeros tienen un PM de 80,000 D, con P.I. de 3.5. Además, es la matriz esencial de los cilindros y parece ser secretada en la orina a nivel del ansa de Henle y del túbulo contorneado distal. Se desconoce su importancia biológica, pero se sospecha que tiene una función antibacteriana y antiviral. Las uroquinasas, por su capacidad de lisar la fibrina, podrían tener un papel en la eliminación de coágulos a nivel capilar o, según otros AA, actuar de manera enzimática sobre los cilindros.

PROTEÍNAS DE ORIGEN PLASMÁTICO aprox. 60 \ 70 % Albúmina aprox. 15 mg \ 24 hora ( 2.0 - 30.0 ) Ceruloplasmina Alfa 1 glicoproteína ácida Alfa 1 antitripsina Alfa 1 microproteína Hemopresina Transferrina Haptoglobina

ID 200223

Electroforesis

287

Las IgA detectadas en la orina, cuya cantidad es de casi 1 mg/24 h, son de tipo dimérico secretorio, igual a las de otras secreciones. El componente secretor es sintetizado por los túbulos y su función es de tipo anticorporal. La cantidad y la composición de proteínas en las orinas dependen del equilibrio entre el paso transglomerular y la reabsorción tubular. Si consideramos que el riñón recibe diariamente unos 25 kg de proteínas, de las cuales solo unos gramos atraviesan la barrera glomerular, para después ayudar en la reabsorción tubular de casi el 90%, se entiende la extrema eficiencia de la nefrona para controlar este aspecto de la homeostasis proteica. Para clasificar clínicamente las proteinurias, es necesario considerar los mecanismos fisiopatológicos que las determinan y que se desarrollan a nivel glomerular y tubular. Anatomía, función e hidrodinámica renal La anatomía

Cápsula fibrosa Sustancia cortical Papilas renales Sustancia medular Cáliz Pelvis renal

Uréter Orina

La función

RIÑÓN

Casi el 25% del total de sangre expulsada por el ventrículo izquierdo en cada ciclo cardiaco se distribuye a través de las arterias renales para su FILTRACIÓN.

Cada riñón contiene aproximadamente un millón de unidades microscópicas (nefronas) que forman la orina. Cada ARTERIOLA AFERENTE llega llega aa un ovillo de capilares (GLOMÉRULO) al redor del cual se observa el extremo ceob rrado (CÁPSULA DE BOWMAN) de un largo y sinuoso so TÚBULO RENAL que consta de varias partes CÁPSULA DE 1er TÚBULO TEJIDO FICONTORNEADO BROSO

En el corpúsculo renal la formación de orina comienza con la filtración de la sangre.

La sangre que llega al ovillo capilar fluye a través de una ARTERIOLA EFERENTE que se divide para formar una 2ared CAPILAR al rededor de los túbulos de la nefrona. Al final, estos capilares convergen SEGUNDO en una TÚBULO VENA CONTORNEADO

ARTERIA Y VENA RENAL

PELVIS

RAMA DESCENDENTE Y ASCENDENTE

CÁLIZ

ID 200223

Electroforesis

DEL ASA DE HENLE

URÉTER

ARTERIOLA AFERENTE (MÁS AMPLIA)

ARTERIOLA EFERENTE (MAS ESTRECHA)

Cada minuto unos 1200 ml de sangre entran al OVILLO GLOMÉRULAR de CAPIContiene 540 ml de CÉLULAS 660 ml de PLASMA LARES

1080 ml de concentrado de sangre sale cada minuto 660 ml de CÉLULAS 540 ml de CÉLULAS

La sangre está bajo una presión de unos 70 mm Hg (casi el doble respecto a otros capilares sistémicos).

Esta presión provoca la salida de agua y sales a través de la pared basal. A ella se oponen la TRACCIÓN PLASMAOSMÓTICA de las PROTEÍNAS que tiende a captar el agua y sa30mmHg les en los vasos y la les retropresión de la. CÁPSULA DE BOWMAN Lo antedicho resulta en una 5 mmHg FILTRACIÓN EFECTIVA, o 35 mmHg bien, en una FUERZA de EMUnos 120 ml PUJE de 70-(30+5) mmHg = son filtrados por 35 mmHg minuto. Plasma, sales, glucosa y otras moléculas pequeñas son filtradas. Las célululas y laslas plasmapoteíLas cifras representan el nas son muynas grandes para volumen de sangre que atravesar la membrana entra y sale de ambos riCAPILAR y CAPSULAR del ñones. TÚBULO RENAL.

En los túbulos la formación de orina se completa gracias a la ABSORCIÓN de sustancias esenciales procedente de la SECRECIÓN y SÍNTESIS de otras sustancias residuales que son liberadas al torrente sanguíneo.

TÚBULOS COLECTORES vacían la orina formada en la PELVIS RENAL

288

CORPÚSCULO RENAL

Entre 100 y 150 litros de FILTRADO diluido son formados diario de esta forma por los GLOMÉRULOS de ambos riñones. Este contiene glucosa, sales, urea, ácido úrico, potasio, fosfatos, sulfatos, etc., en una proporción similar a la del PLASMA SANGUÍNEO.

La función glomerular Los cuatro factores principales que determinan el filtrado glomerular de las proteínas: 1) La permeabilidad selectiva: peso molecular y forma 2) La presencia de estructuras aniónicas con una función electrostática de repulsión 3) La concentración plasmática 4) Las condiciones hemodinámicas locales Número de Reynolds = d • v • ρ / η

LA ARTERIA RENAL SE DIVIDE EN: ARTERIAS INTERLOBULARES Estás se dividen en: ARTERIAS ARCIFORMES Dan origen a las: ARTERIAS RECTAS De las que se derivan las ARTERIOLAS AFERENTES

Cada Arteriola Aferente se divide en unos 50 capilares

Unos 120 ml/min son filtrados

La hidrodinámica fisiológica La nefrona se compone de dos partes: el glomérulo y el túbulo.

El agua y las sales tienden a salir. Sin embargo, la retropresión de las proteínas y de la cápsula (35 mm Hg) se opone.

1200 ml/min 540 ml de células 660 ml de plasma 70 mmHg

Glomérulo

1080 ml/min 540 ml de células 540 ml de plasma

Túbulo

La función tubular Los mecanismos de reabsorción: En la práctica, todas las proteínas de un peso molecular por debajo de los 40,00 D no encuentran dificultades para ser filtradas a nivel glomerular, para luego ser reabsorbidas más del 90% en el túbulo proximal.

ID 200223

Electroforesis

289

El objetivo del estudio del proteinograma electroforético de la orina 1) Búsqueda de componentes monoclonales 2) Valoraciones semicuantitativas de las distintas zonas para clasificar el daño renal y, por tanto, la proteinuria, para luego pasar al análisis de nivel II. La fase preanalítica: el contenedor y su importancia Plan experimental Recolección de 15 orinas (azida de sodio 0.1 %) con proteinuria micromolecular. Determinación k y λ por vía nefelométrica. Valores entre los 23 mg/l y los 765 mg/l. Orinas mezcladas y divididas en dos partes iguales. Una en vidrio y la otra en plástico no para alimentos. Tiempo de conservación, 24 horas. Los resultados

Mecanismos tubulares de reabsorción de péptidos y proteínas

Lumen tubular Proteínas Borde en cepillo Absorción

Célula tubular proximal

vesícula apical vacuola

lisosoma primario heterolisosoma

Peptidasas Aminoácidos

Péptidos

eliminación

Transportador

telolisosoma

metabolismo

Membrana basolateral Productos del desdoblamiento

Mientras que los péptidos son desdoblados a aminoácidos por las enzimas del ribete en cepillo, para su posterior absorción por transportadores Na+ dependientes, las proteínas son absorbidas en el lumen vesicular y desdobladas en los heterolisosomas al fusionarse con los lisosomas primarios. Luego, los productos del desdoblamiento son devueltos al organismo a través de la membrana basolateral y los residuos indigeribles son secretados en el lumen por exocitosis, con secreción simultánea de enzimas lisosomales. El metabolismo y catabolismo del túbulo: Túbulo Glucosa

Glucosa

NaCl

Aminoácidos

Vitamina C

Túbulo

ID 200223

Capil. Peritub.

Urea, fosfatasas Urea, fosfatasas Urea, fosfatasas

Urea, fosfatasas

Úrico, Úrico Úrico

Úrico

Electroforesis

Túbulo K K K K

Túbulo

IF BJ positivas

IF BJ negativas

Vidrio

Plástico

Evaluación Nefelométrica Orina con- Evaluación Nefelométrica Orina conservada en plástico mg/L servada en vidrio m g/l

Capil. Peritub.

K K K

Orina neg. 1

Casi 5

Orina neg. 2

Casi 2

La fase preanalítica: la recolección de la orina Para la detección y clasificación de la proteinuria, debe recolectarse la segunda micción de la mañana (G.P. Merlini) Para confirmar lo anterior, se realizó un estudio en portadores de proteinuria plasmática por sobre flujo de BJ para determinar la excreción máxima de cadenas ligeras libres monoclonales en orinas recolectadas con tiempo:

Capil. Peritub.

Creatinina Sulfatos

290

Aspectos clínicos Desde un punto de vista semiológico, la proteinuria puede ser: • Transitoria • Intermitente • Persistente Proteinuria Transitoria Es el hallazgo ocasional de una proteinuria con valores patológicos, generalmente moderada, que no se repite en controles posteriores y es de tipo benigno. La proteinuria funcional es la que acompaña, cualquiera que sea el estado patológico renal, a diferentes condiciones clínicas caracterizadas por fiebre, en relación con el ejercicio físico intenso y prolongado, condiciones de estrés físico y emocional, por ejemplo, las intervenciones quirúrgicas o la exposición al frío. Esta proteinuria es transitoria y se resuelve con la recuperación de la condición física, cuya alteración fue la causa. Proteinurias Intermitentes Se caracterizan, como lo indica su definición, por la aparición episódica de proteínas patológicas, con intervalos en que la proteinuria entra en el rango del valor fisiológico. Estas proteinurias pueden tener un curso del todo casual e irregular, o tener una periodicidad regular como en la proteinuria ortoestática, que, junto a muestras matutinas con valores normales tras un periodo de reposo en clinostatismo, presenta valores patológicos en las muestras vespertinas después de la actividad ortoestática habitual. Las proteinurias intermitentes son de tipo glomerular y, aunque en cantidad son discretas, merecen atención, pues indican un posible padecimiento renal incipiente. Ante la frecuente magnitud moderada de estas proteinurias, cabe mencionar y señalar la necesidad de una buena calidad analítica de los métodos de cálculo, tanto para la fase de detección, como para la de determinación y, sobre todo, en cuanto a la sensibilidad analítica y la limitación de la imprecisión,

Intervalos de relación: horas

Ciapini, M. Tani, B. Milanesi El Patólogo Clínico 3/2006

Para la búsqueda, clasificación y valoración de la masa proteínica excretada, coléctese la orina de las 24 horas con de azida de sodio al 0.1 %: Resultado a largo plazo de las GMSI: R. A. Kyle and S. V. Rajkumar British Journal of Haematology, 134, 573589 2006 “Para cuantificar las proteínas monoclonales, debe recolectarse una muestra de orina de 24 horas. Esto nos da una medición de la masa tumoral del paciente y además es útil para el seguimiento evolutivo de la enfermedad”.

120 ml FG/min

Sangre efluente por los glomérulos 1080 ml/min

Sangre efluente por los riñones 1199 ml/min

Los túbulos proximales y dislates reabsorben 119 ml/min

Los materiales desechados son eliminados con la orina en los conductos excretores: 1 ml/min

ID 200223

Electroforesis

291

para evitar falsos positivos atribuibles a una variabilidad analítica excesiva. El descubrimiento de una proteinuria intermitente obliga al médico a profundizar sus investigaciones para aclarar la sospecha de una posible lesión renal que, como mencionamos, puede ser la causa. La incidencia de la proteinuria intermitente es propia de la niñez y la adolescencia, donde es esencial descartar una posible infección estreptocócica silente. Proteinurias persistentes Las proteinurias persistentes pueden distinguirse en formas prerrenales, renales y postrenales. Las prerrenales son las proteinurias por “sobre flujo” y no son el reflejo de una enfermedad renal, sino proteínas filtradas fisiológicamente por el glomérulo, que, presentes en una concentración plasmática elevada atribuible a diversas patológicas, exceden el umbral normal de reabsorción tubular. La proteinuria de Bence Jones es una expresión paradigmática de este tipo de proteinuria. Las renales ya se han descrito en la clasificación etiopatogénica (glomerulares, tubulares y mixtas). Las postrenales se deben a lesiones, que, a menudo, suelen relacionarse con un proceso inflamatorio del tejido de las vías renales, como por ejemplo, de la pelvis renal, del uréter, de la vejiga, de la próstata y de los órganos genitales. En ocasiones su composición permite identificarlas gracias a la presencia de proteínas específicas, tales como las enzimas o las proteínas de Tamm-Horsfall. Métodos de estudio de las proteinurias Los métodos de estudio de las proteinurias se dividen en métodos cuantitativos (cuadro 3) y cualitativos (cuadro 4).

En acetato de celulosa Determinación de las proteínas específicas

En gel de agarosa

Albúmina

En gel poliacrilamida

Transferrina

En gel de poliacrilamida SDS (SDS PAGE)

Inmunoglobulinas IgG

En agarosa SDS Hydragel Proteinuria

Beta 2 microglobulina

Electroforesis bidimensional

Alfa 1 microglobulina

Capilar

Proteína ligada al retinol

Cromatografía: En columna de Sephadex

Determinación del CLEARANCE proteínico

HPLC

Enzimuria:

Inmunofijación

Cuadro 3: CUANTITATIVOS

Cuadro 4: CUALITATIVOS

Alanina aminopeptidasa ( AAP )

Determinación de la proteinuria total

Electroforesis:

N Acetil glucosaminidasa ( NAG )

ID 200223

Electroforesis

292

Pero, si la técnica combina electroforesis de gran poder resolutivo, aumento de la masa molecular y una tinción sensible, es posible superar el problema de la detección de las microproteínas, que, además de presentarse en cantidades bajas, migran por debajo de aquellas con un peso molecular mayor, sobre todo en las proteinurias mixtas. En tales situaciones metodológicas, se pueden conseguir cuadros de proteinurias como los de la imagen 1:

Aspectos técnicos Métodos para determinar la proteinuria total. Las técnicas más fidedignas son las de Bradford, SDS-PAGE y Pirogalol. Por otro lado, las tiras reveladoras para la orina permiten seguir, de un modo deficiente, el desarrollo de la perdida de albúmina y dan resultados insatisfactorios en el seguimiento de las otras proteínas. Además, están estrechamente relacionadas con la interpretación del operador. En cuanto a la búsqueda de cadenas ligeras libres y de microproteínas, tanto las técnicas nefelométricas, como las mencionadas, ponen en evidencia sus limitaciones ante pesos moleculares bajos, concentraciones bajas de los niveles normales (microproteínas), y por la dificultad de correlacionar los resultados de los calibradores sobre las proteínas detectadas. Clasificación del tipo de proteinuria: Métodos Cualitativos La técnica más fidedigna es la electroforesis. Sin embargo, el parámetro limitante de esta técnica es el grado de sensibilidad que debe alcanzar. Existen dos soluciones al problema: Aumentar la masa molecular proteica mediante: 1) Concentración 2) Múltiples deposiciones con reducción de la resolución. 3) Técnicas inmunofijativas Aumentar la sensibilidad del marcador de detección mediante: 1) Colorantes de gran sensibilidad 2) Sistemas inmunoenzimáticos El nivel de sensibilidad que se alcanza con estos sistemas oscila entre 1 mg/l y 15 mg\l. La técnica recomendada es la electroforesis de gran poder resolutivo, ya sea en poliacrilamida con gradiente de concentración o en agarosa con un tratamiento previo de la muestra con SDS.

ID 200223

Electroforesis

Imagen 1 Prealbúmina Albúmina

Alfa 1 antitripsina Alfa 2 macroglobulina PFR Transferrina Beta 2 macroglobulina K o L libre Ig policlonales Cistatina C Lisozima

293

Patologías tubulares Beta 2 microglobulina Lisozima PFR Monómero de cadenas ligeras libres Alfa 1 microglobulina Dímero de cadenas ligeras libres Albúmina: patologías glomerulares Transferrina IgG IgA

El uso de gel de agarosa y SDS-PAGE, donde la separación se decide sólo por el peso molecular de la proteína, permite una interpretación fácil y lógica (véanse las figs. 2, 3 y 4).

Fenotipos de haptoglobina IgG y alfa 2 macroglobulinas Punto de deposición

Imagen 2

Imagen 3 Proteínas tubulares

Beta 2 micro

Lisozima PFR Monómeros K/λ Dímeros K/λ

Alfa 1 micro Albúmina

ID 200223

Electroforesis

294

Partiendo del origen probable de las proteínas urinarias, se han propuesto distintas clasificaciones, entre las cuales presentamos la de Boylan (cuadro 5).

Imagen 4 Proteínas glomerulares

Cuadro 5 1) Proteinurias de origen plasmático a) Renales glomerulares b) Renales tubulares c)Prerrenales

Albúmina Transferrina

2) Proteinurias de origen tisular a) Nefrogenéticas

IgG

3) Proteinurias postrenales

IgA

Hpt fenotipos

Una primera distinción se basa en el origen de las proteínas detectadas en la orina y comprende tres grandes categorías:

Alfa 2 macro

IgM NORMAL

El único inconveniente en el uso de este método de separación, radica en su incapacidad para distinguir entre proteínas monoclonales y policlonales, debido a que las proteínas de la misma especie tienen el mismo peso molecular y, por tanto, migran en una banda homogénea. La sensibilidad de este método alcanza por lo regular 5 mg/l.

LESIÓN GLOMERULAR

CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA mg/l CUOTA DE FILTRADO mg/24h (F.G. = 180 l/24h)

Clasificación patogenética de las proteinurias

REABSORCIÓN

La complejidad de los mecanismos que subyacen tras el determinismo de la proteinuria, se refleja en la complejidad del diagnóstico interpretativo de los cuadros proteinúricos observados en la práctica clínica.

ELIMINACIÓN DIARIA mg Con fines ilustrativos se consideraron dos especies proteínicas: albúmina (sectores a rayas) y la beta 2 microglobulina (sectores en blanco).

Imagen 5

ID 200223

Electroforesis

LESIÓN TUBULAR

295

Sin embargo, proponemos una clasificación patogénica más detallada de las proteinurias:

branosa

Cuadro 6 e imágenes 6 y 7:

Imagen 6

CLASIFICACIÓN PATOGENÉTICA DE LAS PROTEINURIAS 1) PROTEINURIA PLASMÁTICA a) Renales Glomerulares

Proteinuria glomerular selectiva

Proteinuria glomerular no selectiva

CAUSA

Alteraciones de la carga de la membrana basal por perdida de cargas negativas

Alteraciones de la estructura de la barrera glomerular por aumento y\o ensanchamiento de los poros

CLASES PROTEICAS

Albúmina Transferrina

Albúmina Transferrina Inmunoglobulinas

TIPO

PESOS MOLECULARES

68.000 \ 77.000 D

68.000 \ 500.000 D

EJEMPLOS DE PATOLOGÍAS CORRELATOS

Cambios mínimos en la nefropatía Esclerosis glomerular focal Glomerulonefritis mem-

Glomerulonefritis proliferativa Diabetes avanzada Amiloidosis

ID 200223

Electroforesis

Lisozima 15 KD PFR 21 KD Monómeros k/l 25 KD Dímeros k/l 50 KD

Tf 80 KD IgG 155 KD Fenotipos Hpt 200/400 KD

Beta 2 micro 12 KD

Alfa 1 micro 33 KD

Albúmina 70 KD IgA 165 KD Alfa 2 macro 850 KD IgM 950 KD

Muestra 7: proteinuria fisiológica con albúmina y transferrina.

296

Muestra 6: proteinuria glomerular selectiva con albúmina y transferrina elevada.

Muestra 5: proteinuria glomerular no selectiva por presencia de albúmina y gamma.

Imagen 7

Cuadro 7 e imágenes 8 y 9: CLASIFICACIÓN PATOGENÉTICA DE LAS PROTEINURIAS 1) PROTEINURIAS PLASMÁTICAS b) Renales Tubulares

Lisozima 15 KD

TIPO

Proteinurias tubulares completas

Proteinurias tubulares incompletas

CAUSA

Defecto de reabsorción de proteínas con bajo peso molecular, normalmente filtradas

Defecto de reabsorción de las proteínas con bajo peso molecular, normalmente filtradas

CLASES PROTEICAS

Hormonas Enzimas Microglobulinas Péptidos Otras

PESOS MOLECULARES

15.000 \ 70.000 D

40.000 \ 70.000 D

EJEMPLOS DE PATOLOGÍAS CORRELACIONADAS

Nefritis intersticial Nefrotoxicidad por metales pesados

Glomeruloesclerosis diabética Glomeruloesclerosis

Beta 2 micro 12 KD

PFR 21 KD Monómeros k/l 25 KD Dímeros k/l 50 KD

Alfa 1 micro 33 KD

Tf 80 KD

Albúmina 70 KD

IgG 155 KD

IgA 165 KD

Fenotipos Hpt 200/400 KD

Alfa 2 macro 850 KD

IgM 950 KD Muestra 6: Proteinuria fisiológica por una presencia moderada de la albúmina.

ID 200223

Electroforesis

297

Nefrotoxicidad por fármacos Rechazo de riñón trasplantado

Muestra 12: Proteinuria tubular incompleta y glomerular no selectiva, por presencia de alfa 1 microglobulina y PFR.

hipertensiva

Imagen 9

Imagen 8

Lisozima 15 KD

Beta 2 micro 12 KD

PFR 21

KD Monómeros k/l 25 KD Dímeros k/l 50 KD Lisozima 15 KD

Tf 80 KD

Beta 2 micro 12 KD

IgG 155 KD

PFR 21 KD Monómeros k/l 25 KD

Dímeros k/l 50 KD Tf 80 KD IgG 155 KD

Fenotipos Hpt 200/400 KD

Alfa 1 micro 33 KD

Albúmina 70 KD

IgA 165 KD Alfa 2 macro 850 KD

Muestra 7: proteinuria tubular completa y glomerular selectiva, por presencia de alfa 1 microglobulina, RBP, beta 2 microglobulina y dos bandas en zona gamma (BJ confirmada mediante IFE).

IgA 165 KD Alfa 2 macro 850 KD IgM 950 KD

ID 200223

Albúmina 70 KD

IgM 950 KD

Fenotipos Hpt 200/400 KD

Electroforesis

Alfa 1 micro 33 KD

298

Cuadro 8 e imagen 10

monocítica Leucemia monoblástica

CLASIFICACIÓN PATOGENÉTICA DE LAS PROTEINURIAS 1) PROTEINURIAS PLASMÁTICAS

Imagen 10

c) Prerrenales por sobre flujo

TIPO

Por sobre flujo

CAUSA

Por destrucción tisular

Por sobreproducción

Por secreción

CLASES PROTEICAS

Mioglobina Hemoglobina Lisozima

Cadenas ligeras y fragmentos Lisozima

Amilasa Proteínas con bajo P.M. ”histuria”

PESOS MOLECULARES

Respetivamente 17.000 D 16.800 D monómero 14.500 D

Respetivamente 22.000 D monómero 44.000 D dímero 14.500 D

Respectivamente 50.000 D ?

EJEMPLOS DE PATOLOGÍAS CORRELACIONADAS

ID 200223

Electroforesis

Respectivamente Rabdomiólisis Síndrome de Crash Infarto del miocardio Enfermedad hemolítica autoinm. Leucemia mielo-

Respectivamente Mieloma Linfomas Enfermedad de Waldenstrom Leucemia mielomonocítica Leucemia monoblástica

Lisozima 15 KD

Beta 2 micro 12 KD

PFR 21 KD

Monómeros k/l 25 KD Dímeros k/l 50

Tf 80 KDKD

IgG 155 KD

Respectivamente Pancreatitis ?

Alfa 1 micro 33 KD

Albúmina 70 KD IgA 165 KD

Fenotipos Hpt 200/400 KD Alfa 2 macro 850 KD IgM 950 KD

Muestra 1: proteinuria prerrenal por sobre flujo, confirmada como positiva para Bence Jones por IFE (fig. 11).

299

Imagen 11

CADENAS K LIBRES POLICLONALES

CADENAS L LIBRES POLICLONALES

45 mg/24h (3.8/211)

35 mg/24h (12/59)

RELACIÓN K/L = 1.3 (0.25/3.4)

La Comisión de estudio sobre proteínas de Bence Jones, de la Sociedad Italiana de Bioquímica Clínica, estableció que los métodos electroforéticos requieren una sensibilidad de unos 10 mg/dl para detectar esta proteína. En la imagen 12 se puede apreciar la sensibilidad expresada por el sistema Interlab:

Recordemos que el hallazgo de cadenas libres policlonales es común en la orina de pacientes “normales”. El promedio de secreción diaria es el siguiente: CADENAS K LIBRES POLICLONALES

CADENAS L LIBRES POLICLONALES

3.1 mg/24h (1.9/7.1)

1.5 mg/24h (0.7/3.4)

RELACIÓN K/L = 2.4 (1.2/3.7)

En pacientes no mielomatosos con proteinuria, supera los 250 mg/24 h.

ID 200223

Electroforesis

La muestra numero 6 (BJ positiva) se diluyó para determinar la sensibilidad del equipo de proteínas de alta resolución. En la imagen 13 se puede observar la sensibilidad obtenida experimentalmente:

300

Imagen 13

8 9 10 11

L Libre K Libre IgGK Negativa

11 756 20

12 13 14 15

L Libre L Libre K Libre L Libre

60 35 23 350

En la imagen 14 figuran los resultados electroforéticos de las primeras trece muestras:

Como control de dicha prueba experimental, quisimos la confirmación mediante un suero control “N PROTEÍNA ESTÁNDAR SY” de Behring. En relación con la normalización IFCC, los valores del preparado son en g/l. La referencia de esta norma internacional es el preparado CRM 470BCR/CAP/IFCC lote 91/06 19 para 14 proteínas séricas. Los valores de la determinación de las 15 muestras de orina se exponen en el cuadro 9: Cuadro 9

ID 200223

Número

Tipificación

Determinación

1 2 3 4 5 6 7

IgGL + L Libre IgGK + K libere IgGK + K Libre L Libre K Libre K Libre IgGL + L Libre

100 160 160 60 10 36 75

Electroforesis

La inspección de las electroforesis revela: 1) La presencia de cadenas libres k en la muestra 5 (10 mg/l). 2) La presencia de cadenas libres λ en la muestra 8 (11 mg/l). Es decir, los niveles requeridos por la SIBioC.

301

Para implementar tal sensibilidad se deberán concentrar las orinas (véase el capítulo dedicado a la concentración). Entre las proteínas tisulares, pueden clasificarse las nefrogénicas. Estas comprenden las proteínas de secreción local (uromucoide, IgA secretora) y las proteínas derivadas de la descamación o destrucción del tejido renal (enzimas celulares tubulares, antígenos renales, etc.). Véase la tabla 10.

Ejemplo de proteinuria nefrogenética:

Cuadro 10 CLASIFICACIÓN PATOGENÉTICA DE LAS PROTEINURIAS 1) PROTEINURIA DE DERIVACIÓN TISULAR a) Nefrogenéticas

TIPO

Proteinurias nefrogenéticas

CAUSA

Secreción local

Descamación o destrucción del tejido renal

CLASES PROTEICAS

Uromucoide o proteína Tamm Horsfall IgA secretora

PESOS MOLECULARES

EJEMPLOS DE PATOLOGÍAS CORRELACIONADAS

Enzimas de las células tubulares Antígenos renales

Respectivamente

80.000 \ > 7 x 106 D 320.000 D

90.000 D ?

Situación fisiológica

Respectivamente Tubulopatías agudas Tubulopatías crónicas Rechazo de trasplante ?

La muestra no. 11, lo mismo para la no.3 (no concentrada), presenta proteinuria nefrogenética con uromucoide (banda gruesa y difusa; la muestra se concentró 5 veces). Otra categoría, representada por las proteinurias postrenales, comprende proteínas asociadas con el sangrado de las vías urinarias (pelvis renal, uréteres, vejiga), inmunoglobulinas producidas localmente en procesos inflamatorios de las vías urinarias y proteínas de origen linfático (quiluria) por una obstrucción neoplásica de los grandes vasos linfáticos (cuadro 11). Cuadro 11 CLASIFICACIÓN PATOGENÉTICA DE LAS PROTEINURIAS TIPO

CAUSA

ID 200223

Electroforesis

302

1) PROTEINURIAS POSTRENALES Proteinurias postrenales

Sangrado local

Secreciones loca-

Quiluria

CLASES PROTEICAS PESOS MOLECULARES EJEMPLOS DE PATOLOGÍAS CORRELACIONADAS

les de inmunoglobulinas Inmunoglobulinas

Proteínas plasmáticas 60.000 \ 500.000 D Cálculos Inflamaciones Neoplasias

IgM Cadena ligera Kappa Cadena ligera Lambda Lisozima Tamm Horsfall Alfa 1 glicoproteína ácida Proteína C reactiva IgD IgE Fibrinógeno Cistatina C

Lipoproteínas

> 150.000 D

Inflamaciones

Obstrucciones por neoplasias

La siguiente tabla muestra las abreviaturas de las proteínas y sus pesos moleculares:

Abreviación

Pesos moleculares en daltonios

Prealbúmina Albúmina Alfa 1 antitripsina Alfa 1 microglobulina Alfa 2 macroglobulina Componente grupo específico Haptoglobina Proteína fijadora del retinol Transferrina Complemento 3 Beta 2 microglobulina IgA IgG

pre Alb ALB α 1 AT α 1M α 2 MG Gc

54960 66500 54000 31000 725000 51000

Hp RBP

86000 21000

Tf C3 β 2M IgA IgG

79500 185000 12000 160000 150000

ID 200223

Electroforesis

970000 23000 ( monómero ) 23000 ( monómero ) 14000 80000 ( monómeros ) 41000

PCR IgD IgE Fibrinógeno Cistatina C

105000 - 115000 175000 190000 340000 11500

Estrategia para el estudio de las proteinurias Los métodos disponibles en la actualidad nos permiten aplicar estrategias de estudio para la identificación de la situación de la excreción de proteínas en la orina, a fin de la clasificación fisiopatológica de los pacientes. Dicha estrategia se resume en los siguientes cuadros de estudio: 1) DETERMINACIÓN DE LA PROTEINURIA • Métodos recomendados: rojo de pirogalol o azul de Coomassie (SDS) 2) SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS URINARIAS • Separación por carga eléctrica neta • Separación por pesos moleculares 3) CLASIFICACIÓN DE LA PROTEINURIA Y BÚSQUEDA DE LAS CADENAS LIGERAS LIBRES • Proteinuria por pesos moleculares. • HR por inspección. 4) PROTEINURIA CON UNA CONCENTRACIÓN MENOR A LOS 120 mg/24 h • Análisis cualitativo de las proteínas excretadas para la definición de: a) PROTEINURIA PLASMÁTICA

Cuadro 12 Nombre de la Proteína

IgM K L Lisozima T.H. GPA

303

b) PROTEINURIA TISULAR c) PROTEINURIA POSTRENAL d) PROTEINURIA CON CADENAS LIGERAS LIBRES 5) DEFINICIÓN DE LOS CASOS a) PROTEINURIA PLASMÁTICA b) PROTEINURIA TISULAR c) PROTEINURIA POSTRENAL 6) DEFINICIÓN DE LA PROTEINURIA CON PRESENCIA DE CADENAS LIGERAS LIBRES • IFE Bence Jones • IFE suero. • Para la tipificación de proteinurias de Bence Jones (GAM, KT, LT, KF, LF). • Para la tipificación de los componentes monoclonales completos (G A, M, KT, LT). 4) PROTEINURIA CON DETERMINACIÓN < 120 mg/ 24 h • Análisis cualitativo de las proteínas excretadas para la definición de: • Ausencia de proteínas patológicas y componentes homogéneos. 5) DEFINICIÓN DE LOS CASOS • PROTEINURIA FISIOLÓGICA 6) DEFINICIÓN DEL ESTADO URINARIO EN CASO DE UNA GAMMAPATÍA MONOCLONAL EN EL SUERO • Proteinuria por pesos moleculares. • HR por inspección. 7) PRESENCIA DE CADENAS LIGERAS LIBRES • IFE Bence Jones • IFE suero. • Para la tipificación de proteinurias de Bence Jones (GAM, KT, LT, KF, LF). • Para la tipificación de los componentes monoclonales completos (G A, M, KT, LT). 8) AUSENCIA DE CADENAS LIGERAS LIBRES

ID 200223

Electroforesis

• Proteinuria por pesos moleculares. • HR por inspección. 9) DEFINICIÓN DE LAS PROTEINURIAS CON PRESENCIA DE CADENAS LIGERAS LIBRES • IFE Bence Jones. • IFE suero. • Para la tipificación de proteinurias de Bence Jones (GAM, KT, LT, KF, LF). • Para la tipificación de los componentes monoclonales completos (G A, M, KT, LT). El método SDS en gel de agarosa junto con los equipos de alta resolución, son una herramienta de diagnóstico útil en los siguientes casos: 1) Proteinurias cuantitativamente dentro del marco fisiológico: debido a su sensibilidad elevada, puede detectar alteraciones cualitativas en la fase inicial de desarrollo. 2) En el seguimiento de pacientes nefropáticos ya clasificados clínicamente, para controlar su desarrollo, sin recurrir a biopsias repetidas. 3) En el estudio de poblaciones con riesgo de desarrollar nefropatías: a) pacientes expuestos a sustancias tóxicas (metales pesados: cadmio, plomo, etc.); b) pacientes sometidos a terapias nefrotóxicas (aminoglucósidos, citostáticos, analgésicos, litio o medios de contraste); c) en preeclampsia diagnosticada; d) al inicio de la diabetes 4) Siempre que la biopsia represente un riesgo en pacientes con una presunta nefropatía. 5) En casos de proteinuria esporádica (proteinuria ortoestática). 6) En la detección de componentes monoclonales completos o de cadenas ligeras libres. 7) Para el control de la perdida diaria de proteínas plasmáticas durante la diálisis peritoneal manual o automatizada.

304

El uso de tiras reactivas y la concentración de las orinas En las siguientes páginas hemos clasificado las proteinurias. Ahora queremos introducir el concepto de eficacia diagnóstica deseada, para que los conceptos anteriores sean validos desde el punto de vista operativo. Para desarrollar este tema partiremos de la utilización de tiras reactivas para el análisis de la orina. Pregunta: ¿Las tiras reactivas pueden cumplir el cometido del tamizado urinario? Veamos: La eficacia diagnóstica. Proteinuria Total

Insuficiente

Búsqueda de CM

Imposible

Tipo de proteinuria

Imposible

La inspección visual de la migración de las cinco muestras a la izquierda arrojó el siguiente resultado (cuadro 13):

Puesto que se basa sólo en parámetros físicos y químicos, arroja resultados semicuantitativos poco confiables, excepto los relativos a las lecucociturias y hematurias. Veamos algunos ejemplos sobre el tema: Se seleccionaron cinco muestras de orina con signos de proteinuria inferior a los 50 mg/l, revelada mediante tiras reactivas, y otras cinco con proteinuria inferior a los 100 mg/l, es decir, orinas “normales”. Las diez muestras se procesaron por electroforesis y los resultados despertaron asombro por la baja eficacia diagnóstica de las tiras. En la imagen 15 podemos observar la electroforesis de las diez muestras de orina: Imagen 15 (a la izquierda, muestras con proteinuria inferior a los 50 mg/l; a la derecha, muestras con proteinuria inferior a los 100 mg/l).)

ID 200223

Electroforesis

Cuadro 13 Muestra n°1

Proteinuria tubular indefinible

Muestra n°2

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 3

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 4

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 5

Proteinuria glomerular no selectiva y tubular incompleta

La inspección visual de las cinco muestras a la derecha arrojó el siguiente resultado (cuadro 14):

305

Cuadro 14

Cuadro 15

Muestra n°1

Proteinuria glomerular no selectiva

Muestra n°1

Presencia de dímero /

Muestra n°2

Proteinuria mixta

Muestra n°2

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 3

Proteinuria tubular incompleta y presencia de banda homogénea (¿BJ?)

Muestra n° 3

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 4

Proteinuria fisiológica

Muestra n°4

Proteinuria fisiológica

Muestra n° 5

Presencia de dímeros o monómeros / y de IgG

Muestra n° 5

Proteinuria fisiológica

Imagen 17 Muestras de orina con proteinuria inferior a 100 mg/l.

El primer hecho fundamental deducible yace en que el valor de proteínas totales no basta para definir un cuadro urinario, porque a menudo es más importante “definir la situación” y “no la cantidad”. Del estudio posterior con SDS se desprenden los siguientes resultados (imágenes 16 y 17): Imagen 16 Muestras de orina con proteinuria inferior a 50 mg/l

La inspección visual del gel arrojó el siguiente hallazgo (cuadro 16): Cuadro 16

La inspección del gel arrojó el siguiente hallazgo (cuadro 15):

ID 200223

Electroforesis

306

Muestra n°1

Presencia de albúmina e IgG (glomerular no selectiva)

Muestra n°2

Presencia de dímeros y monómeros /, RBP, lisozima, beta 2 microglobulina y albúmina, transferrina, IgG, IgA (proteinuria mixta).

Muestra n° 3

Presencia de dímeros y monómeros / y albúmina (tubular incompleta)

Muestra n° 4

Presencia de albúmina, IgG y monómeros / (glomerular no selectiva y tubular incompleta).

Muestra n° 5

Proteinuria fisiológica

Las concentraciones de las orinas.

Con respecto a la presencia de las cadenas ligeras libres policlonales: La presencia de cadenas libres policlonales es un hallazgo común en las orinas de todos los sujetos “normales”. El promedio de secreción diaria es el siguiente: CADENAS K LIBRES POLICLONALES

CADENAS LIGERAS POLICLONALES

3.1 mg/24 horas (1.9/7.1)

1.5 mg/24 horas (0.7/3.4)

RELACIÓN K/L = 2.4 (1.2/3.7)

Detección precoz e identificación de procesos monoclonales tratables La valoración de laboratorio de cuadros clínicos que sugieran la presencia de mieloma múltiple debe prever varias pruebas rutinarias: un hemograma completo con recuento diferencial y frotis de sangre periférica, así como un panel químico que incluya calcio, creatinina, albúmina, proteínas totales, IgG, IgA e IgM. Debido a que los individuos con mieloma múltiple presentan síntomas distintivos producto de inmunoglobulinas monoclonales y/o de su contraparte, cadenas ligeras libres monoclonales, excepto entre el 1% y el 2% de los casos no secretores, todas las pruebas diagnósticas de laboratorio deben dirigirse a la determinación de dichas moléculas. Las cinco pruebas actuales más importantes para detectar estos biomarcadores son: electroforesis de proteínas séricas, inmunoelectrofijación de proteínas séricas, electroforesis de proteínas urinarias (una muestra de orina de 24 horas es lo ideal, pero la muestra de la primera orina de la mañana es útil en términos cualitativos), inmunoelectroforesis de proteínas urinarias y la determinación de cadenas ligeras libres en suero. Pero de los métodos antedichos, ¿cuál debería ordenar el médico para la

El cuadro 17 muestra el cálculo de la sensibilidad diagnóstica de los tres métodos. Cuadro 17 Sensibilidad diagnóstica de 10 muestras con proteinuria entre 50 y 100 mg/l: Tamizado contra EP clásica y contra EP por pesos moleculares (SDS)

Método

Negativas

Positivas

Sensibilidad Diagnóstica

Eficacia de la prueba

Cribado

60 %

71.4%

EP clásica

85.7%

90.9%

EP P.M. (SDS)

100%

Conclusiones sobre el uso de las tiras reactivas como tamizado de las proteinurias. ¿Por qué usarlas? ID 200223

Electroforesis

307

determinación de proteínas monoclonales o, debería ordenarlos todos para cada paciente? En la gran mayoría de los casos con mieloma múltiple los laboratorios pueden detectar fácilmente cantidades enormes de componentes monoclonales por EPS y/o exceso de CLLM por EP en orinas concentradas. En el 15% de casos que presentan sólo CLLM, la valoración de laboratorio debe prever la determinación de cadenas ligeras libres e inmunoelectroforesis en suero. Esta combinación evita la necesidad de obtener la primera orina de la mañana. ¿Cuál de los cinco métodos deben los médicos ordenar para encontrar las proteínas M, y deben ordenar todos para cada paciente? En la mayoría de los casos con mieloma múltiple, los laboratorios pueden fácilmente detectar grandes cantidades de proteínas M intactas con la EPS y/o exceso de mFLCs con la EPU concentradas. En el 15% de los casos que muestran solo mFLC, la evaluación de laboratorio debe incluir el análisis de FLC de suero, así también como EPS e IFE en suero. Esta combinación evita la difícil necesidad de obtener la primera orina de la mañana. El estudio de Katzmann y cols. de 1877 pacientes provee una perspectiva mejor sobre los alcances de las principales pruebas para proteínas monoclonales. Durante el proyecto, los investigadores efectuaron las cinco pruebas en todos los pacientes y sólo con la EPS y la determinación de CLL en suero fueron capaces de determinar los casos de mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenstrom. Sin embargo, fue necesaria la electroinmunofijación en suero y orina para optimizar la detección de amiloidosis AI, enfermedad por depósito de cadenas ligeras y neuropatías asociadas con proteínas M (cuadro 3).

MM (467)

ID 200223

Electroforesis

Detectada usando las 5* pruebas % (n)

Detectada usando EPS y FLC % (n)

Detectado con IFE en suero % (n)

100 (467)

94.4 (441)

100 (26)

SMM (191)

100 (191)

99.5 (190)

98.4 (188)

MGUS (524)

100 (524)

88.7 (465)

92.8 (486)

Plasmocitoma (29)

89.7 (26)

86.2 (25)

72.4 (21)

POEMS (31)

96.8 (30)

74.2 (23)

96.8 (30)

Plasmocitoma extramedular (10)

20.2 (2)

10.0 (1)

AL primario (581)

98.1 (570)

96.2 (559)

73.8 (429)

LCDD (18)

83.3 (15)

77.8 (14)

55.6 (10)

* SPE, UPE, IFE en suero, IFE en orina, FLC Abreviaturas: Mieloma múltiple (MM), mieloma múltiple latente (MML), gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), neuropatía periférica, organomegalia, desordenes endocrinos, proteína M, cambios en la piel (POEMS) Datos de 1877 pacientes (Katzmann, 2009)

Puede parecer paradójico, pero el mejor consejo para elegir el método de separación, entre fases, es no elegir y, por lo tanto, no adoptar ninguno. Todo esto no es sólo por el evidente ahorro de tiempo y costos, sino sobre todo porque cada procedimiento de separación introduce siempre errores en el análisis. De hecho, toda separación se basa en un equilibrio que, por definición, nunca tiende a desplazarse a un lado por completo. Esto significa que el componente por separar se presenta en dos formas, una de las cuales se recupera. El objetivo El objetivo de cualquier procedimiento de separación es aislar el/los componente/componentes de interés en una forma determinable, libre de interferencias por otros componentes, así como de alteraciones por el líquido biológi-

Tabla 3 Estudio Clínico: Detección de Proteínas M

Condición (n)

Waldenstrom (26)

308

co dispersante y por el componente objetivo de la investigación. Los métodos más utilizados:

Se prefiere la técnica de ultrafiltración, pues permite obtener, con costes poco elevados y a corto plazo, “componentes concentrados" sin que cualquier alteración del líquido biológico dispersante y del componente objeto de investigación intervenga, salvo la perdida inevitable de soluto por recuperar. Los concentradores para ultrafiltración más populares Sartorius (de tipo estático):

DIÁLISIS PRECIPITACIÓN QUÍMICA EVAPORACIÓN SECADO LIOFILIZACIÓN ULTRAFILTRACIÓN

Los límites del procedimiento: Las técnicas antedichas suelen presentar una serie de dificultades que pueden resumirse así: • Costo elevado • Tiempos operativos largos • Variaciones químicas o fisicoquímicas del o de los componentes • Perturbaciones del líquido biológico • Pérdida de la actividad biológica • Pérdida de moléculas por disminución de la porosidad Los métodos físicos de separación Estos métodos suscitan interés todo el tiempo y comprenden al menos dos fases. En función del proceso al que se someten estas fases, los métodos pueden dividirse en tres grupos: MÉTODOS QUE IMPLICAN UNA SEPARACIÓN MECÁNICA

MÉTODOS QUE IMPLICAN LA FORMACIÓN DE UNA FASE NUEVA

Absorción de solvente (volumen inicial entre 1ml y 20 ml). Esta técnica emplea una almohadilla absorbente de celulosa montada detrás de la membrana de ultrafiltración, para extraer el solvente y los microsolutos a través de esta última. Las macromoléculas retenidas se concentran en el fondo del recipiente para muestras. Sartorius (de tipo dinámico):

MÉTODOS QUE IMPLICAN LA DISTRIBUCIÓN DE UNA SUSTANCIA ENTRE DOS FASES

La técnica más utilizada

ID 200223

Electroforesis

309

Filtración Centrífuga La unidad filtrante centrifuga Vivaspin 500 ofrece un procedimiento de un sencillo paso para concentrar las muestras. Puede utilizarse en rotores de ángulo fijo y contener tubos de centrifugado de 2.2 ml. Membrana de polietersulfona (PES). Concentradores Minicon® y Miniplus®. Minicon® and Miniplus® Concentrators Concentradores de estática.

Unidad con membrana para una recuperación máxima. Ultracel-YM. La recuperación de soluto suele ser >95%. Ideales para soluciones diluidas de proteínas de ng/ml a µl/ml. Limitadores de volumen muerto patentado para volúmenes de concentrado fiables y reproducibles. Método simple y completo de recuperación del concentrado por centrifugación inversa. Membrana Ultracel-YM con cinco NMWL diferentes (Límite nominal de peso molecular):

Para química clínica. “Antes del análisis electroforético o inmunoelectroforético, concentre las orinas y el líquido cefalorraquídeo para intensificar las proteínas indicativas de estados anormales o patológicos (por ejemplo, proteínas de Bence Jones en orina). El concentrador estático no requiere accesorios.” Centricon®, centrifugas concentradoras.

ID 200223

Electroforesis

• • • •

310

3,000 10,000 30,000 50,000

•

y 100,000 Daltonios

Punta de recolección

Códigos de color para cada NMWL. Conservación fácil de volúmenes de concentrado y ultrafiltrado en tubos para centrifuga estándar. Pueden utilizarse en rotores estándar de ángulo fijo para tubos de 15 ml. La ultrafiltración: la técnica más utilizada. La ultrafiltración es una técnica que aprovecha la permeabilidad selectiva de la membrana para separar las sustancias disueltas en una solución, discriminando en base a su tamaño y peso molecular en relación con el tamaño de los poros de la membrana filtrante. Modelo de trabajo de los concentradores estáticos:

Muestra Muestra concentrada Membrana ultrafiltrante Campo centrífugo

Membrana

Muestra Pared no permeable

Muestra concentrada

Modelo de trabajo de los concentradores centrífugos:

ID 200223

Electroforesis

Filtrado

Algunas consideraciones matemáticas, físicas y químicas El algoritmo de la ultrafiltración puede esquematizarse así: F1, F2( x ) -----> F1, + F2( x ) Donde x, contenido en F2, es el componente por determinar en un procedimiento analítico que comienza con la resolución de una mezcla de dos fases: F1 y F2( x ), en grupos menos heterogéneos. Son cuatro los factores que deben considerarse para la elección del método: 1) El rendimiento de la separación Rz (rendimiento de la separación de x) es la relación entre la cantidad separada del componente x (Pz) y la inicial en la muestra (P0z). Es evidente que la separación será mucho mejor cuando el valor de Rz se aproxime más a 1: Rz = PZ / P0Z (1) 2) Eficiencia de la separación: Por desgracia, es inevitable que junto con el componente x separado se encuentren cantidades variables de sustancias interferentes (Y), de las cuales se quiso separar. Ahora bien, en base a (1): RY / Rz = PY / P0Y * P0Z / PZ La relación entre los rendimientos de la separación de X e Y será:

Pocillos para las muestras

Adsorbente higroscópico de celulosa

Deposito de recolección

311

RY / Z = RY / RZ Donde RY / Z es el grado de recuperación de Y respecto a X. SZ = 1 / RY / Z = RZ / RY Entonces, S es la “eficiencia de la separación” entre X e Y que un proceso implica. Así, el valor de SZ será determinante para seleccionar el método. 3) Capacidad del método de separación: es la cantidad de muestra sobre la que puede efectuarse la separación. Además, dicha capacidad puede ser decisiva en lo que respecta a la elección del método. 4) Rapidez del método. Mientras menos tiempo requiera el método de separación, este será mejor. Así, si se tienen los factores anteriores, la elección recaerá en el más rápido. La descripción del principio: La ultrafiltración por membrana es un procedimiento de separación molecular selectivo basado en el empleo de membranas semipermeables. Estas permiten el paso del solvente y solutos de bajo peso molecular, mientras retienen los de un tamaño molecular determinado. El límite de exclusión, o de corte, depende del modo de preparación y, por consiguiente, del tamaño de los poros de la membrana. En la práctica, si se tienen membranas adecuadas, es posible separar sustancias con un peso molecular de 500 y hasta de más de 100,000 daltonios. Con este método es fácil concentrar las proteínas de los líquidos biológicos, tanto para análisis electroforéticos, como para determinaciones semicuantitativas de cada fracción, estudios de aclaramiento, entre otros. La solución por ultrafiltrar se somete a una presión adecuada que puede obtenerse con la ayuda de varios métodos (gravedad, gas, bombas, centrifugación, etc.). Así, es forzada a pasar a través de la membrana de ultrafiltración, fijada convenientemente sobre un contenedor hermético. El agua y los solutos por debajo de un cierto peso molecular pasan libremente, mientras que las sustancias retenidas se concentran progresivamente. Estas membranas están hechas, por lo general, de polímeros naturales, tales como acetato de celulosa o celulosa modificada. ID 200223

Electroforesis

En el ámbito centrífugo, son factibles de forma más rápida y completa las mismas separaciones que pueden efectuarse en el ámbito gravitatorio, basadas en la diferencia de densidad entre varias fases, como la sedimentación o flotación de sólidos en líquidos, la estratificación de fluidos inmiscibles con diferente densidad. La aplicación de la fuerza centrífuga al proceso de ultrafiltración genera una dinámica en que la membrana microporosa flota sobre la superficie del líquido por concentrar, en un estado de impulso y aceleración proporcionales al número de revoluciones por minuto aplicadas a la centrífuga. En esta condición el líquido es forzado, a través de los poros de la membrana, por una fuerza hidrostática proporcional a los múltiples “g” (giros por minuto de la centrifuga). El filtrado pasa a través de la membrana en sentido contrario al del soluto que sigue la aceleración centrifuga. Para obtener una concentración óptima del soluto, es preciso emplear la centrifuga en función de sus características, tal y como se indica en la descripción sobre el uso de los concentradores centrífugos. Para calcular la fuerza centrifuga relativa (RCF), obtenible con la propia centrifuga, basta con aplicar la siguiente fórmula: RCF = 1.118 x 10-5 x r x (rpm)2 g Donde: RCF = fuerza centrifuga relativa en unidades de g (múltiplos de la aceleración gravitatoria). 1.118 x 10-5 = constante r = radio entre el eje de la centrifuga y el centro de las probetas colocadas en su asiento rpm = número de revoluciones por minuto. El tipo de centrifuga en los laboratorios de química clínica, para las funciones relativas a la ultrafiltración, puede tener dos configuraciones: 1) mecanismo rotativo con inclinación fija del portaprobetas. 2) mecanismo rotativo-oscilante e inclinación del portaprobetas de 0º a 90º. Para los dos mecanismos antedichos es posible calcular la presión ejercida

312

por el líquido sobre el fondo de la probeta y, en el caso de los concentradores centrífugos, la ejercida sobre la superficie del líquido biológico por la probeta coaxial interna que lleva la membrana flotante: P = 55.9 x 10-6 x (R2 – r2) n2 Donde: P = presión en kg/cm2 R = distancia del eje de rotación al punto donde se desea calcular la presión (m). r = distancia del eje de rotación a la superficie libre del líquido (m). n2 = numero de giros por minuto Los límites de la técnica de ultrafiltración Si bien es un procedimiento muy sencillo que no requiere cambios de fase o adición de productos químicos y que consume poca energía, la técnica debe vigilarse con atención para evitar que toda una serie de fenómenos fisicoquímicos afecten la fiabilidad del proceso. A continuación se exponen los factores que modifican el “rendimiento final”. Tiempo de concentración en relación con la recuperación.

la ejecución de una ETF e IFE es un volumen suficiente. Entonces, si la sensibilidad del método electroforético de Interlab para la detección de BJ está entre los 7 y los 10 mg/l, una concentración de 2-3x llevará la sensibilidad de este a casi 3 mg/l. Sin embargo, durante un espacio de tiempo mayor, la recuperación de volumen es más baja. El mismo fabricante recomienda una concentración máxima de 15x para obtener una recuperación del 50% de soluto.

Recuperación total de soluto (%)

Recuperación usual de soluto

Dispositivo Minicon A25 Contenido inicial de proteínas: 0.05%-0.2%

Desestimación usual de soluto

Desestimación (%)

Dispositivo Minicon B15

Factor del volumen de concentración

(ml)

Volumen de muestra (ml)

Líquido cefalorraquídeo

Tiempo en minutos

Para volúmenes iniciales por concentrar, del orden de 5 ml, después de 40 minutos el índice de concentración es de 2-3x con recuperación de 1 ml. Para

ID 200223

Electroforesis

Factor de concentración

Para obtener una cantidad adecuada de soluto sin afectar la concentración, véase el siguiente ejemplo:

Velocidad usual de concentración Contenido de Bence Jones en orina

Margen óptimo de recuperación

Dispositivo Minicon B15

313

Albúmina Proteínas de Bence Jones

Peso molecular

Donde puede apreciarse la eficacia de recuperación de una membrana ultrafiltrante con porosidad de 15,000 D. Si consideramos una BJ completa (24,000 D), la recuperación será de casi el 90%. Si consideramos una BJ en fragmentos (6000-10000 D), la recuperación será pobre, entre el 20 y el 30%. De ahí que no debe exagerarse demasiado con las concentraciones, pues se genera una muestra paupérrima del componente que se quiere estudiar. Por tal razón, el fabricante recomienda lo siguiente:

50 70 90 100

Demostración experimental de la pérdida de soluto para una BJ. Estas son las limitaciones de los concentradores para ultrafiltración: 1) Después de la concentración, la prueba posterior es sólo cualitativa. 2) Una parte del soluto se estratifica sobre la membrana y, por tanto, es irrecuperable. 3) La cantidad de recuperación disminuye con la concentración, tanto es que bajos índices de concentración producirán el grado justo de enriquecimiento. Dos muestras de orina de pacientes con proteinuria de Bence Jones se analizaron, sin concentrar, mediante electroforesis. Luego se registraron los valores integrales de color (trazador cúbico) de las bandas homogéneas de las BJ:

Los concentradores Minicon y Miniplus están destinados para la evaluación cualitativa. Ya que siempre existen algunas uniones inespecíficas de soluto sobre la superficie de la membrana, así como la perdida de película irrecuperable debido a la humedad de la cámara de muestras, los concentradores Minicon y Miniplus no están recomendados para aplicaciones donde se requiere el análisis cuantitativo de los resultados.

Conclusiones de lo anteriormente expuesto: 1) Después de la concentración, la prueba siguiente es sólo cualitativa. 2) Una parte del soluto se estratifica sobre la membrana y, por lo tanto, es irrecuperable. 3) El porcentaje de recuperación disminuye con la concentración, de manera que índices bajos de concentración producirán el grado justo de enriquecimiento. Ejemplo experimental de Porcentaje de recuperación de proteínas BJ frente a Número de concentraciones con Minicon a una porosidad de10000 D.

ID 200223

Electroforesis

Conc. X

% de Recuperación

0 5 10 20 40

100 82 65 48 28

21 11 4 2

Primera muestra

Integral: 700

Segunda muestra

Integral: 3470

314

Después, las dos muestras se concentraron 15 veces con concentradores a una porosidad de 10,000 D: Primera muestra

Peso molecular del soluto

Integral: 3850

Segunda muestra

Como puede apreciarse, para pesos moleculares de 20,000 D (cercanos a una cadena ligera libre completa) la retención de moléculas es aproxima al 90%, pero decrece en gran medida entre el 30% y el 40% para pesos moleculares por debajo de los 20,000 D (fragmentos de cadenas ligeras libres). Las BJ, ¿son todas siempre cadenas completas o agregados? 3) Un valor de pH urinario que deforma la configuración espacial terciaria y cuaternaria Si examinamos las orinas, el líquido implicado con más frecuencia en el procedimiento de concentración, estas suelen presentar un pH que oscila entre 4.6 y 9 con valores más altos cuando, por ejemplo, estamos ante una acidosis diabética (pH < 4.6) o ante una alcalinidad intensa por infecciones del tracto urinario (pH > 10). Todas las proteínas excretadas por el aparto renal se encuentran en un ambiente distinto, en comparación con el plasmático, en términos de concentración de solutos y de pH. Este nuevo estado de suspensión, por no hablar del tiempo de retención, puede generar cambios en la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas, sobre todo cuando se encuentran en un ambiente de condiciones más extremas. Las proteínas, por lo general, tienen un comportamiento en términos del mantenimiento de su disposición estérica, variable en relación con el ambiente que las contiene. Este comportamiento se manifiesta de acuerdo con los datos

Integral: 18460

Los valores de las relaciones entre integrales (concentrado / no concentrado) demuestran que el valor real de la concentración no se trata de un factor 15, sino de un factor 6. Esto indica que la recuperación fue del 56% con una pérdida de Bence Jones debida a: 1) Polarización de la concentración (estratificación sobre membrana porosa) Durante la concentración, el contacto de la solución con la membrana genera una presión. El resultado es un flujo de solutos, sólidos y agua contra la superficie de la membrana y, por consiguiente, la formación de un gradiente de concentración, con el nivel máximo de solutos retenido en dicha superficie, hasta la formación de una capa de gel. 2) Pérdida de BJ por su paso a través de los poros de la membrana

ID 200223

Electroforesis

(%)

Desestimación (%)

Miniplus: punto de corte del peso molecular

315

que figuran en la siguiente tabla:

Viscosidad

EFECTO DEL pH EN LAS ESTRUCTURAS DE LAS PROTEÍNAS

Valor del pH urinario 4< 4-9 9-11.4 > 11.4

Modificaciones en la carga de las proteínas Carga irreversible Modificaciones no apreciables en corto tiempo Modificaciones reversibles Modificaciones reversibles

Todos estos posibles sucesos pueden contribuir a una fácil perdida de componentes proteínicos, en relación con el tamaño de los poros y su variabilidad productiva, durante las etapas de concentración. 4) El valor de la temperatura ambiental (movimientos Brownianos aplicados y agitación térmica). Este tema contempla la difusión molecular de una solución a través de una zona delimitada y bien definida. Los términos de nuestro argumento se refieren a la situación hidrodinámica que se crea en las moléculas proteicas de un líquido biológico en ausencia de un campo eléctrico. El incremento de la temperatura magnifica el desorden molecular (entropía), y con ello, un movimiento molecular casi browniano. Estos movimientos y choques (entre moléculas y entre moléculas y la membrana ultrafiltrante) pueden llegar a un número igual a 7-10 x 1022/seg: Difusión = R • T / 6 π r • η • Νa Por lo tanto, concentrar el mismo líquido biológico a temperaturas ambientales distintas, implicaría una recuperación distinta. La concentración a temperatura elevada será afectada por: 1) Un mayor número de choques por unidad de tiempo y de área. 2) Una mayor pérdida de soluto. Otro problema debido a concentraciones muy elevadas, es la viscosidad. En la tabla siguiente puede apreciarse como cambia la fluidez del líquido urinario en relación con el valor de concentración:

ID 200223

Electroforesis

Una menor fluidez de las orinas (incremento de la viscosidad) implica una mayor resistencia al escurrimiento en la matriz del gel, sometido a electroforesis, con la modificación el recorrido proteico. La distancia recorrida por una proteína sometida a electroforesis se obtiene mediante la fórmula: d = V • t’’ • µ / l Donde: V = voltaje aplicado. t’’ = tiempo en segundos de duración de la migración electroforética. µ = carga de la proteína / 6 π r η l = longitud del soporte en cm (amortiguador / amortiguador) La fuerza del campo eléctrico que actúa sobre las proteínas es: f = η • A • dv / dr En consecuencia, con el aumento de la viscosidad (η), la fuerza del campo eléctrico (ETF) no podrá mover las proteínas con la misma velocidad prevista por d = V • t • µ/l y la migración electroforética será más breve en relación con el incremento de η. Lo anterior se comprobó experimentalmente utilizando una muestra de orina con zona gamma de aspecto policlonal haciéndola migrar por electroforesis después de concentrarla 60 veces.

316

¿Cómo concentrar de manera correcta? Es conveniente que todo laboratorio establezca, basándose en las recomendaciones de la SIBioC para la determinación de la proteinuria de BJ (la sensibilidad deseada de los métodos es de 10 mg/l), los siguientes procesos internos: • La sensibilidad de su sistema para determinar el índice general de concentración. • Concentrar siempre las orinas un número de veces más o menos igual, pero no más de 10 veces. • Seleccionar una porosidad igual o menor a 10,000 D. • Son preferibles los concentradores centrífugos. • Concentrar a temperatura controlada. ¿Qué dudas quedan sobre el uso de los concentradores para ultrafiltración? Efectos indirectos: 1) El pH de las orinas 2) Como se presenta la BJ: monómero, fragmentos, estado de agregación. 3) La temperatura de trabajo. Efectos directos: 1) Qué porosidad elegir. 2) La variabilidad de la porosidad entorno a la media establecida. 3) La polarización de la concentración. 4) Los fenómenos de absorción inespecífica. ¿Qué alternativas tiene el laboratorio para concentrar las orinas? Los métodos físicos de separación suscitan interés todo el tiempo y comprenden al menos dos fases distintas. Pueden dividirse en tres grupos en función del proceso al que se someten las fases:

Orina no concentrada (aplicada 5 veces) de migración electroforética normal.

MÉTODOS QUE IMPLICAN UNA SEPARACIÓN MECÁNICA

ID 200223

MÉTODOS QUE IMPLICAN LA DISTRIBUCIÓN DE UNA SUSTANCIA ENTRE DOS FASES

El método de absorción física es el proceso que resuelve la serie de “efectos

Orina concentrada 60 veces, de migración electroforética muy breve y zona gamma ensanchada.

Electroforesis

MÉTODOS QUE IMPLICAN LA FORMACIÓN DE UNA FASE NUEVA

317

directos” de los concentradores para ultrafiltración. • Descripción del fenómeno de adsorción: A la acumulación de partículas sobre una superficie se le llama adsorción, la sustancia que se adhiere a la superficie se le llama adsorbato y, al material subyacente, adsorbente. • Clasificación de las adsorciones: Las adsorciones pueden clasificarse en dos categorías: 1) Adsorción física. 2) Adsorción química. Según el tipo de interacciones que ocurren entre adsorbido (soluto) y adsorbente (sustrato), la adsorción puede definirse como física (enlaces de Van Der Waals) o química, también llamada “quimioadsorción” (enlaces covalentes). Estos dos tipos de adsorción difieren, en primer lugar, por la diferente entidad de las fuerzas que retienen la especie considerada en la fase adsorbente. La adsorción de tipo físico tiene valores de ΔH (entalpía de formación de los enlaces adsorbente-adsorbato) de unos 20 kJ-mol-1, mientras que la de tipo químico tiene valores de ΔH diez veces superiores, alrededor de 200 kJ-mol-1. Un concentrador para la adsorción física, como el creado por Interlab, prevé la concentración de las orinas por medio de la disminución de la tensión superficial (Joule/m2).

Así, las moléculas dentro del líquido aumentan su entropía y el área superficial del líquido, con la consiguiente separación de las moléculas de solvente:

Velocidad

Hay dos fenómenos concomitantes en la fase inicial: 1) La formación de vapor. 2) La condensación del vapor. Por último, se consigue un equilibrio con la “tensión del vapor”, esto es, la presión ejercida por su vapor cuando las dos fases se encuentran en equilibrio dinámico:

Velocidad de evaporación

Tensión superficial (J/m2 102)

Variación de la tensión superficial del agua con la temperatura

Velocidad de condensación

Temperatura (°C)

ID 200223

Electroforesis

Tiempo

318

Equilibrio liquido-vapor

Así, el líquido urinario se concentra dejando el soluto inalterado.

El nivel de recubrimiento de la superficie se expresa como fracción de recubrimiento (F), definida como: F = número de sitios de adsorción ocupados / número de sitios de adsorción disponibles. La velocidad con la que una superficie determinada se cubre de adsorbato, depende de la capacidad del adsorbente de disipar, en forma de agitación térmica, la energía de las partículas que se precipitan sobre su superficie La fracción de colisiones contra la superficie, que finaliza con la adsorción, se denomina probabilidad de adhesión: S = Velocidad de adsorción de las partículas en la superficie / velocidad de

Adsorbato

Fase adsorbente

ID 200223

Electroforesis

319

2) Rapidez de ejecución: hasta 26 muestras en 10 minutos. 3) Sin alteraciones de los componentes analizados. 4) Recuperación total de los componentes analizados. Entre las desventajas incluimos las siguientes: 1) El índice de concentración máxima del material biológico oscila va de 2 a 5 veces. Este procedimiento implica el uso de métodos ya sensibles en muestras no concentradas. Recordemos que la “Sociedad de Bioquímica y Biológica Molecular Química División Científica: Grupo de Estudio sobre las Proteínas”, establece que un método electroforético para la búsqueda de BJ debe tener una sensibilidad de al menos 10 mg/l. Los métodos en agarosa para el estudio de orinas suelen tener una sensibilidad de 10 mg/l. Así que cualquier índice de concentración que decida elegir, hará que el sistema electroforético alcance una sensibilidad de:

choque de las partículas contra la superficie. El gas liberado (cantidad vaporizada de solvente) y el adsorbido se encuentran en equilibrio dinámico. Ahora bien, el problema que se plantea es el de la relación que conecta el grado de recubrimiento de la superficie con la presión del gas adyacente. La expresión de la dependencia de F por la presión en correspondencia con una serie de valores de la temperatura de trabajo se denomina “isoterma de adsorción”. La velocidad con la que varía el recubrimiento superficial luego de la adsorción, es proporcional a la presión y al número de sitios vacíos. Cualquier aumento en la presión del gas determina un mayor incremento en la cantidad de gas adsorbido, hasta el límite de una presión igual a la tensión del vapor de la sustancia que se adsorbió, cuya presión, isoterma de adsorción, sale verticalmente debido a la condensación. El estado de equilibrio puede interpretarse en términos de equilibrio dinámico, que es el resultado de la igualdad entre la velocidad de evaporación del material absorbido y la velocidad de condensación de las moléculas en fase gaseosa. La teoría de Langmuir sugiere que la velocidad de evaporación puede considerarse como proporcional a la fracción de la superficie cubierta: dF / dt = K p N (1 - F) Donde: • K = constante cinética de adsorción. • p = presión. • N = número total de sitios. En equilibrio, por lo tanto, la velocidad de absorción será la misma que la de desorción y habrá concluido el fenómeno de concentración. Conclusiones sobre la concentración de los líquidos bilógicos por adsorción. Entre las ventajas se incluyen las siguientes: 1) Gran rentabilidad: sin coste alguno.

ID 200223

Electroforesis

Número de concentraciones

Sensibilidad en mg/l

2.5

Además, al aplicar 2 o 3 veces el líquido biológico, ¡podemos reducir a la mitad las sensibilidades expresadas en la tabla! Surge la cuestión: ¿Por qué se ha de concentrar un número exagerado de veces las orinas para la ultrafiltración, a sabiendas de que se altera la viscosidad y se tiene una recuperación baja? En la siguiente tabla se resumen las ventajas y desventajas de los distintos métodos para concentrar líquidos biológicos:

320

Estáticos

Centrífugos

Adsorción

Polarización de la concentración

Efecto de estratificación ++

Efecto de estratificación +

Ausente

Adsorción de proteínas en la membrana

Ausente

PM de las proteínas vs poros de membrana y perdida de soluto

Ausente

pH de la orina y desempeño estructural

Ausente

Efecto de la temperatura de trabajo

Ausente

Número de concentraciones

De 2 a 100

De 2 a 10

De 2 a 5

ID 200223

Electroforesis

321

APĂ&#x2030;NDICE TERCERO las crioglobulinas

ID 200223

Electroforesis

323

LA TIPIFICACIÓN DE LAS CRIOGLOBULINAS

ID 200223

Electroforesis

324

fenómeno de la crioprecipitabilidad. Luego, Wintrobe y Bull lo retomaron y relacionaron con los signos clínicos de una paciente mielomatosa en 1933. En 1947 Lerner y Watson acuñaron por primera vez el término “crioglobulinas”, refiriéndose a un grupo de inmunoglobulinas (Ig) con la propiedad de precipitar y solubilizarse, casi siempre, a una temperatura de 37°C.

INTRODUCCIÓN Existen ciertos casos que plantean problemas de interpretación durante la lectura del cuadro seroproteínico y/o de la inmunofijación. Un ejemplo típico es la presencia de crioglobulinas en el suero. Estas son proteínas o complejos que precipitan a bajas temperaturas y se disuelven, por lo general, a 37°C.

En 1929 Heidelberg y Kendall estudiaron y describieron por primera vez el

ID 200223

Electroforesis

325

CLASIFICACIÓN DE LAS CRIOGLOBULINAS Posteriormente, en 1974 Brouet y col. identificaron tres tipos de crioglobulinas basándose en las características inmunoquímicas del precipitado: Crioglobulinemia tipo I de Brouet: • Macroagregado por interacciones electrostáticas intramoleculares. • Inmunoglobulinas monoclonales que tienden a formar consigo mismas complejos de gran peso molecular. • Las IgM k son más frecuentes. • Las IgG y subclases IgG1, G2, G3 son menos frecuentes. • Raramente IgA. • Organización del crioprecipitado: amorfo o sin una estructura definida, tubular, organizada e hidratada, cristalina, muy compacta (organización más dañina: IgG3 en microcristales). Sin embargo, no siempre el calor solubiliza todo el crioprecipitado:

Crioglobulinemia tipo II de Brouet: • Inmunocomplejos.

ID 200223

Electroforesis

326

• La génesis formativa muestra actividad biológica de inmunoglobulina. • Inmunoglobulinas monoclonales (IgM) con actividad de FR contra las IgG policlonales, rara vez contra las IgA • Tendencia a formar complejos con inmunoglobulinas policlonales y FR • El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. Los factores reumatoides derivan de la proliferación anormal de un clon de plasmocitos. • Se observa sólo una banda monoclonal en la inmunofijación.

• El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. Los factores reumatoides surgen de la proliferación anormal de un clon de plasmocitos. • Se observan dos bandas monoclonales en la inmunofijación.

Crioglobulinemia tipo III de Brouet: • Inmunoglobulinas policlonales. • La composición deriva de una o más inmunoglobulinas. • Los factores reumatoides provienen de perturbaciones y magnificación del proceso flogístico de inmunomodulación, durante la respuesta contra el antígeno. En consecuencia, como ocurre en muchas situaciones, Musset (1992) y Bellotti (1991) descubrieron formas que son inclasificables, llevándonos a desear una clasificación más simple, limitada a dos clases, donde, en la primera clase, tenemos las proteínas monoclonales, y en la segunda, todas las formas mixtas.

Crioglobulinemia tipo II variante “b” de Brouet: • Inmunocomplejos. • La génesis formativa muestra actividad biológica de inmunoglobulina. • Inmunoglobulinas oligoclonales (IgM) con actividad FR contra IgG policlonales, rara vez contra las IgA. • Tendencia a formar complejos con IgG policlonales y FR.

ID 200223

Electroforesis

327

Para justificar lo propuesto, considerando diversos estudios presentes en la literatura, hay uniformidad en lo que respecta a la incidencia de crioglobulinas tipo I de Brouet, definidas también como crioglobulinemias monoclonales por otros autores. En cambio, los datos relativos a las otras formas son demasiado desiguales, evidenciando además heterogeneidad en la selección de la población crioglobulinémica y falta de estandarización de las metodologías. Manifestaciones Clínicas Estas son inconstantes porque alrededor del 50% de las crioglobulinemias monoclonales y el 15% de las formas mixtas son asintomáticas. Las manifestaciones más usuales derivan de la obstrucción del flujo sanguíneo por la crioprecipitación en los capilares (fenómeno de Raynaud, necrosis de las extremidades, acrocianosis, púrpura vascular, etc.). La siguiente tabla muestra las asociaciones y la incidencia entre síntomas y crioglobulinemias (tabla I), así como su incidencia en varias patologías (tabla II).

Crioglobulinemias “microheterogéneas” de Musset • Presencia de dos o más componentes monoclonales ligeros. • Entorno policlonal presente. • Mayor frecuencia de IgG e IgM.

Síntomas

Tipo II

Tipo III

55 14 10

15 40 15

60 20 0

70 0 10

9 35

15 5

15 20

2 58

Síntomas renales

Síntomas neu-

Púrpura Urticaria Livedo reticularis Fenómeno de Raynaud Acrocianosis Artralgia

ID 200223

328

Tabla I % de incidencia en relación con el tipo de crioglobulinemia según Brouet Tipo I

Necrosis distal

Electroforesis

% de Incidencia general

3. pH <7.0. 4. Constante dieléctrica del solvente. 5. Estados hemodinámicos. Las crioglobulinas, por lo tanto, son un fenómeno físico, visualmente evocativo, creado de manera artificial. Los datos propuestos por la literatura y autores interesados en la explicación del fenómeno son contradictorios y no concluyentes. Levo detecto reducciones en esta proteínas, tanto de glucosaminas como de ácido siálico, entendidas como características intrínsecas vinculadas con las inmunoglobulinas crioprecipitantes. Otros autores centraron sus esfuerzos en explicar la solubilidad modificada en función de la respuesta a factores extrínsecos como la temperatura, el pH, la fuerza iónica del solvente. Por ejemplo, las temperaturas bajas pueden dar lugar a modificaciones conformacionales de las proteínas, reduciendo su polaridad y solubilidad. Las proteínas tienden a precipitar en su punto isoeléctrico con pH óptimo entre 5.5 y 8.0. La influencia de la fuerza iónica en los fenómenos de crioprecipitación es variable (0.09-0.3 u). La integridad de las inmunoglobulinas es, en general, indispensable para la precipitación y, solo en casos específicos, Fab y Fab2 conservan la propiedad de precipitar con el frío. Por esta razón, la crioprecipitación de las crioglobulinas monoclonales tipo I parece depender de la estructura cuaternaria, tanto en términos de composición de carbohidratos como de aminoácidos. Si el papel de los carbohidratos es difícil de valorar en los fenómenos de la precipitación, se han observado, en su lugar, secuencias específicas de aminoácidos en la región variable de las cadenas pesadas de las crioglobulinas IgM, situadas en la parte externa de la molécula. De hecho, en ciertas crioglobulinemias tipo I, se ha detectado una carencia

rológicos

Enfermedades Asociadas

Tabla II % de incidencia en relación con el tipo de crioglobulinemia según Brouet Tipo I

Tipo II

Tipo III

Mieloma múltiple

M. de Waldenstroem

16 0 0 0

3 7 4 3

0 11 5 4

L.L.C. LES AR S. de Sjogren Enfermedad hepática Ninguna (crioglobulinemia esencial)

Mecanismos de crioprecipitación La mayoría de los factores que influyen en la crioprecipitación de las inmunoglobulinas monoclonales también actúan en las crioglobulinemias mixtas, donde, a excepción de la fase de latencia (Lawson 1987), tenemos una fase lenta con formación de pequeños agregados de inmunoglobulina, seguida de una agregación rápida y extensa que culmina en la precipitación. La precipitación de las crioglobulinas mixtas resulta del aumento rápido y progresivo del tamaño de los inmunocomplejos (IC) IgG-IgM formados a bajas temperaturas (Brandau 1986). Los factores que influyen en la formación del crioprecipitado son los siguientes: 1. Concentración de inmunoglobulinas, número de colisiones, de encuentros, y de choques efectivos. 2. Temperatura.

ID 200223

Electroforesis

329

de tiroxina y serina, o una sustitución de leucina por prolina en la posición 44 de las cadenas k de una crioglobulinemia de cadenas ligeras. Incluso la presencia de ciertos componentes lipídicos podría constituir un factor, favoreciendo la insolubilidad y la crioprecipitación. De especial interés son algunas crioglobulinas mixtas monoclonales con isotipo IgG3 que tienden a autoagregarse. Estas moléculas poseen un segmento aminoacídico adicional de 11,000 MW en la región bisagra, con catorce residuos de cisteína implicados en puentes disulfúricos inter e intracadenas pesadas. No está claro si dicha cadena adicional en las cadenas pesadas y el número de puentes disulfúricos favorecen la autoagregación, típica de este isotipo (combinación de interacciones no iónicas débiles e hidrofobicas). Menos precisas son las bases moleculares de la crioprecipitación en las crioglobulinemias mixtas, fenómeno frecuente a consecuencia de la formación de inmunocomplejos. En el pasado, se dio gran importancia a la IgG como un antígeno que estimula la formación del IgM factor reumatoide (FR). El concepto se origino de la observación de que en cada proceso infeccioso, agudo o crónico, se podían detectar crioglobulinemias tipo III, interpretadas como un producto prácticamente “fisiológico” por una estimulación antigénica prolongada e intensa. Se buscaron los antígenos en el crioprecipitado contra los que se pensaba que las IgG se dirigían, así como los autoanticuerpos o anticuerpos específicos. La identificación no es fácil por el número infinito de posibles antígenos y anticuerpos presentes en el crioprecipitado. Las crioglobulinas del tipo III y IV son inmunocomplejos, debido a la presencia de complejos antígeno-IgG/IgM anti IgG en el crioprecipitado. Se identificaron numerosas actividades anticorporales en los crioprecipitados, como autoanticuerpos (ANA, AMA, ASMA), autoantígenos de la estructura renal, y lipoproteínas.

ID 200223

Electroforesis

Se han observado incluso antígenos “externos”: componentes del VHB, VEB, CMV, herpes simple, estreptococos, pero al parecer, aún no se han detectado IgG anti VHC en las crioglobulinemias tipo II. El hallazgo de estos antígenos demostró y confirmó la respuesta anticorporal de tipo IgG, pero no aclaró el fenómeno de la crioprecipitación. Para las IgG se propuso la posibilidad de su modificación estructural durante estimulaciones antigénicas intensas y por parte de algunos autores (Levo), la demostración del ya mencionado “empobrecimiento en ácido siálico”, que volvería inmunógenas a las IgG favoreciendo la crioprecipitación. Levo demostró que durante la estimulación antigénica intensa, puede manifestarse un defecto secretorio que conduciría a la producción de inmunoglobulinas desialiladas. Esta situación puede ocurrir en cualquier estimulación bacteriana, viral, fúngica y en procesos de naturaleza autoinmune. Por otra parte, la desialilación también puede ocurrir durante el posttransicional por glucosidasas inespecíficas del organismo o producidas por agentes infecciosos. Las Ig desialiladas generarían una respuesta inmune por expresión de epítopos, antes ocultos, y el IC que se forma, por el carácter de las IgG, adquiriría la capacidad de criopecipitar. El autor amplió la teoría partiendo del supuesto de que los daños hepatocelulares favorecen la permanencia de las Ig desialiladas en la circulación por la capacidad reducida de los hepatocitos designados a eliminarlas. Esta teoría alcanzó gran repercusión y aún hoy día se aplica, posicionando a las IgG como elementos iniciales para la creación del IC IgG-IgM en las crioglobulinas mixtas. Esto no tiene en cuenta las hipótesis de Lospalluto, donde una IgM k monoclonal de una crioglobulina, separada de la IgG, es capaz de reconstruir el IC crioprecipitante con cualquier otra IgG, incluso de sujetos normales, mientras que la IgG del mismo paciente no crioprecipita al contacto con IgM de otros sujetos.

330

Los estudios recientes de Qi y col. también han demostrado la importancia del calcio para la crioprecipitación a 37°C en la interacción entre las dos inmunoglobulinas. Esta es más estrecha a 4°C, precipitando los IC que se forman sólo cuando se producen condiciones fisicoquímicas específicas, entre ellas la presencia de calcio u otros cationes, como el bario y el manganeso. Entre otros factores considerados favorecedores de la crioprecipitación se han considerado ciertos componentes de la fase aguda de la inflamación, pero la atención de los investigadores se enfocó en particular sobre la fibronectina. La fibronectina es un componente integral del criofibrinógeno y de los crioprecipitados inducidos por heparina, por lo que se cree que puede estar implicada en la promoción y la manifestación de la crioprecipitación. Se ha detectado con particularidad en las formas secundarias a procesos flogísticos autoinmunes, donde las crioglobulinas son en su mayoría del tipo III, pero la interacción, la fijación con el crioprecipitado, aún no tiene una definición completa. Fase preanalítica Recomendación para solucionar el problema del transporte de las muestras biológicas. Puesto que no existe una guía básica para preservar las muestras séricas que deben seguir el procedimiento para determinar la presencia de crioglobulinas, todo laboratorio tiende a adoptar los procedimientos que considera más adecuados para la organización logística del propio laboratorio. Ocurren entonces una serie de situaciones heterogéneas e irrepetibles que pueden alterar el curso de la detección de crioglobulinas. Para solucionar el problema de manera adecuada, con inclusión simultanea de la funcionalidad y el costo de la solución, proponemos el siguiente procedimiento: Material necesario

Para ciertas crioglobulinemias tipo III, la hipótesis de Levo es aceptable, pero no aplicable para las del tipo II. Respecto a las crioglobulinemias tipo II, pese a los progresos recientes sobre su génesis y etiología, existen pocos hallazgos para explicar el mecanismo de la crioprecipitación. Las IgM FR parecen presentar una baja afinidad por las inmunoglobulinas a 37ºC, mientras que aumenta con el descenso de la temperatura. Slone y otros demostraron que tras la interacción entre IgM e IgG, la solubilidad de los IC formados es mucho menor que la de cada uno de los componentes por separado, ya que la precipitación de las crioglobulinas mixtas está más relacionada con las dimensiones de los complejos que con los aumentos modestos en el número de enlaces. Las crioglobulinemias monoclonales contienen, por definición, una IgG y un anti-IgG (IgM por lo general), cuya propiedad de criopecipitar depende de la unión IgG anti-IgG. Los FR monoclonales crioprecipitan sólo después de interactuar con las IgG y, normalmente, las determinantes antigénicas están localizadas en la porción Fc. Algunos autores han señalado que el FR crioprecipitante difiere de los anticuerpos anti-IgG por una menor reactividad contra las IgG de conejo, utilizadas comúnmente para la determinación del factor reumatoide. El vínculo entre el FR crioprecipitable y la IgG también fue estudiado con respecto a la subunidad monomérica y al fragmento Fab de los anticuerpos de tipo IgM pentaméricos. Se determinó una valencia de 1 en contraste con la presencia de dos tipos de anticuerpos, quizá por el impedimento estérico derivado del limitado acceso a ciertos sitios de unión del antígeno. Los complejos IgM FR-IgG están presentes ya a 37°C y una disminución de la temperatura aumenta el número de sitios de unión disponibles en el complejo FR.

ID 200223

Electroforesis

Material necesario

331

Realice la extracción venosa con la jeringa precalentada a 37°C. Abra el termo e inserte el tubo de recolección tapado en la probeta más grande, luego cierre la probeta externa y el termo y diríjase al laboratorio. Los controles para preservar la temperatura en el tubo de recolección se muestran en la siguiente tabla, donde pueden verse también los resultados obtenidos con otros métodos para conservar las muestras.

1. Termos con tapón de rosca o caja de conservación a una temperatura controlada (véase la figura anexa). 2. Tubo de vidrio de 40 ml con tapón (que pueda contener una probeta de extracción y agua). 3. Arena. 4. Incubadora a 37°C.

Temperatura registrada en el suero, al transcurrir el tiempo Condiciones ambientales: t° = 25°C

Termo con arenilla a 37° Termo con agua a 37° Becker con arenilla a 37° Becker con agua a 37°

20 minutos

30 minutos

40 minutos

50 minutos

60 minutos

37°

36.9°

36.5°

36.4°

36.3°

36°

35.2°

34.5°

34°

32°

32.5°

30°

28.5°

27°

26°

32.5°

30°

28°

26.5°

25°

La tabla siguiente muestra la temperatura registrada en las muestras, durante su conservación, antes de llegar al laboratorio, con dos sistemas diferentes: Temperatura registrada a la llegada de las muestras al laboratorio Desviación Rango de Estadística Media estándar temperatura

Procedimiento para la termostatación de la muestra para crioglobulinas. Mantenga el termo destapado y que lleve tanto la arenilla como un tubo de volumen adecuado - debe poder contener entre 20 ml y 30 ml de agua así como la probeta de extracción - en la incubadora a 37°C. El tiempo de retención para superar el margen térmico de la arena y alcanzar el objetivo de llevarla a 37°C, es de 24 horas.

ID 200223

Electroforesis

Termo con arenilla y probeta interna a 37°C Becker con agua a 37°C

36.1°

2.5°

31.5°/41°

30.7°

2.7°

25°/35°

La tabla siguiente, en cambio, muestra los resultados de las tipificaciones realizadas en tres lotes de muestras séricas en el laboratorio en tres estados di-

332

ferentes de conservación durante la fase de toma de muestras y arribo al laboratorio: Condiciones de transporte

Termos con arenilla y probetas a 37° Beaker con agua a 37° En mano aprox. a 35°

Número

Porcentaje de tipificación positiva

11%

43 4

5% 0%

Al finalizar la extracción, inserte el tubo en del termo con arenilla y una probeta interna con agua, todo precalentado a 37°C. Esta temperatura es necesaria para tener la certeza de que durante la toma de la muestra y el transporte al laboratorio, esta misma no descienda por debajo de los 36°C. 1.2 Coagulación Llévese el contenedor al laboratorio y colóquelo en la incubadora regulada a 37°C para la etapa de coagulación de la muestra hemática. Manténgala incubada entre 2 y 3 horas. Producida la coagulación, centrifugue el tubo a 37°C para obtener un suero limpio, libre de residuos de eritrocitos y/o fibrina. 1.3 Cuidado: no utilice sueros opalescentes, hemolizados o lipémicos. 1.4 El laboratorio El laboratorio debe tener tanto tubos precalentados a 37°C como tubos conservadas a 4°C. Esto para la consecuente división del suero en dos alícuotas. 1.5 Tratamiento del suero: 1) Tubo 1, precalentado a 37°C. Identifique este tubo con nombre o apellido y la indicación 37°C. Pipeteé entonces 500 microlitros de suero y tápela. Colóquela en la incubadora a 37°C. 2) Tubo 2, prerefrigerado a 4°C Identifique este tubo con nombre o apellido y la indicación 4°C. Pipeteé entonces todo el suero disponible y tápelo. Colóquelo en el refrigerador entre los 2°C y los 6°C. Otra posibilidad respecto al tubo 2, sería un tubo graduado para la lectura del criocrito. 1.6 Incubación de los tubos: El tiempo mínimo de incubación es de tres días. A pesar de esto, el tiempo lo marca el tubo colocado en el refrigerador. De hecho, solo cuando el criogel se ha formado completamente se podrá

Esta simple propuesta le permite elevar el porcentaje de muestras tipificables de manera correcta en el campo de estudio dirigido a las crioglobulinas. Preanálisis: materiales y métodos para la tipificación crioglobulinémica. Método: ditiotreitol > 98% (Sigma-Aldrich). Datos sobre el DDT: Ditiotreitol: excelente para conservar los grupos SH en estado de reducción. El DDT esta activo en las muestras amortiguadas para reducir los enlaces disulfuro de las proteínas antes del SDS-PAGE. Puede utilizarse también para reducir los puentes disulfuro de los reticulantes N, N’-bis (acriloilo) cistamina en el gel de poliacrilamida. Es menos intenso y tóxico que el 2-mercaptoetanol. Por lo general, se usa siete veces menos concentrado que el 2-mercaptoetanol, pero tiene el mismo efecto: 100 mM DDT = 5% de 2-mercaptoetanol (5% v/v, 700 mM). Reactivo ditiotreitol de Cleand. C4H10O2S2 FW 154.25 Mp 41 a 44° C 1.1 Toma de muestras El volumen de sangre necesario para la ejecución de las crioglobulinemias es de al menos 10 ml. Efectúese la toma de muestra con un tubo y jeringa precalentada a 37°C.

ID 200223

Electroforesis

333

considerar concluida la fase de incubación. El tiempo promedio de precipitación del criogel va de los 3 a los 7 días. Las muestras de pacientes VHC positivos deben ser refrigeradas por 10 días. 1.7 Ausencia del crioprecipitado Muestras negativas para crioglobulinas. 1.8 Presencia del crioprecipitado Verifíquese visualmente la presencia del crioprecipitado en el tubo refrigerado. Si la inspección es positiva, realice el siguiente punto. 1.9 Centrifugación en frío Centrifugue el tubo con el crioprecipitado a 1600 rpm/30 min a 4ºC. Lectura del criocrito Al finalizar la centrifugación, inspeccione el valor porcentual, con respecto al total, del volumen ocupado por el crioprecipitado, sólo si se utilizó un tubo graduado. 1.10 Determinación de la proteinemia total y/o de las inmunoglobulinas y del complemento fracción 3 y 4 (opcional) Efectúense estas determinaciones en el suero del tubo 1, conservado en la incubadora, y en el sobrenadante del tubo 2, refrigerado y luego centrifugado. La diferencia entre las determinaciones indicará el contenido en concentración de la crioglobulinemia y las posibles clases inmunoglobulínicas involucradas. 1.11 Preparación del amortiguador de fosfato para lavar el crioprecipitado Solución 1: disuélvanse 3.4 g de KH2PO4 (PM 136) en 500 ml de agua destilada. Solución 2: disuélvanse 4.45 g de Na2HPO4.2H2O (PM 178) en 500 ml de agua destilada. Para obtener la solución de lavado final: mézclense 185 ml de la solución 1 y 315 ml de la solución 2.

ID 200223

Electroforesis

Luego agregue PEG 6000 (v/v) para obtener una solución PEG al 13%. Esta solución debe conservarse entre los 2°C y los 6°C. 1.12 Preparación de la solución de ditiotreitol en disolución amortiguadora. Pésense 0.5g de ditiotreitol y disuélvase en 100 ml de amortiguador de fosfato (pH 7.2) o de disolución amortiguadora para electroforesis. Será estable por un año si se conserva refrigerada y protegida de la luz. 1.13 Lavado del criogel El lavado se realiza en el tubo 2, conservado en el refrigerador. • Elimínese con cuidado el suero sobrenadante para no remover parte del crioprecipitado. • Añádase amortiguador de fosfato (pH 7.2), tomado del refrigerador, de la siguiente manera: - Dosifique algunos mililitros de amortiguador de fosfato en el tubo y resuspenda con mucho cuidado el crioprecipitado. - Centrifugue el tubo en frío (4°C), de la misma forma que el procedimiento descrito en el apartado 1.9 “Centrifugación en frío”. - Retire la disolución amortiguadora sobrenadante del criogel. - Repita las operaciones de 3 a 4 veces. - Al término del último lavado, retire la disolución amortiguadora. La muestra preparada ya está lista para la etapa de desagregación. 1.14 Tratamiento de la muestra y de la solución de ditiotreitol antes de la tipificación Mantenga el tubo, bien tapado, con el crioprecipitado lavado en baño maría a 37°C por una hora. Mantenga otro tubo con algunos milímetros de ditiotreitol en disolución amortiguadora en baño maría a 37°C por una hora. 1.15 Dilución del crioprecipitado con la solución de ditiotreitol Método visual En función de la turbidez de la suspensión. Diluciones recurrentes:

334

Muestra muy turbia = 1 parte + 3 partes de ditiotreitol. Muestra turbia = 1 parte + 2 partes de ditiotreitol. Muestra clara = 1 parte + 1 parte de ditiotreitol. Método experimental En base a la diferencia de concentración entre las determinaciones realizadas en el tubo 1 y el sobrenadante del tubo 2, estimamos las siguientes diluciones: 1) Diferencia entre IgG de casi 200 mg/dl, dilución 1:2. 2) Diferencia entre IgM de casi 150 mg/dl, dilución 1:2. 3) Diferencia entre IgA de casi 150 mg/dl, dilución 1:2. 4) Diferencia entre IgG, IgA e IgM igual o menor a 100 mg/ml, dilución 1:1. 1.16 Termostatación de la muestra diluida Conserve las diluciones en baño maría por una hora. 1.17 Termostatación de los accesorios (puntas para micropipetas, portamuestras, etc.). Conserve estos accesorios a 37°C en la incubadora. 1.18 Tratamiento de la muestra para su tipificación Extraiga del baño maría los tubos con las muestras por analizar y colóquelas en un recipiente que contenga agua a una temperatura entre los 38°C y los 40°C. Mediante este método evitaremos que las diluciones contenidas en las probetas sufran variaciones repentinas de temperatura. Diríjase puesto de trabajo y dosifique, rápidamente sin extraer el tubo del baño maría, la muestra en los pocillos del portamuestras desechable. 1.19 Preprograma Crioglobulinas de los instrumentos Interlab. El programa para la inmunofijación de las crioglobulinas tiene las siguientes características: Programa de precalentamiento del gel Permite elevar la temperatura del gel de agarosa a 37°C.

ID 200223

Electroforesis

Así, la muestra crioglobulinémica no sufrirá cambios de temperatura durante la etapa de aplicación. Programa inmunofijativo de crioglobulinas • Temperatura de aplicación de la muestra biológica igual a 37°C. Permite llevar a cabo toda la fase de aplicación a temperatura controlada, para evitar la precipitación del criogel. • Temperatura de 37°C durante la fase de migración. Permite que el criogel migre sobre la urdimbre del gel sin cambios repentinos de temperatura respecto a las fases anteriores de trabajo.

335

APÉNDICE CUARTO

LA INDISPENSIBILIDAD DE LA INSPECCIÓN DE LOS PATRONES PROTEÍNICOS EN ELECTROFORESIS

Interpretación correcta

Electroforesis

337

INSPECCIÓN DE LOS CUADROS ETF PROTEICOS: Como realizarla

ID 200223

Electroforesis

Cómo no realizarla

338

En 1972 un panel experto, durante el octavo Congreso Internacional de Química Clínica, recomendó eliminar la densitometría: La electroforesis de las seroproteínas 1a Recomendación oficial de la Comisión SIBioC, 2005. Giorn. IT. Clin. Vol. 15, N. 1, 1990 F. Aguzzi, D. Fenili, N. Montalbetti, C. Petrini, F. Salvatore, M. Tarantino Después, el Colegio Estadounidense de Patólogos afirmó y publicó en 1999: "El interprete deberá examinar directamente el gel...tanto en la electroforesis de suero como de orina". Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A. Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106) Directriz 1 La importancia de estas recomendaciones es de interés especial para el laboratorio de electroforesis. La posición de estas comisiones científicas se centra en el hecho de que existen diferencias entre la lectura espectrofotométrica (bioquímica clínica) y la densitometría, entendida como fotometría aplicada a una película de áreas co-

“Ver bien para aprender más".

Dalí de espaldas pintando a Gala de espaldas, 1972-73 ¡Porque el arte está en el buen observar! La necesidad de la inspección para identificar anomalías en la migración electroforética. ID 200223

Electroforesis

339

loreadas. Teoría de la lectura espectrofotométrica Los métodos analíticos empleados con mayor frecuencia en bioquímica clínica se basan en mediciones de energía radiante. Las mediciones corresponden a radiaciones obtenidas de la excitación de átomos (fotometría de emisión) o a la energía luminosa absorbida a nivel de la interacción entre las radiaciones y la materia tanto en estado atómico (absorción atómica) como molecular. En este último caso, se tienen los métodos espectrofotométricos en el rango visible y ultravioleta, que se basan, por lo tanto, en el intercambio de energía que se produce entre las radiaciones electromagnéticas y la materia. Naturaleza de la energía radiante Su origen puede definirse con una representación electromagnética y corpuscular (haz de fotones). Una onda electromagnética está compuesta por dos vibraciones sinusoidales que se propagan en el espacio: • una relativa al campo eléctrico. • y otra al campo magnético.

y emisión de energía sólo pueden ocurrir de manera discontinua a través de la adquisición o la cesión de dichos corpúsculos de energía (cuantos): Donde:

E = energía de los fotones h = constante de Plank 6.6256 • 10-27 erg/seg V = frecuencia del oscilador en ciclos por segundo. C = velocidad de la luz. Einstein, a través de la teoría cuantitativa aplicada al fenómeno de emisión, supuso que las radiaciones no sólo son absorbidas y emitidas en forma de cuantos, sino que también se propagan en forma de fotones por el espacio a la velocidad de la luz. La energía de los fotones se calcula con: E= hV Donde: v = frecuencia de vibración de la radiación electromagnética. Es posible conciliar las dos teorías con el postulado de que las radiaciones electromagnéticas implicadas son tanto de la naturaleza de las ondas como de las partículas, y que se manifiesta alguna de las propiedades dependiendo de las distintas condiciones físicas. La radiación se caracteriza por su energía que, a menudo, se indica mediante el parámetro de frecuencia (v) o con el de la longitud de onda (lambda). En su macroaspecto, la radiación se considera como un rayo (paquete de ondas), producto de una fuente, que avanza en un medio en el que puede reflejarse, refractarse, difractarse y polarizarse. La intensidad de la radiación es la energía irradiada por una fuente por unidad de ángulo solido, en un minuto y en una dirección específica. El espectro electromagnético, por lo tanto, está compuesto por un conjunto de ondas electromagnéticas o fotones de energía creciente y puede dividirse esquemáticamente en regiones características.

De la consideración de la radiación de un cuerpo negro a temperaturas diferentes, Plank postuló que la energía de un cuerpo varía de manera discontinua y sólo de un número entero de "cuantos" y que, por lo tanto, la absorción

ID 200223

Electroforesis

340

La espectrofotometría trata justo de la absorción de radiaciones por las moléculas o átomos. Este fenómeno es causa de muchos estudios, tanto cualitativos como cuantitativos. En realidad, la absorción consiste en un intercambio de energía entre radiaciones y materia. Según la teoría cuántica, los estados energéticos de una molécula están bien definidos y cualquier cambio del estado energético requiere una cierta cantidad de energía. Pero, si la energía es transmitida por la radiación, el paso de un estado a otro corresponderá a la absorción selectiva de fotones a una frecuencia bien definida. LEY DE BEER Regula la absorción de la radiación en cada campo del espectro electromagnético, independientemente del mecanismo con que se produce la absorción y del estado físico de la sustancia absorbente. Cuando una radiación monocromática atraviesa una solución, la intensidad, en su totalidad, depende sólo de la concentración (C) de la solución y del espesor (b) atravesado:

Al sustituir las ecuaciones 2 y 3 en la 1 y tras multiplicar ambos términos por -1 obtenemos: (4) Si I0 es la intensidad de la radiación que penetra en la solución e I la que sale, la integración de la ecuación 4 entre los límites: b=0yc=0 para I = I0 b=byc=c para I = I Genera:

Donde: e = coeficiente de extinción molar sí:

La variación de la intensidad (dI) de la radiación es, sin embargo, descrita por la relación: (1) En la que el primer término indica la variación de I en función del espesor (a concentración constante) y el segundo, la variación de I en función de la concentración (a espesor constante). La influencia únicamente de la concentración y del espesor provoca: LEY BOUGNER

(2)

LEY DE LAMBERT

(3)

(5) De la ecuación (5) se deduce que el espesor y la concentración de una solución son términos intercambiables, en el sentido de que se obtienen los mismos resultados duplicando la concentración y reduciendo a la mitad el espesor, así como al contrario. El factor "e" representa la absortividad y todos los términos que lo definen son de las constantes para cada sistema químico. La magnitud A se denomina absorbancia y representa la absortividad de la solución, cuando b = 1 cm y c = 1 mol:

donde kc y kb son dos constantes de proporcionalidad y el signo menos indica la disminución de la intensidad (I) al aumentar c y b.

ID 200223

Electroforesis

341

Donde: y a son el coeficiente de absortividad molar. Resulta, también, que la absorbancia molar es igual a la absortividad molar. La relación I0/I representa la transmitancia y los límites varían entre 0 y 1. La transmitancia porcentual (T%) es dada por: (límites entre 0 y 100) Mientras que los valores límite de A son 0 e infinito. Ya que I = T I0, al sustituir tenemos: Al graficar el valor de A en función de c, debemos obtener una línea recta, cuya pendiente es proporcional a la absortividad. La segunda ecuación puede resolverse mediante:

Y ya que:

o, cuando T = 0 y A = ¥, la solución es del todo transparente e I = I0. De las ecuaciones:

que, graficada, da una recta paralela al eje de las concentraciones (eje x).

; Obtenemos:

sustituyendo:

Absorbancia, transmisión y concentración Las ecuaciones: dan una proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración. Ambas representaciones son aplicables para controlar dentro de que límites, cuando varía c, un sistema químico respeta la ley de Beer. De la ecuación:

ID 200223

Electroforesis

342

Paso de banda del cromóforo / fuente de luz del paso de banda > 10. 2. La concentración del soluto dentro de los límites de la ley de Beer; soluciones diluidas y que no superan la linealidad instrumental. Muy a menudo la linealidad del densitómetro no va más allá de 2.0-2.5 Abs. Esta situación genera lecturas incorrectas cuando la albúmina tiene valores de absorbancia de pico por arriba de la linealidad instrumental. Por ejemplo, el uso del escáner de reflexión, con una respuesta lineal máxima entre 1.6 y 1.8 de absorbancia, implica la necesidad de adoptar curvas de equilibrio vía programas informáticos. Estas situaciones también se reflejan negativamente en las demás áreas, dando lugar a resultados falsos. 3. Las soluciones deben ser ópticamente homogéneas. La homogeneidad de los soportes de agarosa y de las tiras de acetato de celulosa no garantiza una lectura libre de errores aleatorios y sistemáticos. Además, la calidad de la lectura también se ve afectada por: a) la falta de planitud. b) la limpieza. c) la homogeneidad del espesor. d) el paso óptico. 4. La solución de lectura debe estar libre de fenómenos de fluorescencia. En general, los soportes de agarosa presentan ciertas perturbaciones de fluorescencia. 5. El paso de banda luminoso debe ser lo más estrecha en relación con el cromóforo y, además, libre de luz espuria propia y/o generada por la hendidura que redibuja el pincel óptico. El tamaño del pincel óptico de los densitómetros suele ser amplio y las hendiduras ópticas dispersan luz (luz espuria). Esta situación se traduce en haces luminosos de lectura amplios, amplitud que supera la distancia entre las fracciones electroforéticas, dando lugar a bandas de baja resolución, fenómenos de histéresis óptica con formación de intervalos altos entre fracciones y áreas

se deduce que la dependencia entre c y T no es lineal, sino logarítmica. Por lo tanto, mientras A se duplica o reduce a la mitad, la concentración (c) se duplica o reduce a la mitad. En tanto que, para variaciones similares de T, se tienen cambios de (c) iguales a log 2 o a log ½. Aplicaciones de la ley de Beer a los análisis Esta ley es válida sí: 1. La radiación incidente es monocromática. El límite de la monocromaticidad (paso de banda) está relacionado con la siguiente ecuación: paso de banda instrumental (50% T) menor a una decima parte del paso de banda (al 50% T) del cromóforo en lectura. 2. La concentración del soluto dentro de los límites de la ley de Beer; soluciones diluidas y que no excedan la linealidad instrumental. 3. Las soluciones deben ser ópticamente homogéneas. 4. Las moléculas absorbentes deben ser completamente independientes entre sí, es decir, no debe haber ninguna influencia sobre la estructura molecular y, por lo tanto, en los niveles de energía. 5. No deben ocurrir reacciones químicas entre las moléculas del soluto y entre ellas y el solvente u otras sustancias. 6. La solución de lectura debe estar exenta de fenómenos de fluorescencia. 7. La banda luminosa de paso debe ser lo más estrecha en relación con el cromóforo y, además, libre de luz espuria propia y/o generada por las hendiduras que el pincel óptico redibuja. La lectura densitométrica Las lecturas densitométricas de la migración electroforética, ¿respetan todos los puntos antedichos? 1. La radiación incidente es monocromática. Por lo general, los densitómetros no disponen de fuentes de luz monocromáticas que cumplan los requisitos de la relación:

ID 200223

Electroforesis

343

¿Qué hace ignorar las recomendaciones sobre la inspección visual? En la documentación internacional encontramos estudios de comparación entre sistemas electroforéticos. Algunos de ellos se centran en la comparación del desempeño entre métodos de agarosa y capilares. Así, proponemos algunos como prueba de todo lo afirmado hasta el momento, a manera de solución parcial de los errores sufridos por un sistema considerado eficaz y eficiente, es decir, el uso del densitómetro en lugar del ojo humano. Capítulo dedicado a la literatura falaz Primer trabajo • Identificación de proteínas M en suero: Una comparación cuantitativa entre el acetato de celulosa, el gel de agarosa y la electroforesis capilar. Electrophoresis 1997.18, 1775-1780 J. Katzmann y col. Observemos los resultados y como se obtuvieron:

redondeadas, con pérdida de resolución y sensibilidad. Una solución casi total a estos problemas sería equipar los aparatos para electroforesis con espectrofotómetros apropiados; pero, ¿a qué precio? Las diferencias entre la interpretación visual y la lectura densitométrica pueden resumirse en los siguientes puntos: 1) La interpretación visual valora la migración electroforética en toda su extensión longitudinal y transversal, mientras que la lectura densitométrica valora las variaciones de la intensidad del color a lo largo de una línea longitudinal de amplitud igual a la del pincel luminoso de barrido (2-4 x 2-3 mm). 2) La inspección es más decisiva en la búsqueda y hallazgo de posibles subfracciones ocultas en el subfondo de las proteínas policlonales o por las proteínas especificas. En cambio, la lectura densitométrica traduce las formas de las bandas y posibles subfracciones en alteraciones del perfil de la curva, por no olvidar las alteraciones de los perfiles de las curvas causadas por la baja resolución de las impresoras, del monitor, la velocidad de barrido y todos los disturbios del ruido instrumental. 3) La inspección valora las variaciones cuantitativas no sólo comparando la intensidad de una banda respecto a otra y contra el modelo arquetípico estandarizado de lo “normal”, sino también contra cualquier ampliación, contracción, extensión de los márgenes morfológicos, etcétera, contra lo “normal”. La lectura densitométrica interpreta con detenimiento la intensidad del color de las bandas y calcula los valores porcentuales de cada área, así como los valores ponderales. De lo antedicho, podemos comprender lo recomendado por las comisiones científicas sobre la validez de la lectura densitométrica, sobre todo con respecto a la sensibilidad de los componentes monoclonales pequeños dispersos en el fondo policlonal. ¿Cuándo resulta indispensable el gráfico densitométrico? El gráfico densitométrico tiene valor sólo cuando es preciso tener una medición semicuantitativa de una o más proteínas, por ejemplo, albúmina, inmunoglobulina, componente M, etc.

ID 200223

Electroforesis

Análisis cuantitativo de proteínas séricas por CZE 1775 Identificación de proteínas monoclonales en suero: Una comparación de acetato, gel de agarosa y electroforesis capilar Un grupo selecto de 308 sueros fueron analizados por electroforesis capilar (EC), electroforesis en gel de agarosa (EGA) y electroforesis en acetato de celulosa (EAC) y evaluados por anormalidades que podrían sugerir la presencia de una proteína monoclonal. La sensibilidad (una anormalidad electroforética en el suero que contiene una proteína monoclonal) y la especificidad (un patrón electroforético en el suero que no contiene una proteína monoclonal) fueron determinadas en cada procedimiento electroforético. EAC fue el procedimiento más especifico y EC el más sensitivo. El aumento de la sensibilidad de la EC fue ante todo debido al aumento en la detección de crioglobulinas y cadenas ligeras libres. La cuantificación de la zona gamma y/o picos de anticuerpos monoclonales por EC fue similar a los resultados obtenidos por EAC. La cuantificación de picos monoclonales muy largos (> 3.0 g/dl) por la detección de la absorción en línea (EC) dio mayores resultados que la unión al colorante (EGA).

344

mejor expresión electroforética, la migración. 2) El método capilar solo puede dar como resultado un gráfico, siendo esta su mejor expresión electroforética.

Se compararon tres métodos: acetato de celulosa, agarosa y capilar. 2.3 Electroforesis convencional 2.3.1 Electroforesis en acetato de celulosa La electroforesis en acetato de celulosa se realizó de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el Laboratorio Helena en buffer tris barbital (pH 8.8) sobre una membrana de acetato de celulosa con 8 celdas, fijado con una mezcla de ácido sulfosalicilico y tricloroacético, y visualizado con tinción Ponceau S. La cuantificación del área del pico se realizó en un escáner EDC con el programa Helena.

Tabla 2. Sensibilidad y especificidad para detectar proteínas monoclonales en el suero.

2.3.2 La electroforesis en gel de garosa se realizó en geles de agarosa REP SPE-30 premedidas y electroctroforizados en un sistema de electroforesis rápida Helena como se describe en las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Laboratorios Helena). Las proteínas separadas fueron visualizadas con tinción Ponceau S y las áreas pico fueron calculadas con el programa Helena seguido de un barrido densitométrico con el escáner laser Helena EDC.

Se compararon los datos de los gráficos: Aparte de la consideración sobre la calidad de los gráficos densitométricos, calidad que refleja todas las consideraciones negativas antes mencionadas, los autores cometen dos errores groseros: 1) Utilizan el gráfico en lugar de la inspección visual, siendo que poseían la

ID 200223

AE %

CE%

Sensibilidad 8131 sueros monoclonales|)

Especificidad (177 sueros policlonales)

Los resultados para la agarosa son inusuales por las siguientes razones: 1) La tinción era la menos sensible de las disponibles. 2) Los autores afirman que entre las muestras usadas en el estudio existían: Cinco pequeños picos en policlonales incrementados (difícil de observar en un gráfico densitométrico). Siete cadenas ligeras monoclonales entre policlonales normales (difícil de observar en un gráfico). Cuatro cadenas ligeras monoclonales en policlonales incrementados; esto es incluso aún más difícil de observar en un gráfico. En ciertos congresos ECM recientes (Desenzano del Garda 2006, Buenos Aires 2007, Catana y Palermo 2009) proyectaron el siguiente cuadro: El trabajo experimental preveía la toma de 30 muestras con uno más componentes M, todos estrictamente por debajo de los 4 g/l y los 5 g/l. Las electroforesis se realizaron en agarosa y luego se generaron los gráficos correspondientes. Los geles fueron entregados por separado a dos expertos para valorar la presencia y número de componentes monoclonales (inspección del patrón en la tabla). Después de algunos días se les entrego de forma independiente a los mismos operadores los 30 gráficos con la tarea de señalar la presencia y el

Se uso el colorante menos sensible, Rojo de Ponceau S.

Electroforesis

CAE %

345

número de componentes monoclonales (inspección del gráfico en la tabla). Inspección del patrón

Inspección del gráfico

Muestras totales

CM totales

Muestras negativas

Muestras dudosas

Falsos negativos

23%

CM perdido

44%

Comencemos con ciertas anomalías detectadas en la descripción de los métodos: La comparación fue entre el sistema Capillarys β1 + β2 para proteínas del suero y el sistema Hydrasys de 5 fracciones en gel de agarosa, sin separación de la zona beta; situación que afecta la localización de componentes M en la zona beta. En efecto, la presencia de componentes M pequeños en dicha zona puede pasar inadvertida, ya que es insuficiente como para alterar el porcentaje o la morfología de la banda beta. Sin embargo, ¡se seleccionaron 16 muestras porque presentaban un componente monoclonal pequeño en la zona beta! ¿Cómo se realizó la comparación?, ¡entre gráficos!:

¡La comparación entre las dos inspecciones es sintomática de que es un error usar la inspección del gráfico! Segundo estudio:

ID 200223

Electroforesis

346

El cuadro recapitulativo de los autores:

2) Ya que se uso el equipo en gel de agarosa sin separación de la zona beta y, además, se selecciono un total de 30 muestras con componentes monoclonales en la zona beta, alteraron deliberadamente el desempeño real del gel de agarosa. En este caso, hay dos factores negativos para el método en gel de agarosa: el gráfico y la zona beta. En todo el abanico de los trabajos internacionales sobre la comparación entre el método en gel de agarosa y el capilar, los trabajos sobre este tema son más de 45, hay dos que reflejan la importancia de lo mencionado: 1) R. Clark, J.A. Katzmann, R. Kyle, M. Fleisher, J.P. Landers Electrophoresis 1998, 19, 2479-84 2) Automated Serum Protein Electrophoresis by Capillarys Clin Chem Lab Med 2003; 41(5): 704-710; X. Bussuyt y cols. Para completar y además sustentar, por si aún fuera necesario, lo afirmado, he aquí algunos ejemplos prácticos de la inadecuación densitométrica para resolver la cuestión sobre la presencia o ausencia de componentes monoclonales (los componente monoclonales u otras proteínas específicas fueron confirmadas mediante IFE). Primer ejemplo:

ANÁLISIS DE LOS COMPONENTES MONOCLONALES Detectado

Cuantificado

FRACCIONES γ

FRACCIONES β

FRACCIONES α-2

Detectado

Cuantificado

NÚMERO DE PICOS/muestra 1 pico 2 picos Curvas oligoclonales

Comentario: El método en gel de agarosa puso en evidencia 130 componentes monoclonales frente a 135 del método capilar. Los datos obtenidos con el gel de agarosa se consideran inusuales porque: 1) Se compararon los gráficos; método desaconsejado.

ID 200223

Electroforesis

347

En la migración electroforética, presencia de dos CM. En el gráfico, presencia de un CM Segundo ejemplo:

Gráfico libre de C1q inhibidores. Cuarto ejemplo:

En la migración electroforética: presencia de un componente monoclonal anódico a la Tf En el gráfico: se observa una transferrina redondeada, ¿todos los operadores tendrán la sensibilidad para interpretarla? Quinto ejemplo

En la migración electroforética: presencia de un componente monoclonal. En el gráfico: ausencia de componentes monoclonales. Tercer ejemplo, C1q inhibidor:

ID 200223

Electroforesis

348

En la migración electroforética: presencia de un componente monoclonal que modifica la morfología catódica del C3. En el gráfico: ¿cree usted que un experto tenga dudas sobre la zona beta? Sexto ejemplo:

Volumen 346:564-569 Febrero 21, 2002 Número 8 Cantidad inicial de C.M.

Riesgo de evolución a mieloma después de 20 años

0.5 g/dl 1.5 g/dl 2.0 g/dl 2.5 g/dl 3.0 g/dl

14 % 25 % 41 % 49 % 64%

Además, se afirma que: HEMATOLOGY Sociedad Estadounidense de Hematología GMSI y Mieloma múltiple latente: Actualización sobre su patogénesis, historia natural y control S. Vincent Rajkumar Hematology 2005

En la migración electroforética se aprecia un CM en posición catódica al C3 y otro cercano a la zona gamma catódica. En el gráfico, una hipergammaglobulinemia. Una última recomendación a los profesionales del sector es que estudien siempre con detenimiento la migración electroforética de la zona gamma a la alfa 1; todo CM es importante, cualquiera que sea su concentración:

Estudio a largo plazo sobre el pronóstico de las gammapatías monoclonales de significado incierto Robert A. Kyle, M.D., Terry M. Therneau, Ph.D., S. Vincent Rajkumar, M.D., Janice R. Offord, B.S., Dirk R. Larson,

ID 200223

Electroforesis

Porcentaje

Progresión Progresión, teniendo en cuenta la muerte como un riesgo

Riesgo de progresión de las gammapatías monoclonales de origen indeterminado a mieloma o trastornos relacionados en 1148 pacientes

349

Finalmente:

“El laboratorio, además de la responsabilidad de resultados detallados, debe asegurarse, en la medida de lo posible, que estos se interpreten y apliquen en el mejor interés del paciente. Acciones especializadas en la selección e interpretación de los análisis forman parte del servicio del laboratorio”. C6.3 Anexo C: Ética en el laboratorio de medicina Norma ISO 15189:2033(E)

Probabilidad de progresión (%)

Evolución clínica y pronóstico del mieloma múltiple latente o asintomático Robert A. Kyle, M.D., Ellen D. Remstein, M.D., Terry M. Therneau, Ph.D., Angela Dispenzieri, M.D., Paul J. Kurtin, M.D., Janice M. Hodnefield, M.S., Dirk R. Larson, M.S., Matthew F. Plevak, B.S., Diane F. Jelinek, Ph.D., Rafael Fonseca, M.D., Lee Joseph Melton, III, M.D., and S. Vincent Rajkumar, M.D. Volumen 356:2582-2590 Junio 21, 2007 Numero 25

Sin embargo, el gráfico densitométrico resulta indispensable para valorar la concentración de los componentes monoclonales: Colegio Estadounidense de Patólogos Procedimientos para la valoración de los componentes monoclonales Cuantificación del componente monoclonal: la cuantificación se logra mejor mediante el barrido densitométrico de las proteínas monoclonales Valoración del componente monoclonal, pág. 131. David F. Keren, MD Arch. Pathol. Lab. Med.- Vol 123, February 1999 Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A. Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106–107) Directriz no. 3 El control de la concentración de proteínas monoclonales debe realizarse mediante la técnica densitométrica, salvo que no se pueda medir densitométricamente (componentes monoclonales pequeñísimos dispersos en las inmunoglo-

Mieloma múltiple asintomático

GMSI

Años después del diagnóstico

Riesgo de progresión del mieloma múltiple asintomático o gammapatía monoclonal de origen indeterminado a mieloma múltiple activo o amiloidosis primaria en 276 pacientes

Como se describe arriba, el gráfico puede producir ocultación y/o confusión interpretativa. Si se considera importante entregar el gráfico electroforético, recordemos que el comentario es la “firma” conclusiva del informe:

ID 200223

Electroforesis

350

bulinas policlonales o componentes monoclonales ocultos por proteínas específicas). La inmunofijación no deberá repetirse hasta que el componente monoclonal resulte constante, no exista un cambio de movilidad electroforética, un pico adicional, un incremento de la concentración sobre el 20% o la confirmación de la remisión total en el curso del tratamiento farmacológico.

La concentración del componente monoclonal es uno de los criterios de clasificación clínica del estadio del paciente: Mieloma asintomático (criterios diagnósticos) Los criterios diagnósticos se identifican con el estadio primario del mieloma múltiple de la clasificación de Durie y Salmon The Hematology Journal 2003 4,379-398 - BMG Durie y col.      

Criterios Menores  Células plasmáticas medulares 10-30 %.  Componente M: IgG < 35.0 gr/l IgA < 20.0 gr/l BJ < 1.0 gr 24 horas  Lesiones osteolíticas  Supresión de las Ig normales: IgG < 6.0 gr/l IgA < 1.0 gr/l IgM < 0.5 gr/l

Introducción manual de los mínimos |

Para el diagnóstico del mieloma múltiple es necesario 1 criterio mayor más 1 criterio menor o 3 criterios menores, incluidos los dos primeros. The Hematology Journal 2003 4,379-398BMG; Durie y col. Mieloma múltiple: Estadios clínicos según Durie y Salmon, Cancer 1975; 36: 842-854

El uso del trazador cúbico (véase el quinto apéndice).

ID 200223

Electroforesis

Criterios Mayores Diagnóstico histológico de plasmocitoma en la biopsia del hueso o de tejidos blandos. Plasmocitos medulares: > 30%. Componente M: IgG > 35.0 gr/l IgA > 20.0 gr/l BJ > 1.0 gr/24 horas

351

ESTADIO I Todos los siguientes parámetros:      

ESTADIO II Características intermedias entre el I y el II.      

CM IgG < 50.0 gr/l IgA < 30.0 gr/l BJ < 4 gr/24h Hb < 10 gr/dl Ca < 12 mg% Lesiones osteolíticas: 0-1

Masa tumoral baja. A: creatinina < 2 mg%

Masa tumoral intermedia Subclasificación

una concentración de los plasmocitos medulares por debajo del 10%. Sin embargo, no presentan hipercalcemia, anemia, lesiones osteolíticas o fallo múltiple de órganos. El riesgo general de que progresen a mieloma múltiple u otros procesos proliferativos plasmocíticos tratables, es del 1% al año. En el MML los hallazgos clínicos y de laboratorio son similares a los del GMSI, excepto que la concentración sérica de proteínas monoclonales es ≥3 g/dl y/o los plasmocitos de la medula ósea son ≥10%. El riesgo de progresión del MML a mieloma múltiple asintomático o a amiloidosis AL es de casi el 10% anual durante los primeros cinco años después del diagnóstico, de casi el 3% anual durante los próximos cinco años y del 1% anual durante los siguientes 10 años. Así, la probabilidad acumulada de progresión es del 73% en 15 años. Como conclusión de este apéndice consideramos oportuno señalar la “importancia clínica” de cada dato expresado por el laboratorio de bioquímica clínica: En el control de un parámetro es imprescindible conocer, sea cuál fuere, la variación estadísticamente significativa entre dos mediciones del parámetro para no afectar el significado diagnóstico.

ESTADIO III Uno o más de los siguientes parámetros: CM IgG > 70.0 gr/l IgA > 50.0 gr/l BJ > 12 gr/24h Hb < 8.5 gr/dl Ca > 12 mg% Lesiones osteolíticas: >3

Masa tumoral alta B: creatinina > 2 mg%

Progresión a mieloma múltiple: subclasificación de los riesgos para GMSI o MML Las GMSI y las MML son asintomáticas y ambas tiene un potencial muy diferente de progresión a mieloma múltiple. Por definición, los pacientes con GMSI tienen una concentración sérica del componente M por debajo de los 3 g/dl y

ID 200223

Electroforesis

352

APÉNDICE QUINTO la determinación de los componentes monoclonales

¿Cuál es el mejor método? Mínimos manuales y variaciones intra e interoperadores o trazador cúbico y ausencia de variaciones intra e interoperadores

ID 200223

Electroforesis

353

CM mínimos manuales: 1er operador = 12.7%

ID 200223

Electroforesis

2° operador = 10.4%

354

CM mínimos automáticos con el trazador Cúbico: Cualquier operador = ¡Mismo valor!

MML Las GMSI y las MML son asintomáticas, y ambas tiene un potencial muy diferente de progresión a mieloma múltiple. Por definición, los pacientes con GMSI tienen una concentración sérica del componente M por debajo de los 3 g/dl y una concentración de los plasmocitos medulares por debajo del 10%. Sin embrago, no presentan hipercalcemia, anemia, lesiones osteolíticas o fallo múltiple de órganos. El riesgo general de que progresen a mieloma múltiple u otros procesos proliferativos plasmocíticos tratables, es del 1% al año. Los hallazgos clínicos y de laboratorio del MML son los mismos que los del GMSI, excepto que la concentración sérica del componente M es de 3 g/dl, y la de los plasmocitos medulares, del 10%. El riesgo de progresión a mieloma múltiple asintomático o a amiloidosis primaria es de alrededor del 10% anual durante los primeros 5 años después del diagnóstico, de casi el 3% anual durante los siguientes 5 años y del 1% anual durante los siguientes 10 años. Por tanto, la probabilidad acumulada de progresión es del 73% durante 15 años. Los médicos pueden estimar con mayor precisión el riesgo de progresión de las GMSI a mieloma múltiple basándose en tres factores clave: casos con componentes M IgG, tienen menos probabilidades de progresión que aquellos con componentes monoclonales IgA o IgM, aquellos con una concentración del componente M por debajo de 1.5 g/dl, tienen menos probabilidades que

El nuevo método creado por Interlab Todos los componentes monoclonales ocasionales son de significado incierto y sólo tras 4 años de seguimiento se podrá discriminar entre las formas estacionarias y las evolutivas.

Progresión a mieloma múltiple: subclasificación de los riesgos para GMSI o

ID 200223

Electroforesis

355

concentración de proteínas monoclonales (imagen 1B). Además, con un rango más amplio de lo normal para cadenas ligeras libres, se puede refinar el pronóstico de progresión del MML.

aquellos con niveles mayores, y sujetos con una concentración normal de cadenas ligeras libres, tienen menos probabilidades que aquellos con un cociente anormal (imagen 1A). Sin embargo, el riesgo real es menor cuando los factores concurrentes de muerte están incluidos.

Estratificación pronóstica del mieloma múltiple Hoy en día contamos con dos sistemas de estadiaje para estratificar el pronóstico del mieloma múltiple: el sistema Durie-Salmon (DSS) y el sistema internacional de estadiaje (ISS) (Cuadro 4). Ambos predicen la supervivencia li-

ID 200223

Electroforesis

356

bre de progresión y la supervivencia global. Así mismo, otros factores que indican un riesgo mayor son LDH elevado, isotipo IgA, enfermedad extramedular, insuficiencia renal, concentración anormal de cadenas ligeras libres, leucemia plasmocítica y enfermedad plasmablástica.

Sistema Durie-Salmon

monoclonal para afirmar que está en una etapa evolutiva progresiva? De todas las comisiones operantes desde siempre en el sector electroforético, sólo el C.A.P. (Colegio Estadounidense de Patólogos) en 1998, durante el XXXII congreso de Chicago, a través de una revisión colosal del tema estableció un valor porcentual de aumento del componente monoclonal que puede considerarse significativo durante el seguimiento del paciente. Dicho valor del 20% se confirmó en todos los documentos que siguieron al congreso: “Record any increase or decrease in the M-protein since the previous sample. In our laboratory, I like to see a 20% change in the M-component before I note an increase or decrease from the previous sample.” “Regístrese cualquier aumento o disminución del CM respecto a la última muestra. En nuestro laboratorio, es significativo el aumento o disminución del 20% del CM respecto a la muestra previa.” Procedimientos para la valoración de los componentes monoclonales David F. Keren, MD Archivos de Patología Clínica y Ciencias de Laboratorio Clínico, vol. 123, febrero de 1999. Pág. 132: Control de calidad para la valoración de los componentes monoclonales. Como todos sabemos, hoy en día la determinación de un componente monoclonal parte del cálculo de proteínas totales, seguida de la electroforesis de la muestra y, por último, tras la delimitación del componente monoclonal mediante mínimos, se obtiene su determinación como porcentaje del valor en gramos de proteínas totales. Dicho procedimiento también lo citó el “Colegio Estadounidense de Patólogos”: Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Pe-

Tabla 4 Sistema de estadiaje del mieloma múltiple Estadio I Estadio II Estadio III Entre el estadio I Uno o más de los siguientes: Todo lo siguiente: y II Hemoglobina <8.5 g/dl Hemoglobina > 10 g/dl Calcio sérico < 12 mg/dl

Calcio sérico >12 mg/dl

Estudio radiográfico del esqueleto normal o plasmocitoma solitario

>3 de lesiones osteolíticas Gran cantidad de proteínas M IgG >7 g/dl IgA >5 g/dl Bence Jones >12 g/24h

Cantidad muy baja de proteínas monoclonales IgG <5 g/dl IgA <3 g/dl Bence Jones < 4g/24h Internacional β2 microglobulina < 3.5 mg/l Entre el estadio I β2 microglobulina >5.5 mg/l y albúmina sérica > 3.5 g/dl y II

Como no se dispone de una prueba fiable para distinguir las formas benignas de las malignas, la progresión clínica biohumoral (determinación densitométrica) sigue siendo el criterio diferencial más válido: Colegio Estadounidense de Patólogos Procedimientos para la valoración de componentes monoclonales Cuantificación de los componentes monoclonales: “La cuantificación se logra mejor con un barrido densitométrico de las proteínas monoclonales” Evaluación de los componentes monoclonales, página 131 David F. Keren, MD Arch. Pathol. Lab. Med.- Vol 123, February 1999 Durante el seguimiento de los pacientes, ¿cuánto debe variar el componente

ID 200223

Electroforesis

357

ter D. Gorevic, MD; Robert A. Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106–107) Directriz no. 3 El control de la concentración de proteínas monoclonales debe realizarse mediante la técnica densitométrica, salvo que no se pueda cuantificar la densitometría (pequeñísimos componentes monoclonales dispersos en policlonales o componentes monoclonales ocultos por proteínas específicas). La inmunofijación no deberá repetirse hasta que el componente monoclonal resulte constante, no haya un cambio de movilidad electroforética, un pico adicional, un incremento de la concentración sobre el 20% o la confirmación de la remisión total en el curso del tratamiento farmacológico. Ahora analicemos los errores que afectan el proceso de determinación. 1) Un método electroforético en gel de agarosa tiene una variabilidad entre días que respeta el principio de Tonks. El error es del 6%. 2) La determinación de proteínas totales se ve afectada por un error comprendido entre el 3% y el 6%. 3) La determinación de proteínas totales no es específica. Hemos demostrado experimentalmente y presentado al CEFAR 2005/2007 y SIBioC 2007 los siguientes resultados para los métodos de biuret y turbidimétrico: • Las adiciones de 0.5 g/l de albúmina no fueron detectadas. • Las adiciones de 1 g/l hasta 2.5 g/l de albúmina fueron detectadas como incrementos de 0.1 g/l - 0.2 g/l hasta 0.5 g/l - 0.8 g/l. • Las adiciones de 0.5 g/l de IgG-A-M no fueros detectadas. • Las adiciones de 0.5 g/l hasta 1.0 g/l de IgG-A-M fueron detectadas como incrementos de 0.3 g/l. • Las adiciones de 1.0 g/l hasta 2.5 g/l de IgG-A-M fueron detectadas como incrementos de 0.3 g/l a 1.5 g/l. Así que, las variaciones proteínicas inadvertidas, permaneciendo inmutable el valor de proteinemia total, introducen errores en el cálculo porcentual del componente monoclonal equivalentes a un valor promedio del 2%.

ID 200223

Electroforesis

4) La colocación de los mínimos entorno al componente M es un factor de errores de suma importancia. Hemos demostrado experimentalmente (CEFAR 2005/2007 y SIBioC 2007) el tipo de error que un operador o varios operadores cometen al delimitar un pequeño componente M (siguiente imagen):

Variabilidad en la colocación de mínimos Operador 1 3.3 % 3.9 % 4.1 %

Operador 2 4.4 % 5.2 % 4.7 %

Operador 3 5.6 % 4.9 % 4.7 %

∆ = 0.8 % ∆ = 0.9 % ∆ = 0.8 % Media = 3.8 % Media = 4.8 % Media = 5.1 %

Variación % = 22%

Variación Variación % = 17% % = 18%

∆ Max-Min = 2.3% = variación aprox. 50 % Variación % entre operadores = 28 %

A. Ciapini: CEFAR 2005 / 2007 ; SIBioC 2007

Si ahora calculamos el error global, mediante el teorema de la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de cada error, este es el resultado: Error total = a2 + b2 + c2 …. = 32.2 % >> 20 % C.A.P. Dicho valor supera al que el C.A.P. considera suficiente para un cambio significativo del componente monoclonal. Por tal razón, Interlab inició un estudio para reducir el error a un 26%, a fin de implementar la importancia clínica de la determinación del componente M. El desarrollo matemático de un algoritmo capaz de identificar la previsión estadística de la tendencia de la curva representativa del componente M disperso en inmunoglobulinas policlonales, nos permitió eliminar los errores de los puntos 2, 3 y 4, salvo el error de repetibilidad del 6%, correspondiente al sistema electroforético. El trazador cúbico ya opera en toda la instrumentación de Interlab. Cuenta con una búsqueda automática de base neuronal, para detectar modificaciones

358

en la tendencia subsiguiente de los puntos de lectura fotométrica, que luego generaran el gráfico, que puedan sugerir la presencia de una banda homogénea (CM). El trazador cúbico adquiere 10688 puntos en densidad óptica (cada punto es definido por dos coordenadas que son la D.O. y la posición en décimas de milímetro de distancia recorrida por el lector óptico) que permiten una búsqueda mucho más específica y sensible de variaciones en la tendencia (perfil) de la curva, que será expresada de forma gráfica por sólo 512 puntos. Es decir, lo que el operador ve siempre es una representación a escala de 512 puntos, pero los cálculos se realizan después del análisis de la tendencia de 10688 puntos. Sigue un ejemplo de la descripción, por el trazador cúbico, de un CM graficado, donde puede apreciarse su identificación en el ámbito policlonal, su descomposición en puntos (D.O. y mm) y la función del cálculo integral del área:

En el caso anterior, la representación es una campana simétrica. Esta situación es solo ocasional y relativa al ejemplo real observado, en el que el gran componente monoclonal esta al centro de la policlonalidad, determinando la simetría declinante de los hombros hacía la línea base. La situación por lo general es diferente, porque la dispersión del componente M en la policlonalidad heterogénea determina tendencias regresivas asimétricas de los hombros:

ID 200223

Electroforesis

359

¿El trazador cúbico puede sustituir la inspección visual? Esta función es un auxiliar en el análisis de la determinación y, a veces, en la búsqueda de componentes monoclonales, pero no sustituye la inspección directa de la migración electroforética que, en cualquier caso, debe ser efectuada por un experto: En 1972 un panel de expertos en el octavo Congreso Internacional de Química Clínica recomendó eliminar la densitometría. La electroforesis de las seroproteínas: 1a recomendación oficial de la comisión SIBioC. Giorn. IT. Clin. Vol. 15, N. 1, 1990 F. Aguzzi, D. Fenili, N. Montalbetti, C. Petrini, F. Salvatore, M. Tarantino Directrices para la valoración clínica y de laboratorio de pacientes con gammapatías monoclonales David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A. Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD (Arch Pathol Lab Med. 1999;123: 106) Directriz 1 "El interprete debe examinar de forma directa el gel...tanto en la electroforesis de suero como de orina". La colocación de los mínimos. La identificación de componente monoclonales en el gráfico densitométrico:

La imposición normal de los mínimos manuales.

El componente monoclonal descrito por el trazador cúbico. Pero, ¿qué es el trazador cúbico? Es la mejor ecuación para estudiar la regresión curvilínea de los puntos:

Resultado de la interpolación con el trazador cúbico Regresión de las mismas coordenadas con:

Interpolación polinomial de 2° grado

Interpolación con el trazador cúbico

Este caso subraya la potencia de está función de una manera incuestionable.

ID 200223

Electroforesis

360

El enfoque clásico de la regresión

El enfoque polinomial de la regresión

En este enfoque se supone que la relación entre la variable dependiente (x) y la explicativa (y) puede describirse mediante un modelo lineal. En algunos caos se observa una simplificación excesiva

A = nódos de interpolación B = conexión densitométrica tradicional C = trazador cúbico aplicado a los datos densitométricos

Ejemplo de una interpolación mediante trazador cúbico de quinto y de noveno grado

El enfoque polinomial de la regresión

En este enfoque se considera que la relación entre la variable dependiente (x) y la explicativa (y), nodos de interpolación, puede describirse mediante un modelo no lineal (Horner, Lagrange, Newton, Runge...)

Curva rosa (Runge) = trazador de er 3 grado Curva azul = trazador de 5° grado Curva verde = trazador de 9° grado Sólo el trazador de 3er grado ofrece una interpolación eficaz

Ecuación polinomial de 3er grado

ID 200223

Electroforesis

361

El estudio experimental: error de reproducibilidad

¿Qué es la interpolacion mediante un trazador cúbico?

M ínimos manuales

Conectar dos puntos sucesivos con una ecuación de tercer grado:

Y= a + bx + cx2 +dx3 respetando dos condiciones: 1) La conexión entre un punto y el sucesivo debe ser curvilínea.

Spline c úbico

10 replicas de inserción mínima en la misma muestra

Media CM g/l

CV %

Media CM g/l

CV %

Operador 1

3.3

2.1

Operador 2 Operador 3

4.1

2.3

2.1 2.1

<1 <1

Diferencia máx.

1.8

Replicas = 30 Todos los operadores

2) El área subtendente entre dos puntos debe ser lo más mínima posible

3.23

19.1

2.1

Componente monoclonal pequeño = 2.1 g/L

El cumpliminto de estas dos condiciones evitará anomalias en la conexión entre dos puntos sucesivos

b) El algoritmo describe detenidamente la regresión del componente monoclonal (véanse las figuras anteriores) en el campo policlonal, en virtud del cálculo de la tendencia a la regresión de los zonas de la curva comprendidas entre el pico del componente monoclonal y las pendientes laterales, zonas delimitadas en la parte inferior, sobre la línea de base, por puntos de inflexión; calculo que ocurre a través el ángulo de inclinación de la curva que pasa entre el pico y el punto de inflexión en la transición policlonal.

Además, en el cálculo de la regresión polinomial, el componente M es descrito asumiendo que los puntos de inflexión, del mismo dentro del ámbito policlonal, son los puntos pico, y el pico del componente M es el punto mínimo:

Las funciones matemáticas de la búsqueda de los puntos de inflexión del CM, disperso en los policlonales

Segunda derivada en los puntos de inflexión que se convierten en puntos de máximo. El valor del pico del CM se convierte en cruce por cero o mínimo.

Las ventajas del algoritmo trazador cúbico. a) Cualquier operador encontrará el mismo valor del componente M.

ID 200223

Electroforesis

362

c) Permite una comparación exacta entre los resultados del seguimiento (diez réplicas de la electroforesis sérica y urinaria de la misma muestra):

Lo sperimentale: simulazione Elstudio estudio experimental: simulacióndi follow up su Siero del seguimiento en Suero Minimi manuali Mínimos manuales

Spline cubica Spline cúbico

n = 10

Media CM g/l

CV %

Media CM g/l

CV %

CV% Media Integral 166 6.2

Operador 1

2.10

15.1

2.41

7.82

Operador 2

1.24

33.2

2.41

7.82

6.2

Operador 3

1.24

34.5

2.41

7.82

6.2

Diferencia máx.

Aprox. 1

e) El programa cuenta con una función correctiva que permite ajustar la concentración de cada componente M obtenida con el sistema preexistente, cuando usted decida utilizar el nuevo instrumento que posee este algoritmo. Bastará con leer la electroforesis más reciente, efectuada con el sistema electroforético reemplazado, con el nuevo equipado con el trazador cúbico. La secuencia de operaciones que el laboratorio debe realizar es esta: 1) Determinar, sólo la primera vez que se detecta positiva la muestra, y si se desea, las proteínas totales de la muestra portadora del componente M. 2) Ejecutar la electroforesis.

Componente monoclonale piccola = 2.4 g/L Componente monoclonal pequeño = 2.4 g/l Nota: los valores de CV incluyen la variabilidad del sistema ETF

Lo sperimentale: simulazione Elstudio estudio experimental: simulacióndi follow up su Siero del seguimiento en Suero Minimi manuali Mínimos manuales

Spline cubica Spline cúbico

n = 10

Media CM g/l

CV %

Media CM g/l

CV %

CV% Media Integral 166 6.2

Operador 1

2.10

15.1

2.41

7.82

Operador 2

1.24

33.2

2.41

7.82

6.2

Operador 3

1.24

34.5

2.41

7.82

6.2

Diferencia máx.

Aprox. 1

3) Examinar la migración electroforética e identificar la zona donde se encuentra el componente monoclonal.

Componente monoclonale piccola = 2.4 g/L Componente monoclonal pequeño = 2.4 g/l Nota: los valores de CV incluyen la variabilidad del sistema ETF

d) Proporciona el valor “integral” (número de fotones absorbidos por el componente monoclonal), número independiente del cálculo porcentual y, por tanto, el control real del seguimiento (véase más adelante).

ID 200223

Electroforesis

4) Examinar el gráfico densitométrico para identificar la zona donde se vio

363

el componente monoclonal, delimitarla más o menos con dos mínimos y solicitar el cálculo al programa informático.

6) El valor integral es la piedra angular del sistema. Este valor no es otro sino la suma de los valores en D.O. (en el ejemplo el valor es 135): 5) El programa buscará los puntos de inflexión que delimitan el componente monoclonal, calculará la tendencia estadística de las pendientes de los flancos del componente monoclonal, describirá sobre el gráfico la curva del componente monoclonal y facilitará tanto el valor porcentual, como el valor en gr/l y el integral del área del componente M.

7) En el archivo del paciente positivo para CM, se registrarán los valores: porcentual, gr/l e integral.

ID 200223

Electroforesis

364

El programa identifica los puntos de inflexión del CM y, en función de las pendientes - coeficientes angulares - del CM, describe la superficie (verde) ocupada por el CM: 7.6% del área total x 70 g/l de P. Tot. = 5.0 g/l del CM; Integral = 454 (véase la siguiente figura).

8) En el seguimiento del paciente que se presenta una vez más al control para saber si el CM es estable o no, el laboratorio realizará de nuevo la electroforesis o el procedimiento normal: proteínas totales. 9) Leerá la migración electroforética con el densitómetro y solicitará al programa calcular el CM. El operador deberá controlar, además del valor porcentual, el valor integral del CM. Si el valor está dentro del 5% (+ o -) del valor integral anterior, el CM será estable. Si el valor excede esta oscilación, el CM se considerará en progresión, o en remisión si disminuye. El laboratorio también puede conservar el proceso clásico pero con la incorporación del valor integral. 10) Si dicho valor varía más del 5% en + o -, una simple proporción entre valores integrales - relación entre el penúltimo y el último valor integral, multiplicado por el primer valor en g/l - dará el valor actual en g/l. Con este simple procedimiento se eliminan los errores de: 1) La determinación de proteínas totales como error de reproducibilidad. 2) La determinación de proteínas totales como insensibilidad a las variaciones de inmunoglobulinas y de otras proteínas. 3) La variabilidad del operador u operadores al colocar los mínimos en torno al componente M. Ejemplo práctico: La inspección de la electroforesis reveló una banda homogénea en la zona gamma central. El barrido densitométrico de la muestra es solicitado: se coloca un mínimo a la derecha y otro a la izquierda de la zona afectada.

ID 200223

Electroforesis

Durante el seguimiento del mismo paciente, calcúlese únicamente el valor integral del paciente. Podemos distinguir tres casos diferentes: 1) Valor integral estable, comprendido entre 430 y 478 (+/- 5% de 454). Componente M estable a 5.0 g/l. 2) Valor integral varió a 590, CM en progresión. Cálculo del CM en g/l: 590/454 = 1.3; 1.3 x 5.0 g/l de la 1a determinación = 6.5 g/l, nuevo valor.

365

3) Valor integral varió a 300, CM en remisión. Calculo del CM en g/l: 300/454 = 0.66; 0.66 x 5.0 g/l del primer ensayo = 3.30 nuevo ensayo. Con el procedimiento descrito se evitan los errores de los puntos 1, 2 y 3 anteriormente expuestos. Como una alternativa al procedimiento se puede trabajar con un método estándar: proteínas totales, valor porcentual, valor en g/l y control integral. La inmutabilidad del valor integral Como primera conclusión de esta nota informativa, sobre el nuevo y original método para la determinación de los componentes monoclonales, queremos demostrar la inmutabilidad del valor de integral (valor del componente monoclonal) a los cambios de la disposición proteica del paciente. Supongamos que el paciente del caso anterior presenta una reducción progresiva de inmunoglobulinas policlonales, que simularemos con la eliminación de un área del gráfico. Con los procedimientos normales de cálculo, vista la insensibilidad de los métodos para la determinación de proteínas totales, ejemplos reportados al principio de la relación presente, y la conservación del valor de proteínas totales inalterado, pero disminuida la cantidad de inmunoglobulinas policlonales, el componente monoclonal ocupará un valor porcentual mayor. Así parecería incrementado, pero en realidad es el mismo. En nuestra simulación hemos eliminado un área de la zona gamma.

Como puede apreciarse, el porcentaje del componente monoclonal aumentó de 7.1 a 7.7, mientras que el valor integral se mantiene en 454. Esto indica que el valor integral no fue afectado por ningún parámetro y, por lo tanto, es un valor absoluto. Como segunda y última conclusión, presentamos la determinación de un componente monoclonal calculado con el método convencional: la colocación de mínimos a discreción. En la siguiente imagen el primer operador determinó que el componente monoclonal era de 5.3%.

El segundo operador determinó que era de 3.4%.

ID 200223

Electroforesis

366

La solución básica factible es la adopción del algoritmo trazador cúbico. El mismo hospital realizó el siguiente estudio: • Fueron seleccionados 49 sueros procedentes de pacientes hospitalizados y ambulatorios externos, caracterizados por componentes monoclonales de diferente magnitud. • Cinco operadores realizaron en cada suero una cuantificación densitométrica manual del componente monoclonal y otra con el trazador cúbico. • Se calculó el CV de las cuantificaciones densitométricas manuales de lo cinco operadores. • Los 49 pacientes fueron divididos en tres grupos en función de la cuantificación en g/l del componente monoclonal y, por cada grupo, se calculó el CV promedio de las cuantificaciones manuales. • Cuantificación manual: CV promedio de las cuantificaciones manuales (5 operadores):

El lector intuirá, basándose en la falacia del método, a discreción e interpretación personal, cuánto varía la concentración dependiendo del criterio de quien valora. Como última confirmación de cuánto puede afectar la interpretación del operador en la determinación de los puntos de inflexión en torno a un componente monoclonal, presentamos los resultados obtenidos en un hospital donde cinco graduados se turnaron en el control de los cuadros electroforéticos:

0 - 5 g/l 5 - 15 g/l > 20 g/l

Trabajo hospitalario de rutina Muestra

Operador 1

Operador 2

Operador 3

Operador 4

Operador 5

1 2 3 4 5 6 7 150 mo

5.7 7.8 16.3 28.1 9.7 41.4 12.5

4.2 7.8 19.8 30.1 9.6 41.8 11.8

4.4 6.9 17.2 30.0 10.9 42.5 10.3

1.4 5.4 16.6 24.3 10.5 40.7 7.6

4.4 6.0 14.6 23.7 8.8 37.1 8.8

0 - 5 g/l 5 - 15 g/l > 20 g/l

Extracto de un estudio realizado en el Hospital Fatebenefratelli, Isla Tiberina, Roma Responsable: Dr. M. Cortesi

Rango 8.8-62.7 5.1-49.8 5.1-11.3

CM 33 11 5

CV promedio 0 0 0

Rango 0 0 0

Conclusiones • Anulación de la variabilidad intraoperatoria en la determinación manual de los mínimos de un componente monoclonal. • Mayor precisión y exactitud respecto a la determinación manual de los mínimos de un CM.

La diferencia intra e interoperadores rebasa el 20%

Los componentes monoclonales, ¿son estables o están en progresión?

ID 200223

CV promedio 33.7 20.5 8.7

Los resultados con el trazador cúbico:

Electroforesis

CM 33 11 5

367

• La posibilidad de un control electroforético a través de los valores integrales. • La posibilidad de calcular automáticamente la diferencia crítica en la cuantificación de un componente monoclonal entre dos electroforesis del mismo paciente en tiempos diferentes. • Fácil de usar y flexible en relación con la necesidades del usuario. • Capaz de una valoración precisa y exacta del componente monoclonal. • Libre de errores por el/los operador/es o empleados. • Resultados metodológicamente comparables a través del tiempo. • Capaz de producir resultados confiables sobre la estabilidad o progresión del componente monoclonal. En otro hospital se valoró la variabilidad global del sistema (variabilidad electroforética + variabilidad del operador en el seguimiento): Muestra con CM en policlonales normales:

Muestra con componente monoclonal y policlonales deprimidos:

La reducción de la variabilidad en la definición cuantitativa del componente monoclonal es evidente cuando se aplica el algoritmo trazador cúbico. Presentamos un caso clínico de un hospital: el paciente fue controlado mediante la determinación manual del componente M del 2003 al 2006: SÍNTOMAS Y EXAMEN OBJETIVO HEMOGLOBINA g% CALCIO g% CREATININA g% PLASMOCITOS MEDULARES % PROTEÍNAS TOTALES g/l / PORCENTAJE SÉRICO BJ orina 24h PCR-HS mg%

Muestra con CM y policlonales aumentados:

21/05/03

28/09/04

28/02/05

21/02/06

21/04/06

14/09/06

07/06/07

AUSENTES

14.4 9.0 0.7

14.0 9.3 0.9

14.3 9.1 0.80

13.8 9.3 0.60

9.5 0.80

14.0 9.1 0.80

14.5 9.0 0.85

5% 78

ID 200223

368

0.40

0.36

0.43

0.45

0.43

0.47

AUSENTES

0.060

0.070

0.069

Estos son los resultados de las determinaciones:

Electroforesis

8% 79

0.066

0.068

0.074

Caso clínico: seguimiento electroforético 21/05/2003

Cuantificación manual

28/02/2005

13/04/2005

Caso clínico: seguimiento electroforético

21/02/2006

14/09/2006

14% CM 11.3 g/l

21/04/2006

+ 38%

23/06/2007

¿CM ESTABLE O EN PROGRESIÓN?

16% CM 10.1 g/l 20.9% CM 16.1 g/l 13.3 CM 10.3 g/l 15.8% CM 12.6 g/l

14/09/2006

21.8% CM 18.3 g/l

13.1% CM 10.3 g/l 15.8% CM 12.6 g/l

Entonces, el paciente fue controlado con el trazador cúbico (mismo instrumento, pero con el programa informático actualizado) y el control del valor electroforético del componente monoclonal con la lectura del último informe obtenido sin el trazador cúbico.

El seguimiento medular disipará cualquier duda:

Caso clínico: seguimiento electroforético CRESTA ILIACA POSTERIOR DERECHA Julio 2007

Caso clínico: seguimiento electroforético

Descripción macroscópica Fragmento osteomedular de 1.2 cm de largo

Cuantificación a través del trazador cúbico

El trazador cúbico es el algoritmo polinomial de tercer grado para el cálculo de los mínimos y de los máximos de un pico monoclonal. Identifica los puntos de inflexión del CM y, en función de la pendiente, describe la superficie ocupada. Calcula el valor integral que representa la suma de la D.O. de los fotones absorbidos por la tinción fijada a las proteínas que componen el CM. En el seguimiento del paciente se puede valorar y comparar el valor integral. Reducción de la variabilidad interindividual en la cuantificación de los CM.

14/09/2006 21.3% CM 17.8 g/l

Descripción microscópica El fragmento enviado está constituido por el 50% de su longitud de tejido osteoesclerótico. El 50% restante del fragmento (0.6 cm) está ocupado por tejido medular hematopoyético con celularidad de entre el 35% y el 45%. La población hematopoyética trilineal está normorepresentada. La tinción inmunohistoquímica para CD 138 reveló la presencia de una Proporción de células plasmáticas entre el 20% y el 25%. Marco morfológico e inmunohistoquímico compatible con el llamado “Mieloma Latente”.

23/06/2007 21.8% CM 18.3 g/l

Conclusiones del caso clínico presentado:

CV cuantificación % = 1.64 CV cuantificación CM g/l = 1.96

Como se puede ver, la diferencia entre las dos determinaciones parece significativa y la siguiente pregunta es: ¿El trazador cúbico ha sugerido acertadamente una fase progresiva?

ID 200223

Electroforesis

369

Caso clínico: seguimiento electroforético 14/09/2006

23/06/2007

15.8% CM 12.6 g/l

21.8% CM 18.3 g/l

CORRELACIÓN ADECUADA ENTRE EL TRAZADOR CÚBICO Y LA EVOLUCIÓN CLÍNICA QUE RESULTA EN UNA PRECISIÓN MAYOR EN LA DEFINICIÓN DE LA ESTABILIDAD O PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD

Otras aplicaciones de la función trazador cúbico En caso de que el operador esté interesado en recibir los valores de las áreas electroforéticas de una muestra en particular, sin valores espurios que el gráfico implica (los valles entre áreas, presentes por el tamaño del haz de luz de lectura en relación a la distancia entre dos fracciones sucesivas, los fenómenos de histéresis óptica y gráfica), es posible solicitar a la función trazador cúbico valorar cada área y el conjunto de estas con los valores porcentuales, en g/l e Integral:

Aún en el caso anterior. Si el operador decide estudiar la distribución de la policlonalidad gamma y determinar que tanto migró bajo el C3 y Tf para definir si se trata de una hipogammaglobulinemia real, puede solicitar la ayuda del trazador cúbico:

Resumen sobre la regresión no paramétrica Prólogo La interpolación es el proceso de identificación de una función, a menudo un polinomio, que pasa por un conjunto determinado de puntos (x, y).

En caso de que la inspección del engrosamiento de una zona gamma deprimida deje algunas sospechas, es posible socilitar la ayuda del trazador cúbico:

ID 200223

Electroforesis

370

Puntos soporte Definición: los puntos (xi, yi) utilizados por el procedimiento de interpolación se llaman puntos soporte. A menudo, para identificar los parámetros de un modelo de interpolación f (x, a), se utilizan N puntos soporte y se resuelve el sistema: en N incógnitas. Elección del modelo El modelo utilizado para la interpolación exacta ha de tener las siguientes características: 1. Debe representar de la mejor manera la función que se desea describir. 2. Debe ser fácil de usar. 3. Debe requerir un tiempo reducido de cálculo para su valoración. 4. Los parámetros deben ser fácil y unívocamente calculables. Por consiguiente, la clase de funciones que responde mejor a las especificaciones mencionadas es la de los polinomios: Pn (x) = a0 + a1 x + a2 x2 + ..... an xn Los polinomios de tercer grado son los que más protegen la regresión lineal polinomial aplicada a la solución específica de la regresión electroforética, siempre que se cumplan dos condiciones: a) Los puntos sucesivos deben estar conectados de manera curvilínea. b) El área subtensa de los puntos sucesivos debe ser lo más pequeña.

Propósito de la interpolación 1. Sustituir un conjunto determinado de puntos {(xi, yi)} con una función analítica. 2. Aproximar una función con una más simple. En general, se utiliza un polinomio o una serie de polinomios en tiempos. Una vez identificada la función analítica que pasa por el conjunto de puntos, es posible calcular el valor de la función en un nuevo punto dentro del intervalo. Esta acción se denomina: interpolación. Si, al contrario, se desea conocer el valor de la función en un punto fuera de los extremos de la interpolación, esta operación se denomina: extrapolación. 1. Sustituir un conjunto determinado de puntos {(xi, yi)} con una función analítica. Los datos precisos pueden proceder de una clase de funciones, por ejemplo: p(x) = a0 + a1e2x +... anenx

Trazador cúbico

El objetivo es identificar la función miembro de la clase antedicha por medio de la determinación de los coeficientes {aj} según los puntos establecidos. 2. Aproximar una función con una más simple. Tener disponible una función más simple que la de base, por lo general un polinomio, permite simplificar ciertas operaciones, tales como la derivación o la integración.

ID 200223

Electroforesis

Esto es para evitar soluciones regresivas erróneas.

371

Además, la eficacia de la regresión no es directamente proporcional al grado del polinomio:

Si en cambio se considera una función no lineal en los parámetros, el cálculo de estos será muy complejo y suele requerir procedimientos computacionales iterativos. Ejemplo de relaciones no lineales Pensemos en la relación entre la edad (X) de un individuo y su tasa de crecimiento (Y). Es evidente que la relación entre las dos variables en el primer año de vida es muy diferente de la que se tiene cuando el individuo es adulto. En general, se ha observado que la relación entre estas dos variables puede expresarse más correctamente a través de una función exponencial negativa, es decir, considerando como componente determinista la función no lineal f(X) = exp (-bX). Ejemplos de funciones lineales en los parámetros y no lineales en las variables Ejemplos de funciones no lineales en las variables y lineales en los parámetros: f (Xa+bX+cX2 o bien, f (X1, X2) = a + b + c log(X)2. Tenga en cuenta que todos los parámetros (a, b, c) son lineales de primer grado. Si conocemos los valores concretos de X, entonces también conocemos los valores de X2, X4 y log(X). Si por ejemplo partimos de Z = X2 y lo sustituimos en la primera función obtenemos f(X=a+bX+cZ), ya que los valores de Z son conocidos, entonces la función es lineal en los parámetros y en las variables. Como se muestra en el ejemplo, si tenemos una función lineal en los parámetros pero no en las variables, podemos transformarla de manera fácil en una función lineal tanto en las variables como en los parámetros. Adaptación de funciones no lineales en las variables Consideremos el siguiente gráfico de dispersión relativo a la variable dependiente Y y a la variable explicativa X, en el que también hemos trazado la recta de regresión estimada.

Acercamiento a las funciones no lineales de regresión Funciones no lineales y cálculo de la adaptación La hipótesis del modelo clásico de regresión lineal simple o múltiple sugiere que la relación entre la variable dependiente y las variables explicativas puede sintetizarse mediante una función lineal en los parámetros. Por lo general, suelen adoptarse modelos de regresión lineales en relación con las variables. En determinados casos, dichas hipótesis de linealidad representan una simplificación excesiva. Ya que las determinaciones de las variables son conocidas (también en este capítulo consideraremos variables explicativas no estocásticas), y los parámetros desconocidos, resulta evidente que las hipótesis de no linealidad en los parámetros son más difíciles de tratar matemáticamente. De hecho, si la no linealidad concierne las variables explicativas y no los parámetros, tenemos una situación relativamente simple: en todos los casos en que se ajusta la función adoptada, el procedimiento de cálculo de los parámetros a través del método de interpolación de los mínimos cuadrados es del todo similar a lo visto para la regresión lineal simple y múltiple.

ID 200223

Electroforesis

372

En la figura 3 hemos representado el polinomio de grado 4: mientras que en la figura 4 hemos considerado el polinomio de grado 5: En el ejemplo anterior podemos observar que, aún tomando en cuenta sólo la variable explicativa, se puede optar por un modelo lineal en los parámetros, pero no en las variables, capaz de sintetizar la compleja relación no lineal entre la variable dependiente y la explicativa. Al incrementar la complejidad del modelo (en el ejemplo 3, el grado del polinomio), incrementa la adaptación de la función a los datos. Esto, sin embargo, no es necesariamente una ventaja, incluso si, a la luz de lo que se ha dicho, esta afirmación pudiera resultar bastante extraña: básicamente, en el tratamiento de la regresión lineal, tuvimos siempre como objetivo fundamental aumentar lo más posible la adaptación de la función de regresión a los datos. Es necesario en este punto ver un nuevo concepto: la adaptación excesiva de la función a los datos, también llamada sobreajuste. Si observamos la figura 4, podemos en efecto notar en la parte inicial de la curva una mayor adaptación a los dos primeros puntos del gráfico, es decir, los de abscisa más baja. La forma de la curva parecería sin embargo sugerir que por valores muy bajos de X deberíamos esperar un rápido, por improbable que sea dicho supuesto, crecimiento de la Y. En realidad, los polinomios de alto grado tienden a aproximarse mucho a los puntos del gráfico de dispersión, pero, de este modo, también tienden a amplificar el error presente en los datos. El problema es conocido como “equilibrio entre sesgo y varianza”. La función que buscamos debe comprender sólo los aspectos fundamentales de la relación entre las dos variables y dejar de lado los aspectos menos significativos o accidentales, ya que sólo de este modo podemos obtener una función “generalizable”, es decir, una función que debería conservar una buena adaptación, incluso tomando en consideración otra muestra de datos o toda la población. Si consideramos todas las posibles funciones lineales en los parámetros o li-

La ecuación de la recta de regresión estimada, representada en la figura 1, es dada por: Y = -337,1 + 116,8 X Sin embrago, no es difícil notar en el gráfico que la relación entre las dos variables podría ser descrita mejor por una función no lineal. Si consideramos el siguiente polinomio de grado 3: Y = -213 + 80.2 X – 1.3 X2 + 0.22 X3, obtenemos el gráfico de la figura 2. Esta función parece comprender satisfactoriamente las características de la relación entre Y e X. Por otra parte, cabe considerar una función incluso más compleja para obtener una adaptación aun mayor a los datos observados:

ID 200223

Electroforesis

373

nealizables, tendremos disponibles una gran variedad de funciones, entre las cuales es probable que exista una que se adapte satisfactoriamente a los datos observados y que podría ser apropiada para describir la relación entre la variable dependiente y la explicativa. Sí la función más adecuada no es lineal o linealizable, pero es conocida, es posible aplicar los métodos apropiados de cálculo para la estimación de los parámetros. Por otra parte, si los conocimientos del fenómeno son insuficientes para identificar un sistema interpretativo preciso, entonces aún no existe una metodología eficaz capaz de identificar, entre todas las posibles funciones (lineares o linealizables), la que mejor se adapte a nuestros datos. Además de esto, es necesario tener presente que algunas funciones, como por ejemplo, las polinomiales, pueden adaptarse muy bien a los datos, pero al precio de una gran inestabilidad y una compleja interpretación del modelo. Esto implica que variaciones pequeñas en los datos pueden generar polinomios completamente diferentes. Hemos comparado a este respecto los coeficientes de los polinomios del ejemplo 3. Las funciones no paramétricas de 3er grado y su plasticidad En un estudio sobre diabetes mellitus se desea averiguar la dependencia del nivel del péptido C sérico por otras variables, entre ellas la edad y el déficit básico. El logaritmo de la concentración del péptido C es la variable dependiente. En el gráfico de dispersión consideramos como variable explicativa la edad, representando tanto la línea de regresión de ecuación: f(X) = 1,377 + 0,019 X como la polinomial, de ecuación: f(X) = 1.05 + 0.170X + 0.0172X2 + 0.001X3 Se puede notar una evidente mejoría de la adaptación a los datos utilizando la polinomial. Este modelo pone a la luz una relación entre la edad y el logaritmo de la concentración del péptido C, que aumentó durante unos 7 años y luego permaneció casi constante.

ID 200223

Electroforesis

Conclusiones Por primera vez en el panorama internacional electroforético, Interlab ha desarrollado un programa informático “trazador cúbico” capaz de armonizar los resultados en el laboratorio y, potencialmente, entre laboratorios donde se utilice la misma instrumentación, o bien, el factor reequilibrante del componente monoclonal mediante la lectura de la última electroforesis, del equipo electroforético preexistente, con el nuevo sistema electroforético Interlab para reajustar la concentración del componente monoclonal y continuar con el seguimiento sin perder los datos del historial del paciente.

374

APÉNDICE SEXTO la proteína de Bence jones

Túbulo conector

Túbulo contorneado distal

NEFRONAS CORTICALES: 85%

Túbulo contorneado proximal

NEFRONAS YUXTAMEDULARES: 15%

Corpúsculo renal: cápsula de Bowman y glomérulo

Zona cortical

DIFERENCIAS MORFOLÓGICAS POSICIÓN TAMAÑO GLOMERULAR LONGITUD DEL ANSA DE HENLE DIFERENCIAS FUNCIONALES VELOCIDAD GLOMERULAR DE FILTRACIÓN TRANSPORTE TUBULAR Zona medular CONTENIDO DE RENINA externa

a) Su relación con la funcionalidad renal b) Las directrices de la SIBioC c) La BJ y la contrastografía

Zona medular interna

El papel de las nefronas corticales y yuxtamedulares.

ID 200223

Electroforesis

375

Conducto colector cortical Túbulo recto proximal

Túbulo recto distal

Conducto colector medular externo Rama descendente delgada

Conducto colector medular interno

Rama ascendente delgada

efervescente, toma un color rojizo y se vuelve bastante clara, pero, cuando se enfría, adquiere la consistencia y el aspecto que se ve. Calentar y relicuar. ¿Qué puede ser? En los dos meses siguientes el paciente se mostró demacrado, débil, y fue atormentado por el dolor. Murió el 1° de enero de 1846, en plena posesión de sus facultades mentales. Luego, el Dr. MacIntyre publicó en 1850, post-mortem del paciente, el análisis y la descripción de las orinas enviadas al Dr. Bence. Pero, desafortunadamente, Henry Bence Jones ya había publicado los resultados de los análisis urinarios del paciente en dos artículos como autor único, uno de ellos en la revista The Lancet en 1847. Donde consideraba que la proteína era un “deutóxido hidratado de albúmina”. A continuación presentamos sus declaraciones: “No necesito hacer hincapié sobre la importancia de buscar este óxido de albúmina en otros casos de ossium mollities”. La reputación de Bence Jones pasó a la posteridad, mientras que las contribuciones de sus colegas pasaron a las notas al pie de página de la historia. Para todos puede parecer una injusticia en contra de su colega, William MacIntyre, pero Henry Bence Jones realizó mucho más en su carrera. Publicó más de 40 artículos y se volvió acaudalado y famoso por sus estu-

La proteinuria de Bence Jones: directrices y contrastografías. La historia: Si bien, “cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas” es sinónimo de proteínas de Bence Jones, la historia podría haber sido más generosa con los otros investigadores implicados en su descubrimiento. “El pasado viernes, octubre de 1845, el doctor William MacIntyre, médico del Hospital Occidental St. Marylebone, ubicado en St. Marylebone, Londres, dejó sus habitaciones en Harley Street. Fue llamado para examinar al Sr. Thomas Alexander McBean de 45 años, frutero y verdulero de lomo y tomo, que padecía fuertes dolores óseos y fracturas, que estuvo bajo el cuidado de su médico de cabecera, el Dr. Thomas Watson, durante varios meses. Después de examinar al paciente, William MacIntyre noto la presencia de edema y, considerando la posibilidad de nefrosis, analizó la orina para su contenido de albúmina. Con gran asombro comprobó que al calentar la orina, la proteína albuminosa se precipitaba y disolvía a 75°C.” Tanto el Dr. MacIntyre como el Dr. Watson enviaron las muestras de orina al patólogo químico del Hospital St. George, en atención al Dr. Bence. Una nota que acompañaba la orina enviada por el Dr. Watson decía: ...“Estimado Dr. Bence Jones, el tubo contiene orina de peso específico muy elevado: cuando hierve, se vuelve muy opaca y, al añadir ácido nítrico, es

ID 200223

Electroforesis

376

diferentes entre sí. La proteína de Bence Jones puede detectarse en la sangre, en las orinas o en ambos líquidos biológicos del paciente:

dios sobre la práctica clínica, didáctica y observaciones originales. Luego, a la “tierna edad” de 33 años, recibió una beca para estudiar en la Royal Society. Florence Nightingale lo describió una vez como “el mejor médico químico de Londres”. Sin embargo, sorprende que no hubiera mención alguna de la proteína de Bence Jones en su obituario y, además, tanto el epónimo como el guión en su nombre, no se utilizaron hasta su muerte.

Definición: La proteína de Bence Jones es una proteína de la clase de las globulinas con un peso molecular de 20 kDa. Es en realidad la cadena ligera separada de la cadena pesada de un anticuerpo. Las cadenas ligeras llamadas “proteína de Bence Jones” son distintas de las cadenas ligeras “normales” que los linfocitos B corporales suelen producir: • Las proteínas de Bence Jones están libres y son monoclonales. En cambio, las cadenas ligeras normales están unidas a la cadena pesada correspondiente para formar los anticuerpos. • Las Bence Jones son monoclonales, es decir, genéticamente, todas son iguales. Las cadenas ligeras normales son policlonales, o bien, todas sutilmente

ID 200223

Electroforesis

377

Diversas patologías poco comunes pueden tener como síntoma la producción de proteínas de Bence Jones, entre ellas, la macroglobulinemia de Waldemstroem. Asimismo, tanto en la sangre como en la orina de pacientes con mieloma múltiple, nefropatías y anemia, se detectan, entre otras cosas, proteínas de Bence Jones. Los pueden producir plasmocitos neoplásicos. Pueden ser de tipo kappa o lambda. Las cadenas ligeras pueden ser tanto fragmentos de inmunoglobulina como inmunoglobulinas homogéneas. Por su pequeñez, tras un simple aclaramiento renal, pueden detectarse en la orina. En otras palabras, la proteína de Bence Jones puede definirse como un componente monoclonal, o bien, “un clon de linfocitos B en expansión”.

Arteriola eferente

Capilar peritubular Túbulo distal

Glomérulo Arteriola aferente Cápsula de Bowman Filtración Reabsorción Secreción Excreción

Arteriola eferente

Ansa de Henle

Capilar peritubular

Conducto colector

Vena renal

A la vena renal

Glomérulo Arteriola aferente Cápsula de Bowman

La cantidad de cualquier sustancia presente en la orina (carga excretada) es el resultado del siguiente algoritmo: Cristal de la proteína de Bence Jones en cristalografía de rayos x.

El riñón y la proteína de Bence Jones Una de las funciones principales del riñón es eliminar de la sangre sustancias innecesarias a través de la orina y retener las necesarias. La formación de la orina surge de tres procesos: 1) La filtración glomerular. 2) La reabsorción tubular. 3) La secreción tubular.

ID 200223

Electroforesis

Ahora bien, si consideramos el peso molecular de una proteína de Bence Jones, debemos tener en cuenta que el glomérulo no puede detenerla porque es normal detectar albúmina en las orinas (P.M. 50000 D) en cantidades insignificantes.

378

Primario: cuando se acopla directamente con una fuente de energía (hidrólisis de ATP) bomba ATPasa de Na+ y K+. Secundario: cuando se acopla de modo indirecto con una fuente de energía.

Túbulo contorneado distal

Mácula densa Células yuxtaglomerulares Arteriola aferente

Arteriola eferente Mesangio extraglomerular Polo vascular

Filtración Capilares peritubulares

Endotelio fenestrado

Podocitos

Células tubulares

Asas glomerulares

Lumen

Flujo de masa

Lámina parietal de la cápsula glomerular

ATP Transporte activo Difusión

Sangre

Polo urinario Túbulo contorneado proximal

Osmosis

Es en este punto donde interviene la función tubular:

Vía paracelular Vía transcelular Solutos

H2O Excreción

Reabsorción

Arteriola eferente A la vena renal Capilar peritubular

Reabsorción de Na+ (transporte activo primario) Filtración Células tubulares

Cantidad filtrada

Cantidad absorbida

Cantidad secretada

Na Na

Cantidad de soluto excretada

ATP

Lumen - 3 mV

ATP

A la vejiga y al exterior

Sangre

Arteriola aferente Glomérulo

Cápsula de Bowman

K - 70 mV

Osmosis

Encargada de la reabsorción de solutos, que se divide en mecanismos activos y pasivos: El agua es reabsorbida por ósmosis. Transporte activo:

ID 200223

Electroforesis

Líquido intersticial Membrana basal

379

Na 140 mEq/l

H2O

1) el Na+ entra en su gradiente electroquímico 2) el Na+ es bombeado activamente a través de la membrana baso-lateral por la bomba Na+/K+

ras, hasta superar la capacidad de reabsorción y metabolismo renal. De ello, la aparición de la proteína BJ en las orinas. Las proteínas de BJ pueden ser cadenas ligeras libres monoclonales intactas, cadenas incompletas o fragmentos, o polímeros; de ahí la importancia de las diversas formas moleculares con masas moleculares variables.

Transporte activo secundario (cotransporte Na+, glucosa y aminoácidos y contratransporte Na+/H+) Filtración Lumen

Células tubulares

Na+

ATP

Glucosa

- 70 mV

Na+ Na+

Sangre

Aminoácidos

INDICACIONES (3)  Pacientes con componente monoclonal sérico: en la comparación y en cada control.  Sospecha clínica o de laboratorio (por ejemplo, la hipogammaglobulinemia no se espera en pacientes adultos) de mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström, amiloidosis AL, enfermedad por deposición de cadenas ligeras y otras condiciones relacionadas.

Aminoácidos

- 70 mV

Na+

H+ ATP

Líquido intersticial Membrana basal

K+

Na+ Proteína transportadora

PATOLOGÍAS ASOCIADAS CON LA PROTEÍNA DE BJ La proteinuria de BJ puede manifestarse en distintas situaciones patológicas, las más frecuentes son:  Mieloma múltiple.  Macroglobulinemia de Waldenström.  Amiloidosis por cadenas ligeras de inmunoglobulinas monoclonales (AL).  Enfermedad por deposición de cadenas ligeras. Tenga en cuenta que estas condiciones son raras. Su incidencia en los países occidentales varía aproximadamente de 4/100000 por año para el mieloma múltiple y de 0.9/100000 por año para la amiloidosis AL. También, menos frecuente es la presencia de proteinuria de BJ en los linfomas y en las leucemias linfáticas crónicas. Rara vez se manifiesta en asociación con neoplasias no linfoproliferativas. También ha sido descrita una proteinuria de BJ idiopática, o benigna, o de significado incierto.

En el punto en que la concentración de proteínas de Bence Jones sobrepasa la capacidad de reabsorción del transporte activo secundario, las proteínas pasaran de manera directa a la fase de excreción, generando una proteinuria plasmática por sobre flujo. Ahora siguen dos capítulos breves sobre las directrices para la detección de la proteína de Bence Jones (SIBioC) y, posteriormente, “Bence Jones y la contrastografía”. Directrices para la detección de la proteína de Bence Jones* Documento preparado por Maria Stella Graziani, Giampaolo Merlini, Concetta Petrini

DETECCIÓN Muestra La proteína de BJ es fácilmente degradada por la flora bacteriana presente en la vejiga, por lo que es importante utilizar orina que haya permanecido en la vejiga lo menos posible. *Este es un documento preliminar aprobado por el CD SIBioC el 12 de febrero de 2001, que es publicado para ser puesto en conocimiento de todos los socios en espera de comentarios y observaciones. Todas las sugerencias deben ser enviadas dentro de 6 meses después de la publicación a: Dra. Maria Stella Graziani, Laboratorio de Química Clínica, Hospital Borgo

Sociedad Italiana de Bioquímica y Biología Molecular Clínica División Científica – Grupo de Estudio Proteínas LA PROTEÍNA DE BENCE JONES (BJ) La proteína de BJ son cadenas ligeras libres monoclonales, es decir, que es secretada por células B que derivan de un único progenitor (clon) (1,2). En las discrasias de la línea de células B puede hacerse hincapié en el desequilibrio, ya presente fisiológicamente, entre síntesis de cadenas pesadas y cadenas lige-

ID 200223

Electroforesis

380

Trento, Plaza de Stefani, lla.graziani@mail.azosp.vr.it

1-37126

Verona.

Correo

electrónico:

mariaste-

 En el ensayo cualitativo, los antisueros no discriminan entre cadenas ligeras monoclonales y policlonales o entre cadenas ligeras libres y unidas (a menos que se utilicen antisueros contra cadenas libres).  El antígeno utilizado como calibrador es policlonal y, por esta razón, diferente de aquel en la muestra, que es monoclonal. En consecuencia, faltaría el requisito esencial para la exactitud de una prueba inmunológica, es decir, el paralelismo entre el antígeno en el calibrador y el antígeno en la muestra.  La proteína de BJ puede estar presente en cantidades muy elevadas, tanto como para originar problemas de exceso de antígeno.  La proteína de BJ suele estar presente bajo forma de agregados de tamaños variables, lo que puede provocar que la medición inmunoquímica de proteínas sea poco reproducible. Para la búsqueda de la proteína de BJ es igualmente desalentador:  El uso de métodos para la medición de las proteínas totales (ya sean precipitantes o fijación y tinción) porque son poco sensibles y exactos.  Las tiras reactivas utilizadas para la detección de las proteínas en el ámbito de la prueba de referencia de orina. Este método se basa en el error proteínico de los indicadores y es sensible casi exclusivamente a la albúmina.  La prueba de calor, que se menciona sólo por su valor histórico.

Por lo tanto, la muestra de elección es de orina fresca, se recomienda la segunda orina de la mañana, recolectada entre las 6 y las 9 horas (4). Se puede considerar la adición de azida de sodio (1%) para limitar la proliferación bacteriana. La orina puede utilizarse como tal si se cuenta con un método con suficiente sensibilidad (véase más abajo); en caso de que esté clínicamente indicado, deberá buscarse la proteína BJ con la mayor sensibilidad posible, puede ser necesario concentrar la muestra. Método El método elegido debe permitir la comprobación de las dos características de la proteína de BJ (cadenas ligeras libres monoclonales). Así que, deberá realizarse una inmunofijación que combina una electroforesis (idónea para comprobar la homogeneidad molecular de la proteína) con una tipificación inmunológica (idónea para comprobar que se trata de cadenas ligeras libres) (3, 5, 6). La electroforesis debe ser de buena calidad y cumplir con los criterios propuestos por la Comisión 05 del SIBioC (7). Los antisueros por utilizar son el anti κ y el anti λ totales con la adición del antisuero contra la cadena pesada de la inmunoglobulina presente en el suero de acuerdo con el esquema de la Figura 1. Los antisueros contra las cadenas ligeras libres no son recomendables, puesto que a menudo son de titulo bajo, escaza avidez, costosos y pueden presentar reactividad cruzada con las cadenas ligeras unidas. Su uso puede estar indicado en casos especiales, como por ejemplo, la identificación de una proteína de BJ que migra junto con la inmunoglobulina intacta. La coloración del proteinograma inmunofijado con tinciones coloidales (oro o Coomassie) permite obtener una sensibilidad adecuada (< 100 mg) sin tener que concentrar la muestra (8). Con el uso de métodos que combinan una elevada sensibilidad con una buena resolución, se puede observar con cierta frecuencia la aparición de una serie de bandas múltiples (principalmente con antisueros anti κ, pero también con antisueros anti λ) que no tienen importancia clínica pero que pueden ser confundidas con proteínas de BJ. En realidad son el resultado de la excreción de cadenas ligeras libres policlonales que aparecen en pacientes con una reabsorción tubular disminuda (9,10). Son distinguibles de la proteína de BJ, porque el patrón es típico y repetitivo con bandas regularmente espaciadas entre sí. Los métodos cuantitativos inmunoquímicos no son recomendables por las siguientes razones (11, 12):

ID 200223

Electroforesis

CUANTIFICACIÓN La cuantificación de la proteína de BJ reviste cierta importancia en el diagnóstico diferencial de las condiciones asociadas con la presencia del componente monoclonal y en el seguimiento de estos pacientes (3). Sin embargo, esto es un problema que no se puede resolver con las técnicas de laboratorio actuales. Los métodos inmunoquímicos no son recomendables por las mismas razones expuestas en la sección “BÚSQUEDA”. Las directrices del Colegio Americano de Patólogos (CAP) para el manejo del paciente con CM (6) sugieren el siguiente procedimiento:  Determinación de la proteinuria de las 24 horas.  Proteinograma electroforético e inmunofijación para verificar la presencia de la proteína de BJ.  Determinación del porcentaje densitométrico del pico electroforético debido a la proteína de BJ.  La expresión en porcentaje en relación con las proteínas totales para obtener los g/l de la proteína de BJ. Este procedimiento es criticable en muchos aspectos:

381

1. Berggård I, Edelman GM. Normal counter parts to Bence Jones proteins: free L polypetptide chains of human γ globulin. Proc Natl Acad Sci USA 1963;49:330-7 2. Solomon A. Review: light chains immunoglobulin. Structural-genetic corralates. Blood 1986;68:603-7 3. Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies. Serum and urine assays. Arch Pathol Lab Med 1999;123:114-8 4. Hofmann W, Guder WG. A diagnostic programme for quantitative analysis of proteinuria. J Clin Chem Clin Biochem 1989;27:589-600 5. Merlini G, Aguzzi F, Whicher J. Monoclonal gammapathies. J Internat Fed Clin Chem 1997;9:171-6 6. Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Gorevic PD, Kyle RA, Tomar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of patients with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:106-7 7. COM 05 (Aguzzi F, Fenili D, Montalbetti N, Petrini C, Salvatore F, Tarantino M). L’elettroforesi delle sieroproteine 1 e 2. Raccomandazioni provvisorie. Biochim Clin 1985;9:1127-34 8. Aguzzi F, Bergami MR, Gasparro C, Merlini G. High sensitivity electrophoretic method for the detection of Bence Jones protein and for the study in unconcentrated urine. Ann Clin Biochem 1993;30:287-92 9. Harrison HH. The "ladder light chain" or "pseudooligoclonal" pattern in urinary immunofixation electrophoresis (IFE) studies: a distinctive IFE pattern and an explanatory hypothesis relating it to free polyclonal light chains. Clin Chem 1991;37:1559-64 10. Mac Namara EM, Aguzzi F, Petrini C, Higginson J, Gasparro C, Bergami MR, Bianchi G, Whicher JT. Restricted electrophoretic heterogeneity of immunoglobulin light chains in urine. A cause of confusion with Bence Jones protein. Clin Chem 1991;37:1570-4 11. Tillyer CR. The estimation of free light chains of immunoglobulins in biological fluids. Int J Clin Lab Res 1992;22:152-8 12.Boege F. Measuring Bence Jones protein with antibodies against bound immunoglobulin light chains: how reliable are the results?. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1993;31:403-5 Apéndice A

 Los métodos actuales para la medición de las proteínas totales urinarias no ofrecen/ tienen la misma sensibilidad y linealidad para todas las proteínas presentes en la muestra, en particular las microproteínas y la proteína de BJ tienen una detectabilidad poco satisfactoria. La proteinuria total de una muestra con proteína de BJ puede ser imprecisa.  Del mismo modo, las distintas proteínas tienen diferentes afinidades por los colorantes utilizados para la tinción de los proteinograma electroforéticos y no está demostrado que “a igual intensidad de coloración, igual cantidad de proteínas”, especialmente si se utilizan colorantes coloidales.  A menudo la proteína de BJ se presenta fraccionada en múltiples bandas electroforéticas, de manera que la proteína es difícil de aislar en el proteinograma y de difícil valoración densitométrica. A pesar de los problemas señalados, el procedimiento densitométrico propuesto por el CAP es el único que se puede utilizar en caso de requerir la cuantificación de la proteína BJ, ya que no hay alternativas válidas disponibles. Sin embargo, se recomienda realizar el seguimiento siempre en el mismo laboratorio para minimizar la variabilidad analítica. Paciente con IgG kappa sérica

RESEÑA DE LA FISIOLOGÍA DE LAS INMUNOGLOBULINAS (Ig) Proteína de Bence Jones: Negativa

BIBLIOGRAFÍA

ID 200223

Electroforesis

Proteína de Bence Jones: Positiva

Estructura Las inmunoglobulinas constan de dos cadenas policlonales “pesadas” (CP) idénti-

382

cas (con una masa molecular de aproximadamente 50 kDa) y dos cadenas polipeptídicas “ligeras” (CL) idénticas (con una masa molecular de aproximadamente 22 kDa), unidas entre sí por un número variable de puentes disulfúricos y por enlaces no covalentes. Las CP se componen por 3 o 4 regiones (“dominios”) constantes, de notable homología, y una región variable en la porción N-terminal. Las CL tienen una región constante y una variable. Las diferentes características estructurales y antigénicas de la parte constante de las CP determinan la presencia de diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas: IgG (subdividida en IgG 1, 2, 3 y 4), IgA (IgA1 e IgA2), IgM, IgD, IgE, mientras que en las CL se distinguen dos tipos: kappa y lambda, aunque solamente un tipo está presente en la molécula completa. En función de la homología de porciones de la región variable, tanto las CL como las CP se subdividen en subclases: 4 para las CL κ, 6 para las CL λ y 6 para las CP. Los aminoácidos contrapuestos de las porciones variables de las dos cadenas, pesadas y ligeras, forman el sitio de combinación para el antígeno (2 sitios por cada Ig). En cambio, las funciones efectoras – enlace con los receptores celulares, activación del complemento, fijación del complemento, etc. – se delegan a las regiones constantes (fragmentos Fc).

Del ultrafiltrado, las microproteínas son captadas por las células del túbulo proximal, donde son degradadas a nivel lisosomal a oligopéptidos y aminoácidos, las cuales son introducidas en la circulación y reutilizadas. En condiciones normales, el proceso de reabsorción tubular puede ser esquemáticamente descrito de esta manera:  Fijación y adhesión de la microproteína a la membrana luminal de la célula tubular.  Segregación de la proteína en vesículas endocitósicas.  Migración de las vesículas del margen apical al interior de la célula.  Fusión con el lisosoma y contacto con las enzimas hidrolíticas.  Degradación enzimática de la proteína, proceso que puede durar de pocos minutos a días, dependiendo de la proteína. No se ha demostrado que a nivel de la membrana luminal celular hayan receptores específicos para cada proteína o para grupos de proteínas, por ello no se puede hablar de un proceso selectivo que depende de transportadores específicos. No obstante, existe una selectividad de unión dependiente de la interacción entre la carga de la proteína y la carga negativa de la superficie celular absorbente. La unión puede depender de la cinética de interacción entre grupos catiónicos de la molécula proteínica y los sitios aniónicos en la superficie de todos los tipos de células, incluyendo las células tubulares renales. Además de la carga, interfieren la dimensión y la forma. La demostración de que la albúmina es menos reabsorbida que la insulina y la ribonucleasa y que los aminoácidos catiónicos aumentan la excreción de las microproteínas, apoyaría este tipo de selectividad. Recientemente se ha planteado la hipótesis de que el receptor glicoproteíco “cubilina” (gp280), distribuido a lo largo de la ruta de los “depuradores” endocíticos, puede tener un papel fisiológico como sitio de unión para las CL a nivel del ribete en cepillo de las células renales (4).

Síntesis Las CP y CL de las moléculas inmunoglobulinicas son sintetizadas en diferentes ribosomas, bajo el control de diferentes genes (el cromosoma 14 para las CP, el 2 para las CL κ y el 22 para las λ). El montaje de la molécula ocurre después de la liberación de las cadenas individuales en las cisternas del retículo endoplasmático. Las CL son sintetizadas un poco más que las pesadas; esto origina su paso a la circulación y la eliminación de una parte de este “excedente” de CL policlonales por vía renal, siendo estás en su mayoría reabsorbidas y catabolizadas a nivel del túbulo renal proximal.

BIBLIOGRAFÍA

Catabolismo de las cadenas ligeras El riñón es la sede del catabolismo de las CL (1-3). Las CL, ya sean policlonales o monoclonales, al igual que otras proteínas de masa molecular inferior a los 40 kDa, son filtradas libremente por el glomérulo. Las microproteínas que son reabsorbidas por el túbulo incluyen enzimas (por ejemplo, ribonucleasa, lisozima), inmunoglobulinas (cadenas ligeras), hormonas peptídicas (por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento, hormona paratiroidea) y otras microproteínas (beta 2 microglobulina, alfa 1 microglobulina, proteína transportadora de retinol, etc.). La permeabilidad de la membrana glomerular con las microproteínas es variable en función de sus características físicoquímicas, como la masa molecular, el punto isoeléctrico (pi), el grado de glicosilación, etc. Reducciones modestas del filtrado glomerular también originan incrementos precoces de la concentración plasmática de microproteínas.

ID 200223

Electroforesis

1. Maack T, Johnson V, Kau ST, Figueiredo J, Sigulem D. Renal filtration, transport, and metabolism of low-molecular weight proteins: A review. Kidney Int 1979; 16:251-70. 2. Sumpio BE, Maack T. Kinetics, competition, and selectivity of tubular absorption of proteins. Am J Physiol 1982; 243:379-92. 3. Solling K. Free light chains of immunoglobulins. Scan J Clin Lab Invest 1981;157 (Suppl):1-83. 4. Batuman V, Verroust PJ, Navar GL et al. Myeloma light chains are ligands for cubilin (gp 280). Am J Physiol 1998; 275:246-54.

383

za monocitaria o macrofágica, que a menudo contienen fragmentos de cilindros. Bajo el microscopio electrónico, algunos cilindros parecen densos y homogéneos, otros extremadamente fibrilares (fibrillas distintas de las amiloidales). Cristales alargados de distintos tamaños se encuentran en el lumen y a veces incluso en las células del epitelio tubular (5). La cadena ligera monoclonal responsable de la proteinuria de BJ puede detectarse en los cilindros mediante métodos inmunohistoquímicos en aproximadamente el 50% de los casos (6) y suele estar acompañada por otras proteínas; la que siempre está presente, es la proteína de Tamm-Horsfall, aunque en ocasiones se observa albúmina, la cadena ligera no implicada, cadenas pesadas, C3, etc. Con la presencia de cilindros, se asocian alteraciones morfológicas de los tubos renales con diferentes grados de degeneración celular (aplanamiento del epitelio, descamación celular, necrosis celular). Con respecto a los mecanismos que inducen la precipitación intraluminal de cadenas ligeras monoclonales, se han propuesto diversas hipótesis. Ya que no existe un paralelismo estrecho entre la proteinuria de BJ y la precipitación, se cree que sólo ciertos tipos de BJ están particularmente predispuestos a este fenómeno y esto es apoyado por datos experimentales en animales (7, 8). Se ha descubierto que el efecto patogénico es atribuible a la porción variable de las cadenas ligeras, que es responsable de las propiedades fisicoquímicas y funcionales que las distinguen las unas de las otras. En un principio se consideró (9) que las proteínas de BJ con pl más elevado (> de 5) tenían una mayor tendencia a precipitar por la interacción electroestática con la proteína de Tamm-Horsfall, cuyo pl es de 3.5. Pero estudios posteriores, tanto clínicos como experimentales, descartaron cualquier correlación entre el pI de la proteína y la aparición de la insuficiencia renal (3, 10-13). Además de la posible influencia de las principales características fisicoquímicas de la proteína de BJ, tienen a menudo un papel estimulador algunos factores relacionados con el huésped, tales como:  deshidratación  hipercalcemia  hiperuricemia  infecciones de las vías urinarias  fármacos nefrotóxicos Por último, se puede considerar razonablemente carente de toda influencia el empleo de medios de contraste, cuanto más que ya han sido suspendidos los iónicos, susceptibles de interactuar con la proteína de BJ. Es mucho más probable creer que los daños renales observados en el pasado derivaran de los regímenes fuertemente deshidratantes a los que se sometieron los pacientes para los exámenes pielográficos. 2. Nefropatía por depósitos de cadenas ligeras Mientras que el riñón de mieloma pertenece a la patología relacionada con la tendencia de ciertas cadenas ligeras monoclonales a precipitar en el lumen de los tubos

Apéndice B MANIFESTACIONES CLÍNICAS POR LA PROTEÍNA DE BENCE JONES Como ocurre con ciertos componentes monoclonales (CM) conformados por Ig completas, también la proteína de BJ puede ejercer efectos dañinos sobre los tejidos, órganos o sistemas a causa de sus propiedades fisicoquímicas. Los mecanismos patogénicos son diversos y muchas veces confusos. Puesto que no todas las proteínas de BJ inducen necesariamente manifestaciones clínicas especificas, y cuando son patógenas ejercen efectos dañinos diferentes, los factores que determinan el daño son en gran parte dependientes de las propiedades fisicoquímicas y funcionales de la cadena ligera monoclonal (evidenciado por datos clínicos y experimentales), pero pueden ser incrementados o acentuados por condiciones extrínsecas relacionadas con el huésped. 1. Nefrotoxicidad por cadenas ligeras El riñón es la sede del catabolismo de las cadenas ligeras (policlonales o monoclonales) y, por lo tanto, es el órgano más afectado por el efecto patogénico de la proteína de BJ. Sin embargo, se han reportado casos con proteinuria de BJ de alta concentración y larga duración sin daño renal (1, 2). Los cuadros clínicos relacionados con la nefrotoxicidad de la proteína de BJ son:  Riñón de mieloma.  Enfermedad por depósito de cadenas ligeras.  Amiloidosis.  Síndromes de alteración de la función de los túbulos renales. 1.1 Riñón de mieloma La insuficiencia renal, tanto aguda como crónica, afecta a casi el 50% de los pacientes con mieloma múltiple (3) y es responsable entre el 70% y el 80% de las manifestaciones clínicas y del peculiar cuadro histopatológico del llamado “riñón de mieloma”. La denominación anglosajona “light chain cast nephrophaty” (nefropatía por cilindros de cadenas pesadas) resalta el papel patogenético de las cadenas ligeras (monoclonales) en el determinismo de la nefropatía, caracterizada por proteinuria y precipitación del material proteico bajo la forma de cilindros en los túbulos distales y en los colectores. Morfológicamente, estos cilindros se observan gruesos, densos y refringentes al microscopio óptico, con un aspecto característico multilamelar y contornos fracturados (4), eosinófilos y PAS positivos. La reacción celular incluye: células epiteliales, linfocitos, algunas veces polimorfonucleados y células gigantes multinucleadas, de naturale-

ID 200223

Electroforesis

384

renales, otro grupo de afecciones sistémicas que afectan con preferencia al riñón, pero que también pueden manifestarse a nivel de otros órganos y aparatos, depende de la capacidad de la proteína patológica de depositarse en los espacios extracelulares. Se describen dos formas distintas de depósitos de cadenas ligeras monoclonales: una fibrilar, típica del amiloide, y una no fibrilar, que caracteriza la enfermedad por depósitos de cadenas ligeras.

ten numerosos trabajos en la literatura sobre el análisis estructural de la proteína anormal implicada en la enfermedad por deposición, determinada directamente o a través de estudios a nivel génico o biosintéticos. Los resultados más relevantes parecen concernir la identificación de las sustituciones aminoacídicas que causan una mayor hidrofobicidad potencialmente capaz de desestabilizar la molécula proteica por una conformación anormal (16-12).

2.1 Enfermedad por depósitos de cadenas ligeras Si bien, el espectro de la patología renal asociada con depósitos no fibrilares de componentes monoclonales incluye formas con depósitos de cadenas ligeras aisladas o acompañadas por Ig completas, y otras caracterizadas por la presencia de cadenas pesadas (“enfermedad por depósitos no amiloideos de inmunoglobulinas monoclonales”: NAMIDD) (14), estas notas corresponden a la forma más frecuente, es decir, la enfermedad por depósitos de cadenas ligeras, cuya identidad fue demostrada en 1976 con métodos de inmunofluorescencia (15), aunque desde hace años en los portadores de mieloma fueron descritas alteraciones glomerulares con aspecto lobular similares a las de la glomeruloesclerosis de Kiemmestiel-Wilson de la nefropatía diabética. Los depósitos se encuentran principalmente en las membranas basales y en las paredes de los vasos, constituidos por material no fibrilar, no congofílico, PAS positivo, argirófilo finamente granular a la microscopia electrónica. Bajo el microscopio óptico, la implicación renal puede asumir aspectos heterogéneos: los glomérulos pueden tener una apariencia normal o mostrar distintos grados de expansión mesangial hasta la glomerulopatía nodular. Los depósitos se encuentran siempre a nivel tubular y vascular. Para el diagnóstico es necesario utilizar los métodos inmunohistoquímicos, preferiblemente la inmunofluorescencia en tejido congelado. Si bien, las manifestaciones clínicas están a menudo relacionadas con el daño renal, se han detectado depósitos en otros órganos (hígado, pulmón, piel, etc.), en algunos casos acompañados de sintomatología correlata. La enfermedad se manifiesta con proteinuria, en general, modesta, pero a veces de tipo nefrótico, sin hematuria e hipertensión, asociada con insuficiencia renal de progresión rápida. En casi el 25% de los pacientes no hay una neoplasia linfoproliferativa sintomática presente; sin embargo, a través del estudio inmunológico de la médula, es posible evidenciar una población monoclonal, aunque de entidad modesta, que sintetiza cadenas ligeras del tipo detectado en los depósitos. La proteinuria de BJ puede ser de baja concentración, a veces no detectable si no se recurre a técnicas más sensibles. Con respecto al mecanismo fisiopatológico que provoca el fenómeno de adhesión y deposición tisular, algunos estudios sobre la estructura de las moléculas han evidenciado anomalías estructurales tales como: tamaños anormales (cadenas más largas o más cortas), tendencia a la formación de polímeros, anomalías de la glicosilación. Exis-

2.2 Amiloidosis AL El termino amiloidosis es una expresión genérica que incluye diferentes patologías caracterizadas por depósitos tisulares químicamente heterogéneos. La característica común en todas las formas de amiloidosis, cualquiera que sea la composición bioquímica, es la presencia, sistémica o localizada, de depósitos fibrilares en los espacios extracelulares. Todos los tipos de fibrillas comparten las siguientes propiedades:  Estructura secundaria principalmente en laminas beta antiparalelas.  Birrefringencia verde bajo luz polarizada después de la tinción con el rojo Congo.  Estructura cuaternaria fibrilar con aspectos peculiares a la microscopia electrónica. Además, siempre se puede detectar en el amiloide de cualquier tipo bioquímico, una proteína de alto peso molecular (250 kDa) glicosilada, llamada “componente P del amiloide”. También, la apoliproteína E parece estar asociada constantemente con el amiloide, probablemente contribuyendo, junto con el componente P, con los cambios conformacionales que favorecen la precipitación, en forma de fibrillas, de la proteína amiloidogénica (22). En la amiloidosis AL, las fibrillas están compuestas principalmente por fragmentos de cadenas ligeras monoclonales, a veces asociados con la cadena ligera completa. Los fragmentos con una masa molecular de 5-23 kDa, comprenden la región aminoterminal de la cadena ligera (región variable, más unos 50 aminoácidos de la región constante) (8). En la amiloidosis AL se ha demostrado la prevalencia de cadenas ligeras λ (con un predominio significativo de los grupos λ 6 y λ 3), una mayor frecuencia de cadenas ligeras con pl ácido, y la presencia de fragmentos de CL en el suero y en la orina de los pacientes afectados (23). El estudio estructural de las CL implicadas en la formación de las fibrillas, aunque no reveló ninguna característica común, puso en evidencia, respecto a las CL no amiloidogénicas, sustituciones aminoacídicas peculiares que pueden desestabilizar el “estado plegado” (24). Existe una forma de amiloidosis AL asociada con el mieloma múltiple (6-5% de los casos de mieloma) y una forma primaria con ligera infiltración plasmacelular de la médula ósea (menos del 10%). A través de la inmunofluorescencia es posible demos-

ID 200223

Electroforesis

385

trar la monoclonalidad de los plasmocitos. Al ser una enfermedad sistémica, la deposición puede afectar cualquier órgano (corazón, riñón, hígado, intestino, tejido nervioso y muscular) y la sintomatología deriva del daño provocado al órgano afectado. Dada la complejidad de esta patología, no es posible tratar con detalle las manifestaciones clínicas que conlleva. La afectación renal comprende entre el 75 y el 90% de los casos y comienza en un tercio de los pacientes con síndrome nefrótico debido al depósito de amiloide a nivel glomerular. Evoluciona a insuficiencia renal, causa de muerte entre el 10 y el 25% de los pacientes. En casi la mitad de los pacientes, la muerte sobreviene por insuficiencia cardiaca congestiva, causada por depósitos de amiloide en el tejido cardiaco, presentes en aproximadamente el 90% de los pacientes afectados. La proteína de BJ urinaria está presente a menudo en bajas concentraciones y requiere ser detectada con técnicas de alta sensibilidad, con las que es posible identificarla en casi el 90% de los pacientes. Es conveniente recordar que se han descrito casos con la presencia simultánea de depósitos fibrilares y no fibrilares de CL monoclonales en el mismo paciente (amiloidosis asociada con enfermedad por deposito de cadenas ligeras). En este sentido, algunos autores (25) consideran que tal vez no existen diferencias estructurales entre las cadenas ligeras que producen amiloide y las que originan depósitos no fibrilares. Según estos autores, las cadenas ligeras capaces de formar depósitos tisulares podrían constituir un espectro con un extremo representado por aquellas capaces de formar únicamente amiloide, y otro sólo por aquellas que se depositan en forma más amorfa, no fibrilar, y con un grupo central capaz de formar ambos depósitos. Una hipótesis alternativa sugiere que todas o la mayoría de las proteínas que forman fibrillas pasan por una fase de depósitos no fibrilares y no congofílicos, de duración variable en función de su estructura primaria. Serán necesarios otros estudios para resolver este problema.

de la neoplasia y por la tendencia del componente monoclonal a la cristalización en las células del túbulo proximal, sin formación de cilindros en el túbulo distal. La disfunción tubular distal se caracteriza principalmente por acidosis tubular distal, y más raramente por diabetes nefrogénica (28). También se han descrito casos con las dos formas (29). Experimentalmente, utilizando cortes de tejido renal incubado con BJ, se demostró una reducción de los procesos metabólicos y la inhibición de la actividad de la enzima ATP-asa NA, κ dependiente (30), y distintos estudios clínicos han reportado un efecto tóxico de las cadenas ligeras monoclonales tanto en la reabsorción tubular de microproteínas (31), como en otras funciones tubulares (excreción de acido úrico, fosfatos, osmolalidad, capacidad de acidificación etc.) (32). Las alteraciones funcionales disminuyen sí la terapia suprime la secreción de la proteína de BJ, confirmando así el efecto tóxico de la proteína sobre el túbulo. Aunque es raro, la disfunción tubular puede causar osteomalacia y acidosis metabólica crónica. Cabe destacar que la reducida capacidad de concentración y la disminución de la reabsorción del Na pueden predisponer la deshidratación con todas las consecuencias que conlleva (riñón de mieloma). De los estudios estructurales de una CL kappa monoclonal implicada en el síndrome de Fanconi surgió un comportamiento peculiar: además de su capacidad de formar cristales en las células tubulares y en las células plasmáticas, la porción variable, obtenida del fragmento nativo tras el tratamiento enzimático, resulto ser totalmente resistente a la proteólisis enzimática adicional, a diferencia de otras CL monoclonales kappa (33). Un trabajo reciente (27) sobre 11 casos de síndrome de Fanconi asociado con la eliminación de CL resistentes a la catepsina B (enzima lisosomal), ha puesto en evidencia que, en contraste con una evidente heterogeneidad clínico-patológica, los datos genéticos y bioquímicos mostraron una sorprendente homogeneidad: 1) todas las BJ eran de tipo kappa, 2) 8 pertenecían al subgrupo I de variabilidad (V kappa I), quizá codificadas por sólo 2 genes de la línea germinal (LC02/012 y LC08/018), 3) en 5 de las secuencias codificadas por LC02/012, había un peculiar residuo hidrofóbico o no polar en la posición 30. Los autores sugieren que esta peculiar estructura primaria confiere a la molécula resistencia contra la proteólisis, lo que podría explicar la acumulación de CL en el compartimiento endocítico de las células proximales y el consiguiente déficit funcional.

2.3 Síndromes de función alterada de los túbulos renales Además del daño estructural renal, documentable con datos histológicos e inmunohistológicos, causado por la proteína de BJ, se han descrito situaciones patológicas relacionadas con alteraciones funcionales del túbulo, provocadas por la BJ (26), en pacientes sin reducción de la función renal y con biopsias renales negativas. Las manifestaciones clínicas relacionadas con el padecimiento del túbulo renal proximal, conforman el síndrome de Fanconi del adulto (57 casos descritos hasta la fecha según Messiaen y col.), (27) con varios grados de glicosuria normaglicémica, aminoaciduria, fosfaturia, lisozimuria, y acidosis tubular proximal. Esta asociada más frecuentemente con BJ de tipo kappa y también puede preceder en varios años la manifestación clínica del mieloma. Esta patología fue en el pasado se atribuía a una forma particular de discrasia plasmacelular, caracterizada, además de la proteinuria de BJ, por una progresión lenta

ID 200223

Electroforesis

3. Otras nefropatías por depósitos de inmunoglobulinas Aunque no se relacionan con la proteína de BJ, ameritan una breve mención dos entidades de descripción relativamente reciente y baja incidencia (1% de las glomerulopatías) (34). La glomerulopatía fibrilar no amiloidótica se caracteriza por depósitos de fibrillas al nivel del mesangio y de las asas capilares glomerulares, de un espesor mayor respecto

386

myeloma. Clin Sci 1984;66:229-32. 11. Norden AGW, Fynn FV, Fulcher LM, Richards JDM. Renal impairment in myeloma: negative association with isoelectric point of excreted Bence Jones protein. J Clin Pathol 1989;42:59-62. 12. Melcion C, Mougenot B, Baudouin B et al. Renal failure in myeloma; relationship with isoelectric point of immunoglobulin light-chains. Clin Nephrol 1984;22:138-43. 13. Smolens P, Barnes JL, Stein JH. Effect of chronic administration of different Bence Jones proteins on rat kidney. Kidney Int 1986;30:874-82. 14. Gallo G, Picken M, Buxbaum J, Frangione B. The spectrum of monoclonal immunoglobulin deposition disease associated with immonocytic dyscrasias. Semin Hematol 1989;26:234-45. 15. Randall RE, Williamson WC, Mullinax F et al. Manifestations of systemic light chain deposition. Am J Med 1976;60:293-99. 16. Decourt C,Cogne M, Rocca A. Structural peculiarities of a truncated V kappa III immunoglobulin light chain in myeloma with light chain deposition disease. Clin Exp Immunol 1996;106:357-61. 17. Vidal R, Goni F, Stevens F et al. Somatic mutations of the L 12 a gene in Vkappa (1) light chain deposition disease; potential effects on aberrant protein conformation and deposition. Am J Pathol 1999;155:2009-17. 18. Ling NR. Immunoglobulin production by cultured human lynphocytes. Protein Sci 1999;8:50919. Deret S, Chomilier J, Huang DB et al. Molecular modeling of immunoglobulin light chains implicates hydrophobic residues in non amyloid light chain deposition diseases. Protein Eng 1997;10:1191-7. 20. Gallo G, Goni F, Boctor F et al. Light chain cardiomyopathy. Structural analysis of the light chain tissue deposits. Am J Pathol 1996;148:1397-406. 21. Stevens FJ, Argon Y. Pathogenic light chains and the B-cell repertoire. Immunol Today 1999;20:451-7. 22. Gallo G, Wisniewsky T, Choi-Miura NH et al. Potential role of apolipoprotein E in fibrillogenesis. Am J Pathol 1994;145:526-30. 23. Bellotti V, Merlini G, Bucciarelli E, Perfetti V, Ascari E. Relevance of class, molecular weight and isoelectric point in predicting human light chain amyloidogenicity. Br J Haematol 1990;74:65-9. 24. Bellotti V, Mangione P, Merlini G. Immunoglobulin light chain amyloidosis. The archetype of structural and pathogenic variability. J Struct Biol 2000;130:280-9. 25. Buxbaum J, Gallo G. Non-amyloidotic monoclonal immunoglobulin deposition disease. Lightchain, heavy-chain, and light-and heavy-chain deposition disease. Hematol Oncol Clin North Am 1999;13:1235-48.

al del amiloide, negativos al rojo de Congo, carente de una organización ultraestructural y constituidas principalmente por inmunoglobulinas policlonales. En las glomerulopatías inmunotactoides los depósitos están constituidos por IgGκ o IgGλ monoclonales entre el 50% y el 80% de los casos, no son sistémicos y tienen una estructura cristalina o tactoide. Además, una forma de particular glomerulopatía inmunotactoide llamada “glomerulonefritis con depósitos microtubulares organizados de inmunoglobulinas monoclonales – GOMMID – puede estar asociada con la leucemia linfática crónica o linfoma no Hodgkin. En las formas inmunotactoides, a la biopsia, se detecta glomerulonefritis membranosa, a menudo asociada con la proliferación mesangial segmentaria o con la glomerulonefritis membranoproliferativa lobular con depósitos de Ig monotípicas. Solo en raras ocasiones se detecta una CM circulante. Las manifestaciones clínicas incluyen proteinuria, a menudo en el rango nefrótico, microhematuria e hipertensión. La progresión hacia la insuficiencia renal es más frecuente en la glomerulopatía fibrilar. BIBLIOGRAFÍA 1. Kyle RA, Greipp PR. Idiophatic Bence Jones proteinuria. New Engl J Med 1998; 306:564-67. 2. Woodruff R, Sweet B. Multiple myeloma with massive Bence Jones proteinuria and preservation of renal function. Aust N Z J Med 1977; 7:60-2. 3. Ascari E, Merlini G, Ricciardi A. Il mieloma multiplo. Roma: L. Pozzi Editrice 1989. 4. Pirani CL, Silva FG, Appel GB. Interstitial disease in multiple myeloma and other non renal neoplasia. In: Contran RS, Brenner BM, Stein JH eds. TubuloInterstitial Nephropathies. London: Churchill Livingstone, 1983:208-21. 5. Pirani CL, Silva F, D’Agati V et al. Renal lesions in plasma cells dyscrasia: ultrastructural observation. Am J Kidney Dis 1987;10:208-21. 6. Picken MM, Shen S. Immunoglobulin light chains and the kidney: an overview. Ultrastructural Pathol 1994;18:105-12. 7. Koss MN, Pirani CL, Osserman EP. Experimental Bence Jones cast nephropathy. Lab Invest 1976;34:579-91. 8. Solomon A, Weiss DT. A perspective of plasma cell dyscrasia: clinical implication of monoclonal light chains in renal disease. In: Minetti L, D’Amico G, Ponticelli C eds. The kidney in plasma cell dyscrasia. Dordrecht: Kluwer Acad Publ, 1988:3-18. 9. Clyne DH, Pesce AJ, Thompson RE. Nephrotoxicity of Bence Jones proteins in the rat: Importance of protein isoelectric point. Kidney Int 1979;16:345-52. 10. Coward RA, Delamore IW, Mallick MP, Robinson EL. The importance of urinary immunoglobulin light chain isoelectric point in nephrotoxicity in multiple

ID 200223

Electroforesis

387

obtienen excelentes resultados mediante la relación kappa y lambda, que, como dice el buen John Whicher, da el resultado correcto por la razón equivocada (la cadena libre genera una respuesta inmunométrica exagerada, por lo que la señal es amplificada y la sensibilidad aumenta). Dicha relación no está muy difundida y, de cualquier modo, se obtienen resultados de gran sensibilidad con la inmunofijación que, en caso de una sospecha clínica, debe realizarse incluso en presencia de un proteinograma normal, tal y como figura en el documento de la Comisión de Proteínas. La detección en la orina que, por motivos fisiopatológicos, suele garantizar una mayor sensibilidad, plantea sin embargo algunos problemas adicionales: 1. Las técnicas inmunométricas no permiten cuantificar debidamente la proteína monoclonal (falta de paralelismo entre el calibrador y la muestra por una posible fuerte divergencia antigénica). 2. Es frecuente la eliminación, incluso elevada, de cadenas ligeras libres policlonales por la evidente imposibilidad de distinguirlas inmunometricamente de las monoclonales. 3. La técnica de separación, electroforesis, seguida de, o mejor dicho, asociada con la inmunofijación, sigue siendo, en nuestra opinión, la mejor técnica, sobre todo si se incrementa su sensibilidad mediante tinciones “sensibles” (oro coloidal, mejoramiento con plata). Estas técnicas requieren ciertas habilidades y cuidado. 4. En la separación electroforética, las cadenas libres policlonales se disponen en múltiples bandas (escalera), dificultando en ocasiones la interpretación del proteinograma. Respecto a las contrastografías, cabe recordar, aunque ya se ha hecho más de una vez, que la proteína de Bence Jones no se menciona en ninguno de los tres boletines que nuestro ministerio ha difundido a lo largo del decenio. En contraste, a nivel internacional, el mieloma y la enfermedad de Waldenstrom, junto con las tiropatías, se han incluido en un grupo de condiciones de riesgo ya consideradas obsoletas. En realidad, ¿qué puede ocurrir en el caso de contrastografía?

26. Fang LST. Light chain nephropathy. Kidney Int 1985;27:582-92. 27. Messiaent T, Deret S, Mougenot B et al. Adult Fanconi syndrome secondary to light chain gammopathy. Clinicopathologic heterogeneity and unusual features in 11 patients. Medicine (Baltimore ) 2000;79:135-54. 28. Maldonado JE, Velosa JA, Kyle RA et al. Fanconi syndrome in adults. A manifestation of latent myeloma. Am J Med 1975;58:35-64. 29. Smithline N, Kassirer JP, Cohen JJ. Light chain nephropathy. Renal tubular disfunction associated with light chain proteinuria. New Engl J Med 1972;94:71-4. 30. Mc Geoch J, Smith JF, Ledingham J, Ross B. Inibition of active transport sodium-potassium ATP-ase by myeloma protein. Lancet 1978;2:17. 31. Cooper EH, Forbes MA, Crockson RA, Mac Lennan ICM. Proximal renal tubular function in myelomatosis: observations in the fourth MRC trial. J Clin Pathol 1984;37:848-52. 32. Colussi G, Barbarano L, Airaghi C et al. Clinical spectrum of tubular disorders from light chains. In: Minetti L, D’Amico G, Ponticelli C eds. The kidney in plasma cell dyscrasia. Dordrecht: Kluwer Acad Publ, 1988:191-209. 33. Aucouturier P, Bauwens M, Khamlichi AA et al. Monoclonal Ig L chain and L chain V domain fragment crystallization in myeloma-associated Fanconi’s syndrome. J Immunol 1993;150:3561-8. 34.Ronco P, Aucouturier P, Mougenot B. Plasma cell dyscrasia-related glomerulopathies and Fanconi syndrome: a molecular approach. In: Attualità Nefrologiche & Dialitiche. Atti del XXXI Corso di Aggiornamento in nefrologia e metodiche dialitiche dell’Ospedale San Carlo Borromeo di Milano. A cura di: G D’Amico, C Bazzi, G Colasanti. Milano: Wichtig Editore,1999.

Bence Jones y la contrastografía El correo recibido sobre el tema merece algunas aclaraciones. Clínicamente, cabe destacar que la presencia de Bence Jones - cadenas ligeras libres monoclonales - no equivale al diagnóstico de mieloma micromolecular. De hecho, son muchos más los casos en que la proteína está asociada con una GMSI (gammapatía monoclonal de significado incierto). No es raro que, sobre todo, al comienzo de la enfermedad, no se produzca la disminución de inmunoglobulinas policlonales, que, en cambio, es el signo clásico de enfermedad avanzada. Analíticamente, para la detección de cadenas ligeras libres en el suero, se

ID 200223

Electroforesis

388

Con los antiguos medios iónicos de contrate, además de los ya casi desparecidos, que requerían la deshidratación del paciente para la urografía, en el caso de presentar concentraciones elevadas de Bence Jones, estas podían precipitar en los túbulos renales bloqueándolos (condición definida por los autores anglosajones como “riñón de mieloma”). El mieloma en sí no tiene riesgos particulares, no obstante, debido a que se suele asociarse con nefropatías, implica una condición que puede requerir atención. Por consiguiente, deberá determinarse la creatinina. Todavía, por razones sólidas, aún con los nuevos medios de contraste, el riesgo histórico de que el suero del paciente gelifique, pese a que es teóricamente descartable, puede ocurrir sólo en presencia de concentraciones muy elevadas de IgM con una estructura fisicoquímica específica. Todo lo antedicho es fácil de encontrar en la literatura nacional e internacional. En el curso CEFAR de proteínas organizado el año pasado por Francesco Aguzzi, y celebrado en Desenzano, se organizó una mesa redonda con los radiólogos. Entre otras cosas, surgió que el riesgo contrastográfico, aunque presente, es en cualquier caso moderado (con los medios iónicos el índice de mortalidad es de 0.0000043, y con los no iónicos, de 0.0000029) pero, sin duda, no es despreciable. En lo que respecta al laboratorio, no se tienen armas eficaces que permitan pronosticar la aparición de reacciones inmediatas, por tanto, como los daños a medio y largo plazo son casi sólo renales, la determinación de creatinina sigue siendo la prueba de referencia. Parecería inútil mencionarlo, pero la cooperación entre el clínico, el laboratorista y el radiólogo sigue siendo fundamental. Maria Stella Graziani e Giampaolo Merlini per la Commissione Proteine della SIBioC

ID 200223

Electroforesis

389

APÉNDICE SÉPTIMO Notas sobre las inmunoglobulinas humanas: Bases celulares, estructurales, inmunoquímicas y funcionales

1.1 Introducción 1.2 Bases celulares 1.3 Bases estructurales, inmunoquímicas y funcionales 1.4 Compendio de las principales características fisicoquímicas, estructurales y funcionales de las cinco clases de inmunoglobulinas humanas 1.5 Componentes monoclonales en el suero y en las orinas 1.6 La importancia clínica de la presencia de componentes monoclonales en el suero y en la orina. 1.7 Problemas del laboratorio en la identificación de algunos componentes monoclonales. 1.8 Problemas particulares de interpretación 1.9 Notas técnicas sobre la toma y conservación del suero y de las orinas. 1.10 Detección de los componentes monoclonales

ID 200223

Electroforesis

391

1.1 Introducción La idea de que la protección del organismo contra agentes infecciosos comunes, así como contra toda una serie de sustancias extrañas para el propio organismo, se relacionaba con la aparición de fracciones proteínicas específicas en el suero, ha ido abriéndose paso ya a finales del siglo pasado. A estos factores plasmáticos capaces de unirse específicamente a los agentes de origen externo, llamados de modo genérico antígenos, se les dio el nombre de anticuerpos. La introducción del antígeno en un organismo provoca toda una serie de fenómenos conocida con el nombre de respuesta inmutaría, que, al final, se traduce en la producción de anticuerpos, es decir, de inmunoglobulinas con sitios de combinación dirigidos contra el antígeno que se introdujo. El sistema inmune que sintetiza estas sustancias se compone por centenares de miles de células que, aunque proceden de un sólo progenitor, adquieren la capacidad de producir distintos anticuerpos contra distintos antígenos o contra diferentes determinantes del mismo antígeno. Así que, cuando inmunizamos un animal para producir un antisuero, todas las células productoras de anticuerpos de este se activan y producen anticuerpos, todos diferentes entre sí, que se adaptarán más o menos bien al antígeno inyectado.

ID 200223

Electroforesis

El suero resultante estará compuesto por una mezcla de anticuerpos, distintos tanto en especificidad como en actividad biológica. Para evitar confusiones de nomenclatura, muchas veces provocadas por el uso de múltiples términos para el mismo tipo de anticuerpos, la OMS propuso designar a los anticuerpos con el término de inmunoglobulinas, que señala con precisión una familia de proteínas relacionadas entre sí por estructura y función, provistas de actividad anticorporal específica. 1.2 Bases celulares En la década pasada los inmunólogos reconocieron que el factor más importante de la inmunidad antiviral específica lo representa una clase de células pequeñas, los linfocitos T. De hecho, son auxiliares básicos en la respuesta inmune a la infección bacteriana. Desde hace tiempo se ha aceptado que la actividad de este tipo la inicia una molécula contenida en la membrana de los linfocitos T, llamada: “Receptor de los linfocitos T”. Se entiende que el antígeno específico es compatible y se une a dicho receptor, como una llave que se ajusta a la cerradura, marcando el inicio de una compleja serie de eventos bioquímicos que constituyen la respuesta inmune. Por diversas razones, el aislamiento de dicho receptor es en extremo difícil

392

y, hasta hace no mucho, fue necesario deducir sus propiedades de manera indirecta, sin la dirección del conocimiento de su estructura, que hoy día ha sido el centro de atención en su totalidad. La explicación sobre la estructura del receptor de los linfocitos T también conlleva un mayor entendimiento de las complejas interacciones entre linfocitos T y demás componentes del sistema inmune. En especial, es cada vez más evidente que el linfocito T es el más apropiado para hacer frente a las infecciones de las células del huésped y no a las infecciones que circulan con libertad en los líquidos corpóreos. Así que, para llevar a cabo esta función, el receptor de los linfocitos T no sólo debe reconocer el antígeno específico, sino también determinadas proteínas de membrana de la misma célula huésped. Un mecanismo de reconocimiento de este tipo debe mantenerse bajo control, porque un linfocito T, si tuviera que ser activado sólo por las proteínas del huésped, podría dirigirse sin dificultad contra las células sanas. La sensibilidad resultante del sistema de reconocimiento de los linfocitos T es responsable de muchas propiedades interesantes de este sistema, importantes desde el punto de vista médico. Por ejemplo, los linfocitos T intervienen con rapidez en el rechazo de tejido extraño, injertado o trasplantado por medio de cirugía, en el cuerpo humano. Por lo tanto, los estudios sobre el receptor de los linfocitos T son también de gran importancia para la cirugía. Existen, en efecto, dos tipos de linfocitos responsables del reconocimiento de antígenos específicos, y los linfocitos B componen el segundo grupo. Ambos linfocitos T y B derivan de la medula ósea, pero los primeros finalizan su desarrollo en el timo, glándula situada por detrás del manubrio esternal en el ser humano. Los dos circulan tanto en la sangre como en la linfa, y además se concentran en los principales órganos linfáticos que, en los vertebrados superiores, son los ganglios linfáticos y el bazo.

ID 200223

Electroforesis

Estos tienen una larga vida, e incluso pueden sobrevivir por muchos años en el ser humano sin dividirse. Sin embargo, frente a un antígeno, aumentan de tamaño, se dividen con rapidez, y secretan numerosos factores proteicos que contribuyen con la eliminación del organismo invasor o del material extraño. Es sabido desde hace largo tiempo que la reacción inicial de los linfocitos B contra un antígeno es mediada por una proteína receptora, expuesta sobre la superficie de la membrana celular. El antígeno se une al receptor, lo que origina la división y diferenciación del linfocito B en un clon de plasmocitos. Los anticuerpos producidos presentan las mismas propiedades de unión con los antígenos que posee la molécula receptora superficial de membrana del linfocito B parental. El anticuerpo, de hecho, es idéntico al receptor del linfocito B al que el antígeno se unió originalmente, salvo que no tiene el extremo de la cadena aminoacídica que fija la proteína receptora a la membrana del linfocito B. Tanto el receptor de los linfocitos B como los anticuerpos son llamados inmunoglobulinas. Tras su excreción en la sangre o en la linfa, los anticuerpos se unen al antígeno libre y lo marcan de forma que pueda ser destruido por los otros componentes del sistema inmune. Este cuadro general, en el que el antígeno selecciona un linfocito B basándose en la capacidad de este último para originar un clon de células y secretar anticuerpos contra el antígeno, se denomina: TEORÍA DE LA SELECCIÓN CLONAL En el papel de receptores de los linfocitos B, los anticuerpos están presentes en cantidades pequeñas. Pero, cuando un linfocito B es estimulado por un antígeno, se observan grandes cantidades de estos en el suero. Asimismo, ciertos tipos de tumores de linfocitos B, tal y como los plasmocitomas, los secretan en altos niveles.

393

La fácil disponibilidad de estas concentraciones elevadas de anticuerpos, y el hecho de que toda molécula de anticuerpo puede unirse a un antígeno, ha permitido aislar fácilmente el anticuerpo y adquirir conocimientos importantes sobre la estructura del receptor de los linfocitos B. El linfocito T así como el B, reaccionan contra un antígeno dividiéndose y originando un clon, que luego se diferencia en uno de los numerosos tipos de linfocitos T, específico para el antígeno. Los linfocitos T citotóxicos se fijan al antígeno viral expuesto sobre la superficie de la célula infectada y la eliminan. Los linfocitos T supresores inhiben, en cambio, la respuesta inmune contra el antígeno, transcurrido cierto tiempo desde su comienzo. Los linfocitos T coadyuvantes se unen al antígeno presente en la superficie de un linfocito B, que a su vez ya está unido al antígeno. Entonces, cada linfocito T coadyuvante libera moléculas de acción hormonal símil, las linfoquinas, que le permiten al linfocito B multiplicarse y diferenciarse. Por último, los linfocitos T inductores inician la maduración de los linfocitos T a precursores, obteniendo así células funcionalmente distintas. De esta manera, existe un sistema de dos vías para liberar el gran potencial destructivo de un linfocito B: Una, antígeno libre, por el receptor de los linfocitos B. La otra, antígeno de superficie del linfocito B, por el receptor de los linfocitos T. Los linfocitos T jamás se diferencian en anticuerpos. Por ello, a diferencia del receptor de los linfocitos B, su receptor no está disponible en la cantidad necesaria de sustancia soluble y pura para un análisis satisfactorio. Puesto que son los anticuerpos “construidos” de manera tan refinada y los más eficaces en el reconocimiento de antígenos, por muchos años se pensó que los linfocitos T necesitaban de las moléculas del linfocito B para reaccionar contra el antígeno.

ID 200223

Electroforesis

Resumen LINFOCITOS B Defensa de tipo humoral. Producción de anticuerpos. LINFOCITOS T Defensa de tipo asociada con la célula huésped. No producen anticuerpos Se dividen en T4 y T8 T4 = Linfocitos coadyuvantes e inductores. T8 = Linfocitos citotóxicos supresores. La figura 1 muestra el desarrollo evolutivo de los linfocitos B y T.

PRECURSORES DE LOS LINFOCITOS B LINFOCITOS B

PLASMOCITO

CÉLULA B DE MEMORIA

LINFOCITO T4 COADYUVANTE/INDUCTOR CÉLULA PROGENITORA MULTIPOTENTE

PRECURSORES DE LOS LINFOCITOS T

CÉLULA PROGENITORA MIELOIDE PRECURSORES DE LOS MACRÓFAGOS

LINFOCITO T8 CITOTÓXICO/SUPRESOR

MACRÓFAGO

Las células implicadas en la defensa inmunitaria divergen de precursores comunes, los citoblastos histoespecíficos de la medula ósea.

394

Los linfocitos B se forman en la medula a través de varios estadios y son liberados en la circulación sanguínea y en la linfa. El contacto con el antígeno los estimula a diferenciarse en plasmocitos secretores de anticuerpos y en: células de “memoria”, responsables de la inmunidad permanente. Los precursores de los linfocitos T migran al timo y maduran. Tras su liberación en la sangre o en la linfa, adoptan características bioquímicas y funcionales bien definidas como linfocitos T4, con un papel de coadyuvantes e inductores, y como linfocitos T8, con un papel de agentes citotóxicos y supresores. Los macrófagos comienzan a desarrollarse en la médula ósea como mielohemocitoblastos, que también dan origen a otras clases de leucocitos (no mostrados). Sus precursores circulan en la sangre. Los macrófagos maduros migran a la piel, al bazo y a los ganglios linfáticos, donde tienen mayor probabilidad de encontrar el antígeno. En la figura 2 podemos observar el esquema de acción de los linfocitos T.

La colaboración entre linfocitos T conduce a la destrucción de la célula infectada por un virus. Una célula que expone un antígeno, un macrófago, por ejemplo, ingiere el virus, lo degrada y muestra las proteínas virales antigénicas en la membrana celular, junto con la molécula del CPH (complejo principal de histocompatibilidad) de clase II (CPH II), que es una de las proteínas propias del macrófago. Un linfocito T4 se activa al unirse al mismo tiempo con el antígeno y la proteína codificada por el CPH. Asimismo, la interleucina 1 (IL-1), proteína secretada por el macrófago, tiene un papel en la activación. Los linfocitos T4 secretan entonces la interleucina 2 (IL-2). Esta induce la proliferación de los linfocitos T8, que también han reconocido el antígeno, junto con la proteína codificada por el CPH clase I. Algunos linfocitos T8 destruyen las células infectadas que exponen el antígeno viral. Otros entonces suprimen esta respuesta citotóxica (flecha), al interrumpir la respuesta inmune cuando su función ha finalizado. Los linfocitos T8, para desempeñar las funciones de agentes citotóxicos y supresores, requieren la colaboración de los linfocitos T4, la cual es a través de proteínas solubles o por contacto directo con los linfocitos T8. En la fig. 3 podemos observar el esquema de acción de los linfocitos B y la intervención de los T.

ANTÍGENO PROLIFERACIÓN LINFOCITO T8 IL-2 VIRUS LINFOCITO T4 COLABORACIÓN

LINFOCITO B

DEPRESIÓN

IL-1 MHC II

LINFOCITO B

CÉLULA DE MEMORIA

CRECIMIENTO Y DIFERENCIACIÓN LINFOCITO T4

LINFOCITO B MADURO

IL-2 LINFOCITO T8 VIRUS

MHC I CÉLULA QUE EXPONE AL ANTÍGENO

PLASMOCITO

IL-1

PROLIFERACIÓN

MHC II

CÉLULA INFECTADA

CÉLULA QUE EXPONE AL ANTÍGENO ANTÍGENOS

ID 200223

Electroforesis

395

Los linfocitos T4 ayudan a los linfocitos B a secretar anticuerpos contra el antígeno viral. El linfocito T4 es activado por la interleucina 1 (IL-1) tras reconocer el antígeno junto con una proteína codificada por el CPH clase II (CPH-II), sobre un macrófago u otra célula que exponga un antígeno. El contacto con el linfocito T4 estimula a los linfocitos B a madurar, multiplicarse y diferenciarse en un clon de células memoria y en un clon de plasmocitos secretores de anticuerpos. Los anticuerpos se unen al virus, envolviéndolo e inactivándolo. Las linfoquinas secretadas por los linfocitos T4 favorecen la maduración. Los linfocitos B también pueden reconocer el antígeno libre que circula en la sangre o linfa (arriba a la izquierda), pero aún así requieren la colaboración de los linfocitos T para madurar, crecer y diferenciarse. 1.3 Bases estructurales, inmunoquímicas y funcionales. En el ser humano se distinguen claramente 5 clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. En la fig. 4 se expone de forma esquemática la movilidad electroforética de las inmunoglobulinas:

Las IgG migran en gran medida en la zona gamaglobulínica, pero pueden extenderse anódicamente hasta la región Alfa 2, mientras que las demás clases migran de forma principalmente en la región Beta-Gamma. El estudio de Porter sobre la digestión enzimática de los anticuerpos, representa un gran avance en el conocimiento de la estructura de las inmunoglobulinas. Tras el tratamiento con una enzima proteolítica, por ejemplo, papaína (Fig. 5), la molécula de IgG se divide en dos fragmentos distintos: el fragmento “Fab”, en que es localizado el sitio de combinación con el antígeno y con capacidad de unión al antígeno, y el fragmento “Fc” cristalizable, responsable de una serie de actividades biológicas, tales como la fijación del complemento, el paso transplacentario, la reacción con el factor reumatoide, etc.

Otros estudios revelan que si la digestión se realiza con pepsina, en vez de papaína, se obtiene únicamente el fragmento “F(ab’)2”. Este comprende ambos sitios de unión de la molécula y es, por consecuencia, bivalente; capaz de no sólo unirse específicamente al antígeno, sino también de precipitarlo. El fragmento “Fc” es, en cambio, degradado a pequeños péptidos por la pepsina, que pasan a través de la membrana de diálisis. En lo sucesivo a tales estudios, así como los del grupo de Edelman, sobre la

ID 200223

Electroforesis

396

secuencia aminoacídica de las IgG, se ha ido definiendo de forma clara el modelo estructural actual de las inmunoglobulinas (fig. 6).

P.M. Subclases Cadenas ligeras Fórmula molecular Coeficiente de sedimentación Peso molecular Contenido % en carbohidratos Concentración en suero mg/dl Ritmo se síntesis medio mg/kg/die Distribución % intravascular media % grupo intravascular catabolizado por día Eficacia de aglutinación Presencia en las secreciones Trasplantes Capacidad de sensibilidad cutánea

Según este modelo, cada molécula de IgG (las mismas consideraciones también son válidas para la unidad base de las otras clases inmunoglobulínicas) se compone por 4 cadenas polipeptídicas, en pares y unidas entre sí por puentes de disulfuro. Para ser más precisos, son 2 cadenas H, o pesadas, y 2 L, o ligeras. Si bien las cadenas L son siempre k o λ, las pesadas reciben distintos nombre dependiendo de la clase a la que pertenecen (Tabla 1). Clase Cadenas pesadas Subclases

ID 200223

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

gamma

Alfa

delta

épsilon

G1/2/3/4

A1/2

Electroforesis

397

53000 D

64000 D

70000 D

60000 D

75000 D

κ/λ

κ2/ gamma 2 λ2/ gamma 2

(κ2/alfa2)n (λ2/alfa2)n n= 1,2,3,4

κ2/delta2 λ2/delta2

κ2/épsilon2 λ2/épsilon2

6.5/ 7.0

7.0/ 15.0

(κ2/mu2)n (λ2/mu2)n n= 3,5,6 18.0/ 20.0

6.2/6.8

7.9

155000D

180000 500000 D

950000 D

170000 D

196000 D

2.9

7.5

11.8

11.3

10.7

800-1700

140-420

50-200

3-45

0.01-0.14

0.02

100

++++

0/+

++++

Clase Fijación del complemento Tiempo de reducción medio por días

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

2.8

¿?

Hasta ahora, se han identificado numerosos subgrupos de regiones variables, designadas con un número progresivo, por ejemplo, VκI, VκII, etc. El resto de la cadena H y L es, en cambio, denominada región constante (CH y CL), de secuencia casi inalterada en el ámbito de cada subclase. Por su parte, la región constante de la cadena pesada puede subdividirse en tres segmentos, partiendo del extremo aminoterminal al carboxiterminal, denominados CH1, CH2 y CH3 (fig. 8).

En realidad, los modelos estructurales más recientes, aunque básicamente son similares a los hasta aquí descritos, sugieren una conformación tridimensional molecular diferente, con las cadenas L en el interior en vez de en el exterior, respecto a las cadenas H (Fig. 7). ESQUEMA DE UNA IgG1 HUMANA

Región bisagra

Cadena L Cadena H

El extremo amino terminal, tanto de las cadenas H como de las L, que comprende alrededor de los primeros 110 aminoácidos de cada cadena, se denomina región variable (VH y VL respectivamente). De la secuencia aminoacídica de dicha región variable depende la función de reconocimiento del antígeno y, por tanto, la especificidad anticorporal de una determinada inmunoglobulina (función primaria).

ID 200223

Electroforesis

Según la teoría de las zonas o territorios (dominios compactos), enunciada por Edelman, la estructura de las cadenas polipeptídicas que forman la molécula inmunoglobulínica presenta una regularidad característica, vinculada precisamente a la sucesión de una serie de dominios o regiones homólogas: VH y VL para las regiones variables, CH y CL para las regiones constantes (Fig. 9).

398

  

Sensibilización cutánea Fijación del complemento Propiedad citolítica.

La heterogeneidad de las inmunoglobulinas puede considerarse desde distintas perspectivas, ya que implica diferencias de distintos tipos, es decir: 1. DIFERENCIAS ISOTÓPICAS

Cada dominio es estabilizado por un puente disulfúrico intracatenario, en tanto la región de la cadena pesada en la que se localizan los puentes de sulfuro que unen las dos cadenas H entre sí y a las cadenas L, situada entre CH1 y CH2 y denominada región central o bisagra (región del gozne), no tiene ningún segmento homologo. Esta confiere a la molécula una flexibilidad limitada. Si bien, como ya hemos visto, la región V actúa como sitio de unión para el antígeno, se considera que a cada dominio de la región C también le corresponde una función específica (funciones secundarias): el segmento CH2, por ejemplo, parece desempeñar un papel decisivo en la fijación del complemento (Tabla III). Los fragmentos Fab (1 cadena L + ½ cadena P) condicionan:  Actividad anticorporal

ID 200223

Electroforesis

2. DIFERENCIAS ALOTÍPICAS 3. DIFERENCIAS IDIOTÍPICAS 4. DIFERENCIAS DE CARGA ELÉCTRICA 5. DIFERENCIAS DE AFINIDAD PARA EL ANTÍGENO 1 - DIFERENCIAS ISOTÓPICAS (5 clases, subclases, cadenas H y L) Isotopía: diferencias entre la misma especie. Comprende las cinco clases inmunoglobulínicas, las subclases de las cadenas pesadas, y los tipos de cadenas ligeras. En el suero de cada individuo existen cinco clases de inmunoglobulinas, que difieren entre sí por algunas propiedades fisicoquímicas y por las características inmunológicas de sus cadenas pesadas. Dentro de cada clase también se pueden distinguir, tomando como base las características antigénicas de las cadenas pesadas, las subclases. Las subclases reflejan las variaciones en la secuencia aminoacídica de la parte constante (carboxilo-terminal) de las cadenas pesadas. A diferencia de las cadenas pesadas, existen sólo dos tipos de cadenas ligeras, comunes en todas las clases y subclases de inmunoglobulinas, que se distinguen con las letras κ y λ.

El fragmento Fc (1/2 cadena P x 2) condiciona:  El tamaño y la propiedad de formar polímeros.  Eficacia de aglutinación.  Distribución intra y extravascular.  Entidad del catabolismo y tasa sérica.  Presencia en las secreciones orgánicas.  Paso transplacentario.

399

Por lo tanto, la isotopía está relacionada con las características comunes de todos los sujetos de la misma especie. 2. DIFERENCIAS ALOTÍPICAS Alotípia: diferencias transmitidas por herencia que caracterizan a los diferentes individuos de la misma especie. Individuos diferentes genéticamente, pero de la misma especie, pueden tener inmunoglobulinas de la misma clase diferentes entre sí desde el punto de vista antigénico. Estas diferencias alotípicas son controladas genéticamente y constituyen los grupos séricos Inv y Gm. Los marcadores “Inv” están presentes sólo en las cadenas ligeras de tipo κ, mientras que los “Gm”, sólo en las cadenas gamma, por ejemplo, en las cadenas pesadas de las IgG. Los grupos Gm e Inv son muestra del polimorfismo genético. 3. DIFERENCIAS IDIOTÍPICAS Idiotípia: diferencias estructurales entre los diferentes anticuerpos de la misma clase inmunológica. Los anticuerpos de una determinada especificidad tienen determinantes antigénicos que no poseen otros anticuerpos del mismo individuo o anticuerpos de la misma especificidad de otros individuos. Estos determinantes también pueden variar entre los anticuerpos del mismo individuo contra antígenos similares entre sí. Esta marcada individualidad del anticuerpo está asociada con su región variable. 4. DIFERENCIAS DE CARGA ELÉCTRICA Las inmunoglobulinas normales de una cierta clase se componen por una población de moléculas que poseen diferente movilidad electroforética. Es probable que este polimorfismo sea un reflejo de las diferencias en la secuencia aminoacídica de las distintas moléculas. 5. DIFERENCIAS DE AFINIDAD PARA EL ANTÍGENO Las moléculas anticorporales, aunque son producidas por cada individuo en

ID 200223

Electroforesis

respuesta a un inmunógeno particular, difieren entre sí en afinidad para el antígeno correspondiente. Por afinidad de un anticuerpo se entiende la capacidad de unirse al antígeno correspondiente. A menudo se utilizan indistintamente los términos afinidad y avidez para indicar esta propiedad anticorporal. Estos, sin embargo, no son sinónimos, sino que la avidez depende en parte de la afinidad. La afinidad es la propiedad de combinación de cada sitio de unión del anticuerpo o, considerando que la población anticorporal es heterogénea, la propiedad de unión promedio del anticuerpo para el antígeno correspondiente, cualquiera que sea el número de sitios de unión del anticuerpo. La afinidad de una población anticorporal se obtiene de la promedio de equilibrio constante K0, que es igual a la relación (Ag - Ab) / (Ag) x (Ab), donde el numerador indica la concentración del complejo antígeno y anticuerpo y el denominador, la del antígeno y del anticuerpo en equilibrio. La relación se obtiene, teniendo en cuenta que la reacción entre los reactivos κ1 Ag + Ab <---------> Ag - Ab

κ2 obedece a la ley de acción de las masas (Ag - Ab) / (Ag) x (Ab) = κ1/κ2 = κ, e indica que cuanto más alta es la constante de equilibrio, mayor es la cantidad de anticuerpos que se unen con el antígeno correspondiente en fase de equilibrio. La avidez, por el contrario, depende tanto de la afinidad del anticuerpo como del número de sitios de unión. Por lo tanto, un anticuerpo IgM con 5/10 sitios de unión, posee una avidez que supera a la de un anticuerpo IgG - que cuenta con 2 sitios de unión - de afinidad similar. Las inmunoglobulinas, aparte de encontrase libres en el plasma y en otros líquidos biológicos, donde llevan a cabo las funciones primarias y secundarias

400

de las que ya hemos hablado, también están presentes en la superficie de los llamados linfocitos B o timo independientes, reguladores de la inmunidad humoral, actuando como receptores de membrana. Estos se fijan a la membrana celular mediante el fragmento Fc. Así, los sitios de unión, correspondientes a los fragmentos Fab, quedan libres para unirse de manera específica al antígeno. En condiciones normales, las inmunoglobulinas de membrana se distribuyen de manera más o menos irregular sobre la superficie, con un porcentaje que oscila entre el 10 y el 25% de los linfocitos humanos de la sangre periférica. La frecuencia media de las distintas clases inmunoglobulínicas, que se muestra en la tabla III, surgió durante una reunión internacional de expertos, celebrada recientemente bajo el auspicio de la OMS. Inmunoglobulinas de membrana

Promedio en %

Ámbito de variabilidad %

Ig totales IgG IgA IgM IgD IgE K L

21 7.1 2.2 8.9 6.2 <1 13.9 6.8

16 \ 28 4 \ 12.7 1 \ 4.3 6.7 \ 13 5.2 \ 8.2 ¿? 10 \ 18.6 5 \ 9.3

noglobulinas en la membrana de un linfocito pertenecen a la misma clase y tienen cadenas ligeras del mismo tipo, la presencia de dos clases inmunoglobulínicas distintas en la membrana de la misma célula, por ejemplo, IgG e IgD. Se cree, mejor dicho, que las inmunoglobulinas de membrana responden a etapas sucesivas de maduración en la secuencia: IgD --> IgM --> IgG --> IgA por lo que los linfocitos con receptores IgD serían los menos diferenciados y aquellos con receptores IgG o IgA, los más maduros. No se conoce con precisión el origen de los receptores en la membrana de los linfocitos T o timo-dependientes, reguladores de las funciones de la inmunidad celular. Sin embargo, los principales investigadores creen que en la superficie de los linfocitos T, la actividad receptoría es efectuada por las inmunoglobulinas, lo que, tal vez por estar un poco más profundas en la estructura de la membrana o por demás características fisicoquímicas, resultaría más difícil de demostrar. 1.4 Resumen de las principales características fisicoquímicas, estructurales y funcionales de las cinco clases de inmunoglobulinas humanas IgG Las IgG son la clase inmunoglobulínica cuantitativamente dominante en el plasma, es decir, corresponden al 70-75% aproximado de todas las inmunoglobulinas circulantes (tabla IV).

Como resultado de la reacción con el antígeno, las inmunoglobulinas de la membrana linfocitaria salen a su encuentro agregándose, hasta formar racimos o conglomerados (agregados) sobre uno o más polos de la célula, que pueden apreciarse de forma clara con inmunofluorescencia. La fase posterior de internamiento de los agregados quizá da a la célula la “señal” que la induce a secretar anticuerpos. En varias ocasiones se ha demostrado, aunque por regla general las inmu-

ID 200223

Electroforesis

Propiedades fisicoquímicas de las IgG y sus subclases

401

mg/ml

IgG1 6.6 +/- 1.2

IgG2 3.5 +/- 1.0

IgG3 0.9 +/- 0.2

% sobre el total P.M. de las cadenas

59 51600

30 51600

9 59500

IgG4 0.3 +/0.1 2 51600

pesadas en D Posición en EF P.I. Puentes disulfúricos entre cadenas pesadas Presencia de crioglobulinas

catódica 8.3/9.5

anódica 7.0/7.3

catódica 8.45/8.95

anódica

5/13

subclase IgG4 no fija el complemento, mientras que la IgG2 no se fija a la piel en la prueba de anafilaxia cutánea pasiva. En condiciones normales, la concentración media de IgG circulantes es de 12000 mg/l, con oscilaciones entre los 6000 y los 18000 m/l (Tabla V). IgG: ámbito de referencia

+++

En función de las diferencias en la estructura primaria de la región constante de las cadenas pesadas, se han identificado cuatro subclases de la IgG denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, cuya concentración plasmática disminuye gradualmente.

IgG

mg/dl

Especificidad anticorporal

600/ 800

Cantidad predominante en la respuesta anticorporal secundaria Factor L.E. Patrimonio anticorporal del neonato IgG: algunas propiedades biológicas

LAS CUATRO SUBCLASES DE LA IgG HUMANA

IgG1

IgG2

IgG4

IgG2

IgG3

IgG4

Unión con el complemento

+++

Reacción contra factores reumatoides

Transporte transplacentario

IgG citoplasmáticas

Unión con fagocitos

+ +

Las concentración de las IgG, puesto que atraviesan la placenta, ya es alta en el nacimiento, pero disminuye lentamente en los primeros meses de vida hasta que inicia su síntesis en el recién nacido. Cada zona o dominio tiene, tal como hemos mencionado, dentro de ciertos límites, una cierta especificidad funcional autónoma. En función de esto, se basa el modelo funcional de las IgG (Fig. 11).

Fig. 10 Como se acaba de ver en la fig. 10, el número de puentes S-S que unen a las dos cadenas pesadas entre sí varía de una subclase a otra, quizá en relación con sus diferentes propiedades biológicas: sabemos, por ejemplo, que la

ID 200223

IgG1

IgG de superficie

IgG3

Electroforesis

Subclases

402

MODELO FUNCIONAL DE LAS IgG

IgA: Algunas propiedades biológicas

Subclases Unión con el complemento Semivida en días Valencia para la fijación con el Ag Paso transplacentario Unión con los fagocitos Porcentajes

IgA1

IgA2

0 0 93 %

0+ 0 7%

IgA: distribución y funciones Funciones:

Cada círculo delimita un dominio compacto, estabilizado por un puente disulfúrico intracatenario. La flecha continua corresponde a la región bisagra de la molécula, mientras que las flechas punteadas indican los sitios de posibles bisagras secundarias, susceptibles de la escisión enzimática. IgA Esta clase inmunoglobulínica, si bien en el suero (tabla IV) corresponde al 20% aproximado de todas las inmunoglobulinas circulantes, es, por el contrario, cuantitativamente predominante en las secreciones externas como, por ejemplo, en el calostro, saliva, lágrimas, etc. (tabla VII).

mg/ dl IgA

ID 200223

90 / 430

Electroforesis

 

“Barniz protector” de la mucosa Neutralización viral

 

Distribución en el suero: Estado físico químico = 85% monómeros, 15% dímeros o polímeros Concentración en el adulto normal = 09 / 430 mg/dl

  

Distribución en las excreciones externas: Estado fisicoquímico = 100% dímeros o polímeros Concentración en la saliva = 2.8/15 mg/dl Relación porcentual = 44% IgA1 y 56% IgA2

A las IgA les corresponde el papel de “barniz protector” de las mucosas. Mientras que en el suero las IgA se encuentran en gran medida como monómeros, en las secreciones externas la unidad base se compone por dímeros, algunas veces por polímeros, cuya estructura la integran, según el modelo propuesto por Halpern y Koshland, no sólo las unidades monoméricas del todo

IgA: ámbito de referencia Especificidad anticorporal Anticuerpos dela, considerada, inmunidad local, presentes en las secreciones y en las superficies mucosas Anticuerpos antiinsulÍnicos en la diabetes Anticuerpos antitiroglobulínicos en la tiroides crónica...

403

similares a las que predominan en el suero, sino también dos cadenas polipeptídicas accesorias (Fig. 12)

las cadenas H y L (fig. 13).

DÍMERO DE IgA SECRETORA

IgA1

IgA2 (Am+)

ESQUEMA ESTRUCTURAL DE LAS SUBCLASES DE LA IgA HUMANA

IgM a) La porción secretora o de transporte (S), que es sintetizada por las células epiteliales de las mucosas. b) La cadena J, propia de todas las inmunoglobulinas poliméricas, cuya función es unir entre sí cada monómero que compone al polímero. Las cadenas J son sintetizadas por los plasmocitos que sintetizan las inmunoglobulinas poliméricas. En cuanto al destino de las IgA, procedentes de los plasmocitos del velo característico de muchas mucosas, la mayoría de las secretoras llegan a la superficie de las mucosas para formar el “barniz protector”, al que ya hemos hecho referencia, y un menor número a la circulación, para formar parte del “grupo” de las IgA circulantes. Las IgA comprenden dos subclases, de las cuales, las IgA1 constituyen el 93% y las IgA2 el 7% de las IgA séricas. En las secreciones externas, por el contrario, se observa un ligero predominio de la subclase IgA2. Estas presentan además, al menos para la variante alotípica Am+, un rasgo estructural, la ausencia de puentes de disulfuro entre

ID 200223

Electroforesis

En condiciones normales las IgM representan entre el 7% y el 10% de las inmunoglobulinas circulantes (tabla VIII). IgM: ámbito de referencia mg/dl

IgM

45/190

Especificidad anticorporal Cuota predominante de la respuesta inmunitaria primaria Isohemaglutininas Crioaglutininas Factor reumatoide...

IgM: algunas propiedades biológicas

Subclases Unión con el complemento Semivida en días Valencia para la fijación con el Ag

404

IgM ++ 5 5 (10)

Paso transplacentario Unión con los fagocitos

Conviene destacar además que en algunas condiciones patológicas (lupus, enfermedad de Waldenstrom, lepra) se detectan cantidades considerables de monómeros de IgM o de IgM 7S en la circulación, que son productos de la síntesis, más que de la degradación, de las macromoléculas IgM, y pueden mostrar actividad anticorporal. La concentración sérica de las IgM varía de 45 mg/dl a 190 mg/dl en condiciones normales, y tiende a ser significativamente mayor en las mujeres.

0 0

Estructuralmente, las IgM son siempre de pentámetros, unidos entre sí tanto por puentes de disulfuro como a través de la cadena J. Es más, se ha propuesto el “modelo de hebilla” para las IgM (Fig. 14), según el cual los monómeros están unidos entre sí por puentes S-S localizados en el fragmento Fc, mientras que la primera y la última unidad monomérica se unen con la ayuda de la cadena J.

IgD Si bien las características fisicoquímicas y estructurales de las IgD (tabla I) son similares a las de otras inmunoglobulinas monoméricas, los intentos de identificar en esta clase una o más actividades anticorporales han resultado casi siempre infructuosos. Las únicas actividades que, con métodos indirectos, se han atribuido a la IgD, son la actividad antinuclear, la actividad contra la penicilina y contra la albúmina bovina (tabla IX).

CADENA J

UNIDAD MONOMÉRICA

IgD: ámbito de referencia

mg/dl IgD

MODELO ESTRUCTURAL DE LA INMUNOGLOBULINA M

Fig. 14

IgD: algunas propiedades biológicas

Subclases Unión con el complemento Semivida en días Valencia para la unión con el Ag Paso transplacentario Unión con los fagocitos

Las IgM son las inmunoglobulinas predominantes en número y precocidad de aparición en la respuesta anticorporal primaria. Si bien en teoría los sitios de combinación son diez, dos por cada monómero, la valencia real de las IgM es de cinco, tal vez a causa de un bloqueo por inhibición estérica de la mitad de los sitios de combinación.

ID 200223

Electroforesis

0.3 / 40

Especificidad anticorporal Aun no bien precisada Algunos anticuerpos anti núcleo Algunos anticuerpos anti insulina

405

IgD ¿? 3 2 0

Pero, una serie de estudios muy recientes parecen arrojar nueva luz sobre el significado inmunológico de las IgD. De hecho, se ha demostrado que en la sangre periférica del feto o neonato hay un claro predominio de células con receptores de membrana IgD (18% aproximado, igual a más del 50% de todos los linfocitos B de la sangre periférica), a pesar de que en el suero fetal las IgD son prácticamente indetectables. Y también en el adulto, en el que las IgD circulantes constituyen tan sólo 1/500 de todas las inmunoglobulinas séricas, en promedio el 3% de los linfocitos en la sangre periférica (igual al 18% aproximado de los linfocitos con inmunoglobulinas de membrana) poseen receptores de tipo IgD. Puesto que se detecta también tal predominio en numerosos casos de leucemia linfática crónica, parece lógico suponer que las IgD juegan un crucial en la actividad receptora de la membrana durante la vida fetal o neonatal. Desde este punto de vista, los linfocitos de la leucemia linfática crónica, por lo tanto, deben ser células de carácter fetales que se detuvieron en una fase muy temprana del proceso normal de diferenciación. En condiciones normales la concentración plasmática de las IgD varía en el adulto dentro de límites bastante amplios, siendo de 3 mg/dl en promedio, que equivale al 0.2% de las inmunoglobulinas totales.

Sin embargo, es hasta esta última década que las IgE fueron reconocidas como la clase inmunoglobulínica de individualidad específica, responsable principal - si no exclusivo - de la actividad reagínica. IgE: ámbito de referencia

IgE

Anticuerpos de la anafilaxias o reaginas

Subclases

IgE

Unión al complemento

Semivida en días

2.5

Valencia para la unión al Ag

Paso transplacentario

Unión a fagocitos

Los fenómenos de hipersensibilidad inmediata, denominados de un modo genérico como alérgicos, se conocen desde hace más de un siglo. Entre todos estos, el asma bronquial, la fiebre de heno, la rinitis alérgica, el eczema atópico, etcétera, son, sin duda, los más frecuentes. Se sabe también que, de los clásicos experimentos de Prausnitz, en el suero de los alergopáticos hay sustancias o reaginas que, tras ser depositadas en el tejido subcutáneo de un receptor sano, son capaces de causar una reacción de hipersensibilidad local al contacto con el antígeno o alérgeno contra el que ha sido sensibilizado el donador.

ID 200223

06/780

IgE: algunas propiedades biológicas

IgE

Electroforesis

Especificidad anticorporal

ng/dl

Unión a mastocitos homólogos

Las IgE tienen una estructura monomérica y características fisicoquímicas un poco diferentes respecto a las de otras clases con estructura monomérica similar (IgG, IgD, y la mayoría de las IgA séricas). Estudios recientes sobre la secuencia aminoacídica, señalan que el elevado peso molecular de las IgE (cerca de 200.000 daltonios) se relaciona con la existencia de un dominio adicional (CH4, véase la fig.5) en las cadenas pesa-

406

das o épsilon de esta clase, tal y como también ocurre en las demás, pero en las cadenas mu.

PRIMERA FASE: SENSIBILIZACIÓN

Cadena ligera

Mastocito G.Basófilo

Ac sensibilizante (IgE)

Célula sensibilizada

SEGUNDA FASE: REACCIÓN DESENCADENANTE

MODELOS ESTRUCTURAL DE LA CADENA ÉPSILON Célula sensibilizada

Otra peculiaridad de las IgE es que poseen dos regiones bisagra en las que se encuentran los puentes de disulfuro que unen las dos cadenas épsilon:

La otra entre los segmentos CH2 y CH3 Fisiopatológicamente, las IgE son anticuerpos homocitotrópicos que se fijan a la superficie de los granulocitos basófilos o a los mastocitos mediante su fragmento Fc, dejando, claro está, libres los dos sitios de unión, listos para reaccionar contra el alérgeno específico cuando se presente la oportunidad. La actividad citotropa parece depender de las regiones homologas CH3 y/o CH4. En el momento de la reacción antígeno y anticuerpo, a través del fragmento Fc, se transmite a la célula una “señal” que conduce a la activación enzimática y luego a la liberación de los llamados mediadores químicos de la hipersensibilidad inmediata, a los que se debe, en definitiva, las manifestaciones clínicas de la alergia. Las dos fases a través de las que se manifiesta la hipersensibilidad inmediata se esquematizan en la fig. 16.

ID 200223

Activación enzimática Histamina, 5HT, SRS, etc.

1.5 Componentes monoclonales en el suero y en la orina Definición El componente monoclonal se define como una banda proteínica detectada en el proteinograma electroforético del suero o de la orina, con las siguientes características:

Una entre los segmentos CH1 y CH2

Electroforesis

Alérgeno

movilidad homogénea (debido a la carga eléctrica uniforme de la proteína constitutiva) constituida inmunológicamente por un solo tipo de cadena inmunoglobulínica pesada y/o por un sólo tipo de cadena inmunoglobulínica ligera Esto último es el requisito imprescindible para confirmar la monoclonalidad. Pero hoy día, con el término CM no sólo nos referimos a la proteína relacionada con la proliferación neoplásica del clon inmunocítico, sino a cualquier banda inmunoglobulínica con las características fisicoquímicas mencionadas. ORIGEN DEL COMPONENTE MONOCLONAL El componente monoclonal es el resultado de la proliferación de un clon de

407

plasmocitos que la homeostasis inmunoglobulínica no puede controlar. ESTUDIOS DE LABORATORIO Los problemas que enfrenta el laboratorista durante el estudio de los componentes monoclonales pueden esquematizarse en los siguientes puntos:

con las fraccionas proteínicas normales, por ejemplo: • Los aumentos injustificados de haptoglobina, de transferrina, o del complemento, o una hipogammaglobulinemia marcada, que hacen sospechar la presencia de componentes monoclonales ocultos. • En este caso, está indicada la determinación de las proteínas implicadas con método inmunoquímico, o se aconseja proceder directamente con la tipificación.

Identificación de la anomalía sospechada Interpretación de los resultados

La morfología del componente M puede adoptar formas específicas:

Proteinuria de Bence Jones

• Las IgD monoclonales pueden originar bandas difuminadas por degradación postsintética in vivo o in vitro.

Identificación de la anomalía sospechada

• La enfermedad por cadenas pesadas puede presentar componentes M difíciles de identificar por dos razones: en proporciones variables, dependiendo de la clase inmunoglobulínica involucrada, que van del 50% en las alfa, al 75% en las mu, a menudo no suelen observarse cambios significativos en la electroforesis. Cuando se presentan, adoptan casi siempre la forma de una banda de base amplia y márgenes difusos, simulando un aumento de tipo policlonal. Esto se debe a que son cadenas delta, de masa molecular variable de paciente a paciente e inferior a las contrapartes normales, que, en su mayor parte, tienden a formar dímeros de alto contenido en carbohidratos.

La detección del componente M puede ser un hallazgo casual (como suele ocurrir durante la electroforesis rutinaria) o la confirmación de laboratorio de la sospecha clínica. En el caso de un hallazgo ocasional, la condición imprescindible para no perder los componentes M es disponer de una separación electroforética adecuadamente resolutiva. Los componentes M pueden presentarse de forma demasiado variable en el proteinograma electroforético, tanto por localización como por aspecto morfológico. De hecho, los podemos encontrar en posiciones que suelen estar libres de otras proteínas visibles, condición que no plantea problemas de detección, sobre todo al tratarse de concentraciones elevadas del componente M y/o en combinación con una disminución de las gammaglobulinas policlonales. En cuanto a la velocidad de migración, los componentes M pueden situarse en cualquier lugar de la zona α-1 a la zona γ catódica, a veces con retromigración. Por tanto, los de identificación más difícil son los que migran coincidiendo

ID 200223

Electroforesis

• Los componentes monoclonales IgM pueden ocasionar problemas específicos en relación con la electroforesis y, por tanto, con la inmunofijación, por su estructura polimérica y tendencia a formar complejos que no migran del punto de deposición o que originan distorsiones en el proteinograma. Esto es más habitual con los soportes de acetato, pues tienen poros más pequeños que los de la agarosa.

408

Las condiciones que plantean una interpretación difícil son: • El hallazgo nada raro de múltiples bandas anómalas corresponde a la proliferación anómala de múltiples clones de plasmocitos o a modificaciones postsintéticas como la polimerización, o incluso a la presencia simultánea de inmunoglobulinas completas y de cadenas ligeras libres del mismo tipo. Asimismo, es preciso hacer mención de los cuadros de gammapatía oligoclonal, debidos quizá a una estimulación antigénica prolongada.

• Componentes M pequeñísimos, inferiores a 1 g/l, no acompañadas por inmunosupresión de las policlonales. • Componentes M IgM, pues su peso molecular dificulta la difusión y ocasiona una precipitación escasa. • La presencia de múltiples bandas del mismo componente M, diversos estadios de agregación molecular, condiciona una pérdida de resolución.

Ahora examinemos las anomalías cualitativas del proteinograma no atribuibles al componente M. Nos referimos a la presencia de polimorfismos genéticos, tales como:

Muchas de estas dificultades se han superado mediante la inmunofijación: Proteinuria de Bence Jones Pasemos ahora a revisar los problemas conexos a la identificación de los componentes M en las orinas y, en particular, de la proteína de Bence Jones, puesto que es el hallazgo más frecuente de componentes monoclonales urinarios. La proteína de Bence Jones está compuesta por cadenas ligeras libres monoclonales. Por lo general, los plasmocitos producen un ligero exceso de cadenas ligeras, respecto a la alícuota que va sobre las cadenas pesadas para formar inmunoglobulinas completas. En cualquier caso se trata de una cantidad modesta, de tipo de policlonal, que es filtrada libremente por el glomérulo y reabsorbida, en parte, por el túbulo contorneado proximal, sede del catabolismo de las proteínas de bajo peso molecular. La excreción diaria del paciente “sano”, con los siguientes parámetros generales, oscila en torno a los siguientes valores: Proteinuria total < 150 mg/24h IgG < 100 mg/24h

La aloalbuminemia, la heterocigosis de la α 1 antitripsina, de la transferrina y del C3. Proteínas distintas de las inmunoglobulinas dan lugar a bandas delgadas: • La α fetoproteína, en caso de una concentración elevadísima. • El complejo α1 antitripsina y proteasa. • Los complejos haptoglobina y hemoglobina o hemoglobina libre, por hemolisis in vitro. • El C3 convertido, en caso de sueros no frescos. • El fibrinógeno, en caso de una coagulación muy lenta. • La lisozima en las leucemias mielomonocíticas y monoblásticas. • La proteína C reactiva, sobre todo en ciertas disoluciones amortiguadoras no barbitúricas. La interpretación de los resultados La interpretación de los resultados es más fácil cuando la concentración del componente M es significativa, lo que precisa una dilución adecuada de la muestra, o en caso de una reducción marcada de las inmunoglobulinas policlonales de la misma clase.

ID 200223

Electroforesis

409

Tipo cadena ligera libre

Valor promedio en mg/24h

Rango en mg/24h

K (kappa) L (lambda)

3.1 1.45

1.9 / 7.1 0.7 / 3.4

Pero, en pacientes no mielomatosos, la proteinuria supera los 250 mg/24h, y las IgG oscilan entre los 100 y los 480 mg/24h. Tipo cadena ligera libre

Valor promedio en mg/24h

Rango en mg/24h

K (kappa) L (lambda)

45 35

3.8 / 211 16 / 62

Normales (heterogéneas) o monoclonales (homogéneas) En cambio, la proteína de BJ es un grupo particular de paraproteínas. Las cadenas ligeras están formadas por unos 210 residuos aminoacídicos. Las pesadas, por casi el doble. Las cadenas pesadas se unen entre sí, así como con las cadenas ligeras, por puentes - intercatenarios - de disulfuro. Dentro de cada cadena, puentes de disulfuro suplementarios, o bien, intercatenarios, propician la formación de asas (fig. 18).

Las proteínas de Bence Jones son sustancias proteínicas estrechamente relacionadas, por origen y estructura, con las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas normales (Ig). Estás se detectan predominantemente en las orinas y, rara vez, en la sangre de pacientes afectados por mieloma o macroglobulinemia de Waldenstrom, al igual que solas o, a menudo, asociadas con inmunoglobulinas monoclonales en concentraciones muy variables. En las inmunoglobulinas humanas, las cadenas pesadas van acompañadas de dos cadenas ligeras idénticas, ya sean kappa o lambda (fig. 17) Inmunoglobulina

Cadenas ligeras

Cadenas pesadas

La molécula de IgG, por ejemplo, comprende 12 regiones que reciben el nombre de dominios. En cuanto a la composición aminoacídica, las cadenas pesadas están compuestas por un dominio “variable” (V) y tres “constantes” (C1, C2 y C3); las cadenas ligeras, por un dominio “variable” (V) y uno “constante” (C). La demostración inmunoquímica de una proteína de BJ o de una cadena ligera se efectúa en base a este dominio C. La estructura molecular de los monómeros inmunoglobulínicos puede representarse de manera muy simplificada (Fig. 17 y 18).

Proteínas de Bence Jones (Cadenas ligeras libres)

Esta estructura es la misma para ambas formas inmunoglobulínicas:

ID 200223

Electroforesis

410

En la orina suele detectarse la proteína BJ como dímero, con un peso molecular de unos 44000 daltonios. Sin embargo, no es raro que se detecten formas moleculares diversas, tales como fragmentos derivados de escisiones enzimáticas y de asociaciones transitorias de varios productos (“productos de degradación”), etc. A causa del pequeño tamaño molecular de las proteínas BJ monoméricas y diméricas que atraviesan del filtro renal, la concentración de BJ suele ser más elevada en la orina que en el suero. En contraste, la concentración de proteínas BJ tetraméricas es mucho mayor en el suero respecto a la orina, e incluso pueden estar ausentes en esta última. En base a las propiedades antigénicas, se distinguen dos tipos de proteínas de BJ, denominadas kappa y lambda según la nomenclatura propuesta por la OMS. Ambos tipos se encuentran, como ya se mencionó, en las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas normales y monoclonales. Determinantes antigénicas de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas Así como en otros componentes de la inmunoglobulina, también se observan estructuras diversas en las cadenas ligeras, o en una proteína de BJ, denominadas determinantes antigénicas, y contra los que un animal inmunizado, con la proteína correspondiente, produce anticuerpos específicos. Se tratan de segmentos formados por unos cuantos residuos aminoacídicos, que, estéricamente, son reconocidos como extraños por el sistema inmune del animal. Las proteínas de BJ son inmunógenos relativamente fuertes. Tras su administración parenteral, la mayoría de los animales de laboratorio producen anticuerpos específicos contra ellas, y estos últimos, después de un tratamiento adecuado, pueden utilizarse como inmunoreactivos. Para la determinación de una proteína de BJ, son esenciales los anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos de la fracción constante de las cadenas ligeras (C).

ID 200223

Electroforesis

El estudio con antisueros de animales previamente inmunizados no sólo con distintas proteínas de BJ, sino que también con cadenas ligeras normales aisladas, fragmentos de inmunoglobulinas, etc., sugiere que cada cadena ligera o proteína de BJ posee dos grupos de determinantes específicos (k o λ): • Los de la superficie de la cadena, llamados determinantes externos o de superficie. • Los del interior de la molécula, internos u ocultos. Sí se inmuniza con inmunoglobulinas completas, por ejemplo, IgG, o con fragmentos de estas, que contienen otros dominios además del C, en lugar de con cadenas ligeras aisladas, se forman sólo anticuerpos contra los determinantes “externos” de la superficie de la molécula. Es fácil imaginar que los determinantes “internos” están enmascarados u ocultos estéricamente, por ejemplo, los del dominio C por los dominios colindantes C1, de modo que los linfocitos productores de anticuerpos no pueden acceder a las estructuras internas (fig. 19).

411

las proteínas de BJ de tipo correspondiente, o contra cadenas ligeras libres aisladas, de manera que son inmunoreactivos específicos idóneos para la determinación directa de esta proteína en el suero, en las orinas y otros líquidos biológicos. Un desequilibrio mayor entre la síntesis de cadenas pesadas y de cadenas ligeras caracteriza a casi el 60% de los mielomas, entre el 47% y el 70% según Perry y Kyle. Esto condiciona una afluencia desproporcionada de cadenas ligeras al riñón y su consecuente eliminación urinaria (excedida la capacidad de reabsorción). También existe la bien conocida forma de mieloma micromolecular, con síntesis exclusiva de cadenas ligeras por el clon maligno. En determinados casos, e incluso en situaciones no asociadas con claridad y evidencia con una enfermedad linfoproliferativa maligna (GMSI), se puede detectar proteinuria de Bence Jones, por lo general, de grado moderado. Se observa igualmente una cantidad modesta de Bence Jones en patologías graves, como en la amiloidosis y en la enfermedad por depósito de cadenas ligeras. La indicación para su determinación tiene su origen en el hallazgo precedente de un componente M en el suero. En este caso, el laboratorio es quien debe solicitar una muestra de orina. Otra opción es bajo petición exclusiva por el médico, sobre todo en relación con el uso de medios de contraste radiológicos. Entre los métodos de estudio se distingue:

Mediante una absorción adecuada, podemos eliminar todos los anticuerpos secundarios, salvo aquellos contra los determinantes C “externos”. Los anticuerpos supérstites son específicos, es decir, tienen especificidad anti-kappa o anti-lambda. En caso de que estén presentes ambos anticuerpos, podemos obtener, mediante la absorción con inmunoglobulinas monoclonales correspondientes, inmunoreactivos específicos anti-kappa o anti-lambda. En cambio, sí se inmunizan animales con una proteína de BJ, kappa o lambda, o con cadenas ligeras libres, se forman tanto anticuerpos contra los determinantes “externos” como contra los “internos”. Estos últimos son reconocibles por el animal, pues ya no los ocultan más las demás partes de la molécula. Así obtenemos un antisuero con dos poblaciones de anticuerpos específicos, una contra los determinantes “externos” y otra contra los “internos”. Ya que la producción de antisueros contra cadenas ligeras es más difícil con inmunoglobulinas completas que con proteínas de BJ, la mayoría de los fabricantes usan la segunda como inmunógeno. Por desgracia, esto no siempre se aprecia en la etiqueta del producto. De la representación esquemática de la imagen 19 es fácil deducir que los antisueros - o preparados anticorporales - reaccionan con los determinantes “externos” de todas las inmunoglobulinas completas y con los determinantes “externos” e “internos” de las PBJ o de las cadenas ligeras aisladas. Por lo tanto, pueden servir para identificar el tipo (kappa o lambda) de la cadena ligera de todas las inmunoglobulinas monoclonales y proteínas de BJ y, por supuesto, reaccionar también con los determinantes “externos” de C de todas las inmunoglobulinas normales. Por otro lado, en los antisueros que contienen ambas poblaciones de anticuerpos se pueden eliminar aquellos contra los determinantes “externos” de las cadenas ligeras mediante su absorción con una inmunoglobulina compuesta sólo por determinantes “externos”, por ejemplo, con una IgG. De esta manera podemos obtener antisueros específicos contra determinantes “internos”, que no reaccionan ya más contra ninguna inmunoglobulina, sino solamente contra

ID 200223

Electroforesis

LA PRUEBA DE DETECCIÓN Y LA DE CONFIRMACIÓN Entre las primeras que se han de abandonar son la termoprecipitación por su escasa sensibilidad, superior al g/l, y la prueba cualitativa de la proteinuria mediante tiras reactivas por su falta de especificidad, puesto que sólo detecta proteínas ácidas. La electroforesis en orinas concentradas es la técnica más general. 1.6 Relevancia clínica del componente M en el suero y orina

412

El hallazgo de un componente M en el líquido biológico de un paciente plantea un problema de diagnóstico diferencial entre las siguientes condiciones morbosas: Cuadros clínicos de las gammapatías monoclonales

• Enfermedad por cadenas pesadas y ligeras delta C) Formas clínicamente manifiestas por los efectos patológicos del compuesto M:

A) Formas clínicamente ocultas: asintomáticas o presintomáticas

• • • • • • •

Gammapatías monoclonales de significado incierto (GMSI) asociadas a: • Inflamaciones crónicas y procesos infecciosos, por ejemplo, osteomielitis, tuberculosis, infecciones biliares crónicas, pielonefritis, artritis reumatoide, etc. • Sarcoma de Karpof y SIDA. • Neoplasias no reticulares, en particular, tumores intestinales, del tracto biliar y de las mamas. • Lipodistrofia, en particular con la enfermedad de Gaucher, hipercolesterolemia familiar y xantomatosis. Gammapatías monoclonales transitorias, asociadas con: • Hipersensibilidad a los fármacos, tales como, la difenilhidantoína y las sulfonamidas. • Infecciones virales. • Cardiocirugías: prótesis valvulares.

Criterios diferenciales entre gammapatías monoclonales de significado incierto y mieloma múltiple Criterio G.M.I.S. Mieloma múltiple Evolutiva Ausentes Progresiva Lesiones óseas Ausentes Muy frecuentes Proteinuria de B.J. Ausente o < 200 mg/die Presente en casi el 50% Plasmocitos medular Generalmente < 20% > 20% Índice de marcaje < 1% > 3% Actividad de la fosfatasa Negativa Intensamente positiva ácida intraplasmocitaria Concentraciones del Generalmente < 30 g/l Generalmente > 30 g/l C.M. sérico (IgG e IgA) Concentraciones de las Ig Normal Reducida policlonales Prueba de la hipocalcemia inducida por calcitoNegativo Positivo nina

B) Formas clínicamente manifiestas vinculadas con la proliferación del clon neoplásico: • • • • • • • •

Mieloma múltiple Mieloma solitario Plasmocitoma extramedular Leucemia plasmacelular Macroglobulinemia de Waldemstroem Enfermedad por cadenas pesadas gamma Enfermedad por cadenas pesadas alfa Enfermedad por cadenas pesadas mu

ID 200223

Electroforesis

Amiloidosis AL Enfermedad por depósito de inmunoglobulinas o cadenas Liquen mixedematoso (mucinosis papular) Síndrome de Fanconi del adulto Polineuropatías Síndrome POEMS Síndrome de extravasación capilar

413

Del significado expresado en la tabla, se deduce que el hallazgo de un componente M no coincide con la presencia de una condición maligna. De hecho, menos del 20% de los pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto desarrollan mieloma múltiple, amiloidosis o linfoma, incluso después de más de 10 años de seguimiento. Los criterios que figuran en la tabla son sólo indicativos y de ayuda. Cabe señalar que el nivel del componente M tiene un valor discriminatorio bajo. Pues se conocen casos con componentes M de más de 50 g/l que se mantuvieron “benignos” por años, mientras que, por el contrario, casos con componentes M de menos de 20 g/l pueden tener una evolución rápida y poco favorable. El nivel del componente M refleja la dinámica de síntesis, que varía de forma significativa entre clones y clones de plasmocitos. Por lo general, los clones IgA sintetizados tienen una dinámica productiva del componente M más baja que los clones IgG secretores. Así que, para conservar el mismo nivel del componente M circulante, es necesaria una gran masa de plasmocitos IgA secretores. De ello se desprende que frente a un nivel constante del componente M a lo largo del tiempo, el pronóstico es peor en el caso de componentes M IgA.

Se diferencia de la amiloidosis AL en que los depósitos de cadenas ligeras no están organizados en láminas beta, birrefringentes a la luz polarizada, sino como depósitos amorfogranulosos. Las cadenas ligeras kappa son más frecuentes a diferencia de la amiloidosis AL. Los sitios de deposición son similares en ambas formas. La concentración de cadenas ligeras libres suele ser muy baja en la orina. El diagnóstico se basa habitualmente en los resultados de la determinación de depósitos de cadenas ligeras mediante la inmunofluorescencia de la biopsia renal. 3) Síndrome de Fanconi del adulto Suele asociarse con una gammapatía monoclonal IgGK (son raros los casos de IgGL) con proteinuria de Bence Jones tipo k. El síndrome de Fanconi, acompañado por glicosuria, fosfaturia, etc., puede preceder en años la detección de la gammapatía monoclonal, que, por lo general, evoluciona tórpidamente. Se presume que las cadenas ligeras libres kappa son tóxicas para el túbulo contorneado proximal.

1.7 Problemas del laboratorio en la identificación de algunos componentes monoclonales.

4) Anemias hemolíticas por crioanticuerpos (crioaglutininas)

1) Amiloidosis AL

Suelen ser IgM monoclonales, presentes en una concentración baja, identificables después de la adsorción y elución del eritrocito.

Es necesario el estudio detallado de las orinas concentradas para la detección de cadenas ligeras libres o sus fragmentos, sobre todo de cadenas lambda. Depósitos organizados en láminas beta, birrefringentes a la luz polarizada.

5) Enfermedad por cadenas pesadas En el caso de cadenas pesadas alfa no se aprecia un pico monoclonal. La determinación de cadenas pesadas libres suele realizarse por indicación del médico, o bien, resulta de la comparación entre la determinación de las inmunoglobulinas y el cuadro electroforético; frente a un nivel elevado de IgA, no se

2) Enfermedad por depósito de cadenas ligeras

ID 200223

Electroforesis

414

aprecia ningún pico en el proteinograma. Las cadenas pesadas gamma y mu pueden, pero no siempre, originar un pico electroforético.

do por IgG kappa o lambda y algunos episodios periódicos de extravasación vascular que resultan en choque hipovolémico y angioedema generalizado. 1.8 Problemas particulares de interpretación Hay ciertos casos que plantean problemas de interpretación en relación con la lectura de la inmunofijación. Un ejemplo típico es la presencia de crioglobulinas en el suero. Estas son proteínas o complejos de proteínas que precipitan a baja temperatura y generalmente se descongelan a 37°C. Así que, para un debate más completo sobre el tema, consulte el capítulo 25 “Notas sobre Hydrasys”. Tipología de las crioglobulinas Continuamos con una serie de indicaciones sobre la tipología de las crioglobulinas: Crioglobulinemia I de Brouet • Macroagregado por interacción electrostática intramolecular. • Inmunoglobulinas monoclonales que tienden a formar consigo mismas, por causas fisicoquímicas, complejos de alto peso molecular. • Es más frecuente la clase M κ. • La clase G y las subclases G3, G1 y G2 respectivamente, son menos frecuentes. • Rara vez la clase A. • Organización del crioprecipitado: • Amorfa; sin organización supramolecular. • Tubular; organizada y muy hidratada. • Cristalina; organización muy compacta. • La organización más dañina: IgG3 en criocristales. Crioglobulinemia II variante “a” de Brouet • Inmunocomplejos. • La génesis formativa muestra actividad biológica por inmunoglobulinas. • Inmunoglobulinas monoclonales, por lo general M, con actividad anticorpo-

6) Liquen mixedematoso (mucinosis papular) Suele asociarse con un componente monoclonal IgG lambda de escasa cuantía en el extremo catódico. 7) Síndrome POEMS Es una rara variante de discrasia plasmacelular caracterizada por: • Polineuropatía con endocrinopatía • Osteoesclerosis • Policitemia • Hepatoesplenomegalia • Linfadenopatía • Pigmentación cutánea • Hipertricosis El componente M es pequeño, más frecuente IgG que IgA, con gran predominio de las cadenas ligeras lambda. En estos casos la evolución de la enfermedad es típicamente indolente. 8) Polineuropatías Es cada vez más y más frecuente la descripción de polineuropatía crónica progresiva (sensitiva, motriz o mixta) asociada con G y M. Asimismo, pueden estar asociadas con mieloma múltiple, macroglobulinemia o amiloidosis, aunque la polineuropatía puede ser la única y más importante manifestación clínica. 9) Síndrome de extravasación capilar Es un síndrome poco frecuente, se han reportado sólo 9 casos, caracteriza-

ID 200223

Electroforesis

415

ral contra las IgG policlonales, rara vez contra las IgA. • Tendencia a formar complejos con inmunoglobulinas policlonales y factores reumatoides. • El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. • Los factores reumatoides monoclonales resultan de la proliferación anómala de un clon de plasmocitos. Crioglobulinemia II variante “b” de Brouet • Inmunocomplejos. • La génesis formativa muestra actividad biológica por inmunoglobulinas. • Inmunoglobulinas oligoclonales, por lo general M, con actividad anticorporal contra las IgG policlonales, rara vez contra las IgA. • Tendencia a formar complejos con inmunoglobulinas policlonales y factores reumatoides. • El factor reumatoide actúa en particular sobre las inmunoglobulinas agregadas y menos sobre las nativas. • Los factores reumatoides monoclonales resultan de la proliferación anómala de un clon de plasmocitos. Crioglobulinemia III de Brouet • Inmunoglobulinas policlonales • Su composición deriva de una o más inmunoglobulinas. • Los factores reumatoides implicados resultan de la perturbación y magnificación del proceso fisiológico de inmunomodulación durante la respuesta al antígeno. Crioglobulinemias “microheterogéneas” de Musset • Presencia de dos o más componentes monoclonales ligeros. • Presencia de un entorno policlonal. • Es más frecuente el tipo G y M. Crioglobulinemia II/III y II/III v de Tissot • Presencia de M monoclonales y policlonales.

ID 200223

Electroforesis

• Asociación de las M con IgG policlonales. • Presencia de M oligoclonales. • Asociación con trazas de inmunoglobulinas policlonales. Clínicamente se distinguen: a) Las crioglobulinemias secundarias o relacionadas con otras patologías que pueden ser de diferente naturaleza: • Enfermedades mas. • Enfermedades etc. • Enfermedades malaria, etc. • Enfermedades fritis crónica.

linfoproliferativas: mieloma de Waldemstroem, LLC y linfoautoinmunes: LES, artritis reumatoide, panarteritis nodosa, infecciosas: hepatitis viral, mononucleosis infecciosa, sífilis, crónicas de etiología incierta: hepatitis crónica, glomerulone-

b) La crioglobulinemia mixta esencial no asociada a otra patología • Se caracteriza por un cuadro sintomatológico relacionado con la acción dañina del crioprecipitado, representado por purpura, manifestaciones de tipo Raynaud, artralgias y alteraciones renales. 1.9 Notas técnicas sobre la toma y conservación del suero y orina Suero: No es imprescindible que el paciente este en ayuno. Si la muestra se va a analizar dentro de pocos días, puede conservarse a 4°C, siendo conveniente añadir de azida de sodio 1 g/l. Las distintas inmunoglobulinas se comportan diferentes durante su conserva-

416

ción, en específico: • Tanto la IgG como la IgA resisten bien el estrés térmico. Además, pueden conservarse por periodos largos a 4°C en presencia de azida de sodio, o mejor aún, congeladas a -20°C. • Respecto a las IgM, estas deben ser protegidas de la congelación y las bajas temperaturas. Lo mejor es conservar el suero a 4°C en azida de sodio. • Las IgD son demasiado sensibles a las enzimas proteolíticas plasmáticas (plasminas). Recójase la muestra en una probeta que contenga ácido aminocaproico, analice el suero lo antes posible y consérvelo congelado. • La IgE es el tipo más raro de componente monoclonal. Trate la muestra lo más rápido posible y congélela lo antes posible. • Si se buscan crioglobulinas, es necesario mantener la muestra a 37°C y centrifugarla a calor o a alta velocidad durante un período corto.

pues debe ser perfeccionada por la cultura del laboratorista. Si el suero y la orina no muestran componentes monoclonales o anomalías indefinibles en el proteinograma y no hay una sospecha clínica fundada, la búsqueda puede concluirse a este nivel. La característica fundamental de un componente M, puesto que es producto de un solo clon, es la unidad fisicoquímica e inmunológica que se manifiesta a la electroforesis en la aparición de una banda compacta, y en poseer un solo tipo de cadena pesada y ligera a la inmunofijación. Sin embargo, en ciertas circunstancias pueden darse excepciones más o menos importantes que se listan a continuación: • La banda es poco compacta cuando las inmunoglobulinas monoclonales tienden a agregarse y formar polímeros de grados variables (por lo general las IgA) o producir múltiples bandas de movilidad diferente (a menudo las cadenas ligeras libres) o producir una banda en deposición con anomalías en el frente anódico (a menudo las IgM y a veces las crioglobulinas). • La banda puede faltar tanto en el mieloma no secretor como en la enfermedad por cadenas pesadas, pues se agrupan de forma tan heterogénea que originan sólo una franja, y en el mieloma secretor las cadenas ligeras (micromolecular, enfermedad por cadenas ligeras), pueden estar en una concentración sérica tan baja que son imperceptibles a la electroforesis. • Rara vez el mismo clon puede producir dos tipos de cadenas pesadas, que, por lo general, originan dos bandas electroforéticas distintas. • En el caso de las crioglobulinas de tipo II, por ejemplo, IgM monoclonales fijadas a IgG policlonales, se detectan cadenas mu, gamma, kappa y lambda en la misma banda. • Además, debe tenerse presente que en entre el 1% y el 5% de todos los mielomas, no es posible detectar un componente M plasmático o urinario con los métodos rutinarios (mieloma no secretor). • En estos casos se logra el diagnóstico independientemente de la detección de un componente M.

Orina: Para la determinación de laboratorio, se prefiere una muestra de orina de la mañana (segunda micción). En el control de la enfermedad, es importante que exista un valor cuantitativo; por ello es necesario conocer la diuresis. La muestra por analizar debe ser de al menos 20 ml. Esto permitirá su concentración final. Procure reducir, en la medida de lo posible, la contaminación bacteriana (las bacterias catabolizan las proteínas urinarias con rapidez) mediante la adición de un bacteriostático (solución de azida de sodio 1 g/l) en el contenedor de recolección. 1.10 Búsqueda del componente M Sin duda alguna, es de crucial importancia que la electroforesis se realice de un modo correcto, porque de la calidad de esta, depende la capacidad de detectar una condición potencialmente de gran importancia clínica. Una técnica correcta es una condición previa necesaria, pero no suficiente,

ID 200223

Electroforesis

417

BIBLIOGRAFÍA

A. Ciapini, C. Ciaiolo, G. Marietti, R. Deiana, G. Marletto “Reverse immunofixation” Biochimica Clinica Vol. 12 Luglio 1988

LUKSHMINARAYANAN R – YUEJU L – JANATPOUR K – BECKETT L – JIALAL I Detection by immunofixation of M proteins in hypogammaglobulinemic patients with normal serum electrophoresis results Am J Clin Pathol 2007,127 : 746-751

KEREN DF - ALEXANIAN R –GOEKEN JA – GOREVIC PD –KYLE RA – TOMAR RH Guidelines for clinical and laboratori evaluation of patients with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999,123 : 106-107

KATZMANN JA – KYLE RA Immunochemical characterisation of immunoglobulins in serum,urine and cerebrospinal fluid In Detrick B – Hamilton RG – Folds JD – eds. Manual of molecular and clinical laboratory immunology. 7th ed. Washongton,DC : ASM press 2006, p 88-100

DISPENZIERI A – KYLE R – MERLINI G – MIGUEL JS – LUDWIG H – HAJEK et al. International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia 2009,23: 215-224

DURIE BGM – HAROUSSEAU JL – MIGUEL JS – BLADE J – BARLOGIA B – ANDERSON K et al. International uniform response criteria for multiple myeloma Leukemia 2006,20 : 1467-1473

KATZMANN JA – KYLE RA – BENSON J – LARSON DR – SNIDER MR – LUST JA et al. Screening panels for detection of monoclonal gammopathies Clin Chem 2009,55 : 1517-1522

LOPEZ-CORRAL L – GUTIERREZ NC – VIDRIALES MB – MATEOS MV – RASILO A – GARCIA-SANZ R – PAVIA B – SAM MIGUEL J The progression from MGUS to smoldering myeloma and evenctually to multiple myeloma involves a clonal expansion of genetically abnormal plasma cells Clin Cancer Res 2001 feb.16

ID 200223

Electroforesis

419

ANDERSON KC – CARRASCO RD Pathogenesis of myeloma Annu Rev Pathos 2011 feb.28 ;6: 249-274

1) Musset L., Diemert M.C., Taibi F., Thi Huong Du L., Cacoub P., Leger J.M. et al. Characterization of cryoglobulins by immunoblotting. Clin. Chem. 38 798-802 - 1992.

LANDGREN O Monoclonal gammopathy of undeterminated significance and smoldering myeloma : new insights into pathophysiology and epidemiology Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010;2010 : 295-302

2) Brouet J.C., Clauvel J.P., Danon F., Klein M., Seligmann M. Biologic and clinical significance of cryoglobulins. A report of 86 cases. Am. J. Med. 57 775-88 - 1974 3) Heidelberger M., Kendall F. A quantitative study of the precipitin reaction between type III pneumococcus polysaccharide and purified homologous antibody. J. Exp. Med. 50 809 - 1929

KUMAR L – VERMA R – RADHAKRISHNAN VR Recent advances in the management of multiple myeloma Natl Med J India 2010, Jul-Aug;23(4): 210-8 RAJKUMAR SV Multiple myeloma : 2011 update on diagnosis,risk-stratification,and management Am J Hematol.2011 Jan;86(1):57-65

4) Wintrobe M., Buell M. Hyperproteinemia associated with multiple myeloma. With report of a case in which an extraordinary hyperproteinemia was associated with thrombosis of the retinal veins and symptoms suggesting Raynaud’s disease. Bull. Johns Hopkins Hosp. 52 156 - 1933

KYLE RA – RAJKUMAR SV Multiple myeloma New England J Med 2004,351(18):1860-73

5) Meltzer M., Franklin E.C. Cryoglobulinemia: a study of 29 patients. Am. J. Med. 40 828-36 - 1966 6) Agnello V., Chung R.T., Kaplan L.M. A role for hepatitis C virus infection in type II cryoglobulinemia. N. Engl. J. Med. 327 1490 - 1992

DURIE BG - SALMON SE A clinicala staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features,response to treatment and survival Cance 1975;(36) 942-54

7) Dammacco F., Sansonno D. Antibodies to hepatitis C virus in essential mixed cryoglobulinemia. Clin. Exp. Immunol. 87 352 - 1992 8) Hijikata M., Shimuzi Y.K., Kato H., Iwamoto A., Shih J.W., Alter H.J. et al. Equilibrium centrifugation studies of hepatitis C virus: evidence for circulating immune complexes. J. Virol. 67 1953-58 - 1993

DURIE BG Staging and kinetics of multiple myeloma Semin Oncol 1986,13(3):300-9

ID 200223

Electroforesis

420

9) Misiani R., Bellavita P., Fenili D., Vicari O., Marchesi D., Sironi P.L. et al. Interferon alfa-2a therapy in cryoglobulinemia associated with hepatitis C virus. N. Engl. J. Med. 330 751-56 - 1994

17) Wintrobe MM, Buell MV. Hyperproteinemia associated with multiple myeloma with report of a case in which an extraordinary hyperproteinemia was associated with thrombosis on the retinal veins and symptoms suggesting Raynaudâ&#x20AC;&#x2122;s disease. Bull Johns Hopkins Hosp 1933;52:156-65.

10) Tissot J.D., Schifferli J.A., Hochstrasser D.F., Pasquali C., Spertini F., Clement F., et al. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis of cryoglobulins an identification of an IgM-associated peptide. J. Immunol. Meth. 173 63-75 - 1994

18) Brouet JC, Clauvel JP, Danon F, et al. Biological and clinical significance of cryoglobulins. Am J Med 1974;57:775-88.

11) Basile U., Ciapini A., Palombini G. A method for the charaterization of cryoglobulins Acta Med. Rom. In press

19) Invernizzi F, Galli M, Serino G, et al. Secondary and essential cryoglobulinemias. Acta Haematol 1983;70:73-82.

12) Campioli D., Ghini M., Mascia M.T., Giovanardi P., Carulli M.T., Moreali S. et al. Characterization of cryoglobulins: Some remarks on methodology. Clin. Exp. Rheumatol. 13/S-13 75-78 - 1995

20) Monti G, Galli M, Invernizzi F, et al. Cryoglobulinemias: a multi-centre study of the early clinical and laboratory manifestations of primary and secondary disease. QJM 1995;88:115-26.

13) Cacoub P., Lunel F., Musset L., Opolon P., Piette J.C. Hepatitis C and cryoglobulinemia. N. Engl. J. Med. 328 1121 - 1993

21) Ferri C, Zignego AL, Pileri A. Cryoglobulins. J Clin Pathol 2002;55:4-13.

14) Merlini G., Zorzoli I., Anesi E., Perfetti V., Marinone G. Immunochemical characterization of the cryoglobulins: pathophysiologic implications. Clin. Exp. Rheumatol. 13/S-13 71-73 - 1995

22) Bakker AJ, Slomp J, de Vries T, et al. Adequate sampling in cyioglobulinaemia: recommended warmly. Clin Chem Lab Med 2003;41:85-9.

15) Gorevic PD, Kassab HJ, Levo Y, et al. Mixed cryoglobulinemia: clinical aspects and long-term follow-up of 40 patients. Am J Med 1980;69:287-30.

23) Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of cryoglobulins. Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-25.

16) Brandau DT, Trautman PA, Steadman BL, et al. The temperaturedependent stoichiometry of mixed cryoimmunoglobulins. J Biol Chem 1986;261:16385-91.

ID 200223

Electroforesis

24) Shihabi ZK. Cryoglobulins: an important but neglected clinical test. Ann Clin Lab Sci 2006;36:395-408.

421

25) Musset L, Diemert MC, Taibi F, et al. Characterization of cryoglobulins by immunoblotting. Clin Chem 1992;38:798-802.

33) Bellotti V, Zorzoli I, Bossi A, et al. Immunochemical characteristics of a particular cryoglobulin. A new cryoglobulin subgroup? Clini Exp Rheumatol 1991;9:399-402.

26) Dammacco F, Sansonno D, Piccoli C, et al. The cryoglobulins: an overview. Eur J Clin Invest 2001;31:628-38.

34) Tissot JD, Schifferli JA, Hochstrasser DF, et al. Twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis of cryoglobulins and identification of an IgM-associated peptide. J Immunol Methods 1994;173:63-75.

27) McLeod BC, Sassetti RJ. Hypocryoglobulins: enhanced cryoprecipitation from hypotonic serum in patients with vasculitis. Arch Int Med 1984;144:1381-5.

35) Tissot JD, Pietrogrande M, Testoni L, et al. Clinical implications of the types of cryoglobulins determined by twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Haematologica 1998;83:693-700.

28) Di Stasio E, Bizzarri, Bove M, et al. Analysis of the dynamics of cryoaggregation by light-scattering spectrometry. Clin Chem Lab Med 2003;41:152-8. 29) Fornasieri A, Armelloni S, Bernasconi P, et al. High binding of immunoglobulin M kappa rheumatoid factor from type II cryoglobulins to cellular fibronectin: a mechanism for induction of in situ immune complex glomerulonephritis? Am J Kidney Dis 1996;27:476-83.

36) Pontet F, Halimi C, Brocarde A, et al. Biclonal immunoglobulin M dysglobulinaemia: evolving aspects in a case of primary Sjogren syndrome. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997:35:287-90. 37) Oliver M, Coton T, Ragot C, et al. Les cryoglobulinemies. Annal Biol Clin 2004;62:521-8.

30) Shihabi ZK. Analysis and general classification of serum cryoglobulins by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis 1996;17:1607-12.

38) Ferri C, Zignego AL. Relation between infection and autoimmunity in mixed cryoglobulinemia. Curr Opin Rheumatol 2000;12:53-60.

31) Andre M, Mahammedi H, Aumaitre O, et al. A “missed” cryoglobulin: the importance of in vitro calcium concentration. Ann Rheum Dis 2000;59:490. 32) Le Carrer D. Cryoglobulinemies: proposition d’un d’exploration biologique. Actualisation de leur classification. Feuillets biol 1998;39/221:55-65.

ID 200223

Electroforesis

39) Eng MA, Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Hepatitis C virus, autoimmunity and lymphoproliferation. Mt Sinai J Med 2000;67:120-32.

protocole

422