Dott. Andrea Ciapini
ATLANTE DI QUADRI PROTEICI ELETTROFORETICI ED IMMUNOFISSATIVI DI SIERO PROTEINE, PROTEINE URINARIE E CRIOGLOBULINE
AT L A N T E E L E T T R O F O R E T I C O
PREFAZIONE
Da tanti anni, forse da troppi, la passione per lo studio delle proteine plasmatiche ricorre costantemente nei miei interessi professionali. Dei metodi di separazione delle proteine in campo elettroforetico, dei tamponi, dei supporti, dei coloranti, del grado di risoluzione, della focalizzazione, della sensibilità, della precisione ed accuratezza si discute da decenni. Talvolta in un tentativo esasperato di “perfezione” si sono volute attribuire a questi metodi delle potenzialità a loro estranee per limiti costitutivi; ma rimane il fatto che come affermato da Robert F. Ritchie (Clin Chem Lab Med 2001, 39(11) 1045-1053): “Serum proteins have a unique feature that few test have: they are interrelated. In other words, an effect on one will change others. Serum proteins analysis is, in fact, one multi-use test, not a series of independent test. As a result, measuring only one protein, e.g. haptoglobin to identify hemolysis, decreases diagnostic ability tremendously.” Ne deriva che per utilizzare completamente le potenzialità diagnostiche offerte dalla analisi delle plasmaproteine è indispensabile una stretta collaborazione fra il laboratorista ed il clinico e che ambedue abbiano una sufficiente conoscenza dei campi reciproci di interesse. Nostra intenzione è quella di sensibilizzare il laboratorista alla complessità interpretativa dovuta alle numerose interazioni ed alle possibili sovrapposizione di disordini; alla semiologia proteica che impedisce, tranne rare eccezioni, di trarre sicure deduzioni diagnostiche senza il contributo del clinico.
Elettroforesi
Allo stesso tempo, quest’ultimo, dovrebbe rendersi conto delle potenzialità, ma anche dei limiti e delle possibili cause di errore, che presentano le metodologie di studio utilizzate. Certo è che neppure si possa essere così semplicistici da attribuire, allo studio delle proteine separate in elettroforesi, il solo compito di rilevare la presenza di componenti monoclonali ! Da questi presupposti nasce la architettura del presente atlante, che vuole semplicemente sottolineare, per mezzo di immagini e brevi commenti, la potenzialità della elettroforesi che se “interpretata visivamente”, al pari dei reperti radiografici e cardiografici, dà al laboratorista la occasione di fornire al clinico utili ragguagli sugli equilibri proteici dei pazienti senza voler prevaricare il compito del clinico stesso. Quanto affermato, precedentemente, rientra nell’ottica delle raccomandazioni dell’ Istituto di Medicina (1992) che afferma come linee guida: “Ogni tipo di documento avente come obiettivo quello di indicare ai Clinici quali opzioni diagnostico-terapeutiche debbano essere adottate in specifiche circostanze cliniche“ Anche il commento allegato, per una refertazione esaustiva, a una separazione elettroforetica possiede pari dignità rispetto ad altri referti facendo parte della Medicina di Laboratorio; così come indicato dalla:
I
2) Valutazione qualitativa 3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità) A. Burlina 1992 Molti lettori troveranno inopportuna la definizione di “Elettroforesi Semiquantitativa”, ritenendo di doversi affidare esclusivamente ai dosaggi Nefelo“Il Laboratorio Medico (o Clinico) è il Laboratorio per l’esame biologico, microbiologico, metrici/Turbidimetrici per valutare la concentrazione delle proteine specifiche. immunologico, chimico, immunoematologico, ematologico, biofisico, citologico, anatomo“Il Laboratorio Medico (o Clinico) è il Laboratorio per l’esame biologico, patologico ed altro di materiali derivati dal corpo umano al fine di fornire informazioni per la Costoro hanno perfettamente ragione! microbiologico, immunologico, chimico,e trattamento immunoematologico, diagnosi, prevenzione di malattie oppure per ematologico, la valutazione della salute di esseri umani “ biofisico, citologico, anatomo-patologico ed altro di materiali derivati dal corQuello che gli autori intendono per “Elettroforesi Semiquantitativa” nienpo umano al fine di fornire ladidiagnosi, prevenzione e aspetti trat- delle ricerche te altro è se non la considerazione che un “buon sistema elettroforetico, auto“…einformazioni che può fornire un per servizio consultazione comprendente tutti gli di laboratorio, incluso l’interpretazione risultatidi e il esseri suggerimento di appropriati tamento di malattie oppure per la valutazione delladeisalute umani “ matizzato e sotto controllo statistico” approfondimenti diagnostici “ “…e che può fornire un servizio di consultazione comprendente tutti gli possa fornire, nel tempo, dati confrontabili ed omogenei statisticamente; International Staincluso ndard ISOl’interpretazione 15189:2003(E) punto 3.dei 8 aspetti delle ricerche di laboratorio, risultati e il questa situazione consentirà di accettare, con alto grado di probabilità statisuggerimento di appropriati stica, i dati elettroforetici ponderali come indicativi di valori normali, aumenInoltre:approfondimenti diagnostici “ tati o diminuiti. International Standard ISO 15189:2003(E) punto 3.8 “Il laboratorio, oltre che la responsabilità di accurate risposte, ha quella di assicurarsi quanto Ai metodi specifici il compito del calcolo della “vera” ponderalità. Inoltre: più possibile che esse siano interpretate ed applicate nel miglior interesse del paziente. “ “Il laboratorio, oltre che laspecialistiche responsabilità di ed accurate risposte, haparte quel“Azioni nella selezione interpretazione dei test fanno del servizio del Quanto espresso viene, ulteriormente sottolineato dai seguenti sottocaLaboratorio. “ che esse siano interpretate ed applicala di assicurarsi quanto più possibile pitoli: te nel miglior interesse del paziente. “ C6.3 Annex C Ethics in laboratory medicine a) Sistema elettroforetico, “automatizzato e sotto controllo statistico”: Standard ISO “Azioni specialisticheInternational nella selezione ed15189:2003(E) interpretazione dei test fanno parte del servizio del Laboratorio. Queste definizioni“dell’ “International Standard ISO” sostentano la definizione di appropriatezza Appropriatezza: adatto e conveniente elettroforetico : C6.3 Annex C Ethics dell’esame in laboratory medicine è il test in cui il risultato fornisce una risposta al quesito clinico e mette in grado di International Standard“appropriato ISO 15189:2003(E) prendere una decisione o intraprendere un’azione “ ….appropriate appropriate is the test able to give a replay to a Queste definizioni dell’ “International Standard ISO” sostentano la deficlinical problem and permit to keep a decision or to Price 2000 elettroforetico : nizione di appropriatezzaCPdell’esame undertake an action. action “appropriato è il test “appropriato in cui il risultato una per risposta è tutto ciò chefornisce può essere benefico il paziente”al quesito clinico e mette in grado di prendere una decisione o intraprendere un’azione “ CP Price 2000 “in una medicina sempre più complessa, occorre evitare che alcuni pazienti non ottengano CP Price 2000 l’intervento di cui hanno bisogno ed altri abbiamo l’intervento di cui non necessitano” Test “appropriato è tutto ciò che può essere benefico per il paziente” RH Brook 1994 “in una medicina sempre più complessa, occorre evitare che alcuni paQuesito clinico La elettroforesi delle siero-urine proteine è un test che ha come finalità : zienti non ottengano l’intervento di cui hanno bisogno ed altri abbiamo l’in1) Valutazione semiquantitativa Referto tervento di cui non necessitano” esaustivo Risultato 2) Valutazione qualitativa RH Brook 1994 3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità) La elettroforesi delle siero-urine proteine è un test che ha come finalità : Efficacia diagnostica Risposta al problema 1) Valutazione semiquantitativa
Elettroforesi
II
Il significato della efficacia diagnostica
EBLM e sua attuazione La pratica dell’ EBLM richiede la integrazione della esperienza clinica individuale con la migliore evidenza laboratoristica derivata da ricerche sistematiche.
Malattia ?
Patologia nota
Diagnosi
Cura
Esito positivo
Gold standard globale EBLM
EBM
Gold standard personale
D. Giavarina 2004
Gold standard indipendente
Gold standard separato
Gold standard personale Le finalitĂ della efficacia diagnostica in ETF
Ricerca delle Ri d ll monoclonalitĂ
Q lit ti : Qualitative modificazioni chimico-fisiche a carico di
C3\Hpt-Hb\C.M.
Elettroforesi
Valutazioni quantitative
Gold G ld standard t d d globale
Quantitative : condizioni etero\omozigoti a carico di
Gold standard personale
Alb.\AAT\Trf\ C3\Hpt.
Gold standard indipendente
Gold standard separato
Valutazioni qualitative
A Burlina 1992 A.
Accrescimento conoscitivo individuale: formazione continua continua.
III
Come deve essere attuato il controllo di qualità in ETF ?
Gold standard indipendente Gold standard globale Gold standard personale p
Gold standard indipendente p
• Piccole e semplici p cose p per grandi g risultati !
Gold standard separato p
Il controllo di qualità q
Mirato in prima istanza alla migliore evidenza possibile. Esempio: La esecuzione delle proteine urinarie deve passare per il supporto agarosio e per un colorante sensibile.
I valori di riferimento devono essere ricercati da ciascun laboratorio e per la propria popolazione l i afferente. ff t
Gold standard separato Gold standard globale Gold standard personale
Gold standard indipendente
I valori di riferimento del produttore versus laboratorio
Gold standard separato
Atteggiamento avulso da preconcetti ed incentrato sulla completa collaborazione tra tecnici e medici di laboratorio sì da rispondere alle seguenti domande: a) Il test è accurato e riproducibile? g ed interpretato p in modo corretto? Sarà eseguito b) Quale è la predittività pre-test? c) La probabilità post-test modificherà la gestione della malattia ? d) La significatività della risposta e del referto sarà valutata positivamente dal medico?
Elettroforesi
Aree A EP
Produttore X Densitometro A valori in %
Produttore X Densitometro B valori in %
Albumina
56 / 61 / 66
60 / 65 65.55 / 71
V Valori l i ddell laboratorio in % n = 7700 56 / 61 / 66
Gamma
10 / 14 / 18
8.5 / 12.2 / 16
11 / 15.5 / 20
Annotazioni sui valori di riferimento : I densitometri A e B vengono realizzati dallo stesso produttore ed ambedue gli strumenti leggono lo stesso supporto in agarosio. Risulta agevole considerare, alla luce dei valori espressi dal produttore al confronto con quelli elaborati in laboratorio, la necessità i à per ogni laboratorio di stimare i propri valori di riferimento.
IV
Fig. 1 = Test ideale o patognomonico, con sensibilità e specificità clinica del 100% e con potenza diagnostica assoluta. Fig. 2 = Test inutile con sensibilità e specificità clinica pari al 50% ( come gettare una moneta) Fig. 3 = Test usuale, che presenta una certa zona di sovrapposizione, la sensibilità e la specificità clinica è intermedia e così la potenza diagnostica.
Il controllo di q qualità
La precisione: C Controllo ll mensile il sullo stesso campione ripetuto almeno 21 volte.
Funzione del test di Tonks A = soggetti sani B = soggetti malati C = sovrapposizione pp delle code delle due zone precedenti e la sua ampiezza delimita il settore 2, che comprende i falsi positivi e i falsi negativi.
Il test di Tonks suggerisce il max valore di CV% entro t il quale l i dati d ti permangono significativi.
Albumina Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 Beta 2 Gamma
CV % Max = 2 CV % Max = 6 CV % Max = 5 CV % Max = 4 CV % Max = 4 CV % Max = 6
L’utilizzo sistematico, settimanale, del test di Tonks contrae e mantiene sotto controllo la zona C.
Percentuale di errori clinici applicando il test di Acland Lipton sui dati di Tonks
Tonks DB: Clin Chem 9:217 1963
Albumina: Tonks Max.= 2%
Il significato diagnostico di un test
Albumina: g normalità = 56-66 % Range Un valore di 54% quante probabilità possiede p p di diventare normale per errore di riproducibilità ?
Probabilità = 1.5 %
Fig. 1 = Test ideale o patognomonico, con sensibilità e specificità clinica li i del d l 100% 00% e con potenza diagnostica di i assoluta. l Fig. 2 = Test inutile con sensibilità e specificità clinica pari al 50% ( come gettare una moneta) Fig. 3 = Test usuale, che presenta una certa zona di sovrapposizione, la sensibilità e la specificità clinica è intermedia e così la potenza diagnostica. g
Elettroforesi
V
Percentuale di errori clinici applicando li d il test t t di Acland A l d Lipton Li t su d dati ti più bassi di Tonks
Percentuale di errori clinici applicando li d il test t t di Acland A l d Lipton Li t suii dati di Tonks
Gamma: R Range normalità li à = 11-20 11 20 %
Gamma: Tonks Max.= 6 %
Un valore di 13% quante probabilità possiede di diventare anormale l per errore di riproducibilità i d ibili à ?
Gamma: Range normalità = 11-20 % Un valore di 13% quante probabilità possiede di diventare anormale per errore di riproducibilità ? Probabilità = 5 %
Gamma Tonks = 4 % Probabilità = 2.5 %
b) I dati elettroforetici come indicativi significativamente di normalità, aumento, diminuzione • Materiali e metodi: • selezione di 20 sieri per l’allineamento delle albumine ETF a quelle nefelometriche • 12 sieri con IgA policlonali con concentrazioni comprese tra 100 e 600 mg/dl • 100 sieri (età tra 18 e 75 anni, quadri normali e con varie patologie, 55 donne e 45 uomini) • dosaggio proteine totali con metodo al biureto e bianco campione. • nefelometro Behring per il dosaggio delle proteine specifiche dei 100 sieri • sistema per elettroforesi Microgel in supporto agarosio e colorante Acid Blu • Ispezione visiva (2 operatori esperti) e valutazione proteine con aggettivazioni corrispondenti a numeri da 1 a 5. • Test Kolmogorov-Smirnov e test del parallelismo per lo studio delle popolazioni di dati elettroforetici (aggettivazioni tradotte in numero da 1 a 5) e nefelometrici (g/L). • Nei grafici le curve verdi sono relativa ai dati elettroforetici mentre quelle rosse sono relative ai dati nefelometrici.
C Conclusioni l i i suii dati d ti di Tonks T k
Alb i Albumina Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 Beta 2 G Gamma
Elettroforesi
CV % Max M =2 CV % Max = 6 CV % Max = 5 CV % Max = 4 CV % Max = 4 CV % Max M =6
Ogni riduzione dei valori di Tonks porterà ad una minore probabilità che il dato possa passare da Normale a Patologico e Viceversa: vedi di diapositiva di iti seguente. t
VI
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Albumine ETF allineate con Nef. Dinamica ETF fino a 49 g/L Albumine ETF allineate con Nef. Livello di significatività >0.05Dinamica ETF fino a 49 Test di parallelismo positivo g/L Dinamica ETF fino a 49 g/L
Popolazioni con stessa distribuzione Livello di significatività >0.05 Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione Popolazioni con stessa distribuzione
TestFdi calcolato parallelismo < 3,96 F statistico positivo Test di parallelismo positivo F calcolato <3,96F F statistico calcolato < 3,96 F statistico
Elettroforesi
Dinamica ETF fino a 3.8 g/L di g/L parallelismo Dinamica ETF fino aTest 3.8
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
positivo F calcolato <3,96F Test di parallelismo statistico
positivo F calcolato < 3,96 F statistico
Dinamica ETF fino a 4.9 g/L
Dinamica ETF fino a 3.5 g/L Dinamica ETF fino a 3.5 g/L Dinamica ETF fino a 3.5 g/L Livello di significatività >0.05 Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione Popolazioni con stessa distribuzione Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Test di parallelismo positivo F calcolato < 3,96 F statistico
Dinamica ETF fino a 4.9 g/L
Test di parallelismo
Testpositivo di parallelismo positivo F calcolato <3,96F F calcolato < 3,96 F statistico Test di parallelismo positivo statistico F calcolato < 3,96 F statistico
VII
Livello di significatività >0.05 LivelloPopolazioni di significatività >0.05 con stessa distribuzione
Test di parallelismo positivo Test di parallelismo positivo F calcolato <3,96F statistico F calcolato < 3,96 F statistico
Popolazioni con stessa distribuzione
Test di parallelismo positivo F calcolato < 3,96 F statistico
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
La differenza media tra i valori trovati con i due metodi per le immunoglobuline oscilla tra 2 e 3 g/L in meno per la Elettroforesi. Questa differenza è da imputare a due fattori: 1) La diversa affinità tra anticorpi e colore per le classi Ig (affermazione ovvia da non commentare vista la stechiometria tra colorante e amminoacidi). 2) La percentuale di IgA, elettroforetiche, che non vengono computate perché migrano sotto il C3 e la Tf. Per il punto numero 2 è stato eseguito uno studio per mezzo della Spline Cubica (equazione di terzo grado) applicata ai punti grafici che disegnano la zona gamma.
Dinamica ETF fino a 1.7 g/L Dinamica ETF fino a 1.7 g/L Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Test di parallelismo positivo F calcolato <3,96F statistico
Poiché la Spline Cubica è una equazione di regressione polinomiale Test di parallelismo positivo è stato possibile richiedere, in base alla pendenza della curva gamma F calcolato < 3,96 F statistico verso il C3 e la Tf, la tendenza a regredire fino alla linea di base del grafico se il punto di zero fosse stato il minimo tra C3 e gamma e poi tra Tf e gamma. Il primo grafico dimostra come una percentuale di Ig migrino sotto il C3 e fino all’inizio della Tf.
Dinamica ETF fino a 26 g/L Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Dinamica ETF fino
Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione
Elettroforesi
Test di parallelismo positivo calcolato a F26 g/L <3,96F statistico
Test di parallelismo positivo F calcolato < 3,96 F statistico VIII
La differenza media tra i valori trovati con i due metodi per le immunoglobuline oscilla tra 2 e 3 g/L n meno per la Elettroforesi. Questa differenza è da imputare a due fattori:
Il secondo grafico dimostra come il campione ipogammaglobulinemico debba essere riconsiderato alla luce della ampia percentuale di Ig che migrano sotto il C3 e ben oltre il minimo densitometrico.
Tenore di IgA in mg/dl
Quota totale non computata dal densitometro in mg/dl
Quota non computata sotto C3 in mg/dl
Quota non computata sotto Tf in mg/dl
600
184
99
85
500
136
73
63
400
108
58
50
300
80
43
37
200
50
27
23
100
20
11
9
I dati suesposti dimostrano come un sistema elettroforetico “sotto controllo” (automatizzato e in regime di statistica) possa erogare dati semiquantitativi atti a determinare una correlazione congruente con i dati nefelometrici. Questo significa che un tale “sistema sotto controllo” possa essere un ottimo indicatore per la definizione di proteine specifiche normali, aumentate o diminuite lasciando alla nefelometria/turbidimetria il compito della conferma e del “vero” dosaggio ponderale.
Il terzo grafico dimostra come una cospicua percentuale di Ig migrino sotto C3 e Tf.
Affinché possano realizzarsi le seguenti tre “Valutazioni” 1) Valutazione semiquantitativa: condizioni etero\omozigoti a carico di Alb.\AAT\Trf\C3\Hpt. 2) Valutazione qualitativa modificazioni chimico-fisiche a carico di C3\Hpt-Hb\C.M. 3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità) (Burlina 1992) risulta fondamentale che ogni laboratorio esegua una revisione del proprio sistema Elettroforetico alla luce delle raccomandazioni espresse nel contesto della Evidence Based Medicine (EBM) e della Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM):
L’utilizzo della Spline Cubica ha permesso di stilare la seguente tabella di recupero di Ig non computate dal densitometro a causa dell’errata posizione del minimo posto a fondo valle.
Elettroforesi
Evidence Based Medicine (EBM) :
IX
“L’uso coscenzioso, esplicito e giudizioso della migliore evidenza corrente nel prendere decisioni relativamente alla cura del paziente”. Questa definizione di Sackett et al. comprende specificamente anche il laboratorio in quanto parte integrante del processo decisionale del medico. La EBM è stata definita, anche, come un processo di aggiornamento personale, per tutta la vita. Da questa descrizione deriva che la medicina è un campo in continua scoperta, evoluzione e cambiamento, per cui è importante assicurarsi che la pratica sia basata sulla migliore evidenza disponibile e che ci sia la opportunità di adottare nuove procedure per le quali sia stato dimostrato il beneficio. Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM): La pratica dell’ EBLM richiede la integrazione della esperienza clinica individuale con la migliore evidenza laboratoristica derivata da ricerche sistematiche. Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM) e Gold Standard: Introdurre i principi della Evidence Based Medicine in laboratorio, significa attivare un continuo processo di identificazione di quei tests che da una parte potranno offrire la più alta efficienza ed affidabilità diagnostica (Gold Standard) e, dall’ altra, potranno provocare minori rischi e meno disagi per il paziente nonché un risparmio di lavoro, tempo e danaro. Gold Standard Il concetto di “Gold standard” è un concetto in continuo divenire che non può e non deve conoscere la fase Entalpica. E’ un concetto di continua ricerca della “migliore verità (metodo) disponibile” per una mirata ed efficiente opera di sostegno ai veri fruitori finali di tale azione: i pazienti ! L’attuale Gold Standard nel campo Elettroforetico è rappresentato dal supporto Agarosio. Chi attesta questo (alcuni organismi e convegni in ordine cronologico): 1. College of American Pathologists Arch. Pathol. Lab. Med. Vol. 123 pag. 126 February 1999 2. 36° Congresso Nazionale SIBioC Padova 2004
Elettroforesi
3. XV° Edizione de “ Le Proteine dal Laboratorio alla Clinica” CEFAR 2006 4. Am J Clin Pathol 2008; 129:451-458 “Performance Comparison of Capillary and Agarose Gel Electrophoresis for the Identification and Characterization of Monoclonal Immunoglobulins” 5. Clin Chem Lab Med 2009; 47: 1021-1022 2009 Se la metanalisi è una “ integrazione strutturata e sistematica di informazioni derivate da differenti studi su un dato problema… la procedura analitica per le siero-urine proteine, su agarosio, è probabilmente in grado di realizzare obiettivi utili al clinico al fine di migliorare l’ approccio diagnostico e/o l’ intervento terapeutico. L’utilizzo del miglior metodo disponibile non esaurisce il compito del laboratorio. L’approccio ai metodi elettroforetici, essendo un procedimento diagnostico, deve considerare una fase descrittiva ed una interpretativae: a) la ispezione visiva del quadro proteico (fase descrittiva redatta in termini molecolari con indicazione di assenza e di presenza di proteina sovrannumeraria, aumento o riduzione più aggettivo, delle singole proteine specifiche; alla fase descrittiva, il laboratorio, deve intraprendere la identificazione di C.M. e la ricerca della proteina di B.J.; inoltre il laboratorio, può procedere alla quantificazione di proteine specifiche per avallare la osservazione visiva) b) la fase di “semeiotica elettroforetica” (fase interpretativa redatta in relazione a quadri fisiopatologici ed associazioni cliniche; auspicabile la acquisizione di notizie cliniche. c) la refertazione esaustiva a) la ispezione visiva del quadro proteico metodologia formidabile per identificare modificazioni proteiche, singole od di assieme, rispetto al quadro fisiologico: Guidelines for Clinical and Laboratory Evaluation of Patients with Monoclonal Gammopathies David F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD; Peter D. Gorevic, MD; Robert A Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD
X
“Serum and urine electrophoresis …….. the gel should be examined directly by the interpreter.”
(Arch PatholNelle Labfigure Med. 1999;123:106–107) seguenti è possibile osservare la caducità della lettura densitometrica senza l’intervento della interpretazione visiva: “Serum and urine electrophoresis …….. the gel should be examined“Serum directly by the interpreter.” and urine electrophoresis …….. the gel should be examined directly by the interpreter.” Nelle figure seguenti è possibile osservare la caducità della lettura denNelle figure seguenti è possibile osservare la caducità della lettura densitometrica senza sitometrica senza l’intervento della interpretazione visiva: l’intervento della interpretazione visiva:
La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla lettura La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla letdensitometrica.
Linee guida: associazioni cliniche
Prealbumina
Nefrosi
Albumina
Inesistente
Alfa 1 antitripsina
Effetto estrogenico, infiammazione, necrosi, eteroplasia, epatopatie
Alfa 2 macroglobulina
Nefrosi, apatopatie, diabete, III tri.grav., infanzia, senilità
Aptoglobina
Necrosi, eteroplasia, infiammazione
Transferrina
Anemia siderop., epatite, gravi.
C3
Ostruzio, biliare, infiammazione non recente
Gammaglobuline
Cirrosi epatica e biliare, etilismo, infezioni croniche, epatiti croniche, malattie autoimmuni
La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla lettura
tura densitometrica. densitometrica.
Linee guida: associazioni cliniche
La migrazione ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la più catodica risulta non esistente nel grafico (Frecce)
Prealbumina
Infiammazioni, eteroplasie, epatopatie
Albumina
Epatopatie, nefropatie, infiammazione chachessie, enteropat. disperdenti, eteroplasie
Alfa 1 antitripsina
Difetto genetico
Alfa 2 macroglobulina
Fibrinolisi, artrite reumatoide, eclampsia Spesso priva di significato
Aptoglobina
Difetto congenito, epatopatie Emolisi intravascolare, eritropoiesi insuff.
Transferrina
Epatopatie, nefropatie, infezioni croniche
La migrazione ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la C3 Malattie autoimmuni, epatopatie b) la migrazione fase di “semeiotica elettroforetica” La ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la più catodica più catodica risulta non esistente nel grafico (Frecce) Gammaglobuline Immunodeficenze congenite/acquisite infanzia risulta non esistente nel grafico (Frecce)sullo stato dell’ assetto proteico. che fornisce, attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni b) la fase di “semeiotica elettroforetica” c) la refertazione esaustiva la fase di “semeiotica elettroforetica” che fornisce,b) attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni sullo stato in grado di presentare al clinico una risposta esauriente, al quesito clinico, per poter intraprendere i passi opportuni per l’azione sul paziente. dell’ assetto proteico. che fornisce, attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni sullo stato dell’ assetto proteico.
Elettroforesi
XI
Raramente, però, si ha la conoscenza della evidenza che l’ uso di un test di laboratorio possa, per un dato paziente o per un gruppo di pazienti, modificare l’ atteggiamento clinico rispetto la diagnosi o la terapia. Per questo motivo il laboratorio deve: • fornire omogeneità ai risultati • migliorare la efficacia dei metodi • fornire dati su nuove possibili metodologie Il processo diagnostico si articola su quattro principali modelli di riferimento: Compito del laboratorio 1) Identificazione analitica del quadro Compito del medico 1) Riconoscimento del quadro 2) Ragionamento fisiopatologico 3) Diagnosi probabilistica Tutto questo deve avvenire nel completo rispetto delle singole competenze sì che si realizzi il concetto di globalità del Gold Standard: a) personale: Accrescimento conoscitivo individuale e formazione continua b) indipendente : Mirato in prima istanza alla migliore evidenza possibile. c) separato : Atteggiamento avulso da preconcetti ed incentrato sulla completa collaborazione tra tecnici e medici di laboratorio sì da rispondere alle seguenti domande: a) Il test è accurato e riproducibile? Sarà eseguito ed interpretato in modo corretto? b) Quale è la predittività pre-test? c) La probabilità post-test modificherà la gestione della malattia ? d) La significatività della risposta e del referto sarà valutata positivamente dal medico? La preparazione di questo testo atlante ha per scopo essenziale quello di fornire al lettore un evidente ed esauriente materiale iconografico delle singole proteine specifiche e quadri immunofissativi, evidenziabili con metodo elettroforetico su supporto in agarosio. A. Ciapini
A tale riguardo è necessario che il referto suggerisca degli outcome; questo sia che la esecuzione del test serva una sola (1) volta sia che il test debba essere ripetuto in un follow-up (2): A 1
Necessità clinica Necessità clinica tes test test tes Decisione/Azione Decisione/Azione
A 1
Intervent Intervento Intervento Intervent Outcome Outcom Outcome Outcom B 2
2 B Necessità clinica Necessità clinica
Intervento Intervento
test
test
Outcome Outcome Da Price CP, modificato.
• • •
Da Price CP, modificato. Da Price CP, modificato. Il Gold Standard Globale In laboratorio si accettano diversi tipi di evidenza: i dati delle performances analitiche. i dati del controllo di qualità interno ed esterno. i dati relativi alla specificità e sensibilità dei test.
Elettroforesi
XII
ATLANTE ICONOGRAFICO DEI PATTERN SIEROPROTEICI ED URINARI IN GEL DI AGAROSIO
La rappresentazione grafica di una migrazione elettroforetica e la posizione delle proteine specifiche.
Quadro proteico urinario su agarosio e colorante violetto acido Posizione delle singole proteine plasmatiche Separazione per carica elettrica netta
Le proteine specifiche sieriche pi첫 frequenti ed identificabili alla ispezione visiva
QUADRI SIEROPROTEICI DI SINGOLE PROTEINE SPECIFICHE E METABOLITI COMIGRANTI
PROTEINA Pre-albumina/Transtiretina
Tassonomia Eucarioti Batteri Organismi Homo Sapiens Helix pomatia Gallus gallus Streptococcus Brassica napus Finegoldia magna
Significato clinico: con il suo alto contenuto di triptofano, la breve emivita (2 giorni), la bassa concentrazione, la prealbumina è un fine e veloce indicatore di reazione infiammatoria, denutrizione (congiuntamente con PCR), diminuzione del parenchima epatico. Diverse varianti genetiche, delle oltre 50 identificate, sono amiloidogeniche. â&#x2013;˛ terapia con corticosteroidi, utilizzo di steroidi anabolizzanti, malattia di Hodgkin, alcolismo, acromegalia â&#x2013;ź APR, epatopatia, nefropatie, malnutrizione, amiloidosi ereditaria, iperestrogenismo, tireotossicosi, somministrazione endovenosa di liquidi
La molecola pre-albuminica legata alla Triiodio Tironina
Elettroforesi
7
PROTEINA Pre-albumina/Transtiretina
Tracciato n. 21
Aι Aι
pre
α1
α2
β1 β2
γ
Aι Aι
pre
α1
α2
β1 β2
γ
ID 12008
I coloranti normalmente in uso come: Acid blu, amido nero e rosso Ponceau S manifestano un basso indice di affinità per questa proteina. Un eccellente densitometro riesce a mettere in evidenza anche le piccole quantità di Pre-albumina che si legano ai suddetti coloranti anionici. Questo è forse l’unico caso in qui lo strumento può sostituire la osservazione visiva della ETF.
Elettroforesi
8
PROTEINA Pre-albumina/Transtiretina
Tracciato n. 3
Aι
pre
Aι
α1
α2
β1 β2
ID 23009
Elettroforesi
9
γ
PROTEINA Pre-albumina/Transtiretina
Lâ&#x20AC;&#x2122;utilizzo di coloranti con maggior indice di affinitĂ , per esempio il violetto acido, consente di mettere in evidenza la transtiretina.
ID 30010
Campione con Transtiretina normale
Elettroforesi
ID 30011
Campione con Transtiretina diminuita
10
PROTEINA Albumina
Tassonomia Eucarioti Batteri Organismi Homo Sapiens Helix pomatia Gallus gallus Streptococcus Brassica napus Finegoldia magna
Significato clinico: storicamente indicatore generale dello stato proteico dell’organismo, la sua attendibilità è compromessa per: • lunga emivita (19 giorni) • diminuita sintesi durante la maggior parte dei processi infiammatori Ad oggi: valore prognostico, in particolare nei pazienti cronici ▲ emoconcentrazione ▼ APR, epatopatia, sindrome nefrosica, malnutrizione, gravidanza, neonati prematuri, analbuminemia genetica
Elettroforesi
11
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 8
Aι
α1
Tracciato n. 9
α2
β1
β2
γ
Aι
α1
ID 45012
A sinistra soggetto con riduzione della Albumina A destra campione con Albumina normale
Elettroforesi
12
α2
β1 β2
γ
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 8
Aι
α1
Tracciato n. 9
α2
β1
β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00313
Ipoalbuminemia da clinostatismo. Campione a sinistra: Pazienti ospedalizzati e costretti a letto presentano ipoalbumine per ridistribuzione della albumina negli spazi extravascolari.
Elettroforesi
13
PROTEINA Albumina, condizione analbuminemica
Tracciato n. 12
Aι
α1
α2
β1
ID 00311
Elettroforesi
14
γ
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 21
Aι
α1
Tracciato n. 20
α2
β1
β2
γ
Aι
α1
ID 90015
A destra campione con albumina che veicola farmaci
Elettroforesi
15
α2
β1 β2
γ
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 1
Aι
α1
Tracciato n. 2
α2
β1
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 80016
A sinistra l’unico evento che determina un aumento della Albumina : la disidratazione
Elettroforesi
16
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 9
Aι
α1
Tracciato n. 10
α2
β1
γ
Aι
α1 α2
β1
γ
ID 70017
A sinistra un esempio di sovraccarico della funzione di trasporto della Albumina con comparsa di Albumina “veloce” per allargamento anodico causato da presenza di bilirubina (campione itterico). Inoltre si nota in zona beta-anodica un piccolo “arco”costituito da bilirubina.
Elettroforesi
17
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 12
Aι
α1
Tracciato n. 13
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 60018
A destra campione con alloalbuminemia fast eterozigote (trasmissione autosomica codominante).
Elettroforesi
18
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 2
Aι
α1
Tracciato n. 3
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 50019
A destra campione con alloalbuminemia slow omozigote (trasmissione autosomica codominante).
Elettroforesi
19
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 17
Aι
α1
Tracciato n. 18
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 76020 004520
A sinistra campione con alloalbuminemia slow eterozigote (trasmissione autosomica codominante).
Elettroforesi
20
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 7
Aι
α1
Tracciato n. 8
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
ID 12021
bisalbuminemia (sempre fast) da pancreatite accertata o utilizzo di farmaci.
Elettroforesi
21
γ
PROTEINA Albumina
Tracciato n. 12
Aι
Tracciato n. 13
α1 α2
β1
ID 22022
bisalbuminemia (sempre fast) da farmaci.
Elettroforesi
22
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
PROTEINA Alfa lipoproteina (APO A)
Tassonomia Eucarioti Batteri Virus Archea Organismi Homo Sapiens Mus musculus Bos taurus Rattus norvegicus Escherichia coli Gallus gallus Torpedo californica
Elettroforesi
L’elettroforesi delle lipoproteine è un metodo semplice, utile per lo studio delle dislipidemie. La loro differenziazione in funzione della mobilità elettroforetica è alla base della classificazione di Fredrickson. Alfa lipoproteine o HDL (High Density Lipoproteins): sono la frazione più veloce. Rappresentano la parte maggiore delle lipoproteine e migrano nella posizione compresa tra Albumina e alfa 1antitripsina
23
LE COMPONENTI MONOCLONALI La loro posizione nella migrazione ETF
Dopo stimolazione Ag si assiste ad una rapida espansione del clone; questa è accompagnata da un cambiamento morfologico e da un piccolo linfocita si giunge ad una plasmacellula matura dotata di apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico. Durante le successive divisioni cellulari la regione V viene espressa con costanza, mentre la regione H scifta da D vs M vs G vs A.
Da Monoclonal Gammopaties Aguzzi/Bienveniu/Jones/Whicher
Elettroforesi
115
LE COMPONENTI MONOCLONALI La loro frequenza percentuale in relazione alla posizione assunta nella migrazione ETF Lo studio è stato condotto su 1654 campioni con presenza di CM. Nella zona gamma, come si può osservare, migra l’88% delle CM.
A. Ciapini; Le proteine dal laboratorio alla Clinica; Desenzano del Garda 13-14 Gennaio 2006
Elettroforesi
116
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Alfa 1
Tracciato n. 7
La IFE mostra la presenza di una componente monoclonale di tipo lambda libera.
Tracciato n. 8
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00117
Nel campione di sinistra la zona alfa 1 è in posizione maggiormente anodica rispetto alla omologa proteina del campione di destra.
Aι
Elettroforesi
117
α1
α2
β1 β2
γ
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Alfa 2
Tracciato n. 18
Tracciato n. 19
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
ID 00118
Campione a sinistra normale Campione a destra con presenza di CM IgA K in zona anodica alfa 2.
Elettroforesi
118
γ
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Alfa 2
Tracciato n. 7
Aι
α1
Tracciato n. 8
α2
β1 β2
γ
Aι
α1 α2 β1 β2
γ
ID 00119
Campione a sinistra normale Campione a destra con presenza di CM IgA λ in interzona alfa 2 - transferrina.
Elettroforesi
119
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Alfa 2
Tracciato n. 9
Tracciato n. 8
Aι
α1 α2 β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00120
Campione a destra con aumento alfa 2 e diminuzione di aptoglobina Campione a sinistra con presenza di CM IgA K in interzona alfa 2 - transferrina.
Elettroforesi
120
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Gamma Inter Alfa 2 -Transferrina Tracciato n. 22
Tracciato n. 23
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00121
Campione destro normale Campione sinistro con presenza di banda omogenea ETF (IgA ʎ) in posizione centrale Alfa2 - Transferrina
Elettroforesi
121
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Transferrinica
Tracciato n. 2
Aι
α1
Tracciato n. 3
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00122
Campione a destra normale con assenza di anomalie riferibili a presenza di bande omogenee. Campione a sinistra con zona transferrinica più lenta e presenza di banda omogenea, riferibile a lambda libere monoclonali, nell’interspazio Tf-C3. Riduzione della albumina, C3 e ipogammaglobulinemia.
Elettroforesi
122
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Transferrinica
Tracciato n. 25
Tracciato n. 26
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00123
Campione a destra con transferrina aumentata ma con assenza di anomalie riferibili a presenza di bande omogenee. Campione a sinistra con zona transferrinica allargata anodicamente con profilo morfologico sfumato per presenza di catene leggere libere monoclonali λ.
Elettroforesi
123
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona Transferrinica
Tracciato n. 8
Aι
α1
Tracciato n. 9
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00124
Campione a sinistra con presenza di Gc (componente gruppo specifica) Campione a destra con transferrina aumentata e colorazione intensa, posizione più catodica per presenza di componente Monoclonale IgA K con simile carica elettrica netta.
Elettroforesi
124
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona (Gamma) Inter Transferrina-C3
Tracciato n. 18
Tracciato n. 19
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00125
Campione a sinistra normale Campione a destra con transferrina allargata e sfumata sul margine catodico per presenza di catene leggere libere monoclonali di tipo K.
Elettroforesi
125
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona (Gamma) Inter Transferrina-C3
Tracciato n. 3
Aι
α1
Tracciato n. 4
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1
β2
γ
ID 00126
Campione sinistro normale Campione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA K) in posizione anodica rispetto al C3 che è stato spostato fisicamente e retromigrato, nel verso catodico, per ingombro sterico legato alla presenza della CM.
Elettroforesi
126
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona (Gamma) Inter Transferrina-C3
Tracciato n. 3
Aι
α1
Tracciato n. 4
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00127
Campione sinistro normale Campione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA λ) in posizione anodica rispetto al C3 che compare debolmente sul lato rivolto al catodo e simultanea presenza di Beta 2 lipoproteina addossata alla CM lato anodico.
Elettroforesi
127
LE COMPONENTI MONOCLONALI La zona C3
Tracciato n. 18
Tracciato n. 19
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
Aι
α1
α2
β1 β2
γ
ID 00128
Campione sinistro normale Campione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA λ) in posizione anodica rispetto al C3 che compare ridotto, sfumato e asimmetrico-anodico
Elettroforesi
128
LE IMMUNOFISSAZIONI
ATLANTE immunofissazioni sieriche negative
Quadri IFE negativi per presenza di CM
SPE ID 200195
Elettroforesi
IgG
IgA
IgM
魏
位
SPE
IgG
IgA
ID 200195
195
IgM
魏
位
ATLANTE immunofissazioni sieriche negative
Quadri negativi per presenza di CM. La IFE di sinistra mostra una riduzione della eterogeneità policlonale per la classe G e sottoclasse I. Normali le classi A e M. La IFE di destra mostra una media riduzione delle policlonalità G (ancora nell’ambito di riferimento) e spinta delle A.
SPE ID 200196
Elettroforesi
IgG
IgA
IgM
κ
λ
SPE
IgG
IgA
ID 200196
196
IgM
κ
λ
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe G campioni sierici diversi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200197
Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo λ di grande entità. Policlonalità depresse.
Elettroforesi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200197
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200197
Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo K di media entità. Policlonalità assenti.
197
Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo λ media entità. Policlonalità assenti.
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe G
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K; la catodica di piccola concentrazione, mentre la anodica, in posizione transferrinica, ha una concentrazione media.
SPE
IgG
IgA
IgM
魏
位
ID 200198
Elettroforesi
198
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe G campioni sierici diversi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200199
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K. buona conservazione delle policlonali.
Elettroforesi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200199
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200199
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K. discreta conservazione delle policlonali G e assenza delle A e M.
199
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K. bassa conservazione delle policlonali G.
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe G campioni diversi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200200
Presenza di 1 piccolissima CM di classe IgG e tipo λ. La alta concentrazione delle K policlonali può trarre in inganno nella attribuzione del tipo di catena leggera.
Elettroforesi
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
ID 200200
λ
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200200
Presenza CM di classe IgG e tipo λ.
200
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K. Forte deplezione delle policlonali.
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe G
Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo lambda; la catodica di piccola concentrazione, mentre la anodica ha una concentrazione inferiore. Notare la forte riduzione della eterogeneità policlonale dell’immunofissato IgA (più anodico rispetto alla CM anodica), che simula una banda compatibile con una morfologia “monoclonale“.
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
ID 200201
Elettroforesi
201
ATLANTE
ATLANTE
immunofissazioni sieriche: classe A
immunofissazioni sieriche: classe A
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
SPE
ID 200202
IgA
IgM
κ
λ
Il campione presenta una CM di classe A e tipo λ. Notare la diversa reattività dell’antisiero (affinità e avidità) nei confronti della classe e del tipo.
Presenza di 3 CM di classe IgA e tipo lambda, si nota in posizione catodica gamma la presenza di una CM di tipo lambda confermata con antisiero anti catene leggere libere (Bence Jones positiva). Per la classe A è utile disaggregare il campione e verificare il numero di cloni secernenti.
Elettroforesi
IgG
ID 100202
202
ATLANTE
ATLANTE
immunofissazioni sieriche: classe A
immunofissazioni sieriche: classe M
SPE
IgG
IgA
IgM
κ
λ
SPE IgG
ID 200203
Il campione presenta 2 CM in posizione anodica gamma - C3 di classe IgA e tipo λ;
Elettroforesi
IgA
IgM
κ
λ
ID 100203
Il campione presenta 2 CM in posizione centrale gamma di classe IgM e rispettivamente di tipo k e λ.
203
ATLANTE immunofissazioni sieriche: classe M
Il campione presenta una CM di classe IgM e tipo K.
SPE
IgG
IgA
IgM
魏
位
ID 200204
Elettroforesi
204
APPENDICE SECONDA
Appendice seconda Prima pagina il Titolo: ok quello esistente Inserire questa diciture e figura
a) Le proteine urinarie in elettroforesi b) La concentrazione dei liquidi biologici
IL QUADRO URINARIO ETF E LA CONCENTRAZIONE DEI LIQUIDI BIOLOGICI NELLA PRATICA DEI LABORATORI DI CHIMICA CLINICA.
Il glomerulo
Il glomerulo
a) Le proteine urinarie in elettroforesi
L’apparato renale
Il glomerulo
Il tubulo
b) La concentrazione dei liquidi biologici
Seconda pagina Titolo: L’apparato renale
Elettroforesi
Il tubulo
287
Il tubulo
Concentrare o non concentrare? E se si, come? Questo è il problema!
L’elettroforesi delle proteine urinarie che Tidstrom, per primo, eseguì su carta nel 1963, ha fatto in seguito notevoli progressi per l’impiego di nuovi substrati che la tecnologia ha fornito al laboratorista: dalla carta si è passati al gel d’amido, all’agar, all’acetato di cellulosa, all’acrilamide, ed all’ agarosio, infine con il metodo capillare. Nella tabella 1 viene riportata la storia delle principali tecniche elettroforetiche Tabella 1
INTRODUZIONE La rilevanza dello studio della proteinuria è dimostrata dalla grande mole di letteratura esistente sull’argomento.L’associazione della proteinuria con anormalità del rene è stata chiaramente dimostrata da Richard Bright circa 150 anni fa. Il ruolo del rene nella conservazione e nel metabolismo delle plasmaproteine è stato più volte studiato in passato, ma è negli ultimi due decenni che l’argomento è stato oggetto di numerosi studi. L’interesse per lo studio delle proteinurie è derivato dalla frequenza di comparsa di questo segno presente in quasi tutte le malattie renali, dallo sviluppo dei metodi biochimici per lo studio qualitativo delle proteine urinarie e da una conoscenza più precisa dei processi fisiologici di filtrazione glomerulare e riassorbimento tubulare delle proteine in condizioni normali e patologiche. Riteniamo utile ricordare che la presenza di proteinuria non implica necessariamente l’esistenza di una patologia renale (anche i soggetti normali presentano una proteinuria “fisiologica”) e che sono invece gli studi elettroforetici qualificati a definire una proteinuria come “patologica”, evidenziando la presenza nelle urine di proteine di origine plasmatica che in condizioni normali non superano la barriera glomerulare; di proteine presenti solo qualora il tubulo non svolga più la propria funzione di riassorbimento; di proteine plasmatiche abnormi che passano nelle urine; di proteine secrete dal rene e dalle vie urinarie.
Elettroforesi
Principali tecniche EP impiegate in clinica, per l’ analisi del quadro proteico dei vari liquidi biologici
288
Substrato
Ricercatore
Anno
Carta da filtro
Konig Cremer e Tiselius Durrum Grassman Wunderly*
1937 1950 1950-1955 1950-1954 1954
Gel di agar
Gordon Grabar e Williams Wieme
1949 1953 1956-1959
Gel di amido
Smithies
1955
Beta 2 microglobulina
Acetato di cellulosa
Kohn
1957
Immunoglobuline
Gel di poliacrilamide
Raymond e Weintraub Davis e Ornstein
1959 1964
Proteina legante il retinolo
Gel di acrilamide- agarosio
Uriel
1966
PROTEINE DI ORIGINE RENALE circa 40 \ 30 %
Gel di agarosio
Laurell Johansson
1965 1972
Uromucoide circa 50 mg \ 24 ore
Capillare
Enzimi
Urochinasi
2001
IgA secretorie
Nel soggetto normale l’eliminazione giornaliera urinaria di proteine si aggira intorno ai 150 mg.
Enzimi tubulari Le proteine di origine plasmatica costituiscono il 60 % 70 % e di queste circa 15 mg sono attribuibili alla albumina, mentre altre proteine o polipeptidi sono presenti in quantità minime o in tracce; basti pensare che con tecniche ultrasensibili come l’elettroforesi bidimensionale si evidenziano 500/600 spots. La proteina di produzione endogena renale prevalente nell’urina è l’uromucoide o proteina di Tamm-Horsfall. Si tratta di una proteina ad elevatissimo PM (7.000.000 D) ma con possibilità di aggregati che possono raggiungere 23.000.000 o più. E` una proteina polimerica ad alto contenuto glicidico (30%), i cui monomeri hanno PM di 80.000 D, con P.I. di 3,5; è la matrice essenziale dei cilindri e sembra essere secreta nelle urine a livello di ansa di Henle e di tubulo contorto distale. Non si conosce il suo significato biologico, si ipotizza che abbia un ruolo antibatterico ed antivirale. L’urochinasi, con la sua capacità di lisare la fibrina potrebbe avere un ruolo nel rimuovere coaguli a livello capillare, o, secondo altri AA quello di agire enzimaticamente sui cilindri.
Nella Tabella 2 sono elencate le principali proteine dell’urina normale. Tabella 2 Proteinuria totale 24 ore = 130 mg ( 80 \ 240 ) PROTEINE DI ORIGINE PLASMATICA circa 60 \ 70 % Albumina circa 15 mg \ 24 ore ( 2.0 - 30.0 ) Ceruloplasmina Alfa 1 glicoproteina acida Alfa 1 antitripsina Alfa 1 microproteina Emopessina Transferrina Aptoglobina
Elettroforesi
289
Le IgA ritrovate nelle urine, che ammontano a circa 1 mg/24 h, sono di tipo dimerico secretorio, uguale a quelle presenti in altre secrezioni; la componente secretoria sarebbe sintetizzata dai tubuli; la funzione è di tipo anticorpale. La quantità e la composizione in proteine delle urine dipendono dal bilancio fra il passaggio transglomerulare e il riassorbimento tubulare. Se si considera che il rene riceve giornalmente circa 25 kg di proteine, di cui solo qualche grammo attraversa la barriera glomerulare, per poi andare incontro ad un riassorbimento tubulare di circa il 90%, si comprende l’estrema efficienza del nefrone nel controllare questo aspetto dell’omeostasi proteica. Per inquadrare clinicamente le proteinurie è necessario considerare i meccanismi fisiopatologici che le determinano e che si svolgono a livello glomerulare e tubulare. Anatomia, funzione e idrodinamica renale La anatomia
Elettroforesi
La funzione
290
La funzione glomerulare Quattro fattori principali intervengono nel determinismo del filtraggio glomerulare delle proteine: 1) La permeabilità selettiva: peso molecolare e forma 2) La presenza di strutture anioniche con funzione di repulsa elettrostatica 3) La concentrazione plasmatica 4) Le condizioni emodinamiche locali Numero di Reynolds = d . v . ρ / η
La idrodinamica fisiologica Il nefrone è composto da due parti: il glomerulo e il tubulo
La funzione tubulare I meccanismi di riassorbimento: Tutte le proteine con peso molecolare inferiore a 40.00 D non incontrano, quasi, difficoltà nell’essere filtrate a livello glomerulare e sono riassorbite per oltre il 90% nel tubulo prossimale.
Elettroforesi
291
Le finalità dello studio del quadro proteico Elettroforetico urinario 1) Ricerca delle C.M. 2) Osservazioni “semi-quantitativa” delle differenti zone per inquadrare il danno renale e classificare la proteinuria ed indirizzare ad analisi di II livello. La fase pre-analitica: il contenitore e la sua importanza Piano sperimentale Raccolta di 15 urine ( sodio azide 0.1 %) con proteinuria micromolecolare. Dosaggio K e L per via nefelometrica. Valori tra 23 e 765 mg/L. Urine miscelate e suddivise in due aliquote. Una aliquota in vetro ed una in plastica non per alimenti. Tempo conservazione 24 ore. I risultati
Mentre i peptidi vengono scissi dagli enzimi dell’orletto a spazzola ad aminoacidi che poi possono essere assorbiti tramite carrier Na+- dipendenti, le proteine vengono assorbite nel lume delle vescicole e scisse negli eterolisosomi mediante fusione con lisosomi primari. I prodotti di scissione vengono riportati all’organismo attraverso la membrana basolaterale. I residui non digeribili vengono secreti nel lume per esocitosi, con contemporanea secrezione di enzimi lisosomiali. Il metabolismo e catabolismo del tubulo:
IF BJ positive
IF BJ negative
Vetro
15
0
Plastica
13
2
Valutazione Nefelometrica Urina conservata in vetro m g/L
Valutazione Nefelometrica Urina conservata in plastica mg/L
Urina neg. 1
37
Circa 5
Urina neg. 2
39
Circa 2
La fase pre-analitica: la raccolta delle urine Per la ricerca e classificazione della proteinuria: raccogliere la seconda minzione del mattino (G.P. Merlini) A conferma di quanto affermato è stata condotto uno studio su portatori di proteinuria plasmatica da over-flow BJ, onde valutare la massima escrezione di catene leggere libere monoclonali presente nelle urine raccolte con temporizzazione:
Elettroforesi
292
Aspetti clinici Dal punto di vista semeiologico, la proteinuria può essere: • • •
Transitoria Intermittente Persistente Proteinuria Transitoria
Consiste nel reperto occasionale di una proteinuria con valori patologici, solitamente moderata, che non si ripete nel tempo in successivi controlli ed ha un carattere di tipologia benigna.
Ciapini, M. Tani, B. Milanesi Il Patologo Clinico 3/2006
Per la ricerca, classificazione e valutazione della massa proteica escreta raccogliere le urine delle 24/ore con sodio azide 0.1 %: Long term outcome of MGUS: R. A. Kyle and S. V. Rajkumar British Journal of Haematology, 134, 573589 2006 “A 24h urine specimen should be collected so that the amount of M protein can be measured. This provides a measure of the patient’ s tumor mass and is usefull in monitoring the course of the desease. “
Con il termine di proteinuria funzionale si intende la proteinuria che, indipendentemente da stati patologici renali, si accompagna a diverse condizioni cliniche caratterizzate da stati febbrili, ad esercizio fisico intenso e protratto, a condizioni di stress fisico ed emozionale come gli interventi chirurgici o la esposizione al freddo. Questa proteinuria è definita di tipo transitorio e si risolve assieme al recupero della condizione fisica che, alterandosi, ne è stata la origine. Proteinurie Intermittenti Tali proteinurie sono caratterizzate, come indica la loro definizione, dalla comparsa di proteine patologiche in tempi episodici e con intervalli in cui la proteinuria rientra nel range dei valori fisiologici. Queste proteinurie possono avere decorso del tutto casuale ed irregolare, oppure presentare una periodicità regolare come nella proteinuria di tipo ortostatico che, accanto a valori normali nei campioni di origine mattutina, seguenti il periodo di riposo in clinostatismo, presenta valori patologici nei campioni serotini, dopo la comune attività ortostatica. Le proteinurie intermittenti sono del tipo glomerulare e, benché di consueto quantitativamente modeste, meritano attenzione perché possono essere indici di una incipiente sofferenza renale.
Elettroforesi
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Metodi di studio delle proteinurie I metodi di studio delle proteinurie possono essere distinti in metodi quantitativi (Tabella 3) e qualitativi (Tabella 4).
Data la entità spesso moderata di queste proteinurie torna utile dire e fare presente la esigenza di una buona qualità analitica dei metodi di determinazione, sia per la fase di screening che per quella del dosaggio, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità analitica e la limitazione della imprecisione, onde evitare false positività riconducibili ad eccessiva variabilità analitica. L’accertamento di una proteinuria intermittente obbliga il medico curante ad approfondire le indagini per poter dirimere il potenziale dubbio di una lesione renale che, come abbiamo affermato, può esserne la causa.
Tabella 3: METODI QUANTITATIVI
Tabella 4: METODI QUALITATIVI
Dosaggio della proteinuria totale
Elettroforesi: Su acetato di cellulosa
Dosaggio di singole proteine specifiche:
Su gel di agarosio
Albumina
Su gel poliacrilamide
Le proteinurie persistenti possono essere distinte nelle forme prerenali, renali e post renali.
Transferrina
Su gel di poliacrilamide SDS (SDS PAGE)
Le proteinurie prerenali sono le proteinurie da ‘ overflow ‘, le quali non sono espressione di malattia renale, bensì proteine fisiologicamente filtrate dal glomerulo che presenti nel plasma in concentrazione aumentata per svariate evenienze patologiche, eccedono la normale soglia di riassorbimento tubulare.
Immunoglobuline IgG
Su agarosio SDS Hydragel Proteinuria
Beta 2 microglobulina
Elettroforesi bidimensionale
Espressione paradigmatica di questo tipo di proteinuria è la proteinuria di Bence Jones.
Alfa 1 microglobulina
Capillare
Proteina legante il retinolo
Cromatografia:
L a tipologia della proteinuria intermittente è sovente appannaggio della età infantile ed adolescente dove risulta fondamentale escludere la possibilità di infezioni streptococciche silenti. Proteinurie persistenti
Le proteinurie renali sono quelle già descritte nella classificazione eziopatogenetica, ovvero: glomerulari, tubulari e miste.
Su colonna di Sephadex
Le proteinurie postrenali sono dovute a lesioni, che spesso fanno riferimento alla natura infiammatoria, dei tessuti delle vie renali come: pelvi renale, uretere, vescica, prostata ed organi genitali. Talvolta queste proteinurie hanno una composizione che ne consente la identificazione per la presenza di specifiche proteine come quella della presenza di enzimi o della proteina di Tamm-Horsfall.
Elettroforesi
Determinazione delle CLEARANCE proteiche
HPLC
Enzimuria:
Immunofissazione
Alanina aminopeptidasi ( AAP ) N Acetil glucosaminidasi ( NAG )
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Aspetti tecnici Metodi di determinazione della proteinuria totale Le tecniche maggiormente attendibili risultano quelle di Bradford\SDS ed al Pirogallolo. Le strisce rivelatrici per urine consentono in modo approssimativo di seguire l’ andamento di perdita di albumina e non danno risultati soddisfacenti nel monitoraggio delle altre proteine; infine sono legate strettamente alla interpretazione dell’ operatore.
quella in poliacrilamide in gradiente di concentrazione e quella in agarosio con pretrattamento del campione con SDS. Se la tecnica utilizzata è quella elettroforetica con ampio potere risolutivo, aumento di massa e colorante sensibile è possibile superare lo scoglio della evidenziazione delle microproteine che oltre ad essere presenti in quantità modeste hanno, anche, la prerogativa di migrare sotto a quelle a peso molecolare maggiore, specie nelle proteinurie di tipo misto; in queste situazioni metodologiche è possibile avere quadri di proteinurie come quelli della fig. 1:
Per quanto attiene alla ricerca di catene leggere libere e delle microproteine, sia le tecniche nefelometriche che quelle citate dimostrano i loro limiti vuoi per i bassi pesi molecolari in gioco vuoi per le basse concentrazioni dei livelli di normalità ( microproteine ), vuoi infine per la difficoltà di correlare le risposte dei calibratori sulle proteine ricercate.
Figura 1
Inquadramento del tipo di proteinuria: Metodi Qualitativi La tecnica maggiormente impiegata è quella elettroforetica. Il vero parametro limitante questa tecnica è rappresentato dal grado di sensibilità da dover raggiungere. Due sono le possibili soluzioni al problema: Aumento della massa molecolare proteica per mezzo di: 1) Concentrazione 2) Depositi multipli con riduzione della risoluzione 3) Tecniche immunofissative Aumento della sensibiltà del marcatore di rivelazione per mezzo di: 1) Coloranti ad alta sensibilità 2) Sistemi immunoenzimatici Il livello di sensibilità raggiungibile con tali sistemi oscilla tra 1 e 15 mg\l. Le tecniche consigliate sono la elettroforetica con ampio potere risolutivo,
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Lâ&#x20AC;&#x2122;utilizzo dellâ&#x20AC;&#x2122;agarosio SDS, in cui la separazione è unicamente appannaggio del PM della proteina, consente una interpretazione facile ed evidente: figg. 2/3/4 Figura 2 Figura 3 Proteine tubulari
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Tabella 5
Figura 4 Proteine Glomerulari
1) Proteinurie di derivazione plasmatica a) Renali Glomerulari b) Renali Tubulari c) Pre renali 2) Proteinurie di derivazione tissutale a) Nefrogenetiche
3) Proteinurie post renali
Una prima distinzione è basata sulla origine delle proteine riscontrate a livello urinario e prevede tre grosse categorie: Figura 5
Unico neo nell’impiego di questo metodo di separazione delle proteine è legato alla sua impossibilità di distinguere tra proteine monoclonali e policlonali; questo perché le proteine della stessa specie hanno lo stesso peso molecolare e migrano in una banda omogenea. La sensibilità di questo metodo raggiunge normalmente i 5 mg/L. Classificazione patogenetica delle proteinurie La complessità dei meccanismi che stanno alla base del determinismo della proteinuria si riflette nella complessità del processo diagnostico interpretativo dei quadri proteinurici che si riscontrano nella pratica clinica. Sulla base della probabile origine delle proteine urinarie sono state proposte varie classificazioni fra le quali riportiamo quella proposta da Boylan: tabella 5
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Figura 6
In modo maggiormente esaustivo proponiamo unâ&#x20AC;&#x2122;altra classificazione patogenetica delle proteinurie: Tabella 6 e fig. 6/7: CLASSIFICAZIONE PATOGENETICA DELLE PROTEINURIE 1) PROTEINURIE PLASMATICHE a) Renali Glomerulari
TIPO
Proteinuria Glomerulare selettiva
Proteinuria Glomerulare non selettiva
CAUSE
Alterazioni di carica della membrana basale per perdita di cariche negative
Alterazioni di struttura della barriera glomerulare per aumento e\o ingrandimento dei pori
CLASSI PROTEICHE
Albumina Transferrina
Albumina Transferrina Immunoglobuline
PESI MOLECOLARI
68.000 \ 77.000 D
68.000 \ 500.000 D
ESEMPI DI PATOLOGIE CORRELATE
Minimal change Nefropatia Sclerosi glomerulare focale Glomerulo nefrite membranosa
Glomerulonefrite proliferativa Diabete avanzato Amiloidosi
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Campione 7 = proteinuria fisiologica con presenza di albumina e transferrina Campione 6 = proteinuria glomerulare selettiva con presenza di albumina e transferrina aumentate
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APPENDICE SESTA La proteina di Bence Jones
a) I suoi rapporti con la funzionalitĂ renale b) Le linee guida della SIBioC c) La BJ e le contrastografie
Il ruolo dei nefroni Corticali e Iuxtamidollari
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La proteinuria di Bence Jones: linee guida e contrastografie
Nei due mesi seguenti, il paziente è diventato emaciato, debole, ed è stato tormentato dal dolore. Egli morì il 1 ° gennaio 1846, nel pieno possesso delle sue facoltà mentali. Il Dr MacIntyre successivamente pubblicò (1850), post-mortem del paziente, sia l’esame che la descrizione delle urine inviate al Dr Bence. Purtroppo per lui, Henry Bence Jones aveva già pubblicato i risultati degli accertamenti urinari del paziente in due articoli di autore unico, uno dei quali su The Lancet, nel 1847. Egli considerava la proteina di essere un “deutoxide idratato di albume”. Il suo commento a seguire: “Non ho bisogno di osservazione sulla importanza di cercare per questo ossido di albume in altri casi di ossium mollities”. La reputazione di Bence Jones è stato garantita ai posteri, mentre i contributi dei suoi colleghi sono stati consegnati alle note a piè di storia. Per tutti può sembrare un’ingiustizia nei confronti del suo collega, William MacIntyre, ma Henry Bence Jones realizzò molto altro nella sua carriera. Ha pubblicato oltre 40 articoli ed è diventato ricco e famoso per i suoi studi sulla sua pratica clinica, didattica e osservazioni originali; ricevette una borsa di studio della Royal Society, alla tenera età di 33 anni. Florence Nightingale, una volta lo ha descritto come “il chimico medico migliore di Londra.” Sorprendentemente, non vi era alcuna menzione della proteina di Bence Jones nel suo necrologio e l’eponimo (e il trattino in suo nome) non è stato utilizzato fino alla sua morte.
La storia: Anche se FLC “immunoglobuline” sono sinonimo di proteine di Bence Jones, la storia avrebbe potuto essere più generosa con gli altri ricercatori coinvolti nella loro scoperta. “Venerdì scorso, ottobre 1845, il dottor William MacIntyre, medico dell’Ospedale Occidentale St. Marylebone, St. Marylebone, Londra, ha lasciato le sue stanze in Harley Street. Era stato chiamato per vedere il signor Thomas Alexander McBean, di 45 anni, fruttivendolo di tutto rispetto, che aveva forti dolori ossei e fratture. Era stato sotto la cura del suo medico di medicina generale, il dottor Thomas Watson, per diversi mesi. Dopo un esame del paziente, William MacIntyre osservò la presenza di edema. Considerando la possibilità di nefrosi, testò l’urina per il suo contenuto di albumina. Con grande meraviglia egli verificò che riscaldando l’urina la proteina albuminosa precipitava e si ridiscioglieva a 75 °C “ Sia il Dr MacIntyre e Dr Watson inviano i campioni di urina al patologo chimico all’Hospital St.George e all’attenzione del Dr Bence. Una nota accompagna l’urina inviata dal Dr Watson: .. “Caro Dott. Bence Jones, Il tubo contiene urina di altissimo peso specifico: quando bollito diventa molto opaco in materia di aggiunta di acido nitrico, è effervescente, assume una colorazione rossastra, e diventa abbastanza chiaro, ma quando si raffredda si assume la consistenza e aspetto che si vede. Riscaldare reliquifies. Che cosa è? “
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Definizione: La proteina di Bence Jones è una proteina appartenente alla classe delle globuline. Il suo peso molecolare è di 20 kDa. È di fatto la catena leggera di un anticorpo, distaccata dalla catena pesante. Le catene leggere chiamate “proteina di Bence Jones” sono diverse dalle catene leggere “usuali” che i linfociti B del corpo normalmente producono: •
le Bence Jones sono libere e monoclonali, mentre le normali catene leggere sono legate alla catena pesante corrispondente a formare l’anticorpo. • le Bence Jones sono monoclonali, cioè tutte geneticamente uguali, mentre le normali catene leggere sono policlonali, ovvero tutte con delle sottili differenze tra loro. La proteina di Bence Jones può essere rilevata nel sangue, nelle urine od in ambedue i liquidi biologici dello stesso paziente:
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Svariate patologie rare possono avere come sintomo la produzione di proteine di Bence Jones; tra esse va menzionata la macroglobulinemia di
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2) Riassorbimento tubulare
Waldenström; tra le altre, si riscontrano proteine di Bence Jones nel sangue o nelle urine di pazienti con mieloma multiplo, l’insufficienza renale, l’anemia.
3) Secrezione tubulare
Le Bence Jones possono venire prodotte dalle plasmacellule neoplastiche. Possono essere di tipo kappa o lambda. Le catene leggere possono essere sia frammenti immunoglobulinici sia immunoglobuline omogenee. Possono essere trovate nell’urina per le loro dimensioni piccole, in seguito ad una facile clearance renale. In altri termini la proteina di Bence Jones può essere definita come Componente Monoclonale, ovvero “Clone di Linfociti B in espansione”
La quantità di qualsiasi sostanza presente nell’urina (carico escreto) è il risultato del seguente algoritmo: Cristallo della proteina di Bence Jones in cristallografia a raggi X. Il rene e la proteina di Bence Jones: Una delle funzioni primarie del rene è eliminare dal sangue, riversandole nelle urine, sostanze non necessarie e trattenere le sostanze necessarie. Ora se consideriamo il peso molecolare di una Proteina di Bence Jones,
La formazione dell’urina deriva da tre processi: 1) Filtrazione glomerulare
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dobbiamo considerare che il glomerulo
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L’acqua viene riassorbita per osmosi. Trasporto attivi: Primario = se accoppiato direttamente ad una fonte di energia (idrolisi di ATP) pompa ATPasi Na + / K+. Secondario = se accoppiato indirettamente ad una fonte di energia.
non sia in grado di fermarla poiché è normale reperto la presenza di Albumina nelle urine (P.M. 55.000 D), in lievi quantità. A questo punto interviene la funzione tubulare:
che provvede alla funzione di riassorbimento, dei soluti, che si suddivide in meccanismi attivi e passivi:
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